KR102264305B1 - 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 세포에서 일차섬모발생에 직접적으로 관여하는, 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정할 수 있는 신규한 항체 및 이의 용도를 제공하며, 또한 본 발명은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정함으로써 일차섬모에 의한 암 세포의 항암제 내성을 진단하거나, 항암제 내성 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있어 암의 진단 및 치료에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{PHOSPHORYLATED BETA-CATENIN SPECIFIC ANTIBODY AND USES THEREOF}
본 발명은 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
일차섬모(primary cilium)은 대부분의 포유류 상피 세포와 기질 세포에 존재하는 비운동성, 미세소관 기반의 세포성 안테나 유사 구조이다. 운동성 섬모와 달리, 운동성이 없는 일차섬모는 세포주기 진행 동안 동적조립 및 분해주기를 수행한다. 일차섬모는 세포주기의 정지 단계 (G0 단계) 동안 모중심소체(mother centrioles) 중심에서 조립되며 유사 분열에 들어가기 전에 빠르게 분해된다. 그러나, 일차섬모의 형성이 세포 신호 경로에 의해 어떻게 조절되는지는 여전히 잘 알려져 있지 않다. 반대로, 세포 신호 전달 경로에서 일차섬모의 중요한 역할은 많은 연구를 통해 확인되고 있다. 특히, 일차섬모는 조직 생성에 필요한 Hedgehog (Hh) 신호 전달 경로의 형질 도입에 필수적이다. 이 과정에서 Hh 신호 전달은 일차섬모에 의해 감지되고 Hh 신호 전달 성분은 섬모 내외부에서 운동 단백질에 의해 전달된다. 이러한 수송 기전의 결핍은 섬모이상증(ciliopathy) 및 암으로 이어진다.
일차섬모가 인간 유전자 질환을 유도하는데 중요하지만, 섬모이상증의 분자적 기초는 알려져 있지 않다. 또한, 인간 암과 일차섬모 사이의 밀접한 상관 관계가 확인된 바 있지만, 일차섬모와 관련된 종양 형성의 정확한 메커니즘은 연구되지 않았다.
Wnt 신호전달은 발달과정 동안 세포 이동, 극성 및 분화와 같은 다양한 세포의 운명을 제어하고, 성인 조직의 항상성을 조절하는 주요 신호전달 경로이다. 따라서, Wnt 신호전달의 비정상적인 조절은 발달장애 및 암을 포함한 다양한 인간 질병을 초래한다. 표준경로(canonical pathway)는 β-카테닌 안정화를 통해 다양한 유전자의 발현을 조절하고, 비표준경로(noncanonical pathway)는 세포 극성 및 운명 결정과 같은 많은 세포 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. 비록, 일차섬모와 Wnt 신호 사이의 관계가 고려된 바 있고, 일차섬모에 의한 표준경로의 Wnt 신호 억제가 확인된 바 있지만, Wnt-매개 일차섬모발생(primary ciliogenesis)의 명확한 증거는 확인된 바 없다(Nat. Cell Biol., 13 (2011), pp. 700-707.)
베타-카테닌은 초파리에서 아르마딜로의 포유류 상동체이며 배아발달, 조직 항상성 및 세포재생에서 다양한 역할을 한다. 역사적으로, 베타-카테닌은 Wnt 신호전달 경로의 주요 성분으로서, 그리고 E-카드헤린 관련 세포 부착 분자로서의 기능을 포함하는 두 번의 구별된 기능 때문에 두 차례 발견되었다. 베타 -카테닌은 표준 Wnt 신호전달 경로에서 핵심 분자이며, 다양한 키나아제에 의해 다양한 인산화 부위가 생성된다. 현재까지 20 개가 넘는 베타 -카테닌 인산화 부위가 확인되었지만, 아직 일차섬모발생과의 연관성은 확인된 바 없다.
이에, 본 발명자는 Wnt 신호전달과 일차섬모발생과의 연관성을 밝히기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 표준적인 Wnt 리간드인 Wnt3a가 일차섬모발생을 유도하며, 그 과정에서 베타-카테닌의 특정 부위에서 인산화가 증가됨을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Wnt3a의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 또는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 정상 대조군보다 높을 경우 항암제 내성으로 진단하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 시험물질을 베타-카테닌(β-catenin)을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 베타-카테닌의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Wnt3a의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 또는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 정상 대조군보다 높을 경우 항암제 내성으로 진단하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 시험물질을 베타-카테닌(β-catenin)을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 베타-카테닌의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 용어 "베타-카테닌(β-catenin)"이란, 세포간의 중요한 접착분자인 카드헤린의 세포질영역과 결합하는 약 94kDa의 크기를 갖는 단백질을 의미하는데, 카드헤린 및 α-카테닌과 결합하여 복합체를 형성한다. 한편, 상기 베타-카테닌은 카드헤린과 결합하는 능력 이외에도 wnt 매개 신호전달 경로의 일부를 담당하는데, 상기 wnt 매개 신호전달은 배아발생과정과 성인조직의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 수행하고, 상기 신호전달에 이상이 생긴 경우 암을 비롯한 다양한 질병이 발병된다고 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 베타-카테닌은 wnt, GSK-3β, APC, β-catenin 및 β-catenin:TCF로 구성된 wnt 매개 신호전달 경로의 구성요소로서 간주될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 베타-카테닌은 CTNNB1, CTNNB, MRD19, armadillo, catenin beta 1, EVR7, NEDSDV 등으로 불리기도 하며, 인간에서는 3번 염색체 상(3p22)의 CTNNB1 유전자에 의하 암호화되어 있다. 베타-카테닌은 781개의 아미노산(aa)으로 이루어진 단백질로 발견되며, 이는 NCBI reference sequence NP_001091679, NP_001091680, NP_001159374, NP_031640 등으로 공지되어 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[서열번호 1]
Figure 112020061495203-pat00001
본 발명의 일 실시예에 따르면, 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌은 세포의 일차섬모발생 과정에서 필수적으로 관여하며, 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화가 증가한 세포에서 세포의 섬모화 비율, 섬모의 길이 및 섬모의 두께가 모두 현저히 증가하는 것으로 확인된 바 있다. 세포에서 일차섬모가 비정상적으로 발달하는 섬모 이상증(ciliopathy)이 다양한 질환의 발병과 밀접하게 관련되어 있고, 암의 항암제 내성에도 영향을 미치기 때문에 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화를 검출할 수 있는 본 발명의 항체는 세포의 일차섬모와 관련된 다양한 기초연구, 약물개발, 질병진단 등의 분야에서 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서 “항체(antibody)”는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 구성된다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성을 갖게 된다. 항원에 결합하는 항체 가변영역을 항체의 항원결합부위(antigen-binding site)라고 하고, 항원의 표면에서 항체에 의해 인식되는 부분을 항원결정부(epitope)라고 한다.
항원결합부위(antigen-binding site)를 포함하고 있는 항체의 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원특이성에 가장 중요하다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체로서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 항원결정부(epitope)로 인식하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 베타-카테닌 전장(full-length) 단백질에서 42번째 내지 51번째 아미노산으로 이루어진 것이며, 구체적인 서열은 TAPSLpSGKGN 이다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에서 6번째 아미노산인 세린이 인산화(pS)되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 4 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직하게는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 상기한 CDR, VH와 VL, 또는 경쇄와 중쇄의 구성을 갖는 것이라면 그 종류에 제한이 없으며, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 형태의 항체일 수 있다. 바람직하게는 IgG 형태의 항체일 수 있다.
또한 본 발명에서 항체의 항원 결합 단편은 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌에 특이적인 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변영역과 불변영역으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 VH와 VL이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
또한 본 발명에 따른 항체는 단일한 B 세포에서 유래하는 단일클론(monoclonal) 항체일 수도 있고, 복수의 B 세포에서 유래하는 다클론(polyclonal) 항체일 수도 있으며, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 상이한 종의 항체 서열을 함께 가지고 있는 키메라(chimera) 항체 또는 항체의 단편일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 '폴리뉴클레오티드'는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 특이적인 CDR구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 '벡터(vector)'는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들 (adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterialvectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에서 상기 '벡터'는 '발현벡터(expression vector)'와 동일한 의미로 이해될 수 있으며, 이는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 pOptiVEC™-TOPO 및 pcDNA™3.3-TOPO일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E.coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피.애루기노사(P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현 가능한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.
본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K.wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K.drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K.marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa);쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 사용가능하다.
상기 “형질전환(transformation)”은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다
또한, 본 발명의 상기세포는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.
본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다.
이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지 조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 Wnt3a의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 또는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Wnt3a를 세포에 처리하면 일차섬모를 갖는 세포의 수가 현저히 증가할 뿐 아니라, 섬모의 길이 및 두께도 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다. 반대로, siRNA 형질 감염을 통해 내인성 Wnt3a를 결손시키거나, 항-Wnt3a 특이적 항체를 이용하여 Wnt3a를 중화시키면 세포에서 일차섬모의 생성을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 항암제 내성을 나타내는 세포에 Wnt3a를 처리하면 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화가 현저히 증가되는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 항암제 내성을 나타내는 세포에 Wnt3a를 처리하거나 처리하지 않은 상태에서, 항암제를 처리한 결과, Wnt3a를 처리한 세포의 생존율이 처리하지 않은 세포보다 현저히 높은 것으로 나타났다.
이와 같은 결과는, 항암제 내성을 나타내는 암 세포주에 대한 Wnt3a의 자극은 베타-카테닌의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 증가시키고, 결과적으로 일차섬모발생에 따른 항암제 내성에 기여하는 것으로 해석된다.
따라서, Wnt3a의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 또는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질은 암 세포에서 일차섬모발생을 억제할 수 있고, 결과적으로 암 세포가 항암제에 내성을 나타내는 것을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 상기 Wnt3a의 발현을 억제하는 물질은 Wnt3a 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질일 수 있고, 상기 Wnt3a의 활성을 억제하는 물질은 Wnt3a 단백질의 활성을 직접적으로 억제할 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
상기 Wnt3a 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, Wnt3a 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 PNA 중 1이상을 선택하여 포함할 수 있으며, Wnt3a 단백질의 활성을 억제하는 물질은 앱타머, Wnt3a에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체 등의 천연물과 화학 물질이 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 Wnt3a 유전자에 상보적이고 Wnt3a mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, Wnt3a mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
본 발명에서 상기 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명에서 상기 siRNA 분자는, 센스 가닥(Wnt3a mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(Wnt3a mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 바람직한 예시로서, 상기 siRNA 분자는 특히 본 발명의 서열목록 1에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제시키는 데 이용될 수 있다. 통상적으로, shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.
본 발명에서 상기 “앱타머”는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다, 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태 등 형태에 제한이 없다.
본 발명애서 상기 “항체”는 Wnt3a 단백질의 활성을 억제하는 단일클론항체 또는 다중클론항체일 수 있다. Wnt3a 단백질의 활성을 억제하는 항체는 Wnt3a 단백질에 특이적으로 결합하여 Wnt3a 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. Wnt3a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법에 의해 제조하거나, 또는 상업적으로 이용가능한 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 또한, Wnt3a 단백질의 활성을 억제하는 항체는 Wnt3a 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제할 수 있는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
또한, 본 발명의 Wnt3a 단백질 활성 억제제로서 포함될 수 있는 펩타이드, 펩타이드 모방체, 기질 유사체 등은 모두 Wnt3a 단백질의 특정 도메인을 억제하여 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 모방체는 Ttyh1 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47) 상보적으로 결합함으로써 인산화를 억제하거나, 인산화 효소를 두고 기질에 해당하는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)과 경쟁적으로 작용함으로써 인산화를 억제하는 물질일 수 있다.
상기 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)에 상보적으로 결합하는 인산화 억제제는 기질 유사체, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 또는 항체 등일 수 있다.
또한, 상기 경쟁적으로 작용하여 인산화를 억제하는 인산화 억제제는 베타-카테닌(β-catenin) 단백질에서 47번 세린(Ser47)을 포함하는 단편인 폴리펩티드일 수 있다.
상기 "항암제 내성"의 "항암제(anticancer agent 또는 anticancer drug)"는 악성 종양의 축소, 억제, 및 제거를 포함한 치료를 위하여 사용되는 화학물질을 말한다.
상기 항암제는 예를 들어, 알킬화 약물(Alkylating agents), 항대사물질(Antimetabolites), 천연물질, 호르몬 및 그 길항 약물, 표적 치료제, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 알킬화 약물은 예를 들어, 시스플라틴(Cisplatin), 카르보플라틴(Carboplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 이포스파마이드(Ifosfamide), 멜팔란(Melphalan), 클로람부실(Chlorambucil), 티오테파(Thiotepa), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 부술판(Busulfan), 카무스틴(Carmustine, BCNU), 로무스틴(Lomustine, CCNU), 다카르바진(Dacarbazine, DTIC), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 항대사물질은 예를 들어, 플루오로우라실(Fluorouracil: 5-FU), 카페시타빈(Capecitabine), 시타라빈(Cytarabine), 젬시타빈(Gemcitabine), 메소트렉세이트(Methotrexate), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine: 6-MP), 또는 이들의 조합이다. 상기 천연물질은 예를 들어, 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelvine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 에토포사이드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 미토마이신(Mitomycin), 블레오마이신(Bleomycin), 아스파라기나제(L-Asparaginase), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 호르몬 및 그 길항 약물은 예를 들어, 미토테인(Mitotane), 아미노글루테티미드(Aminoglutethimide), 프레드니손(Prednisone), 프레드니솔론(Prednisolone), 프로게스틴(Progestin), 에스트로겐(Estrogen), 안드로겐(Androgen), 타목시펜(Tamoxifen), 플루타마이드(Flutamide), 루프로라이드(Leuprolide), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 표적 치료제는 예를 들어, 이마티닙(Imatinib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(Sorafenib), 다사티닙(Dasatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 토파시티닙(Tofacitinib), 크리조티닙(Crizotinib), 베무라페닙(Vemurafenib), 다브라페닙(Dabrafenib), 트라메티닙(Trametinib), 보르테조밉(Bortezomib), 오파투무맙(Ofatumumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine, T-DM1), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 리툭시맙(Rituxomab), 파니투무맙(Panitumumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 "항암제 내성(drug-resistance)"은 항암제 치료 요법에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어 상기 치료 요법에 의하여 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 증상을 말한다. 항암제 내성은 암이 특정 항암제 치료 요법에 대하여 처음부터 내성을 가질 수 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나 긴 시간의 치료로 인하여 암세포의 성질이 변하여 동일한 치료제에 대해 더이상 감수성을 나타내지 않게 되어 나타날 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형암 또는 비고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들어 간, 폐, 유방, 피부 등 장기에 암 종양이 발생한 것을 말한다. 비고형암은 혈액 내에서 발생한 암이고, 혈액암으로도 불린다. 상기 암은 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 조혈세포 유래의 암, 배세포 종양(germ cell tumor), 또는 모세포종(blastoma)일 수 있다. 상기 암은 예를 들어 유방암, 결장직장암, 두경부암, 대장암, 피부암, 췌장암, 폐암, 위암, 난소암, 전립선암, 방광암, 요도암, 간암, 신장암, 투명세포 육종, 흑색종, 뇌척수종양, 뇌암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 부갑상선암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 호치킨병(Hodgkin's Disease), 내분비계암, 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 Wnt3a의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 또는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질만을 포함하거나, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용; 또는 섬모 이상증(ciliopathy) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌은 세포의 일차섬모발생 과정에서 필수적으로 관여하며, 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화가 증가한 세포에서 세포의 섬모화 비율, 섬모의 길이 및 섬모의 두께가 모두 현저히 증가하는 것으로 확인된 바 있다. 세포에서 일차섬모가 비정상적으로 발달하는 섬모 이상증이 다양한 질환의 발병과 밀접하게 관련되어 있고, 암의 항암제 내성에도 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 47번 세린이 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체는 일차섬모의 비정상적인 발생에 관여하는 하위 신호전달을 차단함으로써 항암제 내성; 또는 섬모 이상증을 효과적으로 제어할 수 있다.
본 발명에서 상기 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해서는 전술한 바가 참고될 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제 내성에 대해서는 전술한 바가 참고될 수 있다.
본 발명에서 상기 섬모 이상증은 일차섬모의 구조적 또는 기능적 이상으로 나타나는 다양한 질환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 섬모 이상증은 일차섬모의 비정상적인 발현에 의해 유발되는 질환을 의미한다. 상기 일차섬모의 비정상적인 발현은 일차섬모의 저발현, 과발현 및 일차섬모 두께/길이의 비정상적인 변화를 포함하며, 바람직하게는 일차섬모의 과발현 및 일차섬모 두께/길이의 비정상적인 증대를 의미하는 것일 수 있다.
일차섬모는 외부에서 오는 다양한 감각(시각, 후각, 청각, 운동 감각, 삼투압 등)을 감지하는데 중요한 역할을 하고, 세포 내 중요한 신호전달과정이 일차섬모를 매개로 일어난다. 따라서, 일차섬모의 비정상적인 발현은 다양한 질환을 매개할 수 있다.
본 발명에서 상기 섬모 이상증은 일차섬모의 비정상적인 발현으로 유발되는 질환이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 이의 비제한적인 예시로 소뇌와 뇌간(brain stem)의 발달기형, 신장질환, 망막퇴화, 후각상실, 다지증(polydactyly), 비만, 지적장애, 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 다낭성 신장질환(polycystic kidney disease), 바뎃-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome), 신장 낭종, 불임, 호흡기질환, 내장역위증(situs inversus) 및 고혈압을 포함한다.
본 발명은 또한 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화가 증가되면 항암제 내성을 나타내는 세포에서 섬모화된 세포의 비율이 증가하고, 일차섬모의 길이도 길어지는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 항암제 내성을 나타내는 세포에 대한 Wnt3a 자극에 의해 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화가 증가되면, 항암제 내성이 증가하여 암 세포의 사멸이 현저히 감소되는 것으로 확인되었다.
즉, 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정한 결과, 정상 대조군과 비교하여 특정 환자의 생물학적 시료에서 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47) 인산화 수준이 증가되어 있었다면 상기 환자는 항암제 내성을 나타낼 것이라고 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제는 47번 세린이 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 압타머일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제는 서열번호 2로 표시되는 항원결정부(epitope)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 4 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명에서 상기 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명은 또한 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 항암제 내성 진단용 키트에는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 결합하는 항체 또는 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적인 양태로서 상기 키트는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법을 수행하기 위해 필요한 공지의 필수요소 및 부수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일례로, 상기 키트는 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 키트에 제공되는 항체는 그 자체로서 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 별도의 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 잉여의 발색 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 항체와 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 키트에 포함될 수 있는 바람직한 항체는 본 발명이 제공하는 전술한 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 정상 대조군보다 높을 경우 항암제 내성으로 진단하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 생물학적 시료란 전혈, 혈장, 혈구, 혈청, 혈관 내피세포, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 상기 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 그것과 비교한다. 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가되어 있는 피검체는 항암제 내성을 나타내는 환자인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 시험물질을 베타-카테닌(β-catenin)을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 베타-카테닌의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 베타-카테닌의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구투여, 정위주사를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
상기 (b) 단계에서 상기 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계에서는 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 감소된 시험물질을 항암제 내성 억제제 후보물질로 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 연구용 조성물 및/또는 키트를 제공한다.
상기 연구용이란 in vitro, in vivo, in situ 연구에 활용되는 것을 모두 포함하며, 바람직하게는 in vitro 연구용, 보다 더 바람직하게는 면역염색실험(immunostaining analysis) 연구용일 수 있다.
본 발명에서 상기 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해서는 전술한 바가 참고될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명이 제공하는 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 세포에서 47번 세린이 인산화된 베타-카테닌을 면역염색하고, 초고해상도현미경을 이용해 관찰한 결과, 베타-카테닌의 세포 내 위치가 매우 정확하게 확인된 바 있다. 따라서, 본 발명이 제공하는 항체를 이용하면 기존에 알려져 있지 않은 베타-카테닌의 새로운 세포 내 위치를 매우 정확하게 동정할 수 있어 베타-카테닌과 관련된 다양한 연구 분야에서 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 세포에서 일차섬모발생에 직접적으로 관여하는, 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정할 수 있는 신규한 항체 및 이의 용도를 제공하며, 또한 본 발명은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정함으로써 일차섬모에 의한 암 세포의 항암제 내성을 진단하거나, 항암제 내성 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있어 암의 진단 및 치료에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 내지 1i를 포함하는 도 1은 Wnt의 표준적인 리간드인 Wnt3a가 hTERT-RPE 세포에서 일차섬모발생을 촉진한다는 것을 확인한 결과이다.
도 2a 내지 2d를 포함하는 도 2는 Wnt의 표준적인 리간드인 Wnt3a가 hTERT-RPE 세포에서 일차섬모발생을 촉진한다는 것을 확인한 결과이다.
도 3a 내지 3c를 포함하는 도 3은 β-카테닌 또는 CK1δ의 결손에 의해 일차섬모발생이 심각하게 손상된다는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 정제된 GST-CK1δ 및 GST-β-카테닌을 사용한 시험관내 키나제 분석 결과, CK1δ 키나제 활성에 의한 β-카테닌의 강한 특이적 인산화 신호가 관찰된다는 것을 확인한 결과이다.
도 5a 내지 5f를 포함하는 도 5는 CK1δ키나제 활성에 의한 β-카테닌 세린47(Ser47) 잔기의 인산화가 일차섬모발생에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 확인한 결과이다.
도 6a 내지 6f를 포함하는 도 6은 Wnt3에 의해 유도된 CK1δ키나제 활성화가 β-카테닌 세린47(Ser47) 잔기의 인산화를 촉진한다는 것을 확인한 결과이다.
도 7a 내지 7e를 포함하는 도 7은 Wnt3에 의해 유도된 세린47(Ser47) 잔기가 인산화된 β-카테닌의 중심소체성 위치화가 일차섬모발생을 촉진한다는 것을 확인한 결과이다.
도 8a 내지 8d를 포함하는 도 8은 표준적인 Wnt 리간드인 Wnt3a의 자극은 중심소체위성의 주변중심소체 영역으로의 모집을 촉진한다는 것을 확인한 결과이다.
도 9a 내지 9j를 포함하는 도 9는 중심소체위성의 중심소체성 모집은 β-카테닌의 세린47(Ser47) 잔기 인산화에 의존적이라는 것을 확인한 결과이다.
도 10a 내지 10i를 포함하는 도 10은 다약제-내성 종양 세포 모델인 MCF-7/ADR 세포주에서 Wnt3a 의존적인 일차섬모발생을 확인한 결과이다.
도 11a 내지 11c를 포함하는 도 11은 다약제-내성 종양 세포 모델인 MCF-7/ADR 세포주에 Wnt3a를 처리하면 세포가 항암제인 독소루비신에 내성을 나타낸다는 것을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
1. 플라스미드 제작 및 돌연변이 유발
β-카테닌 야생형 형태를 발현하는 마우스(WT) 또는 다양한 돌연변이 형태 [각각의 절단체('T'돌연변이체) 및 알라닌/아스파르트산 치환 돌연변이체 ("A"/"D"돌연변이체)]는 pcDNA-FLAG의 BamI-NotI 위치 내에 서브클론되거나, 또는 pHR'-CMV-SV-puro의 SaIl 위치에 서브클론하여 제작하였다.
각각의 전장 A/D 돌연변이체 및 절단 단편은 pCDNA3-Flag-β-카테닌 WT 및 pEGFP-C1-β-카테닌 WT를 사용하여 PCR에 의해 생성되었다. 마우스 CK1δ 또는 CK1ε의 발현 작제물은 종래 공지된 방법에 따라 생성하였다.
β-카테닌, shRNA-발현 렌티바이러스 작제물(sh1746)을 생성하기 위해, 인간 β-카테닌으로부터 어닐링 된 뉴클레오티드 1746-1769 (수탁 번호 BC058926) 오픈 리딩 프레임 ( forward: 5′-CCGGGGATGTTCACAACCGAATTGTTATGCTAGC　ATAACAATTCGGTTGTGAACATCCTTTTTG-3′ 및 reverse: 5′-AATTCAAAAAGGATGTTCACAACCGAATTGTTATGCTAGCATAACAATTCGGTTGTGAACATCC-3′표적화 서열은 밑줄로 표시됨)는 pLKO.1-puro 벡터의 AgeI-EcoRI 위치 내에 서브클로닝 되었다.
β-카테닌 sh1746 RNA (인간 β-카테닌 서열을 기초로 함)의 침묵 효과에 대해 내성이 있는 마우스 β-카테닌 플라스미드 작제물은 3개의 상이한 뉴클레오티드 (5'-ggacgttcacaaccggattgtaat -3 ')를 포함한다. 모든 돌연변이체는 PCR-기반 부위-지정 돌연변이 유발을 사용하여 생성되었다. shGL (CGTACGCGGAATACTTCGA) 및 shCK1δ (AGGCTACCCTTCCGAATTT)의 표적서열은 sh-카테닌과 동일한 방식으로 pLKO.1- puro 벡터로 서브클로닝되었다.
2. 형질감염
플라스미드 및 siRNA를 제조사의 지시에 따라 X-tremeGENE HP DNA 형질 감염 시약 (Roche) 또는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 상응하는 세포에 형질감염시켰다.
3. 렌티바이러스 생성 및 감염
shRNA 렌티 바이러스를 생성하기 위해, pLKO.1-puro-sh루시퍼라제　(shGL),　-sh 2. 형질감염
플라스미드 및 siRNA를 제조사의 지시에 따라 X-tremeGENE HP DNA 형질 감염 시약 (Roche) 또는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 상응하는 세포에 형질감염시켰다.
3. 렌티바이러스 생성 및 감염
shRNA 렌티 바이러스를 생성하기 위해, pLKO.1-puro-sh루시퍼라제　(shGL),　-shβ-카테닌, 또는　-shCK1δ　작제물을 pHR'-CMV-VSV-G　(protein G of vesicular stomatitis virus) 및 pHR′-CMVΔR8.2Δvpr와 HEK293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 발현하는 단백질을 생성하기 위해, pHR'- CMV-SV-puro-벡터,　pHR′-CMV-SV-puro-벡터-β-카테닌 wild-type R 　(R,　sh1746-저항성 마우스　β-카테닌),　S45A R , S47A R , T217A R ,　또는　S47D R 　작제물을 pHR’-CMV-VSV-G 및 pHR′-CMVΔR8.2Δvpr와 함께 HEK293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 세포를 하루 동안 각각의 렌티 바이러스로 감염시키고 퓨로마이신 처리 (4~20㎍/ml, 2~3일)로 선택하였다.
4. 면역침강 및 면역블롯팅 분석
면역침강법은 종래 공지된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 1 x PBS로 수확된 hTERT-RPE 세포를 1 x TBSN 완충액 [20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.5% NP-40, 150mM NaCl, 1.5mM EDTA, 5mM EGTA, 10mg/ml pNPP (p- 니트로페닐포스페이트; Sigma) 및 프로테아제 억제제 칵테일]에 용해시켰다. 이어서, 총 세포 용해물을 4 ℃에서 20분 동안 15,000g에서 원심분리 하였다. 투명 세포 용해물을 4 ℃에서 4 내지 6시간 동안 지시된 항체와 함께 인큐베이션 한 후, 항체를 4 ℃에서 추가 3 간 동안 단백질 A 또는 G- 세파로스비드에 결합시켰다. 짧은 원심분리로 비드를 침전시키고 1 x TBSN으로 4 회 이상 세척하였다. 생성된 비드에 2 x Laemmli 샘플 완충액 [120 mM Tris-Cl (pH 6.8), 4 % SDS, 20 % 글리세롤, 10 % 2-머캅토 에탄올 및 0.02% 브로모페놀블루]을 첨가하고 95 내지 100℃에서 15 분 동안 끓였다. 생성된 샘플을 SDS-PAGE에 적용하였다.
면역 침전물을 6 내지 12% SDS-PAGE으로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 실온에서 2 내지 4시간 동안(또는 4℃에서 밤새) 1차 항체와 실온에서 추가로 1시간 동안 HRP-접합된 2차 항체와 순차적으로 인큐베이션 하였다. 이어서, 막을 3 회 이상 1 x TBST [(50 mM 트리스-Cl (pH 7.5), 0.05 % 트윈 20, 150 mM NaCl)]로 광범위하게 세척하였다. 면역 반응성 신호는 ECL 검출 시스템으로 검출했다.
5. 항체 제작
토끼 폴리클로날 항-β-카테닌 인산화-Ser47(p-S47) 항체는 합성 인산화-펩타이드, NH2-TAPSL-pS-GKGN-C-COOH(42 ~ 51 아미노산) (AbFRONTIER Inc., 서울)의 투여에 의해 생성되었다. 면역화한 토끼 혈청을 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 항-β-카테닌 p-S47 항체의 생산을 ELISA 면역시험으로 모니터링 하였다. 항-β-카테닌 p-S47 항체의 특이성을 위해, 5μg 내지 10μg/ml 비-인산화 펩티드를 항체 용액에 첨가하였다.
CTNB1-p-S47 하이브리도마 세포주로부터 RNA prep.을 진행한 다음 cDNA 합성 후에 경쇄와 중쇄의 가변 영역 유전자를 PCR 증폭하였다. PCR 증폭된 경쇄와 중쇄의 가변 영역 유전자는 T-vector cloning한 후 sequencing 분석을 통해 서열을 확인하였다. 확인된 서열은 Kabat numbering 방법으로 CDR을 표시하여 정리하였다.
6. In vitro 키나제 어세이, 면역 침전-키나제 어세이, 및 Mass spectrometry 분석
In vitro 키나제 분석을 위해, 대장균 BL21에서 이소프로필 β-d-1-티오 갈락토피라노시드(IPTG) 유도로 GST-β-카테닌 WT, GST-β-카테닌의 다양한 알라닌 치환 돌연변이체 및 GST-CK1δ -WT를 발현시켰다. 이어서 글루타티온 (GSH)-아가로스로 정제하였다. In vitro 키나제 반응을 키나제 칵테일 [50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 5 mM 디티오트레이톨, 10 mg/ml pNPP (p-니트로페닐포스페이트; Sigma) 및 프로테아제-저해제 칵테일], 10μM cold-ATP 및 10μCi [γ-32P]ATP와 함께 30℃에서 30분 동안 수행하였다. 생성된 샘플을 SDS-PAGE에 적용하였다.
면역 침전(IP)-키나제 분석을 위해, Myc-태그된 mCK1δ로 형질감염된 hTERT-RPE 세포를 6시간 동안 굶주린 후, 대조군- 또는 Wnt3a-CM(conditioned medium)로 추가로 24 시간 동안 자극하였다. 이후 세포를 수확하고 항-Myc 항체로 면역 침전시켰다. 면역 침전물을 상기 기재된 바와 같이 키나제 칵테일에서 in vitro 키나제 분석에 적용하였다.
CK1δ 반응에 의한 in vitro β-카테닌 인산화 부위를 확인하기 위해, in vitro 키나제 분석을 방사성 동위원소의 부재하에 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 생성된 샘플을 SDS-PAGE에 적용한 후, 겔을 제조사의 지시에 따라 GelCode Blue Stain Reagent로 염색했다. GST-β-카테닌 밴드를 겔로부터 절제하고 트립신으로 겔 내에서 소화시켰다. 생성된 샘플에 대해 종래 공지된 방법에 따라 질량 분석법을 수행하였다.
7. 혈청-결핍에 기초한 섬모발생 어세이 및 면역형광 어세이
혈청 결핍 기반의 섬모발생 어세이, 섬모가 있는 세포의 수, 일차섬모의 길이/두께의 측정은 본질적으로 종래 공지된 방법에 따라 수행했다. 간략하게, 12개의 배양 웰에서 24 시간 동안 커버 슬립에서 배양된 hTERT-RPE 또는 MCF-7/ADR 세포를 1 x PBS로 3회 세척한 다음 DMEM 단독 배지에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 추가로 48 시간 동안 대조군/Wnt3a CM으로 처리하였다. 일차섬모를 관찰하기 위해, 생성된 세포를 이전에 기재된 바와 같이 항-아세틸 화된 α- 튜불린 항체(Sigma, 1 : 200) 및 항-γ-튜불린 항체(Sigma, 1 : 200)와 공동 면역화시켰다.
일차섬모 함유 세포를 Nikon Eclipse ti-u 역 형광현미경 또는 Zeiss AxioObserver Z1 현미경으로 수동으로 계수하였다. 일차섬모의 길이 또는 두께를 측정하기 위해, 1388 X 1040 픽셀 및 12 비트 해상도에서 Zeiss AxioObserver Z1 현미경으로 이미지를 획득하고, ZEN v2.1소프트웨어로 분석하였다.
β-카테닌 인산화-Ser47(p-S47) 및 중심소체위성(centriolar satellites)의 중심체성 위치화를 검출하기 위해, hTERT-RPE 또는 MCF-7/ADR 세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음, -20℃의 차가운 메탄올로 2분간 투과시켰다. 이어서, 생성된 샘플을 1 X PBST로 4회 광범위하게 세척하였다. 면역형광 분석은 종래 공지된 방법에 따라 수행되었다. 간단히, 1차 항체를 실온에서 2 내지 4 시간 동안 (또는 인산화-항체의 경우 4 ℃에서 밤새) 배양하고 1 x PBST로 3 회 세척하였다. 형광-염색 접합된 이차 항체를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 실온에서 10분 동안 배양하면서 1μg/ml의 DAPI 용액으로 DNA를 염색하였다. 생성된 커버 슬립을 Fluoro-Gel 장착 매체로 장착하고, 관찰하고 Zeiss LSM 700 공초점 현미경, Zeiss AxioObserver 또는 Nikon Eclipse ti-u 역 형광 현미경 시스템으로 사진을 찍었다.
8. Wnt3a의 중화
CM(conditioned medium)에서 Wnt3a 활성은 5㎍/ml의 최종 농도에서 Wnt3a CM에 항-Wnt3a 항체를 첨가함으로써 중화되었다. 항체 및 CM의 혼합물을 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 세포에 적용하였다.
9. FACS (flow cytometry) 분석
대조군 또는 Wnt3a CM으로 처리된 hTERT-RPE 세포를 트립신화로 수확하고 FACS 분석을 수행하였다. PI(propidium iodide)염색은 제조사의 프로토콜에 따라 BD cycletestTM Plus DNA 시약 키트(BD Biosciences, CA)를 사용하여 수행하였다. 결과 샘플을 FACS 분석을 위해 BD FACSCalibur?? 유세포 분석기에 적용하고 결과 데이터를 CellQuest Pro v6.0 (BD Biosciences)으로 분석하였다.
10. 항암제 내성 세포주에서의 in vitro 분석
MCF7/ADR를 6시간 동안 serum starvation한 후, 세포에 control CM 또는 Wnt3a CM 을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 doxorubicin을 2 mM 또는 10 mM 처리하여 6 ~ 10일 동안 추가 배양하였다. 배양된 세포를 Wright 염색(Sigma-Aldrich)용액으로 염색하여 현미경으로 관찰하거나 Flow cytometry (FACS) 분석하였다. FACS 분석은 propidium iodide 염색(BD cycletestTM Plus DNA reagent kit)을 하여 BD FACSCaliburTM Flow Cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 수행하였으며, 데이터는 CellQuest Pro v6.0 (BD Biosciences)를 이용해서 분석하였다.
실험결과
1. Wnt의 표준 리간드인 Wnt3a에 의한 자극은 일차섬모발생을 유도함
일차섬모발생에 대한 표준적인 Wnt 자극의 효과를 평가하기 위해, hTERT-RPE 세포를 혈청 결핍시키고, 도 1a에 나타낸 스케줄에 따라 Wnt3a로 자극하였다. 처리 48 시간 후, 세포를 수확하고 면역 블롯팅하고 지시된 항체로 면역 염색시켰다. 세포밀도는 일차섬모발생에 영향을 미치기 때문에, 일차섬모를 가진 세포의 수는 대조군 또는 Wnt3a CM(conditioned media)-처리된 커버슬립의 유사한 세포밀도 영역에서 계수되었다. 놀랍게도, Wnt3a 자극은 대조군과 비교하여 일차섬모를 갖는 세포의 수를 현저하게 증가시켰다(도 1b 및 1c). hTERT-RPE 세포에서 Wnt3a CM의 자극은 대략 70%의 일차섬모를 유도하는 반면, 대조 CM 처리는 단지 약 40% 섬모를 유도했다(도 1c). 이들 관찰에 더하여, 대조군 CM-처리된 세포와 비교하여 Wnt3a CM-처리된 세포에서 길고 두꺼운 일차섬모가 빈번하게 관찰되었다(도 1d 및 1f). 따라서, 본 발명자들은 면역형광신호를 사용하여 각 섬모 축삭의 길이 및 두께를 측정하였다. 일차섬모의 평균 길이는 대조 CM-처리된 세포 및 Wnt3a CM-처리된 세포에서 각각 2.59 및 4.77μm였다(도 1e). 또한, 섬모축삭(ciliary axoneme)의 두께는 대조군 CM- 및 Wnt3a CM-처리된 세포에서 각각 0.27 및 0.44μm였다(도 1g).
이와 같이, Wnt3a CM 자극은 섬모가 발생한 세포의 수, 섬모의 길이 및 두께 측면에서 일차섬모발생에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
일차섬모발생에 대한 Wnt3a의 효과는 Wnt3a siRNA 형질 감염을 통한 내인성 Wnt3a의 고갈과 항-Wnt3a 특이적 항체를 사용한 Wnt3a의 중화에 의해 추가로 확인되었다. 내인성 Wnt3a의 고갈은 대조군과 비교하여 일차섬모의 생성을 절반으로 감소시켰다. 대조군 siRNA-형질감염된 hTERT-RPE 세포는 48 시간의 혈청 결핍 후 대략 40%의 섬모를 나타냈지만, Wnt3a siRNA-형질감염된 세포는 약 20%만이 섬모화되었다(도 1i).
추가로, Wnt3a CM과 항-Wnt3a 항체의 예비 배양은 Wnt3a-유도된 일차섬모발생을 억제했다. 대조군 CM의 존재하에, 대략 50% 섬모가 발생하는 반면, Wnt3a CM의 자극은 70% 이상의 섬모를 유발하였고, Wnt3a CM과 항-Wnt3a 항체의 예비 배양은 hTERT-RPE 세포에서 30% 미만의 섬모를 생성하였다. 한편, Wnt3a CM과 대조 IgG의 예비 배양은 Wnt3a CM-처리된 세포에서 관찰된 바와 같이 대략 71% 섬모로 Wnt3a-유도된 일차섬모발생에 영향을 미치지 않았다(도 2a 및 2b). 항-Wnt3a 항체 예비 배양에 의한 Wnt3a의 중화효과는 섬모 발생률뿐만 아니라 섬모 길이 및 두께에서도 관찰되었다. Wnt3a CM-처리된 세포의 길고 두꺼운 섬모는 대조 CM-처리된 세포에서 관찰된 것과 유사하였으나, Wnt3a CM과 항-Wnt3a 항체의 예비 배양 후에는 섬모의 길이 및 두께가 감소되었다(도 2c 및 2d).
2. CK1δ키나제 활성에 의한 β-카테닌 세린47(Ser47) 잔기의 인산화가 일차섬모발생에 매우 중요한 역할을 함
본 발명자들이 진행한 이전 연구에 따르면, β-카테닌 또는 CK1δ의 결손이 대조군 낙다운 샘플보다 일차섬모를 적게 유도한다는 것이 확인된 바 있다. 따라서, 본 발명에서는 일차섬모발생에서 Wnt3a와 β-catenin-CK1δ 사이의 기능적 연관성을 확인하고자 하였다. 이를 위해 먼저 일차섬모발생에 대한 β-카테닌 또는 CK1δ의 결손 효과를 자세히 확인하였다. sh-렌티 바이러스 감염을 통해 hTERT-RPE 세포에서 대조군 루시퍼라제, β-카테닌 또는 CK1δ를 결손시키고, 혈청 결핍 후 0, 24 및 48시간 째에 일차섬모를 관찰하였다(도 S4A 및 S4B). 일차섬모발생은 β-카테닌 또는 CK1δ의 결손에 의해 심각하게 손상되었다(도 3a 내지 3c). 48 시간의 혈청 결핍 후(sh-렌티 바이러스 감염 후 96 시간), shLuciferase (shGL) 렌티바이러스에 감염된 세포에서 52%의 세포가 일차섬모를 생성한 반면, shβ-카테닌 또는 shCK1δ 렌티바이러스에 감염된 세포에서는 각각 18% 또는 23%의 세포만이 일차섬모를 생성하였다(도 3b). 섬모길이의 관점에서, 혈청 결핍 후 48 시간(sh-렌티 바이러스 감염 후 96 시간)에, 약 3.5μm 길이의 일차섬모가 shGL 렌티바이러스-감염된 세포에서 생성되는 반면, 약 1.9 또는 2.1μm 길이의 일차섬모가 각각 shβ-카테닌 또는 CK1δ 렌티바이러스-감염 세포에서 생성되었다(도 3c). 이러한 결과는 β-카테닌 및 CK1δ가 일차섬모발생에서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 다음에 일차섬모발생에서 β-카테닌과 CK1δ 사이의 직접적인 관계를 확인하려고 시도했다. 정제된 GST-CK1δ 및 GST-β-카테닌을 사용한 시험관내 키나제 분석 결과, CK1δ 키나제 활성에 의한 β-카테닌의 강한 특이적 인산화 신호가 확인되었다(도 4).
그런 다음, 일차섬모발생을 유도하는 CK1δ 매개 β-카테닌의 인산화 위치를 확인하고자 하였다. 이를 위해, β-카테닌의 전장을 도메인 아미노산 서열에 따라 N-말단 부분(T1), 중간부분(T2) 및 C-말단 부분 (T3)의 세 부분으로 나누었다(도 5a). 각 절단된 돌연변이 단백질을 박테리아 발현시스템을 사용하여 정제하고 GST-CK1δ와 반응시켰다. 3 개의 돌연변이 중에서, T1만이 CK1δ 키나제 활성에 의해 인산화 신호를 보인 반면, 다른 돌연변이인 T2 및 T3은 특정 신호를 나타내지 않았다(도 5b). 따라서, 본 발명자들은 CK1δ(S/Tp-X1-2-S/T)에 대한 컨센서스 인산화 서열에 따라 T1 돌연변이체의 일차 서열에서 CK1δ-유도된 β-카테닌 인산화 위치의 후보를 검색하였다. 인산화 부위 선택의 가능성을 증가시키기 위해, 컨센서스 서열의 후자 S/T 잔기 및 전자 S/T 잔기가 후보 선별에 포함되었다.
본 발명자들은 β-카테닌의 T1 돌연변이 체로부터 10 개의 후보 잔기를 선택하고 각각에 대해 인산화 결핍 알라닌("A") 돌연변이체를 생성하였다. 각각의 "A"돌연변이체를 박테리아 발현 시스템에서 발현시키고 정제하여 생성된 단백질을 CK1δ와 반응시켰다. β-카테닌의 10 개의 "A"돌연변이 중 3개 (즉, S45A, S47A 및 T217A)는 인산화에 명백한 결핍을 나타냈다(도 5c). 3개의 확인된 후보들 사이에서 일차섬모발생을 담당하는 중요한 잔기를 결정하기 위해, 본 발명자는 각 돌연변이를 안정적으로 발현하는 hTERT-RPE 세포주를 생성하고 각 돌연변이체의 일차섬모발생력을 확인했다(도 5d 내지 5f). 내인성 β-카테닌이 결손된 hTERT-RPE 세포에서, β-카테닌 야생형(WT) 발현 세포는 약 35%의 일차섬모를 발생시켰고, S45A 또는 T217A 돌연변이를 발현하는 세포는 약 30%의 일차섬모를 발생시켰다. S47A 돌연변이체를 발현하는 세포는 약 15%의 일차섬모를 발생시켰다(도 5f). 이들 결과는 β-카테닌 세린47(Ser47) 잔기의 인산화가 일차섬모발생에 결정적임을 시사한다.
따라서, 이후, 본 발명자들은 Wnt3a와 관련하여 일차섬모발생을 연구하기 위해 β-catenin Ser47 잔기에 초점을 맞추었다.
3. Wnt3a 자극은 CK1δ 활성-의존적인 β-카테닌 Ser47 잔기의 인산화를 촉진함
다양한 종에서 β-카테닌 Ser47 잔기가 보존되어 있다는 것은, 이것이 얼마나 중요한지를 다시 확인할 수 있도록 한다(도 6a).
인산화-S47(p-S47) 에피토프에 대해 생성된 인산화-특이적 항체에 의한 후속 면역블롯팅 분석 결과, β- 카테닌 야생형(WT)을 이소성으로 발현하는 HEK293T 세포에서 β-카테닌 p-S47 에피토프의 존재를 확인했지만, 인산화-결핍 S47A 돌연변이를 발현하는 HEK293T 세포에서는 그렇지 않았다(도 6b). 내인성 p-S47 에피토프는 대조군 (shGL) 또는 β-카테닌 (shβ-카테닌)-결손된 HeLa CCL2 및 hTERT-RPE 세포에서 확인되었다. p-S47 특이적 항체를 사용한 면역블롯팅 분석 결과, 대조군 결손 세포에서는 내인성 β-카테닌 p-S47 에피토프의 존재가 확인되었지만, β-카테닌 결손 세포에서는 그렇지 않았다(도 6c).
다음으로, 본 발명자는 생체 내에서 CK1δ가 내인성 β-카테닌 p-S47 에피토프를 유도함을 확인하였다 (도 6d). Myc-CK1δ WT의 과발현은 벡터만의 발현 또는 Myc-CK1ε WT와 비교하여 항-p-S47-특이적 항체를 사용한 면역블롯팅 분석에서 내인성 β-카테닌 p-S47 에피토프를 현저하게 증가시켰다 (도 6d). 특히, CK1δ와 유사한 키나제인 CK1ε의 과발현은 빈 벡터 또는 CK1δ 발현과 비교하여 p-S47 신호를 향상시키지 않았다.
그 다음으로, Wnt3a의 자극이 섬모발생 조건에서 β-카테닌 p-S47 에피토프의 생성을 촉진하는지 여부를 확인했다. 이를 위해, 본 발명자들은 먼저 일차섬모발생 조건에서 Wnt3a 자극에 의해 CK1δ의 활성화를 확인하였다. hTERT-RPE 세포에서 Myc-태그된 CK1δ를 사용한 IP-키나제 분석 결과, CK1δ의 활성이 Wnt3a 처리에 의해 현저하게 증가되는 것으로 확인되었다(도 6e). 이러한 결과와 마찬가지로, Wnt3a 처리 후 β-카테닌 p-S47 에피토프의 증가가 혈청 결핍 hTERT-RPE(도 6f)에서 관찰되었다.
일차섬모발생에 β-카테닌 인산화-S47의 효과를 확인하기 위해 빈 벡터, β-카테닌 WT, S47A 또는 S47D를 안정적으로 발현하는 hTERT-RPE 세포를 사용하여 일차섬모발생을 추가로 분석하였다. 내인성 β-카테닌의 부가 효과를 피하기 위해, 면역블롯팅 분석을 통해 내인성 β-카테닌의 결핍을 확인하고 이 세포주를 분석에 사용하였다(도 7a). 혈청 결핍 기반의 섬모발생 어세이를 통해 일차섬모발생을 나타내는 이들 세포주의 능력을 조사하였다. β-카테닌 S47 잔기의 인산화-결핍(S47A) 및 인산화-모방체(S47D) 돌연변이 사이에서 명백히 반대의 결과가 관찰되었다. β-카테닌 S47A를 발현하는 세포에서는 일차섬모발생이 감소하였고 S47D를 발현하는 세포에서는 일차섬모발생이 증가하였다(도 7b 및 7c).
그 다음으로, Wnt3a의 자극이 어떻게 섬모발생을 유도하는지 확인하기 위해, hTERT-RPE 세포에서 Wnt3a 자극 후 β-카테닌 p-S47의 세포 내 위치 변화를 모니터링 하였다. β-카테닌 p-S47의 중심체(centrosome)로의 위치 변화는 hTERT-RPE 세포에서 항-p-S47 항체를 사용한 면역형광분석을 통해 확인되었다.
그 결과, Wnt3a의 자극이 중심체에서 β-카테닌 p-S47의 신호를 향상시킨다는 것이 확인되었다(도 7d 및 7e).
중심체에서 β-카테닌 p-S47의 정확한 국소화를 확인하기 위해, β- 카테닌 p-S47을 모중심소체의 마커인 CEP170과 공동면역화 시켰다. 이들 단백질의 공동-국소화는 초해상도 현미경을 사용하여 모니터링 되었다(도 7f). 공초점 현미경 이미지에서 두 단백질의 공동-국소화가 확인되었고, 두 단백질의 고리-유사 구조가 초해상도 이미지에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 고리형 β-카테닌 p-S47 구조는 CEP170 고리로 둘러싸여 있고 두 단백질은 부분적으로 공동-국소화되었다(도 4F). 이 데이터는 β-카테닌 p-S47이 섬모발생 동안 모중심소체의 subdistal appendages에 국한되어 있음을 나타낸다.
4. Wnt3a-유도-β-카테닌 S47의 인산화는 중심소체위성(centriolar satellites)의 중심체(centrosome) 주변으로의 재구성을 촉진함
중심소체위성은 중심체 주위에서 일정한 움직임을 보이고 이들 입자의 재구성은 일차섬모발생과 밀접한 관련이 있기 때문에, 본 발명자는 Wnt3a 자극에 따라 이의 위치를 주의깊게 모니터링했다. PCM1은 중심소체위성의 형성 및 유지에 필요한 플랫폼인 것으로 알려져 있다. 따라서 PCM1, AZI1/CEP131, CEP290, BBS4 및 OFD1과 같은 PCM1 종속 및 섬모발생 관련 중심소체위성을 관찰했다.
본 발명자는 Wnt3a의 자극이 선택된 중심소체위성의 세포하 국소화(subcellular localization) 변화 여부를 조사했다. 면역형광분석 결과, 대조군 CM-처리 세포에서 분산되어 있던 PCM1 스팟이 Wnt3a 자극에 의해 γ- 튜불린(도 8a, 상부 패널) 및 섬모의 기저 몸체(도 8a, 하부 패널) 주변으로 현저히 모집/축적되었다는 것이 확인되었다(도 8a 및 8b). 다른 선택된 중심소체위성을 모니터링하기 위해, 세포를 PCM1과 동일한 방식으로 처리하고 면역염색하고 관찰하였다. 테스트된 중심소체위성들 중에서, AZI1/CEP131 및 CEP290은 PCM1과 유사한 결과를 보인 반면, BBS4 및 OFD1은 그렇지 않았다. AZI1/CEP131 및 CEP290의 주변중심소체 신호(pericentriolar)는 대조군 CM 처리 세포와 비교하여 Wnt3a CM 처리 세포에서 유의하게 증가하였지만, BBS4 및 OFD1의 주변중심소체 신호는 대조군과 Wnt3a CM 처리 세포 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 8c 및 8d).
다음으로 중심소체위성이 β-카테닌 S47의 인산화에 의해 재구성 될 수 있는지 조사하였다. 예상한 바와 같이, 빈 벡터(+Vec)를 발현하는 shβ-카테닌 세포는 PCM1 주변중심소체 신호 강도의 현저한 감소를 나타낸 반면에, β-카테닌 WT(+WTR) 또는 인산화 모방 S47D 돌연변이체(+S47DR)의 경우에는 중심체 주변에 PCM1의 축적을 크게 증가시켰다. 또한, 인산화-결핍 S47A 돌연변이체(+S47AR)는 중심체 주위에서 PCM1의 가장 낮은 축적을 나타냈다(도 9a 및 9b). 테스트된 다른 중심소체위성의 경우, AZI1/CEP131 및 CEP290은 PCM1과 비슷한 결과를 보인 반면 BBS4 및 OFD1은 그렇지 않았다(도 9c 내지 9f).
상기 결과들과 마찬가지로, PCM1, AZI1/CEP131 또는 CEP290이 결손되면 일차섬모발생이 크게 감소했다(도 9g 내지 9j). 24 시간 혈청 결핍 후에 대조군 siRNA-감염된 hTERT-RPE 세포의 30% 이상에서 섬모가 관찰된 반면, 각각의 모집된 인자에 대한 siRNA로 형질감염된 세포에서는 15% 미만으로 섬모가 관찰되었다 (도 9i).
또한, 대조군 siRNA-형질 감염된 세포와 비교하여 각각의 모집된 인자가 결손된 세포에서 더 짧은 일차섬모가 관찰되었다. 일차섬모의 평균 길이는 대조군 siRNA-형질감염된 세포에서 약 3μm 인 반면, siPCM1-, siAZI1- 또는 siCEP290- 형질감염된 세포에서 각각 약 2.1, 2.1 또는 1.9μm였다(도 9j).
다음으로, 섬모발생 조건하에서 β-카테닌과 모집 인자 및 subdistal appendage 단백질과의 관계를 분석하기 위해, β-카테닌 p-S47을 항-β-카테닌 p-S47 항체를 사용하여 24 시간 동안 혈청이 결핍된 hTERT-RPE 세포에서 면역 침전을 수행했다. 흥미롭게도, β-카테닌 p-S47과 PCM1/AZI1/CEP290/CEP170의 물리적 상호 작용이 면역 침전 분석에서 확인되었다 (도 9k).
5. 다약제-내성 종양 세포 모델에서 Wnt3a-의존성 일차섬모발생
최근 연구에 따르면, 암 세포에서 일차섬모와 약물 내성 사이의 밀접한 상관관계가 확인되었다. 즉, 일차섬모는 키나제 억제제에 대한 내성을 촉진하고 약물 내성은 일차섬모의 길이가 더 긴 암 세포에서 더 크게 나타났다. 따라서, 약물 내성 암 세포에서 일차섬모발생 신호 전달의 이해가 약물 내성을 극복하기 위한 전략으로 이어질 수 있다. 이 가설을 테스트하고 임상 적용 가능성을 탐색하기 위해, 본 발명자들은 다약제 내성 유방 종양 세포주 MCF-7/ADR에서 실험을 수행하였다.
예상한 바와 같이, MCF-7/ADR 세포주는 아드리아마이신(Adriamycin)-민감성 MCF-7 세포와 비교하여 약물 내성의 마커 단백질인 MDR1를 고발현하는 것으로 확인되었다(도 10a). Wnt3a의 자극은 MCF-7/ADR 세포주에서 섬모를 발현하는 세포 집단을 더 많이 유도했고, 섬모 길이도 더 길게 유도하였다. 특히, Wnt3a 자극 후 MCF-7/ADR 세포에서 매우 긴 일차섬모가 관찰되었다(도 10b 내지 10e). Wnt3a-처리된 MCF-7/ADR 세포에서 일차섬모의 평균 길이는 약 11μm이었고, 이는 Wnt3a-처리된 hTERT-RPE 세포의 약 2배(약 5μm)였다. hTERT-RPE 세포와 달리, MCF-7/ADR 세포는 Wnt3a 자극 후 길이가 20μm 이상인 일차섬모를 빈번하게 나타내었다. 이는 Wnt3a 자극에 의한 hTERT-RPE 세포에서 길이가 가장 긴 일차섬모가 약 10μm인 것을 고려하면 놀라운 결과이다.
다음으로, 본 발명자들은 hTERT-RPE 세포에서와 같이 MCF-7/ADR 세포에서 β-카테닌 p-S47 및 PCM1의 중심체 위치에 대한 Wnt3a의 효과를 분석하였다. hTERT-RPE 세포의 결과와 마찬가지로, Wnt3a의 자극은 중심체에서 β-카테닌 p-S47의 증가 및 주변중심소체 주위의 PCM1의 축적을 유발하였다(도 10f 내지 10i). 요약하면, 일차섬모 생성, β-카테닌 p-S47의 중심소체 위치화 및 PCM1의 모집에 대한 Wnt3a의 효과는 hTERT-RPE 세포에서 보다 MCF-7/ADR 세포에서 더 큰 것으로 판단되었다.
따라서, 표준 Wnt 리간드인 Wnt3a는 CK1δ-의존적 β-카테닌 S47 잔기 인산화를 유발하고 그것의 중심체로의 위치화를 유도한다. 이러한 일련의 사건은 PCM1, AZI1/CEP131 및 CEP290과 같은 중심소체위성을 중심체/기저체로 모집하여 궁극적으로 일차섬모발생을 유도한다.
그 다음으로, 유방암 유래 항암제 내성 세포인 MCF7/ADR 세포에 독소루비신(doxorubicin)을 처리한 결과, Wnt3a 자극을 준 세포들은 대조군 자극을 준 세포들 보다 생존률이 높았다(도 11a 및 11b). FACS 분석을 통해 확인한 결과 Wnt3a 자극을 받은 세포는 대조군 자극세포보다 독소루비신 처리에 저항성을 보여 더 적은 세포들이 사멸한 것으로 확인되었다(도 11c).
6. β-카테닌 p-S47에 특이적으로 결합하는 항체 서열분석
β-카테닌 p-S47에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 서열을 분석하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112020061495203-pat00002
본 발명은 세포에서 일차섬모발생에 직접적으로 관여하는, 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정할 수 있는 신규한 항체 및 이의 용도를 제공하며, 또한 본 발명은 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정함으로써 일차섬모에 의한 암 세포의 항암제 내성을 진단하거나, 항암제 내성 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> PHOSPHORYLATED BETA-CATENIN SPECIFIC ANTIBODY AND USES THEREOF <130> NP20-0018 <150> KR 10-2019-0089078 <151> 2019-07-23 <150> KR 10-2020-0012754 <151> 2020-02-03 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 781 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta catenin <400> 1 Met Ala Thr Gln Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro 1 5 10 15 Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gln Gln Gln Ser Tyr Leu Asp 20 25 30 Ser Gly Ile His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly 35 40 45 Lys Gly Asn Pro Glu Glu Glu Asp Val Asp Thr Ser Gln Val Leu Tyr 50 55 60 Glu Trp Glu Gln Gly Phe Ser Gln Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Ala 65 70 75 80 Asp Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gln Arg Val Arg Ala 85 90 95 Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gln Ile Pro Ser Thr 100 105 110 Gln Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn Val Gln Arg Leu Ala Glu Pro 115 120 125 Ser Gln Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu Ile Asn 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Gln Phe 545 550 555 560 Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu Ile Val Glu Gly Cys Thr Gly Ala 565 570 575 Leu His Ile Leu Ala Arg Asp Val His Asn Arg Ile Val Ile Arg Gly 580 585 590 Leu Asn Thr Ile Pro Leu Phe Val Gln Leu Leu Tyr Ser Pro Ile Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu Leu Ala Gln Asp 610 615 620 Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Glu Ala Glu Gly Ala Thr Ala Pro Leu 625 630 635 640 Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ala 645 650 655 Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gln Asp Tyr Lys Lys 660 665 670 Arg Leu Ser Val Glu Leu Thr Ser Ser Leu Phe Arg Thr Glu Pro Met 675 680 685 Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ala Gln Gly 690 695 700 Glu Pro Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Phe His 705 710 715 720 Ser Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Ala Leu Gly Met Asp Pro Met Met Glu 725 730 735 His Glu Met Gly Gly His His Pro Gly Ala Asp Tyr Pro Val Asp Gly 740 745 750 Leu Pro Asp Leu Gly His Ala Gln Asp Leu Met Asp Gly Leu 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180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggagac caaactggaa atcaaa 336

Claims (18)

  1. 47번 세린(Ser47)이 인산화된 베타-카테닌(β-catenin)의 서열번호 2로 표시되는 항원 결정부(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 베타-카테닌은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
  9. 제8항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. Wnt3a의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 또는 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항암제는 알킬화 약물(Alkylating agents), 항대사물질(Antimetabolites), 천연물질, 호르몬, 호르몬의 길항 약물, 표적 치료제, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 천연물질은 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelvine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 에토포사이드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 미토마이신(Mitomycin), 블레오마이신(Bleomycin), 아스파라기나제(L-Asparaginase), 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제제는 47번 세린이 인산화된 베타-카테닌의 서열번호 2로 표시되는 항원결정부(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제제는 청구항 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  16. 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제 내성 진단용 키트.
  17. (a) 암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 베타-카테닌(β-catenin)의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 정상 대조군보다 높을 경우 항암제 내성으로 진단하는 단계를 포함하는,
    항암제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  18. (a) 시험물질을 베타-카테닌(β-catenin)을 발현하는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시험물질이 접촉된 세포 또는 조직에서 베타-카테닌의 47번 세린(Ser47)의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 시험물질이 접촉되지 않은 세포 또는 조직에서의 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준을 측정하여, 상기 (b) 단계에서 측정된 베타-카테닌의 47번 세린의 인산화 수준이 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법.
KR1020200072627A 2019-07-23 2020-06-15 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 KR102264305B1 (ko)

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