RU2648154C2 - Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение - Google Patents
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648154C2 RU2648154C2 RU2016104057A RU2016104057A RU2648154C2 RU 2648154 C2 RU2648154 C2 RU 2648154C2 RU 2016104057 A RU2016104057 A RU 2016104057A RU 2016104057 A RU2016104057 A RU 2016104057A RU 2648154 C2 RU2648154 C2 RU 2648154C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dll4
- antibody
- amino acid
- vegf
- seq
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 113
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 217
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 213
- 101100372758 Danio rerio vegfaa gene Proteins 0.000 title 1
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 title 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 93
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 67
- 101000872077 Homo sapiens Delta-like protein 4 Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 36
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 21
- 102100033553 Delta-like protein 4 Human genes 0.000 claims abstract 14
- 108700041286 delta Proteins 0.000 claims description 221
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 106
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 abstract description 120
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 abstract description 120
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 182
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 117
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 39
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 38
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 35
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 35
- 102000044457 human DLL4 Human genes 0.000 description 30
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 19
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 19
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 101710120693 Myosin light chain kinase 2, skeletal/cardiac muscle Proteins 0.000 description 13
- 102100030788 Myosin light chain kinase 2, skeletal/cardiac muscle Human genes 0.000 description 13
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 13
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 13
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 10
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 102100023181 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 8
- -1 for example Substances 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 7
- 108010029755 Notch1 Receptor Proteins 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 6
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 6
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000001753 Notch4 Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010029741 Notch4 Receptor Proteins 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LCGTWRLJTMHIQZ-UHFFFAOYSA-N 5H-dibenzo[b,f]azepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2NC2=CC=CC=C21 LCGTWRLJTMHIQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 101100387419 Mus musculus Dll4 gene Proteins 0.000 description 3
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700037638 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102000001759 Notch1 Receptor Human genes 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000006884 regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 3
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 2
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 2
- 101100510615 Caenorhabditis elegans lag-2 gene Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000978766 Homo sapiens Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000011842 Serrate-Jagged Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010036039 Serrate-Jagged Proteins Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001552 human cardiac myosin light chain kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010054168 human cardiac myosin light chain kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101001073212 Arabidopsis thaliana Peroxidase 33 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010013142 Disinhibition Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical class C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101001123325 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-O Htris Chemical compound OCC([NH3+])(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108700003486 Jagged-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100028961 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 208000017414 Precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100032702 Protein jagged-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700037966 Protein jagged-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032733 Protein jagged-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710170213 Protein jagged-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002662 enteric coated tablet Substances 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000045609 human NOTCH1 Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940124280 l-arginine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000019860 lauric fat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- IDSXLJLXYMLSJM-UHFFFAOYSA-N morpholine;propane-1-sulfonic acid Chemical compound C1COCCN1.CCCS(O)(=O)=O IDSXLJLXYMLSJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009774 resonance method Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000007761 synergistic anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело, экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид, трансформированную клетку СНО для экспрессии вышеуказанного антитела, способ получения вышеуказанного антитела, фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую терапевтическое эффективное количество антитела, композицию для диагностики рака, способ диагностирования рака и способ лечения рака, включающий этап введения вышеуказанного антитела. В одном из представлений антитело специфически связывается с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и со 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленного в SEQ ID NO: 21, и антитело специфически связывается с VEGF. Изобретение расширяет арсенал антител, связывающихся с VEGF и DLL4. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 10 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к новому белку, направленному на две мишени, который включает белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4), и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF).
Уровень техники
Как сообщалось, путь передачи сигналов Notch у позвоночных и беспозвоночных животных является эволюционно высоко консервативным, играя ключевую роль в определении судьбы клеток на начальной стадии развития. Известно, что путь передачи сигналов Notch служит основным путем регуляции дифференцировки нервных клеток, внутриглазных клеток, лимфоцитов, мышечных клеток, форменных элементов крови и некоторых других клеток, а также участвует в развитии кровеносных сосудов. У млекопитающих имеются четыре рецептора семейства Notch (Notch 1, 2, 3 и 4); каждый из них синтезируется как полипептид с молекулярной массой 300-350 кДа, который расщепляется в сайте S1 фуриноподобной конвертазой в аппарате Гольджи и образует гетеродимер на клеточной поверхности. Кроме того, у млекопитающих обнаружены четыре лиганда Notch: Jagged-1/2 и дельта-подобные лиганды (DLL) 1/3/4.
Установлено, что активированный сигнальный путь Notch вызывает образование и рост опухолей в различных моделях онкогенеза. Когда в гемопоэтических клетках крыс экспрессируется активированный внутриклеточный домен Notch (NICD), развивается Т-клеточный лейкоз/лимфома; активированный рецептор Notch 1 обнаружен в почти 50% случаев острого Т-клеточного лимфобластного лейкоза (T-ALL). Кроме того, обнаружено, что при раке молочной железы у крыс (Czech II), которым ввели вирус, вызывающий раковые опухоли молочных желез у мышей (MMTV), имеет место усиленная экспрессия рецептора Notch 4, и у этих крыс повышена частота опухолей молочных желез. Сообщалось также, что рецепторы Notch, их лиганды и мишени сигнального пути Notch активированы при различных раковых заболеваниях, например, при раке шейки матки, легких, поджелудочной железы, яичников, молочных желез и предстательной железы. Известно, что рецептор Notch 1 ассоциирован с плохим прогнозом у пациенток с раком молочной железы и с метастазированием рака предстательной железы.
Дельта-подобный лиганд 4 (DLL4) - это один из лигандов класса «дельта», связывающихся с белками Notch, уровень экспрессии которых повышен в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Известно, что он является одним из основных факторов регуляции ангиогенеза. В частности, DLL4 связывается с рецептором Notch 1 или Notch 4, уровень экспрессии которого повышен в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Известно, что высокий уровень экспрессии DLL4 имеет место в опухолевых кровеносных сосудах, хотя в нормальных кровеносных сосудах этот белок тоже экспрессируется. Ангиогенезом называют механизм формирования новых кровеносных сосудов из уже существующих кровеносных сосудов. В частности, в опухолях ангиогенез вызывается ангиогенными факторами, например, фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF), для того, чтобы обеспечить поступление кислорода и питательных веществ к области раковой ткани, где имеет место гипоксия. Как известно, ангиогенез в опухолях играет важную роль не только в опухолевом росте, но и в метастазировании. Когда сигнальный путь Notch с участием DLL4 в опухолях блокирован, регуляция ангиогенеза затруднена, и таким образом можно подавить опухолевый рост. Кроме того, когда сигнальный путь Notch с участием DLL4 подавлен, возможно лечение аутоиммунных заболеваний путем увеличения числа регуляторных Т-клеток (Treg) (см. патент США №2011-0189200). По этим причинам DLL4 стал новой мишенью при лечении раковых и аутоиммунных заболеваний.
Тем временем в 2004 г. было получено одобрение Управления по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) на применение противоракового антительного препарата авастин [Avastin® (Genentech/Roche)] для подавления ангиогенеза, мишенью которых является VEGF; этот препарат с успехом широко применялся в качестве противоракового терапевтического агента. Однако проведенные недавно клинические и доклинические исследования с использованием животных моделей показали, что не все солидные опухоли чувствительны к ингибиторам VEGF; также сообщалось о ряде случаев, когда некоторые опухоли после обработки ингибиторами VEGF на начальной стадии спустя какое-то время проявляли устойчивость к такой обработке. Также сообщалось о результатах исследований, свидетельствовавших о том, что введение ингибиторов VEGF приводит к превращению раковых клеток в более агрессивные и легче дающие метастазы. Под влиянием таких сообщений были предприняты исследования и разработки новых мишеней противораковой терапии, которые позволили бы обойти устойчивость к авастину или которые бы позволяли превысить эффективность этого препарата. В числе таких новых мишеней привлекают внимание белки, участвующие в сигнальном пути DLL4/Notch. Судя по полученным на сегодняшний день данным, ожидается, что, поскольку механизмы влияния сигнальных путей VEGF/VEGFR и DLL4/Notch на ангиогенез различны, то можно достичь более сильного синергического противоракового эффекта путем полного подавления этих двух путей передачи сигналов.
Раскрытие изобретения
Технические трудности
Авторы данного изобретения предприняли значительные усилия для разработки белка, направленного на две мишени, который способен специфично связываться с DLL4 и с VEGF человеческого происхождения с тем, чтобы эффективно подавлять сигнальные пути DLL4/Notch и VEGF/VEGFR, сводя к минимуму риск иммуногенности. В результате этой работы авторы данного изобретения создали новое моноклональное антитело человеческого происхождения, специфично связывающееся с человеческим VEGF и являющееся белком, направленным на две мишени, в котором новый одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv), специфично связывающийся с человеческим DLL4, соединен с С-концевой областью белка, сходного с авастином типа IgG; авторы изобретения также обнаружили, что такой белок, направленный на две мишени, эффективно подавляет взаимодействие не только между VEGF и рецептором VEGF, но также между DLL4 и белком Notch, и таким образом обладает превосходным противораковым действием, тем самым довершая данное изобретение.
Решение технических проблем
Цель данного изобретения - предложить белок, направленный на две мишени, который включает: белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, который содержит аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21; и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF).
Другая цель данного изобретения - предложить полинуклеотид, кодирующий описанный выше белок, направленный на две мишени, экспрессионный вектор, содержащий этот полинуклеотид, и трансформант, несущий указанный экспрессионный вектор.
Еще одна цель данного изобретения - предложить способ для получения указанного белка, направленного на две мишени.
Еще одна цель данного изобретения - предложить композицию, содержащую описанный выше, направленный на две мишени.
Еще одна цель данного изобретения - предложить фармацевтическую композицию для лечения рака, которая содержит описанный выше белок, направленный на две мишени.
Еще одна цель данного изобретения - предложить композицию для диагностирования рака, которая содержит описанный выше белок, направленный на две мишени.
Еще одна цель данного изобретения - предложить способ диагностирования рака с использованием описанного выше белка, направленного на две мишени.
Еще одна цель данного изобретения - предложить конформационный эпитоп дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), включающий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21.
Еще одна цель данного изобретения - предложить моноклональные антитела, специфично связывающиеся с DLL4, которые распознают описанный выше конформационный эпитоп.
Еще одна цель данного изобретения - предложить полинуклеотид, кодирующий указанное моноклональное антитело, экспрессионный, вектор, содержащий этот полинуклеотид, и трансформант, несущий указанный экспрессионный вектор.
Еще одна цель данного изобретения - предложить способ лечения рака, включающий этап введения описанного выше белка, направленного на две мишени, индивиду, у которого подозревается рак.
Полезный эффект изобретения
Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению способен лечить рак, связываясь как с VEGF, так и с DLL4, и обладает превосходным сродством связывания и противораковым действием, поскольку включает новый белок, специфично связывающийся с DLL4. Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению можно широко использовать в области лечения и диагностирования рака.
Краткое описание иллюстраций
Фиг. 1А и 1В изображают структуру белка, направленного на две мишени, который способен связываться как с DLL4, так и с VEGF.
Фиг. 2А изображает картину итогового гель-электрофореза, полученную в результате экспрессии белка, направленного на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, в клетках СНО, очистки экспрессированного белка и анализа очищенного белка путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).
Фиг. 2В изображает картину итоговой хроматографии, полученную в результате экспрессии белка, направленного на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, в клетках СНО, очистки экспрессированного белка и анализа очищенного белка путем эксклюзионной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC).
Фиг. 3 изображает результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), проведенного с целью изучить способность белка, направленного на две мишени, связываться с DLL4 и с VEGF.
Фиг. 4А изображает результаты анализа, проведенного с помощью оптической биосенсорной системы BIACORE, для определения равновесной константы диссоциации (KD) белка, направленного на две мишени, для DLL4, являющегося антигеном-мишенью этого белка.
Фиг. 4В изображает результаты анализа, проведенного с помощью оптической биосенсорной системы BIACORE, для определения равновесной константы диссоциации (KD) белка, направленного на две мишени, для VEGF, являющегося антигеном-мишенью этого белка.
Фиг. 5 изображает результаты определения способности белка, направленного на две мишени, нейтрализовать DLL4 и VEGF, проведенного методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Фиг. 6 демонстрирует образование комплекса человеческого DLL4 с антителом MLCK2 в присутствие и в отсутствие поперечной сшивки.
Фиг. 7 изображает модель, в которой фрагмент аминокислотной последовательности DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, состоящий из аминокислотных остатков 58-65 [FRVCLKHF]), и фрагмент, представленный SEQ ID NO: 22, образуют непрерывную молекулярную поверхность в домене С2 человеческого DLL4 С2 (аминокислотные остатки 27-174).
Фиг. 8 демонстрирует результаты изучения методом вестерн-блоттинга сродства связывания мутантных белков, содержащих делегируемый фрагмент внеклеточного домена DLL4, в сравнении с белком дикого типа.
Фиг. 9А демонстрирует, что в результате обработки клеток антителами, направленными против VEGF, (авастином) пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов подавлялась зависимым от концентрации антител образом безотносительно присутствия или отсутствия DLL4.
Фиг. 9В демонстрирует, что в результате обработки клеток антителами, направленными только против DLL4, пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов имела место только в группе с DLL4 зависимым от концентрации антител, направленных против DLL4, образом.
Фиг. 9С демонстрирует, что в результате обработки клеток белком, направленным на две мишени, в группе без DLL4 наблюдалось подавление клеточной пролиферации, сходное с тем, что имело место при обработке авастином (черные столбики), а в группе с DLL4 наблюдалось ослабление эффекта подавления клеточной пролиферации по сравнению с авастином (белые столбики).
Фиг. 10 изображает результаты анализа методом вестерн-блоттинга, свидетельствующие, что белок, направленный на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, обладает активностью, состоящей в подавлении путей передачи сигналов DLL4/Notch и VEGF/VEGFR в клетках эндотелия кровеносных сосудов вены пупочного канатика человека (HUVEC).
Фиг. 11 демонстрирует, что у голых мышей с ксенографтами человеческих клеток SCH рака желудка, устойчивых к авастину, белок, направленный на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, обладает более сильным противораковым действием, чем авастин.
Фиг. 12 демонстрирует, что у голых мышей с ксенографтами человеческих клеток А549 рака легких, устойчивых к авастину, белок, направленный на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, обладает более сильным противораковым действием, чем авастин.
Наилучшее техническое выполнение изобретения
В одном из аспектов данного изобретения предлагается белок, направленный на две мишени, который включает: белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21; и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF).
В настоящем документе термин «белок, направленный на две мишени» относится к белку, который способен связываться с двумя различными антигенами (белками-мишенями). В частности, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению не существует в природе, а предпочтительно создается методами генетической инженерии или какими-либо иными методами.
Для целей данного изобретения белок, направленный на две мишени, способен связываться, с одной стороны, с VEGF, уровень экспрессии которого повышен в раковых клетках, а с другой стороны, - с DLL4, который экспрессируется в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть в форме антитела. В настоящем документе термин «белок, направленный на две мишени» употребляется взаимозаменяемо с термином «антитело, направленное на две мишени», «биспецифичное антитело» или «биспецифичный антительный белок». Предпочтительно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть направлен на VEGF и на DLL4 как на антигены. Формы белка, направленного на две мишени, по данному изобретению включают белковую форму, в которой антитело типа IgG, специфично связывающееся с VEGF, и белок, специфично связывающийся с DLL4, соединены друг с другом посредством линкерной структуры (но не ограничиваются указанным здесь). Структура белка, направленного на две мишени, по данному изобретению схематически изображена на фиг. 1А.
Говоря конкретно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 1, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 20 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).
В настоящем документе термин «антитело» относится к белковым молекулам, которые представляют собой иммуноглобулины, иммунологически взаимодействующие с определенными антигенами, и которые служат рецепторами, специфично распознающими антигены. Этот термин включает все поликлональные антитела, моноклональные антитела, полноразмерные молекулы антител и фрагменты антительных молекул. Кроме того, термин «антитело» включает формы, получаемые путем генетической инженерии, например, химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела) и гетерогенные антитела (например, биспецифичные антитела). В полноразмерной молекуле антитела имеется две полноразмерных легких цепи и две полноразмерных тяжелых цепи, причем каждая легкая цепь соединена с одной из тяжелых цепей дисульфидной связью. Полноразмерная молекула антитела может быть иммуноглобулином (Ig) типа A, D, Е, М или G (подтипы IgG включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Кроме того, термин «антитело» может включать бивалентные молекулы, диантитела, триантитела и тетраантитела. В частности, антитела, специфично связывающиеся с VEGF, могут быть иммуноглобулинами типа G.
По данному изобретению белок, направленный на две мишени, может быть представлен формой, в которой молекула иммуноглобулина типа G (IgG), специфично связывающаяся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF), и полноразмерная молекула антитела или фрагмент Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG или белковая молекула типа scFv, специфично связывающаяся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4), соединены друг с другом линкерной структурой.
Как правило, в молекулах иммуноглобулинов и одноцепочечных антител (scFv) имеются легкие и тяжелые цепи, а каждая легкая или тяжелая цепь содержит константную и вариабельную области (области антительных молекул называют также доменами). Вариабельные области легких и тяжелых цепей содержат четыре каркасных участка (FR) и три гипервариабельные области, определяющих комплементарность (участки CDR). Участки CDR в основном отвечают за связывание с эпитопом антигена. В каждой цепи CDR обычно обозначают CDR1, CDR2, и CDR3 (нумерация последовательная, начиная от N-конца полипептидной цепи; каждый CDR обычно идентифицируется по той цепи, в которой он находится.
Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, который содержит белок, связывающийся специфично с DLL4, и антитело, специфично связывающееся с VEGF, проявляет высокое сродство к DLL4 и VEGF человеческого происхождения, эффективно подавляет связывание клеток, в которых экспрессируется DLL4 (например, раковых клеток или клеток эндотелия кровеносных сосудов), с рецепторами Notch 1 или Notch 4, а также подавляет процесс ангиогенеза, включающий активацию клеток эндотелия кровеносных сосудов, в которых экспрессируется рецептор VEGF, под действием VEGF, уровень экспрессии которого повышен в раковых клетках. Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может обладать мощным терапевтическим эффектом при лечении таких заболеваний, как рак.
Антитело, специфично связывающееся с VEGF, и белок, специфично связывающийся с DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению могут сохранять свою специфичность связывания и, в частности, могут ингибировать одновременно две мишени (антигена). Таким образом, указанные антитело и белок в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению могут быть эффективнее, чем белок или антитело, связывающиеся с единичной мишенью (и ингибирующие ее), и тем самым подавлять одновременно два сигнала.
В настоящем документе термин «фрагменты антител» относится к фрагментам, обладающим способностью связываться с антигеном, и включает формы антител, связывающие антиген, например, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG и scFv. В частности, термин «фрагменты антител» включает одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), бивалентные антительные молекулы или диантитела, триантитела и тетраантитела.
В настоящем документе термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент» (scFv) относится к минимальному фрагменту молекулы антитела, содержащему полностью сайт распознавания и связывания антигена и включающему домены VH и VL молекулы антитела, которые могут быть представлены единой полипептидной цепью.
В настоящем документе выражение «белок, направленный на две мишени, который включает: белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21; и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF)», может включать любой белок, направленный на две мишени, который способен одновременно подавлять два пути передачи сигналов, в которых участвуют DLL4 и VEGF. Антитело, специфично связывающее VEGF, и белок, специфично связывающий DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению могут быть в виде полноразмерных молекул антител или антительных фрагментов, описанных выше.
В настоящем документе выражение «белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21» относится к белку, специфично связывающемуся с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21. Подразумевается, что этот белок может обладать противораковым терапевтическим действием, подавляя опухолевый рост. Этот белок способен связываться с указанным эпитопом с высоким сродством и может действовать таким образом, что активность DLL4 нейтрализуется. Этот белок может блокировать связывание DLL4 с рецептором Notch и подавлять сигнальный путь, опосредуемый DLL4. Белок, специфично связывающийся с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21 и 22, может быть представлен, в частности, полноразмерными антителами или антительными фрагментами Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG или scFv.
Белок, специфично связывающийся с конформационным эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, а именно белок, специфично связывающийся с DLL4, может включать: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7.
Конкретнее, тяжелая цепь, о которой идет речь, может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 8, а легкая цепь, о которой идет речь, может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 9. Однако обсуждаемым белком может быть также любой белок, содержащий указанные выше последовательности CDR и способный специфично связываться с DLL4, оказывая противораковое терапевтическое действие. Указанные тяжелая и легкая цепи могут быть соединены друг с другом линкерной структурой.
Кроме того, белок, специфично связывающийся с DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению может специфично связываться не только с человеческим DLL4, но также и с мышиным DLL4, и может подавлять взаимодействие между DLL4 и белком Notch.
В одном из примеров данного изобретения идентифицирован эпитоп антитела, специфично связывающегося с DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению, обладающий высокой биологической активностью, состоящей в ингибировании DLL4 и VEGF. А именно, по данному изобретению обнаружено, что указанное антитело связывается с непрерывным участком поверхности молекулы DLL4, состоящей из аминокислотных остатков с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности DLL4. Таким образом, аминокислотные остатки с 58-го по 65-й (SEQ ID NO: 22) и/или с 110-го по 115-й (SEQ ID NO: 23) аминокислотной последовательности DLL4 могут составлять эпитоп для антитела, специфично связывающегося с DLL4, по данному изобретению. Конкретнее, участок поверхности молекулы DLL4, состоящий из SEQ ID NO: 22 и 23, может быть конформационным эпитопом.
В настоящем документе термин «дельта-подобный лиганд 4 (DLL4)» относится к одному из лигандов класса «дельта», связывающихся с рецепторами Notch, и предпочтительно относится к белку, связывающемуся с Notch 1 или Notch 2 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). DLL4 может быть белком любого млекопитающего, но предпочтительно это человеческий или мышиный DLL4. Известно, что уровень экспрессии DLL4 повышен в различных опухолевых клетках, в том числе в клетках сосудистой сети опухолей, и что этот белок способствует опухолевому росту, вызывая увеличение числа аномальных сосудов, что было продемонстрировано на моделях с опухолевыми ксенографтами.
Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, который включает белок, специфично связывающийся с конформационным эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, можно эффективно использовать для лечения рака путем подавления функции DLL4. Информацию по DLL4 можно получить из известных баз данных, включая GenBank Национальных институтов здоровья США, например, по регистрационному номеру DLL4 GenBank NM_019074.3 (Gene ID: 54567 и NCBI Reference Sequence: NM_019074.3). DLL4 может содержать аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В настоящем документе термин «рецептор Notch» относится к белку, передающему сигнал по пути Notch; этот термин употребляется взаимозаменяемо с просто Notch. Рецептор Notch - это любой белок, передающий сигнал по пути Notch. Предпочтительно рецептор Notch - это рецептор Notch 1 или Notch 4 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).
В настоящем документе выражение «ингибирование взаимодействия между человеческим дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и рецептором Notch» означает, что белок, специфично связывающийся с DLL4, по данному изобретению, связываясь с DLL4, ингибирует взаимодействие между DLL4 и рецептором Notch. Предпочтительно это выражение означает, что направленный на две мишени белок, специфичный к конформационному эпитопу дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащему аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, связываясь с DLL4, ингибирует взаимодействие между DLL4 и рецептором Notch 1 или Notch 4 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Когда белок, направленный на две мишени, по данному изобретению специфично связывается с конформационным эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, он предотвращает структурное изменение рецепторов Notch, происходящее в результате связывания с ними DLL4. Таким образом предотвращается гидролиз белков Notch и тем самым подавляется передача сигналов по пути Notch. Известно, что при связывании DLL4 с рецептором Notch в опухолях увеличиваются размеры кровеносных сосудов и активируется передача сигналов между клетками эндотелия сосудов или передача сигналов по пути Notch между раковыми клетками и клетками эндотелия сосудов, что имеет значение в пролиферации опухолевых клеток и метастазировании рака.
Итак, когда в опухоли передача сигналов по пути Notch с участием DLL4 подавлена, затрудняется регуляция ангиогенеза и таким образом рост опухоли тормозится. Кроме того, при блокировании DLL4 утрата подавления клеточного роста в боковом направлении в концевом участке роста сосуда приводит к избыточным ответвлениям, в результате снижается продуктивность ангиогенных процессов и может ослабнуть снабжение кислородом, что вызовет гипоксию вокруг опухоли, а это даст противоопухолевый эффект даже в случае опухолей, проявляющих устойчивость к терапии, направленной против VEGF.
Соответственно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, содержащий белок, специфично связывающийся с DLL4, и эффективно подавляющий взаимодействие между DLL4 и Notch, может быть с успехом применен для лечения рака.
В настоящем документе выражение «антитело, специфично связывающееся с VEGF/антитело, специфичное в отношение VEGF» включает все антитела, которые специфично связываются с VEGF как с антигеном в опухолевых клетках. Конкретно говоря, этим антителом может быть используемое в терапевтических целях моноклональное антитело против VEGF, называемое бевацизумабом (авастином, Avastin®) (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Такие антитела, специфично связывающиеся с VEGF, включают полноразмерные молекулы антител или описанные выше антительные фрагменты; это могут быть иммуноглобулины типа G (IgG) (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). VEGF является лигандом, играющим важную роль в ангиогенезе; когда VEGF блокирован, ангиогенез не происходит, и таким образом возможно лечение рака. Препарат бевацизумаб (Avastin®, Genentech), получивший одобрение Управления по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA), является терапевтически применяемым антительным лекарственным средством со стабильным эффектом.
Антитела, специфично связывающиеся с VEGF, включают, в частности: вариабельную область тяжелых цепей, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 10, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 11, участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легких цепей, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 13, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 14, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 15. Конкретнее, антитела, специфично связывающиеся с VEGF, могут содержать аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 16, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 17. Однако антитело, специфично связывающееся с VEGF, может также быть любым антителом, содержащим описанные выше последовательности CDR и способным специфично связываться с VEGF, вызывая противораковый терапевтический эффект.
Антитело, специфично связывающееся с VEGF, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению способно специфично связываться с VEGF, усиленно экспрессирующимся в опухолевых клетках, и таким образом обеспечивать концентрацию белка, направленного на две мишени, по данному изобретению на опухолевых клетках, в которых экспрессируется VEGF. Также противораковая активность этого антитела обусловлена связыванием с VEGF.
В настоящем документе термин «фактор роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF)» относится к одному из факторов роста, усиливающему пролиферативную активность эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, который секретируется клетками различных типов, включая макрофаги, клетки гладких мышц и опухолевые клетки. VEGF играет важную роль в ангиогенезе у плода, а также действует как индуктор ангиогенеза для снабжения кислородом опухолевой ткани, характеризующейся быстрым ростом и интенсивным метаболизмом. Пути передачи сигналов с участием белка VEGF и его рецепторов изучались как мишени противораковых агентов у взрослых индивидов.
Кроме того, наличие сайта связывания VEGF в белке, направленном на две мишени, по данному изобретению означает подавление взаимодействия между человеческим VEGF и рецептором VEGF. Говоря конкретно, это означает, что направленный на две мишени белок, специфичный в отношении VEGF, связываясь с VEGF, подавляет взаимодействие между VEGF и VEGFR-2 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).
Для целей данного изобретения рецептор VEGF может быть любым белком, связывающимся с VEGF млекопитающих. В частности, это может быть белок, связывающийся с человеческим VEGF.
Когда взаимодействие между VEGF и рецептором VEGF подавлено направленным на две мишени белком, специфичным в отношении VEGF, по данному изобретению, подавляется путь передачи сигналов с участием VEGF/VEGF, для которого нужно связывание VEGF с рецептором VEGF. Как известно, когда в опухоли VEGF и рецептор VEGF связываются друг с другом, путь передачи сигналов с участием VEGF и рецептора VEGF в стромальных/эндотелиальных клетках опухолевой ткани активируется таким образом, что ангиогенез значительно подавляется - в отличие от механизма сигнального пути с участием DLL4 и Notch; в результате число кровеносных сосудов уменьшается и функция сосудистого русла в опухоли слабеет, что угнетает пролиферацию опухолевых клеток и метастазирование рака.
Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, специфичный в отношении DLL4 и VEGF, способен подавлять ангиогенез в опухолевой ткани путем различных механизмов, так что его можно использовать в качестве терапевтического агента с повышенной противораковой активностью.
В частности, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть представлен белком, в котором белок, специфично связывающийся с DLL4, и иммуноглобулин типа G (IgG), специфично связывающийся с VEGF, соединены друг с другом с помощью линкерной структуры.
В настоящем документе термин «линкер/линкерная структура» относится к любой структуре, которая может соединить две различные молекулы (например, биологических полимера) в одно целое с использованием водородной связи, электростатических сил, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, дисульфидной связи, солевого мостика, гидрофобных взаимодействий, ковалентной связи и проч. В частности, в линкерной структуре может иметься по меньшей мере один остаток цистеина, способный участвовать в образовании по меньшей мере одной дисульфидной связи в физиологических условиях или в иных условиях, обычно используемых применительно к пептидам (например, в условиях для очистки или хранения пептидов). Помимо того, что линкер осуществляет связь между объединяемыми молекулами, он может служить «спейсером», то есть пространственно разделять их, создавая промежуток между объединяемыми молекулами, или же действовать как шарнир для обеспечения гибкости либо жесткости продукта объединения (конъюгата). Линкерная структура может представлять собой пептидил или же не пептидную структуру. В объем роли линкерной структуры входит и прямое соединение конъюгируемых объектов пептидной или дисульфидной связью.
По данному изобретению линкер является предпочтительно полипептидом, соединяющим белок, специфично связывающий DLL4, с антителом, специфично связывающим VEGF (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Более предпочтительно, чтобы линкерная структура представляла собой пептидил, связующий С-конец области Fc антитела, специфично связывающегося с VEGF, с белком, специфично связывающимся с DLL4. Более предпочтительно, чтобы линкерная структура представляла собой пептидил, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из трех повторов мотива GGGGS. Мотив GGGGS может повторяться 1-10 раз. Наиболее предпочтительно, чтобы линкерная структура содержала аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, или аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, нуклеотидная последовательность которого представлена SEQ ID NO: 19.
Линкерный полинуклеотид (SEQ ID NO: 19):
В настоящем документе термин «не пептидный линкер» относится к биологически совместимым линкерным структурам, состоящим из по меньшей мере двух одинаковых элементов, которые могут быть соединены друг с другом любой ковалентной связью, не являющейся пептидной связью.
Примеры не пептидных линкерных структур, используемых по данному изобретению, включают гомополимеры полиэтиленгликоля (PEG), гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированные многоатомные спирты, поливиниловые спирты, полисахариды, декстран, поливинилэтиловый эфир, полимеры, способные к биологической деградации, полимеризованные липиды, хитин, гиалуроновую кислоту и их комбинации. Не пептидный линкер по данному изобретению предпочтительно является гомополимером полиэтиленгликоля. В объем данного изобретения входят также производные, которые известны в данной области техники или которые могут быть получены на современном техническом уровне в данной области техники. Не пептидный линкер по данному изобретению более предпочтительно является гомополимером полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 1 до 5 кДа. Наиболее предпочтительно, чтобы не пептидный линкер по данному изобретению имел молекулярную массу 3,4 кДа, содержал на обоих своих концах альдегидные группы и был способен соединить антитело, специфично связывающееся с VEGF, и белок, специфично связывающийся с DLL4. В частности, благодаря альдегидным функциональным группам на обоих концах линкерной структуры эффективно сводятся к минимуму неспецифичные взаимодействия.
Области соединяемых (непосредственно или через линкерную структуру) белков включают фрагменты Fc, Fab', F(ab')2, Fab, Fv и т.п. (но не ограничиваются перечисленным здесь). Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной молекулой антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью; или в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной молекулой антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью через линкерную структуру - пептидил; или в форме, являющейся сочетанием указанных (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).
Кроме того, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной тяжелой цепью антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью через пептидиловый линкер; или в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной легкой цепью антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью через пептидиловый линкер; или в форме, являющейся сочетанием указанных.
В одном из примеров по данному изобретению белок, направленный на две мишени, представленный конъюгатом авастин-DLL4 BsAb, который специфично связывается с DLL4 и с VEGF, был создан путем соединения С-конца области тяжелой цепи авастина типа IgG с белком, связывающим DLL4, типа scFv посредством линкерной структуры; для этого был получен полинуклеотид, кодирующий такой направленный на две мишени белок, полученный полинуклеотид встроили в экспрессионный вектор, который ввели в животные клетки, и из этих клеток выделили направленный на две мишени белок, включающий авастин и связывающийся с DLL4. Полученный белок, направленный на две мишени, имел структуру, в которой молекула антитела (авастина типа IgG) соединена с scFv, связывающим DLL4, посредством линкера (см. фиг. 1). Экспрессировавшийся в животных клетках белок, направленный на две мишени, на основе авастина, связывающий DLL4, был выделен, и определили его чистоту (см. фиг. 2А и 2В). Кроме того, было установлено, что этот белок, направленный на две мишени, на основе авастина, связывающий DLL4, специфично связывается со своими мишенями - VEGF и DLL4 (см. фиг. 3). Также показано, что сродство связывания этого белка, направленного на две мишени, к каждому из указанных антигенов сходно с таковым контрольных антител. А именно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению характеризовался KD=30 нМ в отношении человеческого DLL4 и KD=0,126 нМ в отношении человеческого VEGF (см. таблицы 2 и 3). Более того, было продемонстрировано, что обработка этим белком эффективно подавляет пути передачи сигналов, в которых нужны связывание DLL4 эндотелиальных клеток кровеносных сосудов с человеческим рецептором Notch 1 и связывание VEGF с рецептором VEGF (см. фиг. 10). Такие результаты позволяют полагать, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, специфичный в отношении DLL4 и VEGF, способен эффективно блокировать связывание DLL4 с рецептором Notch и связывание VEGF с рецептором VEGF, тем самым обеспечивая противораковый эффект. Обнаружено, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению оказывает противораковое действие в моделях с ксенографтами человеческих раковых клеток линий SCH (рак желудка) и А549 (рак легких) (см. фиг. 11 и 12).
В другом аспекте данного изобретения предлагаются полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, экспрессионный вектор, содержащий этот полинуклеотид, и трансформант, в который ввели указанный экспрессионный вектор.
Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, может быть (не ограничиваясь сказанным здесь) вектором, способным обеспечить репликацию и/или экспрессию указанного полинуклеотида в эукариотических или прокариотических клетках, включая клетки млекопитающих (например, человеческие, обезьяньи, кроличьи, крысиные, хомячьи или мышиные), растений, дрожжей, насекомых и бактерий (например, Esherichia coli). Предпочтительно это вектор, который содержит по меньшей мере один селективный маркер и функционально сопряжен с соответствующим промотором, так что указанный полинуклеотид может экспрессироваться в клетках-хозяевах. Более предпочтительно, чтобы указанный вектор содержал полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, в составе фага, плазмиды, космиды, минихромосомы, вирусного или ретровирусного вектора.
В экспрессионном векторе, содержащем полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, полинуклеотиды, кодирующие легкую или тяжелую цепь указанного белка, могут содержаться каждый в отдельности в своем векторе или же экспрессионный вектор содержит все полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи белка, направленного на две мишени, по данному изобретению.
Клетки, в которые вводится экспрессионный вектор по данному изобретению для образования трансформантов, включают клетки бактерий, например, E. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибов, например, дрожжей и Pichia pastoris; насекомых, например, Drosophila или Spodoptera (клетки Sf9); млекопитающих, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), миеломные клетки мыши SP2/0, лимфобластоидные клетки человека, клетки COS, миеломные клетки мыши NSO, клетки 293Т, клетки меланомы Боуэса, клетки НТ-1080, почечные клетки золотистого хомячка (BHK), человеческие эмбриональные клетки почки (HEK), человеческие клетки сетчатки (PERC.6) и др., а также растительные клетки. В одном из примеров данного изобретения в качестве клеток-хозяев использовались клетки CHO-S.
В настоящем документе термин «введение» применительно к экспрессионному вектору относится к мероприятиям, обеспечивающим попадание экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, в клетку-хозяина. Это введение может осуществляться различными методами, известными в данной области техники, включая трансфекцию с осаждением ДНК фосфатом кальция, с использованием диэтиламиноэтил-декстрана (DEAE-декстрана) или гексадиметрина бромида (полибрена) или липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосом, липофекцию и слияние протопластов. Также трансфекция означает обеспечение попадания желаемого материала внутрь клетки путем заражения вирусными частицами. Кроме того, вектор по данному изобретению может быть введен в клетку-хозяина путем бомбардировки микрочастицами. В контексте данного изобретения термины «введение» применительно к экспрессионному вектору и «трансфекция» употребляются взаимозаменяемо.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ получения белка, направленного на две мишени. Предпочтительно, способ получения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению состоит в получении белка, направленного на две мишени, который содержит белок, специфично связывающийся с DLL4, и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF), и включает следующие этапы: (а) культивирование трансформанта для получения белка, направленного на две мишени, и (b) выделение белка, полученного на этапе (а).
Более предпочтительно, когда способ получения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению включает следующие этапы: (а) получение полинуклеотида, кодирующего антитело, специфично связывающееся с VEGF, и полинуклеотида, кодирующего белок, специфично связывающийся с DLL4, включая вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7; (b) соединение посредством линкерной структуры 3'-конца той части полученного на этапе (а) полинуклеотида, кодирующего антитело, специфично связывающееся с VEGF, которая кодирует область Fc, с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего белок, специфично связывающийся с DLL4, в результате чего получается полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению; (с) клонирование полученного на этапе (b) полинуклеотида, кодирующего белок, направленный на две мишени, в результате чего получается экспрессионный вектор; (d) введение экспрессионного вектора, полученного на этапе (с), в клетки-хозяева, в результате чего получаются клетки-трансформанты, и культивирование этих клеток-трансформантов; и (е) выделение белка, направленного на две мишени, из клеток-трансформантов, полученных на этапе (d).
Кроме того, способ получения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению может включать следующие этапы: (а) получение полинуклеотида, кодирующего антитело, специфично связывающееся с VEGF, и полинуклеотида, кодирующего белок, специфично связывающийся с DLL4, включая вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7; (b) клонирование полинуклеотида полученного на этапе (а), в результате чего получается экспрессионный вектор; (с) введение экспрессионного вектора, полученного на этапе (b), в клетки-хозяева, в результате чего получаются клетки-трансформанты, и культивирование этих клеток-трансформантов; и (d) выделение антител, специфично связывающихся с VEGF, и белка, специфично связывающегося с DLL4, из клеток-трансформантов, полученных на этапе (с), и соединение посредством линкерной структуры С-конца области Fc антитела, специфично связывающего VEGF, с N-концом белка, специфично связывающего DLL4.
Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть получен рекомбинационным или биохимическим путем методами, известными в данной области техники, и указанные антитела могут быть введены в подходящие клетки-хозяева, и выделены из культуральной среды клеток-трансформантов.
В частности, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть выделен любым известным методом, применяемым для выделения белков. Например, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению удобно выделять из культуральной среды, применяя обычные методы очистки белков, например, хроматографию с использованием сефарозы А или гидроксиапатита, гель-электрофорез, диализ или аффинную хроматографию (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера).
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается композиция, содержащая белок, направленный на две мишени, по данному изобретению.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая белок, направленный на две мишени, по данному изобретению.
Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению способен связываться как с DLL4, так и с VEGF, в результате чего подавляется связывание DLL4 и VEGF с рецептором типа Notch и рецептором VEGF соответственно, и таким образом подавляется опухолевый рост. Рецепторы для DLL4 (Notch) и для VEGF (VEGFR) описаны выше. Когда композиция по данному изобретению, содержащая белок, направленный на две мишени, который специфично связывается с DLL4 и с VEGF, вводят в организм in vivo, она может подавить развитие, пролиферацию и метастазирование раковых клеток или предотвратить прогрессирование ракового заболевания и таким образом лечить рак.
В настоящем документе термин «рак» включает все раковые заболевания без ограничения, примерами которых могут быть раковые поражения пищевода, желудка, толстого кишечника, прямой кишки, полости рта, гортани, глотки, легких, толстой кишки, молочной железы, шейки матки, эндометрия, яичника, предстательной железы, яичка, мочевого пузыря, почки, печени, поджелудочной железы, костей, соединительной ткани, кожи, головного мозга, щитовидной железы, а также лейкозы, болезнь Ходжкина, лимфому и множественную миелому.
В настоящем документе термин «лечение» относится ко всем мероприятиям, которые купируют или положительным образом изменяют симптомы ракового заболевания путем введения индивиду композиции по данному изобретению.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать также фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителям или разбавителям, которые не нарушают биологическую активность и свойства вводимого в организм вещества и не вызывают раздражения. В качестве фармацевтически приемлемого носителя для композиции по данному изобретению, которая имеет форму жидкого раствора, используются стерильные биологически совместимые носители. Это может быть физиологический солевой раствор, стерильная вода, раствор Рингера, забуференный солевой раствор, раствор альбумина для инъекций, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этиловый спирт или смесь двух или более из указанных здесь субстанций. Кроме того, композиция по данному изобретению при необходимости может содержать другие обычно используемые в фармацевтических композициях дополнительные ингредиенты, в том числе антиоксиданты, забуферивающие вещества и бактериостатические агенты. Композиция по данному изобретению может быть составлена в форме для инъекций, а именно в виде водного раствора, суспензии или эмульсии, с помощью разбавителей, диспергирующих агентов, поверхностно-активных веществ, связующих агентов и веществ, улучшающих скольжение. Кроме того, композиция по данному изобретению может быть представлена такими лекарственными формами, как пилюли, капсулы, гранулы или таблетки.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть составлены различным образом, например, в форме препаратов для перорального или парентерального применения. При этом используются обычно применяемые в таких составах разбавители или эксципиенты, например, наполнители, разжижители, связующие вещества, увлажняющие агенты, дезинтегрирующие агенты, поверхностно-активные вещества и др. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по данному изобретению, составляется с использованием обычно применяемых в таких случаях разбавителей или эксципиентов, например, наполнителей, разжижителей, связующих веществ, увлажняющих агентов, дезинтегрирующих агентов и поверхностно-активных веществ. Твердые препараты для перорального применения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и др. Такие препараты изготавливаются путем смешивания соединения по данному изобретению с по меньшей мере одним эксципиентом, например, с крахмалом, карбонатом кальция, сахарозой, лактозой, желатином и др.
Помимо простых средств, могут добавляться агенты, улучшающие скольжение, например, стеарат магния, тальк и др. Жидкие препараты для перорального применения, например, суспензии, растворы для приема внутрь, эмульсии, сиропы и др., могут включать простые разбавители, например, воду или жидкий парафин, а также различные иные эксципиенты, например, увлажняющие агенты, подсластители, ароматизаторы, консерванты и др. Препараты для парентерального введения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизованные агенты, суппозитории и др. Неводные растворы и суспензии могут быть изготовлены с использованием пропиленгликоля, полэтиленгликоля, растительных масел (например, оливкового), эфиров, пригодных для введения путем инъекций (например, этилолеата). В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин (Tween-61), масло какао и его заменители (лауриновые жиры), глицериножелатин и др.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть представлена любым препаратом, выбираемым из группы, состоящей из таблеток, пилюлей, порошков, гранул, капсул, суспензий, растворов для приема внутрь, эмульсий, сиропов, стерилизованных водных растворов, неводных растворов, лиофилизованных агентов и суппозиториев.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению вводится в организм в фармацевтически эффективном количестве. В настоящем документе термин «фармацевтически эффективное количество» относится к такому количеству, которое достаточно для лечения данного заболевания с разумным соотношением риска и пользы, применимым к любому лечебному мероприятию. Эффективная дозировка композиции по данному изобретению определяется в зависимости от типа индивида, его возраста и пола, типа и степени тяжести заболевания, активности лекарственного препарата, чувствительность к нему индивида, времени и пути введения препарата, скорости его выведения из организма, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов, принимаемых данным индивидом параллельно с композицией по данному изобретению, и других факторов, известных в области медицины. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может вводиться индивиду в отдельности или же в сочетании с другими терапевтическими агентами, последовательно или одновременно с обычно принимаемыми данным индивидом терапевтическими агентами. Композиция по данному изобретению может вводиться как единичная дозированная лекарственная форма или же как дозированная лекарственная форма, образованная множественными структурно обособленными единицами. Важно вводить композицию по данному изобретению в количестве, минимальном для достижения максимального эффекта без побочных явлений, с учетом всех описанных выше факторов; это количество может легко определить специалист в данной области техники.
В одном из примеров данного изобретения было обнаружено, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может связываться как с VEGF, так и с DLL4 (см. фиг. 3, 4А и 4В), способен нейтрализовать DLL4 (фиг. 5), и обладает противораковым действием в моделях с ксенографтами человеческих раковых клеток линий SCH (рак желудка) и А549 (рак легких) (см. фиг. 11 и 12), устойчивых к авастину; все это свидетельствует, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению можно использовать в качестве активного ингредиента в композициях для лечения рака.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ лечения рака с использованием фармацевтической композиции, содержащей белок, направленный на две мишени, по данному изобретению. Этот способ включает введение индивиду фармацевтически эффективного количества указанной фармацевтической композиции. При этом белок, направленный на две мишени, по данному изобретению и фармацевтически эффективное количество такие, как описано выше.
Указанный способ лечения рака включает введение фармацевтической композиции, содержащей белок, направленный на две мишени, по данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем индивиду, у которого диагностирован или подозревается раковое заболевание. Здесь имеются в виду фармацевтически приемлемый носитель и раковое заболевание, описанные выше. Примеры индивидов, подлежащих такому лечению, включают млекопитающих, в том числе крупный рогатый скот, свиней, овец, кур, собак и людей. Пациент по данному изобретению может быть любым индивидом, у которого раковое заболевание нужно лечить путем введения в организм композиции по данному изобретению.
При этом композицию по данному изобретению можно вводить в виде жидкости, порошка, аэрозоля, капсул, таблеток с кишечнорастворимой оболочкой или суппозиториев. Композицию по данному изобретению можно вводить индивиду внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, чрескожно, перорально, местно, интраназально, внутрилегочно или интраректально (не ограничиваясь перечисленным здесь). Однако, поскольку при пероральном введении пептиды расщепляются в пищеварительном тракте, в композиции по данному изобретению, предназначенной для введения через рот, активный ингредиент должен быть защищен оболочкой или иным образом от переваривания в желудке. Кроме того, фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить индивиду при помощи любого устройства или приспособления, обеспечивающего поступление активного ингредиента к клеткам-мишеням.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается композиция для диагностирования рака, содержащая белок, направленный на две мишени, по данному изобретению. При этом белок, направленный на две мишени, по данному изобретению и раковое заболевание такие, как описано выше.
В настоящем документе термин «диагностирование» означает определение наличия или признака патологического состояния. Для целей данного изобретения термин «диагностирование» означает определение начала ракового заболевания.
Композиция для диагностирования рака по данному изобретению может использоваться следующим образом. С помощью белка, направленного на две мишени, по данному изобретению измеряют уровень белка VEGF или DLL4 в образце, взятом у индивида, у которого подозревают раковое заболевание; и если измеренный уровень VEGF или DLL4 выше, чем в контрольном образце, взятом из нормальной ткани, то считается, что данный индивид болен раком.
Применяемые для этой цели аналитические методы измерения количества белка включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг), метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунологический метод (RIA), метод радиоиммунодиффузии, в том числе двойной радиоиммунодиффузии по Оухтерлони, ракетный иммуноэлектрофорез, иммуногистохимическое окрашивание, иммунопреципитацию, метод фиксации комплемента, метод проточной цитофлуорометрии (FACS) и метод иммунопреципитации хроматина (ChiP). Применяя эти аналитические методы, сравнивают уровень белка VEGF или DLL4 в контрольном образце из нормальной ткани и в образце, взятом у индивида с подозрением на рак, и таким образом можно реально диагностировать начало ракового заболевания у данного индивида.
Композиция для диагностирования рака по данному изобретению может также содержать в дополнение к белку, направленному на две мишени, известные в данной области компоненты, требующиеся для того, чтобы применять методы определения содержания белка.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ для диагностирования рака, включающий следующие этапы: (а) определение уровня белка VEGF или DLL4 в образце, взятом у индивида с подозрением на раковое заболевание, с помощью белка, направленного на две мишени, по данному изобретению; и (b) установление того факта, что у данного индивида имеется раковое заболевания, если уровень белка VEGF или DLL4, определенный на этапе (а), выше, чем в контрольном образце из нормальной ткани. При этом белок, направленный на две мишени, раковое заболевание, индивид, диагностирование и способ (этап) определения уровня белка такие, как описано выше.
В настоящем документе подразумевается, что термин «образец» включает цельную кровь, сыворотку крови, кровь, плазму крови, слюну, мочу, мокроту, лимфу, спинномозговую жидкость и тканевую жидкость, в которых у больных раком уровень экспрессии VEGF или DLL4 отличается от нормального (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).
В другом аспекте данного изобретения предлагается конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), представленного SEQ ID NO: 21.
В одном из примеров данного изобретения аминокислотные остатки в последовательности SEQ ID NO: 21 DLL4, участвующие в поперечной сшивке, идентифицированы путем реакции образования поперечной сшивки и масс-спектрометрии. Обнаружено, что, как показано на фиг. 7, два фрагмента, а именно аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 58-го по 65-й [FRVCLKHF], и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 110-го по 115-й (SEQ ID NO: 23), образуют непрерывную молекулярную поверхность, тем самым формируя эпитоп DLL4.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются моноклональные антитела, специфично связывающиеся с DLL4, которые распознают указанный конформационный эпитоп.
В частности, такое моноклональное антитело может содержать: вариабельную область тяжелой цепи, включающую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 тяжелой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, включающую участок CDR1 легкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 7. Более конкретно, тяжелая цепь указанного антитела может содержать аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 9.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий указанное моноклональное антитело, экспрессионный вектор, включающий этот полинуклеотид, и трансформант, в который введен указанный экспрессионный вектор. Здесь DLL4, моноклональные антитела, экспрессионный вектор, трансформант и проч. по данному изобретению такие, как описано выше.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ для лечения рака, включающий этап введения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению индивиду, у которого подозревается раковое заболевание.
Индивид, о котором идет речь, - это нуждающийся в предотвращении или лечении ракового заболевания индивид, который выбирается (не ограничиваясь перечисленным здесь) из млекопитающих, включая человека, крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней, коз, верблюдов, антилоп, собак и кошек, нуждающихся в лечении рака и сходных проявлений.
В настоящем документе термин «введение» означает введение в организм индивида фармацевтической композиции по данному изобретению любым подходящим способом. Фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить в организм индивида различными путями - как перорально, так и парентерально, если только это позволяет указанной композиции достигнуть нужной ткани.
Способ лечения рака по данному изобретению включает введение индивиду белка, направленного на две мишени, по данному изобретению или содержащей его композиции в терапевтически эффективном количестве. Для специалиста в данной области техники ясно, что подходящую суточную дозу композиции по данному изобретению может определить лечащий врач/ветеринар, исходя из результатов тщательной медицинской оценки. Кроме того, введение композиции по данному изобретению может осуществляться однократно или же многократно в пределах предпочтительного диапазона ее эффективного количества. Однако в виду задач данного изобретения конкретное терапевтически эффективное количество для данного индивида зависит от различных факторов, включая тип и выраженность желаемой реакции организма, конкретный состав композиции (используются ли в ней или вместе с ней другие агенты), возраста, пола, массы тела, общего состояния здоровья и питания индивида, времени и пути введения, скорости выведения композиции из организма, продолжительности лечения, а также от того, применяются ли в сочетании с композицией по данному изобретению или параллельно с ней другие лекарственные средства, и от других факторов, известных в области медицины.
Примеры
Далее данное изобретение описывается подробнее на примерах. Рядовому специалисту в данной области техники должно быть понятно, что эти примеры служат только для иллюстрации, и их не следует считать ограничивающими объем данного изобретения. Таким образом, основной объем данного изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и эквивалентными утверждениями.
Пример 1. Получение белка, направленного на две мишени - DLL4 и VEGF
Пример 1-1. Получение антигена DLL4
В качестве антигена внеклеточного домена человеческого DLL4 использовали белок DLL4 человека (производство R&D System, номер по каталогу 1506-D4/CF). Антигенный белок DLL4 содержит аминокислотные остатки с 27-го по 524-й аминокислотной последовательности DLL4 (регистрационный номер Q9NR61). На С-конце этого белка имеется метка из 10 остатков гистидина (10-His).
Был получен антиген, соответствующий определенной области внеклеточного домена DLL4. Эта область содержит аминокислотные остатки с 27-го по 251-й. Она включает мотив, называемый DSL (delta/Serrate)/lag-2), о котором известно, что он связывается с рецептором Notch 1. Применяя стандартные процедуры технологии рекомбинантных ДНК, получали плазмидный экспрессионный вектор для клеток млекопитающих, включающий промотор CMV, расположенный в направлении 5'-конца полинуклеотида, кодирующего делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, слитый с белком Fc. Аналогичным путем получали дополнительную конструкцию, кодирующую делегируемый фрагмент DLL4, которая представляла собой гибрид - человеческий DLL4, слитый с белком Fc. Полученные конструкции ввели (временная трансфекция) в клетки HEK 293Е для экспрессии рекомбинантных слитых белков, содержащих последовательность из аминокислотных остатков с 27-го по 251-й аминокислотной последовательности человеческого DLL4, слитую с белком Fc. Для того, чтобы выделить антигенный белок, каждые 72 часа собирали кондиционированную среду; это повторяли 4 раза. Антигенный белок очищали из кондиционированной среды путем аффинной хроматографии с протеином А.
Пример 1-2. Получение фаговой библиотеки
Клетки библиотеки человеческих одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), культивировали в количестве 2,7×1010 клеток в среде (3 л), содержащей 17 г смеси 2Х YT СМ [триптон (CONDA, 1612.00), дрожжевой экстракт (CONDA, 1702.00) 10 г; NaCl (Sigma, S7653-5 кг) 5 г; хлорамфеникол (Sigma, С0857) 34 мг/мл], 2% глюкозы (Sigma, G5400) и 5 мМ MgCl2 (Sigma, М2393) при температуре 37°C в течение 2-3 часов до оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,5-0,7. После этого клетки заражали фагом-помощником и культивировали в среде 2Х YT СМК [2Х YT СМ; канамицин (Sigma, K1876) 70 мкг/мл; изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG; ELPISBIO, IPTG025) 1 мМ] при температуре 30°C в течение 16 часов. Культивированные клетки центрифугировали при 4500 об/мин в течение 15 минут при температуре 4°C. К супернатанту прибавляли раствор полиэтиленгликоля (PEG-6000; Fluka, 81253; 4%) и NaCl (Sigma, S7653; 3%), после чего инкубировали на льду в течение 1 часа. Затем этот раствор центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 минут при температуре 4°C; полученный осадок разводили в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (PBS), и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°C. Полученный супернатант, содержащий фаговую библиотеку, помещали в чистую пробирку и хранили при температуре 4°C.
Пример 1-3. Пэннинг с фаговым дисплеем
Для скрининга антител, направленных против DLL4, которые связываются с человеческим DLL4, проводили три цикла пэннинга с антигеном человеческого DLL4.
В иммунологическую пробирку помещали раствор (10 мкг/мл) рекомбинантного человеческого DLL4 (R&D System), и адсорбция белка на поверхности пробирки происходила в течение ночи при температуре 4°C; затем в пробирку прибавляли раствор бычьего сывороточного альбумина (1%) для защиты поверхности, на которой не адсорбировался DLL4. Пробирку опорожняли и добавляли в нее фаговую библиотеку антител (1012 КОЕ) в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, чтобы связать антиген. Неспецифично связавшиеся фаги отмывали физиологическим раствором, забуференным фосфатом, содержавшим 0,05% Tween-20 (PBS-T). Оставшихся фагов с специфичными к антигену антителами элюировали раствором триэтиламина (100 мМ).
Элюированные фаги нейтрализовали буферным раствором (Tris 1М, рН 7,4) и заражали ими клетки Е. coli ER2537 при температуре 37°C в течение 1 часа. Инфицированные бактериальные клетки высевали на агар Лурия-Бертани (LB), содержащий карбенициллин, и культивировали в течение ночи при температуре 37°C. Нас следующий день культивированные клетки Е. coli суспендировали в 4 мл среды «Супербульон» (SB), содержащей карбенициллин, и прибавляли туда 15%-ный глицерин. Часть этой суспензии держали при температуре -80°C, а 50 мкл культивировали в среде SB с карбенициллином, содержащей 2% глюкозы, при температуре 37°C.
Когда оптическая плотность культуральной среды при 600 нм (OD600), достигала 0,6, среду отделяли путем центрифугирования, а оставшийся материал снова суспендировали в среде SB с карбенициллином, и прибавляли к нему фаг-помощник VCSM13 (1012 КОЕ), после чего инкубировали при температуре 37°C с медленным перемешиванием. На следующий день культуральную среду собирали путем центрифугирования и осаждали с полиэтиленгликолем (PEG8000, 4%) и хлоридом натрия (NaCl, 3%) при температуре 4°C в течение 30 минут, после чего центрифугировали. Супернатант отделяли, а осажденные фаги суспендировали в 1 мл PBS. Описанную выше процедуру пэннинга повторяли, используя суспендированные фаги как библиотеку, таким образом амплифицируя и концентрируя клоны, специфичные к антигену.
Для скрининга антител, связывающихся с сайтом связывания Notch 1 человеческого белка DLL4, были проведены циклы перекрестного пэннинга с человеческим белком DLL4 и делегируемым фрагментом (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й), соответствующим определенной области человеческого DLL4. Затем клетки, содержащие ген антитела, высевали и культивировали на среде LB с карбенициллином для получения единичных колоний, которые инокулировали и инкубировали в 400 мкл среды SB с карбенициллином, после чего вызывали экспрессию белка типа scFv в периплазме Е. coli, добавляя IPTG. Клетки Е. coli суспендировали в растворе TES, содержавшем 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол (Tris), этилендиаминтетраацетат (EDTA) и сахарозу, и оставляли при температуре 4°C на 1 час. Затем суспензию центрифугировали, чтобы экстрагировать периплазму, в которой определяли связывание антигена рекомбинантного человеческого DLL4 и scFv методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Связанный scFv выявляли, используя антитела против гемагглютинина (НА), конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) и тетраметилбензидин (ТМВ) в качестве субстрата. Выявленные клоны специфичных к антигену антител секвенировали. Результаты секвенирования обнаруженных scFv представлены в таблице 1, приведенной ниже.
Антитела против DLL4, в которых имелась приведенная выше последовательность, получили название "MLCK-2".
Пример 1-4. Получение антител, направленных на две мишени - _DLL4 и VEGF (биспецифичных антител)
Антитела типа scFv, связывающие человеческий DLL4, полученные в примере 1-3, соединяли с антителами типа IgG, а именно с авастином, с помощью линкерной структуры; таким образом получался белок, направленный на две мишени, т.е. способный связываться также с человеческим VEGF (см. фиг. 1В).
В полученном белке, направленном на две мишени, имелась аминокислотная последовательность тяжелой цепи (тяжелая цепь VEGF-DLL4 BsAb), представленная SEQ ID NO: 1, и аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная SEQ ID NO: 20. Указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, включающую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7.
Для получения продукции желаемых антител в клетках СНО с помощью экспрессионного вектора, кодирующего белок, направленный на две мишени, по данному изобретению проводили трансфекцию соответствующего гена в животные клетки с использованием полимера для увеличения эффективности проникновения гена внутрь клеток. Трансфицированные клетки культивировали в 500-миллилитровых колбах Эрленмейера (Corning Costar) по 200 мл в колбе (общий объем 1 л). Смесь (1 л) среды RPMI (Invitrogen Corp.), содержащей фетальную телячью сыворотку с очень низкой концентрацией IgG (Invitrogen Corp.), и культуральной среды клеток СНО инкубировали в инкубаторе (Sanyo) в течение 4 суток; в результате образовывался рекомбинантный белок. Среду, в которой культивировались клетки, собирали и центрифугировали, чтобы отделить супернатант, содержавший рекомбинантный белок, от суспендированных клеток; супернатант фильтровали один раз с помощью вакуумного фильтра (0,22 мкм; Millipore).
Для очистки биспецифичные антитела авастин-DLL4 BsAb вначале выделяли из культуральной среды, используя колонку с сефарозой и рекомбинантным протеином А (Hitrap MabSelect Sure, 5 мл, GE healthcare). А именно, профильтрованную культуральную среду загружали на колонку с сефарозой и рекомбинантным протеином А. Колонку промывали 20-кратным объемом буферного раствора (50 мМ Tris-Cl, рН 7,5;100 мМ NaCl) и затем 10-кратным объемом буферного раствора цитрата натрия (50 мМ; рН 5,0) для удаления загрязнений. Антитела элюировали буферным раствором (5 мМ цитрата натрия, 10 мМ NaCl; рН 3,4) и нейтрализовали буферным раствором (1 М Tris-HCl (рН 8,0).
На второй стадии очистки удаляли агрегаты направленных на две мишени антител авастин-DLL4 BsAb путем гель-фильтрации, используя колонку HiLoad ТМ 26/60 Superdex 200 Prep grade GL (GE Healthcare). Колонку уравновешивали двукратным объемом буферного раствора (фосфат натрия 50 мМ; рН 6,0), содержавшего L-Arg (20 мМ), и пропускали через нее направленные на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb, которые в результате разделялись по молекулярному размеру.
Фракции, полученные в результате очистке на указанной колонке, анализировали путем гель-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) (см. фиг. 2); нужные фракции концентрировали, используя центрифужное фильтрующее устройство Amicon Ultra (30,000 MWCO, Millipore). На том же устройстве проводили буферный обмен (фосфатный буферный раствор) и дальнейшее концентрирование. Наконец, антитела фильтровали в стерильных условиях, используя шприцевый фильтр с порами размером 0,22 мкм, и измеряли поглощение при 280 нм (А280), чтобы определить концентрацию антител.
Пример 2. Определение сродства связывания белка, направленного на две мишени, с DLL4 и с VEGF методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
Сродство связывания белка, направленного на две мишени, с DLL4 и с VEGF определяли путем гомогенного конкурентного ELISA. А именно, на 96-луночный планшет (Nunc-Immuno Plate, NUNC, Рочестер, шт. Нью-Йорк, США) наносили hVEGF (R&D Systems, номер по каталогу 293-VE) в концентрации 50 нг/мл и rhDLL4 (R&D Systems, номер по каталогу 1506-D4/CF) в концентрации 200 нг/мл в объеме 100 мкл на лунку и оставляли на ночь при температуре 4°C. Сайты неспецифичного связывания блокировали бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 2 часов. Антитела на 96-луночном микропланшете разводили 1:5 начиная с 128 нм и 64 нм и по 100 мкл каждого разведения помещали в лунки планшета, покрытого белками hDLL4 и hVEGF. Планшет инкубировали в течение 2 часов и затем промывали пять раз PBS, содержавшим Tween-20 (0,05%). Для выявления связавшихся на планшете антител использовали антитела против Fab, конъюгированные с пероксидазой хрена (Pierce, номер по каталогу 31414), которые разводили 1:40000, наносили на промытый 96-луночный микропланшет и давали реакции протекать в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем проводили окрашивание, используя в качестве субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Sigma-Aldrich). Ферментативную реакцию останавливали раствором серной кислоты (0,5 мол/л) и измеряли поглощение при 450 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра (ридера) SpectraMax 190 (Molecular Devices, Inc).
Как видно на фиг. 3, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению действительно специфично связывается со своими мишенями - VEGF и DLL4.
Пример 3. Определение равновесной константы диссоциации (KD) для связывания белка, направленного на две мишени (DLL4/VEGF), с DLL4 и с VEGF
Белок, направленный на две мишени (биспецифичное антитело), который был очищен, как описано в примере 1, получил название «авacтин-DLL4 BsAb». Сродство этого очищенного антитела к соответствующим антигенам определяли следующим образом. Разницу в сродстве связывания направленного на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb с DLL4 и с VEGF определяли с помощью оптической биосенсорной системы BIACORE.
А именно, применяли метод плазмонного поверхностного резонанса, используя прибор Biacore Т200 с рабочим буферным раствором HBS-EP (10 мМ HEPES, рН 7,4; 150 мМ NaCl; 3 мМ EDTA; 0,15% поверхностно-активный агент Р20). Подготовку поверхности осуществляли согласно алгоритму для иммобилизации мишени мастера подготовки поверхности программного обеспечения прибора (условия: температура 25°C, скорость потока 5 мкл/мин). Лиганды (hVEGF и hDLL4) разводили буферным раствором (ацетат натрия 10 мМ; рН 4,5) до конечной концентрации 5 мкг/мл и 4 мкг/мл соответственно. Затем иммобилизовали их на поверхности чипа СМ5 до соответствующего уровня. При этом две проточные ячейки объединяли, так что первая и третья ячейки служили контролем, во второй ячейке на поверхности был иммобилизован hVEGF, а в четвертой - hDLL4 Первая и третья проточные ячейки служили для сравнения, чтобы учесть вариабельность эксперимента из-за неспецифичного связывания и буферного эффекта; при анализе результатов величины сдвига угла возникновения резонанса (RU) вычитались (Fc2-Fc1 и Fc4-Fc3). Направленные на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb, связывающиеся с hVEGF и с hDLL4, разводили рабочим буферным раствором до конечной молярной концентрации 100 нМ (серийные разведения 1:2) и каждое из пяти разведений подвергали анализу. Предназначенные для анализа образцы были высоко очищенными и высоко концентрированными - в достаточной степени, чтобы разводить их по меньшей мере в 100 раз; тем самым нивелировался буферный эффект. Во всех случаях при анализе использовались соответствующие мастера программного обеспечения, каждый образец дублировался и после каждой инжекции проводили регенерацию, так что стандарты эксперимента оставались неизменными.
Для анализа результатов использовали программу Biaevaluation (версия 4.0). При определении величин сдвига угла возникновения резонанса (RU) (Fc2-Fc1 и Fc4-Fc3), базовый уровень брали как нулевой, контрольная сенсограмма (инжекция буферного раствора, анализ 0 нМ) вычиталась из сенсограммы каждой пробы. Для определения сродства связывания полученные значения (RU) анализировали по модели бивалентного связывания. Определяли следующие показатели: ka (M-1c-1), kd (с-1) и KD (М). Уточним, что ka - это константа ассоциации, отражающая сродство связывания (распознавание), a kd - константа диссоциации, отражающая стабильность.
В приведенной ниже таблице 2 представлены результаты определения сродства связывания белка, направленного на две мишени, по данному изобретению с hVEGF, а в таблице 3 - результаты определения сродства связывания белка, направленного на две мишени, по данному изобретению с hDLL4.
Как можно видеть из таблиц 2 и 3, равновесная константа диссоциации KD(M) рассчитывается путем деления kd на ka (kd/ka). Результаты анализа сродства связывания с hVEGF показывают, что KD составляет около 0,126 нМ, что сходно с равновесной константой диссоциации для авастина IgG (см. фиг. 4А и таблицу 2), а результаты анализа сродства связывания с hDLL4 показывают, что KD составляет около 30 нМ (см. фиг. 4В и таблицу 3). Из этого следует, что сродство связывания белка, направленного на две мишени, по данному изобретению с каждым из указанных антигенов сохранилось на высоком уровне без изменений.
Пример 4. Определение эффекта нейтрализации для белка, направленного на две мишени (DLL4/VEGF)
Эффект нейтрализации для направленного на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb, определяли методом гомогенного конкурентного ELISA. А именно, проделывали следующее. В каждую лунку 96-луночного микропланшета (Nunc-Immuno Plate, NUNC, Рочестер, шт. Нью-Йорк, США) вносили 100 мкл белка hNotch-1-hFc (R&D Systems), разведенного PBS до концентрации 500 нг/мл, и оставляли на ночь при температуре 4°C, после чего обрабатывали BSA в течение 2 часов, чтобы блокировать сайты неспецифичного связывания.
На 96-луночном микропланшете антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb (очищенный белок) предварительно смешивали с серийными разведениями антигенного белка (человеческий DLL4-His, 600 нг/мл) при концентрациях антител от 0 нМ до 140 нМ. Смесь антиген/антитело инкубировали в течение 30 минут, затем переносили на микропланшет, предварительно покрытый белком - рецептором DLL4 hNotch-1 (50 нг на лунку), чтобы определить количество свободных антител. Планшет инкубировали в течение 2 часов, после чего промывали пять раз раствором PBS, содержащим твин (Tween-20; 0,05%). Для выявления антигена DLL4, связавшегося на планшете, использовали разведенные 1:800 поликлональные антитела против мышиного IgG с гистидиновой меткой, конъюгированные с пероксидазой хрена (Roche applied science); промытый микропланшет обрабатывали указанным разведенным антительным реагентом и давали реакции протекать в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем проводили окрашивание, используя в качестве субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Sigma-Aldrich Co.). Ферментативную реакцию останавливали раствором серной кислоты (0,5 мол/л) и измеряли поглощение при 450 нм. Полученные результаты представлены на фиг. 5. Количество антител, требующееся для достижения 50%-ного снижения количества человеческого DLL4-His, связавшегося на планшете, покрытом белком Notch 1-hFc, (IC50) показано ниже в таблице 4.
Как видно из таблицы 4, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению обладал низким IC50 в отношении DLL4, а именно 1,12 нМ, откуда следует, что его способность подавлять DLL4 сравнима с таковой антител, направленных только против DLL4.
Пример 5. Картирование эпитопа путем поперечного сшивания и масс-спектрометрии
Чтобы идентифицировать конформационный эпитоп, состоящий из множества не соседних последовательностей, образующих благодаря конформации молекулы единую поверхность, применили метод определения положений образования поперечных сшивок и масс-спектрометрический анализ.
Пример 5-1. Образование поперечно-сшитого комплекса
Антигенный белок - дельта-подобный лиганд 4 (человеческий DLL4, hDLL4, R&D Systems) и антитела MLCK2, полученные, как описано в примере 1-3, смешивали в молярном соотношении 2:1 и добавляли в эту смесь поперечно-сшивающий агент K200 (CovalX AG) до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 3 часа, чтобы образовался комплекс антиген-антитело, после чего определяли молекулярную массу продукта реакции с помощью спектрометра Ultraflex II MALDI ToF (Bruker Daltonics). Как показано на фиг. 6, при использовании поперечно-сшивающего агента человеческий DLL4 и антитела MLCK2 образовывали комплекс в соотношении 1:1 и 2:1, чего не наблюдалось в контрольном опыте, в котором поперечно-сшивающего агента не было. Однако можно видеть, что в том случае, когда человеческий DLL4 или антитела MLCK2 по отдельности находились в присутствии поперечно-сшивающего агента, ни мультимеров, ни комплексов не обнаруживалось; из этого следует, что образование комплекса hDLL4/MLCK2 происходит в результате специфичного взаимодействия DLL4 и MLCK2.
Пример 5-2. Образование фрагментов с помощью протеаз
Чтобы идентифицировать поперчено-сшитые пептидные фрагменты, использовали дисукцинимидилсуберат - d0-DSS и d12-DSS, которые смешивали друг с другом в соотношении 1:1 и растворяли в N-диметилформамиде так, чтобы концентрация была 2 мг/мл. Этот раствор прибавляли к смеси DLL4 и MLCK2, находящихся в соотношении 2:1, до конечной концентрации 0,2 мг/мл и проводили реакцию поперечного сшивания при комнатной температуре в течение 3 часов. Продукт реакции модифицировали путем восстановления и алкилирования, используя дитиотреитол (DTT) и иодацетамид, для более эффективного расщепления, и обрабатывали протеазой, например, трипсином, альфа-химотрипсином или эндопротеиназой ASP-N. Полученные фрагменты анализировали путем жидкостной нанохроматографии с помощью системы Ultimate 3000 (Dionex) и масс-спектрометрии с помощью прибора с орбитальной ионной ловушкой LTQ Orbitrap XL (Thermo). Спектрометрические данные анализировали, используя программы Xquest (версия 2.0) и Stavrox (версия 2.1), что позволило выявить пары поперечно-сшитых пептидов. В результате, как показано в приведенной ниже таблице 5, удалось определить пары пептидов, образующиеся при поперечном сшивании hDLL4 и MLCK2.
Как выяснилось, поперечные сшивки образовывались с участием аминокислотных остатков в положениях 59, 63, 64 и 110 аминокислотной последовательности DLL4. Два фрагмента полипептидной цепи - один, состоящий из аминокислотных остатков с 58-го по 65-й [FRVCLKHF] (SEQ ID NO: 22), и второй, состоящий из аминокислотных остатков с 110-го по 115-й [TWPGTF] (SEQ ID NO: 23), образуют непрерывную молекулярную поверхность в домене С2 (27-174) молекулы человеческого DLL4 (см. изображение модели на фиг. 7). Таким образом, можно считать, что эти две аминокислотные последовательности оставляют эпитоп человеческого DLL4, для антитела MLCK2.
Пример 6. Изучение карты эпитопа путем вестерн-блоттинга
Был получен набор мутантных (замена на аланин) форм человеческого DLL4, а именно аминокислотные остатки в положениях 64 (гистидин), 65 (фенилаланин) и 69 (валин) в аминокислотной последовательности внеклеточной области человеческого DLL4 были заменены на аланин. В качестве экспрессионного вектора для получения мутантов с аланиновыми заменами использовали вектор, который служил для получения антигена, соответствующего определенной области внеклеточного домена DLL4, как описано в примере 1-1. Конкретно говоря, этот вектор содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам с 27-го по 251-й аминокислотной последовательности определенной области человеческого DLL4, и эта область содержит мотив, называемый «DSL» (delta/serrate)/lag-2), о котором известно, что он связывается с рецептором Notch 1.
Применяя стандартные методы технологии рекомбинантных ДНК, получили плазмидный экспрессионный вектор для клеток млекопитающих, содержащий промотор CMV в направлении 5' от полинуклеотида, кодирующего делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, слитый с белком Fc. Для изменений в указанном экспрессионном векторе, обеспечивающих замену аминокислотных остатков в положениях 64, 65 и 69 на аланин, применили метод сайт-направленного мутагенеза с помощью набора QuikChange Site-Directed Mutagenesis, (Agilent). Полученными мутантными векторами трансфицировали животные клетки HEK293E, используя липофектамин (Lipofectamine-2000, Invitrogen) и инкубировали в течение 4 суток, после чего выделяли продукт экспрессии из культуральной среды. В качестве контроля использовали белок, содержавший делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, дикого типа.
Инкубированную в течение 4 суток среду с продуктом экспрессии центрифугировали при 1000 об/мин и комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы удалить суспендированный материал; затем супернатант фильтровали через шприц (размер пор фильтровальной насадки 0,45 мкм). Для проведения вестерн-блоттинга в полученном фильтрате определяли концентрацию белка с помощью системы Octet® (ForteBio), чтобы нагружать SDS-гели одинаковым количеством. Затем по 20 мкл каждого образца среды, содержавшей мутантный белок, наносили на два полиакриламидных геля (4-12%; Bis/Tris; Novex) и проводили электрофорез, используя морфолинопропансульфонатный буферный раствор (MOPS), при напряжении 140 В в течение 50 минут. В качестве контроля брали белок, содержавший делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, дикого типа. По окончании электрофореза полосы белков с гелей переносили на поливинилидендифторидную мембрану. Далее осуществляли две процедуры. В одной из них для того, чтобы проверить, одинаковыми ли были количества мутантного белка и белка дикого типа, когда на гели с додецилсульфатом натрия нагружали делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, мембрану с перенесенными белками обрабатывали антителами против человеческого Fc, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (1:10000) (Pierce Cat: 31413), после чего мембрану промывали три раза раствором PBS-T. Другая процедура служила для определения сродства связывания антител MLCK2 с мутантными белками; при этом вначале антитела MLCK2 (1 мкг/мл) связывали с мембраной, на которую были перенесены белки, и мембрану промывали три раза раствором PBS-T, а потом ее обрабатывали антителами против человеческого Fc, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (1:10000) и промывали три раза раствором PBS-T. Наконец, проводили детекцию с усиленной хемилюминесценцией (ECL) с помощью набора производства Amersham (GE Healthcare) и системы для визуализации гелей ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
Как показано на фиг. 8, результаты, полученные путем вестерн-блоттинга, свидетельствуют, что мутантные белки, содержащие делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4 дикого типа, нагружались в одинаковом количестве. Кроме того, при определении сродства связывания антител MLCK2 с мутантными белками, обнаружилось, что при мутации в положении 64 аминокислотной последовательности сродство связывания антител MLCK2 утрачивалось, а при мутации в положении 65 сродство связывания антител MLCK2 значительно уменьшалось. Было также показано, что мутация в положении 69 аминокислотной последовательности не влияла на сродство связывания антител MLCK2.
Пример 7. Изучение влияния антител, направленных на две мишени (DLL4/VEGF), на пролиферацию эндотелиальных клеток вены пупочного канатика человека (HUVEC)
Для изучения влияния направленных на две мишени антител, связывающихся с DLL4 и с VEGF, на пролиферацию эндотелиальных клеток вены пупочного канатика человека (HUVEC) использовались клетки HUVEC, приобретенные в компании Lonza.
Для культивирования клеток HUVEC флаконы типа Т (Nunc) покрывали буферным раствором PBS (Gibco), содержащим желатин (1%; Sigma), при комнатной температуре в течение 4-6 часов, после чего промывали PBS. В качестве культуральной среды брали среду ЕВМ-2 с EGM-2 Single Quot (Lonza); плотность клеток в культуре поддерживалась не выше 80%; культивирование проводилось при температуре 37°C в CO2 (5%)-инкубаторе. В данном эксперименте использовали клетки до 6-го пассажа. Определение влияния на пролиферацию клеток HUVEC проводили следующим образом. Вначале готовили планшет, покрытый hDLL4: за сутки до эксперимента на 96-луночном планшете (BD) rhDLL4 (R&D Systems) разводили карбонатным буферным раствором до конечной концентрации 1 мг/мл и в каждую лунку вносили по 100 мл разведенного rhDLL4, после чего планшет инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. Также клетки HUVEC культивировали в минимальной среде ЕВМ-2 с добавлением 0,1% FBS в течение 24 часов, чтобы свести к минимуму эффект сыворотки. В первый день эксперимента каждую лунку планшета, покрытого rhDLL4, промывали два раза PBS, и для каждой из четырех групп hVEGF (50 нг/мл) и антитела (авастин 20 мг/мл; антитела против DLL4 20 мг/мл; антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb 26 мг/мл) разводили минимальной средой ЕВМ-2 и добавляли в лунку, повторяя каждую пробу по три раза; затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Культуру HUVEC, голодавшую в течение 24 часов, разделяли на отдельные клетки и разводили минимальной средой ЕВМ-2 так, чтобы получалось 4×103 клеток на лунку. Разведенные клетки вводили в лунки, обработанные антителами, и инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение 96 часов. По завершении размножения клеток в каждую лунку добавляли 10 мкл набора для подсчета клеток ССК-8 (Dojino), и планшет инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение 5 часов. Определяли поглощение при 450 нм с помощью устройства для считывания с микропланшетов SpectraMax 190 (Molecular Devices) и сравнивали уровни пролиферации клеток в разных группах.
Как видно из фиг. 9 по результатам для группы с обработкой PBS, при активации пути передачи сигналов DLL4/Notch пролиферация клеток эндотелия сосудов подавляется на около 30% - в отличие от случая, когда пролиферация клеток эндотелия сосудов активирована VEGF. Выше говорилось, что, как известно, в механизмах, действующих in vivo, антитела против VEGF подавляют ангиогенез в опухолях, тем самым подавляя опухолевый рост и метастазирование, в то время как антитела против DLL4 вызывают избыточное образование аномальных кровеносных сосудов (неактивных кровеносных сосудов) в опухолях, тем самым подавляя опухолевый рост. Можно сказать, что результаты, представленные на фиг. 9, отражают различные ангиогенные механизмы с участием VEGF и DLL4 in vitro.
Как видно из фиг. 9А, когда VEGF, его рецептор и путь передачи сигналов с участием VEGFR, который играет важную роль в пролиферации клеток эндотелия кровеносных сосудов, оказываются в присутствии антител, направленных против VEGF (авастина), пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов подавляется зависимым от концентрации образом невзирая на присутствие или отсутствие DLL4. Однако, как видно из фиг. 9В, демонстрирующей результаты, полученные в эксперименте с обработкой антителами, направленными только на DLL4, в той группе, в которой DLL4 не присутствовал, концентрация антител существенно не влияла на пролиферацию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, а в группе, в случае которой DLL4 присутствовал, пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов происходила опять-таки зависимым от концентрации антител, направленных на DLL4, образом. В том случае, когда для обработки брали белок, направленный на две мишени, по данному изобретению в той группе, в случае которой DLL4 не присутствовал, белок, направленный на две мишени, оказывал подавляющее действие на пролиферацию клеток, сходное с наблюдавшимся в случае обработки авастином (фиг. 9С, черные столбики), а в той группе, в случае которой DLL4 присутствовал, подавление пролиферации клеток под влиянием белка, направленного на две мишени, было ослаблено (фиг. 9А и 9С; белые столбики).
Из того факта, что в группе, в случае которой для обработки брали антитела, направленные на DLL4, не наблюдалось подавления пролиферации клеток, сравнимого с тем, что имело место в случае обработки только антителами, направленными на VEGF, можно заключить, что антитела, направленные на две мишени, по данному изобретению эффективно подавляют оба пути передачи сигналов - и с участием VEGF, и с участием DLL4.
Пример 8. Изучение подавления путей передачи сигналов DLL4/Notch и VEGF/VEGFR антителами, направленными на две мишени (DLL4/VEGF)
Чтобы изучить подавляющую активность антител, направленных на две мишени, которые связываются с DLL4 и с VEGF, в отношении путей передачи сигналов DLL4/Notch и VEGF/VEGFR, использовали клетки HUVEC, действуя, как описано в примере 4. А именно, за сутки до эксперимента рекомбинантный человеческий DLL4 (rhDLL4, R&D Systems) разводили карбонатным буферным раствором до конечной концентрации 1 мг/мл и в каждую лунку 96-луночного планшета (BD) вносили по 1 мл разведенного rhDLL4, после чего планшет инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. В контрольной группе, в которой не делали обработку планшета rhDLL4, в лунки помещали только карбонатный буферный раствор (1 мл на лунку), после чего планшет инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. На следующий день доставали планшет, покрытый DLL4, из холодильника, промывали один раз PBS и в каждую лунку прибавляли 1 мл среды EGM-2. Затем вносили в лунки следующие субстанции: авастин 20 мг/мл; дибензазепин (DBZ) 0,08 мМ; антитела, направленные на DLL4, 20 мг/мл; антитела, направленные на DLL4 (OncoMed), 20 мг/мл; антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb 26 мг/мл. Конечный объем среды в каждой лунке составлял 2 мл, антитела добавлялись в объеме, вдвое превышающим объем среды. Планшет инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. В процессе обработки антителами брали планшет 75Т, содержащий клетки HUVEC 2-го - 5-го пассажей, среду удаляли и культуру разделяли на отдельные клетки, которые промывали путем центрифугирования и вновь суспендировали в свежей среде EGM-2. Клетки подсчитывали, затем разводили до концентрации 5×105 клеток/мл и полученную клеточную суспензию вносили в лунки планшета по 1 мл в лунку, после чего инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение одних суток. По истечении этого времени среду из лунок удаляли, клетки промывали один раз PBS и обрабатывали (2 мл на лунку) минимальной средой ЕВМ-2, содержащей 0,2% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Также каждую лунку обрабатывали антителами в тех же концентрациях (авастин 20 мг/мл; дибензазепин (DBZ) 0,08 мМ; антитела, направленные на DLL4, 20 мг/мл; антитела, направленные на DLL4 (OncoMed), 20 мг/мл; антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb 26 мг/мл), которые использовались днем ранее, и клетки инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение одних суток. Затем каждую лунку, содержащую клетки HUVEC, обработанные тем или иным антителом, обрабатывали hVEGF (R&D Systems) в концентрации 100 нг/мл и инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение 5 минут. После этого планшет вынимали и быстро удаляли среду. Клетки промывали один раз PBS и в каждую лунку вносили 150 мкл буферного раствора для лизиса [1% NP-40; 20 мМ Tris; 137 мМ NaCl; 10% глицерин; 2 мМ EDTA, 1 мМ ортованадат натрия; смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз (готовый «коктейль») 1х]; планшет встряхивали, чтобы этот раствор распределился.
Затем планшет ставили на лед, из каждой лунки собирали клетки с помощью клеточного скребка, помещали их в 1,5-миллилитровые пробирки и оставляли на льду. Каждые 5 минут пробирки с клетками брали со льда, три раза встряхивали и ставили обратно на лед, чтобы протекал лизис. Затем образцы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°C, полученный супернатант переносили в чистую пробирку и взвешивали. Для проведения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) к супернатанту прибавляли буферный раствор для образцов с SDS (5х) и кипятили при температуре 100°C в течение 10 минут, после чего проводили SDS-PAGE. Полученные образцы белка пропускали через 4-12%-ный гель (BIS-TRIS), и с разделившимися по молекулярному размеру белками проводили вестерн-блоттинг, используя следующие антитела (см. фиг. 10): NICD (клеточный сигнальный путь), P-ERK (клеточный сигнальный путь), ERK (клеточный сигнальный путь), VEGFR2 (клеточный сигнальный путь), P-VEGFR2 (клеточный сигнальный путь) и актин (Santa Cruz).
Как видно из фиг. 10, антитела, направленные на две мишени, по данному изобретению могут подавлять сигнальные пути DLL4/Notch и VEGF/VEGFR до уровня, сходного с тем, что наблюдается в случае антител, направленных только против DLL4, и антител, направленных только против VEGF.
Пример 9. Изучение противораковой активности антител, направленных на две мишени, в модели с ксенографтами клеток SCH (раковые клетки желудка человека), устойчивых к авастину
По литературным данным, человеческие раковые клетки желудка SCH устойчивы к авастину. В описываемом в данном примере эксперименте, проведенном с целью оценить противораковый эффект антител, направленных на две мишени, использовались голые мыши с ксенографтами клеток SCH.
Конкретно говоря, проделывали следующее. Раковые клетки желудка человека SCH, устойчивые к авастину, вводили самкам голых мышей, и когда размеры опухоли достигали в среднем 200 мм3, животным вводили раз в неделю один из взятых для данного эксперимента антительных препаратов (см. фиг. 11), чтобы проверить противораковую активность антител, направленных на две мишени, по данному изобретению in vivo. В этих опытах в качестве антител, направленных на две мишени, вместо антител авастин-DLL4, направленных против человеческого DLL4, использовали биспецифичные антитела авастин-мышиный DLL4, которые связываются с эпитопом мышиного DLL4 (домен DSL), эквивалентным эпитопу человеческого DLL4 (домен DSL); в итоге был продемонстрирован превосходный противораковый эффект антител, направленных на две мишени.
Как видно из фиг. 11, результаты эксперимента in vivo свидетельствуют, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, обладает существенно повышенной противораковой активностью в отношении раковых клеток желудка, устойчивых к авастину.
Пример 10. Изучение противораковой активности антител, направленных на две мишени, в модели с ксенографтами клеток А549 (раковые клетки легких человека), устойчивых к авастину
Голым мышам вводили клетки А549 и затем в течение 3 месяцев давали авастин (2,5 мг/кг массы тела в неделю), чтобы получить раковые клетки А549, устойчивые к авастину и дающие опухоли, рост и размеры которых не уменьшаются даже после лечения авастином. У этих животных брали опухоли и инкубировали устойчивые к авастину клетки А549 ex vivo, чтобы изучить эффект антител, направленных на две мишени.
Конкретно говоря, проделывали следующее. Раковые клетки легких человека А549, устойчивые к авастину, вводили самкам голых мышей, и когда размеры опухоли достигали в среднем 200 мм3, животным вводили два раза в неделю один из взятых для данного эксперимента антительных препаратов (см. фиг. 12), чтобы проверить противораковую активность антител, направленных на две мишени, по данному изобретению in vivo. В этих опытах в качестве антител, направленных на две мишени, вместо антител авастин-DLL4 направленных против человеческого DLL4, использовали биспецифичные антитела авастин-мышиный DLL4, которые связываются с эпитопом мышиного DLL4, эквивалентным эпитопу человеческого DLL4; в итоге был продемонстрирован превосходный противораковый эффект антител, направленных на две мишени.
Как видно из фиг. 12, результаты эксперимента in vivo свидетельствуют, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, обладает существенно повышенной противораковой активностью в отношении раковых клеток легких, устойчивых к авастину.
Из всего, сказанного выше, специалистам в данной области техники, которым адресовано настоящее изобретение, должно быть ясно, что оно может быть представлено другими конкретными воплощениями без изменения его технической сущности и существенных признаков. В этой связи следует учесть, что приведенные выше примеры являются во всех отношениях иллюстративными и не носят ограничительного характера. Объем данного изобретения следует считать включающим не подробное описание, а смысловое содержание и объем прилагаемой формулы изобретения, а также все изменения и модифицированные формы, происходящие от равнозначных по смыслу ее пунктов.
Claims (25)
1. Антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, где антитело специфически связывается с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и со 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4 (дельта-подобного лиганда 4), представленного в SEQ ID NO: 21, и антитело специфически связывается с фактором роста клеток эндотелия кровеносных сосудов (VEGF),
где антитело, специфически связывающееся с DLL4, включает:
вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и
вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или
где антитело, специфически связывающееся с VEGF, включает:
вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, и
вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
2. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с DLL4, и антитело типа IgG, специфически связывающееся с VEGF, соединены друг с другом посредством линкерной структуры.
3. Антитело по п. 2, в котором пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:18.
4. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с DLL4, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 8, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 9.
5. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с VEGF, содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
6. Антитело по п. 5, в котором антитело, специфически связывающееся с VEGF, является бевацизумабом.
7. Антитело по п. 1, в котором антитело, направленное на две мишени, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
8. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с DLL4, представлено полноразмерной антительной молекулой либо фрагментом Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG или scFv (одноцепочечным вариабельным фрагментом).
9. Полинуклеотид, кодирующий антитело, направленное на две мишени, по п. 1.
10. Экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид по п. 9.
11. Трансформированная клетка СНО для экспрессии антитела, направленного на две мишени, по п. 1, в которую введен экспрессионный вектор по п. 10.
12. Способ получения антитела, направленного на две мишени, содержащего антитело, специфически связывающееся с DLL4, и антитело, специфически связывающееся с фактором роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов (VEGF), который включает следующие этапы: (а) культивирование клеток-трансформантов для экспрессии биспецифического антитела по любому из пп. 1-8, для получения антитела, направленного на две мишени; и (b) выделение антитела, направленного на две мишени, которое получено на этапе (а).
13. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая терапевтически эффективное количество антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8, и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Фармацевтическая композиция по п. 13, в котором раковое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака пищевода, желудка, толстого кишечника, прямой кишки, полости рта, гортани, глотки, легких, толстой кишки, молочной железы, шейки матки, эндометрия, яичника, предстательной железы, яичка, мочевого пузыря, почки, печени, поджелудочной железы, костей, соединительной ткани, кожи, головного мозга, щитовидной железы, лейкозов, болезни Ходжкина, лимфомы и множественной миеломы.
15. Композиция для диагностирования рака, содержащая эффективное количество антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8.
16. Способ диагностирования рака, включающий следующие этапы:
(а) измерение содержания VEGF или DLL4 в образце, взятом у индивида, у которого подозревается раковое заболевание, с использованием антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8; и
(b) установление факта наличия рака у данного индивида, если содержание белка VEGF или DLL4, определенное на этапе (а), выше, чем в контрольном образце из нормальной ткани.
17. Способ лечения рака, включающий этап введения антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8 индивиду, у которого подозревается раковое заболевание.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2013-0080523 | 2013-07-09 | ||
KR20130080523 | 2013-07-09 | ||
PCT/KR2014/006090 WO2015005632A1 (ko) | 2013-07-09 | 2014-07-08 | Dll4와 vegf에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016104057A RU2016104057A (ru) | 2017-08-15 |
RU2648154C2 true RU2648154C2 (ru) | 2018-03-22 |
Family
ID=52280248
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016104057A RU2648154C2 (ru) | 2013-07-09 | 2014-07-08 | Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10184010B2 (ru) |
EP (1) | EP3020731B1 (ru) |
JP (1) | JP6283411B2 (ru) |
KR (1) | KR101673389B1 (ru) |
CN (1) | CN105518028B (ru) |
AU (1) | AU2014287984B2 (ru) |
CA (1) | CA2917402C (ru) |
ES (1) | ES2742855T3 (ru) |
PL (1) | PL3020731T3 (ru) |
RU (1) | RU2648154C2 (ru) |
TR (1) | TR201910592T4 (ru) |
WO (1) | WO2015005632A1 (ru) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112014007035B1 (pt) | 2011-09-23 | 2021-05-04 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc | anticorpos biespecíficos que se ligam a vegf/dll4, composição farmacêutica e célula procariótica, fúngica ou de levedura que compreende os mesmos, moléculas de polinucleotídeo, vetor, usos terapêuticos e método para a produção de um anticorpo |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
US11566082B2 (en) | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
AU2016326609B2 (en) | 2015-09-23 | 2023-03-09 | Mereo Biopharma 5, Inc. | Methods and compositions for treatment of cancer |
AU2016381964B2 (en) | 2015-12-30 | 2024-02-15 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
CN109311949B (zh) | 2016-05-11 | 2022-09-16 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 储存分离基质的方法 |
US11753438B2 (en) | 2016-05-11 | 2023-09-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix |
US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
ES2874974T3 (es) | 2016-05-11 | 2021-11-05 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Matriz de separación |
RU2739393C1 (ru) * | 2017-03-27 | 2020-12-23 | БайоконТАК Ко., Лтд. | АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ C N-КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТЬЮ ЛИЗИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ, ЭКСПОНИРОВАННОЙ НА КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЕ |
AU2019380595A1 (en) | 2018-11-15 | 2021-06-03 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods and monitoring of treatment with VEGF/DLL4 binding agent |
CN109666073B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-02-01 | 中国药科大学 | 一种抗人dll4和抗人vegf双特异性抗体及其制备与应用 |
JP2022553640A (ja) | 2019-10-10 | 2022-12-26 | コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド | 眼障害を処置する方法 |
WO2021092071A1 (en) | 2019-11-07 | 2021-05-14 | Oncxerna Therapeutics, Inc. | Classification of tumor microenvironments |
KR20220124008A (ko) | 2021-03-02 | 2022-09-13 | 서상로 | 자동 연마장치 |
AU2022245322A1 (en) | 2021-03-25 | 2023-10-05 | Oncxerna Therapeutics, Inc. | Targeted therapies in cancer |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090232811A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-09-17 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
WO2010040508A8 (en) * | 2008-10-08 | 2011-02-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
US20110123532A1 (en) * | 2009-04-27 | 2011-05-26 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Method for Making Heteromultimeric Molecules |
RU2011115117A (ru) * | 2008-09-19 | 2012-10-27 | Медиммун Ллк (Us) | Нацеленные средства связывания, направленные на dll4, и их применение |
WO2013044215A9 (en) * | 2011-09-23 | 2014-04-03 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Vegf/dll4 binding agents and uses thereof |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7906116B2 (en) | 2005-09-01 | 2011-03-15 | Parkash Gill | Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4 |
NO347649B1 (no) | 2006-12-14 | 2024-02-12 | Regeneron Pharma | Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse. |
US9029508B2 (en) | 2008-04-29 | 2015-05-12 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
US20110172398A1 (en) * | 2009-10-02 | 2011-07-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy |
JO3183B1 (ar) | 2010-01-29 | 2018-03-08 | Regeneron Pharma | طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4 |
JP2014500712A (ja) * | 2010-11-02 | 2014-01-16 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
KR101535341B1 (ko) | 2012-07-02 | 2015-07-13 | 한화케미칼 주식회사 | Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 |
KR20210111353A (ko) * | 2012-11-01 | 2021-09-10 | 애브비 인코포레이티드 | 항-vegf/dll4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
-
2014
- 2014-07-08 EP EP14823338.0A patent/EP3020731B1/en active Active
- 2014-07-08 WO PCT/KR2014/006090 patent/WO2015005632A1/ko active Application Filing
- 2014-07-08 TR TR2019/10592T patent/TR201910592T4/tr unknown
- 2014-07-08 JP JP2016525275A patent/JP6283411B2/ja active Active
- 2014-07-08 ES ES14823338T patent/ES2742855T3/es active Active
- 2014-07-08 CN CN201480049434.9A patent/CN105518028B/zh active Active
- 2014-07-08 AU AU2014287984A patent/AU2014287984B2/en active Active
- 2014-07-08 US US14/903,077 patent/US10184010B2/en active Active
- 2014-07-08 CA CA2917402A patent/CA2917402C/en active Active
- 2014-07-08 PL PL14823338T patent/PL3020731T3/pl unknown
- 2014-07-08 KR KR1020140085332A patent/KR101673389B1/ko active IP Right Grant
- 2014-07-08 RU RU2016104057A patent/RU2648154C2/ru active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090232811A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-09-17 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
RU2011115117A (ru) * | 2008-09-19 | 2012-10-27 | Медиммун Ллк (Us) | Нацеленные средства связывания, направленные на dll4, и их применение |
WO2010040508A8 (en) * | 2008-10-08 | 2011-02-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies |
US20110123532A1 (en) * | 2009-04-27 | 2011-05-26 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Method for Making Heteromultimeric Molecules |
WO2013044215A9 (en) * | 2011-09-23 | 2014-04-03 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Vegf/dll4 binding agents and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10184010B2 (en) | 2019-01-22 |
CN105518028B (zh) | 2019-08-13 |
US20160159929A1 (en) | 2016-06-09 |
KR20150007241A (ko) | 2015-01-20 |
CA2917402C (en) | 2019-10-22 |
EP3020731A1 (en) | 2016-05-18 |
KR101673389B1 (ko) | 2016-11-08 |
CA2917402A1 (en) | 2015-01-15 |
ES2742855T3 (es) | 2020-02-17 |
JP2016531097A (ja) | 2016-10-06 |
CN105518028A (zh) | 2016-04-20 |
PL3020731T3 (pl) | 2019-11-29 |
EP3020731B1 (en) | 2019-06-12 |
WO2015005632A1 (ko) | 2015-01-15 |
JP6283411B2 (ja) | 2018-02-21 |
RU2016104057A (ru) | 2017-08-15 |
TR201910592T4 (tr) | 2019-08-21 |
AU2014287984A1 (en) | 2016-02-04 |
AU2014287984B2 (en) | 2016-09-22 |
EP3020731A4 (en) | 2017-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2648154C2 (ru) | Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение | |
US11174309B2 (en) | Anti-ANG2 antibody | |
US20220162331A1 (en) | Anti-cd73 monoclonal antibody and application thereof | |
KR102196450B1 (ko) | Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제 | |
WO2018199318A1 (ja) | 抗gpc-1抗体 | |
BR112020015736A2 (pt) | Anticorpo anti-b7-h4, fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo | |
TWI837517B (zh) | 抗claudin 18.2和cd3的雙特異性抗體以及其用途 | |
JP2024042083A (ja) | 抗SIRPαモノクローナル抗体およびその使用 | |
ES2939013T3 (es) | Agentes que se unen específicamente al motivo RGD de la cadherina 17 humana, la cadherina 5 humana, la cadherina 6 humana y la cadherina 20 humana | |
JP2022511311A (ja) | ヒトpd‐l1抗体 | |
KR102106160B1 (ko) | 항 Ang2 항체 | |
KR20230158058A (ko) | 시알산-결합 ig-유사 렉틴 15에 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
CN114437227A (zh) | 双特异抗体及其应用 | |
KR20200144536A (ko) | Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체 | |
CN114729013A (zh) | 抗cd22抗体及其用途 | |
KR20150028087A (ko) | 항 Ang2 항체를 포함하는 혈관누수 차단제 | |
KR102195957B1 (ko) | Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체 | |
WO2022105751A1 (zh) | TGFβRII融合蛋白以及其用途 | |
US20220213201A1 (en) | Anti-tie2 antibody and use thereof | |
TW202333786A (zh) | 逆轉treml1誘導之免疫抑制之方法 |