JPH1094400A - 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法 - Google Patents
臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法Info
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- JPH1094400A JPH1094400A JP17516597A JP17516597A JPH1094400A JP H1094400 A JPH1094400 A JP H1094400A JP 17516597 A JP17516597 A JP 17516597A JP 17516597 A JP17516597 A JP 17516597A JP H1094400 A JPH1094400 A JP H1094400A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】臓器移植後の慢性拒絶反応の早期発見を可能と
する簡便な検査方法を提供すること。 【解決手段】ヒトの尿等の検体中のマトリックスメタロ
プロテアーゼ−2(MMP−2)又はその前駆体を検出
することによって、腎移植等の臓器移植後の慢性拒絶反
応を検査する。
する簡便な検査方法を提供すること。 【解決手段】ヒトの尿等の検体中のマトリックスメタロ
プロテアーゼ−2(MMP−2)又はその前駆体を検出
することによって、腎移植等の臓器移植後の慢性拒絶反
応を検査する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、体液中のマトリッ
クスメタロプロテアーゼ−2(以下「MMP−2」とい
う)又はその前駆体を検出することにより、臓器移植後
の慢性期に出現する拒絶反応(慢性拒絶反応)を検査す
る方法、及び、尿中のMMP−2又はその前駆体の測定
方法に関する。
クスメタロプロテアーゼ−2(以下「MMP−2」とい
う)又はその前駆体を検出することにより、臓器移植後
の慢性期に出現する拒絶反応(慢性拒絶反応)を検査す
る方法、及び、尿中のMMP−2又はその前駆体の測定
方法に関する。
【0002】
【従来の技術】腎移植患者での慢性拒絶反応の診断にお
いては、一般に腎生検が行われている。しかし、定期的
な腎生検は患者に苦痛を与えると同時に腎機能低下をも
たらす可能性がある。さらに、慢性拒絶の進行は緩慢
で、自覚症状に乏しく、苦痛を伴う腎生検は多くの患者
に拒否される。
いては、一般に腎生検が行われている。しかし、定期的
な腎生検は患者に苦痛を与えると同時に腎機能低下をも
たらす可能性がある。さらに、慢性拒絶の進行は緩慢
で、自覚症状に乏しく、苦痛を伴う腎生検は多くの患者
に拒否される。
【0003】一方において、慢性拒絶反応により腎機能
が低下するため、慢性拒絶反応の進行の指標として腎機
能検査が行われている。この検査においては、糸球体の
異常を反映する「蛋白質透過性亢進の指標」として、尿
蛋白、尿中アルブミン、尿中トランスフェリンなどが、
又、「糸球体濾過値(GFR)低下の指標」として、血
中クレアチニン、血中尿素窒素(BUN)、血中β2−
ミクログロブリン、血中α1−ミクログロブリンなどが
測定されている。しかし、慢性拒絶反応の進行によるこ
れらの検査値の変化は緩慢であり、検査値の異常が確認
された時には慢性拒絶反応は末期症状を示している。今
まで、尿や血液中の内因性物質の濃度を測定することに
よって、慢性拒絶反応の早期発見を可能とする様な検査
方法は知られていない。現在、このように簡便な検査方
法がないために、自覚症状に乏しい慢性拒絶反応を呈し
た患者は適切な処置を施されることなく末期症状とな
り、腎機能を喪失する場合が多く見られる。
が低下するため、慢性拒絶反応の進行の指標として腎機
能検査が行われている。この検査においては、糸球体の
異常を反映する「蛋白質透過性亢進の指標」として、尿
蛋白、尿中アルブミン、尿中トランスフェリンなどが、
又、「糸球体濾過値(GFR)低下の指標」として、血
中クレアチニン、血中尿素窒素(BUN)、血中β2−
ミクログロブリン、血中α1−ミクログロブリンなどが
測定されている。しかし、慢性拒絶反応の進行によるこ
れらの検査値の変化は緩慢であり、検査値の異常が確認
された時には慢性拒絶反応は末期症状を示している。今
まで、尿や血液中の内因性物質の濃度を測定することに
よって、慢性拒絶反応の早期発見を可能とする様な検査
方法は知られていない。現在、このように簡便な検査方
法がないために、自覚症状に乏しい慢性拒絶反応を呈し
た患者は適切な処置を施されることなく末期症状とな
り、腎機能を喪失する場合が多く見られる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、臓器移植後
の慢性拒絶反応の早期発見を可能とする簡便な検査方法
を提供することを目的とする。
の慢性拒絶反応の早期発見を可能とする簡便な検査方法
を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】MMP−2は基底膜を構
成するコラーゲンを分解する酵素で、組織の修復や再生
時に働く。また、癌においては、癌細胞の基底膜への浸
潤時にコラーゲンを分解する酵素として働くと考えられ
ている。本発明者らは鋭意検討した結果、MMP−2又
はその前駆体は、健常人の尿、慢性拒絶反応を起こして
いない腎移植患者の尿等に漏れださないか、非常に微量
しか漏れ出さないが、慢性拒絶患者では、この尿等の体
液中のMMP−2又はその前駆体の量が著しく増大する
ことを見い出し、本発明に至った。
成するコラーゲンを分解する酵素で、組織の修復や再生
時に働く。また、癌においては、癌細胞の基底膜への浸
潤時にコラーゲンを分解する酵素として働くと考えられ
ている。本発明者らは鋭意検討した結果、MMP−2又
はその前駆体は、健常人の尿、慢性拒絶反応を起こして
いない腎移植患者の尿等に漏れださないか、非常に微量
しか漏れ出さないが、慢性拒絶患者では、この尿等の体
液中のMMP−2又はその前駆体の量が著しく増大する
ことを見い出し、本発明に至った。
【0006】即ち、本発明は、(1)体液中のMMP−
2又はその前駆体を検出することを特徴とする臓器移植
後の慢性拒絶反応の検査方法、(2)体液がヒトの尿又
は血液である上記(1)記載の検査方法、(3)尿検体
中のMMP−2又はその前駆体を検出することを特徴と
する上記(1)記載の検査方法、(4)臓器移植が腎移
植である上記(1)、(2)又は(3)記載の検査方
法、(5)尿検体中のMMP−2前駆体濃度として0.
1から10.0ng/mlの範囲の間に、腎移植慢性拒
絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する
上記(3)記載の検査方法、(6)カットオフ値を0.
5から5.0ng/mlの範囲の間に設定する上記
(5)記載の検査方法、(7)尿検体中のMMP−2前
駆体濃度およびクレアチニン濃度を測定し、クレアチニ
ン濃度で補正することにより得られるインデックスが、
0.1から20.0μg/g・クレアチニンの範囲の間
に、腎移植慢性拒絶反応の有無を判定するためのカット
オフ値を設定する上記(3)記載の検査方法、(8)カ
ットオフ値を0.5から10.0μg/g・クレアチニ
ンの範囲の間に設定する上記(7)記載の検査方法、
(9)検出が免疫測定法による検出である上記(1)〜
(8)のいずれかに記載の検査方法、(10)免疫測定
法が酵素免疫測定法である上記(9)記載の検査方法、
(11)免疫測定法がサンドイッチ法である上記(9)
又は(10)記載の検査方法、(12)尿中のMMP−
2又はその前駆体を免疫測定法で測定する尿中MMP−
2又はその前駆体の測定方法、に関する。
2又はその前駆体を検出することを特徴とする臓器移植
後の慢性拒絶反応の検査方法、(2)体液がヒトの尿又
は血液である上記(1)記載の検査方法、(3)尿検体
中のMMP−2又はその前駆体を検出することを特徴と
する上記(1)記載の検査方法、(4)臓器移植が腎移
植である上記(1)、(2)又は(3)記載の検査方
法、(5)尿検体中のMMP−2前駆体濃度として0.
1から10.0ng/mlの範囲の間に、腎移植慢性拒
絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する
上記(3)記載の検査方法、(6)カットオフ値を0.
5から5.0ng/mlの範囲の間に設定する上記
(5)記載の検査方法、(7)尿検体中のMMP−2前
駆体濃度およびクレアチニン濃度を測定し、クレアチニ
ン濃度で補正することにより得られるインデックスが、
0.1から20.0μg/g・クレアチニンの範囲の間
に、腎移植慢性拒絶反応の有無を判定するためのカット
オフ値を設定する上記(3)記載の検査方法、(8)カ
ットオフ値を0.5から10.0μg/g・クレアチニ
ンの範囲の間に設定する上記(7)記載の検査方法、
(9)検出が免疫測定法による検出である上記(1)〜
(8)のいずれかに記載の検査方法、(10)免疫測定
法が酵素免疫測定法である上記(9)記載の検査方法、
(11)免疫測定法がサンドイッチ法である上記(9)
又は(10)記載の検査方法、(12)尿中のMMP−
2又はその前駆体を免疫測定法で測定する尿中MMP−
2又はその前駆体の測定方法、に関する。
【0007】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
体液(検体)としては、例えば尿や、血清、血漿等の血
液等のヒト等の体液が挙げられる。尿検体としては、M
MP−2又はその前駆体が安定に保てるように採尿、ま
たは、採尿後保存されたもので有れば何であってもよ
く、また、採尿の時期と方法も、MMP−2又はその前
駆体の臨床的意義を損なわない範囲で有れば、特に制限
されることはなく、通常の方法で採尿されたもの又は保
存されたものは、いずれも使用できる。例えば、蓄尿時
の安定性を保つために抗菌剤等を添加した容器で採尿す
ることがあるが、添加した抗菌剤等が測定に干渉を及ぼ
さない限り、この様な検体も使用できる。また、臓器移
植としては、腎移植、肝移植、心移植、膵移植等が挙げ
られ特に限定されないが、腎移植の場合が特に好まし
い。MMP−2は、その前駆体であるプロMMP−2
(proMMP−2)として細胞外に放出され、細胞外
でMMP−2に変換される。本発明において、MMP−
2の前駆体とは、それが分解されることによりMMP−
2となりうるものを言い、具体的にはプロMMP−2を
意味する。このプロMMP−2は、TIMP(Tiss
ue inhibitor of metallopr
oteinase)−2、TIMP−1等のインヒビタ
ーと複合体を形成していてもよく、本発明における前駆
体には、複合体の形で存在するプロMMP−2も含ま
れ、プロMMP−2の存在様式は特に限定されない。
体液(検体)としては、例えば尿や、血清、血漿等の血
液等のヒト等の体液が挙げられる。尿検体としては、M
MP−2又はその前駆体が安定に保てるように採尿、ま
たは、採尿後保存されたもので有れば何であってもよ
く、また、採尿の時期と方法も、MMP−2又はその前
駆体の臨床的意義を損なわない範囲で有れば、特に制限
されることはなく、通常の方法で採尿されたもの又は保
存されたものは、いずれも使用できる。例えば、蓄尿時
の安定性を保つために抗菌剤等を添加した容器で採尿す
ることがあるが、添加した抗菌剤等が測定に干渉を及ぼ
さない限り、この様な検体も使用できる。また、臓器移
植としては、腎移植、肝移植、心移植、膵移植等が挙げ
られ特に限定されないが、腎移植の場合が特に好まし
い。MMP−2は、その前駆体であるプロMMP−2
(proMMP−2)として細胞外に放出され、細胞外
でMMP−2に変換される。本発明において、MMP−
2の前駆体とは、それが分解されることによりMMP−
2となりうるものを言い、具体的にはプロMMP−2を
意味する。このプロMMP−2は、TIMP(Tiss
ue inhibitor of metallopr
oteinase)−2、TIMP−1等のインヒビタ
ーと複合体を形成していてもよく、本発明における前駆
体には、複合体の形で存在するプロMMP−2も含ま
れ、プロMMP−2の存在様式は特に限定されない。
【0008】検体中のMMP−2又はその前駆体を検出
(定量等)する方法は公知であり、本発明におけるMM
P−2又はその前駆体の検出(定量等)も公知の方法に
従って行なうことができる。例えば、MMP−2又はそ
の前駆体に特異的な系でMMP−2又はその前駆体を測
定し、「蛋白質濃度」または「酵素活性値」等としてM
MP−2又はその前駆体の濃度等を求めることにより実
施することがでる。MMP−2又はその前駆体の濃度等
を求める場合、MMP−2又はその前駆体に特異的な方
法であれば、どの様な方法を用いてもよく、特に限定さ
れないが、簡便かつ高感度で、再現性のよい方法が好ま
しい。
(定量等)する方法は公知であり、本発明におけるMM
P−2又はその前駆体の検出(定量等)も公知の方法に
従って行なうことができる。例えば、MMP−2又はそ
の前駆体に特異的な系でMMP−2又はその前駆体を測
定し、「蛋白質濃度」または「酵素活性値」等としてM
MP−2又はその前駆体の濃度等を求めることにより実
施することがでる。MMP−2又はその前駆体の濃度等
を求める場合、MMP−2又はその前駆体に特異的な方
法であれば、どの様な方法を用いてもよく、特に限定さ
れないが、簡便かつ高感度で、再現性のよい方法が好ま
しい。
【0009】より具体的に示すと、「蛋白質濃度」を求
める方法としては、MMP−2又はその前駆体に特異性
を有する抗体を用いて免疫学的に測定する方法がある。
また、「酵素活性値」を求める方法としては、MMP−
2に特異性の高い基質を用いて、生化学的に測定する方
法がある。
める方法としては、MMP−2又はその前駆体に特異性
を有する抗体を用いて免疫学的に測定する方法がある。
また、「酵素活性値」を求める方法としては、MMP−
2に特異性の高い基質を用いて、生化学的に測定する方
法がある。
【0010】生化学的に酵素活性を測定する方法におい
て、MMP−2に選択性の高い基質としては検体中に存
在するMMP−2以外の酵素、例えば、セリンプロテア
ーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼなどの酵素類で加水
分解され難く、MMP−2で容易に加水分解される基
質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、またはこれらの特
徴的構造部分を有する合成基質が挙げられるが、好まし
い基質としては、(7−メトキシクマリン−4−イル)
アセチル−L−プロリル−L−ロイシル−グリシル−L
−ロイシル−L−〔N−(2,4−ジニトロフェニル)
−L−2,3−ジアミノプロピオニトリル〕−L−アラ
ニル−L−アルギニンアミド(MCA)又は、N−アセ
チル−L−プロリル−L−ロイシル−グリシル−L−ロ
イシル−L−ロイシル−グリシルエチルエステルなどが
挙げられる。
て、MMP−2に選択性の高い基質としては検体中に存
在するMMP−2以外の酵素、例えば、セリンプロテア
ーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼなどの酵素類で加水
分解され難く、MMP−2で容易に加水分解される基
質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、またはこれらの特
徴的構造部分を有する合成基質が挙げられるが、好まし
い基質としては、(7−メトキシクマリン−4−イル)
アセチル−L−プロリル−L−ロイシル−グリシル−L
−ロイシル−L−〔N−(2,4−ジニトロフェニル)
−L−2,3−ジアミノプロピオニトリル〕−L−アラ
ニル−L−アルギニンアミド(MCA)又は、N−アセ
チル−L−プロリル−L−ロイシル−グリシル−L−ロ
イシル−L−ロイシル−グリシルエチルエステルなどが
挙げられる。
【0011】MMP−2の酵素活性を測定する方法とし
ては、MMP−2による基質の水解産物を直接測定して
もよいが、該水解産物の何れかを高感度かつ特異的に検
出できる系と組み合わせて、間接的に測定してもよい。
この方法によるMMP−2前駆体の検出(定量等)は、
公知の方法(例えばトリプシン又は4−アミノフェニル
水銀酢酸(APMA)による処理)によりMMP−2前
駆体を分解してMMP−2を生成させ、生成したMMP
−2の酵素活性を測定することにより行うことが出来
る。
ては、MMP−2による基質の水解産物を直接測定して
もよいが、該水解産物の何れかを高感度かつ特異的に検
出できる系と組み合わせて、間接的に測定してもよい。
この方法によるMMP−2前駆体の検出(定量等)は、
公知の方法(例えばトリプシン又は4−アミノフェニル
水銀酢酸(APMA)による処理)によりMMP−2前
駆体を分解してMMP−2を生成させ、生成したMMP
−2の酵素活性を測定することにより行うことが出来
る。
【0012】免疫測定法としては公知のあらゆる方法が
使用できる。固相を用いる一般的な免疫測定法としては
サンドイッチ測定法、競合法や抑制法(binding
inhibition assay)が使用できる。
特殊な方法としては、酵素一基質の結合性を利用し、抗
体の代わりに基質を固相に固定して用いる測定系や、標
識抗体を使用せずに、固相化抗体へのMMP−2又はそ
の前駆体の結合を表面プラズモン(SPR)で直接検出
する方法などがある。具体的には特開昭60−2187
号公報、特公平7−34014号公報、特開平6−21
3888号公報、特開平7−159402号公報などに
開示されている。また、ラテックスや血球を用いた凝集
反応や比濁法、あるいはウエスタンブロット法での測定
もあげられる。これらの方法はその測定原理において相
違はあるが、いずれの方法でも測定できる。一般的には
不溶性担体に固定した抗体と標識抗体によるサンドイッ
チ測定法が好適である。免疫測定法に使用する抗体はポ
リクロナール抗体であってもモノクローナル抗体であっ
てもよい。抗体の由来する動物種も問わない。サンドイ
ッチ測定法の様に2種の抗体を使用する場合、固相化抗
体と標識抗体によってサンドイッチ複合体が形成される
組み合わせであれば、固相化抗体と標識抗体に同種の抗
体を使用しても、異種の抗体の組み合わせであってもよ
い。抗体に標識する物質としては放射性物質、酵素、蛍
光物質等やビオチンなどが使用できる。
使用できる。固相を用いる一般的な免疫測定法としては
サンドイッチ測定法、競合法や抑制法(binding
inhibition assay)が使用できる。
特殊な方法としては、酵素一基質の結合性を利用し、抗
体の代わりに基質を固相に固定して用いる測定系や、標
識抗体を使用せずに、固相化抗体へのMMP−2又はそ
の前駆体の結合を表面プラズモン(SPR)で直接検出
する方法などがある。具体的には特開昭60−2187
号公報、特公平7−34014号公報、特開平6−21
3888号公報、特開平7−159402号公報などに
開示されている。また、ラテックスや血球を用いた凝集
反応や比濁法、あるいはウエスタンブロット法での測定
もあげられる。これらの方法はその測定原理において相
違はあるが、いずれの方法でも測定できる。一般的には
不溶性担体に固定した抗体と標識抗体によるサンドイッ
チ測定法が好適である。免疫測定法に使用する抗体はポ
リクロナール抗体であってもモノクローナル抗体であっ
てもよい。抗体の由来する動物種も問わない。サンドイ
ッチ測定法の様に2種の抗体を使用する場合、固相化抗
体と標識抗体によってサンドイッチ複合体が形成される
組み合わせであれば、固相化抗体と標識抗体に同種の抗
体を使用しても、異種の抗体の組み合わせであってもよ
い。抗体に標識する物質としては放射性物質、酵素、蛍
光物質等やビオチンなどが使用できる。
【0013】慢性拒絶反応の検査方法では、MMP−2
又はその前駆体の測定値(「蛋白質濃度」や「酵素活性
値」等)自体又はその上昇の度合いを、直接、慢性拒絶
の判定に用いてもよいが、他のマーカーとの比を求めて
変化を強調し、MMP−2又はその前駆体とのインデッ
クスとして判定に用いてもよい。例えば、尿を検体とし
た場合、尿中のクレアチニン濃度で補正する方法(尿中
のMMP−2又はその前駆体の濃度を尿中のクレアチニ
ン濃度で除する方法)等が挙げられる。本発明の検査方
法を実施するにあたり、ほぼ正常な臓器機能を有する臓
器移植患者の少なくとも90%以上が正常と判断される
範囲にカットオフ値を設定し検査するのが好ましい。ま
た、臓器移植患者のMMP−2又はその前駆体を定期的
に測定し、測定値あるいはインデックスの上昇の度合い
から慢性拒絶反応の発症を判断することも可能である。
又はその前駆体の測定値(「蛋白質濃度」や「酵素活性
値」等)自体又はその上昇の度合いを、直接、慢性拒絶
の判定に用いてもよいが、他のマーカーとの比を求めて
変化を強調し、MMP−2又はその前駆体とのインデッ
クスとして判定に用いてもよい。例えば、尿を検体とし
た場合、尿中のクレアチニン濃度で補正する方法(尿中
のMMP−2又はその前駆体の濃度を尿中のクレアチニ
ン濃度で除する方法)等が挙げられる。本発明の検査方
法を実施するにあたり、ほぼ正常な臓器機能を有する臓
器移植患者の少なくとも90%以上が正常と判断される
範囲にカットオフ値を設定し検査するのが好ましい。ま
た、臓器移植患者のMMP−2又はその前駆体を定期的
に測定し、測定値あるいはインデックスの上昇の度合い
から慢性拒絶反応の発症を判断することも可能である。
【0014】又、本発明は、検体中のMMP−2又はそ
の前駆体を定量せずに、以下の実施例に示したように、
例えば、ゼラチン等の基質を含むポリアクリルアミドゲ
ル中で電気泳動を行ないゼラチン等の基質の分解による
バンドが生じるか否かをみることによる方法等の方法に
よっても行うことができる。
の前駆体を定量せずに、以下の実施例に示したように、
例えば、ゼラチン等の基質を含むポリアクリルアミドゲ
ル中で電気泳動を行ないゼラチン等の基質の分解による
バンドが生じるか否かをみることによる方法等の方法に
よっても行うことができる。
【0015】
【実施例】実施例によって、本発明を具体的に説明する
が、本発明がこれらの実施例のみに限定されるものでは
ない。
が、本発明がこれらの実施例のみに限定されるものでは
ない。
【0016】試験例1(ザイモグラム;生化学的なMM
P−2活性の検出) 尿検体に、等量の8%SDS、40%グリセロールを含
む0.5Mトリス緩衝液(pH6.8)を加え、よく混
合する。1mg/mlゼラチンを含む8%ポリアクリル
アミドゲルを作製後、上記混合物をポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動する。泳動終了後、ゲルを2.5%ト
ライトンX−100を含む10mMトリス緩衝液(pH
8.0)で、室温で30分2回振盪しながら洗う。次い
で、0.5mM塩化カルシウム、10μM塩化亜鉛を含
む50mMトリス緩衝液(pH8.0)に交換し、37
℃で16時間インキュベートする。ゲルを1%クマジー
ブルー R−250、5%酢酸、10%メタノールで3
0分間染色後、5%酢酸、10%メタノールで脱色し
た。ゼラチン分解酵素(MMP−2)の存在する場所に
一致して、青いバックグラウンドの中に透明なバンドが
見える。
P−2活性の検出) 尿検体に、等量の8%SDS、40%グリセロールを含
む0.5Mトリス緩衝液(pH6.8)を加え、よく混
合する。1mg/mlゼラチンを含む8%ポリアクリル
アミドゲルを作製後、上記混合物をポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動する。泳動終了後、ゲルを2.5%ト
ライトンX−100を含む10mMトリス緩衝液(pH
8.0)で、室温で30分2回振盪しながら洗う。次い
で、0.5mM塩化カルシウム、10μM塩化亜鉛を含
む50mMトリス緩衝液(pH8.0)に交換し、37
℃で16時間インキュベートする。ゲルを1%クマジー
ブルー R−250、5%酢酸、10%メタノールで3
0分間染色後、5%酢酸、10%メタノールで脱色し
た。ゼラチン分解酵素(MMP−2)の存在する場所に
一致して、青いバックグラウンドの中に透明なバンドが
見える。
【0017】実施例1 腎生検及び血清クレアチニン値(2.0mg/dl以
上)により慢性拒絶と診断された、1年以上前に腎移植
を受けた患者、血清クレアチニン値が1.5mg/dl
以下で、腎移植後1年以内の、腎生検等により慢性拒絶
を起こしていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者
(対照群)の尿を検体として、試験例1の方法でMMP
−2活性を検出した。その結果、慢性拒絶患者の尿検体
で10例中8例で分子量70kDのMMP−2が検出さ
れたのに対し、対照群の患者で検出されたのは14例中
1例であった。MMP−2の濃度の上昇が、慢性拒絶の
有効なマーカーとなっていることを示している。
上)により慢性拒絶と診断された、1年以上前に腎移植
を受けた患者、血清クレアチニン値が1.5mg/dl
以下で、腎移植後1年以内の、腎生検等により慢性拒絶
を起こしていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者
(対照群)の尿を検体として、試験例1の方法でMMP
−2活性を検出した。その結果、慢性拒絶患者の尿検体
で10例中8例で分子量70kDのMMP−2が検出さ
れたのに対し、対照群の患者で検出されたのは14例中
1例であった。MMP−2の濃度の上昇が、慢性拒絶の
有効なマーカーとなっていることを示している。
【0018】試験例2 免疫測定法による尿中のMMP
−2前駆体濃度の測定 MMP−2前駆体分子上の異なる部位を認識する2種の
モノクローナル抗体を用いた、血清を対象とする富士薬
品工業社製のMMP−2測定キット(proMMP−2
及びこれとTIMP−2との複合体を検出し、MMP−
2は検出されない。)を用いた。しかし、血清中に比べ
て尿中のMMP−2前駆体濃度が低いため、その操作条
件を変更して測定した。すなわち試験管に尿あるいはキ
ット添付の標準液を150μlとり1%牛血清アルブミ
ンと10mM EDTAを含む30mMリン酸生理食塩
水pH7.0を加えてよく混合した後、抗体結合ビーズ
を入れて、室温で2時間反応させた。反応液をアスピレ
ーターで吸引除去し、キット添付の標識抗体液を300
μl加えて、室温で1時間反応した。再び反応液をアス
ピレーターで吸引除去し、ビーズを別の試験管に移し、
キット添付の発色液を300μl加えて室温で30分間
反応した。キット添付の停止液1500μlを加えて、
反応を停止した。精製水を対照にして、反応液の波長4
92nmの吸光度を測定し、標準液から得られた吸光度
をもとに作成した検量線より、尿検体中のMMP−2前
駆体濃度を求めた。また、同時に尿中のクレアチニン濃
度を常法により測定し、クレアチニンで補正した尿中の
MMP−2前駆体濃度を算出した。
−2前駆体濃度の測定 MMP−2前駆体分子上の異なる部位を認識する2種の
モノクローナル抗体を用いた、血清を対象とする富士薬
品工業社製のMMP−2測定キット(proMMP−2
及びこれとTIMP−2との複合体を検出し、MMP−
2は検出されない。)を用いた。しかし、血清中に比べ
て尿中のMMP−2前駆体濃度が低いため、その操作条
件を変更して測定した。すなわち試験管に尿あるいはキ
ット添付の標準液を150μlとり1%牛血清アルブミ
ンと10mM EDTAを含む30mMリン酸生理食塩
水pH7.0を加えてよく混合した後、抗体結合ビーズ
を入れて、室温で2時間反応させた。反応液をアスピレ
ーターで吸引除去し、キット添付の標識抗体液を300
μl加えて、室温で1時間反応した。再び反応液をアス
ピレーターで吸引除去し、ビーズを別の試験管に移し、
キット添付の発色液を300μl加えて室温で30分間
反応した。キット添付の停止液1500μlを加えて、
反応を停止した。精製水を対照にして、反応液の波長4
92nmの吸光度を測定し、標準液から得られた吸光度
をもとに作成した検量線より、尿検体中のMMP−2前
駆体濃度を求めた。また、同時に尿中のクレアチニン濃
度を常法により測定し、クレアチニンで補正した尿中の
MMP−2前駆体濃度を算出した。
【0019】実施例2 腎生検及び血清クレアチニン値により慢性拒絶と診断さ
れた、1年以上前に腎移植を受けた患者8例(発症
群)、血清クレアチニン値が1.5mg/dl以下で、
腎移植後1年以内の、腎生検等により慢性拒絶を起こし
ていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者36例
(対照群)の尿を検体として、試験例2の方法でMMP
−2前駆体濃度を測定した。クレアチニン補正しない場
合と、した場合のヒストグラムを図1及び図2に示す。
クレアチニン補正をしない場合にカットオフ値を1μg
/mlとすると対照群の92%は陰性に判定され、腎移
植慢性拒絶と診断された患者は100%陽性と判定され
た。クレアチニン補正をした場合、カットオフ値を5μ
g/g・クレアチニンとすると対照群の95%は陰性に
なり、腎移植慢性拒絶と診断された患者は100%陽性
と判定された。また、カットオフ値を1μg/g・クレ
アチニンにしても対照群の89%は陰性に判定された。
れた、1年以上前に腎移植を受けた患者8例(発症
群)、血清クレアチニン値が1.5mg/dl以下で、
腎移植後1年以内の、腎生検等により慢性拒絶を起こし
ていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者36例
(対照群)の尿を検体として、試験例2の方法でMMP
−2前駆体濃度を測定した。クレアチニン補正しない場
合と、した場合のヒストグラムを図1及び図2に示す。
クレアチニン補正をしない場合にカットオフ値を1μg
/mlとすると対照群の92%は陰性に判定され、腎移
植慢性拒絶と診断された患者は100%陽性と判定され
た。クレアチニン補正をした場合、カットオフ値を5μ
g/g・クレアチニンとすると対照群の95%は陰性に
なり、腎移植慢性拒絶と診断された患者は100%陽性
と判定された。また、カットオフ値を1μg/g・クレ
アチニンにしても対照群の89%は陰性に判定された。
【0020】実施例3 2例の腎移植患者について腎移植慢性拒絶の発症前及び
発症後の尿を検体として、試験例2の方法でMMP−2
前駆体濃度(クレアチニン補正値)を測定した。結果を
表1に示す。MMP−2前駆体濃度は発症後大きく上昇
しており、MMP−2前駆体の濃度の上昇が、腎移植慢
性拒絶の発症を判定するのに役立つことを示している。
発症後の尿を検体として、試験例2の方法でMMP−2
前駆体濃度(クレアチニン補正値)を測定した。結果を
表1に示す。MMP−2前駆体濃度は発症後大きく上昇
しており、MMP−2前駆体の濃度の上昇が、腎移植慢
性拒絶の発症を判定するのに役立つことを示している。
【0021】
【表1】 ──────────────────────────────────── 発症前 発症後 (μg/g・クレアチニン) (μg/g・クレアチニン) ──────────────────────────────────── 患者1 1.3 14.6 患者2 0.6 29.4 ────────────────────────────────────
【0022】
【発明の効果】本発明の検査方法を実施することによ
り、尿等の検体中のMMP−2又はその前駆体の濃度の
上昇等から、慢性拒絶反応の早期発見が可能となる。
り、尿等の検体中のMMP−2又はその前駆体の濃度の
上昇等から、慢性拒絶反応の早期発見が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】腎移植患者の尿中MMP−2前駆体濃度のヒス
トグラム
トグラム
【図2】腎移植患者の尿中MMP−2前駆体濃度をクレ
アチニン濃度により補正した場合のヒストグラム
アチニン濃度により補正した場合のヒストグラム
Claims (12)
- 【請求項1】体液中のマトリックスメタロプロテアーゼ
(MMP)−2又はその前駆体を検出することを特徴と
する臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法。 - 【請求項2】体液がヒトの尿又は血液である請求項1記
載の検査方法。 - 【請求項3】尿検体中のMMP−2又はその前駆体を検
出することを特徴とする請求項1記載の検査方法。 - 【請求項4】臓器移植が腎移植である請求項1、2又は
3記載の検査方法。 - 【請求項5】尿検体中のMMP−2前駆体濃度として
0.1から10.0ng/mlの範囲の間に腎移植慢性
拒絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定す
る請求項3記載の検査方法。 - 【請求項6】カットオフ値を0.5から5.0ng/m
lの範囲の間に設定する請求項5記載の検査方法。 - 【請求項7】尿検体中のMMP−2前駆体濃度およびク
レアチニン濃度を測定し、クレアチニン濃度で補正する
ことにより得られるインデックスが、0.1から20.
0μg/g・クレアチニンの範囲の間に、腎移植慢性拒
絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する
請求項3記載の検査方法。 - 【請求項8】カットオフ値を0.5から10.0μg/
g・クレアチニンの範囲の間に設定する請求項7記載の
検査方法。 - 【請求項9】検出が免疫測定法による検出である請求項
1〜8のいずれかに記載の検査方法。 - 【請求項10】免疫測定法が酵素免疫測定法である請求
項9記載の検査方法。 - 【請求項11】免疫測定法がサンドイッチ法である請求
項9又は10記載の検査方法。 - 【請求項12】尿中のMMP−2又はその前駆体を免疫
測定法で測定する尿中MMP−2又はその前駆体の測定
方法。
Priority Applications (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17516597A JPH1094400A (ja) | 1996-08-01 | 1997-06-17 | 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法 |
EP97933064A EP0985932A4 (en) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | METHOD FOR DETECTING TRANSPLANT REJECTION AND DETECTING URINE COMPONENTS |
AU36358/97A AU726351C (en) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Method for testing chronic rejection after organ transplantation and method for assaying urine components |
RU99101832/14A RU2181887C2 (ru) | 1997-06-17 | 1997-07-29 | Способ определения хронического отторжения после пересадки почки |
CZ99322A CZ32299A3 (cs) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Způsob detekce chronického odmítání po transplantaci orgánu a způsob stanovení složek moči |
PL97331480A PL331480A1 (en) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Method of testing for chronic body organ transplant rejection and method of determining urine constituents |
US09/230,398 US6210912B1 (en) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Method for examining chronic rejection reactions following organ transplantation and method for determining urine components |
PCT/JP1997/002627 WO1998005970A1 (fr) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Procedes d'analyse des reactions de rejet chroniques consecutives aux transplantations d'organes et de detection de composants urinaires |
CN97196932A CN1226967A (zh) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | 器官移植后慢性排斥反应的检验方法以及尿液组分的测定方法 |
BR9710776A BR9710776A (pt) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Processo e kit para detectar o come-o da rejei-Æo cr{nica em um est gio prematuro apÄs o transplante de Ärgaos e processos para analisar a mmp-2 da urina ou o seu precursor e de diagnÄstico para diagnosticar a rejei-Æo crÄnica em um est gio prematuro apÄs o transplante de ÄrgÆos |
KR1019997000634A KR20000029575A (ko) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | 장기이식후의만성거부반응의검사방법및뇨중성분의측정방법 |
CA002261739A CA2261739A1 (en) | 1996-08-01 | 1997-07-29 | Method for examining chronic rejection reactions following organ transplantation and method for determining urine components |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8-218151 | 1996-08-01 | ||
JP21815196 | 1996-08-01 | ||
JP17516597A JPH1094400A (ja) | 1996-08-01 | 1997-06-17 | 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1094400A true JPH1094400A (ja) | 1998-04-14 |
Family
ID=26496516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17516597A Pending JPH1094400A (ja) | 1996-08-01 | 1997-06-17 | 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH1094400A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002060301A (ja) * | 2000-08-17 | 2002-02-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 臓器保存液 |
-
1997
- 1997-06-17 JP JP17516597A patent/JPH1094400A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002060301A (ja) * | 2000-08-17 | 2002-02-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 臓器保存液 |
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