JP2022017961A - コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料中に存在する２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を特異的に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい検出方法を提供する。【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する核酸またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、特定の配列からなる塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなることを特徴とする２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用オリゴヌクレオチドを用いて検出する。【選択図】なし
Description
本発明は、試料中に含まれる２０１９年新型コロナウイルス（以後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とする）を迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法に関する。
新型コロナウイルス感染症（以後、ＣＯＶＩＤ－１９とする）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を原因ウイルスとし、２０１９年、中華人民共和国湖北省武漢市において確認された。世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＣＯＶＩＤ－１９について、「国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）」を宣言した。その後、世界的な感染拡大の状況、重症度等から２０２０年３月１１日ＣＯＶＩＤ－１９をパンデミック（世界的な大流行）とみなせると表明した。
コロナウイルス科は、直径８０～１６０ｎｍのエンベロープを有するプラス鎖１本鎖ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）ウイルスであり、人の他、イヌ、ブタ、ウシならびにラクダ等種々の動物に感染する。遺伝学的特徴からα、β、γならびにδの属に分類される。ヒトに主に風邪症候群を起こすウイルスとして、αコロナウイルス属の２２９Ｅ株、ＮＬ６３株、βコロナウイルス属のＯＣ４３株、ＨＫＵ１株がある。これら４種のウイルスが風邪の原因の１０～１５％（流行期３５％）を占める。これらに加え、２００３年にはＳＡＲＳ（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）コロナウイルスが、２０１２年にはＭＥＲＳ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）コロナウイルスが同定されているが、この２つは、いずれもヒトに肺炎を主とする重篤な感染症を引き起こし、その致死率は前者が約１０％、後者が３０％以上と非常に高い（非特許文献１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳと同じβコロナウイルスに属する。全塩基解析と系統樹解析により、ＳＡＲＳコロナウイルスとは７５～８０％の相同性、コウモリのコロナウイルスとは８５～８８％の相同性が認められている。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコウモリのウイルス由来であると考えられている。
初期症状は軽症で、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、食欲不振、筋肉痛、呼吸困難、喀痰ならびに咽頭痛等がみられるほか、嗅覚・味覚障害が生じることがあり、重症化すると肺炎を発症する。通常、初期症状は５～７日間程度続き、重症化しなければ次第に治っていく。
重症化すると呼吸困難に陥る。肺炎以外にも、上気道炎や気管支炎など、その他の呼吸器系器官への炎症が認められる場合もある。重症型の肺炎が生じても、症状に対する治療を行うことで徐々に回復するが、悪化し重篤化すると、急性呼吸器症候群（ＡＲＤＳ）や敗血症性ショック、多臓器不全などが起こり、場合によっては死に至るケースもある。
通常のウイルス感染症では、他者に感染させる可能性が最も高いのは、症状が強く表れる時期であるが、新型コロナウイルスの感染者は、無症状の場合、軽症の段階、重症化した段階それぞれで感染する可能性があると考えられている。特に無症状でありながらウイルスに感染し、他者への感染力を有する無症状性病原体保有者の特定は、感染を拡大させないこと、院内感染を防ぐのに最も重要なことである。また、無症状者の特定を行うためには、大規模なスクリーニング検査が有効とされ、十分な処理能力を持ち、かつ高感度である検査法が必要である。
高感度検査方法としては、ウイルスの核酸を増幅し検出する遺伝子検査法が挙げられる。しかしながら、検体からウイルス由来の核酸を抽出する工程が煩雑であり、信頼できる結果を得るには作業実施者の練度がある程度必要となる。また、結果を得るのに時間が掛かり、迅速性に欠く一方、抗原抗体検査法は、簡便で処理能力が高く、高い迅速性を有する特徴があるが、感度が遺伝子検査に比べ高くなく、偽陰性となる可能性がある。
本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の増幅対象核酸は、他のコロナウイルスとの間で塩基配列の相同性が高いため、その遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。特に２００３年に流行したコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）との識別が困難であった。比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はより困難なものであった。
Ｗａｎｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ： Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ ｃｏｎｃｅｒｎ． Ｌａｎｃｅｔ ３９５： ４７０－４７３， ２０２０． ｄｏｉ： １０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０１８５－９．
本発明の目的は、試料中に存在する新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する核酸を高感度、迅速に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい特異的なオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなることを特徴とする２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用オリゴヌクレオチド。
（２）前記（１）オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）前記（２）オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
（２）前記（１）オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）前記（２）オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
（４）２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法であって（１）に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、検出方法。
（５）前記（２）に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする（４）に記載の検出方法。
（６）前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする（５）に記載の検出方法。
（７）一組のプライマーセットを用いることを特徴とする（４）～（６）のいずれかに記載の検出方法。
（８）前記一組のプライマーセットが、配列番号６に記載の塩基配列もしくはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなる第一のプライマー、および配列番号１３に記載の塩基配列もしくはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなる第二のプライマー、からなることを特徴とする（７）に記載の検出方法。
（９）前記第一のプライマーが、配列番号６に記載の塩基配列もしくはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなり、かつ第二のプライマーが配列番号１３に記載の塩基配列もしくはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなることを特徴とする（８）に記載の検出方法。
（５）前記（２）に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする（４）に記載の検出方法。
（６）前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする（５）に記載の検出方法。
（７）一組のプライマーセットを用いることを特徴とする（４）～（６）のいずれかに記載の検出方法。
（８）前記一組のプライマーセットが、配列番号６に記載の塩基配列もしくはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなる第一のプライマー、および配列番号１３に記載の塩基配列もしくはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなる第二のプライマー、からなることを特徴とする（７）に記載の検出方法。
（９）前記第一のプライマーが、配列番号６に記載の塩基配列もしくはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなり、かつ第二のプライマーが配列番号１３に記載の塩基配列もしくはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなることを特徴とする（８）に記載の検出方法。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡに特異的な配列およびその相補配列の一部にハイブリダイズすることより、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列またはその相補配列を特異的に検出させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを用いた新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法は、試料中に含まれる新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を迅速、高感度に検出でき、かつ他のコロナウイルス種を検出しないなど、偽陽性の発生も極めて少なく特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による症状の早期改善に寄与するものと考えられる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明中において試料とは、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、胸水、血液、尿、便などがあげられる。
本発明のオリゴヌクレオチドを用いた新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの核酸塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの一例として、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列またはその相補配列を含む核酸の一部と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドがある。前記オリゴヌクレオチドは新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列（またはその相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドとして、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列またはその相補配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズ可能であって、配列番号１に記載の塩基配列中、少なくとも１０塩基からなる連続する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドを上げることができる。より好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２１２番目から２９２２８番目までの塩基配列）またはその相補配列とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２１６番目から２９２３５番目までの塩基配列）またはその相補配列とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２２８番目から２９２４５番目までの塩基配列）またはその相補配列とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２３９番目から２９２５８番目までの塩基配列）またはその相補配列とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。
本発明におけるオリゴヌクレオチドとその相補配列のハイブリダイズ条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、当該条件下で、前記の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、第一及び第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列と比較して置換、欠失、付加、修飾があってもよい。第一及び第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。
本発明は、試料中に含まれる新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列の５’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１３５番目から２９２０６番目までの塩基配列）と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また試料中に含まれる新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列の３’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号１３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２８０番目から２９３９６番目までの塩基配列）と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。
その中でも第一のプライマー及び第二のプライマーが１５～３０塩基からなることが好ましい。
第一のプライマーの一例として、配列番号６に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１５～３０塩基であるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１３５番目から２９１５４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１４２番目から２９１６１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１５５番目から２９１７４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１６６番目から２９１８５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１７９番目から２９１９６番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９１８７番目から２９２０６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
第ニのプライマーの一例として、配列番号１３に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２８０番目から２９２９９番目までの塩基配列）および配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２９５番目から２９３１０番目までの塩基配列）、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９３０７番目から２９３２６番目までの塩基配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９３２４番目から２９３４２番目までの塩基配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９３４０番目から２９３５９番目までの塩基配列）、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９３５９番目から２９３８１番目までの塩基配列）、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９３６５番目から２９３８７番目までの塩基配列）および配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９３７３番目から２９３９６番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
中でも新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号７、８、９、１０、１１、１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号８と２０、１０と２０、１０と１４、１０と１７、１０と１９、１０と２１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが更に好ましい。
本発明のプライマーセットは、ＲＴ－ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの塩基配列またはその相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した塩基配列またはその相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１３～２３に記載の塩基配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーが新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号６～１２に記載の塩基配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、当該増幅領域の塩基配列またはその相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号１またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡまたはその相補的な配列に対し、ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号６～１２に記載の塩基配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、当該増幅領域の塩基配列またはその相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号１またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡまたはその相補的な配列に対し、ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。
前述した態様による新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１５から２０塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。
前述した態様による新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。
前述した態様による新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡの検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを含む新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡ検出用試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的に新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号２～４記載の塩基配列からなるものが好ましい。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２１２番目から２９２２８番目までの塩基配列）またはその相補配列、配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２１６番目から２９２３５番目までの塩基配列）またはその相補配列、配列番号４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２２８番目から２９２４５番目までの塩基配列）またはその相補配列、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．１の２９２３９番目から２９２５８番目までの塩基配列）またはその相補配列、からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号２においては５’末端から１２番目のチミンに、配列番号３においては５’末端から８番目のチミンに、配列番号４においては５’末端から８番目のシトシンに、配列番号５においては、５’末端から５番目のシトシンに、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
実施例２ 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例１で作製したプローブである。
（１）新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が有するＲＮＡとしては、市販のコントロール試薬（ｖｉｒｃｅｌｌ社、ＡＭＰＬＩＲＵＮ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ）を使用した。コントロールＲＮＡは、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．４μＭ 第一のプライマー
０．４μＭ 第二のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２４）を付加したもの）
１０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
９．０Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．４μＭ 第一のプライマー
０．４μＭ 第二のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号２４）を付加したもの）
１０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
９．０Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
９．００％ ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ 塩化マグネシウム
１３７ｍＭ 塩化カリウム
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
９．００％ ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ 塩化マグネシウム
１３７ｍＭ 塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．５を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１、２及び３に示す。実験は、各々の組合せごとに２回数測定し、その平均値を使用した。「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．５以下（陰性判定）であったことを意味する。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（ｓｅｔ１からｓｅｔ２１）のうち、ｓｅｔ１０～１３、ｓｅｔ１５、ｓｅｔ１８を除く、いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを２０分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせｓｅｔ１～３、ｓｅｔ５～８、ｓｅｔ１４、ｓｅｔ１７、２０は１０００コピー／ｔｅｓｔの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを平均で１０分以内に検出しており、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、検出時間が１０分以内であった組合せのうちからｓｅｔ２及びｓｅｔ６を用いて、測定感度評価（表２）及び他のコロナウイルスＲＮＡの交差反応性評価（表３）を実施した。
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの測定感度ついては、３０コピー／ｔｅｓｔの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＲＮＡを検出し、交差反応性については、２００３年型ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ、コロナウイルス（２２９Ｅ、ＯＣ４３）を検出せず、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対して高い特異性を有しており、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の有するＲＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
Claims (9)
- 配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなることを特徴とする２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
- ２０１９年新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、検出方法。
- 請求項２に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項５に記載の検出方法。
- 一組のプライマーセットを用いることを特徴とする請求項４～６のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記一組のプライマーセットが、配列番号６に記載の塩基配列もしくはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなる第一のプライマー、および配列番号１３に記載の塩基配列もしくはその相補配列から選択される連続した１０塩基以上の配列からなる第二のプライマー、からなることを特徴とする請求項７に記載の検出方法。
- 前記第一のプライマーが、配列番号６に記載の塩基配列もしくはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなり、かつ第二のプライマーが配列番号１３に記載の塩基配列もしくはその相補配列中、連続する１５～３０塩基からなることを特徴とする請求項８に記載の検出方法。
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