CZ32299A3

CZ32299A3 - Způsob detekce chronického odmítání po transplantaci orgánu a způsob stanovení složek moči

Info

Publication number: CZ32299A3
Application number: CZ99322A
Authority: CZ
Inventors: Isamu Koyama; Tadaki Yasumura; Kyuichi Nemoto; Takako Mae; Kan Saiga; Hisako Takagi; Atsuko Isoda; Toshio Tanabe
Original assignee: Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 1999-08-11
Also published as: BR9710776A; AU726351B2; AU3635897A; EP0985932A4; KR20000029575A; CN1226967A; EP0985932A1; US6210912B1; WO1998005970A1; CA2261739A1; PL331480A1

Description

(57) Anotace:

Způsob spočívá v detekci trioxldu dusíku /NO3/ a matrixové metaproteázy-2 /MMP-2/ nebo jejích prekurzorů v látkách jako je lidská moč nebo krev. Detekce NO3 se výhodně provádí imunoanalýzou, například sendvičovou analýzou. Řešení se také týká soupravy pro detekci začátku chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu, např. po transplantaci ledvin.

Způsob testování reakce chronického odmítání po ( transplantaci orgánu a způsob určování složek moči

Oblast techniky

Vynález se týká způsob detekce počátku chronického odmítání po transplantaci orgánu zkoumáním tělesných tekutin, odebraných z těla. Vynález se konkrétně týká způsobu detekce odmítání (chronického odmítání), ke kterému dochází v chronické fázi po transplantaci orgánu testováním trioxidu dusíku (NO3) a matrixové metaloproteinázy-2 (označované jako MMP-2) nebo jejích prekurzorů v tělesných tekutinách a způsobu testování MMP2 nebo jejích prekurzorů v moči.

Dosavadní stav techniky

U pacientů s ledvinovou transplantací je obecně chronické odmítání diagnostikováno renální biopsií. Nicméně pacienti trpí periodickým opakováním renální biopsie, která může současně zhoršit funkci ledvin. Kromě toho takové chronické odmítání postupuje pomalu, což způsobuje jen chabé subjektivní symptomy a proto většina pacientů odmítá bolestivou renální bíopsii.

Současně s tím jsou používány testy ledvinové funkce, které dávají indikaci postupu chronického odmítání, neboť chronické odmítání poškozuje funkci ledvin. V těchto testech byly analyzovány močové proteiny, močový albumin a močový transferin a pod. jako indikátory zrychlování proteinové permeability, která odráží glomerulární abnormalitu a dále krevní kreatinin, krevní močovinový dusík (BUN - blood urea nitrogen), krevní p2-mikroglobulin a krevní cti-mikroglobulin jako indikátory poklesu rychlosti glomerulární filtrace (GFR - glomerular filtration rate). Nicméně změny testovaných hodnot při postupu chronického odmítání jsou mírné a pokud jsou naměřeny abnormální hodnoty, chronické odmítání již vykazuje symptomy konečného stadia. Dosud nebyl znám žádný způsob, který by umožnil včasnou detekci chronického odmítání analýzou endogenních látek v tělesných tekutinách jako je moč nebo krev. Jelikož v současné době není k disposici žádná taková jednoduchá testovací metoda, pacienti se slabými subjektivními symptomy chronického odmítání dospějí do konečného stadia, aniž by se jim dostalo odpovídající léčby, takže tito pacienti často pozbývají ledvinové funkce.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout jednoduchý způsob, který umožňuje detekci chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu testování reakce chronického odmítání po transplantaci orgánu a způsob určování složek moči. NO₃ a NO₂ jsou konečné metabolity radikálů NO v biologických organismech. Radikály NO jsou vytvářeny granulocyty a makrofágy a dalšími objekty v průběhu zánětu nebo poškození orgánu. Proto jsou tyto metabolity klinicky zjišťovány v průběhu zánětu, ischemických srdečních onemocnění, způsobených poškozením orgánu, při šoku, akutním odmítání po transplantaci a při bakteriální infekci. Není však známa žádná zpráva, popisující NO radikály v průběhu chronického odmítání po transplantaci. Proto informace o tom, zda NO 3 je nebo není vytvářen v organizmu v důsledku odmítání tkáně, které postupuje chronickým způsobem a tedy zda NO3 se nachází v tělesných tekutinách, může sloužit jako indikátor v testech chronického odmítání a bylo zjištěno, že NO3 v tělesných tekutinách může sloužit jako indikátor při určování, zda dochází k chronickému odmítání.

Kromě toho MMP-2, enzym, který degraduje kolagen, vytvářející bazální membrány, je aktivní v průběhu náhrady a regenerace tkání. Předpokládá se dále, že při rakovině tento enzym způsobuje dekompozici kolagenu v průběhu infiltrace rakovinových buněk do bazální membrány. Po

- 4 • · usilovných výzkumech přihlašovatelé zjistili, že MMP-2 nebo její prekurzor se nikdy nedostává do tělesných tekutin jako je moč u normálních pacientů nebo u pacientů, u nichž nedochází k počátku chronického odmítání tkáně po transplantaci ledvin a pokud již k tomu dojde, nachází se v takové tělesné tekutině enzym jen ve stopovém množství, zatímco množství MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách jako je moč u pacientů s chronickým odmítáním po transplantaci orgánu znatelně vzroste. V souladu s předloženým vynálezem je podán způsob detekce odmítání po transplantaci orgánu zkoumáním endogenních látek jako je NO3 a MMP-2 nebo její prekurzor v tělesných tekutinách jako je krev nebo moč, vycházejíce z objevu, že koncentrace těchto endogenních látek vylučovaných do tělesných tekutin jako je krev nebo moč významně vzroste, pokud dojde k začátku chronického odmítání po transplantaci orgánu; dále je podána testovací souprava pro provádění způsobu podle předloženého vynálezu a způsob testování MMP-2 nebo jeho prekurzoru v moči.

Blíže se vynález týká (1) způsobu detekce začátku chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu analýzou tělesných tekutin, odebraných z těla, (2) způsobu detekce chronického odmítání po transplantaci, při kterém se provádí detekce NO3,

MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách, (3) způsobu popsaného v bodě (2), ve kterém se detekuje NO₃ v tělesných tekutinách, í

(4) způsobu popsaného v bodě (2), ve kterém se detekuje MMP-2 nebo její prekurzor, (5) způsobu popsaného v některém z bodů (2), (3) nebo (4) , ve kterém tělesná tekutina zahrnuje lidskou moč nebo krev, (6) způsobu popsaného v bodě (2), ve kterém se detekuje MMP-2 nebo její prekurzor ve vzorku moči, (7) způsobu popsaného v některém z bodů (2), (3), (4), (5) nebo (6), ve kterém transplantace orgánu je transplantace ledvin, (8) způsobu popsaného v bodě (6), ve kterém se prahová hodnota pro určování, zda dochází nebo nedochází k chronickému odmítání po transplantaci ledvin, nachází v rozmezí od 0,1 do 10,0 ng/ml koncentrace prekurzoru MMP-2 ve vzorku močí, (9) způsobu popsaného v bodě (8), ve kterém se prahová hodnota nachází v rozmezí od 0,5 do 5 ng/ml,

4* • 4 4 ·«·· ·* 44 (10) způsobu popsaného v bodě (6), ve kterém se analyzuje koncentrace prekurzoru MMP-2 a koncentrace kreatininu ve vzorku moči a prahová hodnota indexu po korekci na koncentraci kreatininu pro určování, zda dochází nebo nedochází k chronickému odmítání po transplantaci ledvin, se nachází v rozmezí od 0,1 do 20,0 pg/g kreatininu, (11) způsobu popsaného v bodě (10), ve kterém se prahová hodnota nachází v rozmezí od 0,5 do 10 pg/mg kreatininu, (12) způsobu popsaného v některém z bodů (2) a (4) až (11), ve kterém se detekce provádí imunoanalýzou, (13) způsobu popsaného v bodě (12), ve kterém imunoanalýza je enzymová imunoanalýza, (14) způsobu popsaného v bodě (12) nebo (13), ve kterém imunoanalýza je sendvičová analýza, (15) způsobu analýzy MMP-2 nebo jejího prekurzoru v moči imunoanalýzou, (16) soupravy pro detekci začátku chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu zkoumáním tělesných tekutin, odebraných z těla,

-Ί • Β «· Β Β * · * · * · • · · · · · Β * · · Β * • · · · · · « » V Β « • · Β Β · · Β Β · Β · Β · Β Β * » ♦ * Β Β Β · Β «Β ΒΒ «Β ΒΒΒΒ Β· ΒΒ (17) soupravy pro detekci chronického odmítání po transplantaci orgánu analýzou trioxidu dusíku (NO₃) nebo matrixové metaloproteinázy MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách, (18) soupravy pro detekci chronického odmítání po transplantaci orgánu analýzou MMP-2 nebo jejího prekurzoru v moči nebo krvi, (19) soupravy popsané v bodě (18), ve které se detekce provádí imunoanalýzou, (20) způsobu diagnostiky chronického odmítání v Časném stadiu po transplantaci orgánu zkoumáním tělesných tekutin, (21) způsobu diagnostiky chronického odmítání po transplantaci orgánu analýzou trioxidu dusíku (NO3) nebo matrixové metaloproteinázy MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách, (22) způsobu diagnostiky popsaného v bodě (21), ve kterém tělesné tekutiny zahrnují moč nebo krev.

«* • · · · ·« · · · · ··«· ·«·« · ···· · · » · · · · • · ··· · * φ β · ··· ·· ·· · · · * · · ·♦ ·· «♦ ···· ·· »»

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže vysvětlen prostřednictvím konkrétních příkladů provedení znázorněných na výkresech, na kterých obr. 1 znázorňuje histogram koncentrace prekurzorů močové MMP-2 u pacientů s transplantací ledvin a obr. 2 znázorňuje histogram koncentrace prekurzorů močové MMP-2 u pacientů s transplantací ledvin po korekci založené na koncentracích kreatininu.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález se týká způsobu testování chronického odmítání v jeho časném stadiu po transplantaci orgánu jednoduchým způsobem analýzou endogenních látek specificky vylučovaných do tělesných tekutin v důsledku chronického odmítání po transplantaci orgánu. Podle předloženého vynálezu tělesné tekutiny (jejich vzorky), zahrnují lidské tělesné tekutiny, jako jsou moč a krev a její komponenty, zahrnující sérum a plasma. Vzorek moči může být vyhovující, jestliže je vzorek je shromážděn nebo je «φ φφ • * • · φφφ φ φ φ φ φ φ φ vzorek shromážděn a uchováván takovým způsobem, že látky, které mají být detekovány, jako je MMP-2 a její prekurzor, jsou stabilní. Časový průběh a způsob získávání vzorku moči nejsou žádným specifickým způsobem omezeny, pokud přitom nedojde k poškození klinického významu MMP-2 nebo jejího prekurzoru. Může být použit vzorek moči, který byl odebrán a uchován obvyklým způsobem. Moč může být někdy odebírána a uchovávána v nádobě, do které jsou přidány například antibakteriální činidla, aby se dosáhlo stability moči v průběhu uchovávání a takové vzorky mohou být použity také, pokud přidané antibakteriální činidlo neovlivňuje výsledek analýzy. Navíc transplantace orgánu zahrnuje transplantaci ledvin, transplantaci jater, transplantaci srdce a transplantaci slinivky břišní bez specifických omezení, ale obzvláště výhodný je případ transplantace ledvin.

Endogenní látky zahrnují trioxid dusíku (NOj), matrixovou metaloproteinázu-2 (MMP-2) a její prekurzor a podobně.

Způsob analýzy (kvantitativního určení a podobně) množství NO3 ve vzorku je znám (například Griessova metoda) a podle předloženého vynálezu je množství NO3 určováno známými způsoby. NO₃ může být například určován vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC - high performance liquid chromatography) použitím komerčně dostupných automatických analyzátorů dusíku v dusičnanové a dusitanové podobě. NO3 také může být analyzován v 96φφ

-10 φ φφ φ φ φ φ · · φ · ·* φ* jamkové mi kro desce s komerčně dostupnou NO kolorimetrickou soupravou a NO fluorescenční testovací soupravou s použitím mi kro deskového čtecího zařízení a podobně. Kromě toho může být použit jakýkoli jiný systém schopný určovat NO3.

NO3 je přítomen v séru a dalších tekutinách normálních subjektů nebo pacientů s transplantací orgánu, ale bez začínajícího chronického odmítání, ale množství NOj, který je přítomen v séru a podobně u pacientů s chronickým odmítáním po transplantaci orgánu je významně zvýšen. Nastavením mezní hodnoty na vhodnou úroveň je proto možné stanovit s vysokou přesností, zda u těchto pacientů dochází nebo nedochází k chronickému odmítání. Prahová hodnota se mění v závislosti na druhu vzorku, který je používán nebo na druhu transplantovaného orgánu. Prahová hodnota musí být vhodně určena v závislosti na druhu vzorku a orgánu, ale je možné uvést, že pro vzorek séra pacienta s transplantací ledvin je tato hodnota výhodně nastavena v rozmezí od 50 do 120 μΜ (koncentrace NO3 v séru).

MMP-2 je uvolňována z buněk ve formě svého prekurzoru, pro-MMP-2. Tento prekurzor se potom přeměňuje na MMP-2. Podle předloženého vynálezu výraz „prekurzor MMP-2“ znamená každou látku, která se potenciálně může přeměnit na MMP-2 a speciálně znamená pro-MMP-2. Prekurzor pro4«

-11I» 0· 0 44 «4

09 4 4 · · » 4 » · • 404 94 · 0 4 0 4 • · 440 4 0 0 00 0·0 40· • 4 · 4 « 0 0 · 4· 4·*· «0 44

MMP-2 může vytvářet komplex s inhibitory jako jsou TIMP (tkáňový inhibitor metaloproteinázy)-2 a TIMP-1 a prekurzor podle předloženého vynálezu zahrnuje pro-MMP-2 ve formě takového komplexu. Prekurzor pro-MMP-2 může být přítomen v libovolné podobě, bez jakýchkoli specifických omezení.

Způsob analýzy (kvantitativního určování a pod.) MMP-2 nebo jejího prekurzoru ve vzorku je znám a podle předloženého vynálezu je množství MMP-2 nebo jejího prekurzoru analyzováno (kvantitativně určováno) známými způsoby. Způsob je například prováděn analyzováním MMP-2 nebo jejího prekurzoru v systému, který je specifický pro MMP-2 nebo její prekurzor a umožňuje určovat koncentraci MMP-2 nebo jejího prekurzoru jako proteinovou koncentraci nebo jako úroveň aktivity enzymu. Libovolný způsob analýzy, který je specifický vzhledem k MMP-2 nebo jejímu prekurzoru, může být použit bez specifických omezení, avšak způsob, který zaručí vysokou citlivost a dobrou reprodukovatelnost výsledků může být výhodný.

Konkrétněji způsob určování koncentrace proteinu zahrnuje imunologické metody používající protilátky, které jsou specifické na MMP-2 nebo její prekurzor. Způsob určování koncentrace úrovně aktivity enzymu navíc zahrnuje biochemické metody, používající substrát s vysokou specificitou k MMP-2.

* ·

-120 0*0 0 fc · ·· * · · ·· · · · · · · 0 · fc « 0 0 · 0 · •fc ·0 00 0000 0·

V případě biochemických metod analýzy aktivity enzymu zahrnují substráty s vysokou selektivitou k MMP-2 substráty, které jsou obtížně hydrolyzovatelné enzymy ve vzorku, například enzymy jako jsou serinové proteinázy, peptidázy a esterázy, s výjimkou MPP-2 a snadno hydrolyzovatelné pomocí MMP-2 a substráty zahrnují například želatinu, kolagen nebo syntetické substráty s těmito charakteristickými strukturálními Částmi a výhodně tyto substráty zahrnují (7-methoxykumarin-4-yl)acetyl-Lproíyl-L-leucyl-g!ycyl-L-leucyl-L-(N-(2,4-dinitrofenyl)-L2,3-diaminopropionítril)-L-alanyl-L-arginin amid (MCA) nebo ethylester N-acetyl-L-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-leucylL-leucyl-glycinu.

Jako způsob pro analýzu aktivity enzymu MMP-2 mohou být přímo analyzovány hydrolyzáty substrátu pomocí MMP-2 a nebo může být aktivita enzymu určována nepřímo v kombinaci se systémem, který má schopnost specificky analyzovat kterýkoliv z hydrolyzátů s vysokou citlivostí.

Analýza (kvantitativní určování a pod.) prekurzoru MMP-2 může být prováděno degradací prekurzoru MMP-2 kteroukoli známou metodou (například působením trypsinem nebo 4aminofenylmerkuriacetátem (ΑΡΜΑ - 4-aminophenyl mercury acetate)), čímž se vytvoří MMP-2 a potom se analyzuje aktivita vytvořeného enzymu MMP-2.

Mohou být použity všechny metody, známé jako způsoby

-13« * • · · « 9 * ·*·«*· · · • · « · · · «» 9 9 9· 9 9♦· provádění imunoanalýzy. Mohu být použity všechny obecné imunoanalytické metody, používající pevné fáze, jako je sendvičový (enzymově spřažený) test, kompetitivní test a test inhibíce vazby. Specifické metody zahrnují způsoby používající testovací systémy, ve kterých substráty jsou imobilizovány na pevných nosičích s protilátkami, využívajíce vzájemné vazebné schopností enzymů a substrátů nebo způsoby které přímo detekují vazbu MMP-2 nebo jejího prekurzoru s imobilizovanými protilátkami povrchovým plasmonem (SPR) bez použití značkovaných protilátek. Tyto způsoby jsou podrobněji popsány ve zveřejněném japonském patentu č. 60-2187, v japonské patentové publikaci č. 734014 a ve zveřejněných japonských patentech ě. 6-2 1 3888 a 7-159402. Mohou také být navíc uvedeny způsoby užívající aglutinaění (shlukovací) reakce nebo neferomertie s použitím latexu a krevních buněk nebo způsoby používající „western“ přenos. Všechny tyto způsoby, založené na různých principech, mohu být použity ve způsobu podle vynálezu. Obecně je výhodná sendvičová metoda, používající protilátky imobilizované na nerozpustných nosičích a označené protilátky.

Protilátky, používané v imunologické analýze mohou být s uspokojivým výsledkem polyklonální protilátky nebo monoklonální protilátky. Jako zdroj protilátek může být použit libovolný zvířecí druh. Pokud jsou v sendvičovém testu používány dva druhy protilátek, je pro vytvoření sendvičového komplexu dostatečná kombinace • φ ·· «· φφ « φ * φ

-14'

imobilizovaných protilátek a označených protilátek a to jak v případě, že imobilizované protilátky a označené protilátky jsou protilátkami stejného druhu, tak i v případě, že imobilizované protilátky a označené protilátky jsou protilátkami různých druhů. Jako látky na označování protilátek mohou být použity radioaktivní látky, enzymy, fluorescenční látky a biotin.

Při provádění způsobu detekce chronického odmítání podle předloženého vynálezu mohou být změřené hodnoty MMP-2 nebo jejího prekurzoru (proteinová koncentrace nebo úroveň aktivity enzymu a podobně) nebo jejich přírůstek použity pro určení výskytu chronického odmítání per se, ale výpočtem jejich poměru k ostatním indikátorům, který určí jejich relativní hodnotu, je možné užít tuto relativní hodnotu jako index výskytu MMP-2 nebo jejího prekurzoru. Pokud je jako vzorek použita například moč, pak korekční metoda, založená na koncentraci kreatininu v moči (kdy je koncentrace MMP-2 nebo jejího prekurzoru dělena koncentrací kreatininu v moči) bude ilustrována dále. Pro provádění způsobu podle předloženého vynálezu je výhodně prahová hodnota nastavena v takovém rozmezí, aby alespoň 90 % nebo více pacientů s takřka normální funkcí orgánu po transplantaci orgánu bylo posuzováno jako normálních. Je také možné periodicky analyzovat NO3 nebo MMP-2 nebo její prekurzor u pacientů s transplantací orgánu a určovat začátek chronického odmítání orgánu na základě naměřených hodnot nebo vzrůstu indexu.

-15• ·* * »

Jak je ukázáno v následujících příkladech, při provádění způsobu podle předloženého vynálezu je také možno provádět detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti pásů, vzniklých v důsledku dekompozice substrátů jako je želatina pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu, který obsahuje substráty jako je želatina, přičemž není prováděna kvantifikace MMP-2 nebo jejího prekurzoru ve vzorcích.

Dále bude předložený vynález popsán podrobněji s odvoláním na následující příklady, aniž by přitom rozsah předmětu vynálezu byl omezen na tyto příklady.

Příklad 1

Ve vzorcích séra pacientů, kteří byli pomocí ledvinové biopsie diagnostikováni jako trpící chronickým odmítáním po transplantaci ledvin (A), pacienti diagnostikovaní ledvinovou biopsií tak, že u nich nedochází k začátku chronického odmítání a podobně, jejichž renální funkce byly takřka normální (hodnoty kreatininu v séru velikosti 1,2 mg/dl nebo méně) (B) a normální subjekty (C), byla analyzována úroveň NO3 automatickým analyzátorem dusičnanové formy dusíku a dusitanové formy dusíku (TCINOXIOOO, Tokyo Chemical Industry, Co.). Bylo zjištěno, že koncentrace NO3 v séru u pacientů s diagnózou na chronické odmítání po transplantaci ledvin byla významně vyšší než koncentrace NO3 v séru pacientů s normální renální funkcí

-16• · po transplantaci ledvin a než koncentrace NO3 u normálních subjektů, jak je znázorněno v Tabulce 1. Je ukázáno, že množství NO3 v krvi slouží jako efektivní způsob určení chronického odmítání.

Tabulka 1

Koncentrace NO3 v séru (μΜ) u pacientů s transplantací ledvin a u normálních subjektů

V zorky	Počet vzorků (n)	Stř. hodnota ±st. odchylka	(rozmezí)
Sérum A (chronické odmítání)	1 5	238,2±1 33,3*	(74,3-536,5)
Sérum B (bez chronického odmítání)	24	35,8±2 1,6	(4,3-83,7)
Sérum C (normální subjekty)	7	3 I,6±15,0	(15,4-59,6)

* p < 0,01 pro porovnání s pacienty bez chronického odmítání nebo s normálními subjekty (T-test)

Příklad 2

Zymogram; biochemická detekce MMP-2

Do vzorku moči byl přidán stejný objem 0,5 M pufru Tris (pH 6,8), obsahujícího 8 % SDS a 40 % glycerolu, po čemž následovalo důkladné míchání. Poté byl připraven 8 % polyakrylamidový gel, obsahující 1 mg/ml želatiny a • «

výsledná směs na něm byla elektroforézována. Po provedení elektroforézy byl gel dvakrát promýván 10 mM pufru Tris (pH 8,0), který obsahoval 2,5 % Triton X-100 při třepání za teploty okolí po dobu 30 minut. Potom byl pufr nahrazen 50 mM pufru Tris (pH 8,0), který obsahoval 0,5 mM chloridu vápenatého a 10 μΜ chloridu zinečnatého s inkubací při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin. Gel byl barven 1% Coomassie modří R-250, 5 % kyselinou octovou a 10 % methanolu po 30 minut, poté následovalo odbarvení pomocí 5 % kyseliny octové a 10 % methanolu.

V místech, kde se nacházela želatina, rozložená enzymem MMP-2 byly pozorovány průhledné pásy na modrém pozadí.

Příklad 3

Ve vzorcích moči pacientů s historií ledvinové transplantace před jedním nebo více roky a s diagnózou na chronické odmítání, založené na renální biopsii a hodnotách kreatininu v séru (2,0 mg/dl a více) a u pacientů do jednoho roku po transplantaci ledviny a s diagnózou pomocí renální biopsie a podobně, ukazující, že nedochází k počátku chronického odmítání, jejichž renální funkce byly takřka normální (kontrolní skupina), byla analyzována aktivita MMP-2 pomocí způsobu popsaného v příkladu 2. Takto byla MMP-2 s molekulovou hmotností 70 kD detekována v 8 z 10 vzorků moči pacientů s chronickým odmítáním, ale MMP-2 byla • «

-18• »···** · · · ··· ·· v » · · · · · ·· ·· · «Φ·Φ «· ·· detekována v 1 ze 14 vzorků moči pacientů z kontrolní skupiny.

To indikuje, že přírůstek koncentrace MMP-2 slouží jako účinný způsob prokázání chronického odmítání.

Příklad 4

Analýza koncentrace prekurzoru MMP-2 v moči imunoanalýzou

Byla použita souprava pro testování sérové MMP-2 se dvěma druhy monoklonálních protilátek, rozpoznávajících molekulu prekurzoru MMP-2 v různých místech (pro detekci pro-MMP2 a komplexu pro-MMP-2 s TIMP-2, ale ne pro detekci MMP-2) (výrobce Fuji Pharmaceutical Industry, Co.). Vzhledem k tomu, že koncentrace pro-MMP-2 v moči je nižší než koncentrace pro-MMP-2 v séru, podmínky, použité pro provádění sérové analýzy byly modifikovány pro analýzu prekurzoru v moči. Konkrétně bylo 150 μΐ moči nebo standardního roztoku připojeného k soupravě umístěno do zkumavky, pak bylo přidáno 30 mM fosforečnanového fyziologického roztoku (pH 7,0), obsahujícího 1 % telecí sérový albumin a 10 mM EDTA a směs byla důkladně míchána a ke vzniklé směsi byly přidány kuličky s vázanými protilátkami a reakce byla ponechána probíhat za teploty okolí po dobu 2 hodin. Potom bylo reakční rozpouštědlo odstraněno odsáváním a bylo přidáno 300 μΐ roztoku “19• ·

označených protilátek ze soupravy a reakce probíhala po dobu jedné hodiny při teplotě okolí. Potom bylo reakční rozpouštědlo opět odstraněno odsáváním, kuličky byly přeneseny do další zkumavky, bylo přidáno 300 μΐ barvícího roztoku a reakce probíhala při teplotě okolí po dobu 30 minut. Přidáním 1 500 μΐ ukončovacího roztoku ze soupravy k výslednému reakcnímu roztoku byla reakce zastavena. Absorbance reakčního roztoku byla měřena při vlnové délce 492 nm s použitím destilované vody jako kontrolního vzorku a potom byla koncentrace pro-MMP-2 ve vzorku moči určena na základě kalibrační křivky, získané na základě absorbance standardního roztoku. Současně byla určena obvyklým způsobem koncentrace močového kreatininu, aby mohly být vypočteny koncentrace pro-MMP-2 v moči po korekci na základě kreatininu.

Příklad 5

Ve vzorcích moči od 8 pacientů s diagnózou chronického odmítání po transplantaci ledviny před jedním nebo více roky na základě ledvinové biopsie a koncentrací sérového kreatininu (skupina se začínajícím odmítáním) a 36 pacientů do jednoho roku po transplantaci ledvin a s diagnózou, že u nich nezačíná chronické odmítání na základě ledvinové biopsie a podobně a jejichž ledvinové funkce byly takřka normální (s hodnotami sérového kreatininu 1,5 mg/ml nebo méně) (kontrolní skupina), byly stanoveny způsobem podle « ·

-20··«· * * · · · » « » ·«· « * * 9 9 ··· ·· · »»«·»· · · «· ·« «· ···· ·· »· příkladu 4 koncentrace pro-MMP-2. Histogramy s kreatininovou korekcí a bez kreatininové korekce jsou ukázány na obr. 1 a obr. 2. Při nastavení prahové hodnoty na 1 ng/ml v případě bez kreatininové korekce bylo 92 % osob z kontrolní skupiny posuzováno jako normální, zatímco 100 % pacientů s diagnostikovaným chronickým odmítáním po transplantaci ledvin bylo posuzováno jako pozitivní. Při nastavení prahové hodnoty na 5 pg/g kreatininu v případě kreatininové korekce bylo 95 % osob z kontrolní skupiny posuzováno jako normální, zatímco 100 % pacientů s diagnostikovaným chronickým odmítáním po transplantaci ledvin bylo posuzováno jako pozitivní. Při nastavení prahové hodnoty na 1 μg/g kreatininu bylo stále ještě 89 % osob z kontrolní skupiny posuzováno jako negativní.

Příklad 6

Ve vzorcích moči dvou pacientů s transplantovanou ledvinou před začátkem chronického odmítání v důsledku transplantace ledviny a po začátku chronického odmítání byly určeny koncentrace pro-MMP-2 (hodnoty korigované na kreatinin) způsobem podle Příkladu 4. Výsledky jsou znázorněny v Tabulce 2. Koncentrace pro-MMP-2 velmi vzrostly po začátku chronického odmítání, což indikuje, že zvýšení koncentrace pro-MMP-2 umožňuje určit začátek chronického odmítání způsobeného transplantací ledviny.

-21« * • ·

Tabulka 2

	Před začátkem (pg/g kreatininu)	Po začátku (pg/g kreatininu)
Pacient 1	1,3	14,6
Pacient 2	0,6	29,4

Průmyslová využitelnost

Prováděním způsobu podle předloženého vynálezu může zjištění vzrůstu koncentrace NO3, MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách (jejich vzorcích), jako je sérum nebo moč, umožnit detekci chronického odmítání v jeho počátečním stadiu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob detekce začátku chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu vyznačující se tím, že se provádí analýza tělesných tekutin, odebraných z těla.
2. Způsob detekce chronického odmítání po transplantaci, vyznačující se tím, že se provádí detekce NO3, MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se detekuje NO3 v tělesných tekutinách.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se detekuje MMP-2 nebo její prekurzor v tělesných tekutinách.
5. Způsob podle některého z nároků 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že tělesná tekutina zahrnuje lidskou moč nebo krev.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se detekuje MMP-2 nebo její prekurzor ve vzorku moči.
7. Způsob některého z nároků 2, 3, 4, 5 nebo 6, • * • · vyznačující se tím, že transplantace orgánu je transplantace ledvin.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se prahová hodnota pro určování, zda dochází nebo nedochází k chronickému odmítání po transplantaci ledvin, nachází v rozmezí od 0,1 do 10,0 ng/ml koncentrace prekurzoru MMP2 ve vzorku moči.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se prahová hodnota nachází v rozmezí od 0,5 do 5 ng/ml.
10. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se analyzuje koncentrace prekurzoru MMP-2 a koncentrace kreatininu ve vzorku moči a prahová hodnota indexu po korekci na koncentraci kreatininu pro určování, zda dochází nebo nedochází k chronickému odmítání po transplantaci ledvin, se nachází v rozmezí od 0,1 do 20,0 pg/g kreatininu.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se prahová hodnota nachází v rozmezí od 0,5 do 10 pg/mg kreatininu.
12. Způsob některého z nároků 2 a 4 až 11, vyznačující se tím, ie se detekce provádí imunoanalýzou.

• · • ·

-24♦ · ··· ·
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že imunoanalýza je enzymová imunoanalýza.
14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že imunoanalýzaje sendvičová analýza.
15. Způsob analýzy MMP-2 nebo jejího prekurzoru v moči vyznačující se tím, že s provádí imunoanalýzou.
16. Souprava pro detekci začátku chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu zkoumáním tělesných tekutin, odebraných z těla.
17. Souprava pro detekci chronického odmítání po transplantaci orgánu analýzou trioxidu dusíku (NO3) nebo matrixové metaloproteinázy MMP-2 nebo jejího prekurzoru v tělesných tekutinách.
18. Souprava pro detekci chronického odmítání po transplantaci orgánu analýzou MMP-2 nebo jejího prekurzoru v moči nebo krvi.
19. Souprava podle nároku 18, vyznačující se tím, že se detekce provádí imunoanalýzou.
20. Způsob diagnostiky chronického odmítání v časném stadiu po transplantaci orgánu zkoumáním tělesných tekutin.