DE69524107T2

DE69524107T2 - Bestimmung von freiem und komplexiertem trypsinogen-2

Info

Publication number: DE69524107T2
Application number: DE69524107T
Authority: DE
Inventors: Johan Hedstroem; Ulf-Hakan Stenman
Original assignee: STENMAN ULF HAAKAN
Current assignee: STENMAN ULF HAAKAN
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-24
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2015-08-25
Also published as: WO1996007104A1; FI943921A0; FI100557B; US5976809A; EP0777860B1; FI943921A; EP0777860A1; JPH10504902A; DE69524107D1; JP3522764B2; ATE209359T1; DK0777860T3; ES2168378T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterscheidung von Pankreatitis und einer anderen pankreatischen Erkrankung einerseits von einer nichtpankreatischen gastrointestinalen Erkrankung andererseits, entweder durch Bestimmung von freiem Trypsinogen-2 in Urin oder von Trypsin-2, komplexiert mit alpha-1-Antitrypsin (Trypsin-2-AAT) in Serum.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Trypsinogene sind Serinproteasen, die durch exokrine Zellen des Pankreas sekretiert werden (Travis, J. und Roberts, R., Biochemistry 1969; 8 : 2884-9; Mallory, P. und Travis, J., Biochemistry 1973; 12 : 2847-51). Zwei Haupttypen von Trypsinogenisoenzymen wurden charakterisiert, Trypsinogen-1, auch kationisches Trypsinogen genannt, und Trypsinogen-2, auch anionisches Trypsinogen genannt. Die Trypsinogen-Proenzyme werden im Darm durch Enterokinase aktiviert, die ein Aktivierungspeptid vom N-Ende der Trypsinogene entfernt. Die Trypsinogene zeigen einen hohen Grad der Sequenzhomologie; sie können aber auf der Grundlage von Ladungsunterschieden durch Anwendung von Elektrophorese oder Ionenaustauschchromatographie getrennt werden. Die Hauptform von Trypsinogen im Pankreas und Pankreassaft ist Trypsinogen-1 (Guy CO et al., Biochem Biophys Res Commun 1984; 125 : 516-23). In Serum gesunder Personen ist Trypsinogen-1 auch die Hauptform, wohingegen bei Patienten mit Pankreatitis Trypsinogen-2 stärker erhöht ist (Itkonen et al., J Lab Clin Med 1990; 115 : 712-8). Trypsinogene treten auch in bestimmten ovarialen Tumoren auf, in denen Trypsinogen-2 die Hauptform ist (Koivunen et al., Cancer Res 1990; 50 : 2375-8). Trypsin-1 im Komplex mit alpha-1-Antitrypsin, auch alpha-1-Antiprotease genannt, tritt erwiesenermaßen im Serum von Patienten mit Pankreatitis auf (Borgstrom, A., und Ohlsson, K., Scand J Clin Lab Invest 1984; 44 : 381-6); allerdings wurde festgestellt, dass eine Bestimmung dieses Komplexes zur Unterscheidung von pankreatischen Erkrankungen und anderen gastrointestinalen Erkrankungen nicht geeignet ist (Borgstrom et al., Scand J Clin Lab Invest 1989; 49 : 757- 62).
Trypsinogen-1 und -2 sind immunologisch eng verwandt (Kimland et al., Clin Chim Acta 1989; 184 : 31-46; Itkonen et al., 1990), aber durch Verwendung monoklonaler Antikörper (Itkonen et al., 1990) oder durch Absorption polyklonaler Antikörper (Kimland et al., 1989) ist es möglich, Reagentien zu erhalten, die eine spezifische Messung jeder Trypsinogen-Form ermöglichen.
Wenn aktives Trypsin den Blutstrom erreicht, wird es durch die Haupttrypsininhibitoren alpha-2-Makroglobulin und alpha-1-Antitrypsin (AAT) inaktiviert. AAT ist ein 58 Kilodalton-Serinproteaseinhibitor, der in der Leber synthetisiert wird, und ist einer der Hauptproteaseinhibitoren im Blut. Während Komplexe zwischen Trypsinogen-1 und AAT im Serum nachweisbar sind (Borgstrom und Ohlsson, 1984), sind die Komplexe mit alpha-2-Makroglobulin mit Assays auf Antikörperbasis nicht messbar (Ohlsson, K., Acta Gastroenterol Belg 1988; 51 : 3-12).
Akute Pankreatitis ist eine schwere und möglicherweise tödliche Krankheit, die eine rasche Diagnose erfordert. Die Bestimmung von Amylase im Serum oder Urin wird routinemäßig zu diesem Zweck durchgeführt, allerdings sind diese Verfahren durch Fehlen von Spezifität gehemmt, was ihre klinische Verwendbarkeit begrenzt. Daher hat die Verwendung anderer pankreatischer Marker, z. B. Proteasen und Lipasen, Interesse gefunden (Ogawa et al., Nippon Geka Gackai Zassshi 1985; 86 : 1241-4). Zur Diagnose einer pankreatischen Krankheit wurde die Bestimmung von Trypsinogen-1 und -2 in Serum (Itkonen et al., 1990) und Trypsinogen-1 in Urin (Lake-Bakaar et al., Lancet 1979; ii: 878-80) verwendet.
In der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass Patienten mit einer pankreatischen Krankheit stark erhöhte Konzentrationen an Trypsinogen-2, komplexiert mit alpha-1- Antitrypsin, im Serum und an freiem Trypsinogen-2 im Urin haben. Diese Feststellung hat sich bei der Diagnose von Pankreatitis als sehr nützlich erwiesen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt die Charakterisierung des Trypsin-2- alpha-1-Antitrypsin-Komplexes im Kalibrator durch Gelfiltration dar. Die Elution von Trypsinogen-2-Immunreaktivität ist zum Vergleich dargestellt. Pfeile geben die Elutionspositionen für IGG und Albumin an.
Fig. 2 stellt die Dosis-Reaktions-Kurve für den immunfluorometrischen Assay von Trypsin-2-alpha-1- Antitrypsin-Komplex mit dem verwendeten Kalibrator dar.
Fig. 3A stellt die Konzentration von Trypsinogen-2 in Serumproben von 120 gesunden Kontrollen, 11 Patienten mit extrahepatischem Verschluss des Gallenausgangs, 34 Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs und 29 Patienten mit akuter Pankreatitis dar. Die horizontalen Linien geben die Referenzobergrenzen an.
Fig. 3B stellt die Konzentration von Trypsin-2-alpha-1- Antitrypsin-Komplex und Serumamylase bei denselben Patienten wie in Fig. 3A dar.
Fig. 4 stellt eine ROC-Kurve von Trypsin-2-AAT, Trypsinogen-2 und Amylase in Seren von 29 Patienten mit akuter Pankreatitis dar. Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs wurden als Kontrollgruppe verwendet. Werte für einige Cut-off-Punkte sind angegeben. Die Figur beweist, dass Trypsin-2- AAT die beste Eignung zur Unterscheidung zwischen Pankreatitis und akuten nichtpankreatischen abdominalen Erkrankungen besitzt.
Fig. 5 stellt die Konzentration von Trypsinogen-2 und Amylase in Urinproben von 46 Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs und von 22 Patienten mit akuter Pankreatitis dar. Die Figur beweist, dass Trypsinogen-2 in Urin die beste Diagnosegenauigkeit hat.
Fig. 6A-6D zeigen die Konzentrationen von Trypsinogen-2 und Amylase in Urin- und Serumproben von Patienten mit leichter Pankreatitis (I) und schwerer Pankreatitis (II). Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs dienten als Kontrollen (AC). HC = gesunde Kontrollen. Die gestrichelte horizontale Linie gibt die obere Referenzgrenze an.
Fig. 7A-7B stellen ROC-Kurven dar, die die Genauigkeit verschiedener Tests bei der Unterscheidung zwischen akuter Pankreatitis und extrapankreatischer gastrointestinaler Krankheit (Fig. 7A) und zwischen schwerer und leichter akuter Pankreatitis (Fig. 7B) zeigen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die charakteristischen Merkmale der vorliegenden Erfindung werden in Anspruch 1 dargelegt.
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Unterscheidung zwischen Pankreatitis und anderen pankreatischen Erkrankungen einerseits von einer nichtpankreatischen Erkrankung andererseits, wobei die Verfahren auf der Bestimmung der Konzentration an Trypsin-2-AAT in Serum oder der Konzentration an Trypsinogen-2 in Urin basieren.
Es können kompetitive wie auch nichtkompetitive Assayverfahren angewendet werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird der Trypsin-2-AAT-Komplex oder freies Trypsinogen-2 durch nichtkompetitive Verfahren gemessen, die mindestens zwei unterschiedliche Antikörper verwenden, wobei der Einfangantikörper an eine feste Phase gebunden wird.
Geeignete Markierungen sind z. B. Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende, phosphoreszierende, lumineszierende Marker und gefärbte Partikel, die sichtbar nachgewiesen werden können. Das Wort "Markierung" soll auch so verstanden werden, dass es eine Bindungsstelle abdeckt, die fähig ist, an die genannten Marker zu binden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden, nichtbeschränkenden Beispiele erläutert.
Im Folgenden werden Materialien, die in den Beispielen verwendet werden, beschrieben:

1. Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper wurden durch Standardverfahren in Mäusen produziert. Die Spezifität der Antikörper für Trypsinogen-2 wurde untersucht (Itkonen et al., 1990), indem Trypsinogen-1 und -2 verwendet wurden, die durch Ionenaustauschchromatographie, wie es in der Referenz (Koivunen et al., 1990) beschrieben ist, getrennt worden waren.

2. Reagentien und Puffer

Das polyklonale Antiserum gegen AAT wurde von Cako (Glostrup, Dänemark) erhalten. Der Assaypuffer im immunfluorometrischen Assay (IFMA) war 50 mmol Tris-HCl, pH 7, 7, mit 9 g/l NaCl (TBS), der pro Liter 5 g Rinderserumalbumin, 0,15 g Rinderglobulin und 0,5 g NaN&sub3; enthielt. Die Waschlösung enthielt pro Liter 9 g NaCl, 0,5 g NaN&sub3; und 0,2 g Tween 20. Die Verstärkungslösung war von Wallac Biochemical laboratories (Turku, Finnland).

3. Proben

Serumproben wurden von 29 Patienten mit akuter Pankreatitis, 11 Patienten mit extrahepatischem Gallengangverschluss und 34 Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs erhalten. Die Proben wurden innerhalb von 24 Stunden ab Einlieferung und vor Beginn der Therapie entnommen. Die Diagnose akuter Pankreatitis basierte auf klinischen Befunden und Laborergebnissen (Serum- und Urin-Amylase und CRP), Ranson-Kriterien (Ranson et al., Surg Gynecol Obstet 1974; 139 : 69-80). Die Diagnose wurde durch Kontrastcomputertomographie des Pankreas bestätigt. Die Diagnose eines extrahepatischen Gallengangverschlusses und anderer akuter abdominaler Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs basierten auf normalen klinischen Methoden (klinische Untersuchungen, Laboruntersuchungen, Ultraschalluntersuchungen und radiologischen Untersuchungen oder Operationsbefunde). Magengeschwüre und duodenale Geschwüre, wie auch Ösophagitis und Gastritis, wurden durch Endoskopie diagnostiziert. Serumproben von 120 Blutspendern, die von der Finnisch Red Cross Blood Bank erhalten worden waren, wurden zur Einführung von Referenzwerten verwendet. Alle Proben wurden bei -20ºC gelagert, bis sie untersucht wurden.

4. Gelfiltration

Eine Fraktionierung des Trypsin-2-AAT-Kalibrators wurde durch Gelfiltration unter Verwendung einer 1 · 30 cm-Säule mit. Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia, Schweden) und TBS- Puffer zur Elution durchgeführt. Die Strömungsgeschwindigkeit war 30 ml/h, und es wurden Fraktionen mit einem Volumen von 0,5 ml gesammelt. Die Röhrchen wurden mit 50 ul Assaypuffer, der Aprotinin (1,0 mg/l) enthielt, vorgefüllt, um eine Proteolyse und nichtspezifische Adsorption an den Röhrchen zu verhindern. Die Elutionsvolumina von IgG (150 kD) und Albumin (69 kD) wurden für eine grobe Kalibrierung der Säule verwendet.

5. Amylasebestimmung

Amylase wurde durch einen enzymatischen colorimetrischen Test unter Verwendung eines automatischen Analysators (Hitachi 705E) und von Reagentien von Boehringer Mannheim gemessen. Die Referenzwerte des Verfahrens sind 70 bis 300 E/l in Serum und 60 bis 2.000 E/l in Urin.

Beispiel 1

Herstellung von Trypsin-2-alpha-1-Antitrypsin (Trypsin-2- AAT) zur Verwendung als Kalibrator

Ein Kalibrator für den Trypsin-2-AAT-Komplex wurde aus reinem humanem AAT (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) und Trypsin-2, das wie früher beschrieben (Itkonen et al., 1990) aus Urin eines Patienten mit akuter Pankreatitis gereinigt worden war, hergestellt. Trypsinogen-2 wurde für 2 h bei +37ºC autoaktiviert und danach für 16 h bei +20ºC mit dem siebenfach molaren Überschuss an AAT in TBS-Puffer inkubiert. Das Inkubationsgemisch wurde durch Gelfiltration getrennt, und der Gehalt an Trypsinogen-2 und Trypsin- 2-AAT in den Fraktionen wurde durch Trypsinogen-2-IFMA (Fig. 1) bestimmt. Die Inkubation mit AAT reduzierte die Trypsinogen-2-Komponente auf 6% des Gehalts in der Kontrolle, die mit Aprotinin inkubiert worden war. Die Kreuzreaktion im Trypsinogen-2-IFMA mit Trypsin-2-AAT ist 3, 3% (Fig. 1). Auf dieser Basis wurde errechnet, dass 94% Trypsin-2 mit AAT komplexiert war. Dieses Präparat wurde zur Eichung des Trypsin-2-AAT-Assays verwendet. Kalibratoren wurden hergestellt, indem der Komplex mit Assaypuffer verdünnt wurde, um Trypsin-2-AAT in Konzentrationen von 0,1, 0,5, 1,0, 10 und 100 ug/l zu erhalten.

Beispiel 2

Nichtkompetitiver immunofluorometrischer Assay auf Trypsinogen-2 und Trypsin-2-AAT

Trypsinogen-2 wurde durch einen nichtkompetitiven Assay mit zeitaufgelöstem Fluorimeter unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern bestimmt (Itkonen et al., 1990). Der Referenzbereich für Trypsinogen-2 im Serum war 18 bis 90 ug/l (Media 39 ug/l).
Für den Assay auf Trypsin-2-AAT wurde ein monoklonaler Einfangantikörper für Trypsin-2 (14F10) (Itkonen et al., 1990), der sowohl mit freiem Trypsinogen-2 wie auch mit Trypsin-2-AAT-Komplex reagiert, auf Mikrotitervertiefungen aufgetragen. Ein polyklonaler Kaninchenantikörper für AAT (Dako, Dänemark), der mit Europiumchelat markiert war (Hemmilä et al., Anal Biochem 1984; 137 : 335-43), wurde als Nachweisantikörper verwendet. 25 ul Probe und 200 ul Assaypuffer wurden in die beschichteten Vertiefungen pipettiert. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Vertiefungen ausgeleert, zweimal mit Waschlösung unter Verwendung eines automatischen Waschgerätes (DELFIA Platewash 1296-024, Wallac, Turku, Finnland) gewaschen. Es wurden zweihundert ng Tracer-Antikörper in 200 ul Assaypuffer zugegeben, und nach einer weiteren Inkubation für eine Stunde wurden die Vertiefungen ausgeleert und viermal gewaschen. Es wurden 200 ul Verstärkungslösung zugesetzt, und nach 5 min wurde die Fluoreszenz mit einem 1234 DEL- FIA-Fluorometer (Wallac, Turku, Finnland) gemessen. Die Dosis-Wirkung-Kurve für den Trypsin-2-AAT-IFMA ist in Fig. 2 dargestellt.
Die Nachweisgrenze des Assays war 0,05 ug/l, und die Standardkurve war bis 100 ug/l linear. Der Referenzbereich, der auf der Basis der 2,5- und 97,5-Perzentile in Seren von 120 Blutspendern bestimmt worden war, war 2, 3 bis 12 ug/l, und der Medianwert war 4,2 ug/l.

Trypsin-2-AAT und Trypsinogen-2 in Serum in der Diagnose von Pankreatitis

Die klinische Genauigkeit des Serumassays wurde bestimmt, indem die Konzentrationen an Trypsin-2-AAT, Trypsinogen-2 und Amylase in Serumproben von Patienten mit akuter Pankreatitis, Patienten mit extrahepatischem Gallengangverschluss und Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs bestimmt wurden. Bei Patienten mit akuter Pankreatitis waren die Level an Trypsin-2- AAT und Trypsinogen-2 stark erhöht. Die Mediankonzentration an Trypsin-2-AAT war das 59-fache der bei gesunden Kontrollen. Die von Trypsinogen-2 war das 19-fache und die von Amylase das 5,4-fache der entsprechenden bei gesunden Kontrollen (Tabelle 1).

Tabelle 1

Medianwert und Bereich von Trypsin-2-AAT, Trypsinogen-2 und Amylase in Serum von gesunden Kontrollen und verschiedenen Patientengruppen (AAT ist die Abkürzung für alpha-1- Antitrypsin).
Es gab keine Überlappung bei den Trypsin-2-AAT-Werten zwischen den Patienten mit akuter Pankreatitis und denen mit extrapankreatischer Erkrankung. Bei Trypsinogen-2 wurde bei 4 Patienten (14%) und für Amylase bei 14 Patienten (48%) eine Überlappung beobachtet (Fig. 3A und 3B).
Die Fähigkeit verschiedener Analyten, zwischen Pankreatitis und nichtpankreatischer Erkrankung zu unterscheiden, wurde durch eine Receiver-operating-Charakteristik (ROC)- Analyse bestimmt. Die Fläche unter der ROC-Kurve war für Trypsin-2-AAT 1,00, für Trypsinogen-2 0,996 und für Amylase 0,929, was anzeigt, dass die Empfindlichkeit und Spezifität für Trypsin-2-AAT besser war als für die anderen Bestimmungen (Fig. 4).

Beispiel 3

a) Reinigung von Trypsinogen-2 aus Urin

Ein Liter Urin, der hohe Konzentrationen an Trypsinogen-2 enthielt, wurde zur Entfernung unlöslicher Bestandteile filtriert, dann wurde der pH des Filtrats mit 1 mol/l NaOH auf 7,4 eingestellt. Das Filtrat wurde durch eine Immunaffinitätschromatographiesäule geleitet, welche durch Kupplung von 20 mg des monoklonalen Antikörpers 14F10, der für Trypsinogen-2 spezifisch ist, an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose (von Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt worden war. Die Charakteristika des Antikörpers sind beschrieben (Itkonen et al., 1990). Nach Waschen der Säule mit 1 mol/l NaCl wurde sie mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) eluiert. Das Eluat wurde außerdem durch Reverse phase-Chromatographie unter Verwendung von 0,1% TFA-Puffer und Elution mit einem Acetonitrilgradienten gereinigt. Der Gehalt der Fraktionen wurde auf der Basis seiner Extinktion bei 280 nm bezüglich Protein überwacht. Die erhaltenen Fraktionen wurden unverzüglich mit 1 mol/l Tris-Puffer neutralisiert. Der Gehalt an Trypsinogen-2 in den Fraktionen wurde durch einen Immunoassay bestimmt. Die Fraktionen, die Trypsinogen-2 enthielten, wurden konzentriert. Trypsinogen-2, das nach diesen Verfahren gereinigt worden war, hatte eine Reinheit von mehr als 95%, was durch eine einzelne Bande bei der Natriumdodecylsulfat-Elektrophorese deutlich wurde.

b) Trypsinogen-2 in Urin in der Diagnose von Pankreatitis

Die klinische Genauigkeit des Urinassays auf Trypsinogen-2 wurde bestimmt, indem die Konzentrationen in Urinproben von 22 Patienten mit akuter Pankreatitis und 46 Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs bestimmt wurden. Zum Vergleich wurde Amylase in Urin verwendet. Bei Patienten mit akuter Pankreatitis waren die Trypsinogen-2-Spiegel stark erhöht, wobei die Mediankonzentrationen das 4.000-fache der bei Patienten mit akuten abdominalen Erkrankungen waren. Der ensprechende Unterschied für Amylase war nur 4-fach (Tabelle 2).

Tabelle 2

Medianwert und Bereich für Trypsinogen-2 und Amylase in Urinproben von 46 Patienten mit akuter abdominaler Erkrankung extrapankreatischen Ursprungs und von 22 Patienten mit akuter Pankreatitis
Es gab keine Überlappung bei den Trypsinogen-2-Werten zwischen den Patienten mit akuter Pankreatitis und der Kontrollgruppe mit abdominalen Erkrankungen extrapankreatischen Ursprungs. Nur 4 Patienten mit Pankreatitis hatten für Amylase höhere Werte als der höchste, der in der Kontrollgruppe beoachtet wurde (Fig. 5).

Beispiel 4

Urin-Trypsinogen-2 als Marker für akute Pankreatitis, verglichen mit Serum-Trypsinogen-2 und Amylase in Serum oder Urin

Die klinische Verwendbarkeit der Bestimmungen von Urin- Trypsinogen-2 in der frühen Diagnose und Untersuchung der Schwere akuter Pankreatitis (AP) wurde untersucht. Als Referenz wurden Serum-Trypsinogen-2, Urinamylase und Serumamylase verwendet. Am Helsinki University Central Hospital wurden insgesamt 59 Patienten mit AP-Diagnose und 42 Kontrollen mit einer akuten Erkrankung des oberen Abdomens extrapankreatischen Ursprungs (AC) untersucht. Die Patienten mit AP wurden entsprechend ihren klinischen Ergebnissen in zwei Gruppen eingeteilt: Leichte AP (Gruppe I, 40 Patienten) und schwere AP (Gruppe II, 19 Patienten). Urinproben von Patienten ohne Anzeichen einer akuten abdominalen Erkrankung wurden als gesunde Kontrollen (healthy controls = HC) verwendet. Amylase und Trypsinogen wurden nach den vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt.
Alle Fälle akuter Pankreatitis (AP) hatten erhöhte Konzentrationen an Trypsinogen-2 im Urin; eine Konzentration unter dem oberen Referenzwert schloss diese Diagnose aus. Dagegen hatten 17 der Patienten (28%) mit Pankreatitis eine normale Amylasekonzentration im Urin. Der niedrigste Trypsinogen-2-Wert bei akuter Pankreatitis (15 ug/l) war das 1,4-fache der Referenzobergrenze bei gesunden Kontrollen. Die Mediankonzentration von Trypsinogen-2 im Urin bei Patienten mit AP war das 102-fache der Referenzobergrenze. Zum Vergleich, die Konzentrationen von Amylase im Urin waren nur das 2,0-fache und die der Amylase im Serum das 3,4-fache der Referenzobergrenze.
Die Receiver-operating-Charakteristik (ROC)-Analyse wurde verwendet, um Patienten mit akuter Pankreatitis (AP) und Kontrollen mit akuten abdominalen extrapankreatischen Erkrankungen (AC) zu vergleichen; für Trypsinogen-2 im Urin war AUC (area under the curve = Fläche unter der Kurve) 0,980, und für Amylase im Urin war AUC 0,842. Trypsinogen- 2 im Urin hatte eine ebenso gute Genauigkeit wie Trypsinogen-2 im Serum (AUC = 0,998) und Serumamylase (AUC = 0,965), siehe Fig. 7A.
Die ROC-Analyse zeigte, dass Trypsinogen-2 im Urin die höchste Genauigkeit der Marker besaß, die zur Differenzierung schwerer von leichter AP (AUC = 0, 741, Fig. 7B) untersucht wurden; sie war in dieser Hinsicht etwas besser als Trypsinogen-2 im Serum. Amylase hatte eine schlechte Eignung, schwerer von leichter AP zu differenzieren, und die Amylasekonzentrationen im Urin waren bei schwerer Erkrankung tatsächlich niedriger als bei leichter Erkrankung (Fig. 6C).
Diese Resultate zeigen, dass Trypsinogen-2 im Urin für akute Pankreatitis ein Marker mit hoher Genauigkeit ist. Alle Patienten mit akuter Pankreatitis hatten erhöhte Werte und die Anzahl der falsch-positiven Resultate für Trypsinogen-2 bei Patienten mit anderen gastrointestinalen Erkrankungen ist niedriger als für Amylase im Urin. Darüber hinaus gibt die Trypsinogen-2-Konzentration die Schwere der Erkrankung wieder, was die Amylasekonzentration nicht tut. Somit ist Trypsinogen-2 einem anderen Urintest bei der Diagnose akuter Pankreatitis überlegen und ebenso gut wie der Serumtest auf Trypsinogen-2.
Aus den vorgelegten Daten wird offensichtlich, dass die Bestimmung von Trypsin-2-AAT im Serum oder Trypsinogen-2 im Urin eine bessere klinische Genauigkeit liefert als derzeit verwendete Verfahren, wie z. B. Trypsinogen-2 oder Amylase im Serum oder Amylase im Urin.

Claims

1. Verfahren zur Unterscheidung von pankreatischen Erkrankungen, einschließlich Pankreatitis, von anderen nicht-pankreatischen Erkrankungen durch Verwendung eines Immunoassays für die Messung der Konzentration eines Analyteh in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt entweder

i) Trypsin-2, komplexiert mit α-1-Antitrypsin (Trypsin-2-AAT), in Serum oder

ii) Trysinogen-2 in Urin ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe, die den Analyten umfasst, mit einem Einfangantikörper, der Spezifität für den Analyten hat, inkubiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der Probe in Gegenwart eines kompetitiven markierten Analyten durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt mit einem markierten Detektorantikörper, der Spezifität für eine andere Stelle des Analyten als der Einfangantikörper hat, inkubiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfangantikörper an eine feste Phase gebunden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Analyt Trypsin- 2-AAT ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Trypsin-2-AAT-Komplex, der an den Einfangantikörper gebunden ist, vor der Inkubation mit dem Detektorantikörper von freiem AAT abgetrennt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung ein Enzym, ein Radioisotop, ein fluoreszierender, phosphoreszierender oder lumineszierender Marker, ein gefärbtes Partikel oder eine Bindungsstelle, die fähig ist, den Marker zu binden, ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfangantikörper für Trypsinogen-2 oder Trypsin-2 spezifisch ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektorantikörper für AAT spezifisch ist.