JP3522764B2 - 遊離及び複合化トリプシノーゲン−２のアッセイ - Google Patents
遊離及び複合化トリプシノーゲン−２のアッセイInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は尿中の遊離トリプシノーゲン−２又は血清中
のアルファ−１−抗トリプシン（トリプシン−２−AA
T）とのその複合体のいづれかとしてのトリプシノーゲ
ン−２の測定のためのイムノアッセイを提供する。本発
明は更に、尿中の遊離トリプシノーゲン−２又は血清中
のトリプシン−２−AATのいずれかの測定による、膵臓
炎及びその他の膵臓障害を非膵臓系胃腸障害から判別す
るための方法に関連する。
のアルファ−１−抗トリプシン（トリプシン−２−AA
T）とのその複合体のいづれかとしてのトリプシノーゲ
ン−２の測定のためのイムノアッセイを提供する。本発
明は更に、尿中の遊離トリプシノーゲン−２又は血清中
のトリプシン−２−AATのいずれかの測定による、膵臓
炎及びその他の膵臓障害を非膵臓系胃腸障害から判別す
るための方法に関連する。
発明の背景
本発明の背景を明確にするために、そして特に、実施
に関する追加の詳細を供するために本明細書において利
用する公開物及びその他の資料は引用することで本明細
書に組入れる。
に関する追加の詳細を供するために本明細書において利
用する公開物及びその他の資料は引用することで本明細
書に組入れる。
トリプシノーゲンは膵臓の外分泌性細胞により分泌さ
れるセリンプロテアーゼである（Travis J and Roberts
R,Biochemistry 1969;8:2884−9;Mallory P and Travi
s J,Biochemistry 1973;12:2847−51）。トリプシノー
ゲン異性酵素の２種類の主要タイプ、即ち、カチオン性
トリプシノーゲンとも呼ばれているトリプシノーゲン−
１、及びトリプシノーゲン−２又はアニオン性トリプシ
ノーゲンが特性決定されている。トリプシノーゲンプロ
酵素は腸内でエンテロキナーゼによりトリプシンへと活
性化される。エンテロキナーゼはトリプシノーゲンのＮ
末端から活性化ペプチドを外す。トリプシノーゲンは高
度の配列同一性を示すが、それらは電気泳動又はイオン
交換クロマトグラフィーを利用することにより電荷相違
に基づいて分離される。膵臓及び膵液中のトリプシノー
ゲンの主要形態はトリプシノーゲン−１である（Guy CO
ら、Biochem Biophys Res Commun 1984;125:516−2
3）。健康な対象者の血清中ではトリプシノーゲン−１
も主要な形態であり、一方膵臓炎を有する患者において
は、トリプシノーゲンがより強く高揚する（Itkonen
ら、J Lab Clin Med 1990;115:712−８）。トリプシノ
ーゲンは一定の卵巣腫瘍においても認められ、それにお
いては、トリプシノーゲン−２が主要な形態である（Ko
ivunenら、Cancer Res 1990;50:2375−８）。アルファ
−１−抗トリプシンと複合したトリプシン−１（アルフ
ァ−１−抗トリプシンとも呼ばれる）は膵臓炎を有する
患者の血清の中で認められたが（Borgstrom A and Ohls
son K,Scand J Clin Lab Invest 1984;44:381−６）、
この複合体の測定が膵臓障害とその他の胃腸障害とを判
別するために有用であることは見い出されていない（Bo
rgstromら、Scand J Clin Lab Invest 1989;49:757−6
2）。
れるセリンプロテアーゼである（Travis J and Roberts
R,Biochemistry 1969;8:2884−9;Mallory P and Travi
s J,Biochemistry 1973;12:2847−51）。トリプシノー
ゲン異性酵素の２種類の主要タイプ、即ち、カチオン性
トリプシノーゲンとも呼ばれているトリプシノーゲン−
１、及びトリプシノーゲン−２又はアニオン性トリプシ
ノーゲンが特性決定されている。トリプシノーゲンプロ
酵素は腸内でエンテロキナーゼによりトリプシンへと活
性化される。エンテロキナーゼはトリプシノーゲンのＮ
末端から活性化ペプチドを外す。トリプシノーゲンは高
度の配列同一性を示すが、それらは電気泳動又はイオン
交換クロマトグラフィーを利用することにより電荷相違
に基づいて分離される。膵臓及び膵液中のトリプシノー
ゲンの主要形態はトリプシノーゲン−１である（Guy CO
ら、Biochem Biophys Res Commun 1984;125:516−2
3）。健康な対象者の血清中ではトリプシノーゲン−１
も主要な形態であり、一方膵臓炎を有する患者において
は、トリプシノーゲンがより強く高揚する（Itkonen
ら、J Lab Clin Med 1990;115:712−８）。トリプシノ
ーゲンは一定の卵巣腫瘍においても認められ、それにお
いては、トリプシノーゲン−２が主要な形態である（Ko
ivunenら、Cancer Res 1990;50:2375−８）。アルファ
−１−抗トリプシンと複合したトリプシン−１（アルフ
ァ−１−抗トリプシンとも呼ばれる）は膵臓炎を有する
患者の血清の中で認められたが（Borgstrom A and Ohls
son K,Scand J Clin Lab Invest 1984;44:381−６）、
この複合体の測定が膵臓障害とその他の胃腸障害とを判
別するために有用であることは見い出されていない（Bo
rgstromら、Scand J Clin Lab Invest 1989;49:757−6
2）。
トリプシノーゲン−１及び−２は免疫学的に近縁する
が（Kimlandら、Clin Chim Acta 1989;184:31−46;Itko
nenら、1990）、しかしモノクローナル抗体を利用する
ことにより（Itkonenら、1990）又はポリクローナル抗
血清を吸着させることにより（Kimlandら、1989）、各
トリプシノーゲン形態の特異的な測定を可能にする試薬
を得ることが可能である。
が（Kimlandら、Clin Chim Acta 1989;184:31−46;Itko
nenら、1990）、しかしモノクローナル抗体を利用する
ことにより（Itkonenら、1990）又はポリクローナル抗
血清を吸着させることにより（Kimlandら、1989）、各
トリプシノーゲン形態の特異的な測定を可能にする試薬
を得ることが可能である。
活性トリプシンが血流に到達すると、それは主要トリ
プシンインヒビターアルファ−２−マクログロブリン及
びアルファ−１−抗トリプシン（AAT）により失活す
る。AATは肝臓の中で合成される58キロダルトンのセリ
ンプロテアーゼインヒビターであり、そして血液中の主
要プロテアーゼインヒビターの一つである。トリプシン
−１とAATとの複合体が血清中で検出可能であるが（Bor
gstrom and Ohlsson,1984）、アルファ−２−マクログ
ロブリンとの複合体は抗体ベースアッセイでは測定でき
ない（Ohlsson K,Acta Gastroenterol Belg 1988;51:3
−12）。
プシンインヒビターアルファ−２−マクログロブリン及
びアルファ−１−抗トリプシン（AAT）により失活す
る。AATは肝臓の中で合成される58キロダルトンのセリ
ンプロテアーゼインヒビターであり、そして血液中の主
要プロテアーゼインヒビターの一つである。トリプシン
−１とAATとの複合体が血清中で検出可能であるが（Bor
gstrom and Ohlsson,1984）、アルファ−２−マクログ
ロブリンとの複合体は抗体ベースアッセイでは測定でき
ない（Ohlsson K,Acta Gastroenterol Belg 1988;51:3
−12）。
急性膵臓炎は迅速なる診断を必要とする重篤、且つ潜
在的に致死性の障害である。血清又は尿中のアミラーゼ
の測定がこの目的のために日常的に利用されているが、
これらの方法は特異性の欠如により妨げられ、そのこと
はその臨床的な価値を制約してしまう。それ故、その他
の膵臓マーカー、例えばプロテアーゼ及びリパーゼの利
用に対する関心が高まっている（Ogawaら、Nippon Geka
Gakkai Zasshi（日本外科学会雑誌）1985;86:1241−
４）。血清中のトリプシノーゲン−１及び−２の測定
（Itkonenら、1990）並びに尿中のトリプシノーゲン−
１の測定（Lake−Bukaarら、Lancet 1979;ii:878−80）
が膵臓障害の診断に利用されている。
在的に致死性の障害である。血清又は尿中のアミラーゼ
の測定がこの目的のために日常的に利用されているが、
これらの方法は特異性の欠如により妨げられ、そのこと
はその臨床的な価値を制約してしまう。それ故、その他
の膵臓マーカー、例えばプロテアーゼ及びリパーゼの利
用に対する関心が高まっている（Ogawaら、Nippon Geka
Gakkai Zasshi（日本外科学会雑誌）1985;86:1241−
４）。血清中のトリプシノーゲン−１及び−２の測定
（Itkonenら、1990）並びに尿中のトリプシノーゲン−
１の測定（Lake−Bukaarら、Lancet 1979;ii:878−80）
が膵臓障害の診断に利用されている。
本発明において、膵臓障害を有する患者は、血液中で
はアルファ−１−抗トリプシンと複合したトリプシノー
ゲン−２、そして尿中では遊離トリプシノーゲン−２の
非常に高揚した濃度を有することが示されている。従っ
て、この発見は膵臓の診断において非常に有用であるこ
とが証明された。
はアルファ−１−抗トリプシンと複合したトリプシノー
ゲン−２、そして尿中では遊離トリプシノーゲン−２の
非常に高揚した濃度を有することが示されている。従っ
て、この発見は膵臓の診断において非常に有用であるこ
とが証明された。
図面の簡単な説明
図１はゲル濾過による検量物質中のトリプシン−２−
アルファ−１−抗トリプシンの特性を示す。トリプシノ
ーゲン−２−免疫反応の溶出を対比のために示す。矢印
はIgG及びアルブミンについての溶出位置を示してい
る。
アルファ−１−抗トリプシンの特性を示す。トリプシノ
ーゲン−２−免疫反応の溶出を対比のために示す。矢印
はIgG及びアルブミンについての溶出位置を示してい
る。
図２は使用した検量物質によるトリプシン−２−アル
ファ−１−抗トリプシン複合体の免疫蛍光測定アッセイ
についての容量−応答曲線を示す。
ファ−１−抗トリプシン複合体の免疫蛍光測定アッセイ
についての容量−応答曲線を示す。
図3Aは、120人の健康体コントロール、肝臓外胆管閉
塞を有する11人の患者、膵臓外起源の急性腹部障害を有
する34人の患者及び急性膵臓炎を有する29人の患者由来
の血清サンプル中のトリプシノーゲン−２の濃度を示
す。水平点線は上限対照限界を示す。
塞を有する11人の患者、膵臓外起源の急性腹部障害を有
する34人の患者及び急性膵臓炎を有する29人の患者由来
の血清サンプル中のトリプシノーゲン−２の濃度を示
す。水平点線は上限対照限界を示す。
図3Bは図3Aと同じ患者におけるトリプシン−２−アル
ファ−１−抗トリプシン複合体及び血清アミラーゼの濃
度を示す。
ファ−１−抗トリプシン複合体及び血清アミラーゼの濃
度を示す。
図４は急性膵臓炎を有する29人の患者由来の血清中の
トリプシン−２−AAT、トリプシノーゲン−２及びアミ
ラーゼの受容者作用特性（Receiver Operating Charate
ristic）（ROC）プロットを示す。膵臓外起源の腹部障
害を有する患者をコントロールグループとして利用し
た。一定のカットオフ点についての値を表示する。この
図はトリプシン−２−AATが膵臓炎と非膵臓系急性腹部
障害との間での最良の判別能力をもつことを示した。
トリプシン−２−AAT、トリプシノーゲン−２及びアミ
ラーゼの受容者作用特性（Receiver Operating Charate
ristic）（ROC）プロットを示す。膵臓外起源の腹部障
害を有する患者をコントロールグループとして利用し
た。一定のカットオフ点についての値を表示する。この
図はトリプシン−２−AATが膵臓炎と非膵臓系急性腹部
障害との間での最良の判別能力をもつことを示した。
図５は膵臓外起源の急性腹部障害を有する46人の患者
及び急性膵臓炎を有する22人の患者由来の尿サンプル中
のトリプシノーゲン−２及びアミラーゼの濃度を示す。
この図は尿中のトリプシノーゲン−２が最良の診断精度
をもつことを示す。
及び急性膵臓炎を有する22人の患者由来の尿サンプル中
のトリプシノーゲン−２及びアミラーゼの濃度を示す。
この図は尿中のトリプシノーゲン−２が最良の診断精度
をもつことを示す。
図6A〜図6Dは軽度の膵臓炎（Ｉ）を有する及び重度の
膵臓炎（II）を有する患者由来の尿及び血清サンプル中
のトリプシノーゲン−２及びアミラーゼの濃度を示す。
膵臓外起源の急性腹部障害を有する患者はコントロール
を担う（AC）。HC＝健康体コントロール。水性点線は上
限対照限界を示す。
膵臓炎（II）を有する患者由来の尿及び血清サンプル中
のトリプシノーゲン−２及びアミラーゼの濃度を示す。
膵臓外起源の急性腹部障害を有する患者はコントロール
を担う（AC）。HC＝健康体コントロール。水性点線は上
限対照限界を示す。
図7A〜7Dは急性膵臓炎と膵臓外胃腸障害との（図7A）
及び重度と軽度の急性膵臓炎（図7B）との判別における
様々な試験の精度を示すROCプロットを示す。
及び重度と軽度の急性膵臓炎（図7B）との判別における
様々な試験の精度を示すROCプロットを示す。
発明の詳細な説明
本発明の特徴は請求項１及び10〜13に示す。
本発明はサンプル中の分析物の量を測定するというト
リプシノーゲン−２に関するイムノアッセイに関連し、
この分析物は血清中のアルファ−１−抗トリプシンと複
合したトリプシン−２又は尿中のトリプシノーゲン−２
のいづれかである。
リプシノーゲン−２に関するイムノアッセイに関連し、
この分析物は血清中のアルファ−１−抗トリプシンと複
合したトリプシン−２又は尿中のトリプシノーゲン−２
のいづれかである。
競合及び非競合アッセイ法が採用できる。好適な態様
に従うと、トリプシン−２−AAT複合体又は遊離トリプ
シノーゲン−２は少なくとも２種類の抗体を使用する非
競合法により測定され、ここで捕獲抗体は固相に結合し
ている。
に従うと、トリプシン−２−AAT複合体又は遊離トリプ
シノーゲン−２は少なくとも２種類の抗体を使用する非
競合法により測定され、ここで捕獲抗体は固相に結合し
ている。
適当なラベルは、例えば酵素、放射性同位元素、蛍光
体、フォスフォレセンス又はルミネッセンスマーカー、
及び肉眼で検出可能な有色粒子である。「ラベル」なる
語は上記のマーカーに結合できる結合部位を包括するも
のと解されるであろう。
体、フォスフォレセンス又はルミネッセンスマーカー、
及び肉眼で検出可能な有色粒子である。「ラベル」なる
語は上記のマーカーに結合できる結合部位を包括するも
のと解されるであろう。
本発明は更に実質的に精製されたトリプシン−２−AA
T複合体及び尿に由来する実質的に精製されたトリプシ
ノーゲン−２の調製品に関する。
T複合体及び尿に由来する実質的に精製されたトリプシ
ノーゲン−２の調製品に関する。
更に、本発明は、血清中のトリプシン−２−AATの濃
度又は尿中のトリプシノーゲン−２の濃度の測定に基づ
く、膵臓炎及びその他の膵臓障害を、非膵臓障害から判
別するための方法に関する。
度又は尿中のトリプシノーゲン−２の濃度の測定に基づ
く、膵臓炎及びその他の膵臓障害を、非膵臓障害から判
別するための方法に関する。
本発明は以下の非限定例により明らかとなるであろ
う。
う。
実施例に利用した材料を以下に紹介する：
1. モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を標準の手順によりマウスにおい
て作った。トリプシノーゲン−２に対する抗体の特異性
を文献（Koivunenら、1990）に記載のイオン交換クロマ
トグラフィーにより分離したトリプシノーゲン−１及び
−２を利用して分析した（Itkonenら、1990）。
て作った。トリプシノーゲン−２に対する抗体の特異性
を文献（Koivunenら、1990）に記載のイオン交換クロマ
トグラフィーにより分離したトリプシノーゲン−１及び
−２を利用して分析した（Itkonenら、1990）。
2. 試薬及びバッファー
AATに対するポリクローナル抗血清をDako（Glostrup,
Denmark）から獲得した。免疫蛍光測定アッセイ（IFM
A）のアッセイバッファーは１リットル当り5gの牛血清
アルブミン、0.15gの牛グロブリン及び0.5gのNaN3を含
む9g/のNaClを有する50mMのトリス−HCl,pH7.7（TB
S）とした。洗浄溶液にはリットル当り9gのNaCl,0.5gの
NaN3及び0.2gのTween 20を含ませた。増強溶液はWallac
Biochemical Laboratories（Turku,Finland）に由来し
た。
Denmark）から獲得した。免疫蛍光測定アッセイ（IFM
A）のアッセイバッファーは１リットル当り5gの牛血清
アルブミン、0.15gの牛グロブリン及び0.5gのNaN3を含
む9g/のNaClを有する50mMのトリス−HCl,pH7.7（TB
S）とした。洗浄溶液にはリットル当り9gのNaCl,0.5gの
NaN3及び0.2gのTween 20を含ませた。増強溶液はWallac
Biochemical Laboratories（Turku,Finland）に由来し
た。
3. サンプル
血清サンプルを急性膵臓炎を有する29人の患者、肝臓
外胆管閉塞を有する11人の患者及び膵臓外起源の急性腹
部障害を有する34人の患者から獲得した。サンプルは、
認定の24時間以内、且つ治療開始前に採取した。急性膵
臓炎の診断は臨床及び実験的発見（血清及び尿アミラー
ゼ並びにCRP）、ランソン基準（Ransonら、Surg Gyneco
l Obster 1974;139:69−80）に基づく。診断は膵臓のコ
ントラストコンピューター連動断層撮影により確認し
た。肝臓外胆管閉塞及びその他の膵臓外起源の急性腹部
障害の診断は通常の臨床方法に基づく（臨床、実験室、
超音波測定及び放射性検査、又は外科的発見）、胃及び
十二指腸潰瘍、並びに食道炎及び胃炎は内視鏡により診
断される。フィンニッシュ・レッド・クロス・ブラッド
・バンクから獲得した120人の血液ドナー由来の血清サ
ンプルを対照値を樹立するために利用した。サンプルは
全てアッセイするまで−20℃で保存した。
外胆管閉塞を有する11人の患者及び膵臓外起源の急性腹
部障害を有する34人の患者から獲得した。サンプルは、
認定の24時間以内、且つ治療開始前に採取した。急性膵
臓炎の診断は臨床及び実験的発見（血清及び尿アミラー
ゼ並びにCRP）、ランソン基準（Ransonら、Surg Gyneco
l Obster 1974;139:69−80）に基づく。診断は膵臓のコ
ントラストコンピューター連動断層撮影により確認し
た。肝臓外胆管閉塞及びその他の膵臓外起源の急性腹部
障害の診断は通常の臨床方法に基づく（臨床、実験室、
超音波測定及び放射性検査、又は外科的発見）、胃及び
十二指腸潰瘍、並びに食道炎及び胃炎は内視鏡により診
断される。フィンニッシュ・レッド・クロス・ブラッド
・バンクから獲得した120人の血液ドナー由来の血清サ
ンプルを対照値を樹立するために利用した。サンプルは
全てアッセイするまで−20℃で保存した。
4. ゲル濾過
トリプシン−２−ATT検量物質の分画をSuperdex 200 HR
10/30の１×30cmのカラム（Pharmacia,Sweden）及び溶
出用のTBSバッファーを利用するゲル濾過により実施し
た。流速は30ml/hとし、そして0.5mlの容量の画分を集
めた。チューブをタンパク質分解及びチューブへの非特
異的吸着を防ぐためにアプロチニン（1.0mg/）含有の
50μのアッセイバッファーで事前充填しておいた。Ig
G（150kD）及びアルブミン（69kD）の溶出容量をカラム
の大まかな検量のために用いた。
10/30の１×30cmのカラム（Pharmacia,Sweden）及び溶
出用のTBSバッファーを利用するゲル濾過により実施し
た。流速は30ml/hとし、そして0.5mlの容量の画分を集
めた。チューブをタンパク質分解及びチューブへの非特
異的吸着を防ぐためにアプロチニン（1.0mg/）含有の
50μのアッセイバッファーで事前充填しておいた。Ig
G（150kD）及びアルブミン（69kD）の溶出容量をカラム
の大まかな検量のために用いた。
5. アミラーゼの測定
アミラーゼを自動分析器（Hitachi 705E）及びBoehri
nger Mannheim由来の試薬を利用して酵素比色試験によ
り測定した。この方法の対照値は血清で70〜300U/L、そ
して尿で60〜2000U/Lであった。
nger Mannheim由来の試薬を利用して酵素比色試験によ
り測定した。この方法の対照値は血清で70〜300U/L、そ
して尿で60〜2000U/Lであった。
実施例１
検量物質として利用するためのトリプシン−２−アルフ
ァ−１−抗トリプシン（トリプシン−２−AAT）の調製 トリプシン−２−AAT複合体に関する検量物質を純粋
ヒトAAT（Sigma Chemical Co.,St.Louis,USA）及び既述
の通りに（Itkonenら、1990）急性膵臓炎を有する患者
の尿から精製したトリプシン−２から調製した。トリプ
シノーゲン−２を37℃で2hかけて自己活性化させ、次い
で20℃で16h TBSバッファー中の７倍過剰量のAATとイン
キュベートした。このインキュベーション混合物をゲル
濾過により分離し、そして画分の中のトリプシノーゲン
−２及びトリプシン−２−AATの含有量をトリプシノー
ゲン−2 IFMAにより概算した（図１）。AATとのインキ
ュベーションは、アプロチニンとインキュベートしたコ
ントロール中の含有量の６％にまでトリプシノーゲン−
２成分を減少させた。トリプシノーゲン−2 IFMAとトリ
プシン−２−AATとの交差反応は3.3％であった（図
１）。これに基づき、トリプシン−２の94％がAATと複
合したと計算される。この調製品をトリプシン−２−AA
Tアッセイの検量のために用いた。検量物質は0.1,0.5,
1.0,10及び100μg/の濃度においてトリプシン−２−A
ATを含むように複合体をアッセイバッファーで希釈する
ことにより調製した。
ァ−１−抗トリプシン（トリプシン−２−AAT）の調製 トリプシン−２−AAT複合体に関する検量物質を純粋
ヒトAAT（Sigma Chemical Co.,St.Louis,USA）及び既述
の通りに（Itkonenら、1990）急性膵臓炎を有する患者
の尿から精製したトリプシン−２から調製した。トリプ
シノーゲン−２を37℃で2hかけて自己活性化させ、次い
で20℃で16h TBSバッファー中の７倍過剰量のAATとイン
キュベートした。このインキュベーション混合物をゲル
濾過により分離し、そして画分の中のトリプシノーゲン
−２及びトリプシン−２−AATの含有量をトリプシノー
ゲン−2 IFMAにより概算した（図１）。AATとのインキ
ュベーションは、アプロチニンとインキュベートしたコ
ントロール中の含有量の６％にまでトリプシノーゲン−
２成分を減少させた。トリプシノーゲン−2 IFMAとトリ
プシン−２−AATとの交差反応は3.3％であった（図
１）。これに基づき、トリプシン−２の94％がAATと複
合したと計算される。この調製品をトリプシン−２−AA
Tアッセイの検量のために用いた。検量物質は0.1,0.5,
1.0,10及び100μg/の濃度においてトリプシン−２−A
ATを含むように複合体をアッセイバッファーで希釈する
ことにより調製した。
実施例２
トリプシノーゲン−２及びトリプシン−２−AATの非競
合免疫蛍光測定アッセイ トリプシノーゲン−２を２種類のモノクローナル抗体
を利用する非競合式時間分解免疫蛍光測定アッセイによ
り測定した（Itkonenら、1990）。血清中の対照域は18
〜90μg/であった（中央値39μg/）。
合免疫蛍光測定アッセイ トリプシノーゲン−２を２種類のモノクローナル抗体
を利用する非競合式時間分解免疫蛍光測定アッセイによ
り測定した（Itkonenら、1990）。血清中の対照域は18
〜90μg/であった（中央値39μg/）。
トリプシン−２−AATのアッセイのため、遊離トリプ
シノーゲン−２及びトリプシン−２−AAT複合体の双方
に反応するトリプシン−２に対するモノクローナル捕獲
抗体（14F10）（Itkonenら、1990）をマイクロタイター
ウェル上にコーテイングした。ユーロピウムキレート
（Hemmilaら、Anal Biochem 1984;137:335−43）でラベ
ルしたAATに対するポリクローナルウサギ抗体（Dako,De
mmark）を検出抗体として用いた。25μのサンプル及
び200μのアッセイバッファーをコーテイングを施し
たウェルに分注した。１時間インキュベーション後、ウ
ェルを空にし、自動ワッシャー（DELFIA Platewash 129
6−024,Wallac,Turku,Finland）を利用して洗浄溶液で
２回洗った。200μのアッセイバッファー中の200ngの
トレーサー抗体を加え、そして１時間にわたる更なるイ
ンキュベーションの後、ウェルを空にし、そして４回洗
った。200μの増強溶液を加え、そして５分後、蛍光
を1234 DELFIA蛍光計（Wallac,Turku,Finland）で測定
した。トリプシン−２−AAT IFMAについての用量−応答
曲線を図２に示す。
シノーゲン−２及びトリプシン−２−AAT複合体の双方
に反応するトリプシン−２に対するモノクローナル捕獲
抗体（14F10）（Itkonenら、1990）をマイクロタイター
ウェル上にコーテイングした。ユーロピウムキレート
（Hemmilaら、Anal Biochem 1984;137:335−43）でラベ
ルしたAATに対するポリクローナルウサギ抗体（Dako,De
mmark）を検出抗体として用いた。25μのサンプル及
び200μのアッセイバッファーをコーテイングを施し
たウェルに分注した。１時間インキュベーション後、ウ
ェルを空にし、自動ワッシャー（DELFIA Platewash 129
6−024,Wallac,Turku,Finland）を利用して洗浄溶液で
２回洗った。200μのアッセイバッファー中の200ngの
トレーサー抗体を加え、そして１時間にわたる更なるイ
ンキュベーションの後、ウェルを空にし、そして４回洗
った。200μの増強溶液を加え、そして５分後、蛍光
を1234 DELFIA蛍光計（Wallac,Turku,Finland）で測定
した。トリプシン−２−AAT IFMAについての用量−応答
曲線を図２に示す。
このアッセイの検出限界は0.05μg/であり、そして
標準曲線は100μg/まで直線性を有していた。120人の
血液ドナー由来の血清における2.5及び97.5パーセンタ
イルを基準として決定した対照域は2.3〜12μg/であ
り、そして中央値は4.2μg/であった。
標準曲線は100μg/まで直線性を有していた。120人の
血液ドナー由来の血清における2.5及び97.5パーセンタ
イルを基準として決定した対照域は2.3〜12μg/であ
り、そして中央値は4.2μg/であった。
膵臓炎の診断における血清中のトリプシン−２−AAT及
びトリプシノーゲン−２ 血清アッセイの臨床精度を、急性膵臓炎を有する患
者、肝臓外胆管閉塞を有する患者、及び膵臓外起源の急
性腹部障害を有する患者由来の血清サンプル中のトリプ
シン−２−AAT、トリプシノーゲン−２及びアミラーゼ
の濃度を決定することにより評価した。急性膵臓炎を有
する患者においては、トリプシン−２−AAT及びトリプ
シノーゲン−２のレベルは非常に高揚していた。トリプ
シン−２−AATの中央濃度は健康体コントロールの59倍
であった。健康体コントロールのそれよりも、トリプシ
ノーゲン−２のそれは19倍、そしてアミラーゼのそれは
5.4倍であった（表１）。
びトリプシノーゲン−２ 血清アッセイの臨床精度を、急性膵臓炎を有する患
者、肝臓外胆管閉塞を有する患者、及び膵臓外起源の急
性腹部障害を有する患者由来の血清サンプル中のトリプ
シン−２−AAT、トリプシノーゲン−２及びアミラーゼ
の濃度を決定することにより評価した。急性膵臓炎を有
する患者においては、トリプシン−２−AAT及びトリプ
シノーゲン−２のレベルは非常に高揚していた。トリプ
シン−２−AATの中央濃度は健康体コントロールの59倍
であった。健康体コントロールのそれよりも、トリプシ
ノーゲン−２のそれは19倍、そしてアミラーゼのそれは
5.4倍であった（表１）。
急性膵臓炎を有する患者と膵臓外障害を有する者との
間でトリプシン−２−AAT値の重なりはなかった。トリ
プシノーゲン−２については４人の患者（14％）におい
て重なりが認められ、そしてアミラーゼについては14人
の患者（48％）において重なりが認められた（図3A及び
3B）。
間でトリプシン−２−AAT値の重なりはなかった。トリ
プシノーゲン−２については４人の患者（14％）におい
て重なりが認められ、そしてアミラーゼについては14人
の患者（48％）において重なりが認められた（図3A及び
3B）。
膵臓炎と非膵臓障害とを判別する様々な分析物の能力
を受容者作用特性（ROC）分析により評価した。ROC曲線
下の面積はトリプシン−２−AATについては1.00、トリ
プシノーゲン−２については0.996、そしてアミラーゼ
については0.929であり、感度及び特異性がその他の測
定法よりも優れていることを示唆する（図４）。
を受容者作用特性（ROC）分析により評価した。ROC曲線
下の面積はトリプシン−２−AATについては1.00、トリ
プシノーゲン−２については0.996、そしてアミラーゼ
については0.929であり、感度及び特異性がその他の測
定法よりも優れていることを示唆する（図４）。
実施例３
ａ）尿からのトリプシノーゲン−２の精製
高濃度のトリプシノーゲン−２を含む１リットルの尿
を濾過して不溶性構成分を除去し、そして瀘液のpHを1m
ol/のNaOHで7.4に調整した。その瀘液を、トリプシノ
ーゲン−２に特異的な20mgのモノクローナル抗体を臭化
シアノゲン活性化Sepharose（Pharmacia,Uppsala,Swede
n由来）にカップリングさせることにより調製したイム
ノアフィニティークロマトグラフィーに通した。抗体の
特徴は記述の通りである（Itkonenら、1990）。カラム
を1mol/のNaClで洗浄後、それを0.1％のトリフルオロ
酢酸（TFA）により溶出させた。その溶出液を更に逆相
クロマトグラフィーにより、0.1％のTFAバッファー及び
アセトニトリル勾配による溶出を利用して精製した。画
分の含有量を280nmでの吸収に基づいてタンパク質につ
いてモニターした。得られる画分を1mol/のトリスバ
ッファーで直ちに中和した。画分中のトリプシノーゲン
−２の含有量はイムノアッセイにより決定した。この方
法により精製したトリプシノーゲン−２はドデシル硫酸
ナトリウム電気泳動での一本のバンドにより証明される
通り95％以上の純度であった。
を濾過して不溶性構成分を除去し、そして瀘液のpHを1m
ol/のNaOHで7.4に調整した。その瀘液を、トリプシノ
ーゲン−２に特異的な20mgのモノクローナル抗体を臭化
シアノゲン活性化Sepharose（Pharmacia,Uppsala,Swede
n由来）にカップリングさせることにより調製したイム
ノアフィニティークロマトグラフィーに通した。抗体の
特徴は記述の通りである（Itkonenら、1990）。カラム
を1mol/のNaClで洗浄後、それを0.1％のトリフルオロ
酢酸（TFA）により溶出させた。その溶出液を更に逆相
クロマトグラフィーにより、0.1％のTFAバッファー及び
アセトニトリル勾配による溶出を利用して精製した。画
分の含有量を280nmでの吸収に基づいてタンパク質につ
いてモニターした。得られる画分を1mol/のトリスバ
ッファーで直ちに中和した。画分中のトリプシノーゲン
−２の含有量はイムノアッセイにより決定した。この方
法により精製したトリプシノーゲン−２はドデシル硫酸
ナトリウム電気泳動での一本のバンドにより証明される
通り95％以上の純度であった。
ｂ）膵臓炎の診断における尿中のトリプシノーゲン−２
トリプシノーゲン−２についての尿アッセイの臨床精
度は急性膵臓炎を有する22人の患者及び膵臓外起源の急
性腹部障害を有する46人の患者由来の尿サンプル中の濃
度を測定することにより評価した。急性膵臓炎を有する
患者において、その中央濃度は急性腹部障害を有する患
者のそれの4000倍であった。アミラーゼについての対応
の差は４倍にすぎなかった（表２）。
度は急性膵臓炎を有する22人の患者及び膵臓外起源の急
性腹部障害を有する46人の患者由来の尿サンプル中の濃
度を測定することにより評価した。急性膵臓炎を有する
患者において、その中央濃度は急性腹部障害を有する患
者のそれの4000倍であった。アミラーゼについての対応
の差は４倍にすぎなかった（表２）。
急性膵臓炎を有する患者と膵臓外起源の腹部障害を有
するコントロールグループとの間でトリプシノーゲン−
２値の重なりはなかった。アミラーゼについては、膵臓
炎を有する４人の患者のみがコントロールグループにお
いて観察された最も高い値よりも高い値を有していた
（図５）。
するコントロールグループとの間でトリプシノーゲン−
２値の重なりはなかった。アミラーゼについては、膵臓
炎を有する４人の患者のみがコントロールグループにお
いて観察された最も高い値よりも高い値を有していた
（図５）。
実施例４
血清トリプシノーゲン−２及び血清又は尿中のアミラー
ゼと対比させた急性膵臓炎マーカーとしての尿トリプシ
ノーゲン−２ 早期診断及び急性膵臓炎（AP）の症度の評価における
尿トリプシノーゲン−２の測定の臨床的用途を研究し
た。対照方法として血清トリプシノーゲン−２、尿アミ
ラーゼ及び血清アミラーゼを利用した。APと診断された
全部で59人の患者及び膵臓外起源の急性上腹部障害を有
する42人のコントロール（AC）をヘルシンキ大学中央病
院で研究した。APを有する患者はその臨床結果に応じて
２つのグループに分類した：軽度AP（グループＩ、40人
の患者）及び重度AP（グループII、19人の患者）。急性
腹部障害の徴候のない患者由来の尿サンプルを健康体コ
ントロール（HC）として利用した。アミラーゼ及びトリ
プシノーゲンを前述の方法に従って決定した。
ゼと対比させた急性膵臓炎マーカーとしての尿トリプシ
ノーゲン−２ 早期診断及び急性膵臓炎（AP）の症度の評価における
尿トリプシノーゲン−２の測定の臨床的用途を研究し
た。対照方法として血清トリプシノーゲン−２、尿アミ
ラーゼ及び血清アミラーゼを利用した。APと診断された
全部で59人の患者及び膵臓外起源の急性上腹部障害を有
する42人のコントロール（AC）をヘルシンキ大学中央病
院で研究した。APを有する患者はその臨床結果に応じて
２つのグループに分類した：軽度AP（グループＩ、40人
の患者）及び重度AP（グループII、19人の患者）。急性
腹部障害の徴候のない患者由来の尿サンプルを健康体コ
ントロール（HC）として利用した。アミラーゼ及びトリ
プシノーゲンを前述の方法に従って決定した。
急性膵臓炎（AP）の症例は全員が表示において高いト
リプシノーゲン−２の尿濃度を有し、そして上限対照値
を下まわる濃度は診断ではなかった。一方、膵臓炎を有
する17人（28％）の患者が正常な尿中アミラーゼレベル
を有していた。急性膵臓炎における最低のトリプシノー
ゲン−２値（15μg/）は健康体コントロールの上限対
照値の1.4倍であった。APを有する患者の尿トリプシノ
ーゲン−２の中央濃度は上限対照限界の102倍であっ
た。対比のため、尿アミラーゼのレベルはわずか2.0倍
であり、そして血清アミラーゼのそれは上限対照限界の
3.4倍であった。
リプシノーゲン−２の尿濃度を有し、そして上限対照値
を下まわる濃度は診断ではなかった。一方、膵臓炎を有
する17人（28％）の患者が正常な尿中アミラーゼレベル
を有していた。急性膵臓炎における最低のトリプシノー
ゲン−２値（15μg/）は健康体コントロールの上限対
照値の1.4倍であった。APを有する患者の尿トリプシノ
ーゲン−２の中央濃度は上限対照限界の102倍であっ
た。対比のため、尿アミラーゼのレベルはわずか2.0倍
であり、そして血清アミラーゼのそれは上限対照限界の
3.4倍であった。
受容者作用特性分析（ROC）を、急性膵臓炎を有する
患者（AP）と急性腹部膵臓外障害を有するコントロール
（AC）とを比較するために用いた。AUC（曲線下面積）
は尿中のトリプシノーゲン−２については0.980、そし
て尿中のアミラーゼについては0.842であった。尿中の
トリプシノーゲン−２は血清中のトリプシノーゲン−２
（AUC＝0.998）及び血清アミラーゼ（AUC＝0.965）と同
じくらいに良好な精度を有していた（図7A参照）。
患者（AP）と急性腹部膵臓外障害を有するコントロール
（AC）とを比較するために用いた。AUC（曲線下面積）
は尿中のトリプシノーゲン−２については0.980、そし
て尿中のアミラーゼについては0.842であった。尿中の
トリプシノーゲン−２は血清中のトリプシノーゲン−２
（AUC＝0.998）及び血清アミラーゼ（AUC＝0.965）と同
じくらいに良好な精度を有していた（図7A参照）。
ROC分析は、尿トリプシノーゲン−２が、重度を軽度A
Pから判別するうえで試験したマーカーのうちで最も高
い精度を有することを示し（AUC＝0741、図7B）、そし
てそれはこの観点において血清トリプシノーゲン−２よ
りも若干良かった。アミラーゼは重度を軽度APから判別
する能力に劣り、そして尿アミラーゼのレベルは重度な
障害の方が軽度な障害よりも事実上低かった（図6C）。
Pから判別するうえで試験したマーカーのうちで最も高
い精度を有することを示し（AUC＝0741、図7B）、そし
てそれはこの観点において血清トリプシノーゲン−２よ
りも若干良かった。アミラーゼは重度を軽度APから判別
する能力に劣り、そして尿アミラーゼのレベルは重度な
障害の方が軽度な障害よりも事実上低かった（図6C）。
これらの結果は、尿中のトリプシノーゲン−２が急性
膵臓炎についての高い精度を有するマーカーであること
を示す。急性膵臓炎を有する患者は全員高い値を有し、
そしてその他の胃腸障害を有する患者のトリプシノーゲ
ン−２についての偽陽性結果の数は尿アミラーゼについ
てよりも少なかった。更に、トリプシノーゲン−２のレ
ベルは障害の症度を反映し、一方アミラーゼレベルは反
映しない。従って、トリプシノーゲン−２は急性膵臓炎
の診断においてその他の尿検査よりも明らかに優れ、そ
してトリプシノーゲン−２についての血清検査に関して
は同等である。
膵臓炎についての高い精度を有するマーカーであること
を示す。急性膵臓炎を有する患者は全員高い値を有し、
そしてその他の胃腸障害を有する患者のトリプシノーゲ
ン−２についての偽陽性結果の数は尿アミラーゼについ
てよりも少なかった。更に、トリプシノーゲン−２のレ
ベルは障害の症度を反映し、一方アミラーゼレベルは反
映しない。従って、トリプシノーゲン−２は急性膵臓炎
の診断においてその他の尿検査よりも明らかに優れ、そ
してトリプシノーゲン−２についての血清検査に関して
は同等である。
表示のデーターから血清中のトリプシン−２−AAT又
は尿中のトリプシノーゲン−２の測定は、血清中のトリ
プシノーゲン−２もしくはアミラーゼ又は尿中のアミラ
ーゼの如き現在利用されている方法よりも優れた臨床精
度を提供することが明らかである。
は尿中のトリプシノーゲン−２の測定は、血清中のトリ
プシノーゲン−２もしくはアミラーゼ又は尿中のアミラ
ーゼの如き現在利用されている方法よりも優れた臨床精
度を提供することが明らかである。
本発明の方法は、様々な態様の形態で組込まれること
ができ、その一部しか本明細書において開示されていな
いことが明らかであろう。その他の態様もあり、そして
本発明の範囲を逸脱しないことが当業者に自明であろ
う。即ち、記載の態様は例示であり、そして限定するも
のと解すべきでない。
ができ、その一部しか本明細書において開示されていな
いことが明らかであろう。その他の態様もあり、そして
本発明の範囲を逸脱しないことが当業者に自明であろ
う。即ち、記載の態様は例示であり、そして限定するも
のと解すべきでない。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭57−551（ＪＰ，Ａ)
特開 昭57−94660（ＪＰ，Ａ)
Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，1990
年，Ｖｏｌ．115，Ｎｏ．６，ｐ712−
718
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓ
ｅｙｅｒ，1989年，Ｖｏｌ．370，ｐ
1163−1171
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕ
ｔｒ，1990年，Ｖｏｌ．９，Ｐ39−50
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕ
ｔｒ．，1990年，Ｖｏｌ．９，ｐ25−37
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ.
Ｉｎｖｅｓｔ．，1984年，Ｖｏｌ．44,
ｐ381−386
Ｅｎｚｙｍｅ，1987年，Ｖｏｌ．37,
ｐ174−181
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53 - 33/577
Claims (9)
- 【請求項１】サンプルの分析物の濃度の測定のためのイ
ムノアッセイを利用することにより膵臓炎を含む膵臓障
害を他の非膵臓障害から判別するための検査方法であっ
て、当該分析物が ｉ）血清中のアルファ−１−抗トリプシンと複合したト
リプシン−２（トリプシン−２−AAT）又は ii）尿中のトリプシノーゲン−２、 のいずれかであることを特徴とする、方法。 - 【請求項２】前記分析物を含んで成るサンプルを前記分
析物に対する特異性を有する捕獲抗体とインキュベート
することを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記サンプルのインキュベーションを競合
ラベル化分析物の存在下で実施することを特徴とする、
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】前記分析物を、前記捕獲抗体とは異なる前
記分析物の部位に対する特異性を有するラベル化検出抗
体とインキュベートすることを特徴とする、請求項２記
載の方法。 - 【請求項５】前記捕獲抗体が固相に結合していることを
特徴とする、請求項２、３又は４記載の方法。 - 【請求項６】前記分析物がトリプシン−２−AATであ
り、前記捕獲抗体に結合したトリプシン−２−AAT複合
体を前記検出抗体とのインキュベーションの前に遊離AA
Tから分離させることを特徴とする、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】前記ラベルが酵素、放射性同位元素、蛍光
体、ホスホレッセンスもしくはルミネッセンスマーカ
ー、有色粒子、又は前記マーカーに結合できる結合性部
位であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項８】前記捕獲抗体がトリプシノーゲン−２又は
トリプシン−２に特異的であることを特徴とする、請求
項２〜７のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】前記検出抗体がAATに対して特異的である
ことを特徴とする、請求項６記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI943921 | 1994-08-26 | ||
| FI943921A FI100557B (fi) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | Vapaan trypsinogeeni-2:n määritys |
| PCT/FI1995/000453 WO1996007104A1 (en) | 1994-08-26 | 1995-08-24 | Assay of free and complexed trypsinogen-2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10504902A JPH10504902A (ja) | 1998-05-12 |
| JP3522764B2 true JP3522764B2 (ja) | 2004-04-26 |
Family
ID=8541252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50851296A Expired - Fee Related JP3522764B2 (ja) | 1994-08-26 | 1995-08-24 | 遊離及び複合化トリプシノーゲン−２のアッセイ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5976809A (ja) |
| EP (1) | EP0777860B1 (ja) |
| JP (1) | JP3522764B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69524107T2 (ja) |
| DK (1) | DK0777860T3 (ja) |
| ES (1) | ES2168378T3 (ja) |
| FI (1) | FI100557B (ja) |
| WO (1) | WO1996007104A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| AU2018240306A1 (en) * | 2017-03-22 | 2019-10-10 | Children's Medical Center Corporation | PRSS2 inhibition |
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|---|---|---|---|---|
| DE3016575A1 (de) * | 1980-04-30 | 1981-11-05 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung |
| DE3172143D1 (en) * | 1980-09-30 | 1985-10-10 | Cornell Res Foundation Inc | Process for determining inhibitor-enzyme complexes |
-
1994
- 1994-08-26 FI FI943921A patent/FI100557B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-08-24 DE DE69524107T patent/DE69524107T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-24 EP EP95929116A patent/EP0777860B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-24 AT AT95929116T patent/ATE209359T1/de active
- 1995-08-24 ES ES95929116T patent/ES2168378T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-24 US US08/793,534 patent/US5976809A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-24 JP JP50851296A patent/JP3522764B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-24 DK DK95929116T patent/DK0777860T3/da active
- 1995-08-24 WO PCT/FI1995/000453 patent/WO1996007104A1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｅｒ，１９８９年，Ｖｏｌ．３７０，ｐ１１６３−１１７１ |
| Ｅｎｚｙｍｅ，１９８７年，Ｖｏｌ．３７，ｐ１７４−１８１ |
| Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１９９０年，Ｖｏｌ．１１５，Ｎｏ．６，ｐ７１２−７１８ |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ，１９９０年，Ｖｏｌ．９，Ｐ３９−５０ |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，１９９０年，Ｖｏｌ．９，ｐ２５−３７ |
| Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８４年，Ｖｏｌ．４４，ｐ３８１−３８６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0777860A1 (en) | 1997-06-11 |
| DE69524107D1 (de) | 2002-01-03 |
| DE69524107T2 (de) | 2002-06-06 |
| ATE209359T1 (de) | 2001-12-15 |
| FI943921A (fi) | 1996-02-27 |
| DK0777860T3 (da) | 2002-05-21 |
| FI943921A0 (fi) | 1994-08-26 |
| FI100557B (fi) | 1997-12-31 |
| EP0777860B1 (en) | 2001-11-21 |
| ES2168378T3 (es) | 2002-06-16 |
| WO1996007104A1 (en) | 1996-03-07 |
| JPH10504902A (ja) | 1998-05-12 |
| US5976809A (en) | 1999-11-02 |
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