JP2022114682A - 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを検出する方法及び試薬 - Google Patents
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを検出する方法及び試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022114682A JP2022114682A JP2021011070A JP2021011070A JP2022114682A JP 2022114682 A JP2022114682 A JP 2022114682A JP 2021011070 A JP2021011070 A JP 2021011070A JP 2021011070 A JP2021011070 A JP 2021011070A JP 2022114682 A JP2022114682 A JP 2022114682A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer
- rna
- sequence
- sars
- cov
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 9
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 10
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 17
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 44
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 5
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 4
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical group OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 241000713824 Rous-associated virus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 108010015969 trypsin resistant core repressor Proteins 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLNKXLRYCLKJSS-RMKNXTFCSA-N (2e)-2-hydroxyimino-1-phenylethanone Chemical compound O\N=C\C(=O)C1=CC=CC=C1 MLNKXLRYCLKJSS-RMKNXTFCSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 1
- 241000112287 Bat coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000025371 Taste disease Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 206010049590 Upper respiratory tract inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-1 Chemical compound [I-].[I-].C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4O3)C)=CC=[N+](CCC[N+](C)(C)C)C2=C1 ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 208000026425 severe pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 235000019669 taste disorders Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】試料中に存在する２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を特異的に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい検出方法を提供する。【解決手段】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法であって、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットにより特定塩基配列からなる核酸を増幅する工程、増幅された核酸を検出可能な標識で標識された核酸プローブで検出する工程、からなり、前記第一のプライマーが特定の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなり、前記第二のプライマーが別の特定の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなることを特徴とする新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法、を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、試料中に含まれる２０１９年新型コロナウイルス（以後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とする）を迅速、高感度かつ特異的に検出するための方法及び試薬に関する。
新型コロナウイルス感染症（以後、ＣＯＶＩＤ－１９とする）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を原因ウイルスとし、２０１９年、中華人民共和国湖北省武漢市において確認された。世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＣＯＶＩＤ－１９について、「国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）」を宣言した。その後、世界的な感染拡大の状況、重症度等から２０２０年３月１１日ＣＯＶＩＤ－１９をパンデミック（世界的な大流行）とみなせると表明した。
コロナウイルス科は、直径８０～１６０ｎｍのエンベロープを有するプラス鎖１本鎖ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）ウイルスであり、人の他、イヌ、ブタ、ウシならびにラクダ等種々の動物に感染する。遺伝学的特徴からα、β、γならびにδの属に分類される。ヒトに主に風邪症候群を起こすウイルスとして、αコロナウイルス属の２２９Ｅ株、ＮＬ６３株、βコロナウイルス属のＯＣ４３株、ＨＫＵ１株がある。これら４種のウイルスが風邪の原因の１０～１５％（流行期３５％）を占める。これらに加え、２００３年にはＳＡＲＳ（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）コロナウイルスが、２０１２年にはＭＥＲＳ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）コロナウイルスが同定されているが、この２つは、いずれもヒトに肺炎を主とする重篤な感染症を引き起こし、その致死率は前者が約１０％、後者が３０％以上と非常に高い（非特許文献１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳと同じβコロナウイルスに属する。全塩基解析と系統樹解析により、ＳＡＲＳコロナウイルスとは７５～８０％の相同性、コウモリのコロナウイルスとは８５～８８％の相同性が認められている。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコウモリのウイルス由来であると考えられている。
初期症状は軽症で、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、食欲不振、筋肉痛、呼吸困難、喀痰ならびに咽頭痛等がみられるほか、嗅覚・味覚障害が生じることがあり、重症化すると肺炎を発症する。通常、初期症状は５～７日間程度続き、重症化しなければ次第に治っていく。
重症化すると呼吸困難に陥る。肺炎以外にも、上気道炎や気管支炎など、その他の呼吸器系器官への炎症が認められる場合もある。重症型の肺炎が生じても、症状に対する治療を行うことで徐々に回復するが、悪化し重篤化すると、急性呼吸器症候群（ＡＲＤＳ）や敗血症性ショック、多臓器不全などが起こり、場合によっては死に至るケースもある。
通常のウイルス感染症では、他者に感染させる可能性が最も高いのは、症状が強く表れる時期であるが、新型コロナウイルスの感染者は、無症状の場合、軽症の段階、重症化した段階それぞれで感染する可能性があると考えられている。特に無症状でありながらウイルスに感染し、他者への感染力を有する無症状性病原体保有者の特定は、感染を拡大させないこと、院内感染を防ぐのに最も重要なことである。また、無症状者の特定を行うためには、大規模なスクリーニング検査が有効とされ、十分な処理能力を持ち、かつ高感度である検査法が必要である。
高感度検査方法としては、ウイルスの核酸を増幅し検出する遺伝子検査法が挙げられる。しかしながら、検体からウイルス由来の核酸を抽出する工程が煩雑であり、信頼できる結果を得るには作業実施者の練度がある程度必要となる。また、結果を得るのに時間が掛かり、迅速性に欠く一方、抗原抗体検査法は、簡便で処理能力が高く、高い迅速性を有する特徴があるが、感度が遺伝子検査に比べ高くなく、偽陰性となる可能性がある。
本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の増幅対象核酸は、他のコロナウイルスとの間で塩基配列の相同性が高いため、その遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。特に２００３年に流行したコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）との識別が困難であった。比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はより困難なものであった。
Ｗａｎｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ： Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ ｃｏｎｃｅｒｎ． Ｌａｎｃｅｔ ３９５： ４７０－４７３， ２０２０． ｄｏｉ： １０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０１８５－９．
本発明の目的は、試料中に存在する新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定核酸配列を高感度、迅速、特異的に増幅し、検出する方法及びそれに用いるための試薬を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法であって、
［ｉ］少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットにより特定塩基配列からなる核酸を増幅する工程、
［ｉｉ］増幅された核酸を検出可能な標識で標識された核酸プローブで検出する工程、からなり、
前記第一のプライマーが配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなることを特徴とする新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（２）前記第一のプライマーが配列番号１に記載の塩基配列の連続した２０塩基からなり、前記第二のプライマーが配列番号２の連続した２０塩基～２５塩基からなることを特徴とする（１）に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（３）前記第一のプライマーが配列番号３から配列番号１５のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなり、前記第二のプライマーが配列番号１７から配列番号２２のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなることを特徴とする（２）に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（４）前記標識された核酸プローブが、蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されてなることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（５）前記蛍光色素がインターカレーター性蛍光色素であることを特徴とする（４）に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（６）前記標識された核酸プローブが、配列番号２３に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１７塩基以上の配列からなることを特徴とする（１）～（５）のいずれかに記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（７）前記核酸を増幅する工程が、
［ｉ］前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーは、少なくとも一方の５’末端にＲＮＡポリメラーゼの転写が開始可能なプロモーター配列が付加されてなり、
［ｉｉ］少なくとも、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーからなるプライマーセット、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により転写可能なプロモーター領域を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、
［ｉｉｉ］ＲＮＡポリメラーゼによって前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする転写反応を行うことで特定塩基配列もしくはその相補配列からなるＲＮＡを生産し、
［ｉｖ］該ＲＮＡが［ｉｉ］の２本鎖ＤＮＡを生成するための鋳型となって、［ｉｉ］～［ｉｉｉ］が繰り返し進行する、
ことを特徴とする（１）～（６）のいずれかに記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
［ｉ］少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットにより特定塩基配列からなる核酸を増幅する工程、
［ｉｉ］増幅された核酸を検出可能な標識で標識された核酸プローブで検出する工程、からなり、
前記第一のプライマーが配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなることを特徴とする新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（２）前記第一のプライマーが配列番号１に記載の塩基配列の連続した２０塩基からなり、前記第二のプライマーが配列番号２の連続した２０塩基～２５塩基からなることを特徴とする（１）に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（３）前記第一のプライマーが配列番号３から配列番号１５のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなり、前記第二のプライマーが配列番号１７から配列番号２２のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなることを特徴とする（２）に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（４）前記標識された核酸プローブが、蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されてなることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（５）前記蛍光色素がインターカレーター性蛍光色素であることを特徴とする（４）に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（６）前記標識された核酸プローブが、配列番号２３に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１７塩基以上の配列からなることを特徴とする（１）～（５）のいずれかに記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（７）前記核酸を増幅する工程が、
［ｉ］前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーは、少なくとも一方の５’末端にＲＮＡポリメラーゼの転写が開始可能なプロモーター配列が付加されてなり、
［ｉｉ］少なくとも、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーからなるプライマーセット、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により転写可能なプロモーター領域を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、
［ｉｉｉ］ＲＮＡポリメラーゼによって前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする転写反応を行うことで特定塩基配列もしくはその相補配列からなるＲＮＡを生産し、
［ｉｖ］該ＲＮＡが［ｉｉ］の２本鎖ＤＮＡを生成するための鋳型となって、［ｉｉ］～［ｉｉｉ］が繰り返し進行する、
ことを特徴とする（１）～（６）のいずれかに記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
（８）新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットにより特定塩基配列からなる核酸を増幅する工程、増幅された核酸を検出可能な標識で標識された核酸プローブで検出する工程、からなる検出工程を実施するための試薬であって、少なくとも、配列番号１３に記載の配列からなる第一のプライマー、および配列番号２２に記載の塩基配列からなる第二のプライマー、を含むことを特徴とする新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出するための試薬。
本発明の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列の検出方法は、該特定塩基配列を増幅するための第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセット、核酸増幅方法、核酸検出プローブを提供することにより新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを迅速、高感度、特異的に検出する方法を提供する。
本発明の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法は、試料中に含まれる新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を、一つの遺伝子領域を標的としながら、迅速、高感度に検出でき、かつ他のコロナウイルス種を検出しないなど、偽陽性の発生も極めて少なく特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な治療方針の決定のために有効であり、症状の早期改善や公衆衛生に寄与するものと考えられる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明中において試料とは、鼻咽頭ぬぐい液、唾液、口腔検体、鼻腔検体、喀痰、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、胸水、血液、尿、便などがあげられる。最近、検体採取者の安全性を考慮して、唾液検体への適用が望まれている。
本発明中の特定塩基配列とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ配列において、本発明の第一のプライマーと相同な配列と第二のプライマーと相補的な配列、およびこれらに挟まれた配列からなる、もしくはその相補配列からなる配列である。
本発明中の第一のプライマーおよび第二のプライマーは、配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなり、好適には、配列番号１に記載の塩基配列の連続した２０塩基からなり、前記第二のプライマーが配列番号２の連続した２０塩基～２５塩基からなり、さらに好適には、第一のプライマーが配列番号３から配列番号１５のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなり、前記第二のプライマーが配列番号１７から配列番号２２のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなり、最も好適には、第一のプライマーが配列番号１３に記載の配列からなり、第二のプライマーが配列番号２２に記載の塩基配列からなる。
なお、以上の塩基配列は標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいてその特異性に変化がない範囲内で、塩基の変異、欠失、付加、または化学的修飾がなされていても適用可能であることは言うまでもない。一般に、ステリンジェントな条件、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、中で標的核酸とのハイブリダイゼーション効率に差がなければハイブリダイゼーションの特異性に差がないと考えることができる。
なお、前記第一のプライマーおよび第二のプライマーは、少なくとも一方の５’末端にＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始に寄与するプロモーター配列を付加していても良い。該プロモーターとしては、イン・ヴィトロ転写反応に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
本発明中の核酸プローブは、検出可能なシグナルを呈する物質で標識されていれば特に限定されないが、汎用性などから蛍光物質で標識されているものが好ましい。さらに好適には相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されているものがあげられる。蛍光特性が変化するよう構成された例としては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用したＴａｑＭａｎプローブ、ＢＥＡＣＯＮプローブ、Ｑプローブなどがあげられ、特に限定しないが、最も好適にはインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブがあげられる。該インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの一態様として、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ特定塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端、リン酸ジエステル部、または塩基部分、の少なくともいずれかに適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブがあげられる。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。
また、本発明中の核酸プローブは配列番号２３に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１７塩基以上の配列からなることが好ましく、さらに好適には配列番号２５に記載の配列からなる。プライマーの場合と同様に標的核酸とのハイブリダイゼーションにおいてその特異性に変化がない範囲内で、塩基の変異、欠失、付加、または化学的修飾がなされていても適用可能である。
本発明中の核酸を増幅する方法として、少なくとも一組のプライマーセットを用いる、ＲＴ－ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、などがあげられ特に限定するものではないが、一定温度でかつ約２０分間で実施可能なＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が好ましい。
ＴＲＣ法を用いた核酸を増幅する好適な態様として、（１）第二のプライマー（５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）が新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの特定塩基配列にハイブリダイズし、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する、（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を分解し１本鎖ＤＮＡを生成する、（３）第一のプライマーがハイブリダイズし、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列またはその相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する、（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する、工程があげられる。
さらに本発明中のインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ存在下で前記核酸増幅工程を実施すると、核酸増幅工程と検出工程を同時に実施することが可能で、ＲＮＡ転写産物量に相応する蛍光強度をリアルタイムにモニタリングすることができる。
なお、前記ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記３活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。
前記態様による新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの特定塩基配列検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマーおよびプローブの長さが１５から２５塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で一定の反応温度を設定することができる。
前記態様により新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの特定塩基配列を、最適かされた条件において、核酸増幅および測定をあわせて２０分以内に判定することが可能である。
前記態様による新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの特定塩基配列検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを含む新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ検出用試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な一定温度の温調ブロックに載置することで、自動的に新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡを増幅し検出することができることから、自動化に適した方法であるといえ、操作の簡便化、迅速化に有用である。
本発明中の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出するための試薬とは、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットを含んでなるが、好適な態様としては、該プライマーセット、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、基質、バッファー、塩類、などを含んでなる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１：インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
配列番号２４もしくは配列番号２５からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号２４においては５’末端から８番目のチミンに、配列番号２５においては５’末端から１２番目のチミンにリンカーを介してチアゾールオレンジを標識したインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチド（以下、プローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
実施例２：新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびプローブの組み合わせを用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例１で作製したプローブである。
（１）新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡとしては、市販のコントロール試薬（ｖｉｒｃｅｌｌ社、ＡＭＰＬＩＲＵＮ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ）を使用した（以下、標準ＲＮＡ）。コントロールＲＮＡは、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて３０コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．４μＭ 第一のプライマー
０．４μＭ 第二のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２４）を付加したもの）
１０ｎＭ プローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
９．０Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．４μＭ 第一のプライマー
０．４μＭ 第二のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２４）を付加したもの）
１０ｎＭ プローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
９．０Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後に、自動遺伝子検査装置 ＴＲＣＲｅａｄｙ－８０（東ソー社製）により、前記ＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
９．００％ ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ 塩化マグネシウム
１３７ｍＭ 塩化カリウム
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
９．００％ ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ 塩化マグネシウム
１３７ｍＭ 塩化カリウム
（４）引き続いて、前記反応チューブを自動遺伝子検査装置 ＴＲＣＲｅａｄｙ－８０（東ソー社製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．６を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１に示す。試験は、各々の組合せごとに２回数実施した。「ＮＤ」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．６以下（陰性判定）であったことを意味する。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組合せ（セット１からセット１４）のいずれもが３０コピー／ｔｅｓｔの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを２０分以内に検出した。特に、セット１からセット１３は１０分以内に検出されており、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組合せといえる。なお、セット１４は、同遺伝子領域で設計された本発明適用外の組合せである。
実施例３：新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用オリゴヌクレオチドの唾液スパイク試料による検討
表２および表３に示した、第一のプライマー、第二のプライマーおよびプローブの組合せを用いて、以下に示す方法で、唾液検体を想定したマトリックスの影響を評価した。なお表に記載のプローブは実施例１で作製したプローブである。
（１）新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）陰性の唾液検体を遠心し、上清をＰＢＳで２倍希釈した試料２００μＬを用いた。核酸精製はＴＲＣＲ核酸精製キット（東ソー社製）を用いて実施した。前記試料２００μＬをＴＲＣＲ核酸精製キット（東ソー社製）の変性試薬に添加、撹拌後、前記標準ＲＮＡを、（ｉ）３０００コピー添加、（ｉｉ）１０００コピー添加し、自動遺伝子検査装置 ＴＲＣＲｅａｄｙ－８０（東ソー社製）にて核酸精製を行って４５μＬの核酸精製物を得、このうちの１５μＬをＲＮＡ試料として用いた。
（２）～（４）の操作は、前記実施例２と同様に実施した。
（ｉ）３０００コピー添加（１０００コピー／テストに相当）の結果を表２、（ｉｉ）１０００コピー添加（３３３コピー／テストに相当）の結果を表２に示した。開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．６を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１に示す。試験は、各々の組合せごとに２回数実施した。「ＮＤ」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．６以下（陰性判定）であったことを意味する
唾液スパイク試料を用いた新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの検出性能結果（表２、表３）から、セット１からセット１３、セット１６からセット２１のオリゴヌクレオチドの組合せでは少なくとも１０００コピー／ｔｅｓｔの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを２０分以内に検出可能であることが示された。これらのオリゴヌクレオチド組合せは唾液検体マトリックスの影響を受けにくい組合せであることが示唆された。特に、第一のプライマー（配列番号１３）と第二のプライマー（配列番号２２）の組合せからなるセット１１およびセット２１は３３３コピー／ｔｅｓｔの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを１０分以内に検出しており、唾液を検体として想定した場合も迅速に検出可能な組合せであることが示唆された。なお、セット１４、セット１５、セット２２は、同遺伝子領域で設計された本発明適用外の組合せであるが、唾液検体に適用する場合にはマトリックスの影響を受ける可能性が考えられた。唾液に由来する影響因子としては、タンパク成分や多糖など種々な物質が考えられるが、一つの可能性としては唾液中に混在する核酸成分が考えられ、当該核酸成分とプライマーが相互作用することで反応が阻害されると推測される。したがって、前記、セット１からセット１３、セット１６からセット２１の組合せは前記影響因子との相互作用が小さいと考えられる。
本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、検出時間が１０分以内であった組合せのうちからセット１１を用いて、他のコロナウイルスＲＮＡの交差反応性評価（表３）を実施した。
ＲＮＡ試料以外は実施例１に従って実施した。
交差反応性の結果を表４示した。試験は３回数実施した。「ＮＤ」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．６以下（陰性判定）であったことを意味する。２００３年型ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ、コロナウイルス（２２９Ｅ、ＯＣ４３）を検出せず、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対して高い特異性を有しており、本実施例で検討したプライマーの組み合わせは、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の有するＲＮＡを特異的に検出可能であることが示された。
Claims (8)
- 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法であって、
（ｉ）少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットにより特定塩基配列からなる核酸を増幅する工程、
（ｉｉ）増幅された核酸を検出可能な標識で標識された核酸プローブで検出する工程、からなり、
前記第一のプライマーが配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなることを特徴とする新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。 - 前記第一のプライマーが配列番号１に記載の塩基配列の連続した２０塩基からなり、前記第二のプライマーが配列番号２の連続した２０塩基～２５塩基からなることを特徴とする請求項１に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
- 前記第一のプライマーが配列番号３～配列番号１５のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなり、前記第二のプライマーが配列番号１６～配列番号２２のいずれかに記載の塩基配列から選ばれてなることを特徴とする請求項２に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
- 前記標識された核酸プローブが、蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されてなることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
- 前記蛍光色素がインターカレーター性蛍光色素であることを特徴とする請求項４に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
- 前記標識された核酸プローブが、配列番号２３に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１７塩基以上の配列からなることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。
- 前記核酸を増幅する工程が、
（ｉ）前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーは、少なくとも一方の５’末端にＲＮＡポリメラーゼの転写が開始可能なプロモーター配列が付加されてなり、
（ｉｉ）少なくとも、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーからなるプライマーセット、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、により転写可能なプロモーター領域を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼによって前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする転写反応を行うことで特定塩基配列もしくはその相補配列からなるＲＮＡを生産し、
（ｉｖ）該ＲＮＡが（ｉｉ）の２本鎖ＤＮＡを生成するための鋳型となって、（ｉｉ）～（ｉｉｉ）が繰り返し進行する、
ことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出する方法。 - 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を、少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーセットにより特定塩基配列からなる核酸を増幅する工程、増幅された核酸を検出可能な標識で標識された核酸プローブで検出する工程、からなる検出工程を実施するための試薬であって、少なくとも、配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなる第一のプライマー、配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した２０塩基以上の配列からなる第二のプライマー、を含むことを特徴とする新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ中の特定塩基配列を検出するための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021011070A JP2022114682A (ja) | 2021-01-27 | 2021-01-27 | 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを検出する方法及び試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021011070A JP2022114682A (ja) | 2021-01-27 | 2021-01-27 | 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを検出する方法及び試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022114682A true JP2022114682A (ja) | 2022-08-08 |
Family
ID=82747139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021011070A Pending JP2022114682A (ja) | 2021-01-27 | 2021-01-27 | 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを検出する方法及び試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2022114682A (ja) |
-
2021
- 2021-01-27 JP JP2021011070A patent/JP2022114682A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4773513B2 (ja) | Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルスの核酸を検出するための組成物及びアッセイ | |
| CN111004870B (zh) | 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒 | |
| JP3689333B2 (ja) | Ｈｉｖ−１の全てのサブタイプを増幅及び検出するためにプライマー及びプローブとして使用できる核酸配列 | |
| WO2017212904A1 (ja) | 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法 | |
| US20050202414A1 (en) | Apparatus and methods for detecting a microbe in a sample | |
| US20090117537A1 (en) | Method for detecting sars coronavirus | |
| JP2023516472A (ja) | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法 | |
| JP7313537B2 (ja) | コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法 | |
| CN111321253A (zh) | 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法 | |
| KR20200050872A (ko) | 인플루엔자 a 바이러스 및 인플루엔자 b 바이러스 검출 방법 | |
| JP5754100B2 (ja) | エンテロウイルス７１ｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| CN113652505A (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| JP4913042B2 (ja) | Ｈｉｖタイプおよびサブタイプの検出 | |
| JP2018078806A (ja) | ノロウイルスｒｎａの検出方法 | |
| JP6733215B2 (ja) | プライマー及びマイコプラズマ・ニューモニエの検出方法 | |
| WO2021193853A1 (ja) | 新型コロナウイルスの検査方法および検査試薬 | |
| JP2022114682A (ja) | 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを検出する方法及び試薬 | |
| US20060228698A1 (en) | Oligonucleotide for detection of HIV-1 and detection method | |
| JP2011078389A (ja) | サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| CN112111603A (zh) | 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法 | |
| JP2022017961A (ja) | コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法 | |
| KR102435209B1 (ko) | 인플루엔자 a형 및 b형 바이러스와 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스를 구별하여 동시에 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| JP7472476B2 (ja) | プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 | |
| JP4701532B2 (ja) | Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法 | |
| US20240124947A1 (en) | Compositions for coronavirus detection and methods of making and using therof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231214 |