CN110650751A - Lrp1结合剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本文中提供了与LRP1的结合结构域I结合并模拟鞘脂激活蛋白原在刺激Tsp‑1中之活性的药剂。本文中还提供了通过抑制PRSS2与LRP1的结合来抑制丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)之功能(例如，阻遏Tsp‑1之能力)的药剂。还提供了使用这些药剂来治疗癌症的方法。

Description

LRP1结合剂及其用途

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年3月22日提交的标题为“LRP1 BINDINGAGENTS AND USES THEREOF”的美国临时申请No.62/475,133的权益，其全部内容通过引用并入本文中。

背景技术

当前对于癌症患者的护理标准由广泛作用的细胞毒剂(化学治疗)、辐射以及靶向特定分泌蛋白、细胞表面受体或激酶的定向治疗剂组成。历史上，已存在靶向肿瘤微环境的两类治疗剂，抗血管生成药(其仅限于抗VEGF治疗)和免疫调节药。靶向微环境的治疗的主要缺点之一在于其不具有直接的抗肿瘤活性，并且因此其作为单药治疗的效力已受到限制。相反地，具有直接抗肿瘤活性的靶向治疗和化学治疗的主要缺点在于除了意外的有害副作用之外，患者对药物产生了抗性。

发明内容

本文中提供了通过刺激强效抗血管生成和抗肿瘤发生蛋白血小板应答蛋白1(Thrombospondin 1，Tsp-1)的活性而具有抗癌活性并且靶向癌症微环境以防止癌症复发和/或转移的新的癌症治疗策略。

本公开内容的一些方面提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1，LRP1)的结合结构域I结合的药剂。

在一些实施方案中，LRP1的结合结构域I包含LRP1的第1至172位氨基酸。在一些实施方案中，药剂是蛋白质或肽。

在一些实施方案中，药剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体与LRP1的结合结构域I中的第151至172位氨基酸(SEQ ID NO：3)结合。

在一些实施方案中，药剂是小分子。在一些实施方案中，小分子选自：脂质、单糖、第二信使、代谢物和异生物质(xenobiotics)。

在一些实施方案中，药剂与LRP1的结合结构域I的结合激活Rho-GTP酶途径。在一些实施方案中，Rho途径是LRP1介导的Rho-GTP酶途径。在一些实施方案中，药剂与LRP1的结合结构域I的结合刺激血小板应答蛋白1(Tsp-1)。

在一些实施方案中，药剂经口、肠胃外、肌内、鼻内、气管内、脑室内、静脉内或腹膜内施用。

在一些实施方案中，癌症是转移性的。在一些实施方案中，癌症是胆道癌；膀胱癌；脑癌；胶质母细胞瘤；髓母细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；血液系统肿瘤(hematological neoplasm)；急性淋巴细胞性白血病和髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病；淋巴瘤；上皮内肿瘤；鲍恩病(Bowen’s disease)；佩吉特病(Paget’s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤；霍奇金病(Hodgkin’s disease)；淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；鳞状细胞癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；脂肪肉瘤；纤维肉瘤；骨肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；间质瘤和生殖细胞瘤；甲状腺癌；以及肾癌。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。

本公开内容的另一些方面提供了与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)结合结构域I结合的抗体。在一些实施方案中，LRP-1的结合结构域I包含LRP-1的第1至172位氨基酸。在一些实施方案中，抗体与LRP1的结合结构域I中的第151至172位氨基酸(SEQ ID NO：3)结合。

在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体刺激Tsp-1。

本文中还提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的刺激血小板应答蛋白1(Tsp-1)的药剂。在一些实施方案中，药剂抑制丝氨酸蛋白酶2(Protease，serine 2，PRSS2)阻遏Tsp-1的能力。在一些实施方案中，药剂与LRP1的结合结构域I结合。在一些实施方案中，药剂抑制PRSS2与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的结合。

本文中还提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的抑制丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)之功能的第一药剂，以及有效量的与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的结合结构域I结合的第二药剂。在一些实施方案中，第一药剂与第二药剂同时施用。在一些实施方案中，第一药剂与第二药剂依次施用。

本公开内容的一个或更多个实施方案的细节示于以下描述中。根据以下附图和数个实施方案的详细描述以及还根据所附权利要求书，本公开内容的其他特征或优点将变得明显。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步示出本公开内容的某些方面，通过与本文中给出的一些具体实施方案的详细描述组合参照这些附图中的一个或更多个，可更好地理解这些方面。在附图中：

图1：用载剂对照或以20和40mg/kg/天的剂量的肽处理的AsPc1肿瘤的平均肿瘤质量(tumor mass)的图。

图2A至2B：用psap肽(psaptide)或载剂对照处理的小鼠的(图2A)原发性胰腺肿瘤以及(图2B)肺和脾的代表性图。

图3A至3B：(图3A)从患者腹水建立的9种卵巢癌细胞系以及(图3B)乳腺癌细胞系MCF7、SkBr3和MDA-MB-231中的CD36和β-肌动蛋白的western印迹。

图4：向SCID小鼠注射1×10个卵巢癌细胞并用肽(40mg/kg/QD)或顺铂(4mg/kgQOD)处理(n＝12/组)。

图5：用载剂对照或肽(psap肽)处理的小鼠的腹水中Gr1+(X轴)和CD11b+(y轴)细胞的FACS分析。

图6A至6B：以下的western印迹分析：(图6A)未经处理(-)或者用单独的或与RAP组合的来自PC3细胞的条件培养基处理的前列腺成纤维细胞中的Tsp-1和β-肌动蛋白表达；以及(图6B)未经处理(-)或者用单独的或与PKC抑制剂

6983(PKCi)组合的来自PC3细胞的条件培养基处理的前列腺成纤维细胞中的Tsp-1、p53和β-肌动蛋白表达。

图7：用空载体(pLKO)或者表达对LRP1具有特异性的两种独立shRNA序列的慢病毒载体转导的MRC5肺成纤维细胞中Tsp-1、p53和β-肌动蛋白表达的western印迹分析，所述成纤维细胞为未经处理(-)或者用来自PC3细胞或PC3M-LN4细胞的条件培养基处理。

图8A至8B：(图8A)未经处理(-)或者用单独的或与25或50μg的rhRAP组合的psap肽处理以及(图8B)未经处理(-)或者用单独的或与Y27632组合的psap肽处理的肺成纤维细胞中Tsp-1和β-肌动蛋白表达的western印迹分析。

图9：未经处理(-)或用具有提高浓度的NaCl的经Cu²⁺/肝素琼脂糖柱分级的LN4 CM处理的肺成纤维细胞中Tsp-1和β-肌动蛋白表达的western印迹分析。

图10：PC3和PC3M-LN4细胞中PRSS2和β-肌动蛋白表达的western印迹分析。

图11：未经处理(-)或者用单独的或与STI组合的LN4 CM处理的肺成纤维细胞中Tsp-1和β-肌动蛋白表达的western印迹分析。

图12：未经处理(-)或者用单独的或与Rac1抑制剂组合的LN4 CM处理的肺成纤维细胞中Tsp-1和β-肌动蛋白表达的western印迹分析。

图13A至13B：(图13A)miniLRP1受体的示意图。(图13B)未经处理(-)或经环鞘脂激活蛋白原肽(cyclic prosaposin peptide)处理的293T细胞中Tsp-1、miniLRP和β-肌动蛋白表达的western印迹分析。

图14A至14B：鞘脂激活蛋白原和PRSS2二者需要LRP1用于Tsp-1表达的调节。

图15A至15C：使PRSS2沉默阻断了Tsp-1阻遏和肿瘤形成。

图16A至16B：LRP1肽与PSAP(图16A)或PRSS2(图16B)的免疫共沉淀。

图17：PRSS2活性位点中的突变不影响对Tsp-1的阻遏。在PRSS2活性位点中进行突变，这将消除PRSS2的酶活性。对突变体进行测序以确认突变的存在。将野生型和突变体PRSS2蛋白异位转染到293T细胞中，并将条件培养基用于处理WI-38成纤维细胞。然后通过western印迹来分析Tsp-1和β-肌动蛋白表达。发现PRSS2阻遏Tsp-1的能力未受影响，表明LRP1的结合位点不在活性位点中，并且针对该区域的抗体不影响该酶的蛋白酶活性。

具体实施方式

本文中提供了具有抗癌活性和靶向癌症微环境以防止癌症复发和/或转移之能力二者的新的癌症治疗策略。本文中所述的抗癌策略至少部分依赖于对强效抗血管生成和抗肿瘤发生蛋白质血小板应答蛋白1(Tsp-1)的活性的刺激。“Tsp-1”是经二硫键连接的同三聚体蛋白的亚基。Tsp-1是介导细胞与细胞以及细胞与基质相互作用的黏着糖蛋白(adhesive glycoprotein)。Tsp-1与纤维蛋白原、纤连蛋白、层黏连蛋白、V型胶原蛋白和整联蛋白α-V/β-1结合，并已被示出在血小板聚集、血管生成和肿瘤发生中发挥作用。出于本公开内容的目的，Tsp-1是强效抗肿瘤发生和抗血管生成因子，其活化抑制了肿瘤生长和转移并阻遏了肿瘤微环境中的血管生成。

先前已示出鞘脂激活蛋白原(prosaposin)或鞘脂激活蛋白原来源的肽能够刺激Tsp-1的活性并且对于治疗多种类型的癌症是有效的(参见，例如PCT公开WO2009002931、WO/2011/084685和WO/2013/096868、WO2015148801和美国专利申请12/640,788和13/516,511，所有这些通过引用整体并入本文中)。

本公开内容至少部分地基于以下发现：鞘脂激活蛋白原或鞘脂激活蛋白原来源的肽对Tsp-1的刺激活性由低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)介导。“低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)”也称为α-2-巨球蛋白受体(alpha-2-macroglobulin receptor，A2MR)、载脂蛋白E受体(apolipoprotein E receptor，APOER)或分化群91(cluster ofdifferentiation，CD91)，是形成参与受体介导的内吞作用的细胞的质膜中存在的受体的蛋白质。在人中，LRP1由LRP1基因编码。LRP1是关键的信号传导蛋白，并参与多种生物过程，例如脂蛋白代谢和细胞运动；以及疾病，例如神经退行性疾病、动脉粥样硬化和癌症。

LRP1基因编码600kDa的前体蛋白，该蛋白质在反式高尔基体复合体(trans-Golgicomplex)中由弗林蛋白酶加工，从而产生非共价缔合的515kDa的α链和85kDa的β链。作为LDLR家族的成员，LRP1包含富含半胱氨酸的补体型重复、EGF(基因)重复、β-螺旋桨结构域(β-propeller domain)、跨膜结构域和胞质结构域。LRP1的胞质结构域是α链，其包含分别包含两个、八个、十个和十一个富含半胱氨酸的补体型重复的四个配体结合结构域(称为“结合结构域I至IV”)。这些重复结合胞外基质蛋白、生长因子、蛋白酶、蛋白酶抑制剂复合体以及其他参与脂蛋白代谢的蛋白质。在这四个结构域中，II和IV结合大多数蛋白质配体。EGF重复和β-螺旋桨结构域用来在低pH条件下(例如在内体(endosome)中)释放配体，其中假定β-螺旋桨替换配体结合重复处的配体。跨膜结构域是β链，其包含100个残基的胞质尾。该尾包含负责蛋白质在内吞作用和信号转导中的功能的两个NPxY基序。

迄今为止，尚未鉴定出与LRP1的结合结构域I结合的配体。如本文中所述，LRP1的结合结构域I包含LRP1的约第1至200位氨基酸，并且包含LRP1的前两个β-螺旋桨结构域。“约”意指LRP1的结合结构域I可以比200个氨基酸长或短不多于15％。例如，LRP1的结合结构域I可包含LRP1蛋白的以下氨基酸：第1至200位、第1至199位、第1至198位、第1至197位、第1至196位、第1至195位、第1至194位、第1至193位、第1至192位、第1至191位、第1至190位、第1至189位、第1至188位、第1至187位、第1至186位、第1至185位、第1至184位、第1至183位、第1至182位、第1至181位、第1至180位、第1至179位、第1至178位、第1至177位、第1至176位、第1至175位、第1至174位、第1至173位、第1至172位、第1至171位、第1至170位、第1至201位、第1至202位、第1至203位、第1至204位、第1至205位、第1至206位、第1至207位、第1至208位、第1至209位、第1至210位、第1至211位、第1至212位、第1至213位、第1至214位、第1至215位、第1至216位、第1至217位、第1至218位、第1至219位、第1至220位、第1至221位、第1至222位、第1至223位、第1至224位、第1至225位、第1至226位、第1至227位、第1至228位、第1至229位或第1至230位。在一些实施方案中，LRP1的结合结构域I包含LRP1蛋白的第1至172位氨基酸。

本公开内容还提供了与LRP1的结合结构域I结合的配体的鉴定。如本公开内容的附图和实施例中所示出的，发现鞘脂激活蛋白原或鞘脂激活蛋白原来源的肽与LRP1的结合结构域I结合，并且鞘脂激活蛋白原来源的肽的结合激活Tsp1并阻遏癌症(例如，图13A和13B)。本公开内容中经鉴定的LRP1的结合结构域I的另一配体是丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)(例如，图10)。“PRSS2”是胰蛋白酶原，并且是丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族的成员。PRSS2由胰腺分泌，并在小肠中被切割成其活性形式。其对涉及赖氨酸或精氨酸之羧基的肽键具有活性。如本文中所示出的，PRSS2阻遏肿瘤微环境中Tsp-1的活性，并且因此促进癌症的进程。PRSS2阻遏Tsp-1的能力由PRSS2与LRP-1蛋白的结合结构域I的结合来介导。

因此，本公开内容的一些方面提供了与LRP1的结合结构域I结合的药剂。当与LRP1的结合结构域I结合时，此类药剂模拟鞘脂激活蛋白原或鞘脂激活蛋白原来源的肽的活性并激活Tsp-1。在一些实施方案中，药剂与LRP1蛋白的第1至172位氨基酸内的肽结合。在一些实施方案中，药剂与LRP1蛋白的第140至180位氨基酸区域内的肽结合。例如但不限于，药剂可与LRP1蛋白的以下氨基酸结合：第140至180位、第140至179位、第140至178位、第140至177位、第140至176位、第140至175位、第140至174位、第140至173位、第140至172位、第140至171位、第140至170位、第140至169位、第140至168位、第140至167位、第140至166位、第140至165位、第140至164位、第140至163位、第140至162位、第140至161位、第140至160位、第141至180位、第141至179位、第141至178位、第141至177位、第141至176位、第141至175位、第141至174位、第141至173位、第141至172位、第141至171位、第141至170位、第141至169位、第141至168位、第141至167位、第141至166位、第141至165位、第141至164位、第141至163位、第141至162位、第141至161位、第142至180位、第142至179位、第142至178位、第142至177位、第142至176位、第142至175位、第142至174位、第142至173位、第142至172位、第142至171位、第142至170位、第142至169位、第142至168位、第142至167位、第142至166位、第142至165位、第142至164位、第142至163位、第142至162位、第143至180位、第143至179位、第143至178位、第143至177位、第143至176位、第143至175位、第143至174位、第143至173位、第143至172位、第143至171位、第143至170位、第143至169位、第143至168位、第143至167位、第143至166位、第143至165位、第143至164位、第143至163位、第144至180位、第144至179位、第144至178位、第144至177位、第144至176位、第144至175位、第144至174位、第144至173位、第144至172位、第144至171位、第144至170位、第144至169位、第144至169位、第144至168位、第144至167位、第144至165位、第144至164位、第145至180位、第145至179位、第145至178位、第145至177位、第145至176位、第145至175位、第145至174位、第145至173位、第145至172位、第145至171位、第145至170位、第145至169位、第145至168位、第145至167位、第145至166位、第145至165位、第146至180位、第146至179位、第146至178位、第146至177位、第146至176位、第146至175位、第146至174位、第146至173位、第146至172位、第146至171位、第146至170位、第146至169位、第146至168位、第146至167位、第146至166位、第147至180位、第147至179位、第147至178位、第147至177位、第147至176位、第147至175位、第147至174位、第147至173位、第147至172位、第147至171位、第147至170位、第147至169位、第147至168位、第147至167位、第148至180位、第148至179位、第148至178位、第148至177位、第148至176位、第148至175位、第148至174位、第148至173位、第148至172位、第148至171位、第148至170位、第148至169位、第148至168位、第149至180位、第149至179位、第149至178位、第149至177位、第149至176位、第149至175位、第149至174位、第149至173位、第149至172位、第149至171位、第149至170位、第149至169位、第150至180位、第150至179位、第150至178位、第150至177位、第150至176位、第150至175位、第150至174位、第150至173位、第150至172位、第150至171位、第150至170位、第150至170位、第151至180位、第151至179位、第151至178位、第151至177位、第151至176位、第151至175位、第151至174位、第151至173位、第151至172位、第151至171位、第152至180位、第152至179位、第152至178位、第152至177位、第152至176位、第152至175位、第152至174位、第152至173位、第152至172位、第153至180位、第153至179位、第153至178位、第153至177位、第153至176位、第153至175位、第153至174位、第153至173位、第153至172位、第154至180位、第154至179位、第154至178位、第154至177位、第154至176位、第154至175位、第154至174位、第154至173位、第154至172位、第156至180位、第156至179位、第156至178位、第156至177位、第156至176位、第156至175位、第156至174位、第156至173位、第156至172位、第156至180位、第156至179位、第156至178位、第156至177位、第156至176位、第156至175位、第156至174位、第156至173位、第156至172位、第157至180位、第157至179位、第157至178位、第157至177位、第157至176位、第157至175位、第157至174位、第157至173位、第157至172位、第158至180位、第158至179位、第158至178位、第158至177位、第158至176位、第158至175位、第158至174位、第158至173位、第158至172位、第159至180位、第159至179位、第159至178位、第159至177位、第159至176位、第159至175位、第159至174位、第159至173位、第159至172位、第160至180位、第160至179位、第160至178位、第160至177位、第160至176位、第160至175位、第160至174位、第160至173位或第160至172位。

在一些实施方案中，药剂与LRP1蛋白的第151至172位氨基酸结合。例如，药剂可与LRP1蛋白的以下氨基酸结合：第151至172位、第151至171位、第151至170位、第151至169位、第151至168位、第151至167位、第151至166位、第151至165位、第151至164位、第151至163位、第151至162位、第151至161位、第151至160位、第152至172位、第152至171位、第152至170位、第152至169位、第152至168位、第152至167位、第152至166位、第152至165位、第152至164位、第152至163位、第152至162位、第152至161位、第153至172位、第153至171位、第153至170位、第153至169位、第153至168位、第153至167位、第153至166位、第153至165位、第153至164位、第153至163位、第153至162位、第154至172位、第154至171位、第154至170位、第154至169位、第154至168位、第154至167位、第154至166位、第154至165位、第154至164位、第154至163位、第155至172位、第155至171位、第155至170位、第155至169位、第155至168位、第155至167位、第155至166位、第155至165位、第155至164位、第156至172位、第156至171位、第156至170位、第156至169位、第156至168位、第156至167位、第156至166位、第156至165位、第156至164位、第157至172位、第157至171位、第157至170位、第157至169位、第157至168位、第157至167位、第157至166位、第158至172位、第158至171位、第158至170位、第158至169位、第158至168位、第158至167位、第159至172位、第159至171位、第159至170位、第159至169位、第159至168位、第160至172位、第160至171位、第160至170位、第160至169位、第161至172位、第161至171位、第161至170位、第162至172位、第162至171位或第163至172位。

在一些实施方案中，药剂与LRP1蛋白的结合结构域I中的第140至164位氨基酸结合。例如，药剂可与LRP1蛋白的以下氨基酸结合：第140至164位、第140至163位、第140至162位、第140至161位、第140至160位、第140至159位、第140至158位、第140至157位、第140至156位、第140至155位、第140至154位、第140至153位、第140至152位、第140至151位、第140至150位、第141至164位、第141至163位、第141至162位、第141至161位、第141至160位、第141至159位、第141至158位、第141至157位、第141至156位、第141至155位、第141至154位、第141至153位、第141至152位、第141至151位、第142至164位、第142至163位、第142至162位、第142至161位、第142至160位、第142至159位、第142至158位、第142至157位、第142至156位、第142至155位、第142至154位、第142至153位、第142至152位、第143至164位、第143至163位、第143至162位、第143至161位、第143至160位、第143至159位、第143至158位、第143至157位、第143至156位、第143至155位、第143至154位、第143至153位、第144至164位、第144至163位、第144至162位、第144至161位、第144至160位、第144至159位、第144至158位、第144至157位、第144至156位、第144至155位、第144至154位、第145至164位、第145至163位、第145至162位、第145至161位、第145至160位、第145至159位、第145至158位、第145至157位、第145至156位、第145至155位、第146至164位、第146至163位、第146至162位、第146至161位、第146至160位、第146至159位、第146至158位、第146至157位、第146至156位、第147至164位、第147至163位、第147至162位、第147至161位、第147至160位、第147至159位、第147至158位、第147至157位、第148至164位、第148至163位、第148至162位、第148至161位、第148至160位、第148至159位、第148至158位、第149至164位、第149至163位、第149至162位、第149至161位、第149至160位、第149至159位、第150至164位、第150至163位、第150至162位、第150至161位、第150至160位、第151至164位、第151至163位、第151至162位、第151至161位、第152至164位、第152至163位、第152至162位、第153至164位、第153至163位或第154至164位。

在一些实施方案中，药剂与LRP1蛋白的结合结构域I中的第151至164位氨基酸结合。例如，药剂可与LRP1蛋白的以下氨基酸结合：第151至164位、第151至163位、第151至162位、第151至161位、第151至160位、第151至159位、第151至158位、第151至157位、第151至156位、第152至164位、第152至163位、第152至162位、第152至161位、第152至160位、第152至159位、第152至158位、第152至157位、第153至164位、第153至163位、第153至162位、第153至161位、第153至160位、第153至159位、第153至158位、第154至164位、第154至163位、第154至162位、第154至161位、第154至160位、第154至159位、第155至164位、第155至163位、第155至162位、第155至161位、第155至160位、第156至164位、第156至163位、第156至162位、第156至161位、第157至164位、第157至163位、第157至162位、第158至164位、第158至163位或第159至164位。

在一些实施方案中，药剂可以是结合LRP1蛋白的结合结构域I(例如第1至172位氨基酸)的不同部分的药剂的混合物。

提供了全长LRP1、LRP1的第1至172位氨基酸、LRP-1的第140至164位氨基酸、LRP1的第151至172位氨基酸和LRP1的第151至164位氨基酸的氨基酸序列。本文中提供的氨基酸编号与全长LRP1蛋白对应。本领域技术人员能够确定被本文中所述药剂结合的肽的位置和氨基酸序列。

全长LRP1(SEQ ID NO：1，序列不包含N端20个氨基酸信号序列，其在蛋白质翻译之后被除去)

LRP1第1至172位氨基酸(SEQ ID NO：2)

LRP1第140至164位氨基酸(SEQ ID NO：18)

LRP1第151至172位氨基酸(SEQ ID NO：3)

LRP1第151至164位氨基酸(SEQ ID NO：19)

在一些实施方案中，与LRP1的结合结构域I结合的药剂是蛋白质或肽。在一些实施方案中，与LRP1的结合结构域I结合的药剂是抗体。在一些实施方案中，与LRP1的结合结构域I结合的药剂是抗体片段。在一些实施方案中，与LRP蛋白的结合结构域I(例如，第1至172位氨基酸)结合的药剂是小分子。本领域技术人员熟悉鉴定与任何蛋白质或肽结合的小分子的方法。

本文中所述的药剂(例如，抗体或小分子)当与LRP1蛋白的结合结构域I(例如，第1至172位氨基酸)结合时激活Rho-GTP酶途径。在一些实施方案中，Rho-GTP酶途径由LRP-1介导。这至少部分地基于本公开内容的以下发现：鞘脂激活蛋白原来源的肽以LRP1依赖性方式激活Rho-GTP酶途径(例如图8A)，其继而刺激Tsp-1并抑制癌症，并且鞘脂激活蛋白原来源的肽在结合结构域I中与LRP1结合(例如，图13A和13B)。

“Rho-GTP酶”是控制所有真核细胞中多种信号转导途径的分子开关。Rho GTP酶在调节肌动蛋白细胞骨架、调节细胞极性、微管动力学、膜转运途径和转录中发挥重要作用。“Rho-GTP酶途径”是指通过Rho GTP酶来调节的信号转导途径。“激活Rho-GTP酶途径”意指通过Rho GTP酶调节的传导转导途径在激活之后的强度与激活之前相比提高至少30％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或更多)。

本文中使用的“刺激”意指激活生物分子(例如，蛋白质)或提高其水平或活性。例如，本公开内容的药剂“刺激Tsp-1”意指在药剂存在的情况下Tsp1的表达水平或活性水平与药剂不存在的情况下相比提高至少30％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或更多)。

本文中还提供了抑制PRSS2的功能的药剂。“PRSS2的功能”是指其蛋白酶功能和其具有的任何其他生物学功能。已知PRSS2的生物学功能包括但不限于：(i)在患有胰腺炎患者中上调；(ii)激活卵巢肿瘤中的尿激酶原；(iii)切割类风湿性关节炎滑膜炎组织中的II型胶原蛋白三股螺旋；以及(iv)降解II型富含胶原蛋白的软骨基质。本文中描述了PRSS2与LRP1结合并阻遏Tsp-1。

在一些实施方案中，药剂可抑制PRSS2阻遏Tsp-1的能力。在一些实施方案中，药剂抑制PRSS2的表达。在一些实施方案中，药剂抑制PRSS2与LRP1(例如，与LRP1的结合结构域I)的结合。在一些实施方案中，药剂不抑制PRSS2的酶活性(蛋白酶活性)。

本文中使用的“抑制”意指阻止表达，降低蛋白质(例如，PRSS2)的水平，或降低生物分子(例如，蛋白质)的活性。例如，抑制PRSS2表达的药剂可阻止PRSS2表达，或者其可使PRSS2的水平与药剂不存在的情况下相比降低至少30％(例如，降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多)。抑制PRSS2与LRP1结合的药剂可使与LRP1结合的PRSS2的量与药剂不存的情况下相比降低(例如，降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多)。

抑制蛋白质表达的药剂是本领域中已知的。例如，蛋白质表达可通过RNA干扰(RNAi)来抑制。“RNA干扰(RNAi)”是其中RNA分子通过中和靶向mRNA分子来抑制基因表达或翻译的生物过程。在一些实施方案中，药剂是抑制PRSS2表达的微RNA(microRNA)、干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)或短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)。“微RNA”是在RNA沉默和基因表达的转录后调节中发挥作用的小的非编码RNA分子(包含约22个核苷酸)。“siRNA”是用于诱导蛋白质编码基因的短期沉默的常用RNA干扰(RNAi)工具。siRNA是合成RNA双链体，其被设计成特异性地靶向特定的mRNA以用于降解。“shRNA”是具有紧密发夹转角的人工RNA分子，其可用于通过RNA干扰(RNAi)使靶基因表达沉默。shRNA在细胞中的表达通常通过递送质粒或者通过病毒或细菌载体来完成。在一些实施方案中，抑制PRSS2表达的shRNA包含

的核苷酸序列。示例性shRNA序列并非意指是限制性的。本领域技术人员熟悉使用本文中所述的任意RNA分子进行基因沉默的方法。

在一些实施方案中，药剂抑制PRSS2与LRP1的结合。在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合抑制了PRSS2对Tsp-1的阻遏。“抑制对Tsp-1的阻遏”意指药剂使PRSS2对Tsp-1表达或活性的阻遏与药剂不存在的情况下相比降低至少30％(例如，降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多)。

在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的药剂是与PRSS2结合的蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽来源于LRP1的结合结构域I(例如，LRP1的第1至172位氨基酸)。例如，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽可包含与对应于LRP1蛋白的以下氨基酸的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列：第1至200位、第1至199位、第1至198位、第1至197位、第1至196位、第1至195位、第1至194位、第1至193位、第1至192位、第1至191位、第1至190位、第1至189位、第1至188位、第1至187位、第1至186位、第1至185位、第1至184位、第1至183位、第1至182位、第1至181位、第1至180位、第1至179位、第1至178位、第1至177位、第1至176位、第1至175位、第1至174位、第1至173位、第1至172位、第1至171位、第1至170位、第1至201位、第1至202位、第1至203位、第1至204位、第1至205位、第1至206位、第1至207位、第1至208位、第1至209位、第1至210位、第1至211位、第1至212位、第1至213位、第1至214位、第1至215位、第1至216位、第1至217位、第1至218位、第1至219位、第1至220位、第1至221位、第1至222位、第1至223位、第1至224位、第1至225位、第1至226位、第1至227位、第1至228位、第1至229位或第1至230位。在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽可包含与对应于LRP1蛋白的以下氨基酸的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更多相同的氨基酸序列：第1至200位、第1至199位、第1至198位、第1至197位、第1至196位、第1至195位、第1至194位、第1至193位、第1至192位、第1至191位、第1至190位、第1至189位、第1至188位、第1至187位、第1至186位、第1至185位、第1至184位、第1至183位、第1至182位、第1至181位、第1至180位、第1至179位、第1至178位，第1至177位、第1至176位、第1至175位、第1至174位、第1至173位、第1至172位、第1至171位、第1至170位、第1至201位、第1至202位、第1至203位、第1至204位、第1至205位、第1至206位、第1至207位、第1至208位、第1至209位、第1至210位、第1至211位、第1至212位、第1至213位、第1至214位、第1至215位、第1至216位、第1至217位、第1至218位、第1至219位、第1至220位、第1至221位、第1至222位、第1至223位、第1至224位、第1至225位、第1至226位、第1至227位、第1至228位、第1至229位或第1至230位。

在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽包含与对应于LRP1蛋白的约第140至180位氨基酸的氨基酸序列至少80％(例如，至少80％、至少90％或100％)相同的氨基酸序列。例如，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽可包含与对应于LRP1蛋白的以下氨基酸的氨基酸序列至少80％(例如至少80％、至少90％或100％)相同的氨基酸序列：第140至180位、第140至179位、第140至178位、第140至177位、第140至176位、第140至175位、第140至174位、第140至173位、第140至172位、第140至171位、第140至170位、第140至169位、第140至168位、第140至167位、第140至166位、第140至165位、第141至180位、第141至179位、第141至178位、第141至177位、第141至176位、第141至175位、第141至174位、第141至173位、第141至172位、第141至171位、第141至170位、第141至169位、第141至168位、第141至167位、第141至166位、第142至180位、第142至179位、第142至178位、第142至177位、第142至176位、第142至175位、第142至174位、第142至173位、第142至172位、第142至171位、第142至170位、第142至169位、第142至168位、第142至167位、第143至180位、第143至179位、第143至178位、第143至177位、第143至176位、第143至175位、第143至174位、第143至173位、第143至172位、第143至171位、第143至170位、第143至169位、第143至168位、第144至180位、第144至179位、第144至178位、第144至177位、第144至176位、第144至175位、第144至174位、第144至173位、第144至172位、第144至171位、第144至170位、第144至169位、第145至180位、第145至179位、第145至178位、第145至177位、第145至176位、第145至175位、第145至174位、第145至173位、第145至172位、第145至171位、第145至170位、第146至180位、第146至179位、第146至178位、第146至177位、第146至176位、第146至175位、第146至174位、第146至173位、第146至172位、第146至171位、第147至180位、第147至179位、第147至178位、第147至177位、第147至176位、第147至175位、第147至174位、第147至173位、第147至172位、第148至180位、第148至179位、第148至178位、第148至177位、第148至176位、第148至175位、第148至174位、第148至173位、第149至180位、第149至179位、第149至178位、第149至177位、第149至176位、第149至175位、第149至174位、第149至173位、第149至172位、第151至180位、第151至179位、第151至178位、第151至177位、第151至176位、第151至175位、第151至174位、第151至173位、第151至172位、第152至180位、第152至179位、第152至178位、第152至177位、第152至176位、第152至175位、第152至174位、第152至173位、第152至172位、第153至180位、第153至179位、第153至178位、第153至177位、第153至176位、第153至175位、第153至174位、第153至173位、第153至172位、第154至180位、第154至179位、第154至178位、第154至177位、第154至176位、第154至175位、第154至174位、第154至173位、第154至172位、第156至180位、第156至179位、第156至178位、第156至177位、第156至176位、第156至175位、第156至174位、第156至173位、第156至172位、第156至180位、第156至179位、第156至178位、第156至177位、第156至176位、第156至175位、第156至174位、第156至173位、第156至172位、第157至180位、第157至179位、第157至178位、第157至177位、第157至176位、第157至175位、第157至174位、第157至173位、第157至172位、第158至180位、第158至179位、第158至178位、第158至177位、第158至176位、第158至175位、第158至174位、第158至173位、第158至172位、第159至180位、第159至179位、第159至178位、第159至177位、第159至176位、第159至175位、第159至174位、第159至173位、第159至172位、第160至180位、第160至179位、第160至178位、第160至177位、第160至176位、第160至175位、第160至174位、第160至173位或第160至172位。在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽包含与对应于LRP1蛋白的第151至172位氨基酸(SEQ IDNO：3)的氨基酸序列至少80％(例如至少80％、至少90％或100％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽包含与对应于LRP1蛋白的第140至164位氨基酸(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列至少80％(例如，至少80％、至少90％或100％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽包含与对应于LRP1蛋白的第151至164位氨基酸(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列至少80％(例如至少80％、至少90％或100％)相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抑制PRSS2与LRP1的结合的蛋白质或肽是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体与其中PRSS2结合LRP-1的PRSS2区域结合。在一些实施方案中，抑制PRSS2功能的药剂是小分子。

术语“结合”是指两个实体(例如，两个蛋白质)的缔合。两个实体(例如，两个蛋白质)当它们之间的亲和力(KD)为以下时被认为是彼此结合的：＜10^-4M、＜10^-5M、＜10^-6M、＜10^-7M、＜10^-8M、＜10^-9M、＜10^-10M、＜10^-11M、或＜10^-12M。本领域技术人员熟悉如何评估两个实体(例如，两个蛋白质)的亲和力。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语是指任何尺寸、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常来说，蛋白质、肽或多肽将为至少三个氨基酸长。蛋白质、肽或多肽可指单独的蛋白质或蛋白质的集合。蛋白质、肽或多肽中的一个或更多个氨基酸可例如通过添加例如以下的化学实体来修饰：碳水化合物基团、羟基、磷酸基团(phosphate group)、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、用于缀合的接头、官能化或其他修饰等。蛋白质、肽或多肽还可以是单分子或者可以是多分子复合体。蛋白质、肽或多肽可仅为天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的、或合成的，或其任何组合。

“来源于”蛋白质的肽(例如，来源于LRP1的结合结构域I的肽)意指肽获得自蛋白质，并且具有与其对应的蛋白质的片段共有同源性的氨基酸序列。肽的氨基酸序列可与其对应的蛋白质片段的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。来源于蛋白质的肽还可包含化学修饰、氨基酸替换和/或非天然氨基酸。

“抗体”或“免疫球蛋白(Ig)”是主要由血浆细胞产生的大的Y形蛋白质，其由免疫系统用于中和外源物质(例如，病原体，例如细菌和病毒)。抗体分类为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。“抗体”和“抗体片段”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(framework region，FR)。每条VH和VL由从氨基端至羧基端以以下顺序布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

基础4链抗体单元是由两条相同的L链和两条H链构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基础异四聚体单元和被称为J链的另外的多肽组成，并且因此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个基础4链单元和J链的多价聚集体)。在IgG的情况下，4链单元一般为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链则根据H链的同种型通过一个或更多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，随后是对于每个α和γ链的三个恒定结构域(CH)，以及对于μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和性质，(例如，Basic and ClinicalImmunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章，其通过引用并入本文中)。

来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分入两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别或同种型。有五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别指定为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类别进一步分为亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分布于可变结构域的110个氨基酸跨度中。相反，V区由15至30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变的段(stretch)组成，所述相对不变的段被每个9至12个氨基酸长的称为“高变区”的极度可变的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变区连接的四个FR，所述四个FR主要采用β-片层构型，被形成环连接的三个高变区连接，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见例如Kabatet al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，其通过引用并入本文中)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应功能，例如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。

根据本公开内容使用的“抗体片段”包含抗体的抗原结合部分。抗体的抗原结合部分是指保留与抗原特异性结合之能力的抗体的一个或更多个片段。已经示出抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(例如，如在Ward et al.，(1989)Nature341：544-546中所描述，其通过引用并入本文中)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是可通过合成接头使用重组方法将其连接，所述合成接头使其能够成为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science242：423-426；以及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883，其通过引用并入本文中)。此类单链抗体也旨在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且筛选所述片段用于以与全长抗体相同的方式来应用。

在一些实施方案中，抗体片段可以是Fc片段、Fv片段或单变化Fv片段。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列确定，该区也是在某些类型的细胞上发现的通过Fc受体(Fc receptor，FcR)识别的部分。

Fv片段是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价缔合的一条重链和一条轻链可变区结构域中的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中，产生为抗原结合贡献了氨基酸残基并对抗体赋予了抗原结合特异性的六个高变环(来自H和L链各3个环)。然而，即使单个可变结构域(或者仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。

还缩写为“sFv”或“scFv”的单链Fv是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使sFv能够形成针对抗原结合的所期望结构(例如如Pluckthun在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)中所述的；Borrebaeck 1995，其通过引用并入本文中)。

抗体可以是分离的。分离的抗体是已经从其天然环境的组分中被鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些优选的实施方案中，抗体将被纯化至：(1)通过劳里法(Lowry method)确定的抗体的按重量计大于95％，并且最优选按重量计大于99％；(2)通过使用旋转杯序列分析仪(spinning cup sequenator)足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)使用考马斯蓝或优选银染色剂在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE使其均质。由于抗体天然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常来说，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体是单克隆抗体。“单克隆抗体”是从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能的可少量存在的天然存在的突变之外，包含该群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是直接针对单个抗原位点的高度特异性的。此外，与包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可被合成而不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，本发明中可用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如美国专利No.4,816,567)。单克隆抗体还可例如使用Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离，其通过引用并入本文中。

本文中的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来源于其他物种或属于其他抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可(参见美国专利No.4,816,567；以及Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中的目的嵌合抗体包括包含来源于非人灵长类(例如，旧大陆猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体是多克隆抗体。“多克隆抗体”是与抗原的多于一个免疫原性决定子反应的不同抗体分子的混合物。多克隆抗体可从哺乳动物的血液、分泌物或其他流体或者从卵中分离或纯化。多克隆抗体也可以是重组的。重组多克隆抗体是通过使用重组技术产生的多克隆抗体。重组产生的多克隆抗体通常包含高浓度的不同抗体分子，其全部或大部分(例如，多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于99％或更多)都对由多于一个表位构成的抗原显示出所期望的结合活性。

产生抗体(例如，单克隆抗体或多克隆抗体)的方法是本领域中已知的。例如，多克隆抗体可通过用所选择的变应原对动物(优选哺乳动物)进行免疫接种，随后从血液、骨髓、淋巴结或脾中分离产生抗体的B淋巴细胞来制备。或者，可从动物中分离产生抗体的细胞，并使其在体外暴露于针对其产生抗体的变应原。然后，任选地在与永生化细胞系(例如骨髓瘤)融合之后，可培养产生抗体的细胞以获得产生抗体的细胞群。在一些实施方案中，可从过敏患者的组织中分离作为起始物质的B淋巴细胞，以便产生全人源多克隆抗体。抗体可在对于人免疫球蛋白基因转基因的小鼠、大鼠、猪(pig、swine)、绵羊、牛材料或其他动物中产生，作为起始物质以便产生全人源多克隆抗体。在一些实施方案中，对于人免疫球蛋白基因转基因的小鼠或其他动物(例如如美国专利No.5,939,598中公开的)，可对动物进行免疫接种以刺激特异性抗体和产生抗体之细胞的体内产生，然后通过提取B淋巴细胞或纯化多克隆血清从动物中制备多克隆抗体。

单克隆抗体通常通过细胞培养来制备，其涉及将骨髓瘤细胞与用所期望的抗原免疫接种的小鼠脾细胞进行融合(即，杂交瘤技术)。将细胞混合物稀释，并在微滴定孔上从单亲本细胞培养长克隆。然后测定由不同克隆分泌的抗体与抗原(用例如ELISA或抗原微阵列测定等的测试)、或免疫斑点印迹结合的能力。然后选择最高生产力且稳定的克隆以备将来使用。

在一些实施方案中，本文中所述的抗体被“人源化”以在人中使用(例如，作为治疗剂)。非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是包含最小的来源于非人抗体之序列的嵌合抗体。人源化抗体是人免疫球蛋白(接纳体抗体)，其中来自接纳体的高变区的残基被来自具有所期望的抗体特异性、亲和力和能力的例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含不存在于接纳体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还任选地将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。对于另外的细节，参见Joneset al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

本文中使用的“小分子”是指可在调节生物过程中发挥作用的低分子量(例如，＜900道尔顿)有机或无机化合物的分子。小分子的非限制性实例包括脂质、单糖、第二信使、其他天然产物和代谢物，以及药物和其他异生物质。

“脂质”是指一组天然存在的分子，其包括脂肪；蜡；固醇；脂溶性维生素(例如维生素A、D、E和K)；甘油单酯；甘油二酯；甘油三酯；磷脂等。“单糖”是指不能水解以得到更简单糖的糖类(例如，葡萄糖)。单糖的非限制性实例包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)和半乳糖。“第二信使”是这样的分子，其将细胞表面上的受体(例如，从蛋白激素、生长因子等)接收到的信号传达到胞质和/或胞核中的靶分子。第二信使分子的非限制性实例包括环AMP、环GMP、肌醇三磷酸、二酰甘油和钙。“代谢物”是作为代谢的中间产物形成的分子。代谢物的非限制性实例包括乙醇、谷氨酸、天冬氨酸、5’鸟苷酸、异抗坏血酸、乙酸、乳酸、甘油、以及维生素B2。“异生物质”是在生物体中发现的通常不由生物自然产生的或预期不存在于生物体中的外来化学物质。异生物质的非限制性实例包括药物、抗生素、致癌物、环境污染物、食品添加剂、碳氢化合物、以及农药。

药剂(例如，与LRP-1的结合结构域I结合和/或刺激Tsp-1的药剂，或者抑制PRSS2抑制Tsp-1之能力的药剂)可被配制在药物组合物中。在一些实施方案中，药物组合物还包含可药用载体。本文中使用的术语“可药用载体”意指适合于向对象(例如人)施用的一种或更多种相容的固体或流体填充剂、稀释剂或包封物质。从与制剂的其他成分相容并且对患者的组织无害(例如，生理学上相容、无菌、生理pH等)的意义上来说，可药用载体是“可接受的”。术语“载体”表示与活性成分组合以有利于施用的天然或合成的有机或无机成分。药物组合物的组分还能够以使得不存在将会显著损害所期望的药物效力的相互作用的方式与本公开内容的分子以及彼此共混合。可用作可药用载体的物质的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可豆脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清组分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，例如乙醇；以及(23)药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。制剂中还可存在润湿剂、着色剂、脱模剂(release agent)、包衣剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

药物组合物可方便地以单位剂量形式存在，并且可通过药学领域中公知的任何方法来制备。术语“单位剂量”当关于本公开内容的药物组合物使用时，是指适合作为用于对象的单一剂量的物理上离散的单元，每个单元包含与所需稀释剂(即，载体或载剂)缔合的经计算产生所期望治疗作用的预定量活性物质。

药物组合物的制剂可取决于施用的途径。适合于肠胃外施用或瘤内、瘤周围、病灶内或病灶周围施用的可注射制剂包括例如无菌可注射水性或油性混悬剂，并且可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳剂，例如如1，3-丙二醇或1，3-丁二醇中的溶液剂。在可用的载剂和溶剂中，可使用水、林格液(U.S.P.)和等张氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或助悬介质。出于这个目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸(例如油酸)可用于可注射剂的制剂中。可对可注射制剂进行灭菌，例如，通过细菌保留过滤器进行过滤，或者通过引入无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述无菌固体组合物在使用之前可溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

对于表面施用(topical administration)，药物组合物可被配制成如本领域中通常已知的软膏剂、油膏剂(salve)、凝胶剂、或乳膏剂。表面施用可利用本领域公知的经皮递送系统。一个实例是皮肤贴剂。

适合于经口施用的组合物可以以各自包含预定量抗炎剂的离散单元(例如胶囊剂、片剂、锭剂)存在。其他组合物包括水性液体或非水性液体中的混悬剂，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。

其他递送系统可包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统。此类系统可避免抗炎剂的重复施用，提高对象和医师的便利性。许多类型的释放递送系统是可用的并且为本领域普通技术人员所知悉。它们包括基于聚合物的系统，例如聚(丙交酯-乙交酯)、草酸酯共聚物(copolyoxalate)、聚己内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。包含药物的前述聚合物的微囊剂描述于例如美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，它们是：脂质，其包括固醇(例如胆固醇、胆固醇酯)和脂肪酸或中性脂肪(例如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)；水凝胶释放系统；sylastic系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规黏合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中抗炎剂以在基质中的形式被包含，例如描述于美国专利No.4,452,775、No.4,667,014、No.4,748,034和No.5,239,660中的那些，以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透，例如美国专利No.3,832,253和No.3,854,480中所述。另外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合于植入。

长期持续释放植入物的使用可特别地适合于治疗慢性病症。本文中使用的长期释放意指植入物被构建和布置成递送治疗水平的活性成分持续至少30天、并且优选60天。长期持续释放植入物是本领域普通技术人员公知的并且包括上述的一些释放系统。

在一些实施方案中，用于治疗性施用的药物组合物必须是无菌的。无菌通过无菌过滤膜(例如，0.2微米膜)通过过滤来容易地实现。或者，可使用防腐剂以防止微生物的生长或作用。多种防腐剂是公知的，并且包括例如苯酚和抗坏血酸。通常将环Psap肽和/或药物组合物以冻干形式或作为水性溶液(如果其对热和氧化变性高度稳定)储存。制剂的pH通常将约为6至8，尽管更高或更低的pH值在某些情况下也可适合。

本公开内容的另一些方面提供了使用本文中所述的药剂和药物组合物治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的刺激Tsp-1的药剂。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的对象施用如本文中所述的与LRP-1的结合结构域I结合的药剂(例如，靶向LRP1的第151至172位氨基酸的抗体)。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的对象施用抑制PRSS2阻遏Tsp-1之能力的药剂。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的抑制PRSS2(例如，PRSS2阻遏Tsp-1之能力)的第一药剂和有效量的与LRP1的结合结构域I结合的第二药剂。当施用多于一种药剂时，它们可同时或依次施用。本领域技术人员(例如，医师)能够确定施用的方式。

癌症的“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括但不限于防止、降低、或停止癌症的发展、降低或消除癌症的症状、阻抑或抑制癌症的生长、防止或降低现有癌症的转移和/或侵袭、促进或诱导癌症的消退、抑制或阻抑癌细胞的增殖、降低血管生成和/或提高凋亡癌细胞的量。

“有效量”是足以提供医学上所期望结果(例如癌症的治疗)的药剂的剂量。有效量将随着以下而变化：所治疗的特定疾病或障碍、所治疗的对象的年龄和身体状况、病症的严重程度、治疗的持续时间、任何同时治疗的性质、施用的具体途径以及健康实践者的知识和专门知识(expertise)中的类似因素。为了向对象(例如人)施用，通常可使用约0.001、0.01、0.1、或1mg/kg多至50、100、150、或500mg/kg或更多的剂量。

在一些实施方案中，有效量是不引起对象毒性的药剂剂量。在一些实施方案中，有效量是引起对象降低的毒性的药剂剂量。用于测量毒性的方法(例如，肝、脾和/或肾的活检/组织学；用于肝毒性的丙氨酸转移酶、碱性磷酸酶和胆红素测定；以及用于肾毒性的肌酐水平)是本领域公知的。

本文中所述的药剂和药物组合物可被配制成多种方式的施用，包括全身性的、表面的或局部的施用。多种施用途径是可用的。所选择的特定方式将取决于待治疗的癌症的类型和针对治疗效力所需的剂量。一般而言，本公开内容的方法可使用医学上可接受的任何施用方式来实施，这意味着在不引起临床上不可接受的不良作用的情况下产生活性化合物的有效水平的任何方式。此类施用方式包括但不限于经口、经直肠、表面、经鼻、皮内、或肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内或输注。本文中所述的药物组合物还适合通过瘤内、瘤周围、病灶内、气管内、脑室内、腹膜内或病灶周围途径施用，以发挥局部的和全身性的作用。

技术和制剂一般可见于Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Pharmaceutical Press；第22版和其他类似的参考文献。当施用时，Psap肽可以以可药用量和以可药用组合物施用。本文中还描述了药物组合物和可药用载体。此类制剂可常规地包含盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、以及任选的其他治疗剂。当在药物中使用时，盐应当是可药用的，但是非可药用盐可便利地用于制备其可药用盐，并且不排除在本公开内容的范围之外。此类药理学上可接受的盐和可药用盐包括但不限于从以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，可药用盐可制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。

在一些实施方案中，用所述药剂或药物组合物治疗癌症可与其他治疗(例如化学治疗剂、辐射、细胞抑制剂、抗VEGF剂、抗血管生成因子、p53再活化剂和/或手术)组合。

对象应意指人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类(例如，猴)。本公开内容的方法可用于治疗有此需要的对象。有此需要的对象可以是具有发生癌症的风险(即，通过遗传测试)的对象或患有癌症的对象。

患有癌症的对象可使用本领域中已知的任何方法(例如，血液测试、组织学、CT扫描、X射线、MRI、体格检查(physical exam)、细胞遗传学分析、尿液分析或遗传测试)来鉴定。怀疑患有癌症的对象可能显示出疾病的一种或更多种症状。癌症的体征和症状是本领域普通技术人员公知的。一些示例性实验室测试包括但不限于对例如以下癌症生物标志物的测试：针对乳腺癌的癌抗原(cancer antigen，CA)15-3、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)和HER-2；针对宫颈癌的人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)E6和E7癌蛋白；针对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、AFP级分L3、P4/5、以及+II带，以及超声检查(ultrasonography)；针对前列腺癌的前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)；以及针对卵巢癌和HCC的血清CA-125。

癌症可以是良性或恶性的，并且其可以已转移或可以未转移。本文中考虑了任何类型的癌症，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、癌、转移性癌、肉瘤、腺瘤、神经系统癌症和泌尿生殖系统癌症。示例性的癌症类型包括但不限于：成人和小儿急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、胆道癌、骨肉瘤、纤维组织细胞瘤、脑癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、恶性胶质瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、下丘脑胶质瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、类癌瘤、不明来源的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性和髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏家族肿瘤(Ewingfamily tumor)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、肾细胞癌、喉癌、唇癌与口腔癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinema)、恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、恶性间皮瘤、鳞状颈癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、慢性骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤、垂体癌、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征(Sezarysyndrome)、非黑素瘤皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、幕上原始神经外胚瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、绒毛膜癌、血液系统肿瘤、成人T细胞白血病、淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、间质肿瘤和生殖细胞肿瘤、或肾母细胞瘤(Wilms tumor)。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤或卵巢癌。

实施例

癌症进展至转移阶段是其致死性的主要贡献因素。为了使肿瘤形成致命性转移，其必须进入脉管系统或淋巴系统(内渗)，在运输期间存活，离开血管或淋巴管(外渗)，并在转移部位增殖[1]。在该过程中，肿瘤与其微环境之间的异型信号传导(heterotypicsignaling)可通过调节介导肿瘤生长、血管生成和免疫应答的因子的产生和分泌来影响肿瘤生长。通过功能蛋白质组学筛选鉴定了两种蛋白质鞘脂激活蛋白原和PRSS2，所述筛选设计成鉴定在微环境中调节Tsp-1的分泌蛋白[2]。鞘脂激活蛋白原优先由弱转移性肿瘤表达并刺激肿瘤微环境中的Tsp-1。相反地，PRSS2优先由高度转移性细胞表达并抑制肿瘤微环境中的Tsp-1表达。Tsp-1特别通过以下多方式的活性来抑制肿瘤的生长和进展：(1)其是广泛作用的抗血管生成因子，(2)其具有针对表达CD36之肿瘤的直接抗肿瘤活性，以及(3)其通过与CD47结合来促进巨噬细胞吞噬和T细胞活化[3-5]。已确定鞘脂激活蛋白原的Tsp-1刺激活性和PRSS2的Tsp-1阻遏活性二者是通过与LRP1结合而介导的。本文中提供了模拟鞘脂激活蛋白原的Tsp-1刺激活性并阻断PRSS2的Tsp-1阻遏活性的抗体。

当前对癌症患者的护理标准由广泛作用的细胞毒剂(化学治疗)、辐射以及靶向特定分泌蛋白、细胞表面受体或激酶的定向治疗剂组成。历史上，已存在靶向肿瘤微环境的两类治疗剂，抗血管生成药(其仅限于抗VEGF治疗)和免疫调节药。靶向微环境的治疗的主要缺点之一在于其不具有直接抗肿瘤活性，并且因此其作为单药治疗的效力受到限制。相反地，具有直接抗肿瘤活性的靶向治疗和化学治疗的主要缺点在于除了意外的有害副作用之外，患者对药物产生了抗性。正因为如此，已使用涉及靶向治疗/化学治疗和抗血管生成/免疫调节药之组合的治疗策略，其目的是首先通过抗肿瘤药物的活性使肿瘤缩小，并随后通过靶向肿瘤微环境的治疗的活性使肿瘤陷入困境(at bay)。对特异性地靶向肿瘤微环境以提高具有强效抗肿瘤、抗血管生成和免疫调节活性的蛋白Tsp-1表达的抗体的开发将具有巨大的治疗潜力。

鞘脂激活蛋白原首先被鉴定为肿瘤转移的新的抑制剂，并且这样的抑制被记载是通过刺激肿瘤微环境中的p53并随后刺激Tsp-1来实现的[2]。已鉴定了来自具有强效抗肿瘤和抗转移活性的鞘脂激活蛋白原的5-氨基酸环肽。在目的1中，将优化psap肽的结合亲和力和活性。在目的2中，经优化的psap肽将被开发成治疗剂，并在原发和转移癌症的原位异种移植、同基因和自发遗传模型中进行测试。在目的2中，还将筛选用于CD36、CD47、Tsp-1和psap表达的患者肿瘤组织样品，以扩大psap肽的潜在适应证。对于目的2，将与以下进行合作：Dana Farber Cancer Institute and Harvard Medical School的Drapkin实验室、以及Center for Cancer Biomarkers at the University of Bergen，Norway的Akslen实验室、以及Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School的Kimmelman实验室。

psap肽抑制原发性胰腺肿瘤的生长和转移

已鉴定了刺激骨髓来源髓样细胞的来源于鞘脂激活蛋白原的4-氨基酸肽，该细胞通常被募集来刺激肿瘤生长以表达强效抗血管生成和抗肿瘤发生蛋白Tsp-1。

已示出鞘脂激活蛋白原肽通过刺激肿瘤微环境中骨髓来源细胞中的Tsp-1来抑制转移[6]。正因为如此，测试了以下假设：psap将在治疗转移性胰腺癌中具有效力，所述转移性胰腺癌是其中微环境包含大部分肿瘤团块的癌症[7]。因此，将表达萤火虫萤光素酶的1×10⁶个AsPc1人胰腺癌细胞注射到SCID小鼠的胰腺中。允许肿瘤生长25天，这时所有肿瘤的萤光素酶强度大于1×10⁸。然后用psap肽以20mg/kg和40mg/kg QD的剂量开始处理。在处理21天之后处死所有小鼠，此时经对照(载剂)处理的小鼠是濒死的。如图1和2A中所示，psap肽能够显著地抑制原发肿瘤生长。更显著的是，在检查肝和脾(一般对于细胞系和对于胰腺癌的两个最常见的转移部位)之后，均未观察到任何转移(图2B)。

多种人癌细胞表达CD36

由于Tsp-1通过与细胞表面受体CD36结合而引发其促凋亡活性，因此检查了人癌细胞系是否表达该受体。筛选了来源于患者腹水的一组原发性人卵巢癌细胞以及代表主要亚型(ER⁺、HER2⁺和三阴性)的三种乳腺癌细胞系。惊人地，发现所有细胞均表达易于检测水平的CD36(图3A和3B)。根据该观察，预测psap肽通过Tsp-1与CD36结合来诱导卵巢癌细胞凋亡以及通过抑制血管生成而具有针对卵巢癌的显著效力。该假设将在目的1中进行测试。

卵巢癌将骨髓来源髓样细胞募集至为肽之靶标的腹水。

已示出鞘脂激活蛋白原和治疗性肽的活性由Gr1⁺/Cd11b⁺单核细胞介导[6]。因此，通过FACS分析检查来自图4中处理小鼠的腹水液(ascites fluid)中Gr1⁺/CD11b⁺细胞的存在。观察到经对照处理的小鼠的腹膜液(peritoneal fluid)包含＞70％的Gr1⁺/Cd11b⁺细胞，而通过肽处理“治愈”的小鼠腹腔中的流体包含～30％的Gr1⁺/Cd11b⁺细胞(图5)。这指示卵巢肿瘤细胞募集这些BM来源细胞。

LRP1介导鞘脂激活蛋白原对Tsp-1的刺激

已示出低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)可介导鞘脂激活蛋白原的摄取[8]。因此，为了确定鞘脂激活蛋白原如何能够刺激肿瘤相关成纤维细胞中Tsp-1和p53的表达，在存在和不存在受体相关蛋白(RAP)的情况下，用PC3条件培养基处理前列腺成纤维细胞，其中所述受体相关蛋白是竞争性抑制剂或LRP1结合剂。western印迹分析揭示在存在RAP的情况下，PC3条件培养基不再刺激Tsp-1(图6A至6B)。还示出LRP1的连接释放了胞内Ca²⁺储存[9]。为了确定鞘脂激活蛋白原介导的对Tsp-1的刺激是否利用了该途径，在存在和不存在PKC抑制剂

6983的情况下，用来自PC3细胞的CM处理成纤维细胞。通过western印迹分析观察到，PKC的抑制消除了对Tsp-1和p53的刺激。因此，认为鞘脂激活蛋白原通过与LRP1结合发挥作用。

此外，用两个独立的shRNA序列敲低肺成纤维细胞中的LRP1表达，并检查对Tsp-1表达的影响。发现在不存在刺激的情况下敲低LRP1对Tsp-1表达没有影响(图7)。与获得自用RAP处理细胞的结果一致，当用来自弱转移性PC3细胞系或转移性PC3-LIN4细胞系的条件培养基处理肺成纤维细胞时，未观察到对Tsp-1的刺激，正如用空载体转导的细胞中观察到的那样(图7)。惊人地，使LRP1沉默也消除了LN4条件培养基对LRP1的阻遏，表明该活性也由来自LRP1下游的信号传导途径介导(图7)。

为了描述通过鞘脂激活蛋白原的从LRP1导致Tsp-1刺激的途径，选择了已被报道的在不同条件下通过LRP1刺激的以下两种途径以进行检查：Rho和Rac[10]。观察到所述肽以LRP1依赖性方式刺激Tsp-1，这是由于以剂量依赖性方式与RAP共处理阻断了对Tsp-1的刺激(图8A)。此外，在Rho激酶抑制剂Y27632存在的情况下，当用所述肽处理肺成纤维细胞时对Tsp-1的刺激完全消除(图8B)。

然后将注意力转向PC3M-LN4细胞阻遏肿瘤微环境中Tsp-1的机制。为此，将LN4条件培养基(CM)用具有提高浓度的NaCl的Cu²⁺/肝素琼脂糖柱进行分级。将洗脱的级分用于处理肺成纤维细胞，并通过western印迹分析Tsp-1诱导。发现在0.9至1.0M NaCl之间洗脱的级分能够刺激Tsp-1(图9)。通过串联液相色谱/质谱法(liquid chromatography/massspectrometry，LC/MS)分析洗脱的级分中的蛋白质含量，鉴定出存在于LN4 CM的活性级分中，但不存在于邻近的级分中或来自PC3 CM的用相同NaCl浓度洗脱的级分中的蛋白质。鉴定的蛋白质是丝氨酸蛋白酶PRSS2。通过在PC3和LN4细胞中进行PRSS2表达的western印迹来验证LC/MS分析，其揭示了PRSS2在LN4细胞中以显著较高的水平表达(图10)。然后在存在和不存在丝氨酸蛋白酶抑制剂STI(其完全消除了对Tsp-1的抑制)的情况下，通过用LN4 CM处理肺成纤维细胞验证了PRSS2介导对Tsp-1的阻遏(图11)。最后，试图描来发源于LRP1的介导PRSS2诱导的对Tsp-1之阻遏的信号传导途径。推断如果psap通过LRP1介导的Rho途径的激活来刺激Tsp-1，则PRSS2可能通过LRP1介导的Rac途径的激活来诱导对Tsp-1的阻遏，因为这两种途径是拮抗的。在存在和不存在Racl抑制剂的情况下，通过用LN4 CM处理WI38细胞，观察到对Tsp-1的阻遏减轻并且Tsp-1水平恢复至基础水平(图12)。虽然STI能够阻断由PRSS2介导的对Tsp-1的阻遏，但由于其缺乏对PRSS2的特异性和抑制胰蛋白酶家族所有成员的能力，其并不代表可行的治疗策略。出于相同的原因，由于丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶家族的活性位点的保守性质，设计成抑制PRSS2的化学化合物也将缺乏特异性。因此，认为设计成与PRSS2结合的抗体将是强效的抗癌治疗剂，所述抗体对PRSS2阻遏Tsp-1的能力进行阻断。

最后，试图确定通过鞘脂激活蛋白原肽刺激Tsp-1所需的LRPl受体的最小区域。对于这些研究，利用了包含与跨膜结构域和胞内结构域融合的胞外结构域不同区域的LRP1的突变体(图13A)[11]。然后，用这些构建体转染293T细胞，所述293T细胞表达非常低水平的Tsp-1并且不受肽刺激而产生Tsp-1(图13B)。发现环psap肽能够刺激用miniLRP1a和miniLRP1b转染的293T细胞中的Tsp-1，但不能刺激用其他miniLRP1构建体转染的细胞中的Tsp-1。惊人地，miniLRP1a和miniLRP1b二者是仅有的包含N端和前两个β-螺旋桨结构域的突变体。基于这些结果，认为鞘脂激活蛋白原和psap肽通过与LRP1的该区域结合来刺激Tsp-1表达。认为与LRP1的该区域结合的抗体模拟了肽的活性并且可能以甚至更大的亲和力结合并具有改善的药动学(PK)和药效学(PD)性质。

与PSAP和PRSS2二者结合的LRP1肽

为了映射与鞘脂激活蛋白原(prosaposin，PSAP)和/或PRSS2结合的LRP1上的结合位点，测试了来源于LRP1结合结构域I的肽(SEQ ID NO：3和7至18)与PSAP或PRSS2免疫共沉淀的能力。结果表明肽12(对应于LRP1的第140至164位氨基酸)和肽13(对应于LRP1的第151至172位氨基酸)与PRSS2和PSAP二者结合(图16A至16B)。肽12和肽13在对应于LRP1的第151至164位氨基酸的区域中重叠，表明PRSS2和PASP的结合位点在LRP1的该区域内。

shRNA序列：

PRSS2

TRCN0000046736(Sigma ID)

序列：

LRP1

1：TRCN0000257134(Sigma ID)

序列：

2：TRCN0000257100(Sigma ID)

序列：

LRP1结合结构域I和肽序列

肽1(LRP1的第1至24位氨基酸)：

肽2(LRP1的第15至39位氨基酸)：

肽3(LRP1的第25至49位氨基酸)：

肽4(LRP1的第40至64位氨基酸)：

肽5(LRP1的第50至74位氨基酸)：

肽6(LRP1的第65至89位氨基酸)：

肽7(LRP1的第75至99位氨基酸)：

肽8(LRP1的第90至114位氨基酸)：

肽9(LRP1的第100至126位氨基酸)：

肽10(LRP1的第115至139位氨基酸)：

肽11(LRP1的第125至149位氨基酸)：

肽12(LRP1的第140至164位氨基酸，与PRSS2和鞘脂激活蛋白原二者结合)：

肽13(LRP1的第151至172位氨基酸，与PRSS2和鞘脂激活蛋白原二者结合)：

PRSS2活性位点中的突变不影响Tsp-1的阻遏

使用QuickChange诱变试剂盒对pCMVSPORT6.1中的野生型PRSS2进行突变：G191R、S200A、S200T和S200C(以下提供了核苷酸序列)。使用FuGene转染试剂将野生型和突变体构建体转染到293T细胞中。在48小时之后，收获包含突变体蛋白质的条件培养基并用于处理WI-38成纤维细胞过夜。在处理之后，收获细胞，裂解并通过Bio-Rad蛋白测定来确定蛋白质浓度。将等同水平的蛋白质添加至每个孔，并在聚丙烯酰胺SDS凝胶上运行。然后使用标准方案利用针对Tsp-1和b-肌动蛋白的抗体进行western印迹。

发现PRSS2阻遏Tsp-1的能力不受影响，表明LRP1的结合位点不在活性位点中，并且针对该区域的抗体不影响该酶的蛋白酶活性(图17)。

PRSS2蛋白和核苷酸序列

PRSS2蛋白(活性位点：194-205 200S，G191R失活突变)

PRSS2核苷酸WT(活性位点：194-205 200S，G191R失活突变)

PRSS2 G191R核苷酸(活性位点：194-205 200S，G191R失活突变)

PRSS2 S200A(活性位点：194-205 200A)

PRSS2 S200T核苷酸(活性位点：194-205 200T)

PRSS2 S200C核苷酸(活性位点：194-205 200C)

参考文献

1.Fidler，I.J.，The pathogenesis of cancer metastasis：the′seed andsoil′hypothesis revisited.Nat Rev Cancer，2003.3(6)：p.453-8.

2.Kang，S.Y.，et al.，Prosaposin inhibits tumor metastasis via paracrineand endocrine stimulation of stromal p53 and Tsp-1.Proc Natl Acad Sci USA，2009.106(29)：p.12115-20.

3.Lamy，L.，et al.，Interactions between CD47 and thrombospondin reduceinflammation.Joumal of Immunology(Baltimore，Md.：1950)，2007.178(9)：p.5930-9.

4.Salajegheh，M.，et al.，Upregulation of thrombospondin-1(TSP-1)and itsbinding partners，CD36 and CD47，in sporadic inclusion body myositis.JNeuroimmunol，2007.187(1-2)：p.166-74.

5.Vallejo，A.N.，et al.，Central role of thrombospondin-1 in theactivation and clonal expansion of in flammatory T cells.Journal ofImmunology(Baltimore，Md.：1950)，2000.164(6)：p.2947-54.

6.Catena，R.，et al.，Bone marrow-derived Grl+cells can generate ametastasis-resistant microenvironment via induced secretion ofthrombospondin-1.Cancer Discoy，2013.3(5)：p.578-89.

7.Feig，C.，et al.，The pamcreas cancer microenvironment.Clin CancerRes，2012.18(16)：p.4266-76.

8.Hiesberger，T.，et al.，Cellular uptake of saposin(SAP)precursor andlysosomal delivery by the low density lipoprotein receptor-related protein(LRP).Embo J，1998.17(16)：p.4617-25.

9.Misra，U.K.，G.Gawdi，and S.V.Pizzo，Ligation of low-densitylipoprotein receptor-related protein with antibodies elevates intracellularcalcium and inositol 1，4，5-trisphosphate in macrophages.Arch Biochem Biophys，1999.372(2)：p.238-47.

10.Mantuano，E.，et al.，Low density lipoprotein receptor-relatedprotein(LRP1) regulates Racl and RhoA reciprocally to control Schwann celladhesion and migration.J Biol Chem，2010.285(19)：p.14259-66.

11.Mikhailenko.，I.，et al.，Recognition of alpha 2-macroglobulin by thelow density lipoprotein receptor-related protein requires the cooperation oftwo ligand binding cluster regions.J Biol Chem，2001.276(42)：p.39484-91.

无需进一步阐述，认为本领域技术人员可基于以上描述以其最大程度利用本公开内容。因此，具体的实施方案应被解释为仅是举例说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。本文中引用的所有出版物出于本文中引用的目的或主题通过引用并入。

除非明确指出相反，否则本文中在说明书中和权利要求书中所使用的没有数量词修饰的名词应被理解为意指“至少一个/种”。

根据以上描述，本领域技术人员可容易地确定本公开内容的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本公开内容进行多种改变和修改以使其适应多种用途和状况。因此，其他实施方案也在权利要求书之内。

Claims (33)

1.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的结合结构域I结合的药剂。

2.权利要求1所述的方法，其中LRP1的结合结构域I包含LRP1的第1至172位氨基酸。

3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述药剂是蛋白质或肽。

4.权利要求3所述的方法，其中所述药剂是抗体。

5.权利要求4所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。

6.权利要求5所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

7.权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述抗体与LRP1的结合结构域I中的第151至172位氨基酸(SEQ ID NO：3)结合。

8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述抗体与LRP1的结合结构域I中的第140至164位氨基酸(SEQ ID NO：18)结合。

9.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述抗体与LRP1的结合结构域I中的第151至164位氨基酸(SEQ ID NO：19)结合。

10.权利要求1所述的方法，其中所述药剂是小分子。

11.权利要求10所述的方法，其中所述小分子选自：脂质、单糖、第二信使、代谢物和异生物质。

12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述药剂与LRP1的结合结构域I的结合激活Rho-GTP酶途径。

13.权利要求12所述的方法，其中所述Rho途径是LRP-1介导的Rho-GTP酶途径。

14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述药剂与LRP1的结合结构域I的结合刺激血小板应答蛋白1(Tsp-1)。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述药剂经口、肠胃外、肌内、鼻内、气管内、脑室内、静脉内或腹膜内施用。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性的。

17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述癌症是：胆道癌；膀胱癌；脑癌；胶质母细胞瘤；髓母细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；血液系统肿瘤；急性淋巴细胞性和髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病；淋巴瘤；上皮内肿瘤；鲍恩病；佩吉特病；肝癌；肺癌；淋巴瘤；霍奇金病；淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；鳞状细胞癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；脂肪肉瘤；纤维肉瘤；骨肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；间质肿瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌；以及肾癌。

18.权利要求17所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、或胰腺癌。

19.抗体，其结合低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的结合结构域I。

20.权利要求19所述的抗体，其中LRP-1的结合结构域I包含LRP-1的第1至172位氨基酸。

21.权利要求19或权利要求20所述的抗体，其中所述抗体与LRP1的结合结构域I中的第151至172位氨基酸(SEQ ID NO：3)结合。

22.权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述抗体与LRP1的结合结构域I中的第140至164位氨基酸(SEQ ID NO：18)结合。

23.权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述抗体与LRP1的结合结构域I中的第151至164位氨基酸(SEQ ID NO：19)结合。

24.权利要求19至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。

25.权利要求19至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

26.权利要求19至25中任一项所述的抗体，其中所述抗体刺激Tsp-1。

27.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的刺激血小板应答蛋白1(Tsp-1)的药剂。

28.权利要求27所述的方法，其中所述药剂抑制丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)阻遏Tsp-1的能力。

29.权利要求27所述的方法，其中所述药剂与LRP1的结合结构域I结合。

30.权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制PRSS2与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的结合。

31.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的抑制丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)之功能的第一药剂，以及有效量的与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的结合结构域I结合的第二药剂。

32.权利要求31所述的方法，其中所述第一药剂与所述第二药剂同时施用。

33.权利要求31所述的方法，其中所述第一药剂与所述第二药剂依次施用。

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