CN103384832B - 用于在猫科动物中诊断和治疗肾功能障碍的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在猫科动物中诊断肾疾病的存在的方法，所述方法包括测量来自猫科动物的生物样品中选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19，其中所述样品中的一种或多种生物标志物的表达相对于来自正常动物的样品中的表达的对照值的差异表明存在肾疾病；治疗如此诊断的猫科动物的方法；以及用于实施所述特定方法的组合物、试剂和试剂盒。

Description

用于在猫科动物中诊断和治疗肾功能障碍的组合物和方法
发明领域
本发明涉及在猫科动物中诊断和/或监测肾脏疾病和障碍的组合物、材料和方法，包括在猫科动物中通过测量所选择的基因的表达，用于特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的肾疾病的状态的诊断、设计和监测治疗计划，以及监测所述肾疾病的状态的方法。
序列表
本申请含有已通过EFS-Web递交并通过引用以其全部结合到本文中的序列表。在2010年3月30日创建的所述ASCII副本称为8888P0US.txt，并且大小为7809字节。
发明背景
肾炎为肾脏炎症的通用术语，其可为局灶性或弥漫性的增生性或破坏性的疾病，涉及肾小球、肾小管或肾间质(或结缔)组织。肾炎可通过多个阶段发展，在末期肾脏疾病或末期肾衰竭结束。肾炎的最常见形式为肾小球性肾炎。
肾小球性肾炎或肾小球性肾炎(“GN”)为特征在于肾脏的小球或毛细血管袢的炎症的病症。这种病症以急性、亚急性和慢性形式发生，并可为特发性或继发于感染、疾病或暴露于毒素。
肾衰竭为肾脏不能保持其正常功能。结果，代谢废物和代谢物在血液中积聚。这些废物和代谢物可不利地影响大多数身体系统。保持体液和电解质平衡方面的失调为肾衰竭的特点。
急性肾衰竭可由于创伤、感染、炎症或暴露于肾毒性物质而突然发生。该病症可导致脱水、低血压和循环衰竭。急性肾衰竭通常分成3类：(1) 肾前性衰竭(pre-renalfailure)，其与肾血流量减少有关；(2) 肾内衰竭(intra-renal failure)，其与缺血和毒素有关；和(3) 肾后性衰竭(post-renal failure)，其由尿流堵塞引起。
慢性肾衰竭包括肾功能的进行性丧失，其可最终发展为末期肾脏疾病或衰竭。起初，慢性肾衰竭由于肾功能下降而开始，而没有代谢废物在血液中的明显积聚。当肾小球滤过率由于炎症而减慢，废物开始积聚。疾病由于肾功能低而发展到尿毒症，并且高水平的蛋白最终产物开始积累并损害身体功能。慢性肾衰竭的常见原因包括：炎症、感染、尿路梗塞及某些全身性疾病和毒性，包括血钙过多、红斑狼疮、糖尿病和高血压。
末期肾脏疾病的标志为不可逆性的慢性肾衰竭。血清肌酸酐和血尿素氮水平持续升高，并且生成的尿毒症损害所有身体系统。肾脏可以正常肾功能的大约10%或更少的级数遭受永久性和几乎完全的功能丧失。末期肾脏疾病的一个原因为肾小球性肾炎。其它原因包括对慢性肾衰竭提及的那些原因。
肾小球为肾脏的肾单位的结构组件，并由通常描述为毛细血管袢(capillarytuft)或丛(cluster)的小血管构成。肾单位为肾脏的基本结构和功能单位，其也包含称为马马尔皮基氏(malpighian)或鲍曼氏囊(Bowman’s, capsule)的结构，以及包含小动脉和肾小管。鲍曼氏囊含有肾小球袢和肾小管。肾小球为非常小的毛细血管，因此通过这些血管的血流非常慢，并且血液中的分子可变得易于沉积在这些微小毛细血管的壁上。肾小管由基底膜和上皮层组成，并用于分泌、收集和导尿。
肾小球在肾单位内起过滤器作用。血液中的水和小分子流过肾小球，并通过称为基底膜的结构过滤，其由肾小球和鲍曼氏囊形成。包含水和小分子的滤液通过肾小管被吸收，并在最终转化成尿液之前被重吸收。基底膜由各种大小的孔隙组成，这些孔隙用于过滤小分子和防止较大的分子通过基底膜。肾单位的特殊功能是自血浆去除某些代谢终产物，比如尿酸、尿素和肌酸酐，以及过量的电解质，例如钠、氯和钾离子。通过重吸收水和电解质，肾单位在保持体内正常体液平衡方面起重要作用。
肌酸酐为由于肌氨酸代谢形成的含氮化合物。肌氨酸依次为在体内自3种氨基酸(精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸)合成的非蛋白质物质。发现这种分子在肌肉中以小量存在，并且当与磷酸结合为磷酸肌酸时，用作高能磷酸的存储形式，用于各种代谢过程。肌酸酐被吸收到血液中，并最终在尿中排泄。因此，用于测量血中肌酸酐的简单的实验室测试可用于测定肾脏功能。这种测试通常称为肌酸酐廓清试验，其测量在给定的时间间隔自血浆清除的肌酸酐的量。因为肌酸酐以相对恒定的量自磷酸肌酸形成，血液中的肌酸酐水平上升为肾脏机能障碍，即肾功能丧失的指征。
肾小球性肾炎可能由于对免疫系统的生物损害而出现。外来物质可附着于基底膜上并引起免疫反应，导致抗体产生。这些抗体可与外来物质结合，引起变得沉积在微小的肾小球毛细血管壁上的免疫复合物，导致对肾单位的损害。或者，在一些个体中，免疫系统可产生为免疫球蛋白的自身抗体，其可进攻肾细胞，导致所谓的自身免疫反应。如果体内的蛋白质改变，自身抗体反应可能接着发生，因为自身抗体识别作为非己的改变的蛋白质。这些自身抗体-蛋白质复合物可同样沉积在肾小球的基底膜上，引起肾单位功能的破坏。
肾小球性肾炎为猫科动物蛋白尿的常见原因，并可为病症的特发性或继发形式。在后一情况下，病症可继发为瘤形成、炎性疾病、内分泌机能障碍、感染或家族性肾病。如同在人中，猫科动物的肾小球性肾炎通常为免疫学介导的，涉及动物体内的免疫球蛋白和补体因子。导致肾小球的形态变化的损伤发生在肾脏的肾小球内。最终损伤是不可逆转的，并导致肾单位的机能障碍。
肾小球性肾炎在科学文献中以基于正发生的组织病理学变化的许多不同形式来描述特性。膜性肾小球性肾炎包括肾小球基底膜增厚。增生性或系膜增生性(mesangioproliferative)肾小球性肾炎的特征为系膜基质(mesangial matrix)中细胞的增生。膜性增生性肾小球性肾炎包括上述变化的组合。肾小球硬化症的特征为基质形成和瘢痕形成增加。在一些情况中，存在肾小球的最小变化和系膜细胞增殖仅有稍微增加。
对于研究差异基因表达已开发了许多方法，例如DNA微阵列、表达的标记测序(EST)、基因表达的系列分析(SAGE)、扣除杂交、mRNA的扣除克隆和差别展示(DD)、RNA-任意引物PCR (RAP-PCR)、实时PCR (RT-PCR)、表现度示差分析(RDA)、二维凝胶电泳、质谱和基于抗体结合蛋白的蛋白质微阵列。
由于涉及肾脏疾病的生物途径的复杂性和内在的分子相互作用以及细胞间信号转导过程，高度期望在基因水平上理解正在发生的相互作用。在猫科动物肾功能丧失的早期检测异常调节的(dysregulated)基因，有助于理解肾脏疾病的生物学，尤其是基于全组基因的肾小球性肾炎。基因异常调节可在受到反复缺血性损伤的动物疾病发展的早期进行检测的事实，有助于设计用于猫科动物肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的诊断、设计和监测治疗计划的方法。
涉及通过基因表达概况的生物途径的更详细理解将有助于疾病途径中诊断程序、试剂和试验试剂盒以及有益的药物、营养食品(nutraceutical)和营养(膳食)干预的开发。这些方法可以使得能够早期检测和有效地预防或治疗潜在的肾疾病，特别是肾小球性肾炎、以及监测早期肾衰竭和肾小球性肾炎的预后，尤其是在猫科动物中。涉及这种障碍的病理学的基因异常调节可用作所述障碍的诊断和有效地预防或治疗的重要生物标志物并优化合适的药物、营养食品和营养(膳食)干预的选择。
基因表达的水平和/或所表达的基因产物在猫科动物起作用的水平测定，可用于选择治疗或预防性用途的合适药物。该数据可由技术工人用于选择合适的药物，作为在猫科动物中通过基因表达概况预防或治疗肾脏疾病的药物。基因表达数据和分析也可通过采用表明肾脏功能的健康状态的生物标志物，用于选择对肾脏表现具有有益作用的营养组成、膳食补充剂和营养食品。
迄今为止，在结合猫科动物的疾病诊断筛查猫科动物基因组的基因表达概况方面仅做了非常有限的工作。在猫科动物健康群体与具有如在说明书中描述的疾病比如肾脏疾病和肾功能丧失的群体相比较的研究尚未广泛开展。对于猫科动物基因组的表达概况，尤其是对于猫科动物的肾脏疾病随着时间推移的发展，可得到的数据很少。
肾衰竭为猫科动物死亡的主要原因。为了有效地治疗肾脏疾病，重要的是在肾脏被严重损害之前早期解决这个问题。到受试者显示出肾衰竭的迹象的时候，损害很可能是不可逆转的。这提出了一个挑战，因为肾脏疾病在其早期可能没有任何明显的症状。因此，需要更好的方法以鉴定处于肾脏疾病早期的动物，使得它们可例如通过在特发性病症的情况下给予其合适的饮食，和/或治疗病症比如可造成这种问题的感染或自身免疫性疾病，以帮助逆转或至少延迟和抑制病症的发展，来适当地治疗。
发明概述
本发明涉及用于在猫科动物中诊断特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的肾疾病的状态、设计和监测对所述肾疾病状态的治疗计划以及监测所述肾疾病状态的组合物和方法，其中肾疾病可通过采用至少一种自生物试样分离和测量的相关生物标志物进行检测，所述生物试样取自这样的猫科动物，其中生物标志物的表达与这种疾病正或负相关。用于实践本发明的组合物和方法的相关生物标志物包括在这样的猫科动物的这种生物试样中存在的多核苷酸或蛋白质。用于实践本发明的方法的生物试样可包括例如这样的猫科动物的肾脏的组织样品。生物标志物也基于所分泌的进行选择，使得它们可在血清或血浆或在尿液中被检测出。因此生物试样也可为取自这样的猫科动物的生物流体例如血液或尿液的样本。
本发明部分地基于这样的发现，即猫科动物的特定基因表达概况与这样的动物从正常到异常的肾脏生物学过程的变化有关，这种变化可导致肾脏功能随着时间的推移而下降。特定基因表达概况与肾脏功能下降的相关性可以在猫科动物中进行预测、检测和诊断，而未描述基于肾脏疾病的领域公认的临床体征和症状的常规临床诊断。因此猫科动物基因表达概况的改变预示肾脏功能的下降，因为否则可能在稍后的时间里通过领域公认的肾脏功能测量进行诊断。这样的领域公认的肾脏功能测量一般地可包括例如以下测量之一：肾小球滤过率、肌酸酐清除率、尿蛋白水平、血清肌酸酐水平、尿肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、放射性同位素代谢标记、软组织成像，包括超声波扫描术、磁共振成像和/或计算机断层扫描。非侵入性测试比如血清肌酸酐和BUN水平通常显示与肾脏组织病理学的相关性不佳，并且通常不预示着肾脏的未来变化。
本发明提供例如测量特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的肾疾病的存在的方法，所述方法包括评价选自以下的至少一种同源猫科动物基因或这种基因的翻译产物的基因表达水平或活性：分泌型卷曲相关蛋白-2 (secretedfrizzled-related protein 2，SFRP2)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)；光亮蛋白聚糖(LUM)；核心蛋白聚糖(DCN)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)及基质金属蛋白酶-2、-7和-19(MMP2, MMP7和MMP19)。
本发明提供例如测量特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的肾疾病的存在的方法，所述方法包括评价选自分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)的至少一种同源猫科动物基因或这种基因的翻译产物，以及任选地第二组选自光亮蛋白聚糖(LUM)；核心蛋白聚糖(DCN)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)及基质金属蛋白酶-2、-7和-19 (MMP2, MMP7和MMP19)的至少一种同源猫科动物基因或这种基因的翻译产物的基因表达水平或活性。
在一个实施方案中，本发明包括与正常动物相比较在异常动物中差异性表达的一种或多种基因或基因片段(如本文定义的“基因”)。本发明基于与正常动物相比较在异常动物差异性表达的多核苷酸的发现。所述基因通过使用Affymetrix基因芯片(AffymetrixGeneChip®)技术，比较取自诊断为异常动物的组织样品的基因与来自诊断为正常的动物的组织样品的基因的表达进行确认。
多核苷酸和基因通过测量来自取自诊断为异常和具有肾疾病的猫科动物的组织样品的基因表达与来自诊断为正常的猫科动物的组织样品的基因表达的差异进行确认。基因表达的变化可通过技术人员已知的任何方法测定。通常地，基因表达的变化通过测量转录(测定由基因产生的mRNA的量)或测量翻译(测定由基因产生的蛋白质的量)进行测定。由基因产生的RNA或蛋白质的量可使用技术人员已知用于定量多核苷酸和蛋白质的任何方法测定。
通常地，mRNA表达使用聚合酶链反应(PCR) (包括但不限于逆转录-PCR (RT-PCR)和定量实时PCR (qPCR))、短或长的寡核苷酸阵列、cDNA阵列、EST测序、RNA印迹、SAGE、MPSS、MS、珠阵列及其它杂交方法测定。所测量的RNA一般地以mRNA或逆转录mRNA的形式存在。
蛋白质或多肽表达使用各种比色和光谱法和诸如定量免疫印迹、ELISA、2D-凝胶、气相或液相色谱法、质谱、lowry测试、缩二脲测试、荧光测试、比浊法、二喹啉甲酸测试(bicinchoninic assay)、蛋白质芯片技术、红外吸收、茚三酮、布拉德福测定法(Bradfordarray和紫外吸收的方法测定。
基因芯片使得能够在某个时间点大规模地研究细胞内的生物过程和测量活性。微阵列分析允许人们在大规模的遗传基础上说明显型差异的原因。基因表达产物的实际测量为比测定序列本身更准确的基因功能的指标。微阵列分析基于在给定的时间定量细胞中的基因的mRNA转录的浓度。把DNA固定于介质上，并且所标记的目标mRNA在阵列上与探针杂交。所标记的mRNA与探针的结合通过激光分析进行测量。这种测量为所发射的光子的计数。把整个芯片扫描并数字成像。把图像进行处理以定位探针和把强度测量分配给每一个探针。以这种方式可测定上调和下调的基因。这种分析使得技术人员能够发现具有类似表达概况的基因组，并确定具有类似表达概况的组织。以这种方式，可确认说明所观察到的组织样品差异的基因。
Affymetrix基因芯片(Affymetrix Gene Chips)一般采用25bp探针和对应于特定基因或EST的11-20个探针的探针组。芯片被构造得每一个具有完美匹配和错配的25bp探针，前者与基因的特定区域完全互补，和后者具有被取代以使得错配的13th bp。探针概述算法用于确定背景校正、标准化和探针概述，其为探针值-探针组表达值的转换。RMA为可用于该目的的其中一种算法。这种算法进行探针水平强度测量的分析、标准化和概述的最后两个步骤。完美匹配值因此被背景校正、标准化和概述成为一组表达测量。
原始数据使用GeneSpring版本7.0 (GS)软件(Agilent Corporation)分析和使用R-Bioconductor (RB)免费软件确认。两个软件包用于计算来自由Affymetrix Instrument产生的CEL文件的探针强度。Present/Absent/Marginal呼叫每探针和P-值分别使用R-Bioconductor和GeneSpring软件计算。
通常地，与正常动物相比较在异常动物的差异基因表达，通过测量至少一个基因的表达来确定。优选地，测量两个或更多个差异地表达的基因的表达，以提供基因表达模式或基因表达概况。更优选地，测量多个差异地表达的基因的表达，以提供给更为显著的基因表达模式或概况另外的信息。
本发明提供一起或单独为或可用作肾脏疾病的标志物的多种标志物。在尤其有用的本发明实施方案中，可选择多种这些标志物，并可同时测量其mRNA表达，以提供表达概况，用于在该申请中描述的本发明的各方面。在本方法和组合物的优选实施方案中，至少2、3、4、5、6、7或8种标志物选自：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO. 9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:15)及基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.:16)，并可用于测定用于实践本发明方法的基因表达概况。每一种标志物特别是可与肾脏疾病的某些方面联系起来。
本发明提供一起或单独为或可用作肾脏疾病的标志物的多种标志物。在另一个尤其有用的本发明实施方案中，可选择多种这些标志物，并可同时测量其mRNA表达，以提供表达概况，用于在该申请中描述的本发明的各方面。在本方法和组合物的优选实施方案中，至少2、3、4、5、6、7或8种标志物选自：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO. 9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:10)，和任选地第二组至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.:12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.:13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:15)及基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.:16)，并可用于测定用于实践本发明方法的基因表达概况。每一种标志物特别是可与肾脏疾病的某些方面联系起来。
在另一方面，本发明提供适合于检测与正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达的多个基因的表达的装置。这种装置包含具有多个在已知的位置附着于基底的本发明的寡核苷酸或多核苷酸探针的基底。这种装置本质上为本文描述的寡核苷酸或多核苷酸探针的固定化版本。这种装置用于快速和特异性地检测基因和多核苷酸及其表达模式和概况。一般地，这样的探针被连接于基底或类似的固体支持物，并把含有一种或多种多核苷酸(例如基因、PCR产物、连接酶链反应(LCR)产物、使用扩增技术合成的DNA序列，或其混合物)的样品暴露于探针，使得样品多核苷酸可杂交于探针。探针、样品多核苷酸或两者，通常用荧光团或其它标记比如链霉抗生物素进行标记，并使用技术人员已知的方法检测。如果样品多核苷酸被标记，可通过检测结合的荧光来检测杂交。如果探针被标记，一般通过标记猝灭来检测杂交。如果探针和样品多核苷酸两者被标记，一般通过监测由两种结合的标记的接近造成的色移来检测杂交。各种标记策略和标记物为技术人员已知的，特别是对于荧光标记。优选地，把探针固定于适合于形成比得上本领域已知的那些的阵列(已知的几个名字包括DNA微阵列、基因芯片、生物芯片、DNA芯片和基因阵列)的基底上。
用于测定样品中的蛋白质的量或浓度的方法为技术人员已知的。这样的方法包括放射免疫测定、竞争结合试验、免疫印迹分析和酶联免疫吸附测定。对于使用抗体的方法，多克隆和单克隆抗体为合适的。这样的抗体对于蛋白质、蛋白质表位或蛋白质片段可为免疫特异性的。
本发明的一些实施方案采用抗体用于检测和定量通过本发明的多核苷酸表达产生的蛋白质。尽管蛋白质可通过免疫沉淀反应、亲和分离、蛋白质印迹分析、蛋白质阵列等进行检测，优选的方法采用ELISA技术，其中抗体被固定于固体支持物上，并使靶蛋白或肽暴露于固定化抗体。探针或靶标或两者，可使用已知的方法标记。
在另一方面，本发明提供用于检测样品中与正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达的一个或多个基因的差异表达的方法。所述方法包括(a) 对样品中包含与具有多核苷酸的正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达的多个多核苷酸探针的组合进行杂交，以形成一种或多种杂交复合物；(b) 任选地，按标准杂交包含与具有多核苷酸的正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达的多个多核苷酸探针的组合，以形成一种或多种杂交复合物；(c) 检测来自样品的杂交复合物，和任选地检测来自步骤(b)的标准方法的杂交复合物；和(d) 比较来自样品的杂交复合物与来自标准的杂交复合物，其中标准和样品之间的杂交复合物的量的差异表明样品中与正常动物相比较，在异常动物中差异地表达的基因的差异表达。
如果要进行两个或更多个受试系统的相对同期比较，步骤(b)和步骤(c)的部分为任选的，并得到使用。然而，在优选的实施方案中，用于比较的标准基于使用这种方法先前得到的数据。
把这些探针暴露于样品，以形成被检测的杂交复合物，并与标准方法的那些杂交复合物相比较。来自样品和标准的杂交复合物之间的差异表明样品中多核苷酸的差异表达，并因此表面与正常猫科动物相比较在异常猫科动物中差异地表达的基因。在优选的实施方案中，制作探针以特异性地检测由本发明确认的一个或多个基因或基因片段产生的多核苷酸或其片段。用于检测杂交复合物的方法为技术人员已知的。
在另一方面，本发明提供用于检测样品中与正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达的基因的差异表达的方法。所述方法包括(a) 在使得能够发生探针与蛋白质之间的特异性结合的条件下，使样品中包含多个多肽探针的组合与蛋白质反应，其中由探针结合的蛋白质与正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达；(b) 任选地，在使得能够发生探针与蛋白质之间的特异性结合的条件下，按标准使包含多个多肽探针的组合与蛋白质反应，其中由探针结合的蛋白质与正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达；(c) 检测样品中的特异性结合，和任选地检测来自步骤(b)的标准方法的特异性结合；和(d) 比较样品中的与标准方法的特异性结合，其中标准和样品中的特异性结合之间的差异表明样品中与正常猫科动物相比较，在异常猫科动物中差异地表达的基因的差异表达。
使这些探针暴露于样品，以形成被检测的特异性结合，并与标准方法的那些特异性结合相比较。来自样品和标准的特异性结合之间的差异表明样品中与正常猫科动物相比较的蛋白质的差异表达，并因此表明在异常猫科动物中差异地表达的基因，特别是异常相关的基因。在优选的实施方案中，制作探针以特异性地检测由本发明确认的一个或多个基因或基因片段产生的蛋白质或其片段。
在一个实施方案中，这种方法进一步包括在多肽与蛋白质反应之前使猫科动物或样品暴露于受试物质。然后，比较表明受试物质是否改变样品中与正常猫科动物相比较在异常猫科动物中差异地表达的基因，特别是异常相关的基因。
把用本发明的方法诊断为具有肾疾病例如肾小球性肾炎的动物优选地置于肾脏保护性饮食。肾脏保护性饮食包括例如如以上和在WO 2006/119049 A2、WO 2006/071952中描述的饮食，并且其内容通过引用结合到本文中。
本发明因此提供一种诊断猫科动物中存在肾疾病的方法(方法1)，所述方法包括测量来自猫科动物的生物样品中选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平：光亮蛋白聚糖(LUM)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)；核心蛋白聚糖(DCN)；分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)；MMP-2；MMP-7和MMP-19，其中例如根据任何一种以下方法，样品中一种或多种生物标志物的表达相对于来自正常动物的样品中表达的对照值的差异表明存在肾疾病：
1.1. 方法1，其中一种或多种生物标志物的表达水平通过使用以下方法测量一种或多种生物标志物的基因表达进行测定：(i) DNA微阵列，其包含一种或多种与对应于一种或多种要测量的生物标志物的mRNA或cDNA互补的寡核苷酸，或(ii) 与对应于一种或多种要测量的生物标志物的mRNA或cDNA的寡核苷酸引物的定量聚合酶链反应，例如
a. 上述方法，其中测量一种或多种生物标志物的基因表达的步骤包括(i) 自组织样品分离RNA，(ii) 逆转录所述RNA，以得到对应的cDNA，(iii) 分离并裂解如此得到的cDNA，(iv) 使cDNA片段与包含一种或多种与对应于一种或多种要测量的生物标志物的cDNA互补的寡核苷酸的DNA微阵列接触，和(v) 检测cDNA片段与DNA微阵列中的一种或多种寡核苷酸之间的杂交。
b. 上述方法，其中DNA微阵列中的寡核苷酸包括一种或多种能够杂交于SEQ IDNOS. 9-16中的一种或多种的探针。
c. 上述方法，其中DNA微阵列中的寡核苷酸包括一种或多种包含选自SEQ IDNOS. 1-8中的一种或多种的序列的探针。
d. 包括检测杂交的前述方法中的任何一种，其中cDNA片段与DNA微阵列中的一种或多种寡核苷酸之间的杂交为在严格的条件下进行。
1.2. 方法1，其中生物标志物的表达水平用所表达的蛋白质的抗体进行检测。
a. 方法1.2，其中生物标志物通过选自以下的免疫测定法进行检测：竞争性结合测定、非竞争性结合测定、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、三明治测定法(sandwich assay)、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定、凝集反应测定(agglutinationassay)、荧光免疫测定、化学发光免疫测定、免疫PCR免疫测定、A蛋白或G蛋白免疫测定和免疫电泳测定。
b. 上述方法，其为酶联免疫吸附测定(ELISA)。
c. 方法1.2，其中所述测定为侧流免疫层析法。
d. 方法1.2，其中所述生物样品为血液或尿液。
1.3. 方法1，其中生物标志物的表达水平通过测量生物样品中表达的蛋白质的定量质谱法进行检测，其中所述生物样品为血液或尿液。
1.4. 方法1，其中生物标志物的表达水平通过识别所表达的蛋白质的适体进行检测。
a. 方法1.4，其中所述适体为寡核苷酸。
b. 方法1.4，其中所述适体为肽。
c. 方法1.4，其中所述生物样品为血液或尿液。
1.5. 前述方法中的任何一种，其中生物样品中的一种或多种生物标志物相对于正常样品中表达的对照值的表达水平为其2倍以上，例如5倍以上或少于一半。
1.6. 前述方法中的任何一种，其中生物样品中的一种或多种生物标志物的表达水平为高于或低于正常样品中的生物标志物的平均表达至少一个标准偏差。
1.7. 前述方法中的任何一种，其中生物样品中的一种或多种生物标志物的表达水平相对于已知具有相对恒定表达的一种或多种基因的表达进行标准化。
1.8. 前述方法中的任何一种，其中生物样品为肾组织的样品。
1.9. 前述方法中的任何一种，其中生物样品为血液。
1.10. 前述方法中的任何一种，所述方法包括检测分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)和/或视黄醇结合蛋白5 (rbp5)的表达水平。
1.11. 前述方法中的任何一种，所述方法包括检测分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)和/或视黄醇结合蛋白5 (rbp5)的表达水平，和任选地检测选自以下的至少一种基因的表达水平：光亮蛋白聚糖(LUM)；核心蛋白聚糖(DCN)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12(COL3A1)及基质金属蛋白酶-2 (MMP2)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7)和基质金属蛋白酶-19(MMP19)。
1.12. 前述方法中的任何一种，其中肾疾病为处于早期，例如其中猫科动物具有基本上正常的肾功能，例如如通过以下的一种或多种测量的那样：正常的肾小球滤过率、肌酸酐清除率、尿蛋白水平、血清肌酸酐水平、尿肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、放射性同位素代谢标记、软组织成像，包括超声波扫描术、磁共振成像和/或计算机断层扫描。
1.13. 前述方法中的任何一种，其中肾疾病为特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的疾病。
1.14. 前述方法中的任何一种，其中肾疾病为肾小球性肾炎。
1.15. 前述方法中的任何一种，其中肾疾病通过以下的一种或多种表达相对于对照表达值的显著差异来指示(例如，其中“显著差异”在增加表达的情况下为增加到至少两倍和在减少表达的情况下为减少至少50%)：
光亮蛋白聚糖表达增加；
胶原蛋白α1 (III)链，变体12表达增加；
核心蛋白聚糖表达增加；
分泌型卷曲相关蛋白-2表达增加；
视黄醇结合蛋白5表达减少；
MMP-2表达增加；
MMP-7表达增加；和/或
MMP-19表达增加。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种在有需要的猫科动物中治疗、改善或延迟肾疾病的发展的方法(方法2)，所述方法包括例如使用方法1以及下列等诊断肾疾病的存在，和例如用饮食和/或药物控制病症。例如本发明提供：
2.1. 方法2，所述方法包括提供给患有如通过方法1以及下列等方法中的任何一种方法诊断或可诊断的肾疾病的猫科动物肾脏保护性饮食，作为基本上唯一的饮食。
2.2. 方法2或2.1，其中猫科动物具有基本上正常的肾功能，如通过以下的一种或多种测量的那样：正常的肾小球滤过率、肌酸酐清除率、尿蛋白水平、血清肌酸酐水平、尿肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、放射性同位素代谢标记、软组织成像，包括超声波扫描术、磁共振成像和/或计算机断层扫描。
2.3. 上述方法中的任何一种，其中猫科动物为至少五岁龄。
2.4. 上述方法中的任何一种，其中所述疾病为特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的疾病。
2.5. 上述方法中的任何一种，其中肾疾病为肾小球性肾炎。
2.6. 上述方法中的任何一种，其中猫科动物已被确认为患有肾脏疾病。
2.7. 上述方法中的任何一种，其中猫科动物被维持肾脏保护性饮食至少约6个月的时间段。
2.8. 上述方法中的任何一种，其中猫科动物被维持肾脏保护性饮食在肾脏疾病的发作或初始诊断后开始并一直持续基本上为猫科动物余生的时间段。
2.9. 上述方法中的任何一种，其中肾脏保护性饮食相对于标准猫科动物饮食包含以下改变中的一种或多种：
磷减少
蛋白质水平减少
钠减少
ω-3脂肪酸的水平增加
B-复合维生素的水平增加
抗氧化剂增加。
2.10. 上述方法中的任何一种，其中肾脏保护性饮食基于干物质组成计包含约18%-约40%蛋白质、约0.2%-约0.85%磷和约0.04%-约0.35%钠。
2.11. 上述方法中的任何一种，其中肾脏保护性饮食提供约3.6-约7.9 g/100kcal ME蛋白质、约0.04-约0.17 g/100 kcal ME磷和约0.008-约0.07 g/100 kcal ME钠。
2.12. 上述方法中的任何一种，其中肾脏保护性饮食在“喂食状态(as fed)”的基础上包括包含以约5%-约40%的量存在的蛋白质、以约0.01%-约2%的量存在的磷和以约0.01%-约2%的量存在的钠的干燥食品。
2.13. 上述方法中的任何一种，其中肾脏保护性饮食在“喂食状态”的基础上包括包含以约4%-约12%的量存在的蛋白质、以约0.03%-约0.2%的量存在的磷和以约0.03%-约0.2%的量存在的钠的湿润食品。
在进一步的实施方案中，本发明提供任选标记的，用于在猫科动物检测选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平的试剂：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19，例如
a. 抗体，例如单克隆抗体、单链抗体和功能性抗体片段；选自以下的识别猫科动物蛋白：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19。
b. 适体，例如核酸或肽适体；选自以下的识别猫科动物蛋白：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19。
c. 选自以下的分离和纯化的或重组猫科动物蛋白：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1(III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19。
d. 能够杂交于猫科动物基因，例如能够杂交于SEQ ID NOS. 9-16中的一种或多种，例如选自SEQ ID NOS. 1-8中的一种或多种的选自以下的寡核苷酸探针：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19。
在进一步的实施方案中，本发明提供用于在猫科动物中诊断、预后或监测肾疾病的试剂盒(试剂盒1)，所述试剂盒包含：
a. 用于测量来自猫科动物的生物样品中的选自以下的一种或多种生物标志物的基因表达的试剂(means)：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19，和
b. 使用这样的试剂测量来自猫科动物的生物样品中的一种或多种生物标志物的基因表达并评价在猫科动物中导致肾疾病的过程的存在的用法说明书，例如
1.1 试剂盒1，其中用于测量一种或多种生物标志物的试剂为能够检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针；
1.2 试剂盒1.1，其中一种或多种核酸探针能够在例如严格条件下杂交于SEQ IDNOS. 9-16中的一种或多种；
1.3 试剂盒1.2，其中一种或多种核酸探针包含选自SEQ ID NOS. 1-8中的一种或多种的序列或多个序列；
1.4 前述试剂盒中的任何一种，所述试剂盒包含含有能够检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针的DNA微阵列。
1.5试剂盒1，其中用于测量一种或多种生物标志物的试剂，为能够通过识别所表达的蛋白质检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种抗体。
1.6 ELISA模式中的试剂盒1.5，所述试剂盒包含能够检测一种或多种生物标志物的抗体；分离、纯化或重组的对应于所表达的蛋白质的蛋白，以及缓冲剂。
1.7试剂盒1，其中用于测量一种或多种生物标志物的试剂，为例如如上文描述的，能够通过识别所表达的蛋白质检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种适体。
1.8 上述试剂盒中的任何一种，其中一种或多种生物标志物包括分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)和/或视黄醇结合蛋白5 (rbp5)；
1.9 上述试剂盒中的任何一种，其适合用于上述方法1以及下列等等或方法2以及下列等等中的任何一种。
本发明进一步提供以下在依据方法1以及下列等方法或方法2以及下列等方法的方法中，或在制备依据试剂盒1以及下列等试剂盒的试剂盒中的用途：
对应于猫科动物光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19的基因或与之互补的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO 1-16中的任何一种或与之互补的核苷酸序列，或
选自猫科动物光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19的蛋白质的抗体，或
选自猫科动物光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19的蛋白质的适体，或
分离、纯化或重组的猫科动物光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19。
本发明适用性的进一步领域自下文提供的详述将变得显而易见。应该理解，详述和具体实施例，尽管指明了本发明的优选实施方案，打算仅用于说明的目的，并且不打算限制本发明的范围。
绘图简述
图1a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于与光亮蛋白聚糖前体(硫酸角质素蛋白多糖光亮蛋白聚糖) mRNA类似的基因家犬(Canis familiaris)的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图1b为地区性的平均RMA强度与受试猫科动物对于与光亮蛋白聚糖前体(硫酸角质素蛋白多糖光亮蛋白聚糖) mRNA类似的基因家犬的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图2a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于与胶原蛋白α1 (III) mRNA类似的基因家马的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图2b为地区性的平均RMA强度与受试猫科动物对于与胶原蛋白α1 (III) mRNA类似的基因家马的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图3a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于猫科动物基因家犬核心蛋白聚糖mRNA，完整的猫科动物的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图3b为地区性的平均RMA强度与受试猫科动物对于猫科动物基因家犬核心蛋白聚糖mRNA，完整的猫科动物的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图4a为地区性的平均倍数变化强度与受试猫科动物对于基因家犬分泌型卷曲相关蛋白2 mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图4b为地区性的平均RMA与受试猫科动物对于基因家犬分泌型卷曲相关蛋白2mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图5a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于基因家犬基质金属蛋白酶2mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图5b为地区性的平均RMA与受试猫科动物对于与基质金属蛋白酶2 mRNA类似的基因家犬的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图6a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于基因家猫PUMP-1 mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图6b为地区性的平均RMA强度与受试猫科动物对于基因家猫PUMP-1 mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图7a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于基因恒河猴(Mucacamulatta) mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图7b为地区性的平均RMA强度与受试猫科动物对于基因恒河猴mRNA的表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图8a为地区性的平均倍数变化与受试猫科动物对于与家犬视黄醇结合蛋白5、细胞类似的猫科动物基因表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
图8b为地区性的平均RMA强度与受试猫科动物对于与家犬视黄醇结合蛋白5、细胞类似的基因表达的肾小球性肾炎阶段相比较的绘图。
发明详述
以下优选实施方案的描述性质上仅为示例性的，并且决不打算限制本发明、其应用或用途。
某些定义
本文和在所附权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定，例如提到“变体”包括多个变体。进一步地，所定义的术语包括用于正确的语法语境的术语的变化，例如术语“特异性地结合”包括“特异性结合”以及该术语的其它形式。类似地，单词“包含”、“含有”和“包括”应包含地而不是排它地进行解释。
术语“抗体”意指结合于特异性抗原的任何免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体。该术语包括多克隆、单克隆、单价、人源的、复共轭对配合物、具有聚表位特异性的抗体组合物、嵌合的、双特异性抗体、双体抗体(diabodies)、单链抗体和抗体片段比如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv，或其它抗原结合片断。
术语“阵列”意指基底上至少两种探针的有序排列。探针中的至少一种为对照或标准，和探针中的至少一种为诊断探针。基底上约2-约40000个探针的排列确保在探针与样品多核苷酸或多肽之间形成的每一种标记的复合物的大小和信号强度为可单独区分的。可或者合成或者生物合成制备阵列上沉积的分子集合。这种阵列可采取各种形式，包括可溶性分子库、系于树脂珠、二氧化硅芯片或其它固体支持物上的化合物库。核酸阵列可包括可通过把核酸以基本上任何长度(例如长度为1-约1000个核苷酸)点样(spotting)在基底上制备的核酸的库。核酸探针阵列优选地包含在已知位置结合于基底的核酸。在其它的实施方案中，系统可包含固体支持物或基底，比如膜、滤器、显微镜载物片、微孔、样品管、珠粒、珠列阵等。固体支持物可由各种材料制成，包括纸、纤维素、尼龙、聚苯乙烯、聚碳酸酯、塑料、玻璃、陶瓷、不锈钢等。固体支持物可优选地具有刚性或半刚性的表面，并可优选地为具有合适的孔、升起的区域、蚀刻槽等的球形(例如珠粒)或基本上平面的(例如平面)。固体支持物也可包括其中可嵌入核酸的凝胶或基质。
术语“生物标志物”指的是由本发明的基因或其同源物，尤其是其猫科动物同源物编码的基因和基因产物，其中基因已被确定由于疾病、病症、障碍或给予物质、药物、营养物或膳食组分或其组合而差异地表达，并且其中本发明的这样的基因和基因产物被确认为SEQ ID NOS.: 9、10、11、12、13、14、15和16或其同源基因，包括但不限于猫科动物基因。生物标志物可为多核苷酸、多肽、蛋白质；RNA，包括RNA副本或其翻译产物；DNA、cDNA、上述分子中一种或多种的代谢物、或上述分子中任何一种的有用变体、与肾疾病有关的差异表达，包括但不限于肾小球性肾炎，并且其中在取自受试动物的样品与取自对照组动物的样品的这种差异表达的相关性，可用于在需要它的动物中诊断、预后、监测或治疗病症、疾病或障碍。另外，生物标志物可通常用于指可例如在本发明的试验或其它方法中确认或与全长基因或蛋白质相关的这种基因或蛋白质的任何部分或片段。生物标志物表达也可通过检测生物标志物翻译(即检测样品中的生物标志物蛋白)进行确认。适合于检测生物标志物蛋白的方法包括用于检测和/或测量来自细胞或细胞提取物的蛋白的任何合适的方法。这样的方法包括但不限于免疫印迹(例如免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀反应、免疫组织化学和萤光免疫检验法。用于检测蛋白质的特别优选的方法包括任何单细胞分析，包括免疫组织化学和萤光免疫测定。这样的方法为本领域熟知的。此外，本文描述的针对某些生物标志物的抗体为本领域已知的，并在公共文献中进行了描述，并且用于其制备的方法为技术工人熟知的。
用于比较受试样品与对照样品的表达的术语“可比较地”应意指同样的特征和数量的标志，并应包括但不限于围绕进行所述比较的平均值，和包括在受试样品与对照样品之间差异表达的数值的一个标准偏差范围内的数值。
可互换使用的术语“差异地表达的基因”、“差异基因表达”、“差异表达”或“差异地表达的”及其同义词，指的是基因，其表达相对于其在正常或对照受试者中的表达，在患有疾病、病症或障碍的受试者，或者由于被给予物质、药物、营养物或膳食组分或其组合，被激活至更高或更低的水平。所述术语也包括其表达在同样疾病的不同阶段被激活至更高或更低的水平的基因。也应理解，差异地表达的基因可在核酸水平或蛋白质水平受到激活或抑制，或者可受到选择性剪接，以导致不同的多肽产物。这样的差异可通过例如mRNA水平、表面表达、分泌或其它多肽分区的变化来证明。差异基因表达可包括比较两种或多种基因或其基因产物之间的表达，或者比较两种或多种基因或其基因产物之间的表达比率、或者甚至比较同一基因的两种不同处理的产物，其在正常受试者与患有疾病、病症或障碍的或者由于被给予物质、药物、营养物或膳食组分或其组合的受试者之间，或者在相同疾病、病症或障碍的不同阶段之间，或者由于被给予不同量的物质、药物、营养物或膳食组分或其组合而不同。差异表达包括例如在正常和病变细胞当中，或者在已经历不同的疾病事件或疾病阶段的细胞当中的，基因或其表达产物的时间或细胞表达图谱的定量或定性差异。为了本发明的目的，当样品中转录的多核苷酸或翻译的蛋白质的量变化至少约2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1或1.0-倍，优选地至少约2倍或者更多，更优选地至少约2.5、3或4倍或者更多时，认为存在“差异基因表达”。
术语“倍”当用作差异基因表达的量度时，意指在猫科动物中基因表达的量，该量为将比较的猫科动物(例如患有肾功能的丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的猫科动物)的基因表达的量与证实没有这样的病症的动物相比较的基因表达的倍数或分数。例如，在所述动物表达为在比较动物的2倍的基因具有2倍差异基因表达，和在所述动物表达为在比较动物的一半的基因也具有2倍差异基因表达。
术语“片段”意指(1) 为全序列的一部分，并且对于作为完整的多核苷酸序列的特定用途具有相同或类似活性的寡核苷酸或多核苷酸序列，或(2) 为全序列的一部分，并且对于作为完整的多肽序列的特定用途具有相同或类似活性的肽或多肽序列。这样的片段可包含认为适合于特定用途的任何数目的核苷酸或氨基酸。通常地，寡核苷酸或多核苷酸片段含有至少约10、50、100或1000个核苷酸，和多肽片段含有至少约4、10、20或50个来自全序列的连续氨基酸。该术语包括所述片段的多核苷酸和多肽变体。多核苷酸例如可破碎或分裂成多个分段。
使核酸断裂的各种方法为本领域熟知的。这些方法本质上可例如为化学或物理的。化学断裂可包括用DNase部分降解、用酸部分脱嘌呤、使用限制性内切酶、内含子编码内切核酸酶、基于DNA的裂解方法比如三重和杂交形成方法(依赖核酸片段的特异性杂交以使裂解剂集中于核酸分子的特定位置)、或者在已知或未知的位置裂解DNA的其它酶或化合物。物理断裂方法可包括使DNA受到高剪切速率。高剪切速率可例如通过使DNA移动通过具有坑或峰(pits or spikes)的室或通道，或者迫使DNA样品通过限制尺寸的流道，例如具有微米或亚微米尺度的截面尺寸的孔径来产生。其它物理方法包括声裂法和喷雾法。可同样采用物理和化学断裂方法的组合，比如通过加热和离子介导的水解断裂。参见例如Sambrook et al.,“分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning: A LaboratoryManual),”第3版. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) (“Sambrook et al.”)，其对于所有目的通过引用结合到本文中。这些方法可被优化，以把核酸消化成所选择的尺寸范围的片段。有用的尺寸范围可选自100、200、400、700或1000至500、800、1500、2000、4000或10000个碱基对。然而，较大的尺寸范围比如4000、10000或20000-10000、20000或500000个碱基对也可为有用的。
术语“基因”或“基因”意指涉及产生多肽的DNA的完全或部分片段，包括编码区域之前和之后(前导序列和尾随序列)的区域和各个编码段(外显子)之间的插入序列(内含子)。该术语包括杂交于基因编码序列的补体的任何DNA序列。
术语“同源物”意指(1) 多核苷酸，包括来自相同或不同动物种类的多核苷酸，其与多核苷酸具有大于30%、50%、70%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，和与完整的多核苷酸具有相同或基本上相同的性质和实施相同或基本上相同的功能，或者具有在严格条件下特异性地杂交于多核苷酸的能力，或(2) 多肽，包括来自相同或不同动物种类的多肽，其与通过多核苷酸的表达确认的多肽具有大于30%、50%、70%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，和与完整的多肽具有相同或基本上相同的性质和实施相同或基本上相同的功能，或者具有特异性地结合于通过多核苷酸的表达确认的多肽的能力。两个多核苷酸序列或两个多肽序列的序列相似性使用技术人员已知的方法例如Karlin和Altschul的算法测定(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990))。把这种算法结合到Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410(1990))的NBLAST和XBLAST程序中。为了得到有缺口的比对用于比较目的，有缺口的母细胞(Gapped Blast)可如在Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))中描述的那样采用。当采用母细胞和有缺口的母细胞(BLAST和Gapped BLAST)程序，使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的系统设定的参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
术语“杂交”指的是其中两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”也可指三链杂交。生成的(通常)双链多核苷酸为“杂交体”。形成稳定的杂交体的多核苷酸群体的比例本文称为“杂交度”。
杂交反应可以绝对或差异杂交模式(hybridization formats)实施。在绝对杂交模式，源于一个样品的多核苷酸杂交于核酸阵列中的探针。在形成杂交复合物后检测的信号与样品中的多核苷酸水平相关。在差异杂交模式中，源于两个样品的多核苷酸用不同的标记部分标记。把这些不同标记的多核苷酸的混合物加入到核酸阵列中。然后在其中可单独检测来自两种不同标记的发射的条件下检查核酸阵列。在一个实施方案中，荧光团Cy3和Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)用作用于差异杂交模式的标记部分。
自核酸阵列采集的信号可使用市售可得到的软件比如由Affymetrix or AgilentTechnologies提供的那些软件进行分析。比如用于扫描灵敏度、探针标记和cDNA或cRNA量化的对照物，优选地被包含在杂交实验中。杂交信号可在接受进一步分析之前进行依比例测量(scaled)或标准化。例如，当在类似测试条件下使用多于一个阵列时，对于每一个单独探针的杂交信号可考虑到杂交强度的变化而进行标准化。杂交信号也可使用源于在每一个阵列含有的内部标准化对照的强度进行标准化。另外，跨样品具有相对一致的表达水平的基因可用于把其它基因的表达水平标准化。在一个实施方案中，用于某些维护基因(maintenance genes)的探针包括在本发明的核酸阵列中。选择这些基因是因为它们跨不同组的组织显示稳定的表达水平。杂交信号可基于这些维护基因的表达水平进行标准化和/或依比例测量。
术语“杂交复合物”意指当一个多核苷酸的嘌呤与互补多核苷酸的嘧啶，例如5’-A-G-T-C-3’碱基对与3’-T-C-A-G-5’氢键键合时，在样品多核苷酸之间形成的复合物。核苷酸类似物的互补和使用的程度影响杂交反应的有效性和严格性。
术语“杂交探针”包括能够以碱基特异性方式结合于核酸的互补链的核酸(比如寡核苷酸)。这样的探针包括如在Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991),Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999)中描述的肽核酸及其它核酸类似物和核酸拟似物。参见1996年4月3日递交的美国专利第6156501号。
术语“肾脏疾病”或“肾脏障碍”或类似地“肾疾病”或“肾障碍”打算包括肾脏功能的急性或慢性异常丧失，比如肾衰竭、肾小球滤过率减少和肾小球性肾炎。肾小球性肾炎可采取包括肾小球基底膜增厚的膜性肾小球性肾炎的形式。或者，肾小球性肾炎可采取增生性或特征为系膜基质中细胞的增生的系膜增生性肾小球性肾炎的形式。另外，肾小球性肾炎可采取包括上述变化的组合的膜性增生性肾小球性肾炎的形式。肾小球硬化症为肾小球性肾炎的严重形式。肾脏疾病或肾障碍也包括肾炎、肾病、高滤过、轻度微量白蛋白尿、临床蛋白尿、晚期临床肾病、慢性肾功能不全、肾乳头损伤、肾小管坏死和糖尿病肾病，全部如本领域的普通兽医差异地诊断的那样。该术语不打算包括遗传起源的多囊性肾病。
具有正常肾功能的猫科动物为对肾疾病无症状的猫科动物，并且证明没有肾疾病的临床体征或症状和肾功能的临床实验室测量没有变化。正常肾功能可通过一种或多种包括但不限于肾小球滤过率、尿蛋白水平、血液肌酸酐水平、尿液肌酸酐水平、肌酸酐清除率和血尿素氮的测量进行测定。
“核酸序列”意指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，并且对于基因组或合成起源的DNA或RNA，其可为单-或双-链的，并且代表有义或反义链。
术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”意指核苷酸的聚合物。该术语包括DNA和RNA (包括cDNA和mRNA)分子，或者单链或者双链的，并且如果为单链的，其互补序列呈线形或圆形的形式。该术语也包括合适时与原始序列具有相同或基本上相同的性质和实施相同或基本上相同的功能的序列的片段、变体、同源物和等位基因。当对齐或可具有最多约30%序列错配时，这些序列可为完全互补的(无错配)。优选地，对于多核苷酸，链含有约20-10000个核苷酸，更优选地含有约150-3500个核苷酸。优选地，对于寡核苷酸，链含有约2-100个核苷酸，更优选地含有约6-30个核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的准确大小将取决于各种因素和取决于具体应用以及多核苷酸或寡核苷酸的用途。该术语包括合成的和自天然来源分离和纯化的核苷酸聚合物。术语“多核苷酸”包括“寡核苷酸”。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”意指氨基酸的聚合物。该术语包括天然存在的和非天然存在(合成)的聚合物以及其中人工化学拟似物取代一个或多个氨基酸的聚合物。该术语也包括与原始序列具有相同或基本上相同的性质和实施相同或基本上相同的功能的片段、变体和同源物。该术语包括任何长度的聚合物，优选地聚合物含有约2-1000个氨基酸，更优选地含有约5-500个氨基酸。该术语包括合成的和自天然来源分离和纯化的氨基酸聚合物。
术语“探针”意指(1) 寡核苷酸或多核苷酸，或者RNA或者DNA，无论如在纯化的限制性内切酶消化中天然存在的还是合成产生的，其能够用具有与探针互补的序列的多核苷酸退火或特异性地杂交于这种多核苷酸，或(2) 能够特异性地结合特定蛋白质或蛋白质片段以基本排除其它蛋白质或蛋白质片段的肽或多肽。寡核苷酸或多核苷酸探针可为或者单链或者双链的。探针的准确长度将取决于许多因素，包括温度、来源和用途。例如，对于诊断应用，取决于目标序列的复杂性，寡核苷酸探针通常含有约10-100、15-50或15-25个核苷酸。在某些诊断应用中，多核苷酸探针含有约100-1000、300-600个核苷酸，优选地含有约300个核苷酸。本文的探针被选择以与特定目标序列的不同链“基本上”互补。这意味着探针必须足够互补，以在一组预定的条件下特异性地杂交其各自的目标序列或用其各自的序列退火。因此，探针序列不需要反映目标的准确互补序列。例如，非互补的核苷酸片段可连接于探针的5’或3’末端，探针序列的其余部分与目标序列互补。或者，非互补的碱基或较长序列可散布到探针中，条件是探针序列与目标多核苷酸的序列具有足够的互补性，以对目标多核苷酸特异性地退火。肽或多肽探针可为蛋白质或多肽特异性地结合的任何分子，包括DNA (对于DNA结合蛋白)、抗体、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖类、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。
术语“样品”和“样本”意指含有多核苷酸的任何动物组织或流体，包括含有DNA和RNA的细胞和其它组织。实例包括：血液、肾脏、结缔组织、上皮、淋巴、肌肉、神经、痰等。样品可为固体或液体，并可含有DNA、RNA、cDNA，例如体液比如血液或尿液、细胞、细胞制剂或其可溶性部分或介质等分试样、染色体、细胞器等。
术语“特异性地结合”意指两个分子之间的特殊和精确的相互作用，这取决于其结构，特别是其分子侧基。例如，调节蛋白插入到DNA分子的大沟中，沿着两个单链核酸之间的主链氢键键合，或者在蛋白质和激动剂、拮抗剂或抗体的表位之间键合。
术语“特异性地杂交”意指允许在本领域通常使用的预定条件下的这种杂交的足够互补序列的两个单链多核苷酸之间的缔合(有时称为“基本上互补”)。例如，依据本发明的一个方面，该术语可指多核苷酸探针与在单链DNA或RNA分子中含有的基本上互补的序列的杂交，以基本排除多核苷酸探针与非互补序列的单链多核苷酸的杂交。
术语“严格条件”意指(1) 在42℃下，在含有0.1%牛血清白蛋白、0.1% Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)的50% (vol/vol)甲酰胺(含有750 mMNaCl、75 mM枸橼酸钠)中杂交，(2) 在42℃下，在50%甲酰胺5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075M枸橼酸钠)、50 mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5 x Denhardt氏溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA (50 mg/ml)、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖中杂交，在42℃下用0.2 x SSC和0.1%SDS洗涤，或在50℃下用0.015 M NaCl、0.0015 M枸橼酸钠、0.1% Na2SO4或采用类似的低离子强度和高温洗涤剂和类似变性剂的类似的领域公认程序洗涤。
术语“有用的变化”意指(1) 对于多核苷酸，多核苷酸的补体；多核苷酸的同源物及其补体；多核苷酸的变体、其补体及其同源物；和多核苷酸的片段、其补体、其同源物及其变体，和(2) 对于多肽，多肽的同源物；多肽的变体及其同源物；和多核苷酸的片段、其同源物及其变体。
术语“变体”意指(1) 含有任何取代、变化、修饰、替代、自或向多核苷酸序列缺失或增添一个或多个核苷酸的多核苷酸序列，并且其与原始序列具有相同或基本上相同的性质和实施相同或基本上相同的功能，和(2) 含有任何取代、变化、修饰、替代、自或向多肽序列缺失或增添一个或多个氨基酸的多肽序列，并且其与原始序列具有相同或基本上相同的性质和实施相同或基本上相同的功能。该术语因此包括单核苷酸多态性(SNPs)和等位基因变体，并且包括多肽中的保守和非保守的氨基酸取代。该术语也包括多核苷酸或多肽的化学衍化，以及核苷酸或氨基酸用不是天然存在的核苷酸或氨基酸替代(合适时)。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语和任何缩略词与本发明领域的技术领域中的普通技术人员通常理解的术语具有相同的含义。
探针
用于本发明的实践并且被用于识别猫科动物样品中的猫科动物生物标志物的探针包含SEQ ID NOS:1-8。探针序列对应于用于由Affymetrix制造，确认为AffymetrixFeline GeneChip®的专有猫科动物基因芯片的以下探针识别编号，如在该说明书中更全面描述的那样。
HP04719_at对应于SEQ ID NO.1，其用于杂交于假定的分泌型卷曲相关蛋白2(sfrp2基因)的犬科动物基因家犬mRNA的mRNA序列的猫科动物同源物。SEQ ID NO.1与之杂交的猫科动物同源物的序列为SEQ ID. NO.9。探针ID No.对应于用于Affymetrix FelineGeneChip®上的ID号。相应的犬科动物mRNA序列通过GeneID: 475471的Accession No.NM_001002987.1确认。
HP12767_at对应于SEQ ID NO.2，其用于杂交于与视黄醇结合蛋白5、细胞的、转录变体2类似的家犬的mRNA序列的猫科动物同源物。SEQ ID NO.2与之杂交的猫科动物同源物的序列为SEQ ID. NO.10。探针ID No.对应于用于Affymetrix Feline GeneChip®上的ID号。相应的犬科动物mRNA序列通过LOC477706和通过NCBI参考序列: XM_848184.1确认。
HP04078_at对应于SEQ ID NO.3，其用于杂交于与光亮蛋白聚糖前体(角质素(适合度)蛋白多糖光亮蛋白聚糖) (KSPG光亮蛋白聚糖)类似的基因家犬的mRNA序列的猫科动物同源物。相应的犬科动物序列通过LOC 482599确认。相应的犬科动物mRNA序列通过GeneID: 482599的NCBI参考序列: XM_539716.2确认。
HP04079_at对应于SEQ ID NO.4，其用于杂交于家犬核心蛋白聚糖(DCN)的mRNA序列的猫科动物同源物。相应的犬科动物mRNA序列确认为GeneID: 403904的NCBI参考序列:NM_001003228.1。
HP06873_at对应于SEQ ID NO.5，其用于杂交于与胶原蛋白III型α1 (埃勒斯-当洛斯综合征IV型；常染色体显性类似的家马的mRNA序列的猫科动物同源物。相应的马科动物mRNA序列通过GeneID 100034123的NCBI参考序列: XM_001917620确认。
HP00944_at对应于SEQ ID NO.6，其用于杂交于家犬基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)的mRNA序列的猫科动物同源物。相应的犬科动物mRNA序列通过GeneID: 403733的NCBI参考序列: XM_535300.2确认。
HP09664_at对应于SEQ ID NO.7，其用于杂交于合成构建家猫PUMP-1 mRNA的猫科动物mRNA序列。猫科动物PUMP-1被确认为Accession No. U04444.1。
HP00012_at对应于SEQ ID NO.8，其用于杂交于预测的: 恒河猴基质金属蛋白酶19、转录变体1 (MMP19)的mRNA序列的猫科动物同源物。NCBI参考序列号为GeneID 7100111的XM_001111542。
生物标志物
用于本发明实践的生物标志物为：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)；光亮蛋白聚糖(LUM)；核心蛋白聚糖(DCN)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12(COL3A1)及基质金属蛋白酶-2、-7和-19 (MMP2, MMP7和MMP19)，如以下和附于该说明书的序列表中更全面描述的那样。
SEQ ID NO.9对应于与家犬分泌型卷曲相关蛋白2 mRNA同源的猫科动物核酸序列。犬科动物序列通过NCBI 参考序列: NM_001002987.1和GeneID: 475471确认。全长犬科动物核苷酸序列为1760 bp。相应的犬科动物多肽具有NCBI参考序列NP_001002987.1。犬科动物分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)为294个氨基酸。‘卷曲型’(FZ)跨膜蛋白家族的成员为涉及多种细胞过程，包括控制细胞极性和恶性转化的Wnt家族成员，富含半胱氨酸的糖基化配体的受体。分泌型卷曲相关蛋白(sFRP)似乎通过与膜结合的卷曲受体竞争分泌型Wnt配体的结合，起Wnt信号传导的可溶性调节剂的作用。
SEQ ID NO.10对应于与视黄醇结合蛋白5，细胞的，转录变体2 (LOC477706) mRNA类似的与家犬同源的猫科动物核酸序列。犬科动物序列通过NCBI参考序列XM_848184.1确认。全长犬科动物核苷酸序列为511 bp。相应的犬科动物多肽具有NCBI参考序列XP_853277.1。犬科动物rbp5为135个氨基酸的蛋白质。Rbp5属于脂笼蛋白家族，并且认为是视黄醇(维生素A醇)细胞内载体。
SEQ ID NO.11对应于与光亮蛋白聚糖前体(硫酸角质素蛋白多糖光亮蛋白聚糖)(LOC 482599) mRNA类似的与预测的:家犬同源的猫科动物核酸序列。犬科动物序列通过NCBI参考序列XM_539716.2确认。全长犬科动物核苷酸序列为2028 bp。相应的犬科动物多肽具有NCBI参考序列XP_539716.1。犬科动物光亮蛋白聚糖前体(硫酸角质素蛋白多糖光亮蛋白聚糖)为338个氨基酸的蛋白质。光亮蛋白聚糖(LUM)为细胞外基质硫酸化的蛋白多糖，其与参与基质组装的蛋白比如胶原蛋I型和IV型相互作用。LUM参与细胞增殖和组织形态发生。认为光亮蛋白聚糖在调节胶原纤维组装方面起重要作用。蛋白也为TGF-β的结合伙伴。
SEQ ID NO.12对应于与家犬核心蛋白聚糖前体，mRNA同源的猫科动物核酸序列。该序列通过GeneID 403904的NCBI参考序列NM_001003228.1确认。全长犬科动物核苷酸序列为1470 bp。相应的犬科动物多肽序列具有NCBI参考序列: NM_001003228.1。相应的犬科动物多肽犬科动物核心蛋白聚糖前体具有NCBI参考序列NP_001003228.1。犬科动物核心蛋白聚糖前体为360个氨基酸的蛋白质。这种蛋白为结构上与双糖链蛋白多糖蛋白(biglycanprotein)密切相关的小细胞或细胞外基质蛋白多糖，并且为结缔组织的组分。核心蛋白聚糖结合于I型胶原原纤维，并在基质组装方面起作用。其含有一个连接的粘多糖链。认为这种蛋白能够抑制不同的肿瘤细胞系的生长。许多另外剪接的转录变体已在对该基因的科学文献中被确认。
SEQ ID NO.13对应于与家马胶原蛋白，III型，α1 (埃勒斯-当洛斯综合征IV型，常染色体显性) (COL3A1)，mRNA同源的猫科动物核酸序列。该序列通过GeneID 100034123的NCBI参考序列XM_001917620.1确认。全长马科动物核苷酸序列为5492 bp。相应的马科动物多肽序列具有NCBI参考序列: XP_001917655。马胶原蛋白，III型，α1 (埃勒斯-当洛斯综合征IV型，常染色体显性) (COL3A1)为1466个氨基酸的蛋白质。人的III型胶原蛋白为包含3个α-1(III)链的原纤维形成胶原蛋白，并且在早期胚胎和整个胚胎形成中表达。在成人，III型胶原蛋白为各种内脏器官和皮肤中细胞外基质的主要组分。编码III型前胶原的COL3A1基因的突变引起IV型埃勒斯-当洛斯综合征，其为一种在成年的早期导致主动脉破裂的疾病。
SEQ ID NO.14对应于与家犬基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)，mRNA同源的猫科动物核酸序列。该序列通过GeneID 4037333的NCBI参考序列XM_535300.2确认。全长犬科动物核苷酸序列为2618 bp。相应的马多肽序列具有NCBI参考序列: XP_535300.2。犬科动物MMP-2为612个氨基酸的蛋白质。这种IV型胶原酶为一组分泌型锌金属蛋白酶的成员，其在哺乳动物中降解细胞外基质的胶原蛋白。MMP2具有3个重复的在催化域插入的II型纤连蛋白域，参见由Nagase et al., J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274(31): 21491-21494提供的基质金属蛋白酶的短评(minireview)。
SEQ ID NO.15对应于家猫PUMP-1 mRNA，部分cds的猫科动物核酸序列。该序列确认为GeneBank: U04444.1的NCBI参考序列FDU04444。全长猫科动物PUMP-1核苷酸序列为1001 bp。全长PUMP-1多肽序列确认为GeneBank序列: AAA18222.1。猫科动物PUMP-1为262个氨基酸的蛋白质。
SEQ ID NO.16对应于与预测的: 恒河猴基质金属蛋白酶19，转录变体1 (MMP-19), mRNA同源的猫科动物核酸序列。这种恒河猴序列确认为NCBI参考序列: XM_001111542.1。全长恒河猴核苷酸序列为2182 bp。全长多肽序列确认为XP_001111542.1。恒河猴MMP-19为485个氨基酸的蛋白质。
关于本发明实施方案的讨论应该理解，本发明另外考虑以下生物标志物(包含基因及其表达产物)的组合：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)、基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。考虑本发明的实施方案自两组基因及其表达产物的不同组合构建生物标志物测定板(panelsof biomarkers)。
在本发明的某些实施方案中，猫科动物可具有如通过以下领域公认的临床测量定义的正常肾功能：例如肾小球滤过率、肌酸酐清除率、尿蛋白水平、血液肌酸酐水平、尿液肌酸酐水平和/或血尿素氮水平，并且本发明的方法可用于在这样的猫科动物中预测、检测和诊断从正常状态到导致特征在于肾功能下降、肾衰竭、肾小球滤过率减少和肾小球性肾炎的肾疾病的异常状态的变化。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可通过使用检测选自以下的基因表达变化或者一种或多种基因或其表达产物的水平或活性的阵列进行实践：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7,PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。在一种方法中，这种阵列为DNA微阵列。一种或多种基因的活性或表达的水平可通过测量可为多核苷酸或多肽或蛋白的此类基因的表达产物来测定。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可通过使用检测选自以下的基因表达变化，或者一种或多种基因或其表达产物的水平或活性的阵列进行实践：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.16)。在一种方法中，这种阵列为DNA微阵列。一种或多种基因的活性或表达的水平可通过测量可为多核苷酸或多肽或蛋白的此类基因的表达产物进行测定。
本发明的一个方面包括使组织样品或体液样本与在猫科动物中检测选自以下的一种或多种基因或这样的一种或多种基因的表达产物的试剂接触：分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1(III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。这种试剂可为连同常规检测手段比如在固相上的固定化、微测试孔、试管、试纸条(dipsticks)或其它常规手段一起使用的抗体或核酸探针。
本发明的另一个方面包括使组织样品或体液样本与在猫科动物中检测选自以下的一种或多种基因或这样的一种或多种基因的表达产物的试剂接触：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.16)。这种试剂可为联合常规检测手段比如在固相上的固定化、微测试孔、试管、试纸条或其它常规手段一起使用的抗体或核酸探针。
本发明方法的另一个实施方案包括使用常规检测手段，以单独或连同采用多肽和/或多核苷酸的基因表达阵列显示一起测定猫科动物基因表达，这样的常规检测手段包括ELISA、RIA、免疫印迹分析、原位杂交、RNA印迹分析、蛋白印迹分析和Luminex X-Map®分析中的一种或多种。
本发明的进一步方面为其与猫科动物的肾疾病的新生物标志物的识别以及在这样的猫科动物基于体内此类生物标志物的基因表达特征模式的肾疾病的检测方法有关。具体地讲，本发明的方法包括与对照表达水平相比较，检测身体样品，优选地为血液样品中的至少一种生物标志物的差异表达，其中检测这种生物标志物的差异表达特异性地识别患有肾小球性肾炎的猫科动物。因此，这样的方法依赖于检测与来自正常或对照动物的细胞相比较的在患有肾疾病的猫科动物中差异表达的至少一种生物标志物。本发明的生物标志物为在患有或可能发展成异常肾疾病，特别是肾疾病的猫科动物中差异地表达的蛋白和/或核酸。在一个实施方案中，基因表达模式包括选自以下的这样的基因的至少一种基因或翻译产物的至少一种RNA转录物或其翻译产物：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12(COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。在一个优选的实施方案中，差异为围绕平均值的至少约一个标准偏差。在更优选的实施方案中，差异为至少约2倍差异。
本发明的进一步方面为其与猫科动物的肾疾病的新生物标志物的识别以及在这样的猫科动物基于体内这样的生物标志物的基因表达特征模式的肾疾病的检测方法有关。具体地讲，本发明的方法包括与对照表达水平相比较，检测身体样品，优选地为血液样品中的至少一种生物标志物的差异表达，其中检测这样的生物标志物的差异表达特异性地识别患有肾小球性肾炎的猫科动物。因此，这种方法依赖于检测与来自正常或对照动物的细胞相比较的在患有肾疾病的猫科动物中差异地表达的至少一种生物标志物。本发明的生物标志物为在患有或可能发展成异常肾疾病，特别是肾疾病的猫科动物中差异地表达的蛋白和/或核酸。在一个实施方案中，基因表达模式包括选自以下的这样的基因的至少一种基因或翻译产物的至少一种RNA转录物或其翻译产物：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。在一个优选的实施方案中，差异为围绕平均值的至少约一个标准偏差。在更优选的实施方案中，差异为至少约2倍的差异。
本发明的仍然进一步的方面涉及：包括选自以下的至少一种RNA转录物或其翻译产物的猫科动物肾小球性肾炎的生物标志物：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12(COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。在另一个实施方案中，一种或多种生物标志物用于检测肾小球性肾炎。在一个优选的实施方案中，上述一种或多种生物标志物用于区分猫科动物的肾小球性肾炎的阶段。
本发明的仍然进一步的方面涉及：包括选自以下的至少一种RNA转录物或其翻译产物的猫科动物肾小球性肾炎的生物标志物：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。在另一个实施方案中，一种或多种生物标志物用于检测肾小球性肾炎。在一个优选的实施方案中，上述一种或多种生物标志物用于区分猫科动物肾小球性肾炎的阶段。
在进一步的方面，本发明涉及包含一种或多种核酸探针的组合物，所述探针特异性地杂交于编码选自以下的本发明生物标志物的核酸或其片段：分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1(III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
在进一步的方面，本发明涉及包含一种或多种核酸探针的组合物，所述探针特异性地杂交于编码选自以下的本发明生物标志物的核酸或其片段：分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
在另一方面，本发明涉及包含抗体的组合物，所述抗体特异性地结合于由表达选自以下的本发明生物标志物的基因编码的多肽：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12(COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
在另一方面，本发明涉及包含抗体的组合物，所述抗体特异性地结合于由表达选自以下的本发明生物标志物的基因编码的多肽：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
本文进一步考虑本发明的方法可与能够检测肾疾病的物理和形态特征的传统诊断技术组合使用。因此，例如，自猫科动物的组织样品或体液样本得到的细胞中的基因对肾脏的差异表达的表征可与传统诊断(例如放射学)技术相结合，以证实猫科动物的肾疾病包括例如肾小球性肾炎的诊断。
本发明的进一步方面为用于猫科动物的肾疾病的诊断和/或预后的方法，其中所述方法包括以下步骤：自动物得到至少一种组织样品或体液样本；测定自动物得到的所述至少一种样品或样本中的选自表3的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物。
本发明的又一个实施方案为用于猫科动物的肾疾病的诊断和/或预后，特别是实施用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断和/或预后的方法的试剂盒，其中所述方法包括以下步骤：自动物得到至少一种组织样品或体液样本；测定自动物得到的所述至少一种样品或样本中的选自表3的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物，并且任选地进一步包含连接到所述生物标志物的可检测试剂。
本发明的还一个进一步的实施方案为用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断和/或预后，特别是实施用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断和/或预后的方法的试剂，其中所述方法包括以下步骤：自动物得到至少一种组织样品或体液样本；测定自猫科动物得到的所述至少一种样品或样本中的选自表3的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物，并且任选地进一步包含连接到所述生物标志物的可检测试剂。
本发明的进一步方面为用于猫科动物的肾疾病的诊断和/或预后的方法，其中所述方法包括以下步骤：自动物得到至少一种组织样品或体液样本；测定自动物得到的所述至少一种样品或样本中的选自表3和4的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物。
本发明的又一个实施方案为用于猫科动物的肾疾病的诊断和/或预后，特别是实施用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断和/或预后的方法的试剂盒，其中所述方法包括以下步骤：自动物得到至少一种组织样品或体液样本；测定自动物得到的所述至少一种样品或样本中的选自表3和4的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物，并且任选地进一步包含连接到所述生物标志物的可检测试剂。
本发明的还一个进一步的实施方案为用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断和/或预后，特别是实施用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断和/或预后的方法的试剂，其中所述方法包括以下步骤：自动物得到至少一种组织样品或体液样本；测定自猫科动物得到的所述至少一种样品或样本中的选自表3和4的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物，并且任选地进一步包含连接到所述生物标志物的可检测试剂。
本发明的另一个实施方案为选自以下的一种或多种多肽、蛋白质、RNAs、DNAs、多核苷酸或其代谢物，作为用于肾小球性肾炎的诊断和/或预后的生物标志物，特别是在形成用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断或预后的试剂盒中的用途：分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1(III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
本发明的另一个实施方案为选自以下的一种或多种多肽、蛋白质、RNAs、DNAs、多核苷酸或其代谢物，作为用于肾小球性肾炎的诊断和/或预后的生物标志物，特别是在形成用于猫科动物的肾小球性肾炎的诊断或预后的试剂盒中的用途：分泌型卷曲相关蛋白-2(SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ IDNo.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
本发明的另一个实施方案为选自以下的一种或多种多肽、蛋白质、RNAs、DNAs、多核苷酸或其代谢物，作为用于肾疾病的诊断和/或预后的生物标志物，特别是在形成用于猫科动物的肾疾病的诊断或预后的试剂盒中的用途：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)；视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)；光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12(COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
本发明的另一个实施方案为选自以下的一种或多种多肽、蛋白质、RNAs、DNAs、多核苷酸或其代谢物，作为用于肾疾病的诊断和/或预后的生物标志物，特别是在形成用于猫科动物的肾疾病的诊断或预后的试剂盒中的用途：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID NO.9)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.10)，和任选地第二组的至少一种选自以下的多核苷酸：光亮蛋白聚糖(LUM)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.11)；核心蛋白聚糖(DCN)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.12)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.13)；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.14)；基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.15)和基质金属蛋白酶-19 (MMP19)或其猫科动物同源物或片段(SEQ ID No.16)。
还有的另一个实施方案为这样的试剂盒，其中所述试剂和设备包含DNA微阵列分析材料，包括寡核苷酸微阵列、c-DNA微阵列和集中的基因芯片，或其组合。
本发明的其它和进一步的目的、特征和优势对本领域的技术人员而言将是易于显而易见的。
在整个本公开，本发明的各方面可以范围模式(range format)呈现。应该理解，以范围模式存在的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应视为对本发明范围的刻板限制。因此，应认为范围的描述已经具体地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各单独的数值。例如，范围比如1-5的描述应认为具有具体公开的子范围比如1-3、1-4、2-4、2-5、3-5等，以及所述范围内的各别数字例如1、2、3、4和5。这适用于无论范围的宽度。
除非另外指明，本发明的实践可采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述，其处于本领域的技术范围内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标记的杂交检测。合适技术的具体说明可参照下文的实施例。然而，当然也可使用其它等效的常规程序。这样的常规技术和描述可见于标准实验室手册中：比如基因组分析: 实验室手册系列(Genome Analysis: ALaboratory Manual Series) (第I-IV卷); 使用抗体: 实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual); 细胞: 实验室手册(Cells: A Laboratory Manual); PCR引物:实验室手册(PCR Primer: A Laboratory Manual)和分子克隆:实验室手册(MolecularCloning: A Laboratory Manual) (全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press);Stryer, L. (1995) Biochemistry (第4版) Freeman, New York; Gait, “寡核苷酸合成: 一种实用方法(Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach)”1984, IRLPress, London, Nelson and Cox (2000); Lehninger, 生物化学原理(Principles ofBiochemistry)第3版, W.H. Freeman Pub., New York, N.Y; 和Berg et al. (2002) 生物化学(Biochemistry), 第5版, W.H. Freeman Pub., New York, N.Y., 其全部对于所有目的通过引用以其全部结合到本文中。
用于本发明的核酸阵列包括可以商标名称GeneChip®市售得自Affymetrix(Santa Clara, Calif.)的那些核酸阵列。实例阵列显示在affymetrix.com的网站上。
本发明也考虑附着于固体基底的聚合物的许多用途。这些用途包括基因表达监测、序型分析、库筛查、基因型分型和诊断学。基因表达监测和序型分析方法可显示在美国专利第5800992、6013449、6020135、6033860、6040138、6177248、6309822和6344316号中。基因型分型和因此的用途显示在美国系列号60/319253、10/013598和美国专利第5856092、6300063、5858659、6284460、6361947、6368799和6333179号中。其它用途体现在美国专利第5871928、5902723、6045996、5541061和6197506号中。
本领域的技术人员将认识到，在本发明中体现的产物和方法可应用于各种系统，包括市售可得到的包含核酸探针阵列、膜印迹、微测试孔、珠粒和样品管，使用本领域已知的各种方法用各种材料构造的基因表达监测系统。因此，本发明不限于任何具体的实施方案，并且本发明的具体实施方案的以下描述仅用于说明的目的。
基因表达监测系统，在一个优选的实施方案中，可包含核酸探针阵列(包括寡核苷酸阵列、cDNA阵列、打点阵列等)、膜印迹(比如用于杂交分析，比如RNA印迹、蛋白质印迹、斑点印迹等)或微测试孔、样品管、珠粒或纤维(或包含所结合的核酸的任何固体支持物)。参见美国专利第5770722、5744305、5677195、5445934和6040193号，其通过引用结合到本文中。基因表达监测系统也可在溶液中包含核酸探针。
本发明也考虑包含扩增的样品制备。基因组样品可通过各种机制扩增，其中一些可采用PCR。参见例如PCR技术: 用于DNA扩增的原理与应用(PCR Technology: Principlesand Applications for DNA Amplification) (编辑H.A. Erlich, Freeman Press, NY,N.Y., 1992); PCR协议:方法和应用指南(PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications) (编辑 Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990);Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR方法和应用(PCR Methods and Applications) 1, 17 (1991); PCR (编辑McPherson et al.,IRL Press, Oxford); 以及美国专利第4683202、4683195、4800159、4965188和5333675号，并且其每一个对于所有目的通过引用以其全部结合到本文中。样品可在阵列上进行扩增。参见例如美国专利第6300070号和美国专利申请系列号09/513300，其通过引用结合到本文中。
其它合适的扩增方法包括连接酶链反应(ligase chain reaction) (LCR) (例如Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077(1988)和Barringer et al. Gene 89:117 (1990))、转录扩增(transcriptionamplification) (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)和WO88/10315)、自主序列复制(self-sustained sequence replication) (Guatelli etal., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990) 和WO90/06995)、目标多核苷酸序列的选择性扩增(selective amplification of target polynucleotide sequences)(美国专利第6410276号)、共有序列引物聚合酶链反应(consensus sequence primedpolymerase chain reaction) (CP-PCR) (美国专利第4437975号)、随机引物聚合酶链反应(arbitrarily primed polymerase chain reaction) (AP-PCR) (美国专利第5413909、5861245)和基于核酸的序列扩增(nucleic acid based sequence amplification)(NABSA) (美国专利第5409818、5554517 和6063603号，其每一个通过引用结合到本文中)。可使用的其它扩增方法描述在美国专利第5242794、5494810、4988617、6344316号和美国系列号09/854317中，其每一个通过引用结合到本文中。
样品制备的另外方法和技术描述在Dong et al., 基因组研究(GenomeResearch) 11, 1418 (2001)、美国专利第6361947、6391592和美国专利申请系列号09/916135、09/920491、09/910292和10/013598中。
依据本发明的基因表达监测系统可用于促进在不同的细胞或组织、相同细胞或组织的不同亚群、相同细胞或组织的不同生理状态、相同细胞或组织的不同发育阶段或者相同组织的不同细胞群体的表达的比较分析。在一个优选的实施方案中，本发明的按比例扩增方法可提供足以便于受试样品的定量测量以及定性差异的可重复结果(即在统计学显著的误差或可信度的边缘范围内)。
多核苷酸杂交试验为本领域熟知的。杂交试验的程序和条件依应用而变化，并且依据包括在以下提及的那些的已知的通用结合方法进行选择：Maniatis et al. 分子克隆: 实验室手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版. Cold SpringHarbor, N.Y, 1989); 酶学中的Berger和Kimmel方法(Berger and Kimmel Methods inEnzymology), 第152卷, 分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)(Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987); Young and Davis, P.N.A.S,80: 1194 (1983)。用于实施重复和控制的杂交反应的方法和设备已被描述在美国专利第5871928、5874219、6045996、6386749和6391623号中，其每一个通过引用结合到本文中。配体之间的杂交信号检测在某些优选的实施方案中参见美国专利第5143854、5578832、5631734、5834758、5936324、5981956、6025601、6141096、6185030、6201639、6218803和6225625号、美国专利申请60/364731和PCT申请PCT/US99/06097 (作为WO99/47964公开)，其每一个也对于所有目的通过引用以其全部结合到本文中。用于信号检测和强度数据处理的方法和设备被公开于例如美国专利第5143854、5547839、5578832、5631734、5800992、5834758、5856092、5902723、5936324、5981956、6025601、6090555、6141096、6185030、6201639、6218803和6225625号、美国专利申请60/364731和PCT申请PCT/US99/06097 (作为WO99/47964公开)中，其每一个也对于所有目的通过引用以其全部结合到本文中。
本发明不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。进一步地，本文使用的术语为仅用于描述具体实施方案的目的，并不打算限制本发明的范围。
本文引用或参照的所有专利、专利申请、出版物及其它参考文献通过引用结合到本文中至法律允许的程度。那些参考文献的讨论仅打算概述其中作出的主张。不认可任何这样的专利、专利申请、出版物或参考文献或其任何部分为本发明的相关先前技术，并且专门保留挑战这样的专利、专利申请、出版物和其它参考文献的准确性和针对性的权利。
自始至终使用的范围用作用于描述所述范围内的每一个数值的速记法。所述范围内的任何数值可被选择作为所述范围的端点。另外，本文引用的所有参考文献通过引用以其全部结合到本文中。如果本公开的定义和所引用的参考文献冲突，以本公开为主。
实施例
实施例1：具有慢性肾脏疾病的猫科动物依据国际肾脏关注协会(InternationalRenal Interest Society)的指南的分类
在下述实施例中，呈现慢性肾脏疾病的临床体征的猫科动物与未呈现慢性肾脏疾病的体征或症状的动物相比较进行试验。基于在以下表1和2中阐述的标准和依据国际肾脏关注协会(International Renal Interest Society) (IRIS)的指南进行慢性肾脏疾病的病理诊断。
慢性肾脏疾病的(CKD)的分期进行以下CKD诊断，以促进受试动物的适当治疗和监测。分期最初基于空腹血浆肌酸酐，在稳定的动物中评价至少两次。把证明正常肾功能和没有CKD的临床体征或症状的猫科动物分组为非病猫科动物。猫科动物的1期对应于没有CKD至肾功能不全的生物化学证据的早期肾脏疾病的以前分类，其中没有检测到氮血症，但是其中肾小球滤过率(GFR)可能减少和可能存在肾脏的浓缩能力不佳。2期对应于早期肾衰竭的以前分类。在2期，注意到轻度氮血症。3期对应于尿毒症肾衰竭的以前分类，其中检测到中度氮血症。可能存在尿毒症肾衰竭的全身体征，比如骨痛、尿毒症性胃炎、贫血症和代谢性酸中毒。4期对应于终末期肾衰竭，其特征在于严重的氮血症和尿毒症危险期的全身临床体征增加。
表1分别确定所研究的猫科动物的5个类别。研究总计42只诊断为没有CKD的猫科动物。总计14只1期猫科动物呈现微小病变性肾小球性肾炎(GN)。所研究的呈现晚期CKD的猫科动物数目为：2期轻度GN=24；3期中度GN=8和4期显著GN=13。对于每一组猫科动物的血浆肌酸酐水平，作为每一组猫科动物的平均和中值血浆肌酸酐水平显示在表2中。
表1：猫科动物的分期
表2：血浆肌酸酐水平
病理学诊断 平均血浆肌酸酐mg/dl 中值血浆肌酸酐mg/dl
非疾病(n=15) 1.3 1.0
微小GN (n = 4) 1.4 1.5
轻度GN (n=10) 2.4 1.8
中度GN (n=20) 3.8 2.6
显著GN (n=13) 7.1 7.1
实施例2：候选者选择标准
在以下对通过DNA微阵列分析得到的基因表达数据的猫科动物进行报道的实施例中，建立选择标准，以确认某些基因和所表达的蛋白为慢性肾脏疾病和相应地为肾小球性肾炎的合适的生物标志物。为了被确认为CKD的生物学上有意义的标志物，测定基因表达概况，以要求：(1) 基因是一种分泌蛋白；(2) 在证明没有肾小球性肾炎的临床体征或症状的正常动物与证明具有微小、轻度、中度或显著(分别为1-4期) CKD体征的动物之间必须存在至少2-倍(上-或下-调)的差异表达水平；(3) 基因表达水平必须与微小-轻度、中度和显著(1-4期)的疾病进展相关；和(4) 围绕非疾病动物与中度动物之间的平均值存在至少一个标准偏差。后者的选择标准为基于微阵列基因芯片为半定量装置和对数分度粗放多阵列分析(robust multi-array analysis，RMA)用于数据的标准化的观察结果。
技术工人可在用于分析基因芯片数据的许多算法中进行选择。这些算法包括MASS统计算法、探针对数强度误差估计(PLIER)和粗放多芯片分析(RMA)。处理算法在以下参考文献中详细讨论：Li, C. Mo, 2001, 基于模型的寡核苷酸阵列分析：表达指数计算和离群值检测(Model-based analysis of oligonucleotide arrays: expression indexcomputation and outlier detection), Proc. Acad. Sci., 第98卷: 31-36; IrizarryR.A. et al., 高密度寡核苷酸阵列探针水平数据的探究、标准化和总结(Exploration,normalization and summaries of high density oligonucleotide array probe leveldata), Biostatistics, 2003, 第4卷: 249-264; Irizarry et al., Affymetrix基因芯片探针水平数据的汇总(Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data),Nucleic Acid Res., 2003, 第31卷(4): e15; 和Fan, W., A et al., 一类用于分析基因芯片基因表达分析阵列数据的f模型(A class f models for analyzing GeneChipgene expression analysis array data), BMC Genomics, 2005, 第16卷: 6-16; Zhou,L et al., 基于广义对数的Affymetrix基因芯片的表达指数(An expression index forAffymetrix GeneChips based on the generalized logarithm), Bioinformatics,2005, 地21卷(21): 3983-3989和Hein A.K. et al., BGX: Affymetrix基因芯片数据分析的完全贝叶斯集成方法(a fully Bayesian integrated approach to the analysisof Affymetrix GeneChip data), Biostatistics, 2005, 第6卷: 349-373。
以下实施例中的原始数据使用GeneSpring版本7.0 (GS)软件(AgilentCorporation)进行分析和使用R- Bioconductor (RB)免费软件确认。两个软件包用于计算来自由Affymetrix Instrument产生的CEL文件的探针强度。Present/Absent/Marginal呼叫每探针和P-值分别使用R-Bioconductor和GeneSpring软件进行计算。
基因表达数据对于任何给定的分析被确定为或者“向上”或者“向下”-调节的。决定基因向上”还是“向下”以作为对于每一个单独探针的处理强度/对照强度计算的倍数变化为基础。如果倍数变化值<1/2，则认为其为向下调节的，而如果倍数变化>2.0则认为是向上调节的。而且，如果探针在其中进行比较(处理或对照)的仅有的一种情况下称为存在，并且在其它情况下为“不存在”或“边缘的”，并且倍数变化依据所使用的软件为显著的，那么认为其对于进一步仔细检查是显著的。
实施例3：RNA分离程序.
材料和方法. 以下通用程序可用于自猫科动物和采用基因芯片进行基因表达序型分析的猫科动物的组织样品分离RNA，如在该说明书的实施例中进一步描述的那样。对本领域的普通技术人员显而易见的是，这些程序或其修饰，如本领域中认识到的那样，可用于自组织或体液样品分离RNA，用于使用本领域的普通技术人员可得到的各种分析程序，特别是微阵列技术进行进一步的基因表达分析。
自组织分离核糖核酸(RNA). 可收集组织样品、用液氮冷冻、解冻并然后以研钵和杵(mortal and pestle)研磨、均质化并转移至50 ml锥形瓶中。然后均质化的组织样品使用TRIzol® RNA提取方法，依据制造商的用法说明书(Invitrogen)进行处理，产生良好质量的RNA，其然后接受进一步的基因组分析。
材料：冰、液氮、冷冻的猫科动物组织、TRIzol®细胞溶解试剂、氯仿最低99%、异丙醇、70%乙醇(用乙醇制备，绝对和去离子的，无RNase的水)、RNase Zap®、去离子水、来自Ambion的RNA储备液(RNA Storage Solution®)。
设备：Ultra-Turrax T25 Power Homogenizer、Beckman Coulter Allegra 25RCentrifuge、Eppendorf Centrifuge、镊子、手术刀；硬切削表面，即切板；1.5 mL无DNase和RNase/无菌微型离心管、50mL无DNase和RNase/一次性无菌聚丙烯管；P1000、P200、P20、P10和P2 Rainin Pipetman移液管；P1000、P200、P20、P10和P2移液管的过滤吸管端，无DNase和RNase/无菌；以及化妆棉(lint free wipes)。
准备：准备含有4 mL TRIzol®的50 mL聚丙烯管(选择一个管对应每个组织用于RNA分离)。
组织均化：用3-4勺液氮填充能够容纳液氮的容器。立即把一块冷冻的组织置于上述容器(该组织应为约一个豌豆大小)中，并把该组织置于适当标记的50 mL聚丙烯管(其已经含有4 mL TRIzol®)中。立即开始使用Ultra-Turrax T25 Power Homogenizer进行均化。以最高设置(6)均化10-15秒。使样品在冰上冷却另外10-15秒并然后重复。继续直到组织完全均化并且溶液为浑浊。在完全均化时，把50 mL管加盖并回到冰上。把均化的组织在室温下温育5分钟，之后继续进行分离程序。
实施例4：RNA制备程序.
RNA分离：一般遵循在提供TRIzol®试剂的Invitrogen用法说明书中给出的程序。把均化的样品在4个1.5 mL微型离心管中分成4个1 mL等分试样。向每个1 mL等分试样加入200 uL氯仿。把管加盖，涡流15秒，然后上下摇动。结果应为粉红色乳状液。把管在室温下温育2-3分钟。把管在14000 rpm和4℃下离心15分钟。把水相(顶层)转移至无菌的1.5 mL微型离心管中。应被转移至新管中的水相的一般体积为约500 uL。一定不转移任何中间的或下层相。通过向含有水层的每个微型离心管中加入500 uL异丙醇使RNA自溶液中沉淀。把管上下摇动至少20秒。把样品在室温下温育10分钟。在4℃下，以14000 rpm将样品离心10分钟。通过吸走液体小心去除上清液，确保不要失去颗粒小球。加入1mL的70%乙醇以洗涤颗粒小球。通过轻敲管(或在实验桌上轻拍管)逐出颗粒小球并摇动以混合。在4℃下，以8200 rpm离心5分钟。通过吸走液体小心去除上清液，确保不要失去颗粒小球。使用化妆棉小心吸收过量的乙醇，以确保颗粒小球为干燥的。把每个颗粒小球再次悬浮于30 uL的RNA储备液(RNA Storage Solution)中。通过用吸量管吸移液体轻轻混合，直到RNA回到溶液中，然后在-80℃下储存。可能有必要把样品以低速涡流几秒钟，以促进RNA的再次悬浮。如果这是必要的，在冷冻之前使用微型离心机把样品减慢旋转。
RNA清洗：遵循在RNeasy®微型手册(RNeasy® Mini Handbook)中给出的程序。
自在使用RNeasy微型试剂盒(RNeasy Mini Kit)的OptiCell室(OptiCellChambers)中培养的细胞分离RNA。自哺乳动物细胞系培养的细胞用于分离良好质量的RNA，其然后用于未来的下游基因组分析。涉及细胞培养的所有工作要在严格的无菌条件下进行。
试剂：10X PBS、去离子H2O、绝对乙醇、RNA储备液(RNA Storage Solution)、β-巯基乙醇、RNase Zap®、缓冲液RLT (Buffer RLT)和缓冲液RW1 (Buffer RW1)和缓冲液RPE(Buffer RPE) (以RNeasy Mini Kit提供)。
设备/材料：RNeasy Mini Kit、QIAshredder离心柱(spin columns)、OptiCell刀、20mL无菌注射器、OptiCell尖端、Cell刮刀、P1000 Pipetman移液管、Rainin、P200Pipetman移液管、Rainin、100-100 uL过滤吸管尖端、1-200 uL过滤吸管尖端、无菌移液吸管、55mL无菌溶液池、1.5mL无菌微型离心管和Eppendorf微型离心机(EppendorfMicrocentrifuge)。
溶液：缓冲液RLT (Buffer RLT) (在RNeasy微型试剂盒(RNeasy Mini Kit)中提供的储备物)；-在开始协议之前加入100 uL的β-巯基乙醇每10 mL的缓冲液RLT (BufferRLT)。70%乙醇：通过向15 mL的去离子无RNase水中加入35 mL绝对乙醇制备50 mL的70%乙醇。1X PBS: 无RNase的水。使用a .22 um滤器过滤溶液。
程序：自OptiCell室(OptiCell Chamber)去除细胞(一次进行一个OptiCell)。在分离RNA之前于显微镜下检查细胞，以确保细胞是活的。去除并弃去细胞培养基。使用OptiCell刀，切掉顶膜，在较低的膜暴露细胞。用1X PBS把细胞附着的膜洗涤3次。向细胞附着的膜的中央用移液管吸取600 uL的缓冲液RLT (Buffer RLT)溶液(含有β-巯基乙醇)。使用细胞刮刀，在膜的整个表面上轻轻地撒播缓冲液RLT (Buffer RLT)，然后把液体收集在一个角落。用移液管吸走整个体积的缓冲液RLT (Buffer RLT)并置于QIAshredder离心柱中。
RNA分离：以14000 rpm把QIAshredder离心柱用离心机分离2分钟。弃去离心柱，但是保留收集管及其内容物。向收集管加入600 uL的70%乙醇，并通过用吸液管吸移液体很好混合(总体积现在=1.2mL)。向RNeasy微型柱转移600 uL的细胞溶解产物，并以14000 rpm离心15秒。弃去流体，但是保留收集管和离心柱。把剩余体积的细胞溶解产物(~600uL)转移至离心柱，并重复离心。弃去流体，但是保留收集管和离心柱。向离心柱加入700 uL缓冲液RW1(Buffer RW1)。以14000 rpm离心15秒以洗涤柱。弃去流体和收集管。把离心柱转移至新的2mL收集管，并向柱中加入500 uL缓冲液RPE (Buffer RPE)。以14000 rpm离心15秒。弃去流体，保留收集管/柱。向柱中加入另一份500 uL缓冲液RPE (Buffer RPE)。以14000 rpm离心2分钟。把离心柱转移至1.5mL收集管。直接向硅胶膜加入30 uL的RNA储备液(RNA StorageSolution)，并以14000 rpm离心1分钟，以洗脱RNA。在-70℃下储存最终RNA。
RNA 6000 Nano Assay. 使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent 2100Bioanalyzer)和RNA 6000 Nano Assay，分析自所培养的哺乳动物细胞，淋巴细胞或组织分离的RNA，用于定性。
试剂：RNA 6000 Nano凝胶基质、RNA 6000 Nano染料浓缩物、RNA 6000 NanoMarker (标记物)、(全部以上试剂包含在RNA 6000 Nano Assay (测定)试剂盒, Agilent中)、RNA 6000梯状物、RNase Zap和无RNase水，来自Ambion。
设备/其它材料：Agilent芯片引物溶液(Agilent Chip Priming Station),Agilent；RNA 6000芯片, Agilent；电极清洁剂；P2、P10、P200和P1000 Rainin Pipetman移液管，无菌；无DNase/RNase 过滤吸管尖端、1.5mL微型离心管，无菌；涡流、IKA旋涡混合器、微型离心机和加热块。
程序：由Agilent Technologies在试剂盒使用指南(Reagent Kit Guide), RNA6000 Nano Assay, 2003年11月版本中给出程序。伴随以下改变，遵循在使用指南(Guide)中给出的程序：制备凝胶(Preparing the Gel), 第17页-而不是把过滤的凝胶分成每个65uL的等分试样，在初始微型离心管中保留储备过滤的凝胶，并且如果需要等分65 uL。加载RNA 6000 Nano标记物 (Loading the RNA 6000 Nano Marker), 第22页-向将不含样品的每个样品孔加入1 uL的无RNase水(而不是RNA 6000 Nano Marker (标记物))。这不仅将保持所使用的Marker的量，而且还用作阴性对照以见到没有试剂被污染，包括无RNase水。加载梯状物和样品(Loading the Ladder and Samples), 第23页-把样品和RNA 6000Ladder在71℃下加热变性另外30秒(总计2.5分钟)。开始芯片运行(Starting the ChipRun), 第26页-自分析菜单选择“真核细胞种RNANano (Eukaryote Total RNA Nano)”选项。
实施例5：Affymetrix GeneChip Expression Analysis (Affymetrix基因芯片表达分析).
基因表达使用专有的Affymetrix Feline GeneChip® (猫科动物基因芯片)分析。总的RNA逆转录成cDNA。cDNA用于产生断裂的cRNA和用作基因芯片(GeneChip)杂交的探针。洗涤基因芯片，并用Affymetrix激光扫描仪测量杂交信号。然后根据制造商的用法说明书确认杂交数据并标准化，用于进一步分析。
设备：Eppendorf微型离心机、1.5mL无DNase和RNase /无菌微型离心管、50mL无DNase和RNase/无菌一次性聚丙烯管；P1000、P200、P20、P10和P2 Rainin Pipetman移液管；P1000、P200、P20、P10和P2移液管的Filter吸管尖端；无DNase和RNase/无菌；和Peltier 热循环控制装置PTC-200 (Peltier Thermal Cycler PTC-200)。
程序：遵循如在基因芯片表达分析技术手册(GeneChip Expression AnalysisTechnical Manual) (Affymetrix版权1999-2003)中精确描述的所有程序。使用5微克总的RNA用于第一链cDNA合成。使用或者Peltier Thermal Cycler PTC-200或者加热块用于对反应进行温度控制和探针变性。使用RNA NanoDrop芯片用生物分析仪(BioAnalyer) 2100实施质量控制。使用100 Format (格式板) (Midi Array)用于猫科动物基因芯片。
实施例6：具有慢性肾脏疾病的猫科动物的基因表达
依据先前实施例1-5，使用具有不同阶段的慢性肾脏疾病的猫科动物进行研究，以测定具有正常肾功能的猫科动物与具有对应于如在表1中呈现的1-4期的微小、轻度、中度和显著肾小球性肾炎的猫科动物之间的潜在基因表达差异。如在该说明书的实施例中描述的程序用于自15只具有正常肾功能的猫科动物、4只具有微小肾小球性肾炎的猫科动物、10只具有轻度肾小球性肾炎的猫科动物、20只具有中度肾小球性肾炎的猫科动物和13只具有显著肾小球性肾炎的猫科动物制备组织和体液样品，如由在表2中呈现的血浆肌酸酐水平和由临床观察测定的那样。
基于比较具有正常肾功能的猫科动物与具有肾小球性肾炎的猫科动物的基因表达数据，如在前述实施例中定义的那样，列于表3的4种基因被确认为满足作为猫科动物的慢性肾疾病的潜在标志物的实施例2的选择标准。所述基因包括光亮蛋白聚糖(LUM)；胶原蛋白α1 (III)链，变体12 (COL3A1)；核心蛋白聚糖(DCN)和分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)。对于每个基因的类似人类的同义词和mRNA与蛋白保藏登记号列于表3中。每一种蛋白为分泌型蛋白。对于5种基因中的每一种与肾小球性肾炎的的阶段相比较绘制的几何倍数变化数据分别呈现于图1-4中。
图1a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于光亮蛋白聚糖基因表达产物超过正常猫科动物为10的几何平均倍数变化。图1b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图2a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于COL3A1基因表达产物超过正常猫科动物为10的几何平均倍数变化。图2b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图3a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于核心蛋白聚糖基因表达产物超过正常猫科动物为4.3的几何平均倍数变化。图3b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图4a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于SFRP2基因表达产物超过正常猫科动物为3.8的几何平均倍数变化。图4b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图5a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于基质金属蛋白酶-2基因表达产物超过正常猫科动物为10.3的几何平均倍数变化。图5b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图6a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于基质金属蛋白酶-7基因表达产物超过正常猫科动物为23的几何平均倍数变化。图6b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图7a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于基质金属蛋白酶-19基因表达产物超过正常猫科动物为6.9的几何平均倍数变化。图7b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
图8a证实具有显著肾小球性肾炎的猫科动物对于视黄醇结合蛋白5基因表达产物超过正常猫科动物为3.9向下调节的几何平均倍数变化。图8b呈现对于每一只受试动物与肾小球性肾炎的阶段相比较绘制的几何平均RMA强度数据。
尽管任何组合物、方法、制品或者与本文描述的那些类似或等价的其它试剂或材料可用于本发明的实践，优选的组合物、方法、制品或者其它试剂或材料在本文进行描述。
表3：生物标志物的列表
表4：生物标志物的列表
。

Claims (26)

1.试剂在制备用于在猫科动物中诊断肾疾病的存在的试剂盒中的用途，其中所述试剂为用于测量来自猫科动物的生物样品中选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平的试剂：光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；分泌型卷曲相关蛋白2；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19，其中所述样品中的所述一种或多种生物标志物的表达相对于来自正常动物样品中表达的对照值的差异表明存在肾疾病，其中所述试剂包括用于测量生物标志物分泌型卷曲相关蛋白2的表达水平的试剂。
2.权利要求1的用途，其中所述试剂包括用于检测分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)的表达水平以及任选地选自以下的至少一种生物标志物的表达水平的试剂：光亮蛋白聚糖(LUM)、核心蛋白聚糖(DCN)、胶原蛋白α1 (III)链变体12；基质金属蛋白酶-2 (MMP2)、基质金属蛋白酶-7 (MMP7, PUMP-1)和基质金属蛋白酶-19(MMP19)。
3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述一种或多种生物标志物的表达水平通过使用以下两种方法的任何一种方法测量所述一种或多种生物标志物的基因表达来测定：(i)DNA微阵列，其包含一种或多种与对应于所述一种或多种要测量的生物标志物的mRNA或cDNA互补的寡核苷酸，或(ii) 采用对应于所述一种或多种要测量的生物标志物的mRNA或cDNA的寡核苷酸引物的定量聚合酶链反应。
4.权利要求3的用途，其中测量一种或多种生物标志物的基因表达包括(i) 自组织样品分离RNA，(ii) 逆转录所述RNA，以得到对应的cDNA，(iii) 分离并裂解如此得到的cDNA，(iv) 使cDNA片段与包含一种或多种与对应于所述一种或多种要测量的生物标志物的cDNA互补的寡核苷酸的DNA微阵列接触，和(v) 检测cDNA片段与DNA微阵列中的所述一种或多种寡核苷酸之间的杂交。
5.权利要求4的用途，其中所述DNA微阵列中的寡核苷酸包括一种或多种能够与SEQ IDNO. 9-16中的一种或多种杂交的探针。
6.权利要求5的用途，其中所述DNA微阵列中的寡核苷酸包括一种或多种包含选自SEQID NO. 1-8中的一种或多种序列的探针。
7.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述生物标志物的表达水平用表达的蛋白质的抗体进行检测。
8.权利要求7的用途，其中所述生物标志物通过选自以下的免疫测定法检测：竞争性结合测定、非竞争性结合测定、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、三明治测定法、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定、凝集反应测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定、免疫PCR免疫测定、A蛋白或G蛋白免疫测定和免疫电泳测定。
9.权利要求1或2的用途，其中所述生物标志物的表达水平通过使用定量质谱法测量样品中蛋白质的量进行检测。
10.权利要求1或2的用途，其中所述生物标志物的表达水平通过识别所表达的蛋白质的适体进行检测。
11.权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述生物样品为血液或肾脏组织的样品。
12.权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述试剂包括用于检测分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)的表达水平的试剂。
13.权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述猫科动物具有基本正常的肾功能，所述基本正常的肾功能通过以下一种或多种测量来确定：正常的肾小球滤过率、肌酸酐清除率、尿蛋白水平、血清肌酸酐水平、尿肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、放射性同位素代谢标记、软组织成像，其中所述软组织成像包括超声波扫描术、磁共振成像和/或计算机断层扫描。
14.权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述肾疾病为特征在于肾功能的异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率减少或肾小球性肾炎的疾病。
15.权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述肾疾病为肾小球性肾炎。
16.权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中肾疾病的存在通过以下的一种或多种表达相对于对照表达值的显著差异来指示，其中“显著差异”在增加表达的情况下为增加至少一倍和在减少表达的情况下为减少至少50%：
a. 光亮蛋白聚糖表达增加；
b. 胶原蛋白α1 (III)链，变体12表达增加；
c. 核心蛋白聚糖表达增加；
d. 分泌型卷曲相关蛋白-2表达增加；
e. 视黄醇结合蛋白5表达减少；
f. MMP-2表达增加；
g. MMP-7表达增加；和/或
h. MMP-19表达增加。
17.依据权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述测量所述一种或多种生物标志物的试剂为能够检测所述一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针。
18.依据权利要求17的用途，其中所述一种或多种核酸探针能够与SEQ ID NO. 9-16中的一种或多种杂交。
19.依据权利要求17的用途，其中所述一种或多种核酸探针包含选自SEQ ID NO. 1-8中的一种或多种的一个序列或多个序列。
20.依据权利要求1的用途，其中所述试剂盒包含含有能够检测所述一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针的DNA微阵列。
21.依据权利要求1或2的用途，其中所述用于测量所述一种或多种生物标志物的试剂为能够检测所述一种或多种生物标志物的一种或多种抗体或适体。
22.依据权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒包含ELISA形式，该ELISA形式包含能够检测所述一种或多种生物标志物的一种或多种抗体、对应于生物标志物的用作标准的分离的蛋白，以及缓冲剂。
23.依据权利要求1、2、4、5和6中任何一项的用途，其中所述生物标志物包括分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)和视黄醇结合蛋白5 (rbp5)。
24.对应于猫科动物分泌型卷曲相关蛋白2的基因或与该基因互补的核苷酸序列或猫科动物分泌型卷曲相关蛋白2的抗体在制备依据权利要求1的试剂盒中的用途。
25.依据权利要求24的用途，其中所述试剂盒还包含：
对应于猫科动物光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19的基因或与该基因互补的核苷酸序列，或
猫科动物光亮蛋白聚糖；胶原蛋白α1 (III)链，变体12；核心蛋白聚糖；视黄醇结合蛋白5；MMP-2；MMP-7和MMP-19的抗体。
26.依据权利要求24的用途，其中所述试剂盒包含对应于SEQ ID NO. 1-16中的任何一种或与之互补的核苷酸序列。
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