JP2008501328A - Ｈｉｖタイプおよびサブタイプの検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、増幅およびＰＣＲを基にした方法によるＨＩＶの検出に関する。

Description

本発明は、ＨＩＶおよびＨＩＶサブタイプの分野に関する。より正確には、本発明は、ＨＩＶタイプおよびサブタイプの検出、特に、ＨＩＶタイプおよびサブタイプのマルチプレックス検出に関する。

ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であり、ヒトレトロウイルス科に属するウイルスである。現在、ＡＩＤＳは、ヒトの健康に対して最も大きな脅威の一つとみなされている。ＨＩＶ感染個体は、何年も無症候でいながら疾患を伝達させうる。

推測されるＡＩＤＳを担う病原体は、１９８３〜１９８４年に幾つかの研究グループ（例えば、Barre-Sinoussiら、Science 220:868-871；Montagnierら、Human T-Cell Leukemia Viruses（Gallo, Essex & Gross編）；Vilmerら、The Lancet 1:753を参照）によって別個に同定され、続いてＨＩＶの名称に統一された。

ＨＩＶ科には、数種のタイプおよびサブタイプが含まれる。ＨＩＶ１ウイルスは、サブタイプによって分類することができる。ＨＩＶ１サブタイプの例には、ＨＩＶ１−ＭおよびＨＩＶ１−Ｏが含まれる。同様に、ＨＩＶ２ウイルスには、様々なサブタイプ、例えばＨＩＶ２−ＡやＨＩＶ２−Ｂが含まれる。

薬物開発アッセイ、予防法、およびＡＩＤＳ治療に向けて、現在、所与の試料中に存在するＨＩＶウイルスのグループ、タイプ、およびサブタイプを迅速容易に同定し数量化できることが非常に重要になってきた。

本明細書において本発明者らは、ＨＩＶグループとは、それが優先権主張日に公知であるか否かに関わりなく、任意のＨＩＶグループであると解釈する。様々なＨＩＶグループが当技術分野で公知であり、その対応する文献およびデータベース、例えば、インターネット上のｎｃｂｉに記載されている。その例にはＨＩＶ１−ＭやＨＩＶ１−Ｏが含まれる。

本明細書において本発明者らは、ＨＩＶサブタイプとは、それが優先権主張日に公知であるか否かに関わりなく、任意のＨＩＶサブタイプであると解釈する。様々なＨＩＶサブタイプが、当技術分野で公知であり、その対応する文献およびデータベース、例えば、インターネット上のｎｃｂｉに記載されている。

ＨＩＶ分離体とは、それが優先権主張日に公知であるか否かに関わりなく、本発明者らは本明細書において任意のＨＩＶ分離体または株であると解釈する。様々なＨＩＶ分離体が、当技術分野で公知であり、その対応する文献およびデータベース、例えば、インターネット上のｎｃｂｉに記載されている。幾つかの分離体は基準とみなされる。その例にはＫ０３４５５、Ｌ２０５８７、およびＭ３０５０２が含まれる。

可能な手法は、特異的抗体の開発に依存していた。しかし、感受性および特異性の点から、通常、ＰＣＲを基にした手法が非常に有望に思われる。また、一般的に、この手法によって小さな試料について研究できるようなる。

増幅法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰＣＲに基づく方法、例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＰＣＲが当技術分野では公知である（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch, およびSambrook, CSHL Press；Molecular Biology of the Cell, Albertsら； PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach および Dveksler, CSHL Press；The Polymerase Chain Reaction, Mullis, Ferre, および Gibbs, Birkhauser Boston Press；Gene quantification, Ferre, Birkhauser Boston Press.）

こうした方法は、一般に、複合的な生物試料の定性および定量分析に非常に有効なツールである。

しかし、これらの技術の有効性は、典型的および決定的にプライマーの設計および選択に依存している。

ＨＩＶ１特異的プライマーについて記述する従来技術がある（米国特許第５７１２３８５号、欧州特許第１０４３４０７号、国際公開公報第０３／０２０８７８号、欧州特許第１３４４８３７号）。ＨＩＶ２特異的プライマーについて記述する従来技術もある（米国特許第５９６２６６５号）。

作業条件に応じて、これらの従来技術のプライマーの少なくとも幾つかは、十分なＨＩＶ１またはＨＩＶ２特異性を示すことができ、それによってＨＩＶ１およびＨＩＶ２を特異的に検出できるようにする。しかし、本出願人の知るところでは、これらのプライマーのどれによっても
− 前記サブタイプをリアルタイムで定量的特異的に検出すること、または
− 特異性を残したままで該サブタイプをマルチプレックス（multiplex）で検出すること、または
− リアルタイムで実行した場合でさえも、定量的でありながら該サブタイプをマルチプレックスで検出すること
は可能ではない。

しかし、そのようにリアルタイムで定量的マルチプレックス特異的に検出することは、患者の実際の感染段階に対し、より確実かつ有益なはずである。従って、より正確な診断が利用可能になり、その結果、所与の処置の有害な作用に対して、より正確に正のバ実施スが取れるようになるはずである。それによって、診断する特定の患者に対し最も有効となる処置を調整し、または選択できるようになるであろう。

そのようなリアルタイムでの定量的マルチプレックス特異的検出は、特に大規模な場合、実施にはより迅速、より容易であるという利点もある。

発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶを検出するための方法を提供する。

本発明は、ＨＩＶの検出に適しているプライマーとプローブ、およびそのセットを含むオリゴヌクレオチドを提供する。

この点で、本発明は、増幅、ＰＣＲおよびＰＣＲを基にした方法、ならびに診断の分野にも関する。

本明細書において本発明者らは、ＰＣＲまたはＰＣＲ反応とは任意のＰＣＲを基にした方法であると解釈する。この方法には、標準的ＰＣＲ、定性、定量、および半定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一およびマルチプレックスＰＣＲなどが含まれる。

本明細書において本発明者らは、リアルタイムＰＣＲとは、慣用のＰＣＲ法によるエンドポイント検出とは対照的に、各ＰＣＲサイクル中に、単位複製配列の生成の指標として反応中に発せられる蛍光をモニタリングできるようにする、任意のＰＣＲを基にした方法であると解釈する。

本明細書において本発明者らは、定量ＰＣＲとは、所与の試料中の所与のＰＣＲ標的の初期量を予測できるようにする任意のＰＣＲを基にした方法であると解釈する。

本明細書において本発明者らは、マルチプレックスＰＣＲとは、一つを超える標的の増幅を目的とする任意のＰＣＲ反応、例えば、二重ＰＣＲ（２つの標的）、三重ＰＣＲ（３つの標的）、より多いマルチプレックスＰＣＲを含むマルチプレックスＰＣＲであると解釈する。マルチプレックスＰＣＲには、一つを超えるプライマー対、例えば、２つのプライマー対を用いたＰＣＲ反応が含まれる。その場合、異なる４つのプライマーであってもよいが、２つのプライマー対に、共通する一つのプライマー、例えば、フォワードプライマーを持たせることも、２つの異なるリバースプライマーを持たせることも可能である。マルチプレックスＰＣＲには、特有のプライマー対を用いるが、一つを超えるプローブを用いるＰＣＲ反応も含まれる。

本明細書において本発明者らは、オリゴヌクレオチドとは、任意の短いヌクレオチドポリマーであると解釈し、ここで、ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、縮重ヌクレオチドなどでありうる。前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖であることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドの長さは、様々であってよく、通常、１５０ヌクレオチド（ｎｔ）未満、好ましくは１０〜１００ｎｔ、より好ましくは１５〜６０ｎｔ、さらにいっそう好ましくは１８〜５０ｎｔの範囲であってよい。前記オリゴヌクレオチドは、タギング（tagging）やマーキングなどの化学的修飾を受けていてよく、例えば、放射性、蛍光、ビオチン化、ＤＩＧ標識されていてよい。本発明によるオリゴヌクレオチドは、フォワード（センス）またはリバース（アンチセンス）であってよい。さらに、本発明による幾つかのオリゴヌクレオチドに関係付けて好ましい機能を述べることもできるが、所与のオリゴヌクレオチドは数種の機能を有し、本発明による異なる方法で使用できることは明白であるということを強調すべきである。例えば、オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使用することができる。また、オリゴヌクレオチドが単位複製配列を標的とするプローブとして有用であると記載される場合、当業者は、このオリゴヌクレオチドの相補配列が同じ単位複製配列を標的にするためのプローブとして等しく有用であると解釈するものとする。また、マルチプレックスアッセイに適当ないずれのプライマーも、本発明の意味において、一重プロトコルで使用できることは明白である。同じことは、リアルタイムプロトコルに適当なプライマーについても当てはまり、このプライマーも本発明の意味におけるエンドポイントアッセイのフレームワーク内で使用することができる。

本発明によるオリゴヌクレオチドには、特に、ＰＣＲプライマーおよびプローブが含まれる。特に明記しない限り、核酸配列は５’から３’方向に向けて示される。前記オリゴヌクレオチドは、多くの形態にすることができ、例えば、乾燥状態、所望の溶媒および所望の濃度による溶液／懸濁液にすることもできる。どの溶媒、濃度、保存条件が本発明のオリゴヌクレオチドに適しているかについては、当業者は承知しているものとする。特に、当業者は、保存液として前記オリゴヌクレオチドを調製するための方法を承知しているものとする。本発明によるオリゴヌクレオチドは、当業者が、例えば、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって判断できるような様々な純度であってもよい。

本明細書において本発明者らは、オリゴヌクレオチドのセットとは、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、好ましくは少なくとも２つ、例えば、２〜１０のオリゴヌクレオチドを含む任意の組合せであると解釈する。従って、前記セットは、一つのＰＣＲプライマー、または一対のＰＣＲプライマー、または一つのプローブ、または一つのプローブと一対のプライマーを含むことができる。前記オリゴヌクレオチドは、別々にしておくことも、または部分的に混合し、または完全に混合することもできる。

プライマーまたはＰＣＲプライマーの概念は当業者には公知である。例えば、その概念には、適当なストリンジェンシー条件下で標的鋳型にアニールすることができ、ポリメラーゼ鎖を伸張することが可能な任意のオリゴヌクレオチドが含まれる。前記プライマーの典型的な長さは、１５〜３０ｎｔであり、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ｎｔが好ましい。

プローブの概念も当業者には公知である。例えば、その概念には、所望のハイブリッド形成条件下で標的鋳型にアニールできる任意のオリゴヌクレオチドが含まれる。前記プローブの典型的な長さは２０〜５５ｎｔであり、１５〜６０ｎｔが好ましく、２０〜５５ｎｔがより好ましく、３０〜５０ｎｔがより好ましく、３５〜４５ｎｔがさらに好ましい。該プローブは蛍光標識されているのが好ましい。しかし、ある条件下ではプライマーをプローブとして使用することができ、逆も同様であることは当業者には明白である。さらに、本発明による生成物、特にその中でもオリゴヌクレオチドは、本明細書で述べた所定の使用だけには限らず、示唆した目的に関わらず、むしろ広く解釈されることを本明細書において強調する。例えば、特定の用途のための生成物（オリゴヌクレオチド）に対する請求は、示した使用に実際に適当な生成物（オリゴヌクレオチド）を意味するものとして解釈すべきである。従って、マルチプレックスプロトコルにおいてプライマーとして使用するのに適当なオリゴヌクレオチドはまた、本発明の意味における単一プロトコルに明瞭に適応する。

Taqman（登録商標）プローブ（加水分解プローブ）、molecular beacons（登録商標）（ビーコンプローブまたは分子ビーコンプローブ）、およびScorpion（登録商標）プローブを含む様々な型式（型）のプローブが当技術分野で公知である。

好ましい態様では、本発明によるプローブは全て、分子ビーコン型式で合成し使用することができる。

分子ビーコンの構造は以下の通りである。すなわち、標的配列に無関係な短いヌクレオチド配列（いわゆるビーコンアーム）はプローブ両端に共有結合している。従って、短い無関係のアームはプローブの５’に結合し、そして蛍光部分（すなわち、蛍光色素または蛍光マーカー）によって標識される。別の、しかし同様に無関係のアームは、プローブの３’末端に結合し、蛍光消光部分によって標識される。従って、分子ビーコンは、フルオロフォアとクエンチャーを両端に有する。５’の短いアームは、３’のそれに完全に相補的であり、その結果、それらは一緒にアニールされ、それによって、溶液中の標的にハイブリッド形成されない場合はヘアピン構造を有しうる。このヘアピン高次構造において、クエンチャーおよび蛍光色素は、フルオロフォアを効率的に消光するのに十分なほど互いに近接している。しかし、プローブが標的分子に遭遇した場合、ビーコンアームＴｍおよびプローブＴｍの値が適切に選択されると、アニーリングはヘアピン高次構造に対して優勢になる（理論上：プローブＴｍ＞ビーコンアームＴｍ＞プライマーＴｍ、Ｔｍ＝対象の融解温度）。フルオロフォアおよびクエンチャーは、互いから遠ざかり、次いでフルオロフォアは適当な光励起により照射されると蛍光発光しうる。ＰＣＲが進行するにつれ、増幅生成物は蓄積し、任意の所与のサイクルでの蛍光量は、その時に存在する増幅生成物の量に依存する。（参照、例えば、Sanjay TyagiおよびFred Russell Kramer、 Nature Biotechnology 1996, volume 14, pages 303-308；Nature Biotechnology 1998, volume 16, pages 49-53）。

（注：フルオロフォアを３’末端に結合させ、クエンチャーを５’末端に結合させることもできる）

概略的に、前記プローブを次式（分子ビーコン型式）
５’フルオロフォア−（アーム１）−プローブ−（アーム２）−クエンチャー３’
５’クエンチャー−（アーム１）−プローブ−（アーム２）−フルオロフォア３’
で示すことができる、
ここで、アーム１およびアーム２は、適当なストリンジェンシー条件下でヘアピン構造を形成するような、例えば、３〜１０ｎｔ、好ましくは５、６、７ｎｔ範囲の任意の短いヌクレオチド配列であってよく、すなわち、アーム１およびアーム２は所望のストリンジェンシー条件下でアニールするのに完全に相補的である（標準的ＰＣＲストリンジェンシー条件には、例えば、アニーリング温度５５〜６５°ＣおよびＭｇ濃度４〜８ｍＭが含まれる）。しかし、アーム１およびアーム２は、プローブの標的配列に無関係であり、すなわち、ハイブリッド形成がなかった場合、アーム１とアーム２間のアニーリングから得られたヘアピン高次構造は、プローブに対して本質的に唯一可能な二次構造である。当業者は、所与のプローブに対するそのようなアームの選択方法を承知しているものとする。

例えば、可能なビーコン型式には

が含まれる。

本明細書において、フルオロフォアとは当技術分野で公知の任意の蛍光マーカー／色素と解釈される。そのような適当な蛍光マーカーの例にはＦａｍ、Ｈｅｘ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｒｏｘ、Ｔａｍｒａ、Ｍａｘ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｙ色素、例えば、Ｃｙ５、フルオレセイン、クマリン、エオシン、ローダミン、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ、カスケードブルー、Yakima Yellow、ルシファーイエロー、テキサスレッド（これら全ては登録商標）がある。

本明細書において本発明者らは、クエンチャーとは、当技術分野で公知の任意のクエンチャーであると解釈する。そのようなクエンチャーの例には、Ｄａｂｃｙｌ、Dark Quencher、Eclipse Dark Quencher、ElleQuencher、Ｔａｍｒａ、ＢＨＱ、ＱＳＹ（それらの全ては登録商標）がある。

プローブを設計する場合、どの色素／クエンチャーの組合せが適当であるか、当業者は承知しているものとする。

本発明によれば好ましい態様では、前記プローブのスペクトル特性は、互いに干渉しないように選択することができる。特に、マルチプレックスでプローブを使用する場合、各単一プローブには、互いにスペクトルが著しく異なる、すなわち吸収／発光スペクトルが本質的に重なり合わないそれ自体のフルオロフォアを含めることができる。これにより、個々のシグナルが検出時に互いに干渉し合わないのを確実にし、全ての単一プローブを有利に低ノイズでマルチプレックス検出できるようになる。マルチプレックス法において一緒に使用できる色素の例には、ＦａｍとＴａｍｒａ、ＦａｍとＴａｍｒａとテキサスレッドが含まれる。

本発明によれば、得られたオリゴヌクレオチドは全て、別々にしておくことも、または部分的に混合し、または完全に混合することもできる。

前記オリゴヌクレオチドは、当業者の判断次第で、乾燥形態で、または適当な溶媒に溶解して提供することができる。適当な溶媒には、ＴＥ、ＰＣＲ等級水などがある。

以後、配列番号によって配列を同定する。

対応する配列は、本明細書に添付した図中の表に示す。前記表では、縮重ヌクレオチドの標準コードが使用されている。特に、Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｗ＝ＡまたはＴである。

所与の配列において、数個の位置が縮重している箇所では、各縮重位置を互いに独立して選択できることは当業者には明白である。例えば、ＲＹはＧＣ、ＧＴ、ＡＣ、ＡＴ、それらの組合せおよび混合物であってよい。従って、配列番号５２は、配列番号２５〜５１（表を参照）、またはそれらの組合せもしくは混合物などのどれか一つでよい。

さらに、前記表中、ｄは縮重したオリゴヌクレオチドを示し、ｅは伸張したオリゴヌクレオチド（すなわち、別のオリゴヌクレオチドの延長形）を示し、ｌはループオリゴヌクレオチドを示す。

本明細書において本発明者らは、ループオリゴヌクレオチドとは、任意のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補するように、数個のヌクレオチド（一般的に、３、４、５、６、または７ｎｔ）を加えることによって５’末端を改変した任意のオリゴヌクレオチドであると解釈する。それによって、前記ループオリゴヌクレオチドは、所与のストリンジェンシー条件下で、ループ高次構造をとることができるという有利な特徴を有する。この特徴は、ＰＣＲプロトコル、特に、マルチプレックスプロトコルにおいて、プライマー同士間、またはプライマーとプローブとの間における相互作用を回避することによって、特異性および感受性を増加させる際に極めて有利である。

本発明は、ＨＩＶを検出する方法を提供する。

一局面では、本発明は、少なくとも一つのＨＩＶ標的を検出する方法であって、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドによって、少なくとも一つの単位複製配列を生成するステップを含み、
該オリゴヌクレオチドが、
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）；および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４２８１〜４４２９（配列番号３０６）、４２８３〜４４２９（配列番号３０７）、４２８３〜４４３１（配列番号３０８）から選択される配列番号２のフラグメント；
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４３３６〜４４８４（配列番号３１０）、４４３８〜４４８４（配列番号３１１）から選択される配列番号４のフラグメント；
− Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）；
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４１７６〜４４３６（配列番号１）、および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４１７６〜４４２９（配列番号３０５）と同一である、配列番号１のフラグメント；ならびに
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４２３１〜４４８４（配列番号３０９）と同一である、配列番号３のフラグメント；
からなる群から選択される少なくとも一つの基準鋳型配列の特異的増幅で使用するのに適当である方法を提供する。

従って、基準鋳型配列は、決定したＨＩＶ分離体の単離したフラグメントに対応する（すなわち、指摘した位置から伸張する配列と同一であるフラグメント）。従って、少なくとも前記基準鋳型配列の特異的増幅で使用するのに適当なオリゴヌクレオチドは、この基準鋳型配列を標的とするために、単離したフラグメントの形状で、この基準鋳型配列を増幅するような位置内で選択される。

別の局面では、本発明は、少なくとも一つのＨＩＶ標的を検出する方法であって、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドによって、少なくとも一つの単位複製配列を生成するステップ
ここで、前記オリゴヌクレオチドは、
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）；および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４２８１〜４４２９、４２８３〜４４２９、４２８３〜４４３１から選択される配列番号２のフラグメント（配列番号３０６、３０７、および３０８）；
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４３３６〜４４８４、４４３８〜４４８４から選択される配列番号４のフラグメント（配列番号３１０および３１１）；
− Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）；
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４１７６〜４４３６（配列番号１）、および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４１７６〜４４２９（配列番号３０５）と同一である、配列番号１のフラグメント；ならびに
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４２３１〜４４８４（配列番号３０９）と同一である、配列番号３のフラグメント；
からなる群から選択される少なくとも一つの基準鋳型配列の特異的増幅で使用するのに適当な「定量に配慮されている」かつ／または「マルチプレックス法に配慮されている」プライマーである、
を含む方法を提供する。

別の局面では、本発明は、少なくとも一つのＨＩＶ標的を検出する方法であって、
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）；および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４２８１〜４４２９、４２８３〜４４２９、４２８３〜４４３１から選択される配列番号２のフラグメント；
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４３３６〜４４８４、４４３８〜４４８４から選択される配列番号４のフラグメント；
− Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）；
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４１７６〜４４３６（配列番号１）、および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４１７６〜４４２９と同一である、配列番号１のフラグメント；ならびに
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４２３１〜４４８４と同一である、配列番号３のフラグメント；
からなる群から選択される少なくとも一つの基準鋳型配列を増幅するステップを含む方法を提供する。

好ましい態様では、前記方法は少なくとも一つのプローブによって該単位複製配列を検出するステップを含む。

用語、単位複製配列は、当業者には公知である。本明細書において本発明者らは、単位複製配列とは、任意の増幅生成物であると解釈する。

増幅は当技術分野では公知であり、少なくとも一回の増幅ステップ、特に、少なくとも一回のＰＣＲまたはＰＣＲを基にした増幅ステップが関与する任意の方法でありうる。

本明細書において本発明者らは、「マルチプレックス法に配慮されている（multiplex-friendly）」オリゴヌクレオチドとは、マルチプレックス（ＰＣＲ）プロトコルで首尾よく使用することができる任意のオリゴヌクレオチドであると解釈する。特に、「マルチプレックス法に配慮されている」オリゴヌクレオチドによって、マルチプレックスプロトコルで特異的かつ高感度な結果が得られる。

本明細書において本発明者らは、「定量に配慮されている（quantitative friendly）」オリゴヌクレオチドとは、定量（ＰＣＲ）プロトコルで首尾よく使用することができる任意のオリゴヌクレオチドであると解釈する。特に、「定量に配慮されている」オリゴヌクレオチドによって、特異的、高感度、かつ定量的結果が得られる。

本明細書では、別の配列に相補的な配列は、前記他の配列に、その配列の全長にわたって相補的な配列を意味する。

本発明による方法は、マルチプレックスプロトコルの枠組み内で有利に実施することができるが、単一プロトコル、例えば、単一エンドポイントプロトコルまたは定性プロトコルとしても実施できることは明白である。

本明細書において本発明者らは、基準鋳型配列とは、整列化の基準として使用することができる任意の鋳型配列であると解釈する。例えば、数個のゲノムを基準ゲノムとみなす。配列の整列化は当技術分野で公知である。

有利には本発明によれば、配列番号１〜５および上記したそのフラグメントは、ＨＩＶ１−Ｍ、ＨＩＶ１−Ｏ、ＨＩＶ２−Ａ、およびＨＩＶ２−Ｂのサブタイプの少なくとも一つの定量的検出ができるようにするプライマーを構築および生成するのに適した基準であるという特異的技術的特徴を共有する基準鋳型配列である。該基準鋳型配列は
− 前記ＨＩＶサブタイプの少なくとも一つのリアルタイムでの定量検出、
− 前記ＨＩＶサブタイプの少なくとも一つのマルチプレックス検出、
− 前記ＨＩＶサブタイプの少なくとも一つのリアルタイムでの定量的マルチプレックス検出
を可能にするプライマーを構築生成するのに適した基準である。

本発明の基準鋳型配列は、特に、
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ基準分離体の位置４１７６〜４４３６（配列番号１）、および該Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）、４２８１〜４４２９、４２８３〜４４２９、４２８３〜４４３１、および４１７６〜４４２９から選択される配列番号１のフラグメント；
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）、および該Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）、４３３６〜４４８４、４３３８〜４４８４、および４２３１〜４４８４から選択される配列番号３のフラグメント；
− Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）；
からなる群から選択される配列を含む。

従って、本発明による方法により、リアルタイムでの定量的および／またはマルチプレックス増幅プロトコルによって、主たるＨＩＶのグループおよび／またはタイプおよび／またはサブタイプ、ならびにおそらく事実上任意のＨＩＶのグループおよび／またはタイプおよび／またはサブタイプが特異的に高感度で有利に検出できるようになる。本発明による方法がカバーする、そのようなグループおよび／またはタイプおよび／またはサブタイプの例には、ＨＩＶ１−ＭサブタイプＡ（Ａ１およびＡ２）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ（Ｆ１およびＦ２）、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫが含まれるが、組換え形ＡＥ、ＡＧ、ＡＢ、ＤＦ、ＢＣ、ＣＤ、ＢＦとＢＧ、さらにＵ（高度に分岐している）も含まれる。その他の例にはＨＩＶ２サブタイプＡ、Ｂが含まれる。

従って、本発明は、核酸増幅によるＨＩＶ検出法であって、
− グループ、および／またはタイプ、および／またはサブタイプ特異的であってよく、
− 定量的であり、より具体的にはリアルタイムで定量的にＨＩＶを検出できるようにし、
− 依然として特異性を残したまま、マルチプレックス法で実行することができ、（リアルタイムであってよい）定量的なマルチプレックス増幅プロトコルで実行することさえできる
検出法を提供する。

従って、本発明による方法は、ＨＩＶ１−ＭとＨＩＶ１−ＯグループをＨＩＶ２グループから区別することによって、および、単一手順を使用して非常に広範なＨＩＶタイプおよび／またはサブタイプをカバーすることによって診断手順を有利に容易にすることができる。

本発明の一局面では、該基準鋳型配列は、Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体から得た配列番号２、または位置４２８１〜４４２９、４２８３〜４４２９、４２８３〜４４３１から選択される配列番号２のフラグメントである。

一態様では、該基準鋳型配列は、Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体から得た配列番号２、または該配列番号２のフラグメントの一つであり、前記方法は
− 配列番号９、１２、１４、１５、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、および配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いて実施される。

好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号９、１２、１４、１５、２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

別の態様では、前記方法は
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

より好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号９、１２、１４、１５からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマーを用いて実施される。

さらにより好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号９、１２、１４、１５からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および場合により、
− 配列番号９１、１００、１０９、１１０、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

すなわち、プライマー（プライマー対）の可能な組合せは

［表中、Ｘは、プライマーが対として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号９１、１００、１０９、１１０、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるプローブのどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

本発明の別の局面では、該基準鋳型配列は、Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体から得た配列番号４、または４３３６〜４４８４、４３３８〜４４８４から選択される配列番号４のフラグメントである。

本発明の一態様では、前記基準鋳型配列は、Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体から得た配列番号４または配列番号４の該フラグメントの一つであり、前記方法は
− 配列番号１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４、および配列番号１９０〜１９４の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いて実施される。

好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

別の態様では、前記方法は
− 配列番号１９０〜１９４およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

より好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号１４８、１５７、１６７からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

さらにより好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号１４８、１５７、１６７からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および場合により、
− 配列番号１９０〜１９４およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

すなわち、プライマー（プライマー対）の可能な組合せは

［表中、Ｘは、プライマーが対として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、およびそれらの相補配列からなる群から選択されるプローブ
のどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

本発明の別の局面では、該基準鋳型配列がＭ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体から得た配列番号５である。

本発明の一態様では、該基準鋳型配列がＭ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体から得た配列番号５であり、前記方法は
− 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、２９７〜３０３、および配列番号２９７〜３０３の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いて実施される。

好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

別の態様では、前記方法は
− 配列番号２９７〜３０３、およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

より好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

さらにより好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および場合により、
− 配列番号２９７〜３０３、およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

すなわち、プライマー（プライマー対）の可能な組合せは

［表中、Ｘは、プライマーが対として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるプローブのどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

本発明の別の局面では、該基準鋳型配列はＫ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ基準分離体の配列番号１、または該Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４１７６〜４４２９と同一である、配列番号１のフラグメントである。

本発明の一態様では、該基準鋳型配列はＫ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の配列番号１であり、またはそのフラグメントであり、前記方法は
− 配列番号６、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、および配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いて実施される。

好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号６、２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

別の態様では、前記方法は
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列
からなる群から選択した少なくとも一つのプローブを用いて実施される。

より好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号６である選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

さらにより好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号６である選択した少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および場合により、
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列
からなる群から選択した少なくとも一つのプローブを用いて実施される。

すなわち、プライマー（プライマー対）の可能な組合せは

［表中、Ｘは、プライマーが対として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるプローブのどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

本発明の別の局面では、該基準鋳型配列はＬ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体から得た配列番号３、または該Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４８４と同一である、配列番号３のフラグメントである。

本発明の一態様では、該基準鋳型配列はＬ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体から得た配列番号３またはそのフラグメントであり、前記方法は
− 配列番号１３９、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４、および配列番号１９０〜１９４の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを用いて実施される。

好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号１３９、１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

別の態様では、前記方法は
− 配列番号１９０〜１９４およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

より好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号１３９である少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
を用いて実施される。

さらにより好ましい態様では、前記方法は
− 配列番号１３９である少なくとも一つのプライマー、および
− 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー、および場合により、
− 配列番号１９０〜１９４およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
を用いて実施される。

すなわち、プライマー（プライマー対）の可能な組合せは

［表中、Ｘは、プライマーが対として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、およびそれらの相補配列からなる群から選択されるプローブ
のどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

本発明の一局面では、少なくとも一つの単位複製配列を生成する前記ステップが、少なくとも一つの定量および／または定性的、マルチプレックスおよび／または単一ＰＣＲ増幅を含む。

本発明の別の局面では、該検出ステップはリアルタイムの、かつ／または定量的、かつ／またはエンドポイントでの検出を優先的に含む。

別の局面では、本発明は、上記方法によって、すなわち、本発明の方法をＨＩＶ含有試料に実施することによって得られる単位複製配列を提供する。

別の局面では、本発明による少なくとも一つの単位複製配列を含む増幅組成物を提供する。本明細書において本発明者らは、増幅組成物とは増幅、特に、ＰＣＲによって得られる任意の組成物であると解釈する。

本発明は、単一増幅実施（run）において少なくともＨＩＶ１−Ｍ、ＨＩＶ１−Ｏ、ＨＩＶ２−Ａ、およびＨＩＶ２−Ｂをカバーするためのマルチプレックスで使用できると同時に、依然としてリアルタイムの定量的なそれらの増幅を提供できるプライマーの設計において、基準鋳型配列として使用するのに適当なポリヌクレオチドも対象とする。当然、本発明によるポリヌクレオチドは、単一プロトコル、マルチプレックスプロトコル、エンドポイントプロトコル、定性プロトコル、定量プロトコル、それらの組合せなどを含む別のプロトコルにも適切である。

本明細書において本発明者らは、ポリヌクレオチドとは、任意のヌクレオチドポリマーであると解釈し、ここで、ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、縮重ヌクレオチドなどであってよい。前記ヌクレオチドは、一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。該ポリヌクレオチドの長さは、様々であってよく、通常、５００ヌクレオチド（ｎｔ）以下であり、好ましくは５０〜４００ｎｔ、より好ましくは１００〜３００ｎｔ、１５０−２５０ｎｔの範囲がさらにいっそう好ましい。

好ましい態様では、前記基準鋳型ポリヌクレオチドは、
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）（図７参照）、または４２８１〜４４２９、４２８３〜４４２９、４２８３〜４４３１から選択される配列番号２のフラグメントである。

別の態様では、前記基準鋳型ポリヌクレオチドは、
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）（図７参照）、または４３３６〜４４８４、４３３８〜４４８４から選択される配列番号４のフラグメントである。

別の態様では、前記基準鋳型ポリヌクレオチドは、
− Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）（図７参照）である。

さらに別の態様では、前記基準鋳型ポリヌクレオチドは、
− Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４１７６−４４３６（配列番号１）（図７参照）、または該Ｋ０３４５５ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４１７６〜４４２９と同一である、配列番号１のフラグメントである。

別の態様では、前記基準鋳型ポリヌクレオチドは、
− Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）（図７参照）、または該Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４２３１〜４４８４と同一である、配列番号３のフラグメントである。

本発明によってＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドが提供される。図７〜２１を参照されたい。

一態様では、本発明は、
− 配列番号６〜３０４、および配列番号８３〜１３８、１９０〜１９４、２９７〜３０４の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。

好ましい態様では、本発明は、
− 配列番号６、９、１２、１４、１５、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１３９、１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４、２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、２９７〜３０３、および
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。

一局面では、本発明は、ＨＩＶ１−Ｍの検出に適当であり、
− 配列番号６、９、１２、１４、１５、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、および配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。

別の局面では、本発明は、ＨＩＶ１−Ｏの検出に適当であり、
− 配列番号１３９、１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４、および配列番号１９０〜１９４の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。

さらに別の局面では、本発明は、ＨＩＶ２−Ａの検出に適当であり、
− 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、２９７〜２９９、および配列番号２９７〜２９９の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。

さらに別の局面では、本発明は、ＨＩＶ２−Ｂの検出に適当であり、
− 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、３００〜３０３、および配列番号３００〜３０３の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。

配列番号９や配列番号１２などの配列は縮重した配列であることに留意されたい。Ｒ＝Ａである配列番号９は配列番号８と同一であり、Ｒ＝Ａである配列番号１２は配列番号１１と同一である。

別の局面では、本発明は、示した使用に適当な以下のオリゴヌクレオチドを提供する。

別の局面では、本発明は、示した使用に適当な以下のオリゴヌクレオチドを提供する。

好ましい態様では、本発明は、以下のオリゴヌクレオチドを提供する。

好ましい態様では、本発明による任意のヌクレオチドは蛍光標識することができる。

別の局面では、本発明は、ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

一態様では、本発明は、ＨＩＶ１−Ｍの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ１−Ｍの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
− 配列番号６、９、１２、１４、１５からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、および配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プローブ）；
を含むオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

すなわち、オリゴヌクレオチドの可能な組合せは

［表中、Ｘは、オリゴヌクレオチドが対（プライマー対）として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号９１、１００、１０９、１１０、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド（プローブ）のどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

別の局面では、本発明は、ＨＩＶ１−Ｏの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ１−Ｏの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
− 配列番号１３９、１４８、１５７、１６７からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号１９０〜１９４、および配列番号１９０〜１９４の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プローブ）；
を含むオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

すなわち、オリゴヌクレオチドの可能な組合せは

［表中、Ｘは、オリゴヌクレオチドが対（プライマー対）として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド（プローブ）のどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

別の局面では、本発明は、ＨＩＶ２−Ａの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

好ましい態様では、ＨＩＶ２−Ａの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
− 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号２９７〜２９９、および配列番号２９７〜２９９の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プローブ）；
を含むオリゴヌクレオチドのセットが提供される。

すなわち、オリゴヌクレオチドの可能な組合せは

［表中、Ｘは、オリゴヌクレオチドが対（プライマー対）として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号２９７、２９８、２９９、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド（プローブ）のどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

別の局面では、本発明は、ＨＩＶ２−Ｂの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

好ましい態様では、ＨＩＶ２−Ｂの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
− 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマー）；および／または
− 配列番号３００〜３０３、および配列番号３００〜３０３の一つに、この配列番号の全長にわたって相補的な配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プローブ）；
を含むオリゴヌクレオチドのセットが提供される。

すなわち、オリゴヌクレオチドの可能な組合せは

［表中、Ｘは、オリゴヌクレオチドが対（プライマー対）として互いに組み合わせることができ、加えて各プライマー対が
− 配列番号３００、３０１、３０２、３０３、およびそれらの相補配列
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド（プローブ）のどれか一つと組み合せて使用できることを示す］
の通りである。

別の局面では、本発明は、ＨＩＶのマルチプレックス検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットを提供する。

好ましい態様では、ＨＩＶの検出、好ましくはマルチプレックス検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
− 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
− 配列番号１９０〜１９４およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
− 配列番号２９７〜２９９およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
− 配列番号３００〜３０３およびそれらの相補配列からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
− それらの組合せ；
を含むオリゴヌクレオチドのセットが提供される。

従って、本発明によるオリゴヌクレオチドのそのようなセットは、前記オリゴヌクレオチドの２、３、４、５、さらにそれ以上のそれらのいかなる組合せも含みうる。

好ましい態様では、オリゴヌクレオチドのそのようなセットは、プローブの組合せ、例えば、ＨＩＶ１−ＭプローブとＨＩＶ１−Ｏプローブの組合せでありうる。

（Ｘ＝可能な組合せ、場合により、任意のさらに別のプローブ、例えば、ＨＩＶ２−ＡやＨＩＶ２−Ｂプローブも用いられる）

別の態様では、オリゴヌクレオチドのそのようなセットは、プローブの組合せ、例えば、ＨＩＶ２−ＡプローブやＨＩＶ２−Ｂプローブの組合せでありうる。

（Ｘ＝可能な組合せ、場合により、任意のさらに別のプローブ、例えば、ＨＩＶ１−ＭやＨＩＶ１−Ｏプローブも用いられる）。

さらに可能なものには

（Ｘ＝可能な組合せ、場合により、任意のさらに別のプローブ、例えばＨＩＶ１−Ｏも用いられる）
および

（Ｘ＝可能な組合せ、場合により、任意のさらに別のプローブ、例えばＨＩＶ１−Ｍも用いられる）
が含まれる。

好ましい態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドの任意のセットでは、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが蛍光標識されている。

本発明による少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、および／または本発明によるヌクレオチドの少なくとも一つのセットによって得られる単位複製配列をさらに提供する。

− 配列番号９、１２、１４、もしくは１５のプライマーと、配列番号２４、５２、もしくは８２のプライマー；または
− 配列番号１４８、１５７、もしくは１６７のプライマーと、配列番号１７０、１７９、もしくは１８９のプライマー；または
− 配列番号２２１もしくは２４９のプライマーと、配列番号２７６、２８７、もしくは２９６のプライマー；または
− 配列番号６のプライマーと、配列番号２４、５２、もしくは８２のプライマー；または
− 配列番号１３９のプライマーと、配列番号１７０、１７９、もしくは１８９のプライマー；
から選択した一対のプライマーを用いてＨＩＶ含有試料から増幅によって得た単位複製配列がより具体的に提供される。

ヌクレオチド長が本発明の基準鋳型配列の一つのヌクレオチド（すなわち配列番号２、４、５、１または３および上記したそのフラグメント）の長さと同一であり、プローブ配列とのヌクレオチド同一率がこのプローブ配列の全長にわたって、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、最も好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９６％、最も好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列を含む単位複製配列も提供し、ここで、このプローブ配列は、配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、およびこれらの配列番号の全長にわたってこれらの配列番号に相補的である配列の一つである。

そのような単位複製配列を含む増幅組成物も本発明に含まれる。

キットを提供することも本発明の別の目的である。

好ましい態様では、前記キットは、上記のように本発明による少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）を含む。

別の態様では、前記キットは、上記のように本発明による少なくとも一つのプライマー対を含む。

さらに別の態様では、前記キットは、上記のように本発明による少なくともオリゴヌクレオチドのセット、例えば、本発明による少なくとも一組の複数のプローブを含む。

本発明によるキットでは、オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）は、別々にしておくことも、または部分的に混合し、または完全に混合することもできる。

前記オリゴヌクレオチドは、当業者の判断次第で、乾燥形態で、または適当な溶媒に溶解して提供することができる。適当な溶媒にはＴＥ、ＰＣＲ等級水などが含まれる。

好ましい態様では、本発明によるキットには、ＲＴ−ＰＣＲステップに適当な試薬を含みうる、それ以上のＰＣＲステップに適当な試薬を含めることもできる。

そのような試薬は当業者には公知であり、ヌクレアーゼ不含水、ＲＮａｓｅ不含水、ＤＮＡｓｅ不含水、ＰＣＲ等級の水などの水；マグネシウム、カリウムなどの塩；Ｔｒｉｓなどの緩衝液；ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ（それらの全ては登録商標）、活性化可能なポリメラーゼ、逆転写酵素などを含む酵素；デオキシヌクレオチド、ジデオキスヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰなどのヌクレオチド；ＤＴＴ阻害薬および／またはＲＮａｓｅ阻害薬などの他の試薬；およびポリＴ、ポリｄＴなどのポリヌクレオチド、ならびに他のオリゴヌクレオチド、例えばプライマーが含まれる。

別の好ましい態様では、本発明によるキットはＰＣＲ対照を含む。そのような対照は当技術分野で公知であり、定性対照、正の対照、負の対照、内部標準、定量対照、内部定量対照、および較正範囲が含まれる。前記ＰＣＲステップの内部標準は、ＰＣＲステップで標的鋳型に無関係な鋳型であってよい。そのような対照には、対照プライマーおよび／または対照プローブも含まれる。例えば、ＨＩＶ検出の場合には、内部標準として、人体から得られる試料には存在せず、そのサイズおよびＧＣ含有量が標的配列のそれと当量である遺伝子の中から選択した（例えば、植物の遺伝子由来の）ポリヌクレオチドを使用することができる。

好ましい態様では、本発明によるキットは、生物試料、例えば、血液、血清、血漿から得た核酸を抽出し、かつ／または精製する手段を含む。そのような手段は当業者には周知である。好ましい態様では、本発明によるキットは、それを使用するための使用説明書を含む。前記使用説明書は、有利にはリーフレット、カードなどであってよい。前記使用説明書は、２種の形態：おそらく文献データをも含みうる、キットおよびその使用についての情報を包括的に集めた詳細な形態；および、例えばカード型の、その使用に必要不可欠な情報を集めたクイックガイド形態もしくはメモを含みうる。

好ましい態様では、前記キットは診断キット、特にインビトロ診断キット、すなわちＨＩＶ診断キットである。

本発明は診断分野にも関する。

本発明による上記のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶタイプおよびサブタイプのインビトロ診断に使用することができる。特に、本発明によるプライマーおよびプローブは、インビトロ試料、例えば、患者の血液、血漿および／または血清、あるいは細胞培養上清に存在するＨＩＶ核酸のインビトロタイピング、サブタイピング、および数量化に使用することができる。

試料に存在するＨＩＶ核酸を検出する方法を提供することも本発明の目的である。

一態様では、前記方法は、少なくとも一つのＨＩＶタイプおよび／またはサブタイプおよび／または分離体から得た少なくとも一つの標的鋳型を含むことが推測される少なくとも一つの試料を提供するステップを含む。

本明細書において本発明者らは、核酸とは、合成または非合成であっても、組換えまたは天然であっても、直鎖または環状であってもよい任意の核酸であると解釈する。これにはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であっても、さらに三本鎖であってもよい。核酸は、様々な生物源、例えば、微生物（細菌、酵母など）、または哺乳動物細胞など、より高次の生物に由来してもよい。前記核酸はまた、ウイルス種、例えばＨＩＶ種などのレトロウイルス種であってもよい。核酸はまた、全ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＢＡＣ ＤＮＡ、およびそれらの混合物を含んでもよい。さらに、核酸は様々な純度状態が想定されうる。

本明細書において本発明者らは、試料とは天然または非天然の任意の種類の試料であると解釈する。前記試料は、生物起源から得ることが好ましい。前記試料はまた、細胞培養上清から得てもよい。好ましい態様では、前記試料は血液から得る。試料を含有する前記核酸は、血清および／または血漿から得るのがより好ましい。前記試料は、予備ステップからも得られる。例えば、前記試料は、精製および／または抽出手順により、例えば血液試料から得られるだろう。特に、前記試料は、生物試料に対して実施される分離および／または精製および／または抽出方法から得ることができる。前記試料は対照試料であってもよい。対照試料は、定性対照、正の対照、負の対照、定量対照、および較正対照として試料を含む。前記対照は、内部標準および外部標準であってよい。本発明による任意の試料は数度存在させてよい。例えば、前記試料は、二重、三重、四重・・・多重で提供してよく、これは定量実験の場合に有利である。

当業者は、標的鋳型の概念に詳しいものとする。前記標的鋳型は、存在が前記方法で評価される任意の核酸であってよい。前記標的鋳型は、前記方法（ＰＣＲ単位複製配列）で増幅される核酸でありうるが、必ずしもというわけではない。

前記方法は、少なくとも一種のＨＩＶタイプおよび／またはサブタイプから得た、少なくとも一つの標的鋳型を含むことが推測される試料を含有する、少なくとも一つの核酸を提供するステップを含んでよい。

本発明の一局面では、前記方法は、本発明による少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（例えばＰＣＲプライマーおよび／またはプローブ）、および／または本発明によるヌクレオチドの少なくとも一つのセット（例えば、プライマー対）を提供するステップを含む。

一態様では、前記方法は、前記プライマーおよび／または前記プライマー対および／または前記プローブを前記鋳型にアニーリングさせる条件下で、前記核酸含有試料と、本発明による少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、および／または本発明によるヌクレオチドの少なくとも一つのセットとを接触させるステップを含む。

別の局面では、前記方法は、アニール生成物の存在を観察し、または検出し、それによって前記試料中のＨＩＶ核酸の初期存在を明らかにするステップを含む。

試料中のＨＩＶタイプおよびサブタイプを定量的特異的に検出する方法を提供するのは本発明のさらに別の目的であり、リアルタイムでの定量マルチプレックスＰＣＲ分析が好ましい。

一態様では、前記方法は、少なくとも一つのＨＩＶタイプおよび／またはサブタイプから得た少なくとも一つの標的鋳型を含むと推測される少なくとも一種の試料を提供するステップを含む。

別の好ましい態様では、前記方法は、本発明による少なくとも一つのオリゴヌクレオチド（例えばＰＣＲプライマーおよび／またはプローブ）および／または本発明によるヌクレオチドの少なくとも一つのセット（例えばプライマー対）を提供するステップを含む。

好ましい態様では、前記プローブは前記プライマー対によって得られる推定ＨＩＶ単位複製配列を検出するのに適している。

本発明によれば好ましい態様では、前記プローブのスペクトル特性を互いに干渉しないように選択することができる。特に、プローブをマルチプレックス法で使用する場合、各単一プローブに互いにスペクトルが著しく異なる、すなわち、吸収／発光スペクトルは本質的に重複しないそれ自体のフルオロフォアを含めることができる。これにより、全ての単一プローブを有利に低ノイズでマルチプレックス検出できるようになり、個々のシグナルが検出時に互いに干渉し合わないのを確実にする。マルチプレックス法で一緒に使用することができる色素の例には、ＦａｍとＴａｍｒａ、ＦａｍとＴａｍｒａおよびテキサスレッドが含まれる。

別の好ましい態様では、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマー、および／または対、またはプライマーおよび／またはプローブ、および／またはオリゴヌクレオチドのセットの存在下、かつ恐らく適当な試薬の存在下で、前記プライマー対および／またはセットを含む前記標的鋳型のＰＣＲ増幅に適当な条件に前記試料を接触させるステップを含む。

前記ＰＣＲ増幅は、ＲＴ−ＰＣＲを含む任意のＰＣＲ反応でありうる。

そのような適当な試薬は、当技術分野で公知であり、その例には、ヌクレアーゼ不含水、ＲＮａｓｅ不含水、ＤＮＡｓｅ不含水、ＰＣＲ等級水などの水；マグネシウム、カリウムなどの塩；Ｔｒｉｓなどの緩衝液；ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ（それらの全ては登録商標）、活性可能なポリメラーゼ、逆転写酵素などを含む酵素；デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、ｄＮＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰなどのヌクレオチド；ＤＴＴおよび／またはＲＮａｓｅ阻害薬などの他の試薬；およびポリＴ、ポリｄＴなどのポリヌクレオチドが含まれる。有利には本発明によれば、これらの試薬の少なくとも一部をプレミックスとして使用することができる。その使用量は当業者には公知である。

好ましい態様では、本発明によるプライマーは終濃度範囲１００〜２０００ｎＭで使用する。典型的には、前記プライマーは、終濃度範囲２００〜１５００ｎＭで使用することができ、２５０〜１０００ｎＭが好ましく、５００〜１０００ｎＭがより好ましく、６００〜１０００ｎＭがさらにいっそう好ましい。

ＰＣＲ反応でのプローブ濃度は、典型的には終濃度を５０ｎＭから１０００ｎＭに変えることによって最適化することができる。好ましい態様では、本発明によるプローブは、終濃度範囲５０〜１０００ｎＭで使用され、１００〜８００ｎＭが好ましく、１００〜６００ｎＭがより好ましく、２００〜６００ｎＭさらにいっそう好ましい。

前記条件とは当業者には公知である。その条件には、温度条件、特に温度サイクリング条件、例えば、サイクル温度、サイクル持続時間、サイクル数、サイクル加熱速度が含まれる。好ましい態様では、前記温度条件はＲＴ−ＰＣＲに適当な条件を含み、別の好ましい態様では、前記条件はＱＰＣＲに適当な条件を含む。さらに別の好ましい態様では、前記条件は定量ＲＴ−ＰＣＲに適当な条件を含む。

別の態様では、前記方法は、前記プローブが存在し、前記プローブをアニーリングするのに適当な条件下で、前記試料を前記推定単位複製配列に導くステップを含む。

さらに別の好ましい態様では、前記方法は、潜在的増幅生成物を少なくとも一度、好ましくはリアルタイムで検出、すなわち、前記プローブが、好ましくは各試料とアニールする前記単位複製配列と会合しているか否かを検出するステップを含む。これにより、前記ＨＩＶタイプおよび／またはサブタイプの存在が有利に評価できるようになる。これは、蛍光強度を測定することによって有利に実現できる。蛍光測定手順は当技術分野で公知である。手短に言えば、試料をフルオロフォアの励起波長周辺で照射し発光強度を測定する。

別の態様では、前記方法は、前記単位複製配列にアニールした前記プローブの量を少なくとも一度、好ましくはリアルタイムで測定するステップを含む。これは、蛍光強度を測定することにより有利に実現できる。蛍光測定手順は、当技術分野で公知である。手短に言えば、試料をフルオロフォアの励起波長周辺で照射し発光強度を測定する。

別の好ましい態様では、前記方法は、前記試料中に初めに存在する標的鋳型のコピーの数を少なくとも一度見積もるステップを含む。当業者は、そのようなステップの実施方法を承知しているものとする。例えば、これは、較正標準および／または内部標準を使用して有利に実施することができる。好ましくは、このステップは、試料ごとのいわゆる閾値サイクル（ＣＴ）の決定を含み、それは前記試料中に初めに存在する標的鋳型のコピーの数に相関する。

好ましい態様では、前記方法の少なくとも一つのステップ、好ましくはいくつかのステップ、より好ましくはステップの大部分をＰＣＲプレートで行うことができる。適当なそのようなＰＣＲプレートは当技術分野で公知である。それらのプレートには、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、および２８４ウェルプレートが含まれる。これは、前記ステップにおいて試料を並行して確実に処理できるようにするのに有利である。さらに、これにより時間の節約に有利な高処理スクリーニングが可能になる。

別の好ましい態様では、前記方法の少なくとも一つのステップ、好ましくはいくつかのステップ、より好ましくは大部分のステップはサーマルサイクラーで行うことができる。リアルタイムで蛍光強度を測定するために、そのようなサーマルサイクラーを備えることができるであろう。その場合、前記プレートは有利に光学等級でありうる。

本出願は、本発明による、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、および／またはＰＣＲプライマー、および／または少なくとも一つのＰＣＲプライマー対、および／または少なくとも一つのプローブ、および／またはヌクレオチドの少なくとも一つのセットを用いてＨＩＶ核酸を増幅することにも関する。

本発明には、上記の好ましい特徴を任意の数で組み込めることは当業者なら理解できよう。本明細書に記載した引用は全て、これによりその全体が参照により組み入れられる。

本発明の他の態様は本明細書に示されていないが、それらは当業者に明白であり、従って本発明の範囲および趣旨内にある。特に、マルチプレックスおよび／またはリアルタイムプロトコルによる検出に適当ではあるが、本発明の、方法、工程、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドセット、単位複製配列、およびキットは、一重プロトコル、定性プロトコル、定量プロトコル、エンドポイント検出プロトコル、およびそれらの組合せにも明らかに適当である。

本発明による生成物、工程、および方法の利点は、単に例示として以下に示され、限定的ではない以下の実施例から明白になるであろう。

（実施例）
実施例１
ＨＩＶ２の検出（サブタイプＡおよびＢ）（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂおよび３
本実施例は、ＨＩＶ２サブタイプＡおよびＢをＲＴ−ＰＣＲ特異的にリアルタイムで検出できるようにする本発明のＨＩＶ２プライマーおよびプローブを例示する。

本実施例には、一対のＨＩＶ２プライマー、および異なる２つのＨＩＶ２プローブの使用が関与する。一つのプローブはＨＩＶ２−Ａプローブ（サブタイプＡプローブ）であり、他方の一つはＨＩＶ２−Ｂプローブ（サブタイプＢプローブ）である。これらのプライマーおよびプローブは、ＨＩＶ２分離体の１４７ｂｐ配列を標的にする。

それらは以下の配列を有する。
ＨＩＶ２フォワードプライマー（Ｈ２Ａ３ｆ、配列番号１９５）：

ＨＩＶ２リバースプライマー（Ｈ２Ａ３ｒ、配列番号２５０）：

既に述べたように、ＲはＡもしくはＧに相当し、その結果、フォワードプライマーには４つの形態（ＡＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＧ）およびリバースプライマーには２形態（ＡＧまたはＧＡ）がある。
ＨＩＶ２−Ａプローブ（ＨＩＶ２−Ａプローブ、配列番号２９７）：

ＨＩＶ２−Ｂプローブ（ＨＩＶ２−Ｂプローブ、配列番号３００）：

これらのプローブのそれぞれを本実施例で分子ビーコンとして使用する。各プローブの各末端に付加されている、標的に無関係なビーコンアームを下線で示す（ＦＡＭ＝フルオロフォア、ＤＱ＝Dark Quencher）。
分子ビーコン型式のＨＩＶ２−Ａプローブ（ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ、ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号２９８）：

分子ビーコン型式のＨＩＶ２−Ｂプローブ（ＨＩＶ２−Ｂビーコンプローブ、ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号３０１）：

リアルタイムでの定量的増幅実験をＨＩＶ２陽性血漿試料（ＨＩＶ２−Ａ陽性ＨＩＶ２−Ｂ陰性試料およびＨＩＶ２−Ｂ陽性ＨＩＶ２−Ａ陰性試料）のパネルで三回連続実施する。
ａ）ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ；ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号１９５、２５０、２９８）、
ｂ）ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ｂビーコンプローブ（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号１９５、２５０、３０１），
ｃ）ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ＋ＨＩＶ２−Ｂビーコンプローブ。（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ９ａ、ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号１９５、２５０、２９８、３０１）。

手順の詳細は以下の通りである。
− ＨＩＶ２陽性試料パネル：ＨＩＶ２−Ａ陽性ＨＩＶ２−Ｂ陰性血漿試料（サブタイプＡの試料）およびＨＩＶ２−Ｂ陽性ＨＩＶ２−Ａ陰性血漿試料（サブタイプＢの試料）を感染患者から得る（Centre Hospitalier Bichat, Laboratory of Virology, Assistance Publique - Hopitaux de Paris, フランス）；
− 負の対照：ＨＩＶ２陰性血漿；
− 核酸抽出：Kit Qiagen QiaAmp Viral RNA.（参照符号５２９０４）を製造業者の指示書に従い使用（抽出する試料の量＝１４０μＬ）；
− プライマー対：一反応につき各１μＭ（配列番号１１、１２）；
− プローブ：上記ＦＡＭ−Dark Quencherビーコンプローブ（配列番号２９８、３０１）；一反応につき各０．２μＭ；
− ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＲＮＡｓｅ不含水、およびQiagen QuantiTect Probe ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen参照符号：２０４４４３）を製造業者の指示書に従い使用、［ＭｇＣｌ_２］＝４ｍＭ；
− 装置：IQ-Cycler Bio-Rad；
− 温度サイクリング：
４２°Ｃで３０’（ＲＴステップ）、
９５°Ｃで１５’（ポリメラーゼ活性化ステップ）、
（９４°Ｃで３０"−５５°Ｃで３０"−７２°Ｃで３０"）×５０
＋４°Ｃ

プローブ一つのみ（実験ａ）およびｂ））、または両プローブ（実験ｃ））と共にＨＩＶ２プライマー対を使用し、サブタイプＡの試料およびサブタイプＢの試料のパネルを核酸抽出およびＲＴ−ＰＣＲ増幅にかける。

結果の解釈：各アッセイでは、増幅の初期サイクルで測定した蛍光のバックグラウンドレベルより著しく上と考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）が決定される。Ｃｔ値は標的濃度に反比例する。つまり、Ｃｔが下がるほど標的濃度は上がる。

下表では、ＣＴ＝閾値サイクル；ＲＦＵ ｍａｘ＝ＰＣＲ実施の最後で観察された最大相対蛍光単位；ＣＴＬ−＝負の対照；Ｎ／Ａ＝蛍光レベルがバックグラウンドレベルより低い試料。

表１：実験ａ）でＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａ分子ビーコンプローブを用いて得られた結果（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号１９５、２５０、２９８）。

これらの結果を図１Ａおよび１Ｂにより例示する。

有利には本発明によれば、ＨＩＶ２−Ａプローブ（ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号２９８）によって、サブタイプＢ陽性試料を交差検出しなくても、本発明によるＨＩＶ２プライマー（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、配列番号１９５、２５０）と組み合せて、サブタイプＡ陽性試料を標的とする検出が可能になる（表１、図１Ａおよび１Ｂを参照）。

表２：実験ｂ）でＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ｂプローブを用いて得られた結果（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号１９５、２５０、３０１）。

これらの結果を図２Ａおよび２Ｂにより例示する。

有利には本発明によれば、ＨＩＶ２−Ｂプローブ（ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号３０１）によって、サブタイプＡ陽性試料を交差検出しなくとも、本発明のＨＩＶ２プライマー（Ｈ２Ａ３ｒ、Ｈ２Ａ３ｆ、配列番号１９５、２５０）と組み合せて、サブタイプＢ陽性試料を標的とする検出が可能になる（表２を参照、図２Ａおよび２Ｂ）。

表３：実験ｃ）でＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａプローブ＋ＨＩＶ２−Ｂプローブを用いて得られた結果（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ９ａ、ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号１９５、２５０、２９８、３０１）。

これらの結果を図３により例示する。

本発明の際立つ特徴として、ＨＩＶ２−Ａプローブ（ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号２９８）およびＨＩＶ２−Ｂプローブ（ＳＨ２Ａ１ｂ、配列番号３０１）は同時に使用することができ（表３および図３を参照）、一段階マルチプレックス（ここでは二重）手順で両サブタイプが検出できるようになる。

驚くべき特徴として、ＡおよびＢプローブの同時使用（サブタイプＡプローブおよびサブタイプＢプローブ）（二重鎖プロトコル）において、単一プローブの単独使用（サブタイプＡプローブまたはサブタイプＢプローブ）と比べて相乗効果が観察される。単一プローブで得られた検出シグナルは、両プローブでそれぞれ得られたものよりもわずかに不正確であり、それはサブタイプＡの試料について、実験ｃ）で得られた結果と実験ａ）で得られた結果の比較、および，サブタイプＢの試料について実験ｃ）で得られた結果と、実験ｂ）で得られた結果の比較から判断することができる。

従って、本発明によるオリゴヌクレオチドセット（プライマーおよびプローブ）によって、プローブが同時に使用された場合（マルチプレックス、二重プロトコル）、驚くべき予想外の相乗効果として、特異性が高まることが証明される。

実施例２
ＨＩＶ１−Ｍ／ＨＩＶ１−Ｏプライマーおよびプローブ（図４Ａおよび４Ｂ）
一回の実施で、ＨＩＶ１−Ｍ陽性ＨＩＶ１−Ｏ陰性血清試料の代表的基準パネル（ＨＩＶ１−Ｍパネル試料）およびＨＩＶ１−Ｏ陽性ＨＩＶ１−Ｍ陰性血清試料の代表的基準パネル（ＨＩＶ１−Ｏパネル試料）を、本発明のＨＩＶ１−Ｍプライマー（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、配列番号７、１６）およびＨＩＶ１−Ｍプローブ（ＳＨ１ＢＭ５、配列番号１１９）を用いて、リアルタイムでの定量的ＲＴ−ＰＣＲ増幅にかける。

別の実施では、本発明のＨＩＶ１−Ｏプライマー（Ｈ１Ｂ５ｆ、Ｈ１Ｂ１３ｒ、配列番号１４０、１６８）およびＨＩＶ１−Ｏプローブ（ＳＨ１ＢＯ２配列番号１９１またはＳＨ１Ｂ０１０配列番号１９４）を用いて同じパネルをリアルタイムでの定量的ＲＴ−ＰＣＲ増幅にかける。

ＨＩＶ１プライマーおよびプローブは以下の配列を有する。
ＨＩＶ１−Ｍプライマー

ＨＩＶ１−Ｍプローブ

ＨＩＶ１−Ｏプライマー

ＨＩＶ１−Ｏプローブ

本発明によれば本明細書で、５’の標的に無関係なアームとして"ＴＧＣＧＣ"、そして３’の標的に無関係なアームとして"ＧＣＧＣＡ"（両アームに下線を引く）を用いて、各プローブは分子ビーコンとして生成される。５’アームをＦＡＭフルオロフォアで標識し、３’アームをDark Quencherで標識する。

次いで、プローブ配列は以下のものである。

分子ビーコン型式のＨＩＶ１−Ｍプローブ

分子ビーコン型式のＨＩＶ１−Ｏプローブ

ＲＴ−ＰＣＲ手順の詳細は以下の通りである。
− パネル：ＢＢＩパフォーマンスパネル参照符号ＰＲＤ３０１（１ｍｌ当たり約１０^５個のコピー（copies）の割合で、ヒト血漿に希釈したＨＩＶ１−Ｏ培養物、試料番号の型式は３０１−ｘｘであり、ｘｘは試料番号である）を代表的なＨＩＶ１−Ｏパネルとして使用；
− ＢＢＩパフォーマンスパネル参照符号ＰＲＤ２０１（１ｍｌ当たり約１０^５コピーの割合で、ヒト血漿に希釈したＨＩＶ１−Ｍ培養物、試料番号の型式は２０１−ｙｙであり、ｙｙは試料番号である）を代表的なＨＩＶ１−Ｍパネルとして使用する；
− 負の対照：ＨＩＶ１陰性血漿；
− 抽出：キットQiagen QiaAmp Viral RNA（参照符号５２９０４）を製造業者の指示書に従い使用（抽出する試料の量：１４０μＬ）；
− プライマー対：ＨＩＶ１−Ｏプライマー対（Ｈ１Ｂ５ｆ、Ｈ１Ｂ１３ｒ、配列番号１４０、１６８）およびＨＩＶ１−Ｍ（Ｈ１Ｂ４Ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、配列番号７、１６）プライマー対は、一反応につきそれぞれ０．６μＭで使用されている；
− プローブ：ＦＡＭ−Dark Quencherプローブ（ＳＨ１ＢＭ５、ＳＨ１ＢＯ２、配列番号１１９、１９１）一反応につき各０．６μＭ；
− ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＲＮＡｓｅ不含水、およびQiagen QuantiTect Probe ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen参照符号：２０４４４３）、製造業者の指示書に従い使用、［ＭｇＣｌ_２］＝４ｍＭ；
− 装置：IQ-Cycler Bio-Rad
− 温度サイクリング：
４２°Ｃで３０’、
９５°Ｃで１５’、
（９４°Ｃで１５"−５５°Ｃで３０"−７２°Ｃで３０"）×５０，
＋４°Ｃ。

増幅実験の両タイプについて同じＲＴ−ＰＣＲ手順をその後行っている。

結果の解釈：各アッセイでは、増幅の初期サイクルで測定した蛍光のバックグラウンドレベルより著しく上と考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）が決定される。Ｃｔ値は標的濃度に反比例する。つまり、Ｃｔが下がるほど標的濃度は上がる。

下表では、
ＣＴ＝閾値サイクル；
ＲＦＵ ｍａｘ＝ＰＣＲ実施の最後で観察された最大相対蛍光単位；
ＣＴＬ−＝負の対照；
Ｎ／Ａ＝蛍光レベルがバックグラウンドレベルより低い試料；
Ａｖｇ．：平均；

下表４に実験結果を例示する。

図４Ａおよび４Ｂにより結果を例示する。

図４Ａは、ＨＩＶ１−Ｍパネル（ＢＢＩ ＰＲＤ２０１）、ＨＩＶ１−Ｏパネル（ＢＢＩ ＰＲＤ３０１）、および対照において、本発明のＨＩＶ１−Ｍプライマー（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、配列番号７、１６）およびＨＩＶ１−Ｍプローブ（ＳＨ１ＢＭ５、配列番号１１９）を用いて得られた結果を示す。

図４Ｂは、ＨＩＶ１−Ｏパネル、ＨＩＶ１−Ｍパネル、および対照について、本発明のＨＩＶ１−Ｏプライマー（Ｈ１Ｂ５ｆ、Ｈ１Ｂ１３ｒ、配列番号１４０、１６８）およびＨＩＶ１−Ｏプローブ（ＳＨ１ＢＯ２、配列番号１９１）を用いて得られた結果示す。

両事例では、ＨＩＶ１−Ｏ試料において本発明のＨＩＶ１−Ｍプライマーおよびプローブを使用する場合、ならびにその逆も、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは増幅は検出されない。

有利には本発明によれば、ＨＩＶ１−Ｍ単位複製配列とＨＩＶ１−Ｏプローブの間だけでなく、ＨＩＶ１−Ｏ単位複製配列とＨＩＶ１−Ｍプローブの間でも交差ハイブリダイゼーション形成は生じない。

従って、本発明によるＨＩＶ１−ＭおよびＨＩＶ１−Ｏプライマーおよびプローブによって、リアルタイムの定量ＲＴ−ＰＣＲ条件で、非常に高い特異性検出が可能になることが証明された。

実施例３
ＨＩＶ１−ＭおよびＨＩＶ１−Ｏの数量化
この実施例では、本発明のプライマーおよびプローブにより、ＲＴ−ＰＣＲでＨＩＶウイルス負荷が数量化できるようになることが例示される。

プライマーおよびプローブは以下の配列である。
ＨＩＶ１−Ｍプライマー

ＨＩＶ１−Ｍプローブ

ＨＩＶ１−Ｏプライマー

ＨＩＶ１−Ｏプローブ

本発明によれば、この場合は、５’の標的に無関係なアームとして"ＴＧＣＧＣ"、および３’の標的に無関係なアームとして"ＧＣＧＣＡ"を用いて、各プローブは分子ビーコンとして生成される（両アームに下線を引く）。５’アームをＦＡＭフルオロフォアで標識し、３’アームをDark Quencherで標識する。

従って、プローブ配列は以下の通りである（ビーコンアームを下線で示す）。
分子ビーコン型式のＨＩＶ１−Ｍプローブ

分子ビーコン型式のＨＩＶ１−Ｏプローブ

ＲＴ−ＰＣＲ手順の詳細は以下の通りである。
− パネル：
− ＢＢＩパフォーマンスパネル参照符号ＰＲＤ３０１（１ｍｌ当たり約１０^５コピーの割合で、ヒト血漿に希釈したＨＩＶ１−Ｏ培養物、試料番号の型式は３０１−ｘｘであり、ｘｘは試料番号である）を代表的なＨＩＶ１−Ｏパネルとして使用する；
− ＢＢＩパフォーマンスパネル参照符号ＰＲＤ２０１（１ｍｌ当たり約１０^５コピーの割合で、ヒト血漿に希釈したＨＩＶ１−Ｍ培養物、試料番号の型式は２０１−ｙｙであり、ｙｙは試料番号である）が代表的なＨＩＶ１−Ｍパネルとして使用され、ＨＩＶ１−Ｍサブタイプの数個の異なる遺伝子型に相当する；
− BBI Accurun 315パネルシリーズ５００（サブタイプＢ）を基準パネルとして使用して基準となる検量線を得るが、この検量線はその対応するＣｔに対する公知の標的濃度のログをプロットすることによって構築する。次いで、未知の試料の濃度は、検量線に対してその対応するＣｔをマッピングすることによって決定する；
− 負の対照：ＨＩＶ１陰性血漿；
− 抽出：キットQiagen QiaAmp Viral RNA（参照符号５２９０４）を製造業者の指示書に従い使用（抽出する試料の量：１４０μＬ）；
− プライマー対：ＨＩＶ１−Ｏプライマー対（配列番号７、８）およびＨＩＶ１−Ｍプライマー対（配列番号１、２）は一反応につきそれぞれ０．６μＭで使用される；
− プローブ：ＦＡＭ−Dark Quencherプローブ（配列番号４、１０）、一反応につき各０．２μＭ；
− ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＲＮＡｓｅ不含水、およびQiagen QuantiTect Probe ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen参照符号：２０４４４３）。製造業者の使用説明書に従う、［ＭｇＣｌ_２］４ｍＭ；
− 装置：IQ-Cycler Bio-Rad、
− 温度サイクリング：
４２°Ｃで３０’（ＲＴステップ）、
９５°Ｃで１５’（ポリメラーゼ活性化ステップ）、
（９４°Ｃで１５"−５５°Ｃで３０"−７２°Ｃで３０"）×５０、
＋４°Ｃ。

二連続の増幅実験を本発明のプライマーおよびプローブで実施する。
ａ）一対のプライマーおよびプローブ（ＨＩＶ１−Ｍプライマー対（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、配列番号７、１６）およびＨＩＶ１−Ｍプローブ（ＳＨ１ＢＭ５、配列番号１１９）を用いてのＲＴ−ＰＣＲ
ｂ）両プライマー対および両プローブを用いてのＲＴ−ＰＣＲ（ＨＩＶ１−Ｍプライマー対（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、配列番号７、１６）＋ＨＩＶ１−Ｏプライマー対（Ｈ１Ｂ５ｆ、Ｈ１Ｂ１３ｒ、配列番号１４０、１６８）およびＨＩＶ１−Ｍプローブ（ＳＨ１ＢＭ５、配列番号１１９）＋ＨＩＶ１−Ｏプローブ（ＳＨ１ＢＯ２、配列番号１９１））。

検量線に対してその対応するＣｔをマッピングすることによって、各アッセイのＣｔ結果をパネルＰＲＤ２０１およびＰＲＤ３０１の数量化に使用する。各純粋な試料中のＲＮＡコピー数／ｍｌに相当する数量化の値を製造業者の指示書に従って使用した市販のキットと比較する。Roche社製キットAmplicor HIV1 Monitor Version 1.5（ref.87674）、Ｂａｙｅｒ社製キットQuantiplex HIV1 RNA 3.0 bDNA（ref.6147）、およびOrganon Teknika社製キットNuclisens HIV-1 QT（ref.84152）。

代表的な結果を表５および６に示す。
表５（実験ａ）：ＨＩＶ１−Ｍ試料パネルで一対のプライマー（ＨＩＶ１−Ｍプライマー対、Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、配列番号７、１６）および単一プローブ（ＨＩＶ１−Ｍビーコンプローブ、配列番号１１９）を用いて得られた結果

本発明のＨＩＶ１−Ｍプライマーおよびプローブによって、全てのＨＩＶ１−Ｍ遺伝子型を正確にリアルタイムで定量検出し、市販のキットとの良好な相関が得られるようになるのは、これらの結果から明らかである。

表６（実験ｂ）：ＨＩＶ１−Ｏ試料パネルにおいて、ＨＩＶ１−ＭとＨＩＶ１−Ｏプライマー（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、Ｈ１Ｂ５ｆ、Ｈ１Ｂ１３ｒ、配列番号７、１６、１４０、１６８）およびＨＩＶ１−ＭとＨＩＶ１−Ｏプローブ（配列番号１１９、１９１）を用いて得られた結果

ＨＩＶ１−Ｏパネルで本発明のＨＩＶ１−ＭとＨＩＶ１−Ｏプライマーおよびプローブを用いてより高レベルに数量化できることが表６から分かる。（＜ＬＤＬ＝低検出限界未満）。

実施例４
ＨＩＶ１／ＨＩＶ２マルチプレックスアッセイ（図５Ａおよび５Ｂ）
本実施例は、本発明のＨＩＶ１とＨＩＶ２プライマーおよびプローブが、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２シグナル用マルチプレックスアッセイに使用できることを示す。本実施例はまた、異なる２つのフルオロフォア（ＦＡＭおよびＲＯＸ）の使用によって、同じ試験管内の２つの標的の蛍光を追跡できるようになることを実証する。

プライマーおよびプローブは以下の配列を有する。
ＨＩＶ１−Ｍプライマー

ＨＩＶ１−Ｍプローブ

ＨＩＶ２フォワードプライマー（Ｈ２Ａ３ｆ、配列番号１９５）

ただしＲ＝Ａ／Ｇ（Ｔｍ＝６６℃）
ＨＩＶ２リバースプライマー（Ｈ２Ａ３ｒ、配列番号２５０）

ただしＲ＝Ａ／Ｇ（Ｔｍ＝６５℃）
ＨＩＶ２−Ａプローブ（ＨＩＶ２−Ａプローブ、配列番号２９７）

本発明によれば、この場合、各プローブは、５’の標的に無関係のアームとして"ＣＧＣＧＣ"、および３’の標的に無関係なアームとして"ＧＣＧＣＧ"（両アームに下線を引く）を用いて、分子ビーコンとして生成される。５’アームをＦＡＭまたはＲＯＸフルオロフォアで標識し、３’アームをＤａｂｃｙｌ部分で標識する。

従って、プローブ配列は以下の通りである（ビーコンアームを下線で示す）。
分子ビーコン型式のＨＩＶ１−Ｍプローブ

（ＳＨ１ＢＭ１０、配列番号１２８）
分子ビーコン型式のＨＩＶ２−Ａプローブ

（ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ、ＳＨ２Ａ１４ａ、配列番号２９９）

ＲＴ−ＰＣＲ手順の詳細は以下の通りである。
− ＨＩＶ２−Ａ陽性試料：感染患者から入手（Centre Hospitalier Bichat, Laboratory of Virology, Assistance Publique - Hopitaux de Paris, フランス）；
− BBI Accurun 315パネルシリーズ５００（サブタイプＢ）；
− 負の対照：ＨＩＶ１およびＨＩＶ２陰性試料；
− 抽出：製造業者の指示に従って使用されるキットQiagen QiaAmp Viral RNA（参照符号５２９０４）（抽出する試料の量：１４０μＬ）；
− プライマー対：ＨＩＶ１−Ｍプライマー対（配列番号７、１６）およびＨＩＶ２プライマー対（配列番号１９５、２５０）を、それぞれ、ＨＩＶ１−Ｍには一反応につき各０．５μＭ、そしてＨＩＶ２には一反応につき各０．３μＭ使用した；
− プローブ：ＨＩＶ１−Ｍ ＦＡＭ−Ｄａｂｃｙｌプローブ（配列番号１２８）およびＨＩＶ２−Ａ ＲＯＸ Ｄａｂｃｙｌプローブ（配列番号２９９）、一反応につき各０．４μＭ；
− ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＲＮＡｓｅ不含水、およびQiagen QuantiTect Probe ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen参照符号：２０４４４３）、製造業者の使用説明書に従う、［ＭｇＣｌ_２］４ｍＭ；
− 装置：IQ-Cycler Bio-Rad；
− 温度サイクリング：
４２°Ｃで３０’（ＲＴステップ）、
９５°Ｃで１５’（ポリメラーゼ活性化ステップ）、
（９４℃で１５"−５５℃で３０"−７２℃で３０"）×５０、
＋４°Ｃ。

本発明のプライマーおよびプローブを用いて二連続の増幅実験を実施した。
ａ）ＨＩＶ１−Ｍ標的濃度範囲で、一対のプライマーおよびプローブＨＩＶ１−Ｍ（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、ＳＨ１ＢＭ１０、配列番号７、１６、１１９、一対のプライマーおよびプローブＨＩＶ２（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ１４ａ、配列番号１９５、２５０、２９９）を用いるＲＴ−ＰＣＲ；
ｂ）ＨＩＶ２標的希釈範囲で、一対のプライマーおよびプローブＨＩＶ１−Ｍ（Ｈ１Ｂ４ｆ、Ｈ１Ｂ１０ｒ、ＳＨ１ＢＭ１０、配列番号７、１６、１１９）、一対のプライマーおよびプローブＨＩＶ２（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ１４ａ、配列番号１９５、２５０、２９９）を用いるＲＴ−ＰＣＲ。

結果の解釈：各アッセイでは、増幅の初期サイクルで測定した蛍光のバックグラウンドレベルより著しく上と考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）が決定される。Ｃｔ値は標的濃度に反比例する。つまり、Ｃｔが下がるほど標的濃度は上がる。

下表では、ＣＴ＝閾値サイクル；ＲＦＵ ｍａｘ＝ＰＣＲ実施の最後で観察された最大相対蛍光単位；ＣＴＬ−＝負の対照；Ｎ／Ａ＝蛍光レベルがバックグラウンドレベルより低い試料；Ａｖｇ＝平均；ｃｏｐ＝コピー。

例示的Ｃｔ結果を表７に示す。

本発明のＨＩＶ１とＨＩＶ２プライマーおよびプローブがＨＩＶ１−ＭまたはＨＩＶ２標的を検出するためのマルチプレックスアッセイで使用できることはこれらの結果から明らかである。

図５Ａおよび５Ｂにより結果を例示する（ここでは実験を二重で実施したので各希釈に対し２つの曲線がある）。

実施例５
ＨＩＶ２／ＩＣマルチプレックスアッセイ（図６Ａおよび６Ｂ）
本実施例は、ＨＩＶ２標的および内部標準（ＩＣ）は、ＨＩＶ２シグナルのいかなる混乱もなく、本発明のＨＩＶ２プライマーとプローブ、および選択したＩＣプライマーとプローブを使用し共増幅することができることを示す。本実施例はまた、異なる２つのフルオロフォア（ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡ）の使用によって、同じ試験管内の２つの標的の蛍光を追跡できることを実証する。

本実施例では、一対のＨＩＶ２プライマーおよび一つのＨＩＶ２プローブの使用が関与する。これらのプライマーおよびプローブは、ＨＩＶ２分離体の１４７ｂｐ配列を標的にする。それらは以下の配列を有する。

ＨＩＶ２フォワードプライマー（Ｈ２Ａ３ｆ、配列番号１９５）

ただしＲ＝Ａ／Ｇ（Ｔｍ＝６６℃）
ＨＩＶ２リバースプライマー（Ｈ２Ａ３ｒ、配列番号２５０）：

ただしＲ＝Ａ／Ｇ（Ｔｍ＝６５℃）
ＨＩＶ２−Ａプローブ（ＨＩＶ２−Ａプローブ、配列番号２９７）：

本実施例はまた、ＨＩＶ標的と同じサイズの増幅したフラグメントおよびＧＣ％を得るために選択した、一対のＩＣプライマーおよび一つのＩＣプローブを使用することが関与する。

これらのプローブのそれぞれを本実施例で分子ビーコンとして使用する。ＨＩＶ２プローブ各末端に付加された、標的に無関係なビーコンアームを下線で示す（ＲＯＸ＝フルオロフォア、Ｄａｂｃｙｌ＝クエンチャー）。

分子ビーコン型式のＨＩＶ２−Ａプローブ（ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ、ＳＨ２Ａ１４ａ、配列番号２９９）

ＩＣプローブには、フルオロフォアとしてＴＡＭＲＡ、そしてクエンチャーとしてＤａｂｃｙｌが選択された。

二連続のリアルタイムでの定量増幅実験を実施した。
ａ）ＨＩＶ２標的のみの添加による、ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号１９５、２５０、２９９）＋ＩＣプライマー対＋ＩＣビーコンプローブ；
ｂ）ＨＩＶ２標的およびＩＣの添加による、ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ（Ｈ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ９ａ、配列番号１９５、２５０、２９９）＋ＩＣプライマー対＋ＩＣビーコンプローブ。

手順の詳細は以下の通りである。
− ＨＩＶ２−Ａ陽性試料：感染患者から入手（Centre Hospitalier Bichat, Laboratory of Virology, Assistance Publique - Hopitaux de Paris, フランス）；
− ＩＣ希釈：１０^６コピー／ＰＣＲを得るためにＩＣを希釈する；
− 負の対照：ＨＩＶ２陰性血漿；
− 核酸抽出：キットQiagen QiaAmp Viral RNA（参照符号５２９０４）を製造業者の指示書に従い使用（抽出する試料の量＝１４０μＬ）；
− プライマー対：一反応につき各０．３μＭ（配列番号１１、１２およびＩＣプライマー）；
− プローブ：上記ＨＩＶ２−Ａ Ｒｏｘ−Ｄａｂｃｙｌビーコンプローブ（配列番号２９９）およびＩＣ Ｔａｍｒａ−Ｄａｂｃｙｌビーコンプローブ、一反応につき各０，４μＭ；
− ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＲＮＡｓｅ不含水、およびQiagen QuantiTect Probe ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen参照符号：２０４４４３）を製造業者の指示書に従い使用、［ＭｇＣｌ_２］＝４ｍＭ；
− 装置： IQ-Cycler Bio-Rad；
− 温度サイクリング：
４２°Ｃで３０’（ＲＴステップ）、
９５°Ｃで１５’（ポリメラーゼ活性化ステップ）、
（９４°Ｃで３０"−５５°Ｃで３０"−７２°Ｃで３０"）×５０、
＋４°Ｃ。

ＨＩＶ２−Ａ陽性試料を核酸抽出にかけ、水で１／３００、１／３０００および１／３００００に希釈した後、実験ａ）およびｂ）に記載したＲＴ−ＰＣＲ増幅にかけた。

ＩＣ希釈物は、実験ｂ）に記載したＲＴ−ＰＣＲ増幅（およそ１０^６ ｃｏｐ／ＰＣＲ）にかけた。（ｃｏｐ＝コピー）。

結果の解釈：各アッセイでは、増幅の初期サイクルで測定した蛍光のバックグラウンドレベルより著しく上と考えられる蛍光レベルである閾値サイクル（Ｃｔ）が決定される。Ｃｔ値は標的濃度に反比例する。つまり、Ｃｔが下がるほど標的濃度は上がる。

下表では、ＣＴ＝閾値サイクル；最高ＲＦＵ＝ＰＣＲ実施の最後で観察された最大相対蛍光単位；ＣＴＬ−＝負の対照、Ｎ／Ａ＝蛍光レベルがバックグラウンドレベルより低い試料。

表８：実験ａ）およびｂ）で、ＲＯＸの蛍光が読み取れた場合（ＨＩＶ２シグナル）、ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ＋ＩＣプライマー対＋ＩＣビーコンプローブ（ＨＩＶ２に対してＨ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ１４ａ、配列番号１９５、２５０、２９９）を用いて得られたＣＴ値

試験したＨＩＶ２−Ａ抽出試料の希釈（１／３００、１／３０００、１／３００００）に関わりなく、ＨＩＶ２のＣｔ値はＩＣの添加によって変化しなかったことがこの表から知ることができる。

表９：実験ｂ）で、ＴＡＭＲＡの蛍光（ＩＣシグナル）が読み取れた場合、ＨＩＶ２プライマー対＋ＨＩＶ２−Ａビーコンプローブ＋ＩＣプライマー対＋ＩＣビーコンプローブ（ＨＩＶ２に対してＨ２Ａ３ｆ、Ｈ２Ａ３ｒ、ＳＨ２Ａ１４ａ、配列番号１９５、２５０、２９９）を用いて得られたＣＴ値

添加したＨＩＶ２−Ａ抽出試料の希釈に関わりなく、ＩＣのＣｔ値が非常に再現性が高いことはこの表から知ることができる。

これらの結果を図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃによって示す（図６Ａおよび６Ｂにおいて、ＨＩＶ２−Ａの各希釈に対して、実験がここでは三重に実施されたため３本の曲線がある。負の対象に対して６本の曲線がある。図６Ｃにおいては、ＩＣに対しては９本のカーブがあり、全ては同じ濃度であった）。

本発明によるＨＩＶ２−ＡおよびＨＩＶ２−Ｂの検出を例示する図である（実施例１を参照）。 本発明によるＨＩＶ２−ＡおよびＨＩＶ２−Ｂの検出を例示する図である（実施例１を参照）。 本発明によるＨＩＶ２−ＡおよびＨＩＶ２−Ｂの検出を例示する図である（実施例１を参照）。 本発明によるＨＩＶ２−ＡおよびＨＩＶ２−Ｂの検出を例示する図である（実施例１を参照）。 本発明によるＨＩＶ２−ＡおよびＨＩＶ２−Ｂの検出を例示する図である（実施例１を参照）。 本発明によるＨＩＶ１−ＭおよびＨＩＶ１−Ｏの検出を例示する図である（実施例２を参照）。 本発明によるＨＩＶ１−ＭおよびＨＩＶ１−Ｏの検出を例示する図である（実施例２を参照）。 本発明によるＨＩＶ１／ＨＩＶ２マルチプレックス検出を例示する図である（実施例４を参照）。 本発明によるＨＩＶ１／ＨＩＶ２マルチプレックス検出を例示する図である（実施例４を参照）。 本発明によるＨＩＶ２／内部標準アッセイを例示する図である（実施例５を参照）。 本発明によるＨＩＶ２／内部標準アッセイを例示する図である（実施例５を参照）。 本発明によるＨＩＶ２／内部標準アッセイを例示する図である（実施例５を参照）。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。 本発明に記載の配列を例示する図である。

Claims (41)

1. 少なくとも一つのＨＩＶ標的を検出する方法であって、
   少なくとも２つのオリゴヌクレオチドによって、少なくとも一つの単位複製配列を生成するステップを含み、
   該オリゴヌクレオチドは、
   − Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）；および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４２８１〜４４２９（配列番号３０６）、４２８３〜４４２９（配列番号３０７）、４２８３〜４４３１（配列番号３０８）から選択される配列番号２のフラグメント；
   − Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４３３６〜４４８４（配列番号３１０）、４４３８〜４４８４（配列番号３１１）から選択される配列番号４のフラグメント；
   − Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）；
   − Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ基準分離体の位置４１７６〜４４３６（配列番号１）、および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４１７６〜４４２９（配列番号３０５）と同一である、配列番号１のフラグメント；ならびに
   − Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４２３１〜４４８４（配列番号３０９）と同一である、配列番号３のフラグメント；
   からなる群から選択される少なくとも一つの基準鋳型配列の特異的増幅で使用するのに適当なプライマーであり、
   該基準鋳型配列は、ＨＩＶ１−Ｍ、ＨＩＶ１−Ｏ、ＨＩＶ２−Ａ、およびＨＩＶ２−Ｂのサブタイプの少なくとも一つをリアルタイムで定量的にマルチプレックスで検出できるようにするプライマーを構築および生成するのに適した基準であるという特異的技術的特徴を共有し；
   および、場合により、少なくとも一つのプローブによって該単位複製配列を検出するステップを含む、方法。
2. 前記基準鋳型配列が配列番号２であり、該方法が
   − 配列番号９、１２、１４、１５、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
   を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、
   − 配列番号９、１２、１４、１５、２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
   を用いて実施される、請求項２に記載の方法。
4. 前記方法が、
   − 配列番号９１、１００、１０９、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
   を用いて実施される、請求項２、３のいずれか一項記載の方法。
5. 前記方法が、
   − 配列番号９、１２、１４、１５からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および
   − 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および場合により、
   − 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
   を用いて実施される、請求項２〜４のいずれか一項記載の方法。
6. 前記基準鋳型配列が配列番号４であり、該方法が
   − 配列番号１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
   を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
7. 前記方法が、
   − 配列番号１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
   を用いて実施される、請求項６に記載の方法。
8. 前記方法が、
   − 配列番号１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
   を用いて実施される、請求項６〜７のいずれか一項記載の方法。
9. 前記方法が、
   − 配列番号１４８、１５７、１６７からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および
   − 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および場合により、
   − 配列番号１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
   を用いて実施される、請求項６〜８のいずれか一項記載の方法。
10. 前記基準鋳型配列が配列番号５であり、該方法が
    − 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、２９７〜３０３からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
    を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
11. 前記方法が、
    − 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
    を用いて実施される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記方法が、
    − 配列番号２９７〜３０３からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
    を用いて実施される、請求項１０〜１１のいずれか一項記載の方法。
13. 前記方法が、
    − 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および
    − 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および場合により、
    − 配列番号２９７〜３０３からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
    を用いて実施される、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の方法。
14. 前記基準鋳型配列が配列番号１であり、該方法が
    − 配列番号６、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
    を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
15. 前記方法が、
    − 配列番号６、２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
    を用いて実施される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記方法が、
    − 配列番号９１、１００、１０９、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
    を用いて実施される、請求項１４〜１５のいずれか一項記載の方法。
17. 前記方法が、
    − 配列番号６である選択した少なくとも一つのプライマー；および
    − 配列番号２４、５２、８２からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および場合により、
    − 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
    を用いて実施される、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。
18. 前記基準鋳型配列が配列番号３であり、該方法が
    − 配列番号１３９、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド
    を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
19. 前記方法が、
    − 配列番号１３９、１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー
    を用いて実施される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記方法が、
    − 配列番号１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
    を用いて実施される、請求項１８〜１９のいずれか一項記載の方法。
21. 前記方法が、
    − 配列番号１３９である少なくとも一つのプライマー；および
    − 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのプライマー；および場合により、
    − 配列番号１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのプローブ
    を用いて実施される、請求項１８〜２０のいずれか一項記載の方法。
22. 少なくとも一つの単位複製配列を生成する前記ステップが、少なくとも一つの定量および／または定性的、マルチプレックスおよび／または単一ＰＣＲ増幅を含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
23. ＨＩＶ含有試料に対して請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法を実施することによって得られる単位複製配列。
24. 請求項２３に記載の少なくとも一つの単位複製配列を含む増幅組成物。
25. 単一増幅実施において少なくともＨＩＶ１−Ｍ、ＨＩＶ１−Ｏ、ＨＩＶ２−Ａ、およびＨＩＶ２−Ｂをカバーするためのマルチプレックスで使用できると同時に、依然としてリアルタイムの定量的なそれらの増幅を提供できるプライマーの設計において、基準鋳型配列として使用するのに適当なポリヌクレオチドであって、該基準鋳型ポリヌクレオチドが
    − Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４２８１〜４４３６（配列番号２）；および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４２８１〜４４２９（配列番号３０６）、４２８３〜４４２９（配列番号３０７）、４２８３〜４４３１（配列番号３０８）から選択される配列番号２のフラグメント；
    − Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４３３６〜４４９１（配列番号４）；および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４３３６〜４４８４（配列番号３１０）、４４３８〜４４８４（配列番号３１１）から選択される配列番号４のフラグメント；
    − Ｍ３０５０２ ＨＩＶ２基準分離体の位置４８８９〜５０３６（配列番号５）；
    − Ｋ０３４５５ ＨＩＶ１−Ｍ 基準分離体の位置４１７６〜４４３６（配列番号１）、および該ＨＩＶ１−Ｍ分離体の位置４１７６〜４４２９（配列番号３０５）と同一である、配列番号１のフラグメント；ならびに
    − Ｌ２０５８７ ＨＩＶ１−Ｏ基準分離体の位置４２３１〜４４９１（配列番号３）、および該ＨＩＶ１−Ｏ分離体の位置４２３１〜４４８４（配列番号３０９）と同一である、配列番号３のフラグメント
    からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
26. − 配列番号６、８、１１、１４、１５、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１２７、１３６、１３９、１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４、２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、２９７〜３０３
    からなる群から選択され、ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチド。
27. − 配列番号６、８、１１、１４、１５、２４、５２、８２、９１、１００、１０９、１２７、１３６
    からなる群から選択され、ＨＩＶ１−Ｍの検出に適当である、請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。
28. 配列番号１３９、１４８、１５７、１６７、１７０、１７９、１８９、１９０〜１９４からなる群から選択され、ＨＩＶ１−Ｏの検出に適当である、請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。
29. 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、２９７〜２９９からなる群から選択され、ＨＩＶ２−Ａの検出に適当である、請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。
30. 配列番号２２１、２４９、２７６、２８７、２９６、３００〜３０３からなる群から選択され、ＨＩＶ２−Ｂの検出に適当である、請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。
31. 前記オリゴヌクレオチドが蛍光標識されている、請求項２６〜３０のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
32. ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
    − 配列番号６、９、１２、１４、１５からなる群；
    − 配列番号２４、５２、８２からなる群；
    − 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６からなる群；
    中の異なる２群から選択される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、ＨＩＶ１−Ｍの検出に適当である、オリゴヌクレオチドのセット。
33. ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
    − 配列番号１３９、１４８、１５７、１６７からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号１７０、１７９、１８９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；
    を含み、ＨＩＶ１−Ｏの検出に適当である、オリゴヌクレオチドのセット。
34. ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
    − 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号２９７〜２９９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；
    を含み、ＨＩＶ２−Ａの検出に適当である、オリゴヌクレオチドのセット。
35. ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
    − 配列番号２２１、２４９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号２７６、２８７、２９６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号３００〜３０３からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；
    を含み、ＨＩＶ２−Ｂの検出に適当である、オリゴヌクレオチドのセット。
36. ＨＩＶの検出に適当なオリゴヌクレオチドのセットであって、
    − 配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号１９０〜１９４からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号２９７〜２９９からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    − 配列番号３００〜３０３からなる群から選択した少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；
    を含み、ＨＩＶのマルチプレックス検出に適当なオリゴヌクレオチドのセット。
37. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが蛍光標識されている、請求項３２〜３６のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドのセット。
38. − 配列番号９、１２、１４、もしくは１５のプライマーと、配列番号２４、５２、もしくは８２のプライマー；または
    − 配列番号１４８、１５７、もしくは１６７のプライマーと、配列番号１７０、１７９、もしくは１８９のプライマー；または
    − 配列番号２２１もしくは２４９のプライマーと、配列番号２７６、２８７、もしくは２９６のプライマー；または
    − 配列番号６のプライマーと、配列番号２４、５２、もしくは８２のプライマー；または
    − 配列番号１３９のプライマーと、配列番号１７０、１７９、もしくは１８９のプライマー；
    から選択した一対のプライマーを用いてＨＩＶ含有試料から増幅によって得られる単位複製配列。
39. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド長とヌクレオチド長が同一であり、プローブ配列とのヌクレオチド同一率がこのプローブ配列の全長にわたって少なくとも９０％である配列を含み、ここで、このプローブ配列が以下：配列番号９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、または、これらのプローブ配列番号の配列の一つに、このプローブ配列番号の配列の全長にわたって相補的な配列の一つである、単位複製配列。
40. 請求項３８または３９に記載した単位複製配列を含む増幅組成物。
41. ａ．請求項２６〜３１のいずれか一項記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および／または
    ｂ．請求項３２〜３７のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つのセット；および
    ｃ．場合により、それを使用するための使用説明書
    を含むＨＩＶ診断キット。

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