BR112014007035B1

BR112014007035B1 - anticorpos biespecíficos que se ligam a vegf/dll4, composição farmacêutica e célula procariótica, fúngica ou de levedura que compreende os mesmos, moléculas de polinucleotídeo, vetor, usos terapêuticos e método para a produção de um anticorpo

Info

Publication number: BR112014007035B1
Application number: BR112014007035-0A
Authority: BR
Inventors: Austin L. Gurney; Aaron Ken Sato; Christopher John Bond
Original assignee: Oncomed Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2021-05-04
Also published as: PT2758073T; EP3485903B1; HK1199209A1; DK2758073T3; US9879084B2; IL231628B; PT3485903T; US20230279101A1; TWI583699B; EP2758073A1; SI3485903T1; FI3485903T3; CA2849562A1; US20130164295A1; PL2758073T3; US8858941B2; HUE042192T2; HRP20230078T1; AU2013201095B2; EP2758073A4

Abstract

AGENTES DE LIGAÇÃO A VEGF/DLL4 E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a agentes de ligação ao VEGF, agentes de ligação ao DLL4, agentes de ligação biespecíficos a VEGFIDLL4 e métodos de utilização dos agentes para o tratamento de doenças tal como câncer. A presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente ao VEGF humano, anticorpos que se ligam especificamente ao DLL4 humano e anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente ao VEGF humano e/ou ao DLL4 humano. A presente invenção fornece ainda métodos de utilização dos agentes para inibir o crescimento de tumor. São também descritos métodos de tratamento de câncer que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente ou um anticorpo da presente invenção a um paciente que possui um tumor ou um câncer.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se de forma geral a anticorpos e outros agentes que se ligam a VEGF, DLL4 ou tanto VEGF quanto DLL4, particularmente anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4, bem como a métodos de utilização dos anticorpos ou de outros agentes para o tratamento de doenças tal como câncer.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[002] A angiogênese desempenha uma função importante na patogênese de um número de distúrbios, incluindo tumores sólidos e metástase. A produção de novos vasos sanguíneos é essencial para o fornecimento de oxigênio e nutrientes para o crescimento e o espalhamento de um tumor e, portanto, a angiogênese é um bom alvo para agentes terapêuticos para câncer.

[003] A angiogênese envolve uma família de proteínas que atuam como ati- vadores angiogênicos, incluindo vascular o fator de crescimento endotelial (VEGF- A), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E e seus respectivos receptores (VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3). VEGF-A, também referido como VEGF ou fator de permeabilidade vascular (VPF), existe em várias isoformas que surgem partindo de processamento alternativo de mRNA de um único gene de VEGF, com VEGF165 sendo a isoforma mais relevante biologicamente.

[004] Foi mostrado que os anticorpos anti-VEGF suprimem o crescimento de células tumorais in vitro e in vivo. Um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado, bevacizumab (AVASTIN) foi desenvolvido e aprovado nos Estados Unidos da América como um agente terapêutico para câncer.

[005] A via de sinalização de Notch é um sistema de transdução de sinal universalmente conservado. Esta está envolvida na determinação do destino das células durante o desenvolvimento incluindo a formação do padrão embrionário e a manutenção de tecido pós-embrionário. Em adição, a sinalização de Notch foi identificada como um fator crítico na manutenção de células tronco hematopoiéticas.

[006] A via de Notch foi ligada à patogênese tanto de tumores hematológicos quanto sólidos e de cânceres. Foi mostrado que várias funções celulares e sugestões microambientais associadas com a tumorigênese são moduladas pela via de sinalização de Notch, incluindo a proliferação de células, a apoptose, a adesão e a angiogênese (Leong e outros, 2006, Blood, 107:2223-2233). Em adição, foi mostrado que receptores de Notch e/ou ligantes de Notch desempenham papéis oncogêni- cos potenciais em um número de cânceres humanos, incluindo leucemia mielogêni- ca aguda, leucemia linfocítica crônica de células B, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda de células T, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer pulmonar, câncer pancreático, câncer de próstata e câncer de pele. (Leong e outros, 2006, Blood, 107:2223-2233).

[007] O ligante tipo delta 4 (DLL4) é um componente importante da via de Notch e foi identificado como um alvo para terapia de câncer. O DLL4 é um ligante de Notch, caracterizado por um domínio N-terminal, um domínio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) e repetições similares a EGF em tandem dentro do domínio extracelular. Foi relatado que o DLL4 é induzido por VEGF e que o DLL4 pode atuar como um regulador de feedback negativo para proliferação vascular.

[008] Foi mostrado que os anticorpos anti-DLL4 aumentam o brotamento e a ramificação angiogênica que levam à angiogênese não produtiva e ao crescimento de tumor reduzido (Noguera-Troise e outros, 2006, Nature, 444:1032-1037). Em adição, foi mostrado que um anticorpo anti-DLL4, 21M18, inibe o crescimento de tumor e reduz a frequência de células tronco cancerosas em modelos de tumor de xenoen- xerto (Hoey e outros, 2009, Cell Stem Cell, 5:168-177; Patente U.S. No. 7.750.124).

[009] Embora haja progressos significativos no desenvolvimento de anticorpos monoclonais para uso em tratamentos de câncer, há ainda um enorme potencial para aprimoramentos adicionais. Uma classe de moléculas de anticorpo com a promessa de maior potência e/ou efeitos colaterais reduzidos (por exemplo, toxicidade) é anticorpos biespecíficos.

[010] Moléculas biespecíficas iniciais foram principalmente geradas utilizando reticulação química de dois anticorpos ou eram hibridomas híbridos ou “quadromas”. Um sucesso do formato de quadroma é triomabs, que são combinações de camundongo/rato que demonstram um pareamento de cadeia pesada/leve específica à espécie preferencial. Mais recentemente, avanços na engenharia de anticorpos forneceram uma ampla variedade de novos formatos de anticorpos, incluindo, mas não limitados a, scFv em tandem (bi-scFv), dianticorpos, dianticorpos em tandem (tetra-corpos), dianticorpos de cadeia isolada e anticorpos de domínio variável dual.

[011] É um dos objetivos da presente invenção fornecer moléculas aprimoradas para tratamento de câncer, particularmente anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[012] A presente invenção fornece agentes de ligação, tais como anticorpos, que se ligam a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4 (agentes de ligação a VEGF/DLL4), bem como composições, tais composições farmacêuticas, que compreendem os agentes de ligação. Os agentes de ligação que se ligam a VEGF ou a DLL4, bem como pelo menos um antígeno ou um alvo adicional e as composições farmacêuticas de tais agentes de ligação, também são fornecidos. Em certas modalidades, os agentes de ligação são novos polipeptídeos, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpo e outros polipeptídeos relacionados a tais anticorpos. Em certas modalidades, os agentes de ligação são anticorpos que se ligam especificamente ao VEGF humano. Em algumas modalidades, os agentes de ligação são anticorpos que se ligam especificamente ao DLL4 humano. Em algumas modalidades, os agentes de ligação são anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente ao VEGF humano e ao DLL4 humano. A invenção fornece ainda métodos de inibição do crescimento de um tumor através da administração dos agentes de ligação a um indivíduo com um tumor. A invenção fornece ainda métodos de tratamento de câncer através da administração dos agentes de ligação a um indivíduo que necessita dos mesmos. Em algumas modalidades, os métodos de tratamento de câncer ou de inibição do crescimento de tumor compreendem o direcionamento às células tronco cancerosas com os agentes de ligação. Em certas modalidades, os métodos compreendem a redução da frequência de células tronco cancerosas em um tumor, a redução do número de células tronco cancerosas em um tumor, a redução da tumorigenicidade de um tumor e/ou a redução da tumorigenicidade de um tumor através da redução do número ou da frequência de células tronco cancerosas no tumor.

[013] Em um aspecto, a invenção fornece um agente de ligação, tal como um anticorpo, que se liga especificamente ao VEGF humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação inibe a ligação de VEGF a pelo menos um receptor de VEGF. Em algumas modalidades, o agente de ligação inibe a ligação de VEGF a VEGFR-1 e/ou VEGFR-2. Em algumas modalidades, o agente de ligação modula a angiogênese. Em certas modalidades, o anticorpo ou outro agente de ligação se liga especificamente ainda a e/ou inibe o DLL4 humano em adição ao VEGF humano.

[014] Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[015] Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:11; e/ou uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:12.

[016] Em algumas modalidades, o agente de ligação é o anticorpo 219R45, 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 ou 219R45-MB-21R83.

[017] Em outro aspecto, a invenção fornece um agente de ligação, tal como um anticorpo, que se liga especificamente a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação inibe a ligação de DLL4 a pelo menos um receptor de Notch. Em algumas modalidades, o agente de ligação inibe a ligação de DLL4 a Notch1, Notch2, Notch3 e/ou Notch4. Em algumas modalidades, o agente de ligação inibe a sinalização de Notch. Em algumas modalidades, o agente de ligação promove angiogênese não produtiva. Em certas modalidades, o anticorpo ou outro agente de ligação se liga especificamente ainda a e/ou inibe o VEGF humano em adição ao DLL4 humano.

[018] Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que se liga a DLL4 humano e compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO:80), em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, asparagina ou glicina, X3 é asparagina ou lisina e X4 é glici- na, arginina ou ácido aspártico e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[019] Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:10; e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:12.

[020] Em algumas modalidades, o agente de ligação é o anticorpo 21R79 ou o anticorpo 219R45-MB-21R79.

[021] Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[022] Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:58; e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:12.

[023] Em algumas modalidades, o agente de ligação é o anticorpo 21R75 ou o anticorpo 219R45-MB-21R75.

[024] Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[025] Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:64; e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:12.

[026] Em algumas modalidades, o agente de ligação é o anticorpo 21R83 ou o anticorpo 219R45-MB-21R83.

[027] Em certas modalidades de cada um dos aspectos ou das modalidades mencionadas anteriormente, bem como outros aspectos e/ou modalidades descritas em outro lugar aqui, o agente de ligação é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a VEGF humano e um segundo alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a DLL4 humano e um segundo alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente tanto a VEGF humano quanto a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico modula a angiogênese. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico inibe a sinalização de Notch. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico modula a angiogênese e inibe a sinalização de Notch. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico reduz o número de frequência de células tronco cancerosas. Em certas modalidades, o anticorpo bies- pecífico compreende duas cadeias leves idênticas. Em certas modalidades o anticorpo biespecífico é um anticorpo IgG (por exemplo, IgG2).

[028] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19). Em algumas modali- dades, o anticorpo biespecífico compreende ainda: uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[029] Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO:80), em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, asparagina ou glicina, X3 é as- paragina ou lisina e X4 é glicina, arginina ou ácido aspártico e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende ainda: uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: um primeiro sítio que se liga ao an- tígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[030] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); em que o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO:80), em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, asparagina ou glicina, X3 é asparagina ou lisina e X4 é glicina, arginina ou ácido aspártico e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antí- geno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); em que o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compre- ende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); em que o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antí- geno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); em que o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende: a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); em que o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[031] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico que se liga especificamente a VEGF humano e compreende: uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11 e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a VEGF humano e compreende: uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11 e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12.

[032] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a DLL4 humano e compreende: uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especifi- camente a DLL4 humano e compreende: uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12.

[033] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano e compreende: (a) uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; (b) uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64; e (c) uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo bies- pecífico para VEGF/DLL4 compreende (a) uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; (b) uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9; e (c) uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende (a) uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; (b) uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10; e (c) uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende (a) uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; (b) uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58; e (c) uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende (a) uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11; (b) uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64; e (c) uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 95% de identidade de se-quência em relação à SEQ ID NO:12.

[034] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende (a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga a VEGF humano com uma KD entre aproximadamente 0,1 nM e aproxi-madamente 1,0 nM e (b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano com uma KD entre aproximadamente 0,1 nM e aproximadamente 20 nM. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende duas cadeias leves idênticas.

[035] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico selecionado do grupo que consiste de 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB-21R83.

[036] Em certas modalidades de cada um dos aspectos mencionados anteriormente, bem como outros aspectos e/ou modalidades descritas em outro lugar aqui, o agente de ligação ou o anticorpo está isolado.

[037] Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está isolado. Em certas modalidades, o polipeptídeo está substancialmente puro. Em certas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo ou parte de um anticorpo, tal como um fragmento de anticorpo.

[038] Em outro aspecto, a invenção fornece moléculas de polinucleotídeo isoladas que compreendem um polinucleotídeo que codifica os agentes de ligação e/ou os polipeptídeos de cada um dos aspectos mencionados anteriormente, bem como outros aspectos e/ou modalidades descritas aqui. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID vetores de expressão que compreendem os polinucleotídeos, bem como células que compreendem os vetores de expressão e/ou os polinucleotídeos. Em algumas modalidades, a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.

[039] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos de inibição do cres- cimento de um tumor, que compreendem o contato do tumor com uma quantidade eficiente de um anticorpo (ou outro agente de ligação) que se liga a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4, incluindo cada um de tais anticorpos (ou outros agentes de ligação) descritos aqui.

[040] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de inibição do crescimento de um tumor em um indivíduo, que compreende a administração ao indiví- duo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo (ou outro agente de ligação) que se liga a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4, incluindo cada um de tais anticorpos (ou outros agentes de ligação) descritos aqui.

[041] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de modulação da angiogênese em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo (ou outro agente de ligação) que se liga a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4, incluindo cada um de tais anticorpos (ou outros agentes de ligação) descritos aqui.

[042] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de redução da tumo- rigenicidade de um tumor em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo (ou outro agente de ligação) que se liga a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4, incluindo cada um de tais anticorpos (ou outros agentes de ligação) descritos aqui.

[043] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de redução da tumo- rigenicidade de um tumor em um indivíduo através da redução da frequência de células tronco cancerosas no tumor, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo (ou outro agente de ligação) que se liga a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4, incluindo cada um de tais anticorpos (ou outros agentes de ligação) descritos aqui.

[044] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos de tratamento de câncer em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo (ou outro agente de ligação) que se liga a VEGF, a DLL4 ou tanto a VEGF quanto a DLL4, incluindo cada um de tais anticorpos (ou outros agentes de ligação) descritos aqui.

[045] Composições farmacêuticas que compreendem um agente de ligação (por exemplo, anticorpo) descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável são adicionalmente fornecidas, assim como são linhagens de células que expressam e/ou produzem os agentes de ligação. Métodos de tratamento de câncer e/ou de inibição do crescimento de tumor em um indivíduo (por exemplo, um humano) que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de uma composição que compreende os agentes de ligação também são fornecidos.

[046] Quando os aspectos ou as modalidades da invenção são descritas em termos de um grupo de Markush ou outro agrupamento de alternativas, a presente invenção abrange não somente o grupo inteiro listado como um todo, mas também cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal e também o grupo principal com a ausência de um ou mais dos membros do grupo. A presente invenção também considera a exclusão explícita de um ou mais de qualquer um dos membros do grupo na invenção reivindicada.

BREVES DESCRIÇÕES DOS DESENHOS

[047] Figura 1. 1A) CDRs de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos bi- específicos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21M79, 219R45- MB-21M75 e 219R45-MB-21M83; 1B) SEQ ID NOs da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve; 1C) SEQ ID NOs de cadeia pesada e de cadeia leve.

[048] Figura 2. Ensaio de HTRF para ligação simultânea de anticorpos bies- pecíficos a VEGF humano e a DLL4 humano. Os resultados são relatados em Unidades de Fluorescência Relativa (UFR), que representam a proporção da intensidade de fluorescência relativa em 665 nm em relação à intensidade de fluorescência relativa em 620 nm. 219R45-MB-21M18 (-•-); 219R45-MB-21R79 (-■-); 219R45 mais 21M18 (-▲-); 219R45 mais 21R79 (-□-); 219R45 (-▼-); 21M18 (-◊-); 21R79 (-o- );anticorpo de controle LZ-1 (-Δ-).

[049] Figura 3. Inibição da proliferação de HUVEC induzida por VEGF por anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. A intensidade de fluorescência é lida utilizando um comprimento de onda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda de emissão de 590. 219R45-MB-21M18 (-•-); 219R45-MB-21R79 (-▲-); 219R45 (-■-); Meio sem VEGF (-◊-).

[050] Figura 4. Inibição da sinalização de Notch induzida por DLL4 por anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. A atividade da luciferase foi medida utili-zando um kit de ensaio da luciferase dual com atividade da luciferase de vaga-lume normalizada em relação à atividade da luciferase de Renilla. 219R45-MB-21M18 (-•- ); 219R45-MB-21R79 (-■-); 21M18 (-o-); 21R79 (-□-).

[051] Figura 5. Inibição de crescimento de tumor de cólon in vivo por um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4. Células de tumor de cólon OMP-C8 foram injetadas de forma subcutânea dentro de um enxerto de pele humana em camundongos NOD/SCID. Os camundongos foram tratados com anticorpo de controle (-■- ), anticorpo anti-hDLL4 21M18 (-▲-), anticorpo anti-VEGF bevacizumab (-o-) ou anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 (-▼-). Os dados são mostrados na forma do volume do tumor (fótons/s) ao longo dos dias pós- tratamento. Os anticorpos foram administrados de forma intraperitoneal em uma dose de 25mg/kg uma vez por semana.

[052] Figura 6. Tumorigenicidade de células de tumor pancreático após tratamento com anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. As células de tumor OMP-PN8 provenientes de camundongos tratados com anticorpo de controle, anticorpo anti-hDLL4 21M18, anticorpo anti-VEGF bevacizumab ou anticorpos biespecí- ficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 ou 219R45-MB-21R79 com ou sem gemcitabina foram processadas em suspensões de células isoladas e transplanta-das em série nos camundongos. 90 células de cada grupo de tratamento foram injetadas de forma subcutânea nos camundongos NOD/SCID. Foi permitido que os tumores crescessem sem tratamento. Os dados são mostrados na forma do volume do tumor (mm3) no dia 55. A frequência do tumor é mostrada na forma do número de tumores em relação ao número total de camundongos injetados em cada grupo.

[053] Figura 7. ELISA com anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecífi- cos 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB- 21R83 foram diluídos em tampão de bloqueio (1x PBS, 0,1% de gelatina, 0,1% de Polissorbato-20, pH 7,4) contendo 2 μg/mL de biotina-DLL4-hFc. Os anticorpos foram diluídos em série 3 vezes partindo de 500 ng/mL até 0,008 ng/mL. As amostras de anticorpo foram incubadas durante 2 horas em tampão de bloqueio contendo o biotina-DLL4-hFc. Após a incubação, as amostras de anticorpo foram transferidas para uma placa de ensaio revestida com VEGF (100 μL/poço) e incubadas durante 2 horas. Streptavidin-HRP foi adicionada em cada poço e incubada durante 1 h. O substrato TMB foi adicionado aos poços com um desenvolvimento de coloração de 10 minutos e a reação foi interrompida com ácido sulfúrico a 2 M. A absorbância foi lida em 450-650nm e os dados analisados utilizando o ajuste de 4 parâmetros dentro do programa de análise Softmax Pro.

[054] Figura 8. Focalização isoelétrica em capilar com imagens de anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4.

[055] Figura 9. Inibição do crescimento de tumor de cólon por anticorpos bi- específicos anti-VEGF/anti-DLL4 no modelo de recorrência de tumor. Células de tumor de cólon OMP-C8 foram injetadas de forma subcutânea em camundongos NOD/SCID. Os camundongos foram tratados com anticorpo de controle (-■-), anticorpo anti-hDLL4 21M18 (-•-), anticorpo anti-VEGF bevacizumab (-▲-), uma combinação de 21M18 e bevacizumab (-▼-), anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 (-◊-) ou anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB- 21R79 (-o-), todos em combinação com irinotecan. Os anticorpos 21M18 e bevaci- zumab foram administrados de forma intraperitoneal em uma dose de 7,5 mg/kg uma vez por semana, os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 e 219R45-MB- 21R79 foram administrados de forma intraperitoneal em uma dose de 15 mg/kg uma vez por semana e o irinotecan foi administrado durante as primeiras 4 semanas em uma dose de 45 mg/kg. Os dados são mostrados na forma do volume do tumor (mm3) ao longo dos dias pós-tratamento.

[056] Figura 10. Tumorigenicidade de células de tumor de cólon OMP-C3 após tratamento com anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. Os tumores de camundongos tratados com anticorpo de controle, anticorpo anti-hDLL4 21M18, anticorpo anti-VEGF bevacizumab, uma combinação de 21M18 e bevacizumab ou anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 ou 219R45-MB- 21R79 com ou sem irinotecan foram processados em suspensões de célula isolada e transplantados em série nos camundongos. 150 células de cada grupo de trata-mento foram injetadas de forma subcutânea nos camundongos NOD/SCID. Foi permitido que os tumores crescessem sem tratamento. Os dados são mostrados na forma do volume do tumor (mm3) no dia 68.

[057] Figura 11. Inibição do crescimento de tumor de cólon in vivo por anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. Células de tumor de cólon OMP-C8 foram injetadas de forma subcutânea em camundongos NOD/SCID. Os camundongos foram tratados com anticorpo de controle (-■-), anticorpo anti-VEGF bevacizumab (-▲- ) ou anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 (-◊-), 219R45- MB-21R75 (-•-), 219R45-MB-21R79 (-o-) ou 219R45-MB-21R83 (-▼-). Os camun-dongos foram tratados com anticorpos na forma de agentes isolados (Fig. 10A) ou em combinação com irinotecan (Fig. 10B). Os anticorpos foram administrados de forma intraperitoneal em uma dose de 15 mg/kg uma vez por semana e o irinotecan em uma dose de 7,5 mg/kg uma vez por semana. Os dados são mostrados na forma do volume do tumor (mm3) ao longo dos dias pós-tratamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[058] A presente invenção fornece novos agentes de ligação, incluindo, mas não limitados a polipeptídeos tais como anticorpos, que se ligam a VEGF e/ou a DLL4 (por exemplo, um agente de ligação a VEGF/DLL4). Polipeptídeos e polinucle- otídeos relacionados, composições que compreendem os agentes de ligação a VEGF/DLL4 e métodos de produção dos agentes de ligação a VEGF/DLL4 também são fornecidos. Os métodos de utilização dos novos agentes de ligação a VEGF/DLL4, tais como métodos de inibição do crescimento de tumor, métodos de tratamento de câncer, métodos de redução da tumorigenicidade de um tumor, métodos de redução da frequência de células tronco cancerosas em um tumor e/ou métodos de modulação da angiogênese, são adicionalmente fornecidos.

[059] Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a VEGF humano foi identificado, 219R45. Este anticorpo possui uma afinidade de ligação pelo VEGF humano de aproximadamente 0,67 nM e uma afinidade de ligação pelo VEGF de camundongo de aproximadamente 23 nM. Vários anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a DLL4 humano foram identificados, 21R79, 21R75 e 21R83. O anticorpo 21R79 possui uma afinidade de ligação pelo DLL4 humano de menos que 0,1 nM. Os anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano foram produzidos, 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB-21R83 (sequências de CDR na Figura 1). Como utilizado aqui, o “MB” dentro de um nome de anticorpo refere-se a “monovalen- te/biespecífico”. O anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M18 possui uma afinidade de ligação pelo VEGF humano de menos que 1,0 nM e uma afinidade de ligação pelo DLL4 humano de aproximadamente 16 nM. O anticorpo biespecífico 219R45- MB-21R79 possui uma afinidade de ligação pelo VEGF humano de menos que 1,0nM e uma afinidade de ligação pelo DLL4 humano de menos que 1,0 nM. O anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75 possui uma afinidade de ligação pelo DLL4 humano de aproximadamente 5 nM, enquanto que o anticorpo biespecífico 219R45- MB-21R83 possui uma afinidade de ligação pelo DLL4 humano de aproximadamente 1 nM. Os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 e 219R45-MB-21R79 se ligam a VEGF de camundongo (Exemplo 1, Tabela 3). Os anticorpos biespecíficos anti- VEGF/anti-DLL4 se ligam a VEGF humano e a DLL4 humano simultaneamente (Exemplo 2, Figura 2). Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 inibem a proliferação induzida por VEGF de células HUVEC (Exemplo 3, Figura 3). Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 inibem a sinalização de Notch induzida por DLL4 (Exemplo 4, Figura 4). Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 inibem o crescimento de tumor (Exemplos 5, 9, 11 e Figuras 5, 9, 11). Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 inibem a tumorigenicidade (Exemplos 6 e 10 e Figuras 6, 10). Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 se ligam tanto a VEGF quanto a DLL4 em um ELISA biespecífico (Exemplo 7, Figura 7). Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 são isolados e purificados em um produto que compreende pelo menos 90% de anticorpo heterodimérico (Exemplo 8, Tabela 7).

I. Definições

[060] Para facilitar um entendimento da presente invenção, um número de termos e expressões é definido a seguir.

[061] O termo “anticorpo” como utilizado aqui se refere a uma molécula de imunoglobulina que reconhece e se liga especificamente a um alvo, tal como uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um lipídeo ou combinações dos anteriores, através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno dentro da região variável da molécula de imunoglobulina. Como utilizado aqui, o termo abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclo- nais intactos, anticorpos de cadeia isolada, fragmentos de anticorpo (tais como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv), anticorpos Fv de cadeia isolada (scFv), anticorpos multiespecíficos tais como anticorpos biespecíficos, anticorpos monoespecíficos, anticorpos monovalentes, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fusão que compreendem um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno (isto é, sítio de ligação ao antíge- no) contanto que os anticorpos exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser qualquer um das cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM ou subclasses (isotipos) das mesmas (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), com base na identidade de seus domínios constantes de cadeia pesada referidos como alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As diferentes classes de imunoglobulinas possuem estruturas de subunidades diferentes e bem conhecidas e configurações tridimensionais. Os anticorpos podem estar nus ou conjugados a outras moléculas, incluindo, mas não limitadas a, toxinas e radioisóto- pos.

[062] O termo “fragmento de anticorpo” refere-se a uma porção de um anticorpo intacto e refere-se às regiões variáveis de determinação antigênica de um anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia isolada e anticorpos multiespecíficos formados partindo de fragmentos de anticorpo. “Fragmento de anticorpo” como utilizado aqui compreende um sítio de ligação ao antígeno ou um sítio de ligação ao epítopo.

[063] O termo “região variável” de um anticorpo refere-se à região variável de uma cadeia leve do anticorpo ou à região variável de uma cadeia pesada do anticorpo, isoladamente ou em combinação. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve consistem cada um de quatro regiões estruturais (FR) conectadas por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), também conhecidas como “regiões hipervariáveis”. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas regiões estruturais e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno do anticorpo. Há pelo menos duas técnicas para a determinação das CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade de sequência de espécies cruzadas (isto é, Kabat e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e (2) uma abordagem baseada nos estudos cristalográficos de complexos de antígeno-anticorpo (Al-Lazikani e outros, 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). Em adição, combinações destas duas abordagens são algumas vezes utilizadas na arte para determinar as CDRs.

[064] O termo “anticorpo monoclonal” como utilizado aqui se refere a uma população de anticorpos homogênea envolvida no reconhecimento altamente específico e na ligação de um único determinante antigênico ou epítopo. Isto está em contraste com os anticorpos policlonais que incluem tipicamente uma mistura de anticorpos diferentes direcionados contra uma variedade de diferente determinantes antigênicos. O termo “anticorpo monoclonal” abrange tanto anticorpos monoclonais intactos quanto de comprimento completo bem como fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticorpos de cadeia isolada (scFv), proteínas de fusão que compreendem uma porção do anticorpo e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno (sítio de ligação ao antígeno). Além disso, “anticorpo monoclonal” refere-se a tais anticorpos produzidos através de qualquer número de técnicas, incluindo, mas não limitadas a, produção por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante e animais transgênicos.

[065] O termo “anticorpo humanizado” como utilizado aqui se refere a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) que são cadeias de imunoglobu- lina específicas, imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos das mesmas que contêm sequências não humanas mínimas. Tipicamente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas em que os resíduos das CDRs são substituídos por resíduos das CDRs de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou hamster) que possuem a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade de ligação desejada (Jones e outros, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann e outros, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen e outros, 1988, Science, 239:1534-1536). Em alguns casos, os resíduos da região estrutural de Fv de uma imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos correspondentes em um anticorpo de uma espécie não humana que possui a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade de ligação desejada. O anticorpo humanizado pode ser adicionalmente modificado através da substituição de resíduos adicionais na região estrutural de Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos substituídos para refinar e otimizar a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade de ligação do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois ou três, domínios variáveis contendo todas ou substancialmente todas as CDRs que correspondem à imunoglobulina não humana enquanto que todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imunoglo- bulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região ou um domínio constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Os exemplos de métodos utilizados para gerar anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 5.225.539.

[066] O termo “anticorpo humano” como utilizado aqui se refere a um anticorpo produzido por um humano ou um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos correspondente a um anticorpo produzido por um humano. Um anticorpo humano pode ser produzido utilizando qualquer uma das técnicas conhecidas na arte. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende CDRs que não são humanas.

[067] O termo “anticorpo quimérico” como utilizado aqui se refere a um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada corresponde à região variável de anticorpos derivada de uma espécie de mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, coelho etc.) com a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade de ligação desejada, enquanto que as regiões constantes correspondem às sequências nos anticorpos derivados de outra espécie (geralmente humanos).

[068] A expressão “anticorpo com afinidade maturada” como utilizada aqui se refere a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs do mesmo que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo pelo antígeno, comparado a um anticorpo parental que não possui tal(is) alteração(ões). A definição inclui ainda alterações em resíduos sem ser da CDR feitas em associação com alterações nos resíduos da CDR. Os anticorpos com afinidade maturada preferidos terão afinidades nanomolares ou até mesmo picomolares pelo antígeno alvo. Os anticorpos com afinidade maturada são produzidos através de procedimentos conhecidos na arte. Por exemplo, Marks e outros, 1992, Bio/Technology 10:779-783, descrevem a maturação da afinidade através do embaralhamento dos domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de CDR e/ou estruturais é descrita por Barbas e outros, 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier e outros, 1995, Gene, 169:147155; Yelton e outros, 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson e outros, 1995, J. Immunol., 154:3310-9; e Hawkins e outros, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896. A muta- gênese direcionada ao sítio também pode ser utilizada para a obtenção de anticorpos com afinidade maturada.

[069] Os termos “epítopo” e “determinante antigênico” são utilizados de forma intercambiável aqui e referem-se àquela porção de um antígeno capaz de ser reconhecido e ligado especificamente por um anticorpo particular. Quando o antíge- no for um polipeptídeo, os epítopos podem ser formados tanto partindo de aminoáci- dos contíguos quanto de aminoácidos não contíguos justapostos pelo dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados partindo de aminoácidos contíguos (também referidos como epítopos lineares) são tipicamente retidos após a desnaturação da proteína, enquanto que os epítopos formados pelo dobramento terciário (também referidos como epítopos conformacionais) são tipicamente perdidos após a desnaturação da proteína. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3 e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.

[070] Os termos “molécula heteromultimérica” ou “heteromultímero” ou “complexo heteromultimérico” ou “polipeptídeo heteromultimérico” são utilizados de forma intercambiável aqui para se referirem a uma molécula que compreende pelo menos um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o segundo po- lipeptídeo difere em sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo em pelo menos um resíduo de aminoácido. A molécula heteromultimérica pode compreender um “heterodímero” formado pelo primeiro e pelo segundo polipeptídeos ou pode formar estruturas terciárias de ordem superior em que polipeptídeos adicionais estão presentes.

[071] Os termos “antagonista” e “antagonístico” como utilizado aqui se referem a qualquer molécula que bloqueia, inibe, reduz ou neutraliza parcialmente ou completamente uma atividade biológica de um alvo e/ou uma via de sinalização (por exemplo, a via de Notch). O termo “antagonista” é utilizado aqui para incluir qualquer molécula que bloqueia, inibe, reduz ou neutraliza parcialmente ou completamente a atividade de uma proteína. As moléculas antagonistas adequadas incluem especificamente, mas não estão limitadas a, anticorpos ou fragmentos de anticorpos antagonistas.

[072] Os termos “modulação” e “modulam” como utilizado aqui se referem a uma modificação ou uma alteração em uma atividade biológica. Modulação inclui, mas não está limitada à estimulação ou à inibição de uma atividade. Modulação pode ser um aumento ou um decréscimo na atividade (por exemplo, um decréscimo na angiogênese ou um aumento na angiogênese), uma modificação nas características de ligação ou qualquer outra modificação nas propriedades biológicas, funcionais ou imunológicas associadas com a atividade de uma proteína, uma via ou outro ponto biológico de interesse.

[073] Os termos “se liga de forma seletiva” ou “se liga especificamente” significam que um agente de ligação ou um anticorpo reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração, com maior afinidade ou com alguma combinação do que foi descrito anteriormente ao epítopo, à proteína ou à molécula alvo do que com substâncias alternativas, incluindo proteínas não relacionadas. Em certas modalidades “se liga especificamente” significa, por exemplo, que um anticorpo se liga a uma proteína com uma KD de aproximadamente 0,1 mM ou menor, mas mais geralmente menor que aproximadamente 1 μM. Em certas modalidades, “se liga especificamente” significa que um anticorpo se liga a um alvo em tempos com uma KD de pelo menos aproximadamente 0,1 μM ou menor, em outros tempos de pelo menos aproximadamente 0,01 μM ou menor e em outros tempos de pelo menos aproximadamente 1 nM ou menor. Devido à identidade de sequência entre proteínas homólogas em espécies diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo que reconhece uma proteína em mais de uma espécie (por exemplo, VEGF humano e VEGF de camundongo). Similarmente, devido à homologia dentro de certas regiões de sequências polipeptídicas de proteínas diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo (ou outro polipeptídeo ou agente de ligação) que reconhece mais de uma proteína (por exemplo, VEGF-A humano e VEGF-B humano). É entendido que, em certas modalidades, um anticorpo ou um grupamento de ligação que se liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente a um segundo alvo. Como tal, “ligação específica” não necessariamente requer (embora esta possa incluir) ligação exclusiva, isto é, ligação a um único alvo. Assim, um anticorpo pode, em certas modalidades, se ligar especificamente a mais de um alvo. Em certas modalidades, vários alvos podem estar ligados através do mesmo sítio de ligação ao antígeno sobre o anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode, em certos casos, compreender dois sítios de ligação ao antígeno idênticos, dos quais cada um se liga especificamente ao mesmo epítopo sobre duas ou mais proteínas. Em certas modalidades alternativas, um anticorpo pode ser multiespecífi- co e compreender pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno com especificidades diferentes. Com a finalidade de exemplo não limitante, um anticorpo biespecífico pode compreender um sítio de ligação ao antígeno que reconhece um epítopo sobre uma proteína (por exemplo, VEGF humano) e compreender ainda um segundo sítio de ligação ao antígeno diferente que reconhece um epítopo diferente sobre uma segunda proteína (por exemplo, DLL4 humano). Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação específica.

[074] Os termos “polipeptídeo” e “peptídeo” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável aqui e referem-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoá- cidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos abrangem ainda um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou através de intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipida- ção, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Estão também incluídos dentro da definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um amino- ácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais), bem como outras modificações conhecidas na arte. É entendido que, devido ao fato de que os polipeptídeos desta invenção podem ser baseados nos anticorpos, em certas modalidades, os po- lipeptídeos podem ocorrer na forma de cadeias isoladas ou cadeias associadas.

[075] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucléico” são utilizados de forma intercambiável aqui e referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado dentro de um polímero pela DNA ou RNA polimerase.

[076] “Condições de alta estringência” podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam força iônica baixa e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 15 mM de cloreto de sódio/1,5 mM de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina do soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio em pH 6,5 em 5x SSC (0,75 m de NaCl, 75 mM de citrato de sódio) a 42°C; ou (3) empregam durante a hibridização 50% de formamida em 5x SSC, 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão tratado com ultrassom (50 μg/mL), 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextran a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2x SSC e 50% de formamida, seguidas por uma lavagem de alta estringência consistindo de 0,1x SSC contendo EDTA a 55°C.

[077] Os termos “idênticos” ou porcentagem de “identidade” no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou que possuem uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas (introduzindo espaços, se necessário) para correspondência máxima, não considerando quaisquer substituições de aminoácidos conservati- vas como parte da identidade de sequência. A porcentagem de identidade pode ser medida utilizando software ou algoritmos de comparação de sequências ou através de inspeção visual. Vários algoritmos e softwares que podem ser utilizados para a obtenção de alinhamentos de sequências de aminoácidos ou nucleotídeos são bem conhecidos na arte. Estes incluem, mas não estão limitados a, BLAST, ALIGN, Me- galign, BestFit, GCG Wisconsin Package e variações dos mesmos. Em algumas modalidades, dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos da invenção são substancial- mente idênticos, significando que possuem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e em algumas modalidades pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, que é medida utilizando um algoritmo de comparação de sequências ou através de inspeção visual. Em algumas modalidades, a identidade existe ao longo de uma região das sequências que possui pelo menos aproximadamente 10, pelo menos aproximadamente 20, pelo menos aproximadamente 40-60 resíduos, pelo menos aproximadamente 60-80 resíduos de comprimento ou qualquer valor integral entre estes. Em algumas modalidades, a identidade existe ao longo de uma região mais longa que 60-80 resíduos, tal como pelo menos aproximadamente 80-100 resíduos e em algumas modalidades as sequências são substancialmente idênticas ao longo do comprimento completo das sequências que estão sendo comparadas, tal como a região codificadora de uma sequência de nucleotídeos.

[078] Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram identificadas na arte, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspá- rtico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleuci- na) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histi- dina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina por uma tirosina é uma substituição conservativa. Preferencialmente, as substituições conservativas nas sequências dos polipeptídeos e dos anticorpos da invenção não anulam a ligação do poli- peptídeo ou do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos, ao antígeno ao qual o polipeptídeo ou o anticorpo se liga. Os métodos de identificação de substituições conservativas de nucleotídeos e aminoácidos que não eliminam a ligação ao antígeno são bem conhecidos na arte.

[079] O termo “vetor” como utilizado aqui significa uma construção, que é capaz de fornecer e geralmente expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Os exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou de RNA nu, vetores de plasmídeos, cosmídeos ou fagos, vetores de expressão de DNA ou de RNA associados com agentes de condensação catiônicos e vetores de expressão de DNA ou de RNA encapsulados em lipossomos.

[080] Um polipeptídeo, um anticorpo, um polinucleotídeo, um vetor, uma célula ou uma composição que é “isolada” é um polipeptídeo, um anticorpo, um polinu- cleotídeo, um vetor, uma célula ou uma composição que está em uma forma não encontrada na natureza. Polipeptídeos, anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células ou composições isoladas incluem aquelas que foram purificadas até um grau em que não estão mais em uma forma em que são encontradas na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo, um anticorpo, um polinucleotídeo, um vetor, uma célula ou uma composição que está isolada está substancialmente pura.

[081] O termo “substancialmente puro” como utilizado aqui se refere a um material que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 98% puro ou pelo menos 99% puro.

[082] Os termos “câncer” e “canceroso” como utilizado aqui se referem a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos em que uma população de células é caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Os exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, blastoma, sarcoma e cânceres hematológicos tais como linfoma e leucemia.

[083] Os termos “tumor” e “neoplasma” como utilizado aqui se referem a qualquer massa de tecido que resulta do crescimento ou da proliferação celular excessiva, benigna (não cancerosa) ou maligna (cancerosa) incluindo lesões pré- cancerosas.

[084] O termo “metástase” como utilizado aqui se refere ao processo através do qual um câncer se espalha ou se transfere partindo do sítio de origem para outras regiões do corpo com o desenvolvimento de uma lesão cancerosa similar em uma nova localização. Uma célula “metastásica” ou “em metástase” é uma que perde os contatos de adesão com células vizinhas e migra através da corrente sanguínea ou da linfa partindo do sítio primário da doença para invadir estruturas do corpo vizinhas.

[085] Os termos “célula tronco cancerosa” e “CSC” e “célula tronco tumoral” e “célula iniciadora de tumor” são utilizados de forma intercambiável aqui e referem- se a células de um câncer ou um tumor que: (1) possuem capacidade de proliferação extensiva; 2) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos de progênie de células diferenciadas em que as células diferenciadas possuem potencial proliferativo ou de desenvolvimento reduzido; e (3) são capazes de divisões celulares simétricas para autorrenovação ou automanutenção. Estas propriedades conferem às células tronco cancerosas a capacidade de formar ou de estabelecer um tumor ou um câncer após o transplante em série em um hospedeiro imu- nocomprometido (por exemplo, um camundongo) comparadas com a maioria das células tumorais que falham em formar tumores. As células tronco cancerosas sofrem autorrenovação versus diferenciação de uma maneira caótica para formar tumores com tipos de células anormais que podem se alterar ao longo do tempo à medida que ocorrem mutações.

[086] Os termos “célula cancerosa” e “célula tumoral” referem-se à população total de células derivada de um câncer ou um tumor ou uma lesão pré- cancerosa, incluindo tanto células não tumorigênicas, que compreendem a massa da população de células cancerosas quanto células tronco tumorigênicas (células tronco cancerosas). Como utilizado aqui, os termos “célula cancerosa” ou “célula tumoral” serão alterados pelo termo “não tumorigênica” quando se faz referência apenas àquelas células que não possuem a capacidade de se renovar e de se diferenciar para distinguir as células tumorais das células tronco cancerosas.

[087] O termo “tumorigênico” como utilizado aqui se refere às características funcionais de uma célula tronco cancerosa incluindo as propriedades de autorreno- vação (dando origem a células tronco cancerosas tumorigênicas adicionais) e de proliferação para gerar todas as outras células tumorais (dando origem às células tumorais diferenciadas e assim não tumorigênicas).

[088] O termo “tumorigenicidade” como utilizado aqui se refere à capacidade de uma amostra de células aleatória proveniente do tumor de formar tumores palpáveis após o transplante em série em hospedeiros imunocomprometidos (por exemplo, camundongos). Esta definição inclui ainda populações de células tronco cancerosas enriquecidas e/ou isoladas que formam tumores palpáveis após o transplante em série em hospedeiros imunocomprometidos (por exemplo, camundongos).

[089] O termo “indivíduo” refere-se a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, mas não limitado a, humanos, primatas não humanos, caninos, felinos, roedores e similares, que deverá ser o receptor de um tratamento particular. Tipicamente, os termos “indivíduo” e “paciente” são utilizados de forma intercambiá- vel aqui em referência a um indivíduo humano.

[090] O termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se a um produto ou um composto aprovado (ou aprovável) por uma agência reguladora do Governo Federal ou um governo estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopeia ge-ralmente reconhecida para uso em animais, incluindo humanos.

[091] Os termos “excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitá- vel” ou “veículo farmaceuticamente aceitável” referem-se a um excipiente, um veículo ou um adjuvante que pode ser administrado a um indivíduo, junto com pelo menos um agente de ligação (por exemplo, um anticorpo) da presente divulgação e que não destrói a atividade do agente de ligação. O excipiente, o veículo ou o adjuvante deve ser atóxico quando administrado com um agente de ligação em doses suficientes para fornecer um efeito terapêutico.

[092] Os termos “quantidade eficiente” ou “quantidade terapeuticamente eficiente” ou “efeito terapêutico” referem-se a uma quantidade de um agente de ligação, um anticorpo, um polipeptídeo, um polinucleotídeo, uma molécula orgânica pe-quena ou outro fármaco eficiente para “tratar” uma doença ou um distúrbio em um indivíduo ou um mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficiente de um fármaco (por exemplo, um anticorpo) possui um efeito terapêutico e como tal reduz o número de células cancerosas; diminui a tumorigenicidade, a frequência tumorigênica ou a capacidade tumorigênica; reduz o número ou a frequência de células tronco cancerosas; reduz o tamanho do tumor; reduz a população de células cancerosas; inibe e/ou interrompe a infiltração de células cancerosas para dentro de órgãos periféricos incluindo, por exemplo, o espalhamento de câncer para dentro do tecido mole e do osso; inibe e/ou interrompe a metástase das células tu- morais ou cancerosas; inibe e/ou interrompe o crescimento das células tumorais ou cancerosas; alivia até alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o câncer; reduz a morbidez e a mortalidade; melhora a qualidade de vida; ou uma combinação de tais efeitos. Até a extensão em que o agente, por exemplo, um anticorpo, previne o crescimento e/ou mata as células cancerosas existentes, este pode ser referido como citostático e/ou citotóxico.

[093] Os termos “tratando” ou “tratamento” ou “tratar” ou “aliviando” ou “aliviar” referem-se tanto a 1) medidas terapêuticas que curam, retardam, diminuem os sintomas de e/ou interrompem a progressão de um estado de saúde ou distúrbio patológico diagnosticado quanto a 2) medidas profiláticas ou preventivas que previnem ou retardam o desenvolvimento de um estado de saúde ou um distúrbio patológico alvo. Assim aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já com o distúrbio; aqueles propensos a terem o distúrbio; e aqueles nos quais o distúrbio deve ser prevenido. Em algumas modalidades, um indivíduo é “tratado” de forma bem sucedida de acordo com os métodos da presente invenção se o paciente exibir um ou mais dos seguintes: uma redução no número de ou ausência completa de células cancerosas; uma redução no tamanho do tumor; inibição de ou uma ausência de infiltração de células cancerosas para dentro de órgãos periféricos incluindo o espalhamento de células cancerosas para dentro de tecido mole e osso; inibição de ou uma ausência de metástase de células tumorais ou cancerosas; inibição ou uma ausência de crescimento do câncer; alívio de um ou mais sintomas associados com o câncer específico; morbidez e mortalidade reduzidas; aprimoramento na qualidade de vida; redução na tumorigenicidade; redução no número ou na frequência de célu-las tronco cancerosas; ou alguma combinação dos efeitos.

[094] Como utilizado na presente divulgação e nas reivindicações, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as formas no plural a não ser que o contexto determine claramente o contrário.

[095] É entendido que onde quer que as modalidades são descritas aqui com a linguagem “que compreende(m)” modalidades de outra maneira homólogas descritas em termos de “consistindo de” e/ou “consistindo essencialmente de” também são fornecidas. Também é entendido que onde quer que as modalidades são descritas aqui com a linguagem “consistindo essencialmente de” modalidades de outra maneira homólogas descritas em termos de “consistindo de” também são for-necidas.

[096] É pretendido que o termo “e/ou” como utilizado em uma expressão tal como “A e/ou B” aqui inclua tanto A quanto B; A ou B; A (isoladamente); e B (isola- damente). Similarmente, é pretendido que o termo “e/ou” como utilizado em uma expressão tal como “A, B e/ou C” abranja cada uma das modalidades a seguir: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (isoladamente); B (isoladamente); e C (isoladamente).

II. Anticorpos

[097] A presente invenção fornece agentes que se ligam especificamente às proteínas VEGF humanas e/ou às proteínas DLL4 humanas. Estes agentes são referidos aqui como “agentes de ligação a VEGF/DLL4”. A expressão “agente de ligação a VEGF/DLL4” abrange agentes que se ligam apenas a VEGF, agentes que se ligam apenas a DLL4 e agentes biespecíficos que se ligam tanto a VEGF quanto a DLL4. Em certas modalidades, em adição à ligação especificamente a VEGF e/ou a DLL4, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 se ligam especificamente adicionalmente a pelo menos um alvo ou um antígeno adicional. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um polipeptídeo. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga especificamente a VEGF humano. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga especificamente a DLL4 humano. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano. As sequências de aminoácidos (aa) de comprimento completo para VEGF humano (VEGF-A) e para DLL4 humano são conhecidas na arte e são fornecidas aqui como SEQ ID NO:27 (VEGF) e SEQ ID NO:23 (DLL4).

[098] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 ou anticorpo se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma constante de dissociação (KD) de aproximadamente 1 μM ou menor, aproximadamente 100 nM ou menor, aproximadamente 40 nM ou menor, aproximadamente 20 nM ou menor, aproximadamente 10 nM ou menor, aproximadamente 1 nM ou menor ou aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma KD de aproximadamente 20 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma KD de aproximadamente 10 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma KD de aproximadamente 1 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma KD de aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga tanto a VEGF humano quanto a VEGF de camundongo com uma KD de aproximadamente 100 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga tanto a VEGF humano quanto a VEGF de camundongo com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga tanto a DLL4 humano quanto a DLL4 de camundongo com uma KD de aproximadamente 100 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga tanto a DLL4 humano quanto a DLL4 de camundongo com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor. Em algumas modalidades, a constante de dissociação do agente de ligação (por exemplo, um anticorpo) a VEGF é a constante de dissociação determinada utilizando uma proteína de fusão de VEGF que compreende pelo menos uma porção de VEGF imobilizada sobre um chip Biacore. Em algumas modalidades, a constante de dissociação do agente de ligação (por exemplo, um anticorpo) a DLL4 é a constante de dissociação determinada utilizando uma proteína de fusão de DLL4 que compreende pelo menos uma porção de DLL4 imobilizada sobre um chip Biacore.

[099] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a tanto a VEGF quanto a DLL4 com uma KD de aproximadamente 100 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a tanto a VEGF quanto a DLL4 com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a tanto a VEGF quanto a DLL4 com uma KD de aproximadamente 20 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a tanto a VEGF quanto a DLL4 com uma KD de aproximadamente 10 nM ou menor. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo se liga a tanto a VEGF quanto a DLL4 com uma KD de aproximadamente 1 nM ou menor. Em algumas modalidades, a afinidade de um dos sítios de ligação ao antígeno pode ser mais fraca que a afinidade do outro sítio de ligação ao antígeno. Por exemplo, a KD de um sítio de ligação ao antígeno pode ser de aproximadamente 1 nM e a KD do segundo sítio que se liga ao antígeno pode ser de aproximadamente 10 nM. Em algumas modalidades, a diferença na afinidade entre os dois sítios de ligação ao antígeno pode ser de aproximadamente 2 vezes ou mais, aproximadamente 3 vezes ou mais, aproximadamente 5 vezes ou mais, aproximadamente 8 vezes ou mais, aproximadamente 10 vezes ou mais, aproximadamente 15 vezes ou mais, aproximadamente 20 vezes ou mais, aproximadamente 30 vezes ou mais, aproximadamente 50 vezes ou mais ou aproximadamente 100 vezes ou mais. A modulação das afinidades dos dois sítios de li-gação ao antígeno pode afetar a atividade biológica do anticorpo biespecífico. Por exemplo, a diminuição da afinidade do sítio de ligação ao antígeno por DLL4 ou por VEGF, pode ter um efeito desejável, por exemplo, menor toxicidade do agente de ligação ou maior índice terapêutico.

[0100] Com a finalidade de exemplo não limitante, o anticorpo biespecífico pode compreender (a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga a VEGF humano com uma KD entre aproximadamente 0,1 nM e aproximadamente 1,0 nM e (b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano com uma KD entre aproximadamente 0,1 nM e aproximadamente 20 nM, entre aproximadamente 0,5 nM e aproximadamente 20 nM, entre aproximadamente 1,0 nM e 10 nM. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende duas cadeias leves idênticas.

[0101] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma concentração eficiente máxima média (EC50) de aproximadamente 1 μM ou menor, aproximadamente 100 nM ou menor, aproximadamente 40 nM ou menor, aproximadamente 20 nM ou menor, aproximadamente 10 nM ou menor, aproximadamente 1 nM ou menor ou aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga a VEGF e/ou a DLL4 com uma concentração eficiente máxima média (EC50) de aproximadamente 1 μM ou menor, aproximadamente 100 nM ou menor, aproximadamente 40 nM ou menor, aproximadamente 20 nM ou menor, aproximadamente 10 nM ou menor, aproximadamente 1 nM ou menor ou aproximadamente 0,1 nM ou menor.

[0102] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG2. Em certas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que compreende um sítio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo é monovalente, monoespecífico, bivalente ou multiespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado a um grupamento citotóxico. Em algumas modalidades, o anticorpo está isolado. Em algumas modalidades, o anticorpo está substancialmente puro.

[0103] Os agentes de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpos) da presente invenção podem ser analisados em relação à ligação específica através de qualquer método conhecido na arte. Os ensaios imunológicos que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como análise Biacore, análise de FACS, imuno- fluorescência, imunocitoquímica, análise de Western blot, ensaio radioimunológico, ELISA, ensaio imunológico em “sandwich”, ensaio de imunoprecipitação, reação de precipitação, reação de precipitin com difusão em gel, ensaio de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaio de fixação do complemento, ensaio imunorradiométrico, ensaio imunológico fluorescente, ensaio de fluorescência revelada com o tempo homogênea (HTRF) e ensaio imunológico com proteína A. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Ausubel e outros, Editors, 1994-presente, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY).

[0104] Por exemplo, a ligação específica de um anticorpo a VEGF humano e/ou a DLL4 humano pode ser determinada utilizando ELISA. Um ensaio de ELISA compreende a preparação do antígeno, o revestimento dos poços de uma placa para microtitulação de 96 poços com o antígeno, a adição do anticorpo ou outro agente de ligação conjugado a um composto detectável tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de raiz forte ou fosfatase alcalina) ao poço, a incubação durante um período de tempo e a detecção da presença do agente de ligação ligado ao antígeno. Em algumas modalidades, o agente de ligação ou o anticorpo não está conjugado a um composto detectável, mas, ao invés disso, um segundo anticorpo que reconhece o agente de ligação ou o anticorpo (por exemplo, um anticorpo antiFc) e está conjugado a um composto detectável é adicionado ao poço. Em algumas modalidades, ao invés de revestir o poço com o antígeno, o agente de ligação ou o anticorpo pode ser revestido no poço e um segundo anticorpo conjugado a um composto detectável pode ser adicionado após a adição do antígeno ao poço revestido. Um perito na arte seria instruído em relação aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado bem como outras variações de ELISAs conhecidas na arte.

[0105] Em outro exemplo, a ligação específica de um anticorpo a VEGF humano e/ou a DLL4 humano pode ser determinada utilizando FACS. Um ensaio de verificação por FACS pode compreender a produção de uma construção de cDNA que expressa um antígeno na forma de uma proteína de fusão, a transfecção da construção para dentro das células, a expressão do antígeno sobre a superfície das células, a mistura do agente de ligação ou do anticorpo com as células transfectadas e a incubação durante um período de tempo. As células ligadas pelo agente de ligação ou pelo anticorpo podem ser identificadas através da utilização de um anticorpo secundário conjugado a um composto detectável (por exemplo, anticorpo anti-Fc conjugado com PE) e um citômetro de fluxo. Um perito na arte seria instruído em relação aos parâmetros que podem ser modificados para otimizar o sinal detectado bem como outras variações de FACS que podem aprimorar a verificação (por exemplo, verificação em relação a anticorpos de bloqueio).

[0106] A afinidade de ligação de um anticorpo ou outro agente de ligação a um antígeno (por exemplo, VEGF ou DLL4) e a “off-rate” de uma interação anticor- po-antígeno podem ser determinadas através de ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um ensaio radioimunológico que compreende a incubação de antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125I) ou fragmento ou variante do mesmo, com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado seguida pela detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo em relação ao antígeno e as “def-rates” de ligação podem ser determinadas partindo dos dados por análise de representação gráfica de Scatchard. Em algumas modalidades, a análise cinética Biacore é utilizada para determinar as taxas de ligação e de desligamento de anticorpos ou de agentes que se ligam a um antígeno (por exemplo, VEGF ou DLL4). A análise cinética Biacore compreende a análise da ligação e da dissociação de anticorpos dos chips com antígeno imobilizado (por exemplo, VEGF ou DLL4) sobre sua superfície.

[0107] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a VEGF humano, em que o agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) compreende uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs do anticorpo 219R45 (ver a Tabela 1). Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma ou mais das CDRs de 219R45, duas ou mais das CDRs de 219R45, três ou mais das CDRs de 219R45, quatro ou mais das CDRs de 219R45, cinco ou mais das CDRs de 219R45 ou todas as seis CDRs de 219R45. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF humano e a VEGF de camundongo.

[0108] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a VEGF humano, em que o agente de ligação a VEGF compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19). Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende ainda uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0109] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a VEGF humano, em que o agente de ligação a VEGF compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (c) uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (d) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (e) uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e (f) uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são substituições conser- vativas.

[0110] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a VEGF, em que o agente de ligação a VEGF compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve que consiste essencialmente da SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:49 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a VEGF ou outro agente compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ IDNO:7 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8.

[0111] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 10 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 0,01 nM ou menor. Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoáci- do em pelo menos uma CDR do agente de ligação a VEGF é substituído por um aminoácido diferente de forma que a afinidade do agente de ligação a VEGF pelo VEGF é alterada. Em algumas modalidades, a afinidade do agente de ligação a VEGF é aumentada. Em algumas modalidades, a afinidade do agente de ligação a VEGF é diminuída. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga a VEGF humano e a VEGF de camundongo.

[0112] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo 219R45. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF compreende a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo 219R45 (com ou sem a sequência líder). Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF é o anticorpo 219R45.

[0113] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF compreende, consiste essencialmente de ou consiste de, o anticorpo 219R45.

[0114] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre VEGF como um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, um agente de ligação a VEGF é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre VEGF que se sobrepõe ao epítopo sobre VEGF ligado por um anticorpo da invenção. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre VEGF como o anticorpo 219R45. Em outra modalidade, o agente de ligação a VEGF é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre VEGF que se sobrepõe ao epítopo sobre VEGF ligado pelo anticorpo 219R45.

[0115] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF inibe a ligação de VEGF a pelo menos um receptor de VEGF. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF inibe a ligação de VEGF humano a VEGFR-1 ou a VEGFR-2. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga especificamente a VEGF e modula a angiogênese. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga especificamente a VEGF e inibe a angiogênese. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF se liga especificamente a VEGF e inibe o crescimento de tumor.

[0116] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) compreende uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs do anticorpo 21R79 (ver a Tabela 2). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma ou mais das CDRs de 21R79, duas ou mais das CDRs de 21R79, três ou mais das CDRs de 21R79, quatro ou mais das CDRs de 21R79, cinco ou mais das CDRs de 21R79 ou todas as seis CDRs de 21R79. Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) compreende uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs do anticorpo 21R75 (ver a Tabela 2). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma ou mais das CDRs de 21R75, duas ou mais das CDRs de 21R75, três ou mais das CDRs de 21R75, quatro ou mais das CDRs de 21R75, cinco ou mais das CDRs de 21R75 ou todas as seis CDRs de 21R75. Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga espe-cificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) compreende uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs do anticorpo 21R83 (ver a Tabela 2). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma ou mais das CDRs de 21R83, duas ou mais das CDRs de 21R83, três ou mais das CDRs de 21R83, quatro ou mais das CDRs de 21R83, cinco ou mais das CDRs de 21R83 ou todas as seis CDRs de 21R83. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a DLL4 humano e a DLL4 de camundongo.

[0117] Em certas modalidades, a CDR1 de cadeia pesada do anticorpo que se liga a DLL4 é uma HC CDR1 mínima que compreende AYYIH (SEQ ID NO:79).

[0118] Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo que se liga a DLL4 humano e compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO:80), em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, asparagina ou glicina, X3 é asparagina ou lisina e X4 é glici- na, arginina ou ácido aspártico e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0119] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende ainda uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0120] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (c) uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (d) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (e) uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e (f) uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são substituições conser- vativas.

[0121] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4, em que o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve que consiste essencialmente da SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:48 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a DLL4 ou outro agente compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:6 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

[0122] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende ainda uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0123] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (c) uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (d) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (e) uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e (f) uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são substituições conser- vativas.

[0124] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4, em que o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:58 e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:58 e uma região variável de cadeia leve que consiste essencialmente da SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:56 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8.

[0125] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende ainda uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0126] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o agente de ligação a DLL4 compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (c) uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (d) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (e) uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e (f) uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22) ou uma variante da mesma que compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são substituições conser- vativas.

[0127] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a DLL4, em que o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve que consiste essencialmente da SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:62 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8. Em algu- mas modalidades, o agente é um anticorpo biespecífico.

[0128] Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 é um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:5 e uma cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

[0129] Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a DLL4 com uma KD de 25 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a DLL4 com uma KD de 10 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 0,01 nM ou menor. Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoácido em pelo menos uma CDR do agente de ligação a DLL4 é substituído por um aminoácido diferente de forma que a afinidade do agente de ligação a DLL4 pelo DLL4 é alterada. Em algumas modalidades, a afinidade do agente de ligação a DLL4 é aumentada. Em algumas modalidades, a afinidade do agente de ligação a DLL4 é diminuída.

[0130] Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo 21R79. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo 21R79 (com ou sem a sequência líder). Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 é o anticorpo 21R79.

[0131] Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 compreende, consiste essencialmente de ou consiste de, o anticorpo 21R79.

[0132] Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo 21R75. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo 21R75 (com ou sem a sequência líder). Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 é o anticorpo 21R75.

[0133] Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 compreende, consiste essencialmente de ou consiste de, o anticorpo 21R75.

[0134] Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo 21R83. Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 compreende a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo 21R83 (com ou sem a sequência líder). Em certas modalidades, o agente de ligação a DLL4 é o anticorpo 21R83.

[0135] Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 compreende, consiste essencialmente de ou consiste de, o anticorpo 21R83.

[0136] Em algumas modalidades, um agente de ligação a DLL4 se liga a um fragmento N-terminal de DLL4 humano (aminoácidos 1-191 da SEQ ID NO:24). Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a um epítopo que com-preende os aminoácidos 40-47 da SEQ ID NO:25. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a um epítopo que compreende os aminoácidos 113-120 da SEQ ID NO:25. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga a um epítopo que compreende os aminoácidos 40-47 da SEQ ID NO:25 e os aminoácidos 113-120 da SEQ ID NO:25.

[0137] Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, um agente de ligação a DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado por um anticorpo da invenção. Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como o anticorpo 21R79. Em outra modalidade, o agente de ligação a DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado pelo anticorpo 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como o anticorpo 21R75. Em outra modalidade, o agente de ligação a DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado pelo anticorpo 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como o anticorpo 21R83. Em outra modalidade, o agente de ligação a DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado pelo anticorpo 21R83.

[0138] Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 inibe a ligação de DLL4 a pelo menos um receptor de Notch. Em certas modalidades, o receptor de Notch é Notch1, Notch2, Notch3 ou Notch4. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga especificamente a DLL4 e inibe a atividade de DLL4. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga especificamente a DLL4 e inibe a sinalização de Notch. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga especificamente a DLL4 e modula a angiogênese. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga especificamente a DLL4 e inibe o crescimento de tumor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga especificamente a DLL4 e inibe a tumorigenicidade. Em algumas modalidades, o agente de ligação a DLL4 se liga especificamente a DLL4 e reduz o número ou a frequência de CSCs em um tumor.

[0139] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF/DLL4 que é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga a um alvo associado ao tumor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende ainda: uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo bies- pecífico que compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0140] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende ainda uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12.

[0141] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF/DLL4 que é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga a um alvo associado ao tumor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO:80), em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, asparagina ou glicina, X3 é asparagina ou lisina e X4 é glicina, arginina ou ácido aspártico e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende ainda: uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo bies- pecífico que compreende: um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16) e (b) uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0142] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende ainda uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64; e/ou uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12.

[0143] Em certas modalidades, a invenção fornece um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo biespecífico) que se liga especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífi- co compreende: a) um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e b) um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19); em que o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13) ou AYYIH (SEQ ID NO:79), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO:80), em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, asparagina ou glicina, X3 é asparagina ou lisina e X4 é glicina, arginina ou ácido aspártico e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, um anticorpo bies- pecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especifi-camente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0144] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é 219R45-MB-21R79.

[0145] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é 219R45-MB-21M18.

[0146] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que com- preende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é 219R45-MB-21R75.

[0147] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é 219R45-MB-21R83.

[0148] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo biespecífico) compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de se-quência em relação à SEQ ID NO:11; uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64; e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 97% ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região vari-ável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos aproximadamente 95% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:9 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que compreendem a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:10 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que compreendem a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de ca- deia pesada que compreende a SEQ ID NO:58 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que compreendem a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:64 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que compreendem a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:9 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que consistem essencialmente da SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:10 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que consistem essencialmente da SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:58 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que consistem essencialmente da SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, o agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que consiste essencialmente da SEQ ID NO:64 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia leve que consistem essencialmente da SEQ ID NO:12.

[0149] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada pro- veniente do anticorpo anti-VEGF 219R45. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21M18. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21R79. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21R75. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21R83. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-VEGF 219R45, uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21R79 e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-VEGF 219R45, uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21M18 e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-VEGF 219R45, uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21R75 e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-VEGF 219R45, uma região variável de cadeia pesada proveniente do anticorpo anti-DLL4 21R83 e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas.

[0150] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro domínio CH3 e um segundo domínio CH3, dos quais cada um é modificado para promover a formação de hete- romultímeros. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios CH3 são modificados utilizando uma técnica de “knobs-into-holes” (botões dentro dos orifícios). Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios CH3 compreendem alterações nos aminoácidos que resultam em interações eletrostáticas altera-das. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios CH3 compreendem alterações nos aminoácidos que resultam em interações hidrofóbicas/hidrofílicas alteradas.

[0151] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende regiões constantes de cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste de: (a) uma primeira região constante de IgG1 huma-na, em que os aminoácidos nas posições 253 e 292 são substituídos por glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG1 humana, em que os aminoá- cidos nas posições 240 e 282 são substituídos por lisina; (b) uma primeira região constante de IgG2 humana, em que os aminoácidos nas posições 249 e 288 são substituídos por glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG2 humana em que os aminoácidos nas posições 236 e 278 são substituídos por lisina; (c) uma primeira região constante de IgG3 humana, em que os aminoácidos nas posições 300 e 339 são substituídos por glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG3 humana em que os aminoácidos nas posições 287 e 329 são substituídos por lisina; e (d) uma primeira região constante de IgG4 humana, em que os aminoácidos nas posições 250 e 289 são substituídos por glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG4 humana em que os aminoácidos nas posições 237 e 279 são substituídos por lisina.

[0152] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região constante de IgG1 hu mana com substituições de aminoácidos nas posições 253 e 292, em que os amino- ácidos são glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG1 humana com substituições de aminoácidos nas posições 240 e 282, em que os aminoáci- dos são lisina. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições 249 e 288, em que os amino- ácidos são glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições 236 e 278, em que os aminoáci- dos são lisina. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região constante de IgG3 humana com substituições de aminoácidos nas posições 300 e 339, em que os amino- ácidos são glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições 287 e 329, em que os aminoáci- dos são lisina. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região constante de IgG4 humana com substituições de aminoácidos nas posições 250 e 289, em que os amino- ácidos são glutamato ou aspartato e uma segunda região constante de IgG4 humana com substituições de aminoácidos nas posições 237 e 279, em que os aminoáci- dos são lisina.

[0153] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições 249 e 288, em que os amino- ácidos são glutamato e uma segunda região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições 236 e 278, em que os aminoácidos são lisina. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo bies- pecífico que compreende uma primeira região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições 249 e 288, em que os aminoácidos são aspa- rato e uma segunda região constante de IgG2 humana com substituições de amino- ácidos nas posições 236 e 278, em que os aminoácidos são lisina.

[0154] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:7. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífi- co que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:56. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:62. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende ainda uma cadeia leve da SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma cadeia pesada da SEQ ID NO:5 e duas cadeias leves da SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma cadeia pesada da SEQ ID NO:6 e duas cadeias leves da SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma cadeia pesada da SEQ ID NO:56 e duas cadeias leves da SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma cadeia pesada da SEQ ID NO:62 e duas cadeias leves da SEQ ID NO:8.

[0155] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor, aproximadamente 25 nM ou menor, aproximadamente 10 nM ou menor, aproximadamente 1 nM ou menor ou aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor, aproximadamente 25 nM ou menor, aproximadamente 10 nM ou menor, aproximadamente 1 nM ou menor ou aproximadamente 0,1 nM ou menor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor e se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 50 nM ou menor. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecí- fico se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 25 nM ou menor e se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 25 nM ou menor. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga a VEGF com uma KD de aproximadamente 10 nM ou menor e se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 10 nM ou menor. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga a VEGF com uma KD de apro-ximadamente 1 nM ou menor e se liga a DLL4 com uma KD de aproximadamente 1 nM ou menor.

[0156] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno com uma afinidade de ligação que é mais fraca que a afinidade de ligação do segundo sítio que se liga ao antígeno. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo biespe- cífico pode se ligar a VEGF com uma KD variando desde aproximadamente 0,1 nM até 1 nM e pode se ligar a DLL4 com uma KD variando desde aproximadamente 1 nM até 10 nM. Ou o anticorpo biespecífico pode se ligar a VEGF com uma KD variando desde aproximadamente 1 nM até 10 nM e pode se ligar a DLL4 com uma KD variando desde aproximadamente 0,1 nM até 1 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico pode se ligar a DLL4 com uma KD variando desde aproximadamente 0,1 nM até 1 nM e pode se ligar a VEGF com uma KD variando desde aproximadamente 1 nM até 10 nM. Ou o anticorpo biespecífico pode se ligar a DLL4 com uma KD variando desde aproximadamente 1 nM até 10 nM e pode se ligar a VEGF com uma KD variando desde aproximadamente 0,1 nM até 1 nM. Em algumas moda- lidades, a diferença na afinidade entre os dois sítios de ligação ao antígeno pode ser de aproximadamente 2 vezes ou mais, aproximadamente 3 vezes ou mais, aproximadamente 5 vezes ou mais, aproximadamente 8 vezes ou mais, aproximadamente 10 vezes ou mais, aproximadamente 15 vezes ou mais, aproximadamente 30 vezes ou mais, aproximadamente 50 vezes ou mais ou aproximadamente 100 vezes ou mais. Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoácido em pelo menos uma CDR do sítio de ligação ao antígeno para VEGF é substituído por um aminoácido diferente de forma que a afinidade do sítio de ligação a VEGF seja alterada. Em algumas modalidades, a afinidade do sítio de ligação a VEGF é aumentada. Em algumas modalidades, a afinidade do sítio de ligação a VEGF é diminuída. Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoácido em pelo menos uma CDR do sítio de ligação ao antígeno para DLL4 é substituído por um aminoáci- do diferente de forma que a afinidade do sítio de ligação a DLL4 seja alterada. Em algumas modalidades, a afinidade do sítio de ligação a DLL4 é aumentada. Em algumas modalidades, a afinidade do sítio de ligação a DLL4 é diminuída. Em algumas modalidades, as afinidades dos sítios de ligação ao antígeno tanto a VEGF quanto a DLL4 são alteradas.

[0157] A invenção fornece polipeptídeos, incluindo, mas não limitados a anticorpos, que se ligam especificamente a VEGF e/ou a DLL4. Em algumas modalidades, um polipeptídeo se liga a VEGF humano. Em algumas modalidades, um poli- peptídeo se liga a DLL4 humano. Em algumas modalidades, um polipeptídeo se liga a VEGF humano e a VEGF de camundongo. Em algumas modalidades, um polipep- tídeo se liga a DLL4 humano e a DLL4 de camundongo.

[0158] Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:49.

[0159] Em algumas modalidades, um agente de ligação a DLL4 compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ NO ID:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64.

[0160] Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64.

[0161] Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende ainda um polipep- tídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende ainda um polipep- tídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:12.

[0162] Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende ainda um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 compreende ainda um polipep- tídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:12.

[0163] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) compete pela ligação específica a VEGF com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compete com o anticorpo 219R45 pela ligação específica a VEGF humano. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo compete pela ligação específica a VEGF em um ensaio de ligação competitiva in vitro. Em algumas modalidades, o VEGF é VEGF humano. Em algumas modalidades, o VEGF é VEGF de camundongo.

[0164] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF-DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epí- topo, sobre VEGF como um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre VEGF que se sobrepõe ao epítopo sobre VEGF ligado por um anticorpo da invenção. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre VEGF como o anticorpo 219R45. Em outra modalidade, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre VEGF que se sobrepõe ao epítopo sobre VEGF ligado pelo anticorpo 219R45.

[0165] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a VEGF com o anticorpo 219R45 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva).

[0166] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) compete pela ligação específica a DLL4 com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID NO:12. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compete com o anticorpo 21R79 pela ligação específica a DLL4 humano. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compete com o anticorpo 21R75 pela ligação específica a DLL4 humano. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 compete com o anticorpo 21R83 pela ligação específica a DLL4 humano. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo compete pela ligação específica a DLL4 em um ensaio de ligação competitiva in vitro. Em algumas modalidades, o DLL4 é DLL4 humano. Em algumas modalidades, o DLL4 é DLL4 de camundongo.

[0167] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epí- topo, sobre DLL4 como um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado por um anticorpo da invenção. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga ao mesmo epítopo ou es-sencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como o anticorpo 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga ao mesmo epítopo ou essencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como o anticorpo 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga ao mesmo epítopo ou es- sencialmente ao mesmo epítopo, sobre DLL4 como o anticorpo 21R83. Em outra modalidade, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a um epí- topo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado pelo anticorpo 21R79. Em outra modalidade, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado pelo anticorpo 21R75. Em outra modalidade, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a um epítopo sobre DLL4 que se sobrepõe ao epítopo sobre DLL4 ligado pelo anticorpo 21R83.

[0168] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a DLL4 com o anticorpo 21R79 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a DLL4 com o anticorpo 21R75 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a DLL4 com o anticorpo 21R83 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a DLL4 com o anticorpo 21M18 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva).

[0169] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a VEGF e/ou a DLL4 com o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M18 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a VEGF e/ou a DLL4 com o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M79 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a VEGF e/ou a DLL4 com o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21M75 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um agente que compete pela ligação específica a VEGF e/ou a DLL4 com o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M83 (por exemplo, em um ensaio de ligação competitiva).

[0170] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) descrito aqui se liga a VEGF e modula a atividade de VEGF. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de VEGF e inibe a atividade de VEGF. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de VEGF e modula a angiogênese. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de VEGF e inibe a angiogênese. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de VEGF e inibe o crescimento de tumor.

[0171] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) descrito aqui se liga a DLL4 humano e modula a atividade de DLL4. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anta-gonista de DLL4 e inibe a atividade de DLL4. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de DLL4 e inibe a atividade de Notch. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de DLL4 e inibe a sinalização de Notch. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de DLL4 e modula a angiogênese. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de DLL4 e promove angiogênese aberrante. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de DLL4 e inibe o crescimento de tumor.

[0172] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) descrito aqui é um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF humano e modula a atividade de VEGF. Em certas modalidades, um agente de liga-ção a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) descrito aqui é um anticorpo biespe- cífico que se liga a DLL4 humano e modula a atividade de DLL4. Em certas modali- dades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) descrito aqui é um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF humano e a DLL4 humano e modula tanto a atividade de VEGF quanto de DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e inibe tanto a atividade de VEGF quanto a atividade de DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e inibe a atividade de VEGF e a atividade de Notch. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e inibe a atividade de VEGF e a sinalização de Notch. Em algumas modalidades, o anticorpo bies- pecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e modula a angiogê- nese. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e promove angiogênese aberrante. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e inibe a angiogênese. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um antagonista de VEGF e um antagonista de DLL4 e inibe o crescimento de tumor.

[0173] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo ou um anticorpo biespecífico) é um antagonista de VEGF. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de VEGF e inibe a atividade de VEGF. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a atividade de VEGF em pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 90% ou aproximadamente 100%. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de VEGF humano é o anticorpo 219R45. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de VEGF humano é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 219R45. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de VEGF humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21M18. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de VEGF humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de VEGF humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de VEGF humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R83.

[0174] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) é um antagonista de DLL4. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de DLL4 e inibe a atividade de DLL4. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a atividade de DLL4 em pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 90% ou aproximadamente 100%. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo 21R83. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é um anticorpo bi- específico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R83. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M18. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a atividade de DLL4 humano é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R83.

[0175] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) é um antagonista da sinalização de Notch. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a sinalização de Notch em pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 90% ou aproximadamente 100%. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é o anticorpo 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é o anticorpo 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é o anticorpo 21R83. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a si-nalização de Notch é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é um anticorpo biespecífico que com-preende o sítio de ligação ao antígeno de 21R83. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é o anticorpo biespecí- fico 219R45-MB-21M18. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a si- nalização de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a sinalização de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R83.

[0176] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) inibe a ligação de VEGF a pelo menos um receptor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a ligação de VEGF a VEGFR-1 ou a VEGFR-2. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a ligação de VEGF a pelo menos um receptor de VEGF em pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 90% ou pelo menos aproximadamente 95%. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de VEGF humano a pelo menos um receptor de VEGF é o anticorpo 219R45. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de VEGF humano a pelo menos um receptor de VEGF é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antí- geno de 219R45. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de VEGF humano a pelo menos um receptor de VEGF é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M18. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de VEGF humano a pelo menos um receptor de VEGF é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de VEGF humano a pelo menos um receptor de VEGF é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de VEGF humano a pelo menos um receptor de VEGF é o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21R83.

[0177] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) inibe a ligação de DLL4 proteína a pelo menos um receptor de Notch. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a ligação de DLL4 a Notch1, Notch2, Notch3 e/ou Notch4. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 inibe a ligação de DLL4 a pelo menos um receptor de Notch em pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 90% ou pelo menos aproximadamente 95%. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo 21R83. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R79. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é um anticorpo biespe- cífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é um anticorpo biespecífico que compreende o sítio de ligação ao antígeno de 21R83. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M18. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79. Em certas mo-dalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que inibe a ligação de DLL4 humano a pelo menos um receptor de Notch é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R83.

[0178] Ensaios in vivo e in vitro para a determinação do fato de que um agente de ligação a VEGF/DLL4 (ou agente de ligação a VEGF/DLL4 candidato) inibe VEGF ou afeta a angiogênese são conhecidos na arte. Os ensaios de angiogê- nese in vitro incluem, mas não estão limitados a, ensaios de proliferação de HUVEC, ensaios de formação de tubos de células endoteliais, ensaios de brotamento (ou formação de brotamento), ensaios de migração de células HUVEC e ensaios de invasão. Em algumas modalidades, células na presença de VEGF e na presença de um agente de ligação a VEGF/DLL4 são comparadas às células na presença de VEGF sem o agente de ligação a VEGF/DLL4 presente e avaliadas em relação aos efeitos sobre a angiogênese (ou efeitos biológicos associados com a angiogênese). Os ensaios de angiogênese in vivo incluem, mas não estão limitados a, ensaios com bloco de matrigel, ensaios com microbolsas corneais e ensaios com membrana cori- oalantóica de frango (CAM).

[0179] Os ensaios in vivo e in vitro para a determinação do fato de que um agente de ligação a VEGF/DLL4 (ou agente de ligação a VEGF/DLL4 candidato) inibe a ativação ou a sinalização de Notch são conhecidos na arte. Por exemplo, en-saios repórteres com luciferase à base de células utilizando um vetor repórter TCF/Luc contendo várias cópias do domínio de ligação a TCF a montante de um gene repórter de luciferase de vaga-lume podem ser utilizados para medir os níveis de sinalização de Notch in vitro (Gazit e outros, 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA). Em algumas modalidades, um ensaio repórter com luciferase à base de células utilizando um vetor repórter CBF/Luc contendo várias cópias do domínio de ligação a CBF a montante de um gene repórter de luciferase de vaga-lume pode ser utilizado. O nível de sinalização de Notch na presença de um ou mais ligantes de Notch (por exemplo, DLL4 expresso sobre a superfície de célu- las transfectadas ou proteína de fusão DLL4-Fc solúvel) e na presença de um agente de ligação a VEGF/DLL4 é comparado com o nível de sinalização de Notch sem o agente de ligação a VEGF/DLL4 presente.

[0180] Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 possuem um ou mais dos efeitos a seguir: inibem a proliferação de células tumorais, inibem o crescimento de tumor, reduzem a tumorigenicidade de um tumor, reduzem a frequência de células tronco cancerosas em um tumor, ativam a morte celular de células tumorais, previnem a metástase de células tumorais, diminuem a sobrevivência de células tumorais, modulam a angiogênese, inibem a angiogênese, inibem a angiogênese produtiva ou promovem a angiogênese aberrante.

[0181] Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de inibir o crescimento de tumor. Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de inibir o crescimento de tumor in vivo (por exemplo, em um modelo de camundongo de xenoenxerto e/ou em um ser humano que possui câncer). Em certas modalidades, o crescimento de tumor é inibido pelo menos aproximadamente duas vezes, aproximadamente três vezes, aproximadamente cinco vezes, aproximadamente dez vezes, aproximadamente 50 vezes, aproximadamente 100 vezes ou aproximadamente 1000 vezes quando comparado com um tumor não tratado.

[0182] Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de reduzir a tumorigenicidade de um tumor. Em certas modalidades, o agente de ligação ou o anticorpo para VEGF/DLL4 é capaz de reduzir a tumorigenicidade de um tumor que compreende células tronco cancerosas em um modelo de animal, tal como um modelo de xenoenxerto em camundongo. Em certas modalidades, o agente de ligação ou o anticorpo para VEGF/DLL4 é capaz de reduzir a tumorigenicidade de um tumor através da diminuição do número ou da frequência de células tronco cancerosas no tumor. Em certas modalidades, o número ou a frequência de células tronco cancerosas em um tumor é reduzida em pelo menos aproximadamente duas vezes, aproximadamente três vezes, aproximadamente cinco vezes, aproximadamente dez vezes, aproximadamente 50 vezes, aproximadamente 100 vezes ou aproximadamente 1000 vezes. Em certas modalidades, a redução no número ou na frequência de células tronco cancerosas é determinada através do ensaio de diluição limitante utilizando um modelo de animal. Exemplos e diretrizes adicionais em relação ao uso de ensaios de diluição limitante para determinar uma redução no número ou na frequência de células tronco cancerosas em um tumor podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação Internacional Número WO 2008/042236; Publicação de Patente U.S. No. 2008/0064049; e Publicação de Patente U.S. No. 2008/0178305.

[0183] Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de modular a angiogênese. Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de modular a angiogênese in vivo (por exemplo, em um modelo de camundongo de xenoenxerto e/ou em um ser humano que possui câncer). Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de inibir a angiogênese. Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de promover a angiogênese aberrante. Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são capazes de inibir a angiogênese e/ou de promover a angiogênese aberrante, levando à vascularização não produtiva.

[0184] Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 descritos aqui possuem uma meia-vida circulante em camundongos, macacos cynomolgus ou humanos de pelo menos aproximadamente 2 horas, pelo menos aproximadamente 5 horas, pelo menos aproximadamente 10 horas, pelo menos aproximadamente 24 horas, pelo menos aproximadamente 3 dias, pelo menos aproximadamente 1 semana ou pelo menos aproximadamente 2 semanas. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo IgG (por exemplo, IgG1 ou IgG2) que possui uma meia-vida circulante em camundongos, macacos cynomolgus ou humanos de pelo menos aproximadamente 2 horas, pelo menos aproximadamente 5 horas, pelo menos aproximadamente 10 horas, pelo menos aproximadamente 24 horas, pelo menos aproximadamente 3 dias, pelo menos aproximadamente 1 semana ou pelo menos aproximadamente 2 semanas. Os métodos de aumento (ou de diminuição) da meia-vida de agentes tais como polipeptídeos e anticorpos são co-nhecidos na arte. Por exemplo, os métodos conhecidos de aumento da meia-vida circulante de anticorpos IgG incluem a introdução de mutações na região Fc que aumentam a ligação do anticorpo dependente do pH ao receptor de Fc neonatal (FcRn) em pH 6,0 (ver, por exemplo, as Publicações de Patente U.S. Nos. 2005/0276799, 2007/0148164 e 2007/0122403). Os métodos conhecidos de aumento da meia-vida circulante de fragmentos de anticorpo que não possuem a região Fc incluem técnicas tais como PEGuilação.

[0185] Em algumas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são anticorpos. Os anticorpos policlonais podem ser preparados através de qualquer método conhecido. Em algumas modalidades, os anticorpos policlonais são produzidos através da imunização de um animal (por exemplo, um coelho, um rato, um camundongo, um caprino, um burro) com um antígeno de interesse (por exemplo, um fragmento de peptídeo purificado, uma proteína recombinante de comprimento completo ou uma proteína de fusão) através de várias injeções subcutâneas ou intraperitone- ais. O antígeno pode ser opcionalmente conjugado a um veículo tal como hemocia- nina da lapa do buraco da fechadura (KLH) ou albumina do soro. O antígeno (com ou sem uma proteína veículoa) é diluído em solução salina esterilizada e geralmente combinado com um adjuvante (por exemplo, Adjuvante Completo ou Incompleto de Freund) para formar uma emulsão estável. Após um período de tempo suficiente, os anticorpos policlonais são recuperados do animal imunizado, geralmente do sangue ou dos ascitos. Os anticorpos policlonais podem ser purificados partindo do soro ou dos ascitos de acordo com métodos padronizados na arte incluindo, mas não limitados a, cromatografia por afinidade, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel e diálise.

[0186] Em algumas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridoma conhecidos por um perito na arte (ver, por exemplo, Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256:495-497). Em algumas modalidades, utilizando o método de hibridoma, um camundongo, um hamster ou outro animal hospedeiro apropriado, é imunizado como descrito anteriormente para ativar partindo dos linfócitos a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno de imunização. Em algumas modalidades, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Em algumas modalidades, o antígeno de imunização pode ser uma proteína humana ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o antígeno de imunização pode ser uma proteína de camundongo ou uma porção da mesma.

[0187] Após a imunização, os linfócitos são isolados e fundidos com uma linhagem de célula de mieloma adequada utilizando, por exemplo, polietileno glicol. As células de hibridoma são selecionadas utilizando meios especializados que são conhecidos na arte e os linfócitos e as células de mieloma não fundidos não sobrevivem ao processo de seleção. Os hibridomas que produzem os anticorpos monoclo- nais direcionados especificamente contra um antígeno escolhido podem ser identificados através de uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a, imuno- precipitação, immunoblotting e ensaios de ligação in vitro (por exemplo, citometria de fluxo, FACS, ELISA e ensaio radioimunológico). Os hibridomas podem ser propagados em culturas in vitro utilizando métodos padronizados (J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3a Edição, Academic Press, San Diego, CA) ou in vivo na forma de tumores de ascitos em um animal. Os anticorpos mono- clonais podem ser purificados partindo do meio de cultura ou do fluido de ascitos de acordo com métodos padronizados na arte incluindo, mas não limitados a, cromato- grafia por afinidade, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel e diálise.

[0188] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas do DNA recombinante que são conhecidas por um perito na arte. Os polinucleotídeos que codificam um anticorpo monoclonal são isolados partindo de células B maduras ou células de hibridoma, tal como através de RT-PCR utilizando iniciadores de oligonucleotídeos que amplificam especificamente os genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo e sua sequência é determinada utilizando técnicas padronizadas. Os polinucleotídeos isolados que codificam as cadeias pesada e leve são então clonados dentro de vetores de expressão adequados que produzem os anticorpos monoclonais quando transfectados em células hospedeiras tal como E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outra maneira proteínas de imunoglobulina.

[0189] Em certas outras modalidades, anticorpos recombinantes monoclo- nais ou fragmentos dos mesmos, podem ser isolados de bibliotecas de exibição de fago que expressam domínios variáveis ou CDRs de uma espécie desejada (ver, por exemplo, McCafferty e outros, 1990, Nature, 348:552-554; Clackson e outros, 1991, Nature, 352:624-628; e Marks e outros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

[0190] O(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) um anticorpo monoclonal po- de(m) ser modificado(s), por exemplo, através da utilização da tecnologia do DNA recombinante para gerar anticorpos alternativos. Em algumas modalidades, os domínios constantes das cadeias leve e pesada, por exemplo, de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser substituídos por aquelas regiões, por exemplo, de um anticorpo humano para gerar um anticorpo quimérico ou por um polipeptídeo sem ser de imunoglobulina para gerar um anticorpo de fusão. Em algumas modalidades, as regiões constantes são truncadas ou removidas para gerar o fragmento de anticorpo desejado de um anticorpo monoclonal. A mutagênese direcionada ao sítio ou de alta densidade da região variável pode ser utilizada para otimizar a especificidade, a afinidade etc. de um anticorpo monoclonal.

[0191] Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal contra VEGF e/ou DLL4 é um anticorpo humanizado. Tipicamente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas nas quais os resíduos provenientes das CDRs são substituídos por resíduos provenientes de uma CDR de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster etc.) que possuem a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade de ligação desejada utilizando métodos conhecidos por um perito na arte. Em algumas modalidades, os resíduos da região estrutural de Fv de uma imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos correspondentes em um anticorpo de uma espécie não humana que possui a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade de ligação desejada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado pode ser adicionalmente modificado através da substituição de resíduos adicionais na região estrutural de Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos substituídos para refinar e otimizar a especificidade, a afinidade e/ou a capacidade do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todas de pelo menos uma e tipicamente duas ou três, regiões de domínio variável contendo todas ou substancialmente todas, as CDRs que correspondem à imunoglobulina não humana enquanto que todas ou substancialmente todas, as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região ou um domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Em certas modalidades, tais anticorpos humanizados são utilizados de forma terapêutica porque estes podem reduzir a antigenicidade e as respostas de HAMA (anticorpo anticamundongo humano) quando administrados a um indivíduo humano. Um perito na arte seria ca- paz de obter um anticorpo humanizado funcional com imunogenicidade reduzida seguindo técnicas conhecidas (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; e 5.693.762).

[0192] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser diretamente preparados utilizando várias técnicas conhecidas na arte. Em algumas modalidades, os anticorpos hu-manos podem ser gerados partindo de linfócitos B humanos imortalizados imunizados in vitro ou partindo de linfócitos isolados de um indivíduo imunizado. Em qualquer um dos casos, as células que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo podem ser geradas e isoladas (ver, por exemplo, Cole e outros, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer e outros, 1991, J. Immunol., 147:86-95; e Patentes U.S. Nos. 5.750.373; 5.567.610; e 5.229.275). Em algumas modalidades, o anticorpo humano pode ser selecionado partindo de uma biblioteca de fagos, em que a biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan e outros, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets e outros, 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks e outros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, partindo de repertórios de genes de domínios variáveis de imunoglobulinas de doadores não imunizados. As técnicas para a geração e para o uso de bibliotecas de fagos de anticorpos também estão descritas nas Patentes U.S. Nos. 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593.081; 6.300.064; 6.653.068; 6.706.484; e 7.264.963; e Rothe e outros, 2008, J. Mol. Bio., 376:1182-1200. Uma vez que os anticorpos são identificados, as estratégias de maturação da afinidade conhecidas na arte, incluindo, mas não limitadas a, embaralhamento de cadeias (Marks e outros, 1992, Bio/Technology, 10:779-783) e mutagênese direcionada ao sítio, podem ser empregadas para gerar anticorpos hu- manos de alta afinidade.

[0193] Em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser produzidos em camundongos transgênicos que contêm loci de imunoglobulina humana. Após a imunização estes camundongos são capazes de produzir o repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Esta abordagem é descrita nas Patentes U.S. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016.

[0194] Esta invenção abrange ainda anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são capazes de reconhecer e de se ligar especificamente a pelo menos dois antígenos ou epítopos diferentes. Os epítopos diferentes podem estar dentro da mesma molécula (por exemplo, dois epítopos em uma única proteína) ou sobre moléculas diferentes (por exemplo, um epítopo sobre uma proteína e um epítopo sobre uma segunda proteína). Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico possui maior potência quando comparado com um anticorpo individual ou com uma combinação de mais de um anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo bies- pecífico possui toxicidade reduzida quando comparado com um anticorpo individual ou com uma combinação de mais de um anticorpo. É sabido pelos peritos na arte que qualquer agente de ligação (por exemplo, anticorpo) pode ter farmacocinética (PK) única (por exemplo, meia-vida circulante). Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico possui a capacidade de sincronizar a PK de dois agentes de ligação ativos em que os dois agentes de ligação individuais possuem perfis de PK diferentes. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico possui a capacidade de concentrar as ações de dois agentes de ligação (por exemplo, anticorpos) em uma área comum (por exemplo, um tumor e/ou um ambiente de tumor). Em algumas mo-dalidades, um anticorpo biespecífico possui a capacidade de concentrar as ações de dois agentes de ligação (por exemplo, anticorpos) para um alvo comum (por exemplo, um tumor ou uma célula tumoral). Em algumas modalidades, um anticorpo bies- pecífico possui a capacidade de direcionar as ações de dois agentes de ligação (por exemplo, anticorpos) para mais de uma via ou função biológica.

[0195] Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a VEGF e um segundo alvo. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a DLL4 e um segundo alvo. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a VEGF e a DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é um anticorpo humano ou humanizado monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico inibe a angiogênese e reduz o número ou a frequência de células tronco cancerosas. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico inibe o crescimento de vasos sanguíneos e inibe a maturação de vasos sanguíneos. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico previne a hiperproliferação endotelial. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico possui menor toxicidade e/ou efeitos colaterais. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico possui menor toxicidade e/ou efeitos colaterais quando comparado com uma mistura dos dois anticorpos individuais ou os anticorpos na forma de agentes isolados. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífi- co possui um maior índice terapêutico. Em algumas modalidades, o anticorpo bies- pecífico possui um maior índice terapêutico quando comparado com uma mistura dos dois anticorpos individuais ou os anticorpos na forma de agentes isolados.

[0196] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico pode especificamente reconhecer e se ligar a um primeiro alvo de antígeno, (por exemplo, DLL4) bem como um segundo alvo de antígeno, tal como uma molécula efetora sobre um leucócito (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7) ou um receptor de Fc (por exemplo, CD64, CD32 ou CD16) de forma a centralizar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa o primeiro alvo de antígeno. Em algumas modalidades, os anti-corpos biespecíficos podem ser utilizados para direcionar agentes citotóxicos para células que expressam um antígeno alvo particular. Estes anticorpos possuem um sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, a DLL4 humano) e um segundo site que se liga a um agente citotóxico ou um quelante de radionuclídeo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA.

[0197] As técnicas para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidas pelos peritos na arte, ver, por exemplo, Millstein e outros, 1983, Nature, 305:537-539; Brennan e outros, 1985, Science, 229:81; Suresh e outros, 1986, Methods in Enzymol., 121:120; Traunecker e outros, 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby e outros, 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny e outros, 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruber e outros, 1994, J. Immunol., 152:5368; Patente U.S. No. 5.731.168; Publicação Internacional No. WO 2009/089004; e Publicação de Patente U.S. No. 2011/0123532. Em algumas modalidades, os anticorpos biespecífi- cos compreendem regiões constantes de cadeia pesada com modificações nos ami- noácidos que fazem parte da interface entre as duas cadeias pesadas. Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem ser gerados utilizando uma estratégia de “knobs-into-holes” (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.731.168; Ridgway e outros, 1996, Prot. Engin., 9:617-621). De vez em quando a terminologia “knobs” e “holes” é substituída pelos termos “protuberâncias” e “cavidades”. Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem compreender regiões de dobradiça variantes incapazes de formar ligações dissulfeto entre as cadeias pesadas (ver, por exemplo, WO 2006/028936). Em algumas modalidades, as modificações podem compreender alterações em aminoácidos que resultam em interações eletrostáticas alteradas. Em algumas modalidades, as modificações podem compreender alterações em aminoácidos que resultam em interações hidrofóbicas/hidrofílicas alteradas.

[0198] Os anticorpos biespecíficos podem ser anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpo que compreendem sítios de ligação ao antígeno. Os anticorpos com mais de duas valências também são considerados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados (Tutt e outros, 1991, J. Immunol., 147:60). Assim, em certas modalidades os anticorpos para VEGF e/ou para DLL4 são multies- pecíficos.

[0199] Em certas modalidades, os anticorpos (ou outros polipeptídeos) descritos aqui podem ser monoespecíficos. Em certas modalidades, cada um do um ou mais sítios de ligação ao antígeno que um anticorpo contém é capaz de ligação (ou se ligar a) com um epítopo homólogo sobre proteínas diferentes.

[0200] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo podem ter funções ou capacidades diferentes daquelas de anticorpos intactos; por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ter maior penetração no tumor. Várias técnicas são conhecidas para a produção de fragmentos de anticorpo incluindo, mas não limitadas a, digestão prote- olítica de anticorpos intactos. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo incluem um fragmento F(ab')2 produzido através da digestão com pepsina de uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo incluem um fragmento Fab gerado através da redução das pontes dissulfeto de um fragmento F(ab')2. Em outras modalidades, os fragmentos de anticorpo incluem um fragmento Fab gerado através do tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são produzidos de forma recombinante. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fv ou Fv de cadeia única (scFv). Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem ser expressos em e secretados partindo de E. coli ou outras células hospedeiras, permitindo a produção de grandes quantidades destes fragmentos. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo são isolados partindo de bibliotecas de fago de anticorpo que são discutidas aqui. Por exemplo, os métodos podem ser utilizados para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Hu- se e outros, 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir a identificação rápida e eficiente de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada por VEGF e/ou por DLL4 ou derivados, fragmentos, análogos ou homólogos dos mesmos. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo são fragmentos de anticorpo lineares. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são monoespecíficos ou biespecíficos. Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um scFv. Várias técnicas podem ser utilizadas para a produção de anticorpos de cadeia isolada específicos para VEGF ou para DLL4 (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.946.778).

[0201] Pode ser adicionalmente desejável, especialmente no caso de fragmentos de anticorpo, modificar um anticorpo com a finalidade de alterar (por exemplo, aumentar ou diminuir) sua meia-vida no soro. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da incorporação de um epítopo de ligação a um receptor de salvage dentro do fragmento de anticorpo através da mutação da região apropriada no fragmento de anticorpo ou através da incorporação do epítopo dentro de um tag de peptídeo que é então fundido ao fragmento de anticorpo em qualquer uma das extremidades ou no meio (por exemplo, através de síntese de DNA ou de peptídeo).

[0202] Os anticorpos heteroconjugados também estão dentro do âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados de forma covalente. Tais anticorpos foram propostos, por exemplo, para direcionar células imunológicas para células indesejadas (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.676.980). É também considerado que os anticorpos heteroconjugados podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de proteína sintética, incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imu- notoxinas podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de uma ligação tioéter. Os exemplos de reagentes adequados para esta finalidade incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

[0203] Para as finalidades da presente invenção, deve ser considerado que anticorpos modificados podem compreender qualquer tipo de região variável que permita a associação do anticorpo com o alvo (isto é, VEGF humano ou DLL4 humano). Sob este aspecto, a região variável pode compreender ou ser derivada de qualquer tipo de mamífero que pode ser induzido a montar uma resposta humoral e gerar imunoglobulinas contra o antígeno desejado. Como tal, a região variável dos anticorpos modificados pode ser, por exemplo, de origem humana, murina, de primata não humano (por exemplo, macacos cynomolgus, macacos etc.) ou de coelho. Em algumas modalidades, tanto as regiões variáveis quanto constantes das imunoglobu- linas modificadas são humanas. Em outras modalidades, as regiões variáveis de anticorpos compatíveis (geralmente derivados de uma fonte não humana) podem ser engenheiradas ou especificamente produzidas de forma customizada para aprimorar as propriedades de ligação ou reduzir a imunogenicidade da molécula. Sob este aspecto, as regiões variáveis úteis na presente invenção podem ser humanizadas ou de outra maneira alteradas através da inclusão de sequências de aminoácidos importadas.

[0204] Em certas modalidades, os domínios variáveis em ambas as cadeias pesada e leve são alterados através da substituição pelo menos parcial de uma ou mais CDRs e, se necessário, através da substituição da região estrutural parcial e modificação e/ou alteração de sequência. Embora as CDRs possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou ainda subclasse que aquela do anticorpo do qual as regiões estruturais são derivadas, é considerado que as CDRs podem ser derivadas de um anticorpo de classe diferente e frequentemente de um anticorpo de uma espécie diferente. Pode não ser necessário substituir todas as CDRs por todas as CDRs da região variável do doador para transferir a capacidade de ligação ao antígeno de um domínio variável para outro. Ao invés disso, pode ser apenas necessário transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação ao antígeno.

[0205] Alterações na região variável notwithstanding, os peritos na arte considerarão que os anticorpos modificados desta invenção compreenderão anticorpos (por exemplo, anticorpos de comprimento completo ou fragmentos imunorreativos dos mesmos) em que pelo menos uma fração de uma ou mais dos domínios de região constante foi deletada ou de outra maneira alterada de forma a fornecer características bioquímicas desejadas tal como maior localização de tumor ou maior meia- vida no soro quando comparados com um anticorpo de aproximadamente a mesma imunogenicidade que compreende uma região constante nativa ou não alterada. Em algumas modalidades, a região constante dos anticorpos modificados compreenderá uma região constante humana. As modificações na região constante compatíveis com esta invenção compreendem adições, deleções ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou mais domínios. Os anticorpos modificados divulgados aqui podem compreender alterações ou modificações em um ou mais dos três domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) e/ou no domínio constante de cadeia leve (CL). Em algumas modalidades, um ou mais domínios são parcialmente ou inteiramente deletados das regiões constantes dos anticorpos modificados. Em algumas modalidades, os anticorpos modificados compreenderão construções ou variantes com domínio deletado em que o domínio CH2 inteiro foi removido (construções ΔCH2). Em algumas modalidades, o domínio de região constante omitido é substituído por um espaçador de aminoácido curto (por exemplo, 10 resíduos de aminoácidos) que fornece parte da flexibilidade molecular tipicamente conferida pela região constante ausente.

[0206] Em algumas modalidades, os anticorpos modificados são engenhei- rados para fundir o domínio CH3 diretamente à região de dobradiça do anticorpo. Em outras modalidades, um espaçador peptídico é inserido entre a região de dobradiça e os domínios CH2 e/ou CH3 modificados. Por exemplo, podem ser expressas construções em que o domínio CH2 foi deletado e o domínio CH3 remanescente (modificado ou não modificado) é ligado à região de dobradiça com um espaçador de 5-20 aminoácidos. Tal espaçador pode ser adicionado para garantir que os elementos reguladores do domínio constante permaneçam livres e acessíveis ou que a região de dobradiça permaneça flexível. Entretanto, deve ser notado que os espaça- dores de aminoácidos podem, em alguns casos, provar ser imunogênicos e ativam uma resposta imunológica indesejada contra a construção. Consequentemente, em certas modalidades, qualquer espaçador adicionado à construção será relativamente não imunogênico de forma a manter as qualidades biológicas desejadas dos anticorpos modificados.

[0207] Em algumas modalidades, os anticorpos modificados podem ter apenas uma deleção parcial de um domínio constante ou substituição de alguns ou até mesmo um único aminoácido. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação ao Fc e dessa maneira aumenta a localização das células cancerosas e/ou a penetração no tumor. Similarmente, pode ser desejável simplesmente deletar a parte de um ou mais domínios de região constante que controlam uma função efetora específica (por exemplo, ligação a C1q do complemento) que será modulada. Tais deleções parciais das regiões constantes podem aprimorar características selecionadas do anticorpo (meia-vida no soro) enquanto deixam outras funções desejáveis associadas com o domínio de região constante individual intactas. Além disso, como insinuado anteriormente, as regiões constantes dos anticorpos divulgados podem ser modificadas através da mutação ou da substituição de um ou mais aminoácidos que aprimoram o perfil da construção resultante. Neste aspecto pode ser possível interromper a atividade fornecida por um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação ao Fc) enquanto são substancialmente mantidos a configuração e o perfil imunogênico do anticorpo modificado. Em certas modalidades, os anticorpos modificados compreendem a adição de um ou mais aminoácidos na região constante para aprimorar as características desejáveis tal como a diminuição ou o aumento da função efetora ou fornecer mais sítios de ligação de citotoxinas ou carboidratos.

[0208] É conhecido na arte que a região constante medeia várias funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complemento à região Fc de anticorpos IgG ou IgM (ligados ao antígeno) ativa o sistema do complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e na lise de agentes patogênicos celulares. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e também pode estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Em adição, a regi-ão Fc de um anticorpo pode se ligar a uma célula que expressa um receptor de Fc (FcR). Há um número de receptores de Fc que são específicos para classes diferentes de anticorpo, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação do anticorpo aos receptores de Fc sobre as superfícies das células ativa um número de respostas biológicas importantes e distintas incluindo o engolfamento e a destruição de partículas revestidas com anticorpo, a eliminação de complexos imunológicos, a lise de células alvos revestidas com anticorpo por células killer (chamada de citotoxicidade celular dependente de anticorpo ou ADCC), a liberação de mediadores inflamatórios, a transferência da placenta e o controle da produção de imunoglobulina.

[0209] Em certas modalidades, os anticorpos modificados fornecem funções efetoras alteradas que, por sua vez, afetam o perfil biológico do anticorpo administrado. Por exemplo, em algumas modalidades, a deleção ou a inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação do receptor de Fc do anticorpo modificado circulante aumentando assim a localização de células cancerosas e/ou a penetração do tumor. Em outras modalidades, as modificações na região constante aumentam a meia-vida no soro do anticorpo. Em outras modalidades, as modificações na região constante reduzem a meia-vida no soro do anticorpo. Em algumas modalidades, a região constante é modificada para eliminar ligações dissulfeto ou grupamentos de oligossacarídeo. As modificações na região constante de acordo com esta invenção podem ser facilmente produzidas utilizando técnicas bioquímicas ou de engenharia molecular bem conhecidas conhecidas pelos peritos na arte.

[0210] Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 que é um anticorpo não possui uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo não possui atividade de ADCC e/ou nenhuma atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Em certas modalidades, o anticorpo não se liga a um receptor de Fc e/ou fatores do complemento. Em certas modalidades, o anticorpo não possui função efetora.

[0211] A presente invenção compreende ainda variantes e equivalentes que são substancialmente homólogos aos anticorpos quiméricos, humanizados e humanos ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, apresentados aqui. Estes podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservativas, isto é, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos similares. Por exemplo, substituição con- servativa refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido dentro da mesma classe geral tal como, por exemplo, um aminoácido ácido por outro aminoá- cido ácido, um aminoácido básico por outro aminoácido básico ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que é pretendido por uma substituição de aminoácido conservativa é bem conhecido na arte e é descrito aqui.

[0212] Assim, a presente invenção fornece métodos para a produção de um anticorpo que se liga a VEGF e/ou a DLL4, incluindo anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente tanto a VEGF quanto a DLL4. Em algumas modalidades, o método para a produção de um anticorpo que se liga a VEGF e/ou a DLL4 compreende a utilização de técnicas de hibridoma. Em algumas modalidades, o método de produção de um anticorpo que se liga a VEGF ou a DLL4 ou um anticorpo biespecí- fico que se liga a VEGF e a DLL4 compreende a verificação de uma biblioteca de fagos humana. A presente invenção fornece ainda métodos de identificação de um anticorpo que se liga a VEGF e/ou a DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado por verificação através de FACS em relação à ligação a VEGF ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado por verificação através de FACS em relação à ligação a DLL4 ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado por verificação através de FACS em relação tanto a VEGF quanto a DLL4 ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado através da verificação utilizando ELISA em relação à ligação a VEGF. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado através da verificação utilizando ELISA em relação à ligação a DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado através da verificação utilizando ELISA em relação à ligação a VEGF e a DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado por verificação através de FACS em relação ao bloqueio da ligação de VEGF humano a um receptor de VEGF humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado por verificação através de FACS em relação ao bloqueio da ligação de DLL4 humano a um receptor de Notch humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado através da verificação em relação à inibição ou ao bloqueio da sinalização de Notch. Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado através da verificação em relação à inibição ou ao bloqueio da atividade de VEGF (por exemplo, indução da proliferação de HUVEC). Em algumas modalidades, o anticorpo é identificado através da verificação em relação à modulação da angiogênese.

[0213] Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo para VEGF humano compreende a imunização de um mamífero com um polipeptí- deo que compreende os aminoácidos 27-232 do VEGF humano. Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo para VEGF humano compreende a imunização de um mamífero com um polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-232 do VEGF humano. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o isolamento de anticorpos ou células produtoras de anticorpo do mamífero. Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo monoclonal que se liga a VEGF compreende: a imunização de um mamífero com um polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção dos aminoácidos 27232 do VEGF humano e o isolamento de células produtoras de anticorpo do mamífero imunizado. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a fusão das células produtoras de anticorpo com células de uma linhagem de célula de mieloma para formar células de hibridoma. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a seleção de uma célula de hibridoma que expressa um anticorpo que se liga a VEGF. Em certas modalidades, o mamífero é um camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado utilizando um polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-232 do VEGF humano.

[0214] Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo para DLL4 humano compreende a imunização de um mamífero com um polipeptídeo que compreende os aminoácidos 27-529 do DLL4 humano. Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo para DLL4 humano compreende a imunização de um mamífero com um polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-529 do DLL4 humano. Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo monoclonal que se liga a DLL4 compreende: a imunização de um mamífero com um polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-529 do DLL4 humano e o isolamento das células produtoras de anticorpo do mamífero imunizado. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a fusão das células produtoras de anticorpo com células de uma linhagem de célula de mieloma para formar células de hibridoma. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a seleção de uma célula de hibridoma que expressa um anticorpo que se liga a DLL4. Em certas modalidades, o mamífero é um camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado utilizando um polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-529 do DLL4 humano.

[0215] Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo para VEGF humano compreende a verificação de uma biblioteca de expressão de anticorpo em relação a anticorpos que se ligam a VEGF humano. Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo DLL4 humano compreende a verificação de uma biblioteca de expressão de anticorpo em relação a anticorpos que se ligam a DLL4 humano. Em algumas modalidades, um método de geração de um anticorpo para VEGF humano e/ou para DLL4 humano compreende a verificação de uma biblioteca de expressão de anticorpo em relação a anticorpos biespecíficos que se ligam a VEGF humano e a DLL4 humano. Em algumas modalidades, a biblioteca de expressão de anticorpo é uma biblioteca de fagos. Em algumas modalidades, a verificação compreende separação. Em algumas modalidades, a biblioteca de expressão de anticorpo (por exemplo, uma biblioteca de fagos) é verificada utilizando pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-232 do VEGF humano. Em algumas modalidades, os anticorpos identificados na primeira verificação, são verificados novamente utilizando pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-529 do DLL4 humano para identificar um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF e a DLL4. Em algumas modalidades, a biblioteca de expressão de anticorpo (por exemplo, uma biblioteca de fagos) é verificada utilizando pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-529 do DLL4 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos identificados na primeira verificação, são verificados novamente utilizando pelo menos uma porção dos aminoácidos 27-232 do VEGF humano para identificar um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF e a DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo identificado na verificação é um antagonista de VEGF. Em algumas modalidades, o anticorpo identificado na verificação inibe atividades biológicas induzidas por VEGF. Em algumas modalidades, o anticorpo identificado na verificação é um antagonista de DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo identificado na verificação inibe a sinalização de Notch induzida por DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo identificado na verificação se liga tanto a VEGF humano quanto a VEGF de camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo identificado na verificação se liga tanto a DLL4 humano quanto a DLL4 de camundongo.

[0216] Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui estão isolados. Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui estão substancialmente puros.

[0217] Em algumas modalidades da presente invenção, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são polipeptídeos. Os polipeptídeos podem ser polipeptídeos re- combinantes, polipeptídeos naturais ou polipeptídeos sintéticos que compreendem um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que se liga a VEGF e/ou a DLL4. Será reconhecido na arte que algumas sequências de aminoácidos dos agentes de ligação descritos aqui podem ser variadas sem efeito significativo sobre a estrutura ou a função da proteína. Assim, a invenção inclui ainda variações dos polipeptídeos que exibem atividade substancial ou que incluem regiões de um anticorpo ou um fragmento do mesmo, contra VEGF humano e/ou DLL4. Em algumas modalidades, as variações de sequências de aminoácidos de polipeptídeos que se ligam a VEGF/DLL4 incluem deleções, inserções, inversões, repetições e/ou outros tipos de substituições.

[0218] Em algumas modalidades, os polipeptídeos descritos aqui estão isolados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos descritos aqui estão substancialmente puros.

[0219] Os polipeptídeos, os análogos e os variantes dos mesmos, podem ser adicionalmente modificados para conterem grupamentos químicos adicionais que normalmente não fazem parte do polipeptídeo. Os grupamentos derivatizados podem aprimorar ou de outra maneira modular a solubilidade, a meia-vida biológica e/ou a absorção do polipeptídeo. Os grupamentos também podem reduzir ou eliminar efeitos colaterais indesejáveis dos polipeptídeos e variantes. Uma visão geral para os grupamentos químicos pode ser encontrada em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, 2005, University of the Sciences, Filadélfia, PA.

[0220] Os polipeptídeos descritos aqui podem ser produzidos através de qualquer método adequado conhecido na arte. Tais métodos variam de métodos de síntese de proteínas diretos até a construção de uma sequência de DNA que codifica sequências polipeptídicas e que expressa tais sequências em um hospedeiro adequado. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA é construída utilizando tecnologia recombinante através do isolamento ou da síntese de uma sequência de DNA que codifica uma proteína do tipo selvagem de interesse. Opcionalmente, a sequência pode ser submetida à mutagênese através de mutagênese específica ao sítio para fornecer análogos funcionais da mesma. Ver, por exemplo, Zoeller e ou-tros, 1984, PNAS, 81:5662-5066 e Patente U.S. No. 4.588.585.

[0221] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse pode ser construída através de síntese química utilizando um sintetizador de oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos podem ser planejados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e selecionando os códons que são favorecidos na célula hospedeira em que o polipeptídeo recombi- nante de interesse será produzido. Os métodos padronizados podem ser aplicados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo isolado de interesse. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos completa pode ser utilizada para construir um gene retrotraduzido. Ainda, um oligômero de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo isolado particular pode ser sintetizado. Por exemplo, vários oligonucleotídeos pequenos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e então ligados. Os oligo- nucleotídeos individuais tipicamente contêm pontas penduradas a 5' ou a 3' para montagem por complementaridade.

[0222] Uma vez montadas (através de síntese, mutagênese direcionada ao sítio ou outro método), as sequências de polinucleotídeos que codificam um polipep- tídeo particular de interesse podem ser inseridas dentro de um vetor de expressão e ligadas de forma operacional com uma sequência de controle da expressão apropriada para a expressão da proteína em um hospedeiro desejado. A montagem apropriada pode ser confirmada através do sequenciamento de nucleotídeos, do mapeamento com enzimas de restrição e/ou da expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Como é bem conhecido na arte, com a finalidade de se obter níveis de expressão altos de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene tem que estar ligado de forma operacional a sequências de controle da expressão de transcrição e de tradução que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.

[0223] Em certas modalidades, vetores de expressão recombinantes são utilizados para amplificar e expressar o DNA que codifica anticorpos ou fragmentos dos mesmos, contra VEGF humano e/ou DLL4. Por exemplo, vetores de expressão re- combinantes podem ser construções de DNA replicáveis que possuem fragmentos de DNA sintéticos ou derivados do cDNA que codificam uma cadeia polipeptídica de um agente de ligação a VEGF/DLL4, tal como um anticorpo anti-VEGF ou um anticorpo anti-DLL4 ou um fragmento do mesmo, ligados de forma operacional a elementos reguladores da transcrição e/ou da tradução adequados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insetos. Uma unidade de transcrição geralmente compreende uma montagem de (1) um elemento genético ou elementos que possuem uma função reguladora na expressão gênica, por exemplo, promotores ou intensificadores da transcrição, (2) uma sequência estrutural ou codificadora que é transcrita em mRNA e traduzida em proteína e (3) sequências de início e de término da transcrição e da tradução apropriadas. Os elementos reguladores podem incluir uma sequência de operador para controlar a transcrição. A capacidade de se replicar em um hospedeiro, geralmente conferida por uma origem de replicação e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes podem ser adicionalmente incorporados. As regiões de DNA estão “ligadas de forma operacional” quando estas são funcionalmente relacionadas com cada outra. Por exemplo, o DNA para um peptídeo sinal (líder secretor) está ligado de forma operacional ao DNA para um polipeptídeo se este for expresso na forma de um precursor que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor está ligado de forma operacional a uma sequência codificadora se este controlar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está ligado de forma operacional a uma sequência codificadora se este estiver posicionado de forma a permitir a tradução. Em algumas modalidades, elementos estruturais pretendidos para uso em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência líder que possibilita a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Em outras modalidades, em situações em que a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, esta pode incluir um resíduo de metionina N-terminal. Este resíduo pode opcionalmente ser subsequentemente clivado da proteína recombinante expressa para fornecer um produto final.

[0224] A escolha de uma sequência de controle da expressão e um vetor de expressão depende da escolha do hospedeiro. Uma ampla variedade de combinações de hospedeiros/vetores de expressão pode ser empregada. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores que compreendem sequências de controle da expressão de SV40, vírus papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de E. coli, incluindo pCR1, pBR322, pMB9 e seus derivados e plasmídeos com faixa de hospedeiros mais ampla, tais como M13 e outros fagos de DNA de filamento simples filamentosos.

[0225] Os agentes de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, polipeptídeos) da presente invenção podem ser expressos partindo de um ou mais vetores. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de cadeia pesada é expresso por um vetor, um segundo polipeptídeo de cadeia pesada é expresso por um segundo vetor e um polipeptídeo de cadeia leve é expresso por um terceiro vetor. Em algumas modalidades, um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada e um polipeptídeo de cadeia leve são expressos por um vetor e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada é expresso por um segundo vetor. Em algumas modalidades, dois polipeptídeos de cadeia pesada são expressos por um vetor e um polipeptídeo de cadeia leve é expresso por um segundo vetor. Em algumas modalidades, três polipeptídeos são expressos partindo de um vetor. Assim, em algumas modalidades, um primeiro poli- peptídeo de cadeia pesada, um segundo polipeptídeo de cadeia pesada e um poli- peptídeo de cadeia leve são expressos por um único vetor.

[0226] As células hospedeiras adequadas para expressão de um polipeptí- deo ou um anticorpo que se liga a VEGF/DLL4 (ou uma proteína VEGF ou DLL4 para utilizar como um antígeno) incluem procariotos, células de levedura, células de inseto ou células eucarióticas superiores sob o controle de promotores apropriados. Os procariotos incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, E. coli ou Bacillus. As células eucarióticas superiores incluem linhagens de células estabelecidas de origem de mamífero que são descritas a seguir. Sistemas de tradução livres de células também podem ser empregados. Os vetores de clonagem e de expressão apropriados para uso com células hospedeiras bacterianas, fúngicas, de levedura e de mamífero são descritos em Pouwels e outros, 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY. Informação adicional em relação aos métodos de produção de proteínas, incluindo a produção de anticorpos, pode ser encontrada, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. No. 2008/0187954; Patentes U.S. Nos. 6.413.746; 6.660.501; e Publicação de Patente Internacional No. WO 04/009823.

[0227] Vários sistemas de cultura de células de mamíferos ou de insetos podem ser utilizados para expressar polipeptídeos recombinantes. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser desejável porque estas proteínas são geralmente dobradas corretamente, modificadas apropriadamente e biologicamente funcionais. Os exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem, mas não estão limitados a, linhagens de células COS-7 (derivada de rim de macaco), L-929 (derivada de fibroblastos murinos), C127 (derivada de tumor mamário murino), 3T3 (derivada de fibroblastos murinos), CHO (deri-vada de ovário de hamster chinês), HeLa (derivada de câncer cervical humano), BHK (derivada de fibroblastos renais de hamster), HEK-293 (derivada de rim embrionário humano) e variantes destas linhagens de células. Os vetores de expressão de mamíferos podem compreender elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor adequado e um intensificador ligado ao gene que será expresso e outras sequências não transcritas flanqueadoras a 5’ ou a 3’ e sequências não traduzidas a 5’ ou a 3’, tais como sítios de ligação ao ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e receptores de processamento e sequências de término da transcrição. A expressão de proteínas recombinantes em baculovírus também oferece um método robusto para a produção de proteínas dobradas corretamente e biologicamente funcionais. Os sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de insetos são bem conhecidos pelos peritos na arte (ver, por exemplo, Luckow e Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47).

[0228] Assim, a presente invenção fornece células que compreendem os agentes de ligação a VEGF/DLL4 descritos aqui. Em algumas modalidades, as células produzem os agentes de ligação a VEGF/DLL4 descritos aqui. Em certas modali- dades, as células produzem um anticorpo. Em algumas modalidades, as células produzem um agente de ligação a VEGF, tal como um anticorpo anti-VEGF. Em algumas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF. Em algumas modalidades, as células produzem um agente de ligação a DLL4, tal como um anticorpo anti-DLL4. Em algumas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que se liga a DLL4. Em certas modalidades, as células produzem um agente de ligação biespecífico a VEGF/DLL4, tal como um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF e a DLL4. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo 219R45. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo 21R79. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo 21R75. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo 21R83. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 219R45. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 21R79. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo bies- pecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 21R75. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 21R83. Em certas modalidades, as cé-lulas produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 219R45 e um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 21R79. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 219R45 e um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 21M18. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 219R45 e um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 21R75. Em certas modalidades, as células produzem um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo 219R45 e um sítio de ligação ao antígeno do anti- corpo 21R83. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21M18. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo bies- pecífico 219R45-MB-21R79. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em certas modalidades, as células produzem o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R83.

[0229] As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Os métodos padronizados incluem cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, de afinidade e coluna de classificação de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou através de qualquer outra técnica padronizada para a purificação de proteína. Tags de afinidade tais como hexa-histidina, domínio de ligação à maltose, sequência do revestimento de influenza e glutationa-S-transferase podem ser ligados à proteína para permitir fácil purificação através de passagem ao longo de uma coluna de afinidade apropriada. A cromatografia por afinidade utilizada para a purificação de imuno- globulinas pode incluir cromatografia com Proteína A, Proteína G e Proteína L. As proteínas isoladas podem ser fisicamente caracterizadas utilizando técnicas tais como proteólise, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), espectrometria de massa (MS), ressonância magnética nuclear (NMR), focalização isoelétrica (IEF), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e cristalografia de raio X. A pureza das proteínas isoladas pode ser determinada utilizando técnicas conhecidas pelos peritos na arte, que incluem, mas não limitadas a, SDS-PAGE, SEC, eletroforese em gel por capilaridade, IEF e focalização isoelétrica por capilaridade (cIEF).

[0230] Em algumas modalidades, os sobrenadantes provenientes de sistemas de expressão que secretam proteína recombinante dentro do meio de cultura podem ser primeiramente concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplica- do em uma matriz de purificação adequada. Em algumas modalidades, uma resina de troca aniônica pode ser empregada, por exemplo, uma matriz ou um substrato que possui grupos dietilaminoetila pendentes (DEAE). As matrizes podem ser acri- lamida, agarose, dextran, celulose ou outros tipos comumente empregados na purificação de proteína. Em algumas modalidades, uma etapa de troca catiônica pode ser empregada. Os trocadores catiônicos adequados incluem várias matrizes insolúveis que compreendem grupos sulfopropila ou carboximetila. Em algumas modalidades, um meio de hidroxiapatita pode ser empregado, incluindo, mas não limitado a, hidro- xiapatita de cerâmica (CHT). Em certas modalidades, uma ou mais etapas de HPLC de fase inversa que empregam meio RP-HPLC hidrofóbico, por exemplo, sílica gel que possui grupos metila ou outros alifáticos pendentes, podem ser empregadas para purificar adicionalmente uma proteína recombinante (por exemplo, um agente de ligação a VEGF/DLL4). Parte ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, podem ser empregadas para fornecer uma proteína recombi- nante homogênea.

[0231] Em algumas modalidades, proteínas heterodiméricas tais como anticorpos biespecíficos são purificadas de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 são isolados e/ou purificados utilizando pelo menos uma etapa de cromatografia. Em algumas modalidades, a pelo menos uma etapa de cromatografia compreende cro- matografia por afinidade. Em algumas modalidades, a pelo menos uma etapa de cromatografia compreende ainda cromatografia de troca aniônica. Em algumas modalidades, o produto de anticorpo isolado e/ou purificado compreende pelo menos 90% de anticorpo heterodimérico. Em algumas modalidades, o produto de anticorpo isolado e/ou purificado compreende pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de anticorpo heterodimérico. Em algumas modalidades, o produto de anticorpo isolado e/ou purificado compreende aproximadamente 100% de anticorpo heterodimérico.

[0232] Em algumas modalidades, a proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por exemplo, através da extração inicial partindo das pelotas de células, seguida por uma ou mais etapas de concentração, “saltingout”, troca iônica aquosa ou cromatografia por exclusão de tamanho. A HPLC pode ser empregada para etapas de purificação finais. As células microbianas empregadas na expressão de uma proteína recombinante podem ser rompidas através de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento-descongelamento, ultrassom, rompimento mecânico ou uso de agentes de lise de células.

[0233] Os métodos conhecidos na arte para a purificação de anticorpos e outras proteínas incluem ainda, por exemplo, aqueles descritos nas Publicações de Patente U.S. Nos. 2008/0312425; 2008/0177048; e 2009/0187005.

[0234] Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um poli- peptídeo que não é um anticorpo. Uma variedade de métodos para a identificação e para a produção de polipeptídeos que não são anticorpos que se ligam com alta afinidade a um alvo de proteína é conhecida na arte. Ver, por exemplo, Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse e outros, 2006, Protein Science, 15:1427; Gill e outros, 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; e Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83. Em certas modalidades, a tecnologia de exibição de fagos ou de células de mamífero pode ser utilizada para produzir e/ou identificar um polipeptídeo que se liga a VEGF/DLL4 que não é um anticorpo. Em certas modalidades, o polipeptídeo compreende uma estrutura de proteína de um tipo selecionado do grupo que consiste de proteína A, proteína G, uma lipocalina, um domínio de fibronectina, um domínio de repetição consenso de anqui- rina e tiorredoxina.

[0235] Em certas modalidades, os agentes de ligação a ou os anticorpos para VEGF/DLL4 podem ser utilizados em qualquer um de um número de formas conjugadas (isto é, um imunoconjugado ou um radioconjugado) ou não conjugadas. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser utilizados em uma forma não conjugada para armar mecanismos de defesa naturais do indivíduo incluindo citotoxicidade dependente do complemento e toxicidade celular dependente de anticorpo para eliminar células malignas ou cancerosas.

[0236] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo ou um polipeptídeo) é conjugado a um agente citotóxico. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um agente quimioterapêutico que inclui, mas não está limitado a, metotrexato, adriamicina, doxorrubicina, melfalan, mitomici- na C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes. Em algumas modalidades, o agente citotóxico é uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacte- riana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos da mesma, incluindo, mas não limitados a, cadeia A da difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina, cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecci- na, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curci- na, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fe- nomicina, enomicina e os tricotecenos. Em algumas modalidades, o agente citotóxi- co é um radioisótopo para produzir um radioconjugado ou um anticorpo radioconju- gado. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados incluindo, mas não limitados a, 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re e 212Bi. Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como calicheamicinas, maitansinoides, tricotecenos e CC1065 e os derivados destas toxinas que possuem atividade de toxina, também podem ser utilizados. Os conjugados de um anticorpo e um agente citotóxico podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais incluindo, mas não limitados a, propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (tal como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p- diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).

III. Polinucleotídeos

[0237] Em certas modalidades, a invenção abrange polinucleotídeos que compreendem polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo (ou um fragmento de um polipeptídeo) que se liga especificamente a VEGF, a DLL4, tanto a VEGF quanto a DLL4. O termo “polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo” abrange um poli- nucleotídeo que inclui apenas sequências codificadoras para o polipeptídeo, bem como um polinucleotídeo que inclui sequências codificadoras e/ou não codificadoras adicionais. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece um polinu- cleotídeo que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica um anticorpo para VEGF humano ou codifica um fragmento de tal anticorpo (por exemplo, um fragmento que compreende o sítio de ligação ao antígeno). Em algumas modalidades, a invenção fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica um anticorpo para DLL4 humano ou codifica um fragmento de tal anticorpo (por exemplo, um fragmento que compreende o sítio de ligação ao antígeno). Os polinucleotídeos da invenção podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA. DNA inclui cDNA, DNA genômico e DNA sintético; e pode ser de filamento duplo ou de filamento simples e se for de filamento simples pode ser o filamento codificador ou o filamento não codificador (antissenso).

[0238] Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende um polinucleo- tídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende a sequência de polinucleotídeos selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ NO:77 e SEQ ID NO:78.

[0239] Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende um polinucleo- tídeo que possui uma sequência de nucleotídeos pelo menos aproximadamente 80% idêntica, pelo menos aproximadamente 85% idêntica, pelo menos aproximadamente 90% idêntica, pelo menos aproximadamente 95% idêntica e em algumas modalida-des, pelo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polinucle- otídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo que possui uma sequência de nu- cleotídeos pelo menos aproximadamente 80% idêntica, pelo menos aproximadamente 85% idêntica, pelo menos aproximadamente 90% idêntica, pelo menos aproxima-damente 95% idêntica e em algumas modalidades, pelo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polinucleotídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77 e SEQ ID NO:78. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo que se hibridiza a SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ NO:78. Em certas modalidades, a hibridização ocorre sob condições de alta estrin- gência.

[0240] Em certas modalidades, os polinucleotídeos compreendem a sequên- cia codificadora para o polipeptídeo maduro fundida no mesmo quadro de leitura a um polinucleotídeo que auxilia, por exemplo, na expressão e na secreção de um po- lipeptídeo partindo de uma célula hospedeira (por exemplo, uma sequência líder que funciona como uma sequência secretora para controlar o transporte de um polipeptí- deo da célula). O polipeptídeo que possui uma sequência líder é uma pré-proteína e pode possuir uma sequência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipeptídeo. Os polinucleotídeos também podem codificar uma pró- proteína que é a proteína madura mais resíduos de aminoácidos a 5' adicionais. Uma proteína madura que possui uma pró-sequência é uma pró-proteína e é uma forma inativa da proteína. Uma vez que a pró-sequência é clivada, permanece uma proteína madura ativa.

[0241] Em certas modalidades, os polinucleotídeos compreendem a sequência codificadora para o polipeptídeo maduro fundida no mesmo quadro de leitura a uma sequência marcadora que permite, por exemplo, a purificação do polipeptídeo codificado. Por exemplo, a sequência marcadora pode ser um tag de hexa-histidina fornecido por um vetor pQE-9 para permitir a purificação do polipeptídeo maduro fundido com o marcador no caso de um hospedeiro bacteriano ou a sequência marcadora pode ser um tag de hemaglutinina (HA) derivado da proteína de hemaglutini- na de influenza quando um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7) é utilizado. Em algumas modalidades, a sequência marcadora é um FLAG-tag, um peptídeo de sequência DYKDDDDK (SEQ ID NO:45) que pode ser utilizado em associação com outros tags de afinidade.

[0242] A presente invenção refere-se ainda a variantes dos polinucleotídeos descritos anteriormente aqui que codificam, por exemplo, fragmentos, análogos e/ou derivados.

[0243] Em certas modalidades, a presente invenção fornece polinucleotídeos que compreendem polinucleotídeos que possuem uma sequência de nucleotídeos pelo menos aproximadamente 80% idêntica, pelo menos aproximadamente 85% idêntica, pelo menos aproximadamente 90% idêntica, pelo menos aproximadamente 95% idêntica e em algumas modalidades, pelo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que com-preende um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) ou fragmento do mesmo, descrito aqui.

[0244] Como utilizado aqui, é pretendido que a expressão de um polinucleo- tídeo que possui uma sequência de nucleotídeos pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeos de referência signifique que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência exceto pelo fato de que a sequência de polinucleotídeos pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para a obtenção de um polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência pode ser inserido dentro da sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais a 5' ou a 3' da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre tais posições terminais, intercaladas individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[0245] Os variantes de polinucleotídeos podem conter alterações nas regiões codificadoras, regiões não codificadoras ou ambas. Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo contém alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou as atividades do polipeptídeo codificado. Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo compreende substituições silenciosas que não resultam em alteração na sequência de aminoácidos do polipeptídeo (devido à degeneração do código genético). Os variantes de polinucleotídeos podem ser produzidos por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão dos códons para um hospedeiro particular (isto é, alterar códons no mRNA humano por aqueles preferidos por um hospedeiro bac- teriano tal como E. coli). Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo compreende pelo menos uma mutação silenciosa em uma região não codificadora ou codificadora da sequência.

[0246] Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo é produzido para modular ou alterar a expressão (ou os níveis de expressão) do polipeptídeo codificado. Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo é produzido para aumentar a expressão do polipeptídeo codificado. Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo é produzido para diminuir a expressão do polipeptí- deo codificado. Em algumas modalidades, um variante de polinucleotídeo possui maior expressão do polipeptídeo codificado quando comparado com uma sequência de polinucleotídeos parental. Em algumas modalidades, um variante de polinucleotí- deo possui menor expressão do polipeptídeo codificado quando comparado com uma sequência de polinucleotídeos parental.

[0247] Em algumas modalidades, pelo menos um variante de polinucleotídeo é produzido (sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado) para aumentar a produção de uma molécula heteromultimérica. Em algumas modalidades, pelo menos um variante de polinucleotídeo é produzido (sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado) para aumentar a produção de um anticorpo biespecífico.

[0248] Em certas modalidades, os polinucleotídeos estão isolados. Em certas modalidades, os polinucleotídeos estão substancialmente puros.

[0249] Os vetores e as células que compreendem os polinucleotídeos descritos aqui também são fornecidos. Em algumas modalidades, um vetor de expressão compreende uma molécula de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreende um vetor de expressão que compreende a molécula de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreende uma molécula de polinucleotídeo.

IV. Métodos de uso e composições farmacêuticas

[0250] Os agentes de ligação (incluindo polipeptídeos e anticorpos) da in- venção que se ligam (por exemplo, se ligam especificamente) a VEGF e/ou a DLL4 são úteis em uma variedade de aplicações incluindo, mas não limitadas a, métodos de tratamento terapêutico, tal como o tratamento de câncer. Em certas modalidades, os agentes são úteis para a inibição da atividade de VEGF, para a inibição da sinalização de Notch induzida por DLL4, para a inibição do crescimento de tumor, para a redução do volume do tumor, para a redução da frequência de células tronco cancerosas em um tumor, para a redução da tumorigenicidade de um tumor, para a modulação da angiogênese e/ou para a inibição da angiogênese. Os métodos de uso podem ser in vitro, ex vivo ou in vivo. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista de VEGF humano. Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista do DLL4 humano. Em certas modali-dades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 é um antagonista tanto de VEGF quanto de DLL4.

[0251] Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são utilizados no tratamento de uma doença associada com a angiogênese, isto é, maior angiogênese e/ou angiogênese aberrante. Em certas modalidades, a doença é uma doença dependente da angiogênese. Em certas modalidades, os agentes de ligação a VEGF/DLL4 são utilizados no tratamento de distúrbios caracterizados por níveis mais altos de células tronco e/ou células progenitoras.

[0252] A presente invenção fornece métodos para a inibição do crescimento de um tumor utilizando os agentes de ligação a ou os anticorpos para VEGF/DLL4 descritos aqui. Em certas modalidades, o método de inibição do crescimento de um tumor compreende o contato de uma célula tumoral com um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) in vitro. Por exemplo, uma linhagem de célula imortalizada ou uma linhagem de célula cancerosa é cultivada em meio ao qual é adicionado um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-DLL4 ou um anticorpo bies- pecífico anti-VEGF/anti-DLL4 para inibir o crescimento das células tumorais. Em al- gumas modalidades, as células tumorais são isoladas de uma amostra do paciente tal como, por exemplo, uma biópsia de tecido, uma efusão pleural ou uma amostra de sangue e são cultivadas em meio ao qual é adicionado um agente de ligação a VEGF/DLL4 para inibir o crescimento de células tumorais.

[0253] Em algumas modalidades, o método de inibição do crescimento de um tumor compreende o contato de um tumor ou células tumorais com um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpo) in vivo. Em certas modalidades, o contato de um tumor ou célula tumoral com um agente de ligação a VEGF/DLL4 é realizado em um modelo de animal. Por exemplo, um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-DLL4 ou um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 pode ser admi-nistrado a um animal hospedeiro imunocomprometido (por exemplo, camundongos NOD/SCID) que possui um xenoenxerto de tumor. Em algumas modalidades, as células tumorais e/ou as células tronco cancerosas são isoladas de uma amostra do paciente tal como, por exemplo, uma biópsia de tecido, uma efusão pleural ou uma amostra de sangue e são injetadas em um animal hospedeiro imunocomprometido (por exemplo, camundongos NOD/SCID) que recebe então a administração de um agente de ligação a VEGF/DLL4 para inibir o crescimento de células tumorais. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é administrado ao mesmo tempo ou logo após a introdução de células tumorigênicas no animal para prevenir o crescimento de tumor (“modelo preventivo”). Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é administrado na forma de um agente terapêutico após os tumores terem crescido até um tamanho especificado (“modelo terapêutico”). Em certas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano.

[0254] Em certas modalidades, o método de inibição do crescimento de um tumor compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficiente de um agente de ligação a VEGF/DLL4. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em certas modalidades, o indivíduo possui um tumor ou teve um tumor que foi removido. Em certas modalidades, o tumor compreende células tronco cancerosas. Em certas modalidades, a frequência de células tronco cancerosas no tumor é reduzida através da administração do agente de ligação a VEGF/DLL4. A invenção fornece ainda um método de redução da frequência de células tronco cancerosas em um tumor, que compreende o contato do tumor com uma quantidade eficiente de um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4). Em algumas modalidades, um método de redução da frequência de células tronco cancerosas em um tumor em um indivíduo, compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente de ligação a VEGF/DLL4.

[0255] Em algumas modalidades, o tumor é um tumor sólido. Em certas modalidades, o tumor é um tumor selecionado do grupo que consiste de tumor colorre- tal, tumor de cólon, tumor pancreático, tumor pulmonar, tumor de ovário, tumor de fígado, tumor de mama, tumor renal, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de bexiga, glioblastoma e tumor de cabeça e pescoço. Em certas modalidades, o tumor é um tumor colorretal ou um tumor de cólon. Em certas modalidades, o tumor é um tumor de ovário. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor pulmonar. Em certas modalidades, o tumor é um tumor pancreático. Em certas modalidades, o tumor é um tumor de mama.

[0256] A presente invenção fornece ainda métodos para o tratamento de câncer que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente de ligação a VEGF/DLL4 a um indivíduo. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga a VEGF e inibe ou reduz o crescimento do câncer. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga a DLL4 e inibe ou reduz o crescimento do câncer. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF e a DLL4 e inibe ou reduz o crescimento do câncer. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga a VEGF, interfere nas interações de VEGF/receptor de VEGF e inibe ou reduz o crescimento do câncer. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga a DLL4, interfere nas interações de DLL4/Notch e inibe ou reduz o crescimento do câncer. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga a tanto a VEGF quanto a DLL4, interfere nas interações de VEGF/receptor de VEGF e nas interações de DLL4/Notch e inibe ou reduz o crescimento do câncer. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 se liga a DLL4 e reduz a frequência de células tronco cancerosas no câncer.

[0257] A presente invenção fornece métodos de tratamento de câncer que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente de ligação a VEGF/DLL4 a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo que necessita de tratamento). Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em certas modalidades, o indivíduo possui um tumor canceroso. Em certas modalidades, o indivíduo teve um tumor removido.

[0258] O câncer/tumor do indivíduo, pode, em algumas modalidades, ser refratário a certo(s) tratamento(s). Como um exemplo não limitante, o câncer (ou o tumor) do indivíduo pode ser quimiorrefratário. Em certas modalidades, o câncer do indivíduo pode ser resistente à terapia anti-VEGF ou à terapia anti-DLL4 ou a ambas.

[0259] Em certas modalidades, o câncer é um câncer selecionado do grupo que consiste de câncer colorretal, câncer pancreático, câncer pulmonar, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, câncer gastrointestinal, melanoma, câncer cervical, câncer de bexiga, glioblastoma e câncer de cabeça e pescoço. Em certas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em certas modalidades, o câncer é câncer colorretal ou câncer de cólon. Em certas modali- dades, o câncer é câncer pancreático. Em certas modalidades, o câncer é câncer de mama. Em certas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em certas modalidades, o câncer é câncer pulmonar. Em algumas modalidades, o câncer é a câncer hematológico tal como leucemia ou linfoma. Em algumas modalidades, a leucemia ou o linfoma é uma leucemia ou um linfoma de células B. Em algumas modalidades, a leucemia ou o linfoma é uma leucemia ou um linfoma de células T. Em algumas modalidades o câncer hematológico é leucemia mielogênica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma sem ser de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia de células peludas, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, linfoma de células T cutâneo ou leucemia linfoblástica aguda de células T.

[0260] A invenção fornece ainda métodos de tratamento de uma doença ou um distúrbio em um indivíduo, em que a doença ou o distúrbio está associado à an- giogênese. Em algumas modalidades, a doença ou o distúrbio está associado à an- giogênese aberrante. Em algumas modalidades, a doença ou o distúrbio está associado à maior angiogênese. Assim, a presente invenção fornece métodos para a modulação da angiogênese em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de qualquer um dos agentes de ligação a VEGF/DLL4 descritos aqui. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a VEGF humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo que se liga a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga a VEGF humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífi- co que se liga a VEGF humano e a DLL4 humano.

[0261] Os métodos de tratamento de uma doença ou um distúrbio em um indivíduo, em que a doença ou o distúrbio é caracterizado por um maior nível de célu- las tronco e/ou células progenitoras são adicionalmente fornecidos. Em algumas modalidades, os métodos de tratamento compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente de ligação a VEGF/DLL4, um polipeptídeo ou um anticorpo ao indivíduo.

[0262] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos descritos aqui, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a VEGF humano e a DLL4 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) ou YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anti-corpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antíge- no compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao an- tígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antíge- no compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespe- cífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao antígeno que se liga es- pecificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio de ligação ao antígeno que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo sítio que se liga ao an- tígeno que se liga especificamente a DLL4 humano, em que o primeiro sítio que se liga ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO:17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO:19) e o segundo sítio que se liga ao antíge- no compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO:13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65) e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO:21) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22).

[0263] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos descritos aqui, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58 ou SEQ ID NO:64 e uma primeira e uma região variável de cadeia leve que possui pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:9 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproxima-damente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:10 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:58 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico para VEGF/DLL4 compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:11, uma segunda região variável de cadeia pesada que possui pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:64 e uma primeira e uma segunda regiões variáveis de cadeia pesada que possuem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:12.

[0264] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos aqui, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo anti-VEGF. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-VEGF é o anticorpo 219R45. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo anti-DLL4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-DLL4 é o anticorpo 21R79. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-DLL4 é o anticorpo 21R75. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- DLL4 é o anticorpo 21R83. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao an- tígeno do anticorpo 219R45. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao an- tígeno do anticorpo 21R79. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao an- tígeno do anticorpo 21R75. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um sítio de ligação ao an- tígeno do anticorpo 21R83. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 219R45 e um segundo sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 21R79. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 219R45 e um segundo sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 21M18. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo bies- pecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 219R45 e um segundo sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 21R75. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 219R45 e um segundo sítio que se liga ao antígeno do anticorpo 21R83. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21M18. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79. Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R75. Em algumas modalida-des, o agente de ligação a VEGF/DLL4 é o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21R83.

[0265] A presente invenção fornece ainda composições farmacêuticas que compreendem os agentes de ligação descritos aqui. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições farmacêuticas encontram uso na inibição do crescimento de tumor e/ou no tratamento de câncer em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano).

[0266] Em certas modalidades, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem anticorpos biespecíficos, em que pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% dos anticorpos na composição são anticorpos biespecíficos ou anticorpos heterodiméricos. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos são anticorpos IgG (por exemplo, IgG2 ou IgG1). Em certas moda-lidades, menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 2% ou menos que aproximadamente 1% dos anticorpos totais nas composições é de anticorpos monoespecíficos ou anticorpos homodiméri- cos. Em certas modalidades, os anticorpos na composição são pelo menos aproximadamente 98% heterodiméricos.

[0267] Em certas modalidades, as formulações são preparadas para armazenamento e uso através da combinação de um anticorpo ou um agente purificado da presente invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um veículo ou um excipiente). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, tampões atóxicos tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais tal como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservantes tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amô- nio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico ou benzílico, alquil parabenos, tal como metil ou propil parabeno, ca- tecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol; polipeptídeos de baixo peso molecular (por exemplo, menos que aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos); proteínas tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofí- licos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagi- na, histidina, arginina ou lisina; carboidratos tais como monossacarídeos, dissacarí- deos, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; íons indicadores formadores de sais tal como sódio; complexos metálicos tais como complexos de Zn-proteína; e tensoati- vos não iônicos tal como TWEEN ou polietileno glicol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, 2005, University of the Sciences, Filadélfia, PA).

[0268] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em qualquer número de maneiras para tratamento local ou sistêmico. A administração pode ser tópica através de adesivos epidérmicos ou transdermais, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós; pulmo- nar através de inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo através de ne- bulizador, intratraqueal e intranasal; oral; ou parenteral incluindo intravenosa, intraarterial, intratumoral, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular (por exemplo, injeção ou infusão) ou intracraniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular).

[0269] A formulação terapêutica pode estar na forma de dosagem unitária. Tais formulações incluem comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões em água ou meios não aquosos ou supositórios. Nas composições sólidas tais como comprimidos o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico. Os ingredientes para comprimidos convencionais incluem amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas e diluentes (por exemplo, água). Estes podem ser utilizados para formar uma composição pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável atóxico do mesmo. A composição pré-formulação sólida é então subdividida em for-mas de dosagem unitária de um tipo descrito anteriormente. Os comprimidos, as pílulas etc. da formulação ou da composição podem ser revestidos ou de outra maneira compostos para fornecer uma forma de dosagem que fornece a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou a pílula pode compreender uma composição interna coberta por um componente externo. Além disso, os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração e permite que o componente interno passe intacto através do estômago ou que tenha liberação retardada. Uma variedade de materiais pode ser utilizada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluem um número de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como shellac, álcool cetílico e acetato de celulose.

[0270] Os agentes de ligação a ou os anticorpos para VEGF/DLL4 descritos aqui também podem estar capturados dentro de microcápsulas. Tais microcápsulas são preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervation ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de al-bumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões como é descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, 2005, University of the Sciences na Filadélfia, PA.

[0271] Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas incluem um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção complexado com lipossomos. Os métodos para a produção de lipossomos são co-nhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, alguns lipossomos podem ser gerados através de evaporação em fase inversa com uma composição lipídica que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG- PE). Os lipossomos podem ser extrusados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomos com o diâmetro desejado.

[0272] Em certas modalidades, podem ser produzidas preparações de liberação controlada. Os exemplos adequados de preparações de liberação controlada incluem matizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo), em que as matrizes estão na forma de artigos moldados (por exemplo, filmes ou microcápsulas). Exemplos adicionais de matrizes de liberação controlada incluem poliésteres, hidrogéis tal como poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(álcool vinílico), polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico.

[0273] Em certas modalidades, em adição à administração de um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo), o método ou o tratamento compreende ainda a administração de pelo menos um agente terapêutico adicional. Um agente terapêutico adicional pode ser administrado antes de, concorrentemente a e/ou subsequentemente à administração do agente de ligação a VEGF/DLL4. As composições farmacêuticas que compreendem um agente de ligação a VEGF/DLL4 e o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) também são fornecidas. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional compreende 1, 2, 3 ou mais agentes terapêuticos adicionais.

[0274] A terapia de combinação com pelo menos dois agentes terapêuticos frequentemente utiliza agentes que funcionam através de mecanismos de ação diferentes, embora isto não seja necessário. A terapia de combinação utilizando agentes com mecanismos de ação diferentes pode resultar em efeitos aditivos ou sinérgicos. A terapia de combinação pode permitir uma dose menor de cada agente do que a que é utilizada na monoterapia, reduzindo assim efeitos colaterais tóxicos e/ou aumentando o índice terapêutico de pelo menos um dos agentes. A terapia de combinação pode diminuir a probabilidade de que células cancerosas resistentes irão se desenvolver. Em algumas modalidades, a terapia de combinação compreende um agente terapêutico que afeta primariamente (por exemplo, inibe ou mata) células não tumorigênicas e um agente terapêutico que afeta primariamente (por exemplo, inibe ou mata) CSCs tumorigênicas.

[0275] As classes úteis de agentes terapêuticos incluem, por exemplo, agentes antitubulina, auristatinas, agentes de ligação à ranhura menor do DNA, inibidores da replicação do DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina tais como cisplatina, mono(platina), bis(platina) e complexos de platina tri-nucleares e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabólitos, agentes de sensibilização à quimioterapia, duocarmicinas, etoposídeos, pirimidinas fluoradas, ionó- foros, lexitropsinas, nitrosouréias, platinóis, antimetabólitos de purina, puromicinas, agentes de sensibilização à radiação, esteroides, taxanos, inibidores de topoisomerase, alcaloides de vinca ou similar. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é um agente alquilante, um antimetabólito, um antimitótico, um inibidor de topoisomerase ou um inibidor de angiogênese. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um complexo de platina tal como carboplatina ou cisplatina. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um complexo de platina em combinação com um taxano.

[0276] Os agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com os agentes de ligação a VEGF/DLL4 incluem agentes quimioterapêuticos. Assim, em algumas modalidades, o método ou o tratamento envolve a administração de um agente de ligação ou um anticorpo anti-VEGF da presente invenção em combinação com um agente quimioterapêutico ou um coquetel de vários agentes quimio- terapêuticos diferentes. Em algumas modalidades, o método ou o tratamento envolve a administração de um agente de ligação ou um anticorpo anti-DLL4 da presente invenção em combinação com um agente quimioterapêutico ou um coquetel de vários agentes quimioterapêuticos diferentes. Em algumas modalidades, o método ou o tratamento envolve a administração de um anticorpo biespecífico da presente invenção que se liga a VEGF e a DLL4 em combinação com um agente quimioterapêutico ou um coquetel de vários agentes quimioterapêuticos diferentes.

[0277] Os agentes quimioterapêuticos úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN); alquil sulfonatos tais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziri- dinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e me- tilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietile- notiofosfaoramida e trimetilolomelamima; mostardas de nitrogênio tais como cloram- bucil, clornafazina, cholofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clori- drato do óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisi- nas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamici- na, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorru- bicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorru- bicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, es- treptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antime- tabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citosina arabinosídeo, di- desoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tais como ca- lusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; replenishers do ácido fólico tal como ácido folínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevu- línico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; dia- ziquona; elformitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiuréia; len- tinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxa- no; sizofuran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2''- triclorotrietilamina; uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mito- lactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo (Ara-C); taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL) e docetaxel (TAXOTERE); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mer- captopurina; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorel- bina; navelbina; novantrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; ibandronato; CPT11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina (XELODA); e sais, ácidos ou derivados far- maceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Os agentes quimiotera- pêuticos incluem ainda agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormônios sobre tumores tais como antiestrógenos incluindo, por exemplo, tamoxifen, raloxifeno, 4(5)-imidazóis inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (FARESTON); e antian- drógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é cisplatina. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é carboplatina. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é paclitaxel.

[0278] Em certas modalidades, o agente quimioterapêutico é um inibidor de topoisomerase. Os inibidores de topoisomerase são agentes quimioterapêuticos que interferem na ação de uma enzima topoisomerase (por exemplo, topoisomerase I ou II). Os inibidores de topoisomerase incluem, mas não estão limitados a, doxorrubici- na HCl, citrato de daunorrubicina, mitoxantrona HCl, actinomicina D, etoposídeo, topotecan HCl, teniposídeo (VM-26) e irinotecan, bem como sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um destes. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é irinotecan.

[0279] Em certas modalidades, o agente quimioterapêutico é um antimetabó- lito. Um antimetabólito é um reagente químico com uma estrutura que é similar a um metabólito necessário para reações bioquímicas normais, ainda diferente o suficiente para interferir em uma ou mais funções normais das células, tal como a divisão celular. Os antimetabólitos incluem, mas não estão limitados a, gemcitabina, fluorouracil, capecitabina, sódio metotrexato, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, citosina arabinosí- deo, tioguanina, 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6-tioguanina, pentosta- tina, fosfato de fludarabina e cladribina, bem como sais, ácidos ou derivados farma- ceuticamente aceitáveis de qualquer um destes. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é gemcitabina.

[0280] Em certas modalidades, o agente quimioterapêutico é um agente an- timitótico, incluindo, mas não limitado a, agentes que se ligam à tubulina. Em algumas modalidades, o agente é um taxano. Em certas modalidades, o agente é paclitaxel ou docetaxel ou um sal, um ácido ou um derivado farmaceuticamente aceitável de paclitaxel ou docetaxel. Em certas modalidades, o agente é paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel ligado à albumina (ABRAXANE), DHA-paclitaxel ou PG-paclitaxel. Em certas modalidades alternativas, o agente antimitótico compreende um alcaloide de vinca, tal como vincristina, binblastina, vinorelbina ou vindesina ou sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis das mesmas. Em algumas modalidades, o agente antimitótico é um inibidor de quinesina Eg5 ou um inibidor de uma mitótico quinase tal como Aurora A ou Plk1. Em certas modalidades, quando o agente quimioterapêutico administrado em combinação com um agente de ligação a VEGF/DLL4 for um agente antimitótico, o câncer ou o tumor que está sendo tratado é câncer de mama ou um tumor de mama.

[0281] Em algumas modalidades, um segundo agente terapêutico compreende um agente tal como uma molécula pequena. Por exemplo, o tratamento pode envolver a administração combinada de um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção com uma molécula pequena que atua como um inibidor contra proteínas associadas a tumor adicionais incluindo, mas não limitadas a, EGFR, ErbB2, HER2 e/ou VEGF. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é uma molécula pequena que inibe uma via de célula tronco cancerosa. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um inibidor de molécula pequena da via de Notch. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um inibidor de molécula pequena da via de Wnt. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um inibidor de molécula pequena da via de BMP. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é uma molécula pe-quena que inibe a sinalização de β-catenina.

[0282] Em algumas modalidades, um segundo agente terapêutico compreende uma molécula biológica, tal como um anticorpo. Por exemplo, o tratamento pode envolver a administração combinada de um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção com outros anticorpos contra proteínas associadas a tumor adicionais incluindo, mas não limitadas a, anticorpos que se ligam a EGFR, a ErbB2, a HER2 e/ou a VEGF. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que é um anticorpo marcador anticélula tronco cancerosa. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que se liga a um componente da via de Notch. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que se liga a um componente da via de Wnt. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que inibe uma via de célula tronco cancerosa. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo inibidor da via de Notch. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo inibidor da via de Wnt. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo inibidor da via de BMP. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que inibe a sinalização de β-catenina. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é um anticorpo que é um inibidor ou um modulador da angiogênese (por exemplo, um anticorpo an- ti-VEGF ou para o receptor de VEGF). Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é bevacizumab (AVASTIN), trastuzumab (HERCEPTIN), panitumumab (VECTIBIX) ou cetuximab (ERBITUX). A administração combinada pode incluir co- administração, em uma formulação farmacêutica única ou utilizando formulações separadas ou administração consecutiva em qualquer ordem, mas geralmente den- tro de um período de tempo tal que todos os agentes ativos possam exercer suas atividades biológicas simultaneamente.

[0283] Além disso, o tratamento com um agente de ligação a VEGF/DLL4 descrito aqui pode incluir tratamento de combinação com outras moléculas biológicas, tal como uma ou mais citocinas (por exemplo, linfocinas, interleucinas, fatores de necrose de tumor e/ou fatores de crescimento) ou pode ser acompanhado pela remoção cirúrgica de tumores, células cancerosas ou qualquer outra terapia considerada necessária por um médico que está fazendo o tratamento.

[0284] Em certas modalidades, o tratamento envolve a administração de um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção em combinação com terapia de radiação. O tratamento com um agente de ligação a VEGF/DLL4 pode ocorrer antes de, concorrentemente a ou subsequente à administração de terapia de radiação. A programação de dosagens para tal terapia de radiação pode ser determinada pelo médico praticante perito.

[0285] Será considerado que a combinação de um agente de ligação a VEGF/DLL4 e um agente terapêutico adicional pode ser administrada em qualquer ordem ou concorrentemente. O tratamento com um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) pode ocorrer antes de, concorrentemente a ou subsequente à administração de quimioterapias. A administração combinada pode incluir coadministração, em uma formulação farmacêutica única ou utilizando formulações separadas ou administração consecutiva em qualquer ordem, mas geralmente dentro de um período de tempo tal que todos os agentes ativos possam exercer suas atividades biológicas simultaneamente. A programação de preparação e dosagens para tais agentes quimioterapêuticos pode ser utilizada de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo perito. As programações de preparação e dosagens para tal quimioterapia também são descritas em The Chemotherapy Source Book, 4a Edição, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadélfia, PA.

[0286] Em algumas modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 será administrado a pacientes que sofreram previamente tratamento com um segundo agente terapêutico. Em certas outras modalidades, o agente de ligação a VEGF/DLL4 e um segundo agente terapêutico serão administrados substancialmente simultaneamente ou concorrentemente. Por exemplo, um indivíduo pode receber um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) enquanto passa por um curso de tratamento com um segundo agente terapêutico (por exemplo, quimioterapia). Em certas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 será administrado dentro de 1 ano do tratamento com um segundo agente terapêutico. Em certas modalidades alternativas, um agente de ligação a VEGF/DLL4 será administrado dentro de 10, 8, 6, 4 ou 2 meses de qualquer tratamento com um segundo agente terapêutico. Em certas outras modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 será administrado dentro de 4, 3, 2 ou 1 semanas de qualquer tratamento com um segundo agente terapêutico. Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 será administrado dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 dia de qualquer tratamento com um segundo agente terapêutico. Será considerado ainda que os dois (ou mais) agentes ou tratamentos podem ser administrados ao indivíduo dentro de uma questão de horas ou minutos (isto é, substancialmente simultaneamente).

[0287] Para o tratamento de uma doença, a dosagem apropriada de um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção depende do tipo de doença que será tratado, da gravidade e do curso da doença, da capacidade de resposta da doença, se o agente de ligação ou o anticorpo para VEGF/DLL4 é administrado para finalidades terapêuticas ou preventivas, terapia anterior, histórico clínico do paciente e outros, tudo sob a ponderação do médico que está fazendo o tratamento. O agente de ligação ou o anticorpo para VEGF/DLL4 pode ser administrado uma vez ou na forma de uma série de tratamentos espalhados ao longo de vários dias até vários meses ou até uma cura ser realizada ou uma diminuição do estado de doença ser atingida (por exemplo, redução no tamanho do tumor). As programações de dosagens ótimas podem ser calculadas partindo de medidas de acúmulo de fármaco no corpo do paciente e variarão dependendo da potência relativa de um anticorpo ou um agente individual. O médico que está fazendo a administração pode determinar dosagens ótimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. Em certas modalidades, a dosagem de um agente de ligação a VEGF/DLL4 ou um anticorpo é de aproximadamente 0,01 μg até aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,1 μg até aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 1 μg até aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 1 mg até aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg até aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal de aproximadamente 10 mg até aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 10 mg até aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal ou de aproximadamente 10 mg até aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, a dosagem do anticorpo ou outro agente de ligação a VEGF/DLL4 é de aproximadamente 0,1 mg até aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. Em certas modalidades, a dosagem pode ser fornecida uma vez ou mais ao dia, semana, mês ou ano. Em certas modalidades, o anticorpo ou outro agente de ligação a VEGF/DLL4 é fornecido uma vez a cada semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cada mês.

[0288] Em algumas modalidades, um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo) pode ser administrado em uma dose “de carga” mais alta inicial, seguida por uma ou mais doses menores. Em algumas modalidades, a frequência de administração também pode mudar. Em algumas modalidades, um regime de dosagem pode compreender a administração de uma dose inicial, seguida por doses adicionais (ou doses “de manutenção”) uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cada mês. Por exemplo, um regime de dosagem pode compreender a administração de uma dose de carga inicial, seguida por uma dose de manutenção semanal de, por exemplo, metade da dose inicial. Ou um regime de dosagem pode compreender a administração de uma dose de carga inicial, seguida por doses de manutenção de, por exemplo, metade da dose inicial em semanas alternadas. Ou um regime de dosagem pode compreender a administração de três doses iniciais durante 3 semanas, seguidas por doses de manutenção de, por exemplo, a mesma quantidade em semanas alternadas. Ou um regime de dosagem pode compreender a administração de uma dose inicial seguida por doses adicionais a cada 3 semanas ou uma vez ao mês. O médico que está fazendo o tratamento pode estimar taxas de repetição para dosagem com base nos tempos de residência medidos e nas concentraçãos do fármaco nos fluidos corporais ou nos tecidos. O progresso da terapia pode ser monitorado através de técnicas e ensaios convencionais.

[0289] Como é conhecido pelos peritos na arte, a administração de qualquer agente terapêutico pode levar a efeitos colaterais e/ou toxicidades. Em alguns casos, os efeitos colaterais e/ou as toxicidades são tão graves de forma a impossibilitar a administração do agente particular em uma dose terapeuticamente eficiente. Em alguns casos, a terapia com fármaco tem que ser descontinuada e outros agentes podem ser testados. Entretanto, muitos agentes na mesma classe terapêutica frequentemente exibem efeitos colaterais e/ou toxicidades similares, significando que o paciente tem que interromper a terapia ou se possível, sofrer os efeitos colaterais desagradáveis associados com o agente terapêutico.

[0290] Os efeitos colaterais provenientes dos agentes terapêuticos podem incluir, mas não estão limitados a, urticária, skin rashes, coceira, náusea, vômito, apetite diminuído, diarreia, chills, febre, fadiga, muscle aches e pain, cefaleias, baixa pressão sanguínea, alta pressão sanguínea, hypokalemia, baixas contagens san- guíneas, sangramento e problemas cardíacos.

[0291] Assim, um aspecto da presente invenção está direcionado a métodos de tratamento de câncer em um paciente que compreende a administração de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 utilizando um regime de dosagem inter-mitente, que pode reduzir os efeitos colaterais e/ou as toxicidades associadas com a administração do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4. Como utilizado aqui, “dosagem intermitente” refere-se a um regime de dosagem utilizando um intervalo de dosagem de mais de uma vez por semana, por exemplo, dosagem uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas etc. Em algumas modalidades, um método para o tratamento de câncer em um paciente humano compreende a administração ao paciente de uma dose eficiente de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de acordo com um regime de dosagem intermitente. Em algumas modalidades, um método para o tratamento de câncer em um paciente humano compreende a administração ao paciente de uma dose eficiente de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de acordo com um regime de dosagem intermitente e o aumento do índice terapêutico do anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende a administração de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4 ao paciente e a administração de doses subsequentes do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 aproximadamente uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende a administração de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 ao paciente e a administração de doses subsequentes do anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4 aproximadamente uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende a administração de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 ao paciente e a administração de doses subsequentes do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 apro- ximadamente uma vez a cada 4 semanas.

[0292] Em algumas modalidades, as doses subsequentes em um regime de dosagem intermitente são aproximadamente a mesma quantidade ou menos que a dose inicial. Em outras modalidades, as doses subsequentes são uma quantidade maior que a dose inicial. Como é conhecido pelos peritos na arte, as doses utilizadas variarão dependendo das metas clínicas que devem ser atingidas. Em algumas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 0,25 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg. Em algumas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 mg/kg. Em certas modali-dades, a dose inicial é de aproximadamente 0,5 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 1 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 2,5 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 5 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 7,5 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 10 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 12,5 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 15 mg/kg. Em certas modalidades, a dose inicial é de aproximadamente 20 mg/kg. Em algumas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 0,25 mg/kg até aproximadamente 15 mg/kg. Em certas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/kg. Em certas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 0,5 mg/kg. Em certas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 1 mg/kg. Em certas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 2,5 mg/kg. Em certas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 5 mg/kg. Em algumas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 7,5 mg/kg. Em algumas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 10 mg/kg. Em algumas modalidades, as doses subsequentes são de aproximadamente 12,5 mg/kg.

[0293] Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende: (a) a administração ao paciente de uma dose inicial de um anticorpo bies- pecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 2,5 mg/kg e (b) a administração de doses subsequentes de aproximadamente 2,5 mg/kg uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende: (a) a administração ao paciente de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 5 mg/kg e (b) a administração de doses sub-sequentes de aproximadamente 5 mg/kg uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende: (a) a administração ao paciente de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 2,5 mg/kg e (b) a administração de doses subsequentes de aproximadamente 2,5 mg/kg uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende: (a) a administração ao paciente de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximada-mente 5 mg/kg e (b) a administração de doses subsequentes de aproximadamente 5 mg/kg uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende: (a) a administração ao paciente de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 2,5 mg/kg e (b) a administração de doses subsequentes de aproximadamente 2,5 mg/kg uma vez a cada 4 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem intermitente compreende: (a) a administração ao paciente de uma dose inicial de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 5 mg/kg e (b) a administração de doses subsequentes de aproximadamente 5 mg/kg uma vez a cada 4 semanas. Em certas modalidades, a dose inicial e as doses de manutenção são diferentes, por exemplo, a dose inicial é de aproximadamente 5 mg/kg e as doses subsequentes são de aproximadamente 2,5 mg/kg. Em certas modalidades, um regime de dosagem intermitente pode compreender uma dose de carga, por exemplo, a dose inicial é de aproximadamente 20 mg/kg e as doses subsequentes são de aproximadamente 2,5 mg/kg ou aproximadamente 5 mg/kg administradas uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas ou uma vez a cada 4 semanas.

[0294] Outro aspecto da presente invenção está direcionado a métodos para a redução da toxicidade de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 em um paciente humano que compreendem a administração ao paciente do anticorpo bies- pecífico anti-VEGF/anti-DLL4 utilizando um regime de dosagem intermitente. Outro aspecto da presente invenção está direcionado a métodos para a redução dos efei-tos colaterais de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 em um paciente humano que compreendem a administração ao paciente do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 utilizando um regime de dosagem intermitente. Outro aspecto da presente invenção está direcionado a métodos para o aumento do índice terapêutico de um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 em um paciente humano que compreendem a administração ao paciente do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti- DLL4 utilizando um regime de dosagem intermitente.

[0295] A escolha do método de fornecimento para as doses iniciais e subsequentes é feita de acordo com a capacidade do animal ou do paciente humano de tolerar a introdução do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 no corpo. Assim, em qualquer um dos aspectos e/ou das modalidades descritas aqui, a administração do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 pode ocorrer através de injeção intravenosa ou de forma intravenosa. Em algumas modalidades, a administração ocorre através de infusão intravenosa. Em qualquer um dos aspectos e/ou das modalidades descritas aqui, a administração do anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 pode ocorrer através de uma rota que não é intravenosa.

V. Kits que compreendem agentes de ligação a VEGF/DLL4

[0296] A presente invenção fornece kits que compreendem os agentes de li- gação a VEGF/DLL4 (por exemplo, anticorpos) descritos aqui e que podem ser utilizados para realizar os métodos descritos aqui. Em certas modalidades, um kit compreende pelo menos um anticorpo purificado contra VEGF e/ou DLL4 em um ou mais recipientes. Em algumas modalidades, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para realizar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, as diretrizes para a realização dos ensaios e qualquer software necessário para análise e apresentação dos resultados. Um perito na arte reconhecerá facilmente que os agentes de ligação a VEGF/DLL4 divulgados da presente invenção podem ser facilmente incorporados dentro de um dos formatos de kits estabelecidos que são bem conhecidos na arte.

[0297] São adicionalmente fornecidos kits que compreendem um agente de ligação a VEGF/DLL4 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti- DLL4), bem como pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas modalidades, o segundo (ou mais) agente terapêutico é um agente quimioterapêutico. Em certas modalidades, o segundo (ou mais) agente terapêutico é um inibidor de angio- gênese.

[0298] As modalidades da presente divulgação podem ser adicionalmente definidas com referência aos exemplos não limitantes a seguir, que descrevem em detalhes a preparação de certos anticorpos da presente divulgação e métodos para a utilização dos anticorpos da presente divulgação. Será evidente para os peritos na arte que muitas modificações, tanto nos materiais quanto nos métodos, podem ser praticadas sem se afastar do âmbito da presente divulgação.

EXEMPLOS Exemplo 1 Afinidades de ligação dos anticorpos anti-VEGF/anti-DLL4

[0299] As KDs de anticorpos parentais anti-VEGF 219R45 (formato de IgG), anti-DLL4 21R79 (formato de IgG), anti-DLL4 21m18 (formato de IgG) e anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79 foram determinadas utilizando um sistema Biacore 2000 da Biacore LifeSciences (GE Healthcare). Proteínas recombinantes DLL4 humano-Fc ou DLL4 de camundongo-Fc foram imobilizadas sobre chips de carboxila CM5 utilizando química à base de amina padronizada (NHS/EDC) e foram bloqueadas com etanolamina. VEGF humano165 ou VEGF de camundongo165 recombinante foi biotinilado e imobilizado sobre chips de estreptavi- dina. Os anticorpos foram diluídos em série 2 vezes partindo de 100 nM até 0,78 nM em HBS-P (0,01 M de HEPES pH7,4, 0,15 M de NaCl, 0,005% v/v de Polissorbato 20). Para cada anticorpo, todas as 8 diluições foram injetadas sequencialmente sobre um chip específico. Os dados de cinética foram coletados ao longo do tempo e foram ajustados utilizando a equação de ajuste global simultânea para fornecer constantes de afinidade (valores de KD) para cada anticorpo biespecífico.

[0300] Como mostrado na Tabela 3, o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21m18 tinha uma constante de afinidade (KD) pelo VEGF humano de 0,36 nM e uma KD pelo DLL4 humano de 16 nM. O anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79 tinha uma KD pelo VEGF humano de 0,68 nM e uma KD pelo DLL4 humano de 0,53 nM. Ambos os anticorpos biespecíficos demonstraram ligação mais fraca ao VEGF de camundongo quando comparado com o VEGF humano e nenhum anticorpo se ligou ao DLL4 de camundongo. Assim, ambos os anticorpos biespecíficos demonstraram afinidade de ligação similar ao VEGF humano e o 219R45-MB-21R79 demonstrou uma ligação aproximadamente 30 vezes mais forte ao DLL4 humano do que o 219R45-MB-21m18. Além disso, o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79 tinha uma afinidade de ligação similar ao VEGF humano apesar do fato de que o anticorpo biespecífico é monovalente em relação ao VEGF quando comparado com o anti-corpo parental bivalente.

[0301] Foram identificados vários anticorpos anti-DLL4 adicionais que tinham afinidades de ligação intermediárias a uma KDs de 21m18 e 21R79. Dois destes anticorpos anti-DLL4 foram utilizados para produzir os anticorpos biespecíficos anti- VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB-21R83. Utilizando o sistema Bia- core 2000 como descrito anteriormente, as KDs dos anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB-21R83 pelo DLL4 humano foram determinadas. Uma comparação da afinidade de ligação pelo DLL4 humano destes quatro anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 é mostrada na Tabela 4.

[0302] As CDRs para os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB-21R83 são mostradas na Figura 1A. As SEQ ID NOs da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve são mostradas na Figura 1B e as SEQ ID NOs de cadeia pesada e de cadeia leve (com e sem sequência sinal) são mostradas na Figura 1C.

[0303] O anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 compreende uma (a) cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:75 depositada na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13233, (b) uma cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:33 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13236 e (c) uma cadeia leve codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:34 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designa- ção PTA-13235.

[0304] O anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 compreende uma (a) cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:31 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13232, (b) uma cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:33 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13236 e (c) uma cadeia leve codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:34 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA- 13235.

[0305] O anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R83 compreende (a) uma cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:72 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 24 de outubro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13278, (b) uma cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:33 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13236 e (c) uma cadeia leve codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:34 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA- 13235.

[0306] O anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R75 compreende (a) uma cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:74 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13234, (b) uma cadeia pesada codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:33 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA-13236 e (c) uma cadeia leve codificada pelo DNA que compreende a SEQ ID NO:34 depositada na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste em 21 de setembro de 2012 e recebeu o número de designação PTA- 13235.

Exemplo 2 Ensaio de HTRF para a ligação simultânea de anticorpos biespecíficos para VEGF humano e para DLL4 humano

[0307] Para caracterizar as capacidades de ligação de certos anticorpos e/ou misturas de anticorpos tanto a VEGF quanto a DLL4, foram realizados ensaios de fluorescência revelada com o tempo homogênea (HTRF). Os anticorpos testados eram os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79, anticorpos parentais 219R45 (anti-VEGF), 21m18 (anti-DLL4), 21R79 (anti-DLL4), uma combinação de 219R45 e 21m18 ou uma combinação de 219R45 e 21R79. Os anticorpos ou as misturas de anticorpos foram diluídas em série 2 vezes partindo de 3000 nM até 2,9 nM em tampão de ligação (1X PBS, 0,1% de gelatina, 0,1% de Polissorbato 20, 400 mM de fluoreto de potássio) e colocadas em uma placa de 96 poços branca. Um volume igual de solução contendo 4 μg/mL de hDLL4-Fc marcada com d2 e 21,4 ng/mL de hVEGF165 marcada com criptato de európio foi adicionado em cada poço para um volume final de 100 μL (as concentrações finais de fluoróforos receptores e doadores eram de 2 μg/mL e 10,7 ng/mL, respectivamente). As placas de ensaio foram incubadas durante 2 horas até durante a noite toda elidas em uma leitora SpectraMax M5e Microplate (Molecular Devices, Sunnyvale CA) em um comprimento de onda de excitação de 314 nm.

[0308] Como mostrado na Figura 2, os anticorpos biespecíficos anti- VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79, eram capazes de se ligar tanto a hVEGF quanto a hDLL4 simultaneamente. De maneira importante, nenhuma das combinações dos anticorpos parentais (isto é, 219R45 e 21m18 ou 219R45 e 21R79) era capaz de se ligar a VEGF e a DLL4 simultaneamente. Estes resultados demonstram claramente que os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79 são capazes de funcionar diferentemente do que apenas uma mistura dos dois anticorpos individuais.

Exemplo 3 Inibição da proliferação de HUVEC por anticorpos biespecíficos anti- VEGF/anti-DLL4

[0309] As células HUVEC foram obtidas na Lonza (Walkersville MD) e cultivadas em meio de crescimento (M199, 10% de FBS inativado com calor (HI-FBS), 50 μg/mL de EGS, 1X heparina, 1 mM de L-glutamina). Para o ensaio de prolifera-ção de HUVEC, uma placa de 96 poços foi pré-revestida com 50 μL de solução de colágeno do tipo I de cauda de rato a 10 μg/mL (colágeno I em ácido acético a 0,02 N) e incubada a 4°C durante toda a noite. Após a incubação, a placa foi vigorosamente aspirada para remover a solução de colágeno I não ligada e lavada uma vez com 200 μL de DPBS. As células HUVEC foram removidas da superfície dos frascos de crescimento utilizando um reagente de subclonagem de célula endotelial e centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. As células foram ressuspensas em meio de starvation/ensaio (M199 e 2% de HI-FBS, 1X heparina, 5 U/mL de heparina- glutamina) a uma densidade de 105 células/mL. As células foram semeadas dentro da placa de ensaio revestida com colágeno a 5000 células/poço, 50 μL/po^o. As células foram incubadas durante 3 horas a 37°C, lavadas uma vez, realimentadas com 100 μL de meio de ensaio e incubadas durante toda a noite a 37°C. No dia seguinte, os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18, 219R45-MB-21R79, o anticorpo parental 219R45 ou o anticorpo de controle LZ1 foi preparado em uma mistura com VEGF humano (R&D Biosystems, Minneapolis MN). Os anticorpos foram diluídos em série 5 vezes partindo de 20 μM até 0,25 nM em tampão de ensaio em combinação com hVEGF (concentração final de 5 ng/mL). A mistura foi pré-incubada a 37°C durante 2 horas. O meio foi removido da placa de ensaio e 100 μL da mistura de anti- corpo/hVEGF foram adicionados em cada poço. Após uma incubação de 3-4 dias, o meio foi removido e uma alíquota fresca da mistura de anticorpo/hVEGF foi adicionada em cada poço e foi permitida que fosse incubada durante mais 4 dias. No dia 7, 20 μL de reagente Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionados em cada poço e incubados a 37°C durante 5-6 horas. A placa foi lida com uma leitora SpectraMax M5e Microplate (Molecular Devices, Sunnyvale CA) utilizando um comprimento de onda de excitação de 539 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm.

[0310] Como mostrado na Figura 3, os anticorpos biespecíficos anti- VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79, bem como o anticorpo parental anti-VEGF 219R45 inibiam a proliferação de HUVEC. Estes resultados de-monstraram que os anticorpos biespecíficos eram capazes de inibir a proliferação induzida por VEGF das células HUVEC.

Exemplo 4 Inibição da sinalização de Notch induzida por DLL4 por anticorpos biespecí- ficos

[0311] Células PC3 humanas foram transfectadas com um vetor de expressão que codifica um receptor de Notch2 humano de comprimento completo e um vetor repórter de luciferase de vaga-lume (repórter de luciferase 8xCBF) que é capaz de responder à sinalização de Notch. As células também foram transfectadas com um repórter de luciferase de Renilla (Promega, Madison WI) como um controle interno para a eficiência de transfecção. A proteína DLL4 humana purificada foi revestida sobre placas de 96 poços a 100 ng/poço e células PC3-luc expressando Notch2 foram adicionadas aos poços. Os anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18, 219R45-MB-21R79, os anticorpos parentais anti-DLL4 21m18, 21R79 ou um anticorpo de controle LZ1 foi diluído em série 5 vezes partindo de 20 μg/mL até 0,064 μg/mL, adicionado nos poços apropriados e incubado durante toda a noite. A atividade da luciferase foi determinada utilizando um kit de ensaio da luciferase dual (Promega, Madison, WI) com a atividade da luciferase de vaga-lume normalizada em relação à atividade da luciferase de Renilla.

[0312] Como mostrado na Figura 4, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti- DLL4 219R45-MB-21R79 e os anticorpos parentais anti-DLL4 21m18 e 21R79 inibiam a sinalização de Notch induzida por DLL4. O anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21m18 inibia a sinalização de Notch induzida por DLL4 apenas em altas concentrações do anticorpo. Estes resultados demonstraram que o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79 e até uma extensão menor o anticorpo biespecífico 219R45-MB- 21m18, eram capazes de inibir a sinalização de Notch induzida por DLL4. Assim, em combinação com os resultados apresentados no Exemplo 3, os anticorpos biespecí- ficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 e 219R45-MB-21m18 demonstraram a capacidade de inibir a sinalização tanto induzida por VEGF quanto induzida por DLL4 e/ou as funções de proliferação.

Exemplo 5 Inibição do crescimento de tumor in vivo por um anticorpo biespecífico em um modelo de enxerto de pele humana

[0313] Foi relatado um modelo de enxerto de pele humana que compreende um enxerto de pele humana e células tumorais humanas. Um enxerto de pele humana é estabelecido e então as células tumorais humanas são implantadas dentro do enxerto de pele, permitindo que as células tumorais crescessem em um ambiente com estroma e vasculatura humanos (Tahtis e outros, 2003, Mol. Cancer Ther. 2:229-737). Amostras de pele humana foram obtidas partindo do tecido de prepúcio neonatal e enxertadas sobre o flanco lateral de camundongos NOD-SCID. Após o estabelecimento do enxerto de pele, células de tumor de cólon OMP-C8 marcadas com luciferase (20.000 células) foram injetadas de forma intradermal dentro da pele humana. O crescimento de tumor foi monitorado por obtenção de imagens por bio- luminescência utilizando um sistema de obtenção de imagens IVIS (Caliper Life Sciences, Mountain View, CA). Foi permitido que os tumores crescessem até atingirem 1,2 x 106 fótons por segundo. Os camundongos carregando tumor (n = 6 camundon- gos/grupo) foram separados aleatoriamente e tratados com Ab de controle, anticorpo anti-hDLL4 21m18, anticorpo anti-VEGF bevacizumab ou anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18. Os animais foram tratados uma vez por semana e os anticorpos foram administrados de forma intraperitoneal em uma dose de 25 mg/kg. O crescimento de tumor foi monitorado por obtenção de imagens por biolu- minescência nos dias indicados.

[0314] Como mostrado na Figura 5, tanto o anticorpo anti-hDLL4 21m18 quanto o anticorpo anti-VEGF bevacizumab inibiam o crescimento de tumor neste modelo de enxerto de pele humana/tumor humano. Além disso, o anticorpo biespecí- fico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 era mais eficiente que o anticorpo anti- DLL4 ou o anticorpo anti-VEGF isoladamente. Estes dados demonstram a utilidade de direcionamento de forma simultânea a DLL4 e a VEGF com um anticorpo biespe- cífico.

Exemplo 6 Tumorigenicidade de células de tumor pancreático OMP-PN8 após o tratamento com anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4

[0315] Camundongos carregando tumores pancreáticos OMP-PN8 foram tra- tados com anticorpo de controle (15 mg/kg), anticorpo anti-hDLL4 21m18 (15 mg/kg), anticorpo anti-VEGF bevacizumab (15 mg/kg) ou anticorpos biespecíficos anti- VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 ou 219R45-MB-21R79 (30 mg/kg) com ou sem gemcitabina (70 mg/kg). Após quatro semanas de tratamento, os tumores foram coletados, processados em suspensões de células isoladas e as células tumorais humanas foram purificadas através da eliminação imunomagnética de células murinas. 90 células tumorais humanas de cada grupo de tratamento foram transferidas para um novo grupo de camundongos (n = 10 camundongos/grupo). Foi permitido que os tumores crescessem durante 55 dias sem qualquer tratamento e os volumes dos tumores foram medidos com calibre eletrônicos.

[0316] A Figura 6 mostra o volume do tumor dos camundongos individuais em cada grupo. As células isoladas dos camundongos tratados com anticorpo anti- hDLL4 21m18 tinham tumorigenicidade enormemente diminuída, 5 de 10 camundongos tinham tumores, quando comparadas com as células isoladas dos camundongos tratados com anticorpo de controle em que 9 de 10 camundongos tinham tumores. A redução na frequência de crescimento do tumor indica uma redução na frequência de células tronco cancerosas. Em contraste, o tratamento com bevacizu- mab não resultou na redução da frequência de crescimento do tumor, 10 de 10 camundongos tinham tumores. Similar ao bevacizumab, o tratamento com gemcitabina como um único agente não tinha efeito sobre a frequência de crescimento do tumor uma vez que 10 de 10 camundongos tinham tumores. Ambos os anticorpos biespe- cíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79 reduziram a frequência de crescimento do tumor (5 de 10 camundongos tinham tumores e 4 de 10 camundongos tinham tumores, respectivamente). O tratamento de combinação com gemcitabina parecia não ter efeito sobre a frequência de crescimento do tumor. Estes dados indicam que o direcionamento ao DLL4 reduz a frequência de células tronco cancerosas enquanto que o direcionamento ao VEGF isoladamente não o faz. De forma importante, estes dados indicam que a atividade anti-CSC do anticorpo anti-DLL4 é mantida em um anticorpo biespecífico.

Exemplo 7 ELISA de anticorpo biespecífico

[0317] VEGF (ATGEN, Coréia do Sul) foi revestido sobre placas Nunc maxisorb a 2 μg/mL (100 μL/poço) e incubado durante toda a noite a 2-8°C. Os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 e 219R45-MB-21R83 foram diluídos em tampão de bloqueio (1x PBS, 0,1% de gelatina, 0,1% de Polissorbato-20, pH 7,4) contendo 2 μg/mL de biotina-DLL4-hFc. Os anticorpos foram diluídos em série 3 vezes partindo de 500 ng/mL até 0,008 ng/mL. As amostras de anticorpo foram incubadas durante 2 horas em tampão de bloqueio contendo a biotina-DLL4-hFc. Após a incubação, as amostras de anticorpo foram transferidas para a placa de ensaio revestida com VEGF (100 μL/poço) e incubadas durante 2 horas. Streptavidin-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) foi adicionado em cada poço e incubado durante 1 h. O substrato TMB foi adicionado nos poços com um desenvolvimento de coloração de 10 minutos e a reação foi interrompida com ácido sulfúrico a 2 M. A absorbância foi lida em 450-650 nm e os dados foram analisados utilizando o ajuste de 4 parâmetros dentro do programa de análise Softmax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[0318] A Figura 7 mostra as curvas de titulação dos anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18 (círculos abertos), 219R45-MB-21R79 (quadrados abertos), 219R45-MB-21R75 (triângulos abertos) e 219R45-MB-21R83 (diamonds abertos) em comparação com um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de referência (círculos sólidos). As potências relativas para os anticorpos biespecíficos quando comparados com o anticorpo biespecífico de referência são mostradas na Tabela 5.

[0319] O anticorpo biespecífico 219R45-MB-21R79 era o mais potente, aproximadamente 7 vezes mais potente que 219R45-MB-21m18, que refletia a maior afinidade do sítio de ligação ao antígeno 21R79.

Exemplo 8 Produção dos anticorpos biespecíficos

[0320] Os anticorpos biespecíficos foram produzidos utilizando uma linhagem de célula GS-CHO. As células CHOK1SV (Lonza Biologics) foram transfectadas através de eletroporação com o(s) gene(s) de interesse acoplado(s) à glutamina sin- tetase (GS) como o marcador selecionável. Os transfectantes e os subclones foram verificados em relação à produtividade de anticorpo e os altos produtores foram se-lecionados para produção em escala aumentada. As células foram crescidas utilizando um processo de batelada alimentada e biorreatores de batelada alimentada. O anticorpo acumulado no fluido de cultura de células coletado (HCCF) foi isolado e purificado utilizando técnicas de cromatografia.

[0321] As linhagens de células dos anticorpos biespecíficos 219R45-MB- 21m18.010.017 e 219R45-MB-21R79.017.003 foram cultivadas em biorreatores de tanque agitados de 5 L durante 14 dias. A linhagem de célula 219R45-MB- 21m18.010.017 produzia um título de anticorpo final de 3,0 g/L e a linhagem de célula 219R45-MB-21R79.017.003 produzia um título de anticorpo final de 0,8 g/L. As linhagens de células 219R45-MB-21R75.101 e 219R45-MB-21R83.113 foram cultivadas em sistemas de biorreator WAVE de 25 L (GE Healthcare) utilizando um processo de batelada alimentada que atingia títulos de anticorpos finais de 0,4 g/L. As linhagens de células dos anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18AG.138.007, 219R45-MB-21m18AG.038.009, 219R45-MB-21m18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014 e 219R45-MB-21R83AG.129.003 foram cultivadas em biorreato- res de tanque agitados de 5 L durante 14 - 15 dias. A linhagem de célula 219R45- MB-21m18AG.138.007 produzia um título de anticorpo final de 1,0 g/L após 14 dias. A linhagem de célula 219R45-MB-21m18AG.038.009 produzia um título de anticorpo final de 1,6 g/L após 14 dias. A linhagem de célula 219R45-MB-21m18AG.142.002 produzia um título de anticorpo final de 2,6 g/L após 14 dias. A linhagem de célula 219R45-MB-21R79AG.072.014 produzia um título de anticorpo final de 2,1 g/L após 15 dias. A linhagem de célula 219R45-MB-21m18AG.038.009 produzia um título de anticorpo final de 2,4 g/L após 15 dias. O fluido de cultura foi coletado por filtração partindo de cada uma destas quatro linhagens de células e submetido à cromatogra- fia por afinidade com Proteína A. A coluna de Proteína A foi lavada com uma série de tampões e os anticorpos foram eluídos utilizando um tampão de eluição de pH baixo. A caracterização inicial da pureza dos anticorpos biespecíficos foi realizada utilizando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC-HPLC) e focalização isoelé- trica (IEF).

[0322] A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) foi utilizada para determinar a pureza do produto de anticorpo. A SEC é um método cromatográfico bem conhecido em que as moléculas (por exemplo, anticorpos) em solução são separadas por seu tamanho. A SEC pode ser utilizada para distinguir um produto de anticorpo do agregado e/ou impurezas e para determinar a porcentagem do produto de anticorpo quando comparado com a mistura total. Como utilizado aqui, a SEC não distingue entre um anticorpo homomérico e um anticorpo biespecífico heterodiméri- co.

[0323] A focalização isoelétrica por capilaridade em imagens (icIEF) foi utilizada para determinar a identidade e a pureza dos heterodímeros de anticorpos bi- específicos. Utilizando icIEF, as isoformas de carga de um anticorpo são separadas de acordo com seu pI e o resultado é um “fingerprint” da distribuição de cargas do anticorpo. O método de icIEF também pode servir como uma determinação da pureza através da separação dos heterodímeros de anticorpos biespecíficos por seu pI distinto de quaisquer produtos de homodímeros ou impurezas.

[0324] As amostras de anticorpo biespecífico foram analisadas por icIEF em um instrumento ProteinSimple ICE280 (ProteinSimple, Santa Clara, CA). Para esta análise, uma mistura de proteína é introduzida dentro de um capilar, é aplicada alta voltagem ao longo do capilar e anfolitos estabelecem um gradiente de pH linear ao longo do comprimento do capilar. Sob a influência do campo elétrico, tanto os marcadores de pI quanto a mistura de proteína migram ao longo do comprimento do capilar até ser atingido um valor de pH em que a carga líquida é zero. Uma vez reali-zada a focalização, o instrumento ICE280 utiliza detecção de imagens da coluna inteira com uma câmera de UV de 280 nm para monitorar o padrão de isoformas de proteínas dentro do capilar. O eletroferograma é calibrado utilizando marcadores de pI internos e integrado para estabelecer as respectivas áreas de porcentagem das isoformas carregadas diferentes da mistura de proteína. Os perfis de carga provenientes de vários anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 são mostrados na Figura 8. Para este experimento, os eluatos de Proteína A foram diluídos com água MilliQ até uma concentração de 6,6 mg/mL. Um total de 18 μL da amostra foi misturado com 100 μL de ureia a 8 M, 70 μL de metilcelulose a 0,5%, 8 μL de 3-10 Phar- malyte, 2 μL de marcador de pI alto e 2 μL de marcador de pI baixo até um volume final de 200 μL. A Tabela 6 mostra a porcentagem de produto de anticorpo das linhagens de células 219R45-MB-21m18.010.017, 219R45-MB-21R79.017.002, 219R45-MB-21R75.101, 219R45-MB-21R83.113, 219R45-MB-21m18.138.007,219R45-MB-21m18AG.038.009, 219R45-MB-21m18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014 e 219R45-MB-21R83AG.129.003 após a cromatografia por afinidade com Proteína A que é determinada por SEC-HPLC. A Tabela 6 também mostra a porcentagem de anticorpos heterodiméricos das linhagens de células 219R45-MB- 21m18.010.017, 219R45-MB-21R79.017.002, 219R45-MB-21R75.101, 219R45-MB- 21R83.113, 219R45-MB-21m18.138.007, 219R45-MB-21m18AG.038.009, 219R45- MB-21m18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014 e 219R45-MB-21R83AG.129.003 após a cromatografia por afinidade com Proteína A que é analisada por icIEF.

[0325] A pureza do produto de anticorpo biespecífico pode ser adicionalmente aumentada através de etapas de cromatografia adicionais. Após a cromatografia por afinidade com Proteína A, a fração de eluato foi mantida em um pH baixo durante não menos que 60 minutos à temperatura ambiente para inativação viral. A solução de anticorpo (eluato da coluna de Proteína A, pH ajustado) foi carregada sobre uma coluna de troca aniônica forte. As impurezas relacionadas ao produto e ao processo ligadas à resina de cromatografia de troca aniônica e a fração do que foi eluí- do (produto de anticorpo) foram coletadas. Em alguns casos, a pureza foi adicionalmente aprimorada através do uso de uma resina de cromatografia multimodal tal como hidroxiapatita cerâmica. Em alguns casos, a troca de tampão do produto de anticorpo foi realizada utilizando técnicas de ultrafiltração e diafiltração, após o que foram adicionados excipientes. O anticorpo formulado foi esterilizado por filtração dentro de recipientes esterilizados e armazenado refrigerado ou congelado. A pureza dos anticorpos biespecíficos foi reavaliada utilizando SEC-HPLC e IEF. Tabela 7

[0326] Como mostrado na Tabela 7, a purificação dos anticorpos biespecífi- cos anti-VEGF/anti-DLL4 com etapas de cromatografia adicionais após a Proteína A resultou no isolamento do produto de anticorpos que era 95% até aproximadamente 99% puro quando analisado por SEC. A análise por IEF determinou que o anticorpo purificado biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB-21m18.010.017 era 98,5% heterodimérico, o anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB-21R79.017.002 era 99,3% heterodimérico, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB-21R75.101 era 98,2% heterodimérico, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB- 21R83.113 era 91,4% heterodimérico, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB-21m18.138.007 era 100% heterodi- mérico, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB-21m18AG.142.002 era 100% heterodimérico, o anticorpo biespe- cífico anti-VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB- 21R79AG.072.014 era 100% heterodimérico e o anticorpo biespecífico anti- VEGF/anti-DLL4 proveniente da linhagem de célula 219R45-MB-21R83AG.129.003 era 100% heterodimérico. Estes resultados demonstraram que a etapa de cromato- grafia de troca aniônica aumentava enormemente a porcentagem de anticorpos he- terodiméricos quando comparada com a purificação por cromatografia com Proteína A isoladamente. A adição de uma etapa de cromatografia multimodal tal como hidro- xiapatita cerâmica também pode aprimorar a pureza monomérica (que é determinada por SEP-HPLC).

Exemplo 9 Inibição do crescimento de tumor de cólon OMP-C8 no modelo de recorrência de tumor in vivo

[0327] Suspensões de células isoladas de xenoenxertos de tumor de cólon OMP-C8 (20.000 células) foram injetadas de forma subcutânea nos flancos de camundongos NOD/SCID com 6-8 semanas de idade. Foi permitido que os tumores crescessem durante 33 dias até estes atingirem um volume médio de 240 mm3. Os camundongos foram separados aleatoriamente (n = 10 por grupo) e tratados com anticorpo anti-hDLL4 21m18, anticorpo anti-VEGF bevacizumab, uma combinação de anticorpos 21m18 e bevacizumab, anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18, anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 ou anticorpo de controle, todos em combinação com irinotecan. Os anticorpos e o irinotecan foram dosados semanalmente por injeção dentro da cavidade intraperitoneal. Os anticorpos 21m18 e bevacizumab foram dosados em 7,5 mg/kg, os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79 foram dosados em 15 mg/kg e irinotecan foi dosado em 45 mg/kg. Irinotecan foi dosado durante quatro semanas, em cujo período de tempo, este foi descontinuado e a administração dos anticorpos continuava. O crescimento de tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com calibres eletrônicos nos pontos de tempo indicados. Os dados são expressos na forma da média ± S.E.M.

[0328] Como mostrado na Figura 9, o anticorpo anti-hDLL4 21m18 continuava a inibir o crescimento de tumor após o tratamento com irinotecan ser interrompido. Em contraste, o anticorpo anti-VEGF bevacizumab não era capaz de inibir o novo crescimento do tumor após o irinotecan ter sido interrompido. A combinação de anticorpo anti-DLL4 21m18 e anticorpo anti-VEGF bevacizumab resultou em uma maior inibição do novo crescimento do tumor do que cada um dos agentes isoladamente. Além disso, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB- 21m18 era mais eficiente na inibição do novo crescimento do tumor que a mistura dos dois anticorpos.

Exemplo 10 Redução na tumorigenicidade de tumores de cólon OMP-C8

[0329] Suspensões de células isoladas de xenoenxertos de tumor de cólon OMP-C8 (20.000 células) foram injetadas de forma subcutânea nos flancos de camundongos NOD/SCID com 6-8 semanas de idade. Foi permitido que os tumores crescessem durante 33 dias até estes atingirem um volume médio de 300 mm3. Os camundongos foram separados aleatoriamente (n = 5 por grupo) e tratados com anticorpo anti-DLL4 21m18, anticorpo anti-VEGF bevacizumab, uma combinação de anticorpos 21m18 e bevacizumab, anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18, anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 ou anticorpo de controle, cada um em combinação com irinotecan ou sem irinotecan. Os anticorpos e o irinotecan foram dosados semanalmente por injeção dentro da cavidade intraperitoneal. Os anticorpos 21m18 e bevacizumab foram dosados em 7,5 mg/kg, os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R79 foram dosados em 15 mg/kg e o irinotecan foi dosado em 45 mg/kg. Os tumores foram coletados após 4 semanas, processados em suspensões de células isoladas e as células tumorais humanas foram isoladas. 150 células tumorais de cada grupo expe-rimental foram injetadas de forma subcutânea em um novo grupo de camundongos (n = 10 por grupo) e foi permitido que os tumores crescessem sem tratamento. O crescimento de tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com calibres eletrônicos.

[0330] Os volumes dos tumores individuais no dia 68 são mostrados na Figu- ra 10. O anticorpo anti-DLL4 21m18, a combinação de 21m18 com o anticorpo anti- VEGF bevacizumab, os anticorpos biespecíficos 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB- 21R79 e o irinotecan reduziam todos a frequência de crescimento do tumor na forma de agentes isolados. Em contraste, o anti-VEGF bevacizumab na forma de um agente isolado não tinha efeito sobre a frequência de crescimento do tumor quando comparado com o anticorpo de controle. Nos grupos tratados com uma combinação de irinotecan e anticorpos, o anticorpo biespecífico 219R45-MB-21m18 tinha o maior efeito na redução da frequência de crescimento do tumor.

Exemplo 11 Inibição do crescimento de tumor de cólon OMP-C8 in vivo

[0331] Suspensões de células isoladas de xenoenxertos de tumor de cólon OMP-C8 (50.000 células) foram injetadas de forma subcutânea nos flancos de camundongos NOD/SCID com 6-8 semanas de idade. Foi permitido que os tumores crescessem durante 21 dias até estes atingirem um volume médio de 80 mm3. Os camundongos foram separados aleatoriamente (n = 8 por grupo) e tratados com anticorpo anti-DLL4 21m18, anticorpo anti-VEGF bevacizumab, anticorpos biespecífi- cos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB- 21R79, 219R45-MB-21R83 ou anticorpo de controle, isoladamente ou em combinação com irinotecan. Os anticorpos e o irinotecan foram dosados semanalmente por injeção dentro da cavidade intraperitoneal. O bevacizumab e os anticorpos biespecí- ficos 219R45-MB-21m18, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB-21R79 e 219R45-MB- 21R83 foram dosados em 15 mg/kg e o irinotecan foi dosado em 7,5 mg/kg. O crescimento de tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com calibres eletrônicos nos pontos de tempo indicados. Os dados são expressos na forma da média ± S.E.M.

[0332] Na forma de agentes isolados, todos os quatro anticorpos biespecífi- cos anti-VEGF/anti-DLL4 exibiram maior atividade antitumor em relação ao anticorpo anti-VEGF bevacizumab. Em combinação com irinotecan, o tratamento com anticorpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R83 resultou na maior inibição de crescimento de tumor (Figura 11).

[0333] Após a fase de tratamento, seções de tumor foram preparadas e analisadas através da coloração com hematoxilina e eosina (H&E). Os tumores tratados com 219R45-MB-21m18 e 219R45-MB-21R83 em combinação com irinotecan exibiam regiões de coloração rosa escura fornecendo evidência de calcificação extensiva. Esta é característica de tecido tumoral altamente necrótico. Exemplo 12 Estudo de toxicidade sem ser GLP de anticorpos biespecíficos em macacos cynomolgus Um estudo de toxicidade sem ser GLP em macacos cynomolgus foi iniciado para avaliar e para comparar o perfil de toxicidade de alguns dos anticorpos biespe- cíficos. Os animais foram dosados com 0 mg/kg (controle), 5 mg/kg (dose baixa) ou 30 mg/kg (dose alta) de anti-DLL4/anticorpo anti-VEGF biespecífico (219R45-MB- 21m18, 219R45-MB-21R83 ou 219R45-MB-21R79) a cada 2 semanas via infusão IV. 3 machos e 3 fêmeas foram dosados em cada grupo. Após 15 semanas, os pesos corporais médios eram mais baixos em animais que receberam a dose alta de 219R45-MB-21R79 do que em animais que receberam a dose alta de 219R45-MB- 21R18 ou 219R45-MB-21R83. Em adição, os níveis médios de albumina do soro eram mais baixos nos animais que receberam 219R45-MB-21R79 do que naqueles que receberam 219R45-MB-21R18 ou 219R45-MB-21R83. Embora de natureza preliminar, estes dados iniciais sugerem que 219R45-MB-21R18 e 219R45-MB-21R83 podem ter um perfil de toxicidade superior comparados com 219R45-MB-21R79.

[0334] É entendido que os exemplos e as modalidades descritos aqui têm apenas finalidades de ilustração e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas pelos peritos na arte e devem ser incluídas dentro do espí- rito e do purview deste pedido de patente.

[0335] Todas as publicações, as patentes, os pedidos de patentes, os sites na internet e os números de acesso/sequências de bancos de dados incluindo tanto sequências polinucleotídicas quanto polipeptídicas citados aqui são incorporados aqui como referência na mesma em sua totalidade para todas as finalidades até a mesma extensão como se cada publicação, patente, pedido de patente, site na internet ou número de acesso/sequência de banco de dados individual fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada como referência. SEQUÊNCIAS Cadeia pesada com sequência sinal de 21m18 (sublinhada) (SEQ ID NO:1) MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVQ LVQ SGAEVKKPGASVKISC KAS GYS FTA YYIHWVKQAP GQGLEWIGYISSYNGATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK VDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada com sequência sinal de 21R79 (sublinhada) (SEQ ID NO:2) MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVQ LVQ SGAEVKKPGASVKISC KAS GYS FTA YYIHWVKQAP GQGLEWIGYIANYNRATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK VDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada com sequência sinal de 219R45 (sublinhada) (SEQ ID NO:3) MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVQ LVQ SGAEVKKPGASVKVSC KAS GYTFTN YWMHWVRQAP GQGLEWMGDINPSNGRTSYKEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDT AVYFCTIHYD DKYYPLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLKSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia leve com sequência sinal (sublinhada) (SEQ ID NO:4) MVLQTQVFISLLLWISGAYG DIVMTQSPDS LAVS LGE RAT IS C RAS ESVDNY GISFMKWF QQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYY CQQSKEVPW TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC Cadeia pesada sem sequência sinal prevista de 21m18 (SEQ ID NO:5) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI SSYNGATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVD KSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada sem sequência sinal prevista de 21R79 (SEQ ID NO:6) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI ANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVD KSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada sem sequência sinal prevista de 219R45 (SEQ ID NO:7) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWM GDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYW GQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTL PPSREKMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia leve sem sequência sinal prevista (SEQ ID NO:8) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLI YAASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Região variável de cadeia pesada de 21m18 (SEQ ID NO:9) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI SSYNGATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSS Região variável de cadeia pesada de 21R79 (SEQ ID NO:10) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI ANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSS Região variável de cadeia pesada de 219R45 (SEQ ID NO:11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWM GDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYW GQGTLVTVSS Região variável de cadeia leve (SEQ ID NO:12) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLI YAASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIK CDR1 de cadeia pesada de 21R75, 21R79, 21R83 e 21m18 (SEQ ID NO:13) TAYYIH CDR1 de cadeia pesada alternativa de 21R75, 21R79, 21R83 e 21m18 (SEQ ID NO:79) AYYIH CDR2 de cadeia pesada de 21R79 (SEQ ID NO:14) YIANYNRATNYNQKFKG CDR2 de cadeia pesada de 21m18 (SEQ ID NO:15) YISSYNGATNYNQKFKG CDR3 de cadeia pesada de 21R75, 21R79, 21R83 e 21m18 (SEQ ID NO:16) RDYDYDVGMDY CDR1 de cadeia pesada de 219R45 (SEQ ID NO:17) NYWMH CDR2 de cadeia pesada de 219R45 (SEQ ID NO:18) DINPSNGRTSYKEKFKR CDR3 de cadeia pesada de 219R45 (SEQ ID NO:19) HYDDKYYPLMDY CDR1 de cadeia leve (SEQ ID NO:20) RASESVDNYGISFMK CDR2 de cadeia leve (SEQ ID NO:21) AASNQGS CDR3 de cadeia leve (SEQ ID NO:22) QQSKEVPWTFGG DLL4 humana com sequência sinal (sublinhada) (SEQ ID NO:23) MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQE FINE RGVLAS GRPC EPGCRTFFRV CLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFT WPGTFSLIIE AWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYR VICSDNYY GDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQ NGYCSKPAECL CRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYC THHSPCKNGATC SNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCL CPPGYYGLHCE HSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSN PCANGGQCLNR GPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAG FSGRRCEVRTS IDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVG DLL4 humana sem sequência sinal prevista (SEQ ID NO:24) SGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTF GTVSTPVLGT NSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPD ALISKIAIQ GSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFG HYVCQPDGNL SCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIP HNGCRHGTCST PWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRP GYTGVDCELELS ECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGG SCRERNQGANY ACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGT YCELHVSDCAR NPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCY TDLSTDTFVC NCPYGFVGSRCEFPVG Região N-Terminal da DLL4 Humana (SEQ ID NO:25) SGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTF GTVSTPVLGT NSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPD ALISKIAIQ GSLAVGQN Domínio DSL da DLL4 Humana (SEQ ID NO:26) WLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDG NLSCLPGWTG EYC VEGF-A humana com sequência sinal (sublinhada)(SEQ ID NO:27) MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQ RSYCHPIETLVD IFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPH QGQHIGEM SFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGA RCCLMPWSLPG PHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDK PRR VEGF-A humana sem sequência sinal prevista (SEQ ID NO:28) APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSC VPLMRCGGC CNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRA RQEKKSVRG KGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHL FVQDPQTCKCSC KNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada de 21m18 (13B Versão 1) (SEQ ID NO:29) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCC GTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCTTACTACATCCACTGGGTCA AGCAGGCCCCT GGGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCTCCTACAACGGCGCC ACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCC ACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGT GTCCTCTGCCTCC ACCAAGGGCCCATCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACC TCTGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAG TCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCC AGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTG GAGCGGAAGTGC TGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTG TCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATAC AAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTG GAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG TCCCTGTCCCTG TCTCCTGGCAAGTAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada de 21R79 (13B Versão 1) (SEQ ID NO:30) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCC GTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTGA AACAGGCACCA GGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTATATCGCCAACTACAACCGGGCC ACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCC ACAGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGT GTCCTCCGCCTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACC TCTGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAG TCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCC AGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTG GAGCGGAAGTGC TGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTG TCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATAC AAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTG GAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG TCCCTGTCCCTG TCTCCTGGCAAGTAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada de 21R79 (13B Versão 2) (SEQ ID NO:31) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGG TGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCC GTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTA AACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTAATTATAATAGAGCTA CAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGA CAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTA GAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTG TCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCT CTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAG TCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCA AACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTG AGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGA CTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACA AGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTT GAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGT CCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada de 219R45 (13A Versão 1) (SEQ ID NO:32) ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTGTTGCTCGTGGCGGCACCCAGATGGG TGTTGTCCCAA GTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCAAG CGTAAAAGTATCG TGTAAGGCCTCGGGGTACACGTTTACAAACTACTGGATGCATTGGGTGC GGCAGGCTCCG GGACAGGGGTTGGAATGGATGGGTGACATTAACCCCTCAAATGGCAGA ACATCATATAAG GAAAAGTTCAAACGCCGCGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCAAGCTCG ACTGCGTACATG GAACTTTCGTCGCTGAGGTCGGAGGACACGGCAGTGTACTTTTGCACC ATCCATTATGAT GACAAGTATTACCCTCTGATGGATTATTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCA CCGTCTCCAGC GCGTCGACGAAAGGTCCCTCGGTATTTCCCCTCGCCCCCTGCTCGAGG TCGACATCCGAA TCAACAGCTGCCCTCGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCAGAGCCG GTAACGGTGTCG TGGAACTCGGGAGCGCTTACGTCCGGAGTCCACACATTTCCGGCGGTA CTGCAATCCTCG GGACTGTATTCGTTGTCGTCAGTGGTGACTGTCCCGTCCTCCAATTTCG GGACTCAGACC TATACGTGCAACGTCGACCACAAACCCTCAAACACCAAGGTGGATAAGA CAGTGGAGCGC AAGTGCTGCGTGGAGTGTCCCCCGTGTCCGGCACCCCCTGTCGCCGG ACCCTCAGTCTTT TTGTTTCCGCCGAAGCCCAAAGATACACTCATGATCTCAAGAACGCCCG AGGTAACATGC GTGGTGGTCGATGTAAGCCACGAGGATCCAGAAGTACAATTCAATTGGT ATGTAGACGGG GTCGAGGTCCATAACGCAAAGACGAAACCGAGGGAAGAGCAGTTCAAT TCGACTTTCCGG GTGGTGTCGGTGCTTACAGTCGTACATCAGGACTGGTTGAACGGGAAG GAGTACAAGTGT AAAGTATCGAATAAGGGCCTTCCAGCGCCGATTGAAAAGACCATCTCCA AGACCAAAGGA CAGCCACGAGAGCCGCAAGTCTATACGCTTCCTCCCAGCCGAGAAAAG ATGACTAAAAAC CAGGTATCGCTTACGTGTCTCGTCAAGGGTTTCTACCCTTCGGACATCG CGGTGGAATGG GAGAGCAATGGACAACCGGAAAACAACTACAAGACGACACCGCCTATG TTGAAAAGCGAT GGATCGTTTTTCCTCTATTCGAAACTCACGGTCGATAAGTCACGGTGGC AGCAGGGGAAT GTGTTCTCCTGTTCAGTGATGCACGAGGCGCTCCACAATCACTATACCC AGAAAAGCCTG TCACTTTCCCCGGGAAAATGA Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada de 219R45 (13A Versão 2) (SEQ ID NO:33) ATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTGCTCCTCGTGGCTGCTCCTCGGTGG GTCCTCTCCCAA GTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCTTC CGTCAAAGTCTCC TGTAAGGCTTCCGGATACACCTTTACCAACTATTGGATGCACTGGGTGC GGCAGGCTCCT GGACAAGGGCTGGAATGGATGGGAGACATCAATCCTTCCAATGGCAGA ACCTCCTACAAG GAAAAATTCAAACGGCGGGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCTAGCTCCA CAGCTTACATG GAACTCTCCTCCCTGCGGTCCGAAGACACAGCTGTCTACTTCTGCACCA TCCACTACGAC GACAAGTACTACCCTCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC ACCGTGTCCAGC GCTTCCACAAAAGGACCCTCCGTCTTTCCCCTCGCCCCCTGCTCCCGG TCCACATCCGAA TCAACAGCTGCCCTCGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCAGAGCCT GTCACAGTGTCC TGGAACTCCGGAGCTCTCACATCCGGAGTCCACACATTTCCTGCTGTGC TCCAATCCTCC GGACTGTATTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAATTTCG GGACACAGACC TATACATGCAACGTGGACCACAAACCCTCCAACACCAAAGTCGATAAGA CAGTGGAGCGC AAGTGCTGCGTGGAGTGTCCCCCTTGTCCTGCTCCCCCTGTGGCTGGA CCTTCCGTCTTT CTGTTTCCTCCTAAACCTAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCCG AGGTCACATGC GTGGTCGTCGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAAGTCCAATTTAATTGG TATGTGGACGGG GTGGAGGTCCATAACGCTAAGACCAAACCTAGGGAAGAGCAGTTCAATT CCACTTTCCGG GTGGTGTCCGTGCTGACCGTCGTTCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAA GAATACAAATGC AAAGTCTCTAATAAGGGCCTCCCTGCTCCTATTGAAAAAACAATTTCCAA AACAAAAGGA CAACCTCGGGAGCCTCAAGTCTACACACTGCCACCTTCCCGGGAAAAA ATGACAAAAAAT CAAGTCTCCCTCACATGTCTCGTCAAGGGATTCTACCCTTCCGACATTG CTGTGGAATGG GAATCCAATGGACAACCTGAAAACAACTACAAGACAACACCTCCTATGC TCAAAAGCGAT GGGTCCTTTTTCCTCTATTCCAAACTCACAGTCGATAAGTCTCGGTGGC AGCAGGGGAAT GTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAATCACTATACCC AGAAAAGCCTG TCCCTCTCCCCTGGAAAATGA Sequência de nucleotídeos de cadeia leve (SEQ ID NO:34) ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCC GGCGCCTACGGC GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGA GAGCGGGCCACC ATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCA TGAAGTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCAAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCC AACCAGGGATCT GGCGTGCCCGACCGGTTCTCTGGATCCGGCTCTGGCACCGACTTTACC CTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAA GAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGC TCCCTCCGTGTTC ATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGAACCGCCTCCGTC GTGTGCCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAAC GCCCTGCAGTCC GGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACC TACTCCCTGTCC TCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTAC GCCTGCGAAGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGC GAGTGTTAG Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21m18 (SEQ ID NO:35) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCTTACTACATCCACTGGG TCAAGCAGGCC CCTGGGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCTCCTACAACGGC GCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACC TCCACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCAC CGTGTCCTCT Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R79 (13B) (SEQ ID NO:36) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGG TGAAACAGGCA CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTATATCGCCAACTACAACCGG GCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACC TCCACAGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC AGTGTCCTCC Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R79 (13B Versão 2 ) (SEQ ID NO:37) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCAT CCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGG TTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTAATTATAATAGAG CTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCT CGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCG CTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACA GTGTCTTCT Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 219R45 (13A versão 1) (SEQ ID NO:38) CAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGC AAGCGTAAAAGTA TCGTGTAAGGCCTCGGGGTACACGTTTACAAACTACTGGATGCATTGGG TGCGGCAGGCT CCGGGACAGGGGTTGGAATGGATGGGTGACATTAACCCCTCAAATGGC AGAACATCATAT AAGGAAAAGTTCAAACGCCGCGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCAAGCT CGACTGCGTAC ATGGAACTTTCGTCGCTGAGGTCGGAGGACACGGCAGTGTACTTTTGC ACCATCCATTAT GATGACAAGTATTACCCTCTGATGGATTATTGGGGTCAGGGTACGTTGG TCACCGTCTCC AGC Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 219R45 (13A Versão 2) (SEQ ID NO:39) CAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGC TTCCGTCAAAGTC TCCTGTAAGGCTTCCGGATACACCTTTACCAACTATTGGATGCACTGGG TGCGGCAGGCT CCTGGACAAGGGCTGGAATGGATGGGAGACATCAATCCTTCCAATGGC AGAACCTCCTAC AAGGAAAAATTCAAACGGCGGGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCTAGCT CCACAGCTTAC ATGGAACTCTCCTCCCTGCGGTCCGAAGACACAGCTGTCTACTTCTGCA CCATCCACTAC GACGACAAGTACTACCCTCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTGTCC AGC Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (SEQ ID NO:40) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGA GAGCGGGCCACC ATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCA TGAAGTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCAAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCC AACCAGGGATCT GGCGTGCCCGACCGGTTCTCTGGATCCGGCTCTGGCACCGACTTTACC CTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAA GAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG Região constante de cadeia pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO:41) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Região constante de cadeia pesada de IgG2 humana (SEQ ID NO:42) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Região constante de cadeia pesada de IgG3 humana (SEQ ID NO:43) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTC PRCPEPKSC DTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NIFSCSVMHE ALHNRFTQKSLSLSPGK Região constante de cadeia pesada de IgG4 humana (SEQ ID NO:44) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPA PEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Peptídeo FLAG (SEQ ID NO:45) DYKDDDDK Cadeia pesada com cadeia não modificada sublinhada de sequência sinal de 21R79 parental (SEQ ID NO:46) MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVQ LVQ SGAEVKKPGASVKISC KAS GYS FTA YYIHWVKQAP GQGLEWIGYIANYNRATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK VDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada com sequência sinal sublinhada de 219R45 parental (SEQ ID NO:47) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQ LVQ SGAEVKKPGASVKVSC KAS GYTFTN YWMHWVRQAP GQGLEWMGDINPSNGRTSYKEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDT AVYFCTIHYD DKYYPLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada sem sequência sinal prevista de 21R79 parental (SEQ ID NO:48) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI ANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada sem sequência sinal de 219R45 parental (SEQ ID NO:49) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWM GDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYW GQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTL PPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R79 parental (SEQ ID NO:50) CAAGTGCAGCTCGTGCAGTCAGGGGCGGAGGTCAAGAAGCCGGGAGC ATCGGTCAAAATC TCGTGTAAGGCCTCGGGGTACTCCTTTACTGCGTATTACATCCATTGGG TAAAGCAGGCG CCAGGGCAGGGATTGGAGTGGATTGGGTATATCGCCAATTACAATCGC GCGACGAACTAT AACCAGAAATTCAAGGGAAGGGTGACCTTCACAACGGATACATCGACAT CGACGGCCTAC ATGGAACTTCGCAGCCTGCGATCAGATGACACGGCGGTATACTATTGC GCAAGAGATTAC GACTATGATGTGGGAATGGACTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACAG TCTCCTCC Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 219R45 parental (SEQ ID NO:51) CAGGTACAGCTCGTGCAATCGGGGGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGTGC GTCGGTAAAGGTC AGCTGCAAAGCGTCAGGTTATACATTCACGAATTACTGGATGCATTGGG TCAGACAGGCC CCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGAGATATCAATCCGTCGAACGGA CGGACTAGCTAT AAGGAGAAGTTTAAGAGGCGCGTAACACTGTCGGTGGACAAATCGTCC TCAACGGCCTAC ATGGAGTTGTCATCCCTGCGGTCGGAAGATACGGCGGTCTACTTCTGTA CTATCCACTAT GACGATAAGTACTACCCGCTTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACATTG GTAACCGTGAGC AGC Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal de 21R79 parental (SEQ ID NO:52) ATGAAACACTTGTGGTTTTTCCTCTTGCTCGTGGCAGCTCCTCGGTGGG TACTTTCACAA GTGCAGCTCGTGCAGTCAGGGGCGGAGGTCAAGAAGCCGGGAGCATC GGTCAAAATCTCG TGTAAGGCCTCGGGGTACTCCTTTACTGCGTATTACATCCATTGGGTAA AGCAGGCGCCA GGGCAGGGATTGGAGTGGATTGGGTATATCGCCAATTACAATCGCGCG ACGAACTATAAC CAGAAATTCAAGGGAAGGGTGACCTTCACAACGGATACATCGACATCGA CGGCCTACATG GAACTTCGCAGCCTGCGATCAGATGACACGGCGGTATACTATTGCGCA AGAGATTACGAC TATGATGTGGGAATGGACTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACAGTCT CCTCCGCCAGC ACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACC AGCGAGAGCACA GCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAAC TCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAG TCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACC CAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGT TGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCA GTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACGTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACG TTCCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCA AAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAA Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal de 219R45 parental (SEQ ID NO:53) ATGAAACACCTCTGGTTCTTTTTGCTCCTGGTGGCAGCTCCCCGATGGG TGCTTAGCCAG GTACAGCTCGTGCAATCGGGGGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGTGCGTC GGTAAAGGTCAGC TGCAAAGCGTCAGGTTATACATTCACGAATTACTGGATGCATTGGGTCA GACAGGCCCCT GGACAAGGGCTTGAATGGATGGGAGATATCAATCCGTCGAACGGACGG ACTAGCTATAAG GAGAAGTTTAAGAGGCGCGTAACACTGTCGGTGGACAAATCGTCCTCAA CGGCCTACATG GAGTTGTCATCCCTGCGGTCGGAAGATACGGCGGTCTACTTCTGTACTA TCCACTATGAC GATAAGTACTACCCGCTTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACATTGGTAA CCGTGAGCAGC GCGTCCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGG AGCACCAGCGAG AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTC CTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTC GGCACCCAGACC TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG ACAGTTGAGCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGG TACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTTCCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG GAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAACCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGA GATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATG CTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAA Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de 21R79 e 219R45 parentais (SEQ ID NO:54) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGC GAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTAT GAAGTGGTTC CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCA ACCAAGGGTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACT CTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAG GAGGTGCCTTGG ACATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA Sequência de nucleotídeos de cadeia leve de 21R79 e 219R45 parentais (SEQ ID NO:55) ATGGTGCTCCAGACCCAGGTCTTCATTTCCCTGCTGCTCTGGATCAGCG GAGCCTACGGG GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGC GAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTAT GAAGTGGTTC CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCA ACCAAGGGTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACT CTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAG GAGGTGCCTTGG ACATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCC CCCTCCGTCTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAAAGCGGCACTGCCAGCGTG GTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAAC GCCCTCCAAAGC GGCAACTCCCAGGAGAGCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAC CTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGC GAGTGTTGA Cadeia pesada sem sequência sinal prevista de 21R75 (SEQ ID NO:56) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI AGYKDATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVD KSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada com sequência sinal prevista de 21R75 (sublinhada) (SEQ ID NO:57) MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVQ LVQ SGAEVKKPGASVKISC KAS GYS FTA YYIHWVKQAP GQGLEWIGYIAGYKDATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK VDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Região variável de cadeia pesada de 21R75 (SEQ ID NO:58) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI AGYKDATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSS CDR2 de cadeia pesada de 21R75 (SEQ ID NO:59) YIAGYKDATNYNQKFKG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal de 21R75 (13B Versão 1) (SEQ ID NO:60) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCC GTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCA AGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCC ACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTA CCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCTCTGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCT CCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACA GTGTCTTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAG TCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCC AGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTG GAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGC GTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTG ACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTAC AAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCA AGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGAC TCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG TCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal de 21R75 (13B Versão 1T) (SEQ ID NO:77) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCTCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCC GTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCA AGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCC ACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTA CCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCTCTGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCT CCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACA GTGTCTTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAG TCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCC AGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTG GAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGC GTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTG ACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTAC AAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCA AGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGAC TCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG TCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal de 21R75 (13B Versão S1-2) (SEQ ID NO:61) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCCCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCC GTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTA AACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTA CAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGA CAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTA GAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTG TCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCT CTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAG TCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCA AACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTG AGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGA CTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACA AGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTT GAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGT CCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAG Cadeia pesada sem sequência sinal prevista de 21R83 (SEQ ID NO:62) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI SNYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVD KSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia pesada com sequência sinal prevista de 21R83 (sublinhada) (SEQ ID NO:63) MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVQ LVQ SGAEVKKPGASVKISC KAS GYS FTA YYIHWVKQAP GQGLEWIGYISNYNRATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK VDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Região variável de cadeia pesada de 21R83 (SEQ ID NO:64) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYI SNYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYW GQGTLVTVSS CDR2 de cadeia pesada de 21R83 (SEQ ID NO:65) YISNYNRATNYNQKFKG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal sublinha- da de 21R83 (13B Versão 1) (SEQ ID NO:66) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCC GTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCA AGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCC ACCAATTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTA CCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCTAGCGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCT CCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACA GTGTCCTGGAAC TCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAG TCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCC AGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTG GAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGC GTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTG ACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTAC AAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCA AGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGAC TCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG TCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal sublinhada de 21R83 (13B Versão 1T) (SEQ ID NO:78) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCTCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCC GTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCA AGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCC ACCAATTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTA CCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC CAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCTAGCGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCT CCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACA GTGTCCTGGAAC TCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAG TCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCC AGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTG GAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGC GTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTG ACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTAC AAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCA AGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGAC TCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG TCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal sublinhada de 21R75 (13B Versão S1-2) (SEQ ID NO:67) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGG GTGCTGTCCCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCC GTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTA AACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTA CAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGA CAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTA GAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTG TCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCT CTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAG TCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCA AACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTG AGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGA CTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACA AGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTT GAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGT CCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAG Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R75 (13B Versão 1) (SEQ ID NO:68) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGG TCAAGCAGGCC CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGAC GCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCT CTACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGAC CGTGTCCTCT Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R75 (13B Versão 2) (SEQ ID NO:69) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCAT CCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGG TTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATG CTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCT CGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCG CTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACA GTGTCTTCT Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R83 (13B Versão 1) (SEQ ID NO:70) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGC CTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGG TCAAGCAGGCC CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGG GCCACCAATTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCT CTACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGAC CGTGTCTAGC Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R75 (13B Versão 2) (SEQ ID NO:71) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCAT CCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGG TTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATG CTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCT CGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCG CTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACA GTGTCTTCT Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal sublinhada de 21R83 (13B Versão 2) (SEQ ID NO:72) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGG TGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCC GTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTA AACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCAATTATAATAGAGCTA CAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGA CAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTA GAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTG TCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCT CTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAG TCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCA AACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTG AGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGA CTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACA AGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTT GAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGT CCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 21R83 (13B Versão 2) (SEQ ID NO:73) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCAT CCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGG TTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCAATTATAATAGAG CTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCT CGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCG CTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACA GTGTCTTCT Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada com sequência sinal sublinhada de 21R75 (13B Versão 2) (SEQ ID NO:74) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGG TGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCC GTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTA AACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTA CAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGA CAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTA GAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTG TCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCT CTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAG TCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCA AACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTG AGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGA CTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACA AGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTT GAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGT CCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Sequência de nucleotídeos de cadeia pesada de 21m18 (versão 2) (SEQ ID NO:75) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGG TGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCC GTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTA AACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCTCTTATAATGGAGCTA CAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGA CAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTA GAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTG TCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCT CTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACC GTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAG TCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCA AACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTG AGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCT GTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGA CTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTG GACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACC TTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACA AGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACC AAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACC AAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTT GAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGAC TCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGT CCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Região variável de cadeia pesada de 21m18 (versão 2) (SEQ ID NO:76) CAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTG AAAATAAGTTGC AAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAAC AGGCACCAGGA CAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCTCTTATAATGGAGCTACAA ACTATAACCAA AAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAG CATACATGGAA TTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAG ATTATGATTAT GATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCT Sequência consenso da CDR2 de cadeia pesada de anti-DLL4 (SEQ ID NO:80): YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG, em que X1 é serina ou alanina, X2 é serina, as- paragina ou glicina, X3 é asparagina ou lisina e X4 é glicina, arginina ou ácido aspár- tico.

Claims

1. Anticorpo biespecífico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), e b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao ligante tipo delta 4 humano (DLL4), em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende NYWMH (SEQ ID NO: 17), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); em que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14) ou YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO:16); e em que tanto o primeiro quanto o segundo sítios de ligação ao antígeno compreendem uma CDR1 de cadeia leve que compreende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), uma CDR2 de cadeia leve que compreende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), e uma CDR3 de cadeia leve que compreende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22).

2. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16).

3. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), e uma CDR3 de cadeia pesada que compreende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16).

4. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) uma primeira região variável da cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 11; (b) uma segunda região variável da cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 58; e (c) uma primeira e uma segunda região variável da cadeia leve tendo a sequência da SEQ ID NO:12.

5. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um primeiro domínio CH3 e um segundo domínio CH3, cada um dos quais é modificado para promover a formação de heteromultímeros.

6. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e o segundo domínios CH3 são modificados com base nos efeitos eletrostáticos.

7. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo de IgG1 ou um anticorpo de IgG2.

8. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma primeira região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições que correspondem às posições 249 e 288 da SEQ ID NO: 42, em que os aminoácidos são substituídos por glutamato ou aspartato, e uma segunda região constante de IgG2 humana com substituições de aminoácidos nas posições que correspondem às posições 236 e 278 da SEQ ID NO: 42, em que os aminoácidos são substituídos por lisina.

9. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) inibe a ligação de VEGF a pelo menos um receptor de VEGF; (ii) inibe a ligação de DLL4 a pelo menos um receptor de Notch; (iii) inibe a sinalização de Notch; e/ou (iv) modula a angiogênese.

10. Anticorpo biespecífico que se liga especificamente ao VEGF humano e ao DLL4 humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 7; (b) uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 5 ou da SEQ ID NO: 6; e (c) duas cadeias leves da SEQ ID NO: 8.

11. Anticorpo biespecífico CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em 219R45-MB-21M18 e 219R45-MB-21R79.

12. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Célula procariótica, fúngica ou de levedura, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ou produz o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

14. Molécula de polinucleotídeo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 32 ou 33, (ii) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 30 ou 31, e (iii) duas sequências da cadeia leve da SEQ ID NO: 34, ligadas operacionalmente a uma sequência controle da expressão.

15. Molécula de polinucleotídeo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) uma sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 38 ou 39, (ii) uma sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 36 ou 37, e (iii) duas sequências da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 40, ligadas operacionalmente a uma sequência controle da expressão.

16. Molécula de polinucleotídeo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 32 ou 33, (ii) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 29 ou 75, e (iii) duas sequências da cadeia leve da SEQ ID NO: 34, ligadas operacionalmente a uma sequência controle da expressão.

17. Molécula de polinucleotídeo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) uma sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 38 ou 39, (ii) uma sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 35 ou 76, e (iii) duas sequências da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 40, ligadas operacionalmente a uma sequência controle da expressão.

18. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotí- deo, como definido em qualquer umas das reivindicações 14 a 17, ligado operacionalmente a um promotor heterólogo e sequências de terminação.

19. Célula procariótica, fúngica ou de levedura, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 18.

20. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

21. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pulmonar, câncer de fígado, câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, câncer gastrointestinal, melanoma, câncer cervical, câncer de bexiga, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, linfoma e leucemia.

22. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato do que é para a fabricação de um medicamento para a inibição do crescimento de um tumor.

23. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor é selecionado do grupo que consiste em tumor colorretal, tumor de cólon, tumor de ovário, tumor pancreático, tumor pulmonar, tumor de fígado, tumor de mama, tumor renal, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de bexiga, glioblastoma, e tumor de cabeça e pescoço.

24. Uso do anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso compreende o anticorpo e pelo menos um agente quimioterapêutico adicional.

25. Método para a produção de um anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende expressar pelo menos um polinucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em uma célula.