NO311302B1 - Fremgangsmåte for å amplifisere et target RNA segment - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt fremskritt innen molekylær biologi og rekombinant DNA teknologi.

Mere spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å amplifisere et target RNA segment.

Den foreliggende oppfinnelse viser amplifikasjon av en slik spesiell nukleinsyre-targetsekvens i et selvopprettholdende, enkeltstående in vitro system hvori amplifikasjonen av tar-getnukleinsyresekvensen gjennomføres ved fremstilling av multiple transkriptprodukter med eventuell evne til selv-replikasjon. Dette selvopprettholdte amplifikasjonssystem unngår nødvendigheten av gjentatt denaturering av nukleinsyreduplekser som krever gjentatte temperaturendringer (temperatursyklisering). Den foreliggende oppfinnelse kom-binerer på en ny måte alle de reagenser som er nødvendig for å danne, i et enkelt reaksjonsoppsett, et amplifisert produkt, eller et produkt som er passende for påvisning i amplifisert form, og som representerer tilstedeværelse av en target-nukleinsyresekvens.

Den foreliggende oppfinnelse kan blant annet anvendes i forbindelse med analyser av RNA-sekvenser, eller ved ekstra-polering, DNA-sekvenser, som er karakteristiske for en spesiell eller generell patogen sykdom eller tilstand, ved in vitro eller ex vivo nukleinsyreprobehybridiseringsbestemmel-" ser av kroppsvæsker og kroppsvev som inneholder den eller de nødvendige target-nukleinsyresekvenser.

Innen denne teknikk er det et mål å påvise forskjellige nukleinsyresekvenser i en biologisk prøve, hvori en gitt sekvens, en såkalt target-nukleinsyre, er tilstede i små mengder i forhold til dens forekomst blant en rekke forskjellige andre nukleinsyrearter omfattende RNA, DNA eller begge. Det er således ønskelig å påvise den nukleinsyre som koder for polypeptider som kan være forbundet med patologiske syk-dommer eller tilstander, som f.eks. nukleinsyren som korre-lerer til den i det humane virus som gir nedsatt immunforsvar (HIV-1). I tillegg til påvisningen av nukleinsyrer som koder for slike polypeptider, er det ønskelig å påvise andre nukleinsyrer som er karakteristiske for en patologisk sykdom eller tilstand, slik som et defekt gen, som i tilfellet av påvisningen av et defekt humant betaglobingen som f.eks. i forbindelse med hemofili.

De nukleinsyrer som er forbundet med dette er karakteristisk eventuelt tilstede i svært små mengder i forhold til total mengde nukleinsyre i en gitt biologisk prøve som blod eller et annet kroppsfluid, eller en vevsprøve av et gitt individ som skal testes. Påvisning av slik nukleinsyrespesies krever en slik spesifisitet at, dersom tilstede, skal den være på-visbar og kunne måles blant det store utvalg av andre nukleinsyrespesies med hvilke den er omgivelsesmessig forbundet. Enkelte av disse spesier kan ha nær beslektet homologi, i det minste i isolerte segmenter, med targetnukleinsyren. Videre, som angitt over, er disse targetnukleinsyrespesies svært ofte bare funnet i meget små mengder i den biologiske prøve som undersøkes. For rett diagnose av den underliggende sykdoms-tilstand er det viktig at selv små mengder av en slik target-nukleinsyre kan påvises utvetydig hva angår målesystemets nøyaktighet.

Det er gjennomført en rekke forsøk for oppnåelse av dette. I et forsøk er mengden nukleinsyre i prøven ikke endret eller påvirket. I stedet er det utviklet et reportersystem hvorved et stort antall påvisbare molekyler tilsvarende nukleinsyre-targeten dannes for enkel påvisbarhet og måling. Et slikt reportersystem er et signaldannende system forbundet med target-nukleinsyren og gir et påvisbart signal som er repre-sentativt for antall target-sekvensmolekyler.

En annen fremgangsmåte er utviklet og denne er fundamentalt forskjellig ved at den involverer en økning i kopiantallet av selve target-nukleinsyresekvensen. Dette kan gjennomføres ved selektiv amplifikasjon av target-nukleinsyresekvensen. Man kan forbedre dyrkingsteknikkene for prøven slik at target-nukleinsyresekvensen på en eller annen måte foretrukket amplifiseres fremfor andre nukleinsyresekvenser. Disse teknikker er tungvinte og tidkrevende og avhengige av prøving og feiling.

Et annet eksempel på denne fremgangsmåte er amplifikasjon av en target-nukleinsyresekvens i en såkalt "polymerasekjede-reaksjon" (PCR). Denne teknikk ble rapportert av Saiki et al., Science 230, 1350, 1985, og Mullis et al., EPO-patent-søknader, publikasjonsnr. 200362 og 201184 (se også US-PS 4.683.195 og 4.683.202), og omfatter spesielt 1) hybridisering av en primer til et segment av en target-nukleinsyresekvens, 2) ekstendering av nevnte primer med en polymerase, og 3) gjøre dupleksene oppnådd fra primer-eksten-sjonsreaksjonen enkeltrådete. Denne prosedyre kan gjentas i en rekke sykluser for å amplifisere den underliggende target-nukleinsyresekvens.

En forbedret og ny fremgangsmåte er beskrevet detaljert i US-patentsøknader 07/064141 og 07/202978, og i PCT med publikasjonsnr. WO 88/10315, supra. Det anvendes et nytt RNA-tran-skriptproduksjonstrinn sammen med og avledet fra en syntetisert dobbeltrådet cDNA-kopi av den targetsekvens som er operabelt bundet til en promoter derfor. I kraft av at tran-skripsjonstrinnet er det dominerende nyhetsaspekt, er det passende omtalt som et transkripsjonsbasert amplifikasjonssystem (TAS).

Den oppfinnelse omfatter således in vitro eller ex vivo påvisning av minst en spesifikk nukleinsyresekvens (targetsekvens eller segment) i en prøve som inneholder nukleinsyre, omfattende en metode for fremstilling av en dobbeltrådet nukleinsyre inneholdende en sekvens som tilsvarer en targetsekvens som er bundet operabelt til en RNA-polymerasepromoter derfor, ved anvendelse av nevnte dobbeltrådete nukleinsyre som et dobbeltrådet nukleinsyretemplat for fremstilling av et flertall RNA-transkripter derfra, som hver bærer en RNA-sekvens som tilsvarer nevnte targetsekvens, og påvisning av tilstedeværelsen av nevnte RNA-sekvens og ved analogi, tilstedeværelsen av targetsekvens.

Det dobbeltrådete nukleinsyretemplat fremstilles i sin tur ved å tilveiebringe en første nukleinsyreprimer eller probe som inneholder en promotersekvens som er operabelt bundet til en sekvens tilsvarende et segment av en targetsekvens, hybridisering, under passende betingelser, av den første nukleinsyreprimer med targetsekvensen i en prøve som inneholder nukleinsyre, ekstendering av den hybridiserte nevnte første nukleinsyreprimer i en polymerase-ekstensjonsreaksjon komplementært til targetsekvensen for å danne en tilsvarende dupleksnukleinsyre, separering av trådene i nevnte dupleks, hybridisering til den separerte promoterholdige sekvenstråd under passende betingelser av en annen nukleinsyreprimer på den motsatte ende av nevnte promotersekvens, og ekstendering av den hybridiserte nevnte andre nukleinsyreprimer i en polymerase-ekstensjonsreaksjon komplementært til nevnte promoterholdige sekvens.

Den oppfinnelse gir således et enkeltrådet RNA-transkript, eller en RNA-DNA-dupleks dannet derfra når det ikke tas for-holdsregler for å forhindre dens dannelse, som har en sekvens som tilsvarer target-nukleinsyren. Det enkeltrådete RNA-transkriptprodukt blir "struck -off" mer eller mindre kontinuerlig og gir direkte påvisning av targetsegment uten nødvendigheten av tungvinte, gjentatte PCR-sykluser og kjedeseparasjon med feiltilbøyelighet. Slike fordeler tilveiebringes ikke med PCR-teknikken som gir dobbeltrådet DNA (en tråd som omfatter targetsegment og den andre tråd som omfatter komplement av targetsegment), og som må separeres før påvisning og kun etter en rekke gjentatte nødvendige sykluser for å oppnå aksepterbare amplifikasjonsnivåer.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse som en ut-valgt utførelsesform å dra ytterligere fordel av den grunnleggende replikative prosess for amplifikasjon, for å lette påvisningen av target-nukleinsyresekvenser og således oppnå eksponentiell kopiering uten påkrevet temperatursyklisering og annen måling av forløpet av amplifikasjonsmetoden med hensyn til reagenstilsetninger, o.s.v. Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er å kombinere, på en ny måte, fordelene med transkripsjons- og ekstensjonsprodukt-prosedyrer som et middel for å påvise og måle tilsvarende target-nukleinsyre.

Et hovedformål med den foreliggende oppfinnelse er å anvende en selektiv, enzymatisk kutting av RNA-tråden i en RNA-DNA-dupleks, dannet ved hybridisering av en primer til en nukleinsyre -target sekvens etterfulgt av primerekstensjon, som et middel for å tilveiebringe DNA-tråden som et templat for ytterligere hybridisering dertil etterfulgt av primerekstensjon. Det dobbeltrådete DNA-dupleksprodukt inneholder minst en promotersekvens som kan gjenkjennes ved en DNA-avhengig RNA-polymerase og tjener således som et templat for fremstillingen av en rekke transkripter som til sist påvises og måles som et middel for påvisning og måling av target-nukleinsyresekvensen. Dette formål tilveiebringer fordelene med selvopprettholdende targetsekvensamplifikasjon uten behov for temperatursyklisering i en enkel reaksjonsblanding som inneholder (tre) passende enzymaktiviteter og minst en primer som inneholder en promoter som gjenkjennes operativt av en DNA-avhengig RNA-polymerase.

Det er således et generelt formål for den foreliggende oppfinnelse å oppnå de mål som er angitt innen den kjente teknikk og tilveiebringe selektive midler for å ytterligere fremme amplifikasjon av target-nukleinsyresekvenser. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en enkel teknikk som kan anvendes på reproduserbar måte innen en aksepterbar kort tidsperiode, i et isotermisk reaksjonssystem, ved å benytte seg av fordelen med kjente reagenser og med en nøyaktighet som er nødvendig for å oppnå overensstemmende vitenskapelige resultater; en teknikk som kan anvendes i et reproduserbart prøve-oppsett og som kan tilpasses for anvendelse i kit for labora-torie/kliniske analyser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for å amplifisere et target RNA segment som omfatter et 51-subsegment og et 3'-subsegment som ikke overlapper, som er kjennetegnet ved at den omfatter å bringe target RNA segmentet i kontakt med en reaksjonsblanding som omfatter

a) en første primer, som er en enkeltrådet DNA og som omfatter en sekvens som er tilstrekkelig komplementær

til sekvensen av 3<1->subsegmentet av targetsegmentet og, operabelt bundet dertil, sekvensen av en promoter, og b) en andre primer som er en enkeltrådet DNA og omfatter en sekvens som er del av 5<1->subsegmentet av targetsegmentet , c) et enzym med RNA polymeraseaktivitet som gjenkjenner nevnte promoter,

d) et enzym med DNA avhengig DNA polymeraseaktivitet,

e) et enzym med DNA avhengig RNA polymeraseaktivitet,

f) ribonukleosid- og deoksyribonukleosid-trifosfater,

g) et enzym med RNase H aktivitet

og hvor den nevnte reaksjonsblanding holdes under passende

betingelser slik at en reaksjon følger som omfatter dannelsen av et templat inkluderende en funksjonell dobbeltrådet promoter og sekvensen av nevnte target RNA segment,

og dannelsen av RNA ved transkripsjon fra templatet omfattende nevnte promoter ved enzymet med RNA

polymeraseaktivitet,

hvorved RNA dannet ved transkripsjon anvendes som target for videre amplifikasjon ved anvendelse av det eller de enzymer med RNA avhengig DNA polymeraseaktivitet, DNA avhengig DNA polymeraseaktivitet, enzymet med RNA polymeraseaktivitet og de to primere, idet den nevnte fremgangsmåte er en kontinuerlig prosess som ikke involverer noen vesentlig termisk denaturering av nukleinsyreduplekser.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på anvendelsen av et middel for å "tråd-separere" en RNA/DNA-dupleks for å fri-gjøre DNA-kjeden for hybridisering med oligonukleotider inneholdende RNA-polymerasebindingssekvenser (PBS) etterfulgt av primerekstensjon for å danne en DNA-dupleks som kan tjene som et templat for fremstillingen av en rekke tilsvarende RNA-transkripter som kan påvises og måles i form av en endelig bestemmelse for tilstedeværelse av targetnukleinsyresekvens. RNA/DNA-dupleksen er i sin tur dannet ved hybridisering til en RNA-target av en DNA-primer som operativt inneholder en promotersekvens, etterfulgt av primerekstensjon.

Middelet for å bevirke "kjedeseparasjon" omfatter anvendelse av et enzym med RNase H-lignende aktivitet, som RNase H, som selektivt og foretrukket kutter RNA-tråden i dupleksen slik at DNA-tråden frigjøres for ytterligere bearbeiding. Anvendelsen av et slikt enzym eliminerer anvendelse av en tempera-tursyklus for å denaturere den nevnte dupleks.

Nukleinsyre-targetsekvensen kan være en sekvens som egentlig er tilstede som sådan i en nukleinsyreprøve, eller den kan være et tilsvarende DNA-targetsekvens-ekstrapoleringsprodukt. Ekstrapoleringsproduktet fremstilles ved at den dobbeltrådete DNA-targetsekvens denatureres, den hybridiseres til en primersekvens med en operativt assosiert promotersekvens etterfulgt av en primerekstensjonsreaksjon for å danne en DNA-dupleks. Denne DNA/DNA-dupleks denatureres deretter og tråden som inneholder promotersekvensen hybridiseres i den ende som er motsatt promoteren med en andre primer etterfulgt av primerekstensjon for å danne en DNA-dupleks som, når den bringes i kontakt med en DNA-avhengig RNA-polymerase gir det tilsvarende transkript, ekstrapoleringsproduktet. RNA tjener deretter som en target-nukleinsyresekvens for formålene i følge den foreliggende oppfinnelse.

Etter tilveiebringelse av nukleinsyre-targetsekyensen, uavhengig av kilde, hybridiseres denne med en primersekvens som er operativt assosiert med en promotersekvens, etterfulgt av primerekstensjon til å gi en RNA-DNA-dupleks som inneholder en promotersekvens på 5'-enden av DNA-tråden. Primereksten-sjonsreaksjonen kan gjennomføres med enhver passende polymerase, som revers transkriptase. Det grunnleggende aspekt ved den foreliggende oppfinnelse tjener deretter til å frigjøre DNA-tråden i RNA-DNA-dupleksen ved behandling av RNA/DNA-dupleksen med et enzym som selektivt kutter RNA-tråden, som RNase H. Den således frigjorte DNA-tråd gjennomgår enten 1) selvgenerert primerekstensjon via en RNA-primer som er et resultat av den tidligere selektive kutting eller 2) hybridisering med en ytre avledet oligonukleotidprimer som eventuelt bærer operativt en promotersekvens. Primerekstensjon gir en dobbeltrådet DNA-dupleks inneholdende en eller to promotersekvenser, som tjener som et templat for DNA-avhengig RNA-polymeraseindusert transkripsjon til å gi et flertall transkripter.

Under forutsetning av at den foregående reaksjonssekvens kan gjennomføres isotermisk og i samtidig blanding med de tre passende enzymaktiviteter, som f.eks. tilveiebringes av revers transkriptase, RNase H og DNA-avhengig RNA-polymerase, gjennomføres de forskjellige trinn i den foregående prosess på en kontinuerlig, samtidig måte i en gitt tidsperiode. Således, ved det tidspunkt som i det foregående er bestemt som et endepunkt, kan de dannede transkripter påvises og måles for utledet tilstedeværelse av utgangstarget-nukleinsyresekvens . Under forutsetning av at den kontinuerlige og samtidige beskaffenhet av den ovennevnte reaksjonssekvens imidlertid er uavhengig av temperatursyklisering og krever kun en enkel, innledende tilsetning av de enzymaktiviteter som er nødvendig for å gjennomføre disse reaksjoner, gjennomgår transkriptproduktene i seg selv hybridisering med en primer som eventuelt operativt bærer en ytterligere promotersekvens. Dette hybridiseringskompleks etterfølges av en primerekstensjonsreaksjon til å gi en annen RNA/DNA-dupleks som i sin tur underkastes virkningen av det selektive RNA-kutteenzym for å frigjøre DNA-tråden derfra. Denne hybridiseres i sin tur med en selvgenerert RNA-primer eller ytre avledet oligonukleotidprimer som er tilstede i reaksjonsblandingen og som eventuelt operativt bærer en promotersekvens for å danne en annen DNA-dupleks som kan gjenkjennes ved en DNA-avhengig RNA-polymerase til å gi et flertall transkripter med en "sense" motsatt de opprinnelig dannede transkripter.

Mens mekanismen for den eller de forutgående reaksjonssekven-ser ikke er fullstendig klarlagt, mener man at fordi reaksjonsblandingen i kombinasjon anvender de tre passende enzymaktiviteter (som tilveiebringes med f.eks. revers transkriptase, RNase H og DNA-avhengig RNA-polymerase) og minst en primer som inneholder en promoter som gjenkjennes av polymerasen, og fordi reaksjonene ikke er avhengige av en tempe-ratursyklus, forventes det at der hvor to promoterholdige oligonukleotidprimer anvendes, kan reaksjonen gjennomgå en rekke sykluser spontant og kontinuerlig og danne både sense-og antisense-transkripter som på forskjellige måter kan påvises og måles til å gi en amplifikasjonsbestemmelse av mengden target-nukleinsyresekvens som er tilstede i den under-søkte prøve.

Det vesentlige ved den foreliggende oppfinnelse er tilveiebringelse av en reaksjonsblanding som i alt vesentlig til-lates å forbli i ro i en tidsperiode ved en passende temperatur, uten behov for syklisering mellom høyere og lavere temperaturer og uten behov for periodisk tilsetning av enzym eller andre reagenser, hvorved en target-nukleinsyresekvens amplifiseres kontinuerlig og spontant på en selvgenerert måte i nærvær av minst en primer som operativt bærer en promotersekvens og enzymaktivitet som tilveiebragt ved RNA-polymerase som gjenkjenner polymerasebindingssetet i promoteren, en revers transkriptase, et enzym som RNase H som selektivt kutter RNA når dette RNA hybridiseres til DNA i dupleks form, og nødvendige nukleosidtrifosfatsubstrater for RNA-polymerasen og den reverse transkriptase. I et slikt system som er definert heri kan reproduserbare amplifikasjonsnivaer på opp til IO<7> oppnås i løpet av omtrent to timer ved omtrent 37°C ved f.eks. anvendelse av T7 RNA-polymerase, AMV revers transkriptase og E. coli RNase H. En temperatur på mellom omtrent 4°C og omtrent 50°C, foretrukket i området omkring 40°C, kan anvendes. Størrelsen på nukleinsyre-targetsekvensen i foretrukne utførelsesformer inneholder færre enn omtrent 250 baser. Andre variable kan påvirke optimaliseringen av amplifikasjonen heri som f.eks. den anvendte RNA-polymerase, den anvendte reverse transkriptase, pH-verdier, saltkonsentra-sjoner, nukleosidtrifosfatkonsentrasjoner. Disse variable er innen den ordinære kunnskap til fagkyndige på området.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter således in vitro eller ex vivo påvisningen av minst en spesifikk nukleinsyre-targetsekvens i en prøve som inneholder en heterogen samling av RNAer. Den foreliggende oppfinnelse henviser til en metode som omfatter fremstilling av en dobbeltrådet DNA som koder for en sekvens tilsvarende en targetsekvens og med en opera-tiv RNA-polymerasepromoter, idet nevnte dobbeltrådete DNA i sin tur fremstilles ved hybridisering etterfulgt av primerekstensjon til en DNA-tråd som har fått fjernet dens RNA-komplement i en RNA/DNA-dupleks ved virkning av et RNA-selektivt kutteenzym, idet nevnte RNA/DNA-dupleks er dannet ved hybridisering med en primer som operativt bærer en promotersekvens til en targetnukleinsyresekvens etterfulgt av primerekstensjon. Den dobbeltrådete DNA tjener som et templat for fremstillingen av en rekke RNA-transkripter derfra, idet hver bærer en RNA sekvens som tilsvarer nevnte target-nukleinsyresekvens. Tilstedeværelsen av nevnte RNA-sekvens og, ved deduksjon, tilstedeværelse av targetsekvens, kan påvises og måles.

Assosierte metoder og midler for fremstilling og anvendelse av slike RNA-transkripter er omfattet heri. En utførelses-form vedrører den eventuelt repeterende metode for fremstilling av nevnte dobbeltrådete nukleinsyretemplat som definert over, med tilveiebringelse av en første nukleinsyreprimer inneholdende en promotersekvens som er operativt koblet til en sekvens tilsvarende et segment av en targetnukleinsyresekvens, med hybridisering av nevnte første nukleinsyreprimer med target-nukleinsyresekvensen i en prøve som inneholder nukleinsyre under passende betingelser, med ekstensjon av den hybridiserte nevnte første nukleinsyreprimer i en polymerase-ekstensjonsreaks jon komplementært til targetsekvensen for å danne en tilsvarende RNA/DNA-dupleksnukleinsyre, enzymatisk kutting av RNA i nevnte RNA/DNA-dupleks, hybridisering til den frigjorte promoterholdige DNA-sekvenstråd under passende betingelser av en annen nukleinsyreprimer i enden motsatt av nevnte promotersekvens via enten 1) en produktavledet RNA-primer eller 2) en oligonukleotidprimer som eventuelt inneholder en promotersekvens som er operativt koblet dertil, ekstendering av den hybridiserte nevnte andre nukleinsyreprimer komplementært til nevnte promoterholdige sekvens i en polymeraseekstensj onsreaksj on.

En ytterligere utførelsesform vedrører metoder og midler for anvendelse av ovennevnte dobbeltrådete nukleinsyre som et

templat for fremstillingen av en rekke RNA-transkripter derfra i en reaksjon som er katalysert med en DNA-avhengig RNA-polymerase som gjenkjenner promoteren derav, og etter ytterligere eventuell syklisering som beskrevet over påvises og måles tilstedeværelse av nevnte RNA-transkripter.

En ytterligere utførelsesform vedrører forbedring av metoden for amplifisering av en target-nukleinsyresekvens som er dannet som sådan eller som et ekstrapoleringsprodukt fra en target DNA-sekvens, omfattende trinnene med hybridisering av en DNA-primer som har en promotersekvens operativt bundet dertil med nevnte targetsekvens etterfulgt av primerekstensjon til å gi en tilsvarende RNA/DNA-dupleks, hybridisering av den frigjorte DNA-ekstensjonsprodukt-tråd som bærer promotersekvensen av nevnte dupleks med en annen primer i den ende som er motsatt promotersekvensen etterfulgt av primerekstensjon for å danne et dobbeltrådet DNA-templat som kan anvendes for fremstilling av eventuelt replikerbare RNA-transkripter derfra for påvisning som sådan eller for resirkulering som angitt i det foregående. Forbedringen omfatter frigjørelse av ekstensjonsprodukt-DNA-tråden som bærer promotersekvensen av nevnte RNA/DNA-dupleksprimer ved selektiv enzymatisk kutting av RNA-tråden i nevnte RNA/DNA-dupleks.

En utførelsesform vedrører produktet fra fremgangsmåten omfattende behandling av en RNA/DNA-dupleks-RNA som på 5'-enden av DNA-sekvensen har bundet en promotersekvens, med et selektivt RNA-kutteenzym.

En ytterligere utførelsesform vedrører kit som omfatter nød-vendige reagenser og tilhørende midler som kan anvendes i in vitro eller ex vivo påvisning av minst en spesifikk nukleinsyre -targetsekvens i en prøve som inneholder RNA, ved anven-deise av de metoder og midler som er definert i det foregående .

1. Kort beskrivelse av tegningen.

Fig. 1 er en skjematisk fremstilling av en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse. Den skjematiske fremstilling omfatter i alt tolv trinn som, i et foretrukket aspekt derav, menes å være kontinuerlige, selvgenererte trinn ved tilstedeværelse av de nødvendige tre enzymer i reaksjonsblandingen sammen med targetsekvensen og ved en gitt opererbar temperatur. De tre enzymer er som angitt, f.eks. revers transkriptase (RT) anvendt for primer-ekstensjonsreaksjon, RNase H som er et selektivt RNA kutteenzym og som representerer det grunnleggende aspekt for den foreliggende oppfinnelse, og T7 RNA-polymerase som et eksempel på et anvendbart enzym for fremstilling av transkripter fra DNA-duplekstemplatet. Det vesentlige ved den foreliggende oppfinnelse som beskrevet over, er representert ved trinn 3 i den skjematiske fremstilling og det skal forståes og forventes at RNA-transkriptpro-duktet fra trinn 6 kan påvises og måles som sådan eller det kan underkastes en kontinuerlig reaksjon som angitt i trinnene 7 til 12 til å gi anti sensetråden av et RNA-transkript. De dannede RNA-transkripter påvises og måles som et indirekte resultat av tilstedeværelsen av target-nukleinsyresekvensen. PBS representerer polymerasebindingssetet i promotersekvensen. TCS representerer targetkomplementærsekvens.

2. Generelle metoder og definisjoner.

Det henvises til standard lærebøker innen molekylær biologi som inneholder definisjoner og metoder og midler for å gjen-nomføre grunnleggende teknikker i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, som: fremstilling av DNA-probe eller primer, omfattende DNA- syntese eller isolering av sekvenser fra naturlige kilder via restriksjonsenzymkutting og forlengelse derav til å bli passende som sådan eller når bundet til annet DNA for anvendelse som en primer eller probe heri,

fremstilling av oligonukleotider med forskjellige funk-sjonelle sekvenser for anvendelse i hybridisering,

hybridiseringsmetodikk omfattende variasjoner i stringer-te betingelser for å gi mer eller mindre sikker hybridisering avhengig av graden av homologi mellom primeren og

en target-DNA-sekvens,

identifikasjon, isolering eller fremstilling av promotere, eller mere spesifikt promotere eller seter som gjenkjennes av bakteriofag DNA-avhengig RNA-polymerase og bakteriofag RNA-avhengig RNA-polymerase eller ved anvendelse av eukaryote systemer, viral DNA- og RNA-avhengig RNA-polymerase, f.eks. adenoviruskodet RNA-polymerase og

"brome"-mosaikkvirus RNA-polymerase,

identifikasjon, isolasjon eller fremstilling av RNA-polymerase som er i stand til å gjenkjenne de ovennevnte promotere eller i stand til primerekstensjonsreaksjoner, med betingelser som fører til fremstilling av RNA-transkripter omfattende såkalte transkripsjons-enhancer sekvenser, forhold som leder til initiering og opprettholdelse av primer-ekstensjonsreaksjoner omfattende anvendelse av

DNA-avhengig polymerase og DNTPer,

mekanisme og metodikk for (indusert) replikasjon, o.s.v.

Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, og Colowick et al., Methods in Enzymology 100, vol. 152, Academic Press, Inc., 1987, og de forskjellige referanser som angitt deri, Hong, Bioscience Reports 1, 243, 1981, Cooke et. al., j. Biol. Chem. 255 6502, 1980, og Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468-500, 1983, Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331, 1980, Narang et al., Meth.

Enzym. 68, 90, 1979, Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981, Brown et al., Meth. Enzym. 68, 109, 1979, Caruthers et al., Meth. Enzym. 154, 287, 1985, Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073, 1980, Lee et al., Science 239, 1288, 1988, Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8783, 1987, Miller et al., Virology 125, 236, 1983, Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 153, 23, 1981, Miller et al., Nature 313, 68, 1985, Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 172, 369, 1984, Ahlquist et al., Plant Mol. Biol. 3, 37, 1984, Ou et al., PNAS 79, 523 5, 1982, Chu et al., Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986), europeisk patentsøknad publikasjonsnr. (EPA) 194809, Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses, side 327-336, Alan R. Liss (publisert, New York), 1987, Proceedings of UCLA Symposium, 1986), Miller et al., J. Mol. Biol. 187, 537, 1986, Stoflet et al., Science 239, 491, 1988, Kramer et al., J. Mol. Biol. 89, 719, 1974, Saris et al., Nucl. Acids Res. 10, 4831, 1982, Bresser et al., PNAS 80, 6523, 1983, Chu et al., Nucleic Acids Research 16, 3671, 1988, Gubler et al., Gene 25, 263, 1983, og D'Alessio et al., Nucleic Acids Res.

16, 1999, 1988, såvel som de referanser som er angitt deri.

Med uttrykket "promoter" menes en nukleinsyresekvens (naturlig forekommende eller fremstilt syntetisk eller et produkt av restriksjonskutting) som spesifikt gjenkjennes av en RNA-polymerase som binder til en gjenkjent sekvens og initierer transkripsjon hvorved det dannes et RNA-transkript. Den kan eventuelt inneholde nukleotidbaser som strekker seg utover det aktuelle gjenkjenningssete, og som synes å gi ytterligere stabilitet overfor nedbrytningsprosesser, og kan også inklu-dere ytterligere pluss (+) nukleotider tilstøtende til tran-skripsjonsinitieringssetet. Prinsipielt kan enhver promotersekvens anvendes for hvilken den er en kjent og tilgjengelig polymerase som er i stand til å gjenkjenne initieringssekven-sen. Typiske kjente og anvendbare promotere er dem som gjenkjennes av bestemte bakteriofagpolymeraser som bakteriofag T3, T7 eller SP6. Se Siebenlist et al., Cell 20, 269, 1980. Disse er kun eksempler på de polymeraser som kan anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse sammen med deres assosierte promotersekvenser.

"RNA-transkriptet" herav er den ribonukleinsyresekvens som er dannet etter transkripsjonsinitiering etter RNA-polymerase-gjenkjenning av promotersekvensen (se det foregående). Fremstillingen av slike transkripter er mer eller mindre kontinuerlig, avhengig delvis av mengden tilstedeværende polymerase.

Med betegnelsen "probe" eller "primer" i denne sammenheng

menes en enkeltrådet nukleinsyresekvens (naturlig forekom-

mende eller dannet syntetisk eller et produkt av restriksjonskutting) som har tilstrekkelig komplementaritet med targetsekvensen slik at den under passende hybridiseringsbe-tingelser er i stand til hybridisering, d.v.s. binding til den passende (target) sekvens. En typisk probe eller primer har minst omtrent ti nukleotider, og mest foretrukket omtrent tyve eller flere nukleotidbaser, og i dens mest foretrukne utførelsesform har den felles identitet med eller den er

svært komplementær til den passende (target) sekvens. Se f.eks. EPA 128042 (publisert 12. desember 1984). En slik probe eller primer er slik at den vil hybridisere til en kom-plementsekvens for en primerekstensjonsreaksjon i nærvær av passende reagenser og under passende betingelser.

> Betegnelsen "operativt bundet/koblet" eller "assosiert" eller grammatiske variasjoner derav, særlig i forbindelse med bin-dingen av en promotersekvens inne i en RNA-kodende DNA-sekvens, refererer til dens funksjonalitet i forbindelse med

dannelse av tilsvarende RNA-transkripter når promoteren gjen-) kjennes ved hjelp av den passende polymerase, som angitt over.

Teknikkene som omfatter dannelse av et deteksjonssignal som

via radioaktiv merking eller ved hjelp av kromogene midler

5 ved anvendelse av et fargefølsomt enzym er også vel kjente og dokumentert innen den kjente teknikk.

En prøve hvorpå analysemetoden i henhold til oppfinnelsen

gjennomføres kan være en uren prøve av et biologisk material, o som serum eller en annen kroppsvæske, et vevskulturmedium eller et næringsmiddelmaterial. Mere typisk gjennomføres metoden på en bearbeidet prøve, som er fremkommet fra en uren prøve ved hjelp av forskjellige behandlinger for å fjerne

materialer som vil kunne interferere med påvisning av target, 5 som ved å gi ikke-spesifikk binding av affinitetsmolekyler. Metoder for bearbeiding av urene prøver til å gi en prøve som er mer passende for fremgangsmåten i overensstemmelse med oppfinnelsen er vel kjente innen teknikken.

Transkriptene (RNA) kan påvises på en rekke forskjellige måter: Påvisning kan gjennomføres ved UV-absorbans av RNA, som f.eks. ved metoden med kontaktkopiering (Kutateladze et al., Anal. Biochem. 100, 129, 1979).

Ved anvendelse av et radioaktivt merket ribonukleosid-5'-tri-fosfat i reaksjonen (f.eks.<3>H-merket eller cc-32P04-merket) , slik at RNA er radioaktivt, kan RNA påvises ved hjelp av en rekke kjente prosedyrer på grunn av dens radioaktivitet.

Biotin eller iminobiotin kan innlemmes i RNA som deretter kan påvises ved hjelp av kjente teknikker med et enzymavidin-eller enzymstreptavidinaddukt, som binder til det RNA-bundne biotin og katalyserer dannelse av et passende påvisbart kromogen. Innlemmelse av biotin eller iminobiotin kan gjen-nomføres ved anvendelse av UTP som er biotinylert gjennom en avstandsdanner (spacer) til karbon-5 i uracildelen som et substrat for replikase i replikasjonsreaksjonen. Slike UTPer er kjente forbindelser. Det er videre kjent at slike UTPer er substrater for QB-replikase, og at RNAer som inkluderer uraciler som er biotinylert gjennom spacergrupper bundet til karbon-5-stillingen, er templater for QB-replikasekatalysert replikasjon på grunn av anvendelse av slik UTPer i deres syntese.

RNA kan gjøres fluorescerende ved anvendelse av en T4 RNA-ligasekatalysert reaksjon for å tilknytte nukleotider som er modifisert til å være fluorscerende til 3'-enden av replika-tiv RNA. Se Cosstick et al., Nucl. Acids Res. 12, 1791, 1984. Fluorescensen for det resulterende RNA kan anvendes for å påvise RNA ved hjelp av en rekke standard teknikker.

Blant ytterligere metoder som kan anvendes for å påvise RNA er dem hvori en reportersubstans, som binder spesifikt med nukleinsyre, tilsettes til systemet hvori replikasjonen har funnet sted, eller til mediet, slik som en positivt ladet bærer som ECTEOLA-papir, hvorpå replikert RNA er isolert, og signalet fra reportersubstansen måles. Slike substanser inkluderer: kromogene fargestoffer, som "stains all"

(Dahlberg et al., J. Mol. Biol. 41, 139, 1969), metylenblatt (Dingman et al., Biochemistry 7, 659, 1968), og sølvfarge (Sammons et al., Electrophoresis 2, 135, 1981, Igloi, Anal. Biochem. 134, 184, 1983), fluorogene forbindelser som binder til RNA, f.eks. etidiumbromid (Sharp et al., Biochemistry 12, 3055, 1973, Bailey et al., Anal. Biochem. 70, 75, 1976), og fluorogene forbindelser som binder spesifikt til RNAer som er templater for replikasjon ved QB-replikase, f.eks. et fykobiliprotein (Oi et al., J. Cell Biol. 93, 981, 1982, Stryer et al., US-PS 4.520.110) konjugert til virussubenheten i QB-replikase.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse blir analyser gjennomført samtidig og under forhold som er så like som mulig for både testprøver og kontrollprøver. Som kjent innen teknikken er kontrollprøver tilsvarende testprøver, men de er kjent til enten å ikke inneholde target eller de inneholder en kjent mengde target. En kontroll uten target gir "bak-grunnen" hvorunder det ikke er mulig å skjelne prøver som inneholder target fra dem uten target. Ved å sammenligne mengden eller konsentrasjonen av dannet RNA i en analyse av en testprøve med mengden eller konsentrasjonen som er dannet med kontrollprøver som analyseres samtidig, kan tilstedeværelse av target i testprøven på et nivå over bak-grunnen bestemmes. Dersom det anvendes kontrollprøver med et område av kjente targetkonsentrasjoner kan konsentrasjon av target i en testprøve estimeres.

Anvendelse av en "replikase" for (autokatalytisk) induksjon

av replikasjon av de eventuelt replikerbare RNA-transkripter i oppfinnelsens sammenheng er generelt kjent innen teknikkens stand. Passende eksempler på slike replikaser som kan anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer den såkalte QB-virus replikase som gjenkjenner visse nukleinsyresekvensseter på endene av det gitte RNA-transkript og det såkalte "brome"-mosaikkvirus (BMV) så vel som a-virus-replikaser som antas å gjenkjenne nukleinsyresekvensseter på 31 -

enden av et gitt RNA-transkript. Disse replikaser tjener til å replikere, d.v.s. reprodusere, RNA-transkriptene og komple-mentene for å flerdoble kopier derav. Når et slikt enzym er tilstede i reaksjonen under transkripsjonsprosessen kan det forutses at de multiple transkripter som dannes under transkripsjon selv kan gjennomgå replikasjon for å eksponentielt øke mengden RNA-transkriptprodukt.

3. Detaljert beskrivelse av utførelsesformer.

Det vesentligste ved den foreliggende oppfinnelse er evnen til å fullføre multiple amplifikasjonssykluser in vitro uten behov for termisk syklisering eller tilsetning av ytterligere enzymer. Den figur som er vedlagt den foreliggende beskrivelse angir et skjema for en foretrukket utførelsesform i form av et diagram. Et prinsipielt og særlig fremtredende aspekt er innlemmelse av enzymet RNase H. Med ytterligere henvisning til tegningen er trinn 1 og 2 identiske med dem som anvendes i den såkalte TAS-prosedyre, se de patentsøk-nader og PCT-søknader man har henvist til i innledningen til foreliggende søknad, men i trinn 3 blir RNA/DNA-hybrid dupleksen "trådseparert" ved selektiv kutting av RNA-targeten ved anvendelse av RNase H istedet for et trinn med varmedena-turering. RNase H aktiviteten har bare spesifisitet for RNA når den er tilstede i en RNA/DNA-hybrid dupleks. Produktene fra denne kutting kan enten være unike RNA-oligomerer eller multiple RNA-oligomerer (trinn 4), og disse oligomerer kan deretter virke som primere for DNA-syntese ved anvendelse av revers transkriptase (RT) som katalysator i denne cDNA-reaksjon (trinn 5). Den dobbeltrådete DNA vist i trinn 5 kan virke som et templat for T7 RNA-polymeraserettet transkripsjon (trinn 6). Dette amplifiserte RNA-produkt tjener nå som deteksjonsreportermolekyler for targetsekvensen og/eller tjener som ytterligere targetmolekyler for å vedlikeholde de selvsykliserende reaksjoner (trinnene 7 til 12).

De mest vellykkede reaksjoner som gir en ca. 10<6->dobbelt tar-getamplifikasjon virker med tre enzymer og to oligonukleotidprimere som inneholder T7 RNA-polymerasebindingssekvensen (PBS). De nødvendige enzymer er AMV revers transkriptase, T7 RNA-polymerase og E. coli RNase H. Tilsetning av E. coli RNase H til reaksjonen understøtter RNase-aktiviteten som er tilstede i AMV revers transkriptase og synes nødvendig for å gi høye amplifikasjonsnivåer. Utvelging av optimale oligo-nukleotidprimersentre i områder av lengden av den target-rettede sekvens, innlemmelse av polymerasebindingssekvensen på en eller begge primere og virkningen av de polymerasebindende sekvensholdige primere som en transkripsjonspromoter virker alle tre på amplifikasjonsnivået. Innlemmelse av to oligonukleotidprimere som hver inneholder en PBS ga mere amplifikasjon enn innlemmelse av en enkel PBS-holdig primer og en ikke-PBS-holdig primer.

Under henvisning til den vedlagte figur:

1) er mRNA-targetmolekyl annealet med et targetspesifikt syntetisk oligodeoksyribonukleotid med innlemmelse av en

T7 RNA-polymerasepromoterbindingssekvens,

2) denne primer ekstenderes ved hjelp av DNA-polymeraseaktiviteten av AMV revers transkriptase for å syntetisere den

første cDNA-tråd,

3) RNase H-aktiviteten av AMV revers transkriptase og E. coli RNase H degraderer RNA i RNA/DNA-hybrid dupleksen, og gjør DNA tilgjengelig som et templat for andre-tråd

cDNA syntese,

4) selvgenererte oligoribonukleotider fra RNase H kutting eller et syntetisk oligodeoksyribonukleotid som foretrukket innlemmer en T7 RNA-polymerase-promoterbindings-sekvens (ikke vist i figuren) initierer syntese av andre-tråd cDNA. AMV revers transkriptase ekstenderer deretter primeren til å gi dobbeltrådet DNA som innlemmer en ope-rativ T7 RNA-polymerasepromoterbindingssekvens, 5) T7 RNA-polymerase binder til den dobbeltrådete promoter-bindingssekvens og transkriberer kopier av RNA komplementært til target-nukleinsyre, 6) en annen oligodeoksyribonukleotidprimer med en PBS anne-aler til RNA-transkriptet, 7) AMV revers transkriptase katalyserer syntese av en cDNA-tråd, 8) RNase H degraderer RNA i RNA/DNA-hybrid dupleksen og gjør

DNA tilgjengelig som et templat for andre-tråd syntese,

9) en oligodeoksyribonukleotidprimer hybridiserer til andre-tråd cDNA, og AMV revers transkriptase syntetiserer DNA. Transkripsjon forekommer og syklisering fortsetter.

4. Eksempler.

1. Amplifikasjon av et første HIV-1 env område. Et område av HIV-l RNA ble amplifisert i en isoterm enzymatisk reaksjon som dannet IO6 ganger flere kopier av dette området på slutten av reaksjonen.

a. Amplifikasjonsreaksjon.

Utgangsnukleinsyrematerialet var cesiumpelletert RNA som var ekstrahert fra HIV-l-infiserte CEM-celler (human lymfoblas-toid cellelinje, Folks et al., Proe. Nati. Sei. USA 82, 4531, 1985) ved guanidinisotiocyanat-cesiumklorid-gradient-prosedyren som beskrevet av Maniatis et al., Supra. (HIV-1-spesifikke sekvenser ble estimert til å være fra 1 til 10 % av total mengde tilstedeværende nukleinsyre.)

En tiendedels attomol av target-nukleinsyren ble plassert i en reaksjonsblanding (totalt volum 100 /il) inneholdende (sluttkonsentrasjoner) : 40 mM Tris-HCl, pH 8,1,

12 mM MgCl2,

25 mM NaCl,

2 mM Spermidin - (HC1)3,

5 mM Ditiotreitol,

8 0 /ig/ml BSA,

1 mM av hver av dATPm, dCTP, dGTP, dTTP,

1 mM av hver av ATP, CTP, GTP, UTP,

0,25 [ ig av hvert priming-oligonukleotid (88-211 og 88-347, se nedenfor).

Reaksjonsbestanddelene ble kombinert i et 1,5 ml Eppendorf-rør på 1,5 ml og deretter vortex-blandet kortvarig og for-siktig. Target-nukleinsyren ble denaturert ved oppvarming av røret til 65°C i ett minutt i et vannbad. Etter avkjøling til 37°C i ett minutt ble følgende enzymer tilsatt:

2 5 enheter AMV revers transkriptase (15 - 25 enheter//il) ,

100 enheter T7 RNA-Polymerase (100 enheter//il) ,

4 enheter E. coli RNase H (2 enheter//il) .

Reaksjonen fortsatte i tre timer ved 37°C uten ytterligere endringer.

b. Påvisning av amplifikasjonsprodukter.

Etter omtrent en time ble produktene påvist ved anvendelse av et <32>P-merket oligonukleotid som er komplementært til et område med 30 basepar innen det amplifiserte fragment (88-298). En prøve av reaksjonsblandingen som representerte 1/40 av det totale volum ble denaturert i 95,0 /il 7,4 % formaldehyd og 10x SSC (Maniatis et al., Supra) ved 55°C i et vannbad i tyve minutter. Prøven ble umiddelbart avkjølt på is og deretter påført på en nitrocellulosemembran gjennom et "slot-blot"-apparat. Nukleinsyrer ble immobilisert til nitrocellulosen ved hjelp av UV-bestråling (254 nm).

Etter fiksering ble filtrene prehybridisert ved 55°C i 15 minutter i 50-100 /il buffer/cm<2> filter inneholdende 0,5 % BSA, 0,5 % polyvinylpyrrolidon, 5x SSPE (20x=3,6 M NaCl, 200 mM NaH2P04, 20 mM EDTA, PH 7 - 8) og l % SDS. Hybridisering skjedde ved 55°C i to timer i den samme buffer inneholdende 2-5 x IO<6> cpm/ml av den fosforylerte oligonukleotidprobe. Proben var tilsatt til prehybridiseringsbufferen. Filtrene ble derpå vasket tre ganger ved romtemperatur i tre minutter ved anvendelse av 1 ml buffer/cm<2> filter, lx SSPE, 1% SDS, deretter ett minutt i den samme buffer ved 55°C.

Filtrene ble deretter røntgenfotografert ved -70°C med en forsterkende skjerm.

Amplifikasjonsnivåer ble estimert ved å sammenligne inten-siteten av signalet dannet ved det amplifiserte produkt med signalet dannet ved kjente mengder av HIV-l RNA eller på pARV7A/2 (Luciw et al. Nature 312, 760, 1984), et plasmid inneholdende en cDNA-kopi av HIV-l-genomet innskutt i EcoRI-setet av pUC19.

I det eksempel som er beskrevet i det foregående var amplifikasjonsnivået 1 x IO<6>. Northern-blot og Southern-blot analyser av produktet ved anvendelse av deteksjonsprober 88-297 og 88-2 98 viste at det var en blanding av DNA og RNA, hvori RNA var den dominerende spesies. Produktet var av diskret størrelse (= 210 bp) innen et snevert område (20 - 40 bp) . 2. Amplifikasjon av et andre HIV-1 env område.

Amplifikasjon av et andre HIV-1 env område ble gjennomført ved anvendelse av de prosedyrer som er beskrevet i eksempel 1, med unntak av at priming-oligonukleotider 87-284 og 88-347 (nedenfor) ble anvendt for amplifikasjon, og deteksjonsoligonukleotider 86-272 og 86-273 (nedenfor) ble anvendt for påvisning. Det ble oppnådd en IO<3->ganger amplifikasjon.

3. Amplifikasjon av HIV-1 sor område.

Amplifikasjon av HIV-1 sor området ble gjennomført ifølge den prosedyre som er beskrevet i eksempel 1, med unntak av at primingoligonukleotider 88-77 og 87-292 (nedenfor) ble anvendt for amplifikasjon, og deteksjonsoligonukleotider 86-31 og 86-32 (nedenfor) ble anvendt for påvisning. Det ble oppnådd en IO<3->ganger amplifikasjon. 4. Amplifikasjon av det første HIV-1 env område fra kliniske blodprøver fra AIDS pasienter.

RNAer fra tre HIV-l-infiserte kliniske prøver ble amplifisert . RNAer ble ekstrahert ved prosedyren for organisk ekstraksjon (nedenfor).

Amplifikasjon ble gjennomført som i eksempel 1 ved anvendelse av primingoligonukleotider 88-211 og 88-347 (nedenfor) og deteksjonsoligonukleotider 88-297 og 88-298 (nedenfor).

To av prøvene viste positive resultater. Den totale amplif fikasjon for reaksjonene i disse forsøk var 10<5->ganger. På grunn av at det signal som ble påvist etter amplifikasjon er direkte proporsjonalt med mengden utgangsmaterial som er tilstede ved begynnende reaksjon (se eksempel 5) , er det mulig at den tredje kliniske prøve ikke ble identifisert til å være HIV-1-infisert fordi den inneholdt for lite av utgangstarget HIV-1-sekvensen. 5. Amplifikasjon av det første HIV-1 env område i ikke-infiserte CEM-celler blandet med forskjellige mengder HIV-l-infiserte CEM-celler.

Amplifikasjon ble gjennomført som i eksempel 4 ved anvendelse av primingoligonukleotider 88-211 og 88-347 (nedenfor), og deteksjonsoligonukleotider 88-297 og 88-298 (nedenfor).

Target-amplifikasjon ved anvendelse av totale nukleinsyrer ekstrahert (se eksempel 7) fra IO<3> til 1 HIV-l-infiserte CEM-celler i en populasjon på IO<6> ikke-infiserte CEM-celler viste et signal som var proporsjonalt med antall infiserte celler tilstede i prøven. Den negative kontroll, d.v.s. IO<6> ikke-inf iserte CEM-celler, viste liten bakgrunn. Dette bakgrunns-signal var betydelig mindre enn det signal som ble oppnådd fra den 10-infiserte CEM-celleprøve.

6 . Reagenser og oligonukleotider.

a. Reagenser: Nukleotidtrifosfater er fra Sigma, AMV revers transkriptase er fra Life Sciences, T7 RNA polymerase er fra Stratagene, E. coli ribonuklease H og BSA er fra Bethesda Research

Labs.

b. Oligoer: Oligonukleotider ble syntetisert ved fosfor-amidittkjemi ved anvendelse av Applied Biosys-tems 38OA, og deretter renset ved hjelp av

HPLC.

De oligonukleotider som ble anvendt som primere og prober er spesifikke for HIV-1 og tilsvarer de sekvenser som er rapportert av Råtner et al., Nature 313, 277, 1985, for env og sor områdene.

88-211: (priming-oligonukleotid, nt 6450-6479, env)

88-297: (deteksjonsoligonukleotid, nt 6560-6531, env) 88-298: (deteksjonsoligonukleotid, nt 6531-6560, env) 88-347: (priming-oligonukleotid, nt 6661-6632, env) 88-77: (nt 5018-4988, sor) priming 87-292: (nt 4766-4796, sor) priming 86-31: (nt 4901-4932, sor) påvisning 86-32: (nt 4932-4901, sor) påvisning 87-284: (nt 6551-6579, env) priming 86-272: (nt 6591-6620, env) påvisning 86-273: (nt 6620-6591, env) påvisning

Hvert priming-oligonukleotid inneholder en sekvens i 5'-enden som er den T7 RNA-polymerasebindende sekvens (understreket) og det foretrukne transkripsjonsinitieringssete (uthevet). Resten av sekvensen er komplementær til targetsekvensen.

I forhold til HIV-1-targetsekvensen, er oligonukleotidene 88-211, 88-298, 87-292, 86-31, 87-284 og 86-273 komplementære til den negative tråd, og oligonukleotidene 88-347, 88-297, 88-77, 86-32 og 86-272 er komplementære til den positive tråd.

7. Organisk ekstraksjon av RNAer.

Prosedyre for nukleinsyrefremstilling på infiserte celle-prøver: Pelletceller: 5K opm i ti muinutter fra 1 ml Tris-bufret saltoppløsning. Supernatanten trekkes av og kastes, og det oppnås 50 fil av en pellet.

Pelleten resuspenderes i 600 fil Lysis-buffer.

Løsningen vortex-blandes kraftig og inkuberes ved 50°C i 45 minutter og vortex-blandes i 10 - 15 sekunder hvert tiende minutt.

En blanding av 600 fil fenol:kloroform: isoamylalkohol (50:48:2) tilsettes. Blandingen rystes og vortex-blandes for å emulgere blandingen og sentrifugeres ved 14K opm i to minutter for å separere fasene.

575 fil tas ut av den vandige toppfase. Det tilsettes 600 /il av en blanding av fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:48:2). Blandingen rystes og vortex-blandes for å emulgere blandingen og sentrifugeres ved 14K opm i to minutter for å separere fasene.

525 /il tas ut av den vandige fase, og 600 /il av en blanding av kloroform:isoamylalkohol (24:1) tilsettes. Blandingen

rystes og vortex-blandes for å emulgere blandingen og den sentrifugeres ved 14K opm i to minutter for å separere fasene.

400/xl tas ut fra den vandige fase (ikke overfør cellerester som kan være tilstede i grenseflaten).

1/10 volum (40 fil) 8 M LiCl tilsettes. På dette tidspunkt kan prøver oppdeles for bearbeiding. 3 volumdeler iskald 100 % etanol tilsettes til prøver som er oppdelt. 2,5 volumdeler iskald 100 etanol tilsettes til prøver som ikke er oppdelt. Man blander godt og gjennomfører utfelling ved -20°C over natten eller i et tørris/etanolbad i 15 minutter.

Reagenser:

Lysis-buffer: 20 mM Tris pH 7,5,

150 mM NaCl,

10 mM EDTA,

0,2 % SDS

200 /ig/ml proteinase K. Tris-bufret saltløsning:137 mM NaCl,

5,1 mM KC1,

24,8 mM Tris-base,

Innstill pH til 7,4 med 1 N HCl,' Steriliser ved autoklavering.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for å amplifisere et target RNA segment som omfatter et 5'-subsegment og et 3<1->subsegment som ikke overlapper, karakterisert ved at den omfatter å bringe target RNA segmentet i kontakt med en reaksjonsblanding som omfatter a) en første primer, som er en enkeltrådet DNA og som omfatter en sekvens som er tilstrekkelig komplementær til sekvensen av 3'-subsegmentet av targetsegmentet og, operabelt bundet dertil, sekvensen av en promoter, og b) en andre primer som er en enkeltrådet DNA og omfatter en sekvens som er del av 5'-subsegmentet av targetsegmentet , c) et enzym med RNA polymeraseaktivitet som gjenkjenner nevnte promoter, d) et enzym med DNA avhengig DNA polymeraseaktivitet, e) et enzym med DNA avhengig RNA polymeraseaktivitet, f) ribonukleosid- og deoksyribonukleosid-trifosfater, g) et enzym med RNase H aktivitet og hvor den nevnte reaksjonsblanding holdes under passende betingelser slik at en reaksjon følger som omfatter dannelsen av et templat inkluderende en funksjonell dobbeltrådet promoter og sekvensen av nevnte target RNA segment, og dannelsen av RNA ved transkripsjon fra templatet omfattende nevnte promoter ved enzymet med RNA polymeraseaktivitet, hvorved RNA dannet ved transkripsjon anvendes som target for videre amplifikasjon ved anvendelse av det eller de enzymer med RNA avhengig DNA polymeraseaktivitet, DNA avhengig DNA polymeraseaktivitet, enzymet med RNA polymeraseaktivitet og de to primere, idet den nevnte fremgangsmåte er en kontinuerlig prosess som ikke involverer noen vesentlig termisk denaturering av nukleinsyreduplekser.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at enzymet med RNase H aktivitet er E. coli RNase H.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at både den DNA-avhengige DNA polymerase og revers transkriptase-aktiviteter tilveiebringes ved en revers transkriptase av et retrovirus valgt fra gruppen som utgjøres av AMV og MMLV, og hvor RNA polymeraseaktiviteten tilveiebringes ved RNA polymerasen av en bakteriofag valgt fra gruppen som utgjøres av T7, T3 og SP6, og hvor der er en RNA polymerase tilstede i opp-løsningen.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte reaksjonsblanding holdes ved en temperatur mellom 3 3°C og 46°C.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 4, karakterisert ved at, etter amplifikasjonen, detekteres target RNA og/eller RNA med en sekvens komplementær til nevnte target RNA i en nukleinsyre-probehybridise-ringsanalyse.

6. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den andre primer er et resultat av selektiv kutting av RNA tråden i en RNA/DNA dupleks som er dannet i prosessen.