JP2002523018A - デルタ関連ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物膜表面結合リガンドのデルタファミリーのポリペプチドメンバーをコードする核酸配列を開示する。特に、染色体のマッピングおよび分析用にこのような配列を使用して対応するＤＮＡ分子の組換え発現によりポリペプチドを大量に産生させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、「デルタ」として公知の細胞発達周期タンパク質ファミリーの新規
の哺乳動物ポリペプチドメンバー、対応する核酸、ならびに核酸分子およびポリ
ペプチドの作製法および使用法に関する。

【０００２】 発明の背景 Ｎｏｔｃｈ遺伝子ファミリーは、細胞運命の決定を調節する膜貫通レセプター
をコードする（Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、７、４３７〜４４１、１９９７の総説を参照のこと）。現在
、ヒトにおけるこのファミリーには４つの公知のメンバー（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏ
ｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４）が存在する（参考として、Ｅｌ
ｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、６６、６４９〜６６１、１９９１；Ｋａ
ｔｓａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３５、１０１〜１０８、１９
９６、Ｊｏｕｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、３５０、１５１１
〜１５１５、１９９７、およびＵｙｔｔｅｎｄａｅｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２、２２５１〜２２５９、１９９６をそれぞれ参照のこ
と）。Ｎｏｔｃｈシグナリングの公知の作用の多くが下等生物（蠕虫およびハエ
）の分化において報告されてるが、現在、これらのレセプターが哺乳動物の胚形
成の間に果たされる役割について注目されている（Ｌｅｗｉｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６、３〜１０、１９９６
）。しかし、現在のところ、生体の哺乳動物の生物学におけるこれらのレセプタ
ーの機能については比較的知られていない。

【０００３】 Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化は、デルタおよびＪａｇｇｅｄ遺伝子ファミリ
ーに属するリガンドによって達成することができる。これらの遺伝子産物はまた
、膜貫通ドメインを含み、リガンドのレセプターとの相互作用は、おそらく、細
胞と細胞の接触を介して起こる。おそらく、最も十分に文献に記載されているデ
ルタ−Ｎｏｔｃｈシグナリングは、ショウジョウバエの神経前駆細胞の産生にお
いて起こっている。デルタ−Ｎｏｔｃｈシグナリングにより神経細胞が過剰に産
生されるので、このシグナリング経路は、側面特異化として公知のプロセスにお
ける前駆体の分化を阻害すると考えられる。Ｌｅｗｉｓ、上記を参照のこと。こ
のようなプロセスは、定められた細胞増殖をある特定の細胞運命に与える一方で
、近辺の細胞をその指令から回避させる。

【０００４】 マウスで２つのデルタリガンド（すなわち、デルタ様１（「Ｄ１１１」ともい
う）およびデルタ様３（「Ｄ１１３ともいう」））が報告されている。これらの
遺伝子は、神経外胚葉および前体節中胚葉で最初に発現し、神経系および筋骨格
系の形成で機能すると考えられる（Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２４、３０６５〜３０７６、１９９７を参照のこと）。

【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、リガンドのデルタファミリーのメンバーと考えることができるマウ
スおよびヒト由来のポリペプチドをコードする新規の核酸の発見および単離に基
づく。

【０００６】 以前に、脊椎動物Ｎｏｔｃｈリガンドが２つのクラス（デルタおよびＳｅｒｒ
ａｔｅ）に分類されている（Ｎｙｅ ａｎｄ Ｋｏｐａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、５（９）、９６６〜９６９、１９９５を参照のこと）。両ファミ
リーのポリペプチドメンバーは、シグナル配列、アミノ末端デルタ−Ｓｅｒｒａ
ｔｅ−Ｌａｇ（ＤＳＬ）ドメイン、一連のＥＧＦ様反復、およびシグナル膜貫通
（疎水性）ドメインを含む。Ｓｅｒｒａｔｅファミリーメンバーはまた、細胞外
部分中のシステインの豊富な領域およびＥＧＦ様反復のいくつかを中断するイン
サートを含む。デルタクラスに特徴的な本発明に関する全長ポリペプチドは、シ
グナル配列、ＤＳＬドメイン、ＦＧＦ様反復、および膜貫通ドメインを含むが、
いくつかのＥＧＦ様反復または細胞外のシステイン豊富な領域を中断するインサ
ートを含まない。さらに、本発明のマウスポリペプチドのアミノ酸配列は、マウ
スＤ１１１および類似のＤ１１１のアミノ酸配列に約５０％同一で、８つのＥＧ
Ｆ様反復を含む。従って、本発明のポリペプチドは、デルタファミリーのメンバ
ーであると考えることができる。

【０００７】 デルタファミリーの他のメンバーの公知の作用と合わせて、血管内皮内の新規
に発見されたマウス遺伝子の高度に特異的な発現パターンは、内皮細胞の生物学
の調節における本発明のポリペプチドの役割を示す。

【０００８】 非ヒト種におけるＮｏｔｃｈ−デルタシグナリングに関する研究により、この
ようなレセプター−リガンド相互作用が脊椎動物の神経発生の中心であり、網膜
および中枢神経系の前駆細胞の発達に影響を与えることが示されている（Ｎｙｅ
ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ＢｉｏｌｏｇｙおよびＬｅｗｉｓ、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、上記）。他の研究
では、Ｎｏｔｃｈシグナリングはまた線維芽細胞成長因子誘導性血管新生の調製
に関与することが示唆されている（Ｚｉｍｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１、５１、３２４
９９〜３２５０２、１９９６）。さらに、皮質下梗塞および白質脳症を有する大
脳常染色体優性動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）（成人の虚血性脳卒中を引き起こす常
染色体優性障害）は、Ｎｏｔｃｈ３遺伝子の変異欠損であることが究明されてい
る（Ｊｏｕｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ、上記）。

【０００９】 このような情報に基づいて、Ｎｏｔｃｈの挙動に関する現在の理解では、Ｎｏ
ｔｃｈはおそらくデルタなどのリガンドとの相互作用によって次の分化状態に細
胞を進行させる能力を調節していると考えられている。従って、デルタポリペプ
チドは、細胞発達の重要な役割を果たしていると考えられる。さらに、Ｎｏｔｃ
ｈ−デルタシグナリングおよびデルタ遺伝子における異常により１つまたは複数
の疾患または障害を起こし得る可能性について、更なる調査および研究により多
くの根拠が示唆されている。

【００１０】 上記を考慮して、本明細書中に記載の全長ＤＮＡ配列またはその部分配列を、
染色体同定および遺伝子マッピング（おそらく、ＥＳＴ）に使用することができ
、これは、本発明の有用性である。このような適用では、遺伝子が遺伝病または
遺伝障害に関連する染色体の公知の領域内にあるかどうか、および遺伝子自体が
異常であるかどうかを決定することが重要な目的であろう。このような研究を、
マウスおよびヒトの配列を用いて行うことができる。例えば、マウス遺伝子およ
びその生物学に関する情報は、マウスの遺伝子に関連する異常がヒトにも当ては
まる場合、ヒト遺伝子の理解に有用であり得る。

【００１１】 本発明の分子用の他の潜在的な使用を以下にさらに記載するが、これには、対
応する（おそらく、Ｎｏｔｃｈファミリーの）レセプターを同定するためのポリ
ペプチドの使用が含まれる。特に、本発明に照らして、本発明のポリペプチドの
生物活性の更なる解明に基づけば、本発明の核酸およびポリペプチド分子のさら
に他の使用は、時がたてば明白になるであろう。

【００１２】 本発明はまた、以下にさらに記載の上記のポリペプチドの生物活性フラグメン
トおよびアナログ、このようなフラグメントおよびアナログをコードするＤＮＡ
分子、ならびにこのようなポリペプチドの誘導体を含む。

【００１３】 さらに、本発明は、異種宿主細胞における上記の核酸分子の組換え発現用のベ
クターならびにこのような発現ベクターを（例えば、トランスフェクションまた
は形質転換によって）含むように改変された宿主細胞を含む。

【００１４】 さらに、本発明は、宿主細胞中のＤＮＡ分子によってコードされる上記のポリ
ペプチド、フラグメント、またはアナログを発現する工程および得られた発現産
物を回収する工程を含む、上記のポリペプチド、フラグメント、およびアナログ
の組換え作製法を含む。

【００１５】 本発明のさらなる態様として、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに結合
および／またはポリペプチドで活性化されるレセプターの同定用の方法および系
に使用することができる。このようなレセプターは、例えば、自然に起こる状態
で結合した膜である本発明のポリペプチドと接触するか近位になる隣接細胞の表
面上に見出すことができる。

【００１６】 図面の簡単な説明 図１（Ａ−Ｂ）は、本発明のマウスポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示
す図である。マウスポリペプチドの膜貫通領域をコードする部分に下線を引いて
いる。

【００１７】 図２は、推定シグナルペプチド領域（アミノ酸１〜２２、１〜２３、１〜２４
、１〜２５、１〜２６、または１〜２７）、推定細胞外ドメイン（アミノ酸２３
〜５３２、２４〜５３２、２５〜５３２、２６〜５３２、２７〜５３２、または
２８〜５３２）、膜貫通領域（アミノ酸５３３〜５５３）、および細胞内／細胞
質部分（アミノ酸配列５５４〜６８６）を含む、図１Ａ〜図１ＢのＤＮＡ分子に
よってコードされるマウスポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。膜貫通
領域に下線を引いている。

【００１８】 図３（Ａ−Ｂ）は、本発明のヒトポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す
図である。ポリペプチドの膜貫通領域をコードする部分に下線を引いている。

【００１９】 図４は、推定シグナルペプチド領域（アミノ酸１〜２３、１〜２４、１〜２５
、１〜２６、１〜２７、または１〜２８）、推定細胞外ドメイン（アミノ酸２４
〜５３１、２５〜５３１、２６〜５３１、２７〜５３１、２８〜５３１、または
２９〜５３１）、膜貫通領域（アミノ酸５３２〜５５２）、および細胞内／細胞
質部分（アミノ酸配列５５３〜６８５）を含む、図３Ａ〜図３ＢのＤＮＡ分子に
よってコードされるヒトポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。膜貫通領
域に下線を引いている。

【００２０】 図５（Ａ−Ｐ）は、「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーションによって分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチ
ドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図である。

【００２１】 図６（Ａ−Ｐ）は、「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーションによって分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチ
ドのｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。

【００２２】 図７（Ａ−Ｄ）は、「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーションによって分析した、受精後１０日と半日目（図Ａおよび図Ｂ）お
よび１１日と半日目（図Ｃおよび図Ｄ）のマウス胚におけるマウスポリペプチド
のｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。

【００２３】 発明の詳細な説明 示したように、本発明によってヒトデルタファミリーの新規のメンバーおよび
そのマウス対応物が得られる。この発見は、マウス白色脂肪組織から単離したポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フラグメントの同定に起因する。以下の実施例で
さらに例示するように、ＰＣＲフラグメントは、本発明のマウスポリペプチドを
コードする全長核酸配列（配列番号１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号
２）の同定が可能であった。次いで、マウス配列から調製したプローブを使用し
て、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして対応ヒトポリペプチド（
配列番号４）をコードする全長核酸配列（配列番号３）を単離および同定した。

【００２４】 疎水性分析を用いると、マウスポリペプチドのリーダー（「シグナル」）配列
は、アミノ酸１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、
または１〜２８を含むようである。「成熟」ポリペプチドの第１のアミノ酸は、
２３（Ｑ）、２４（Ｒ）、２５（Ａ）、２６（Ａ）、２７（Ｇ）、または２８（
Ｓ）のようである。膜貫通ドメインの最初は、５３３位（Ｖ）に位置するようで
ある。膜貫通ドメインの最後は、５５３位（Ｖ）に位置するようである。生物活
性に必要とされる最小単位は、成熟ポリペプチドの細胞外ドメインであり、特に
、２３（Ｑ）、２４（Ｒ）、２５（Ａ）、２６（Ａ）、２７（Ｇ）、または２８
（Ｓ）〜アミノ酸５３２（Ａ）である。従って、本発明によるマウスポリペプチ
ドは、アミノ（Ｎ）末端メチオニン残基を含むか含まない（−１）、以下のアミ
ノ酸配列を有する任意のポリペプチドを含む。

【００２５】 （ａ）１〜６８６（配列番号２）、 （ｂ）２３〜５３２（配列番号５）、 （ｃ）２４〜５３２（配列番号６）、 （ｄ）２５〜５３２（配列番号７）、 （ｅ）２６〜５３２（配列番号８）、 （ｆ）２７〜５３２（配列番号９）、 （ｇ）２８〜５３２（配列番号１０）、 （ｈ）２３〜５５３（配列番号１１）、 （ｉ）２４〜５５３（配列番号１２）、 （ｊ）２５〜５５３（配列番号１３）、 （ｋ）２６〜５５３（配列番号１４）、 （ｌ）２７〜５５３（配列番号１５）、 （ｍ）２８〜５５３（配列番号１６）、 （ｎ）２３〜６８６（配列番号１７）、 （ｏ）２４〜６８６（配列番号１８）、 （ｐ）２５〜６８６（配列番号１９）、 （ｑ）２６〜６８６（配列番号２０）、 （ｒ）２７〜６８６（配列番号２１）および、 （ｓ）２８〜６８６（配列番号２２）。

【００２６】 ヒトポリペプチドのリーダー（「シグナル」）配列は、アミノ酸１〜２３、１
〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、または１〜２８を含むようである。「
成熟」ポリペプチドの第１のアミノ酸は、２４（Ａ）、２５（Ａ）、２６（Ｇ）
、２７（Ｓ）、または２８（Ｇ）、または２９（Ｖ）のようである。膜貫通ドメ
インの最初は、５３２位（Ｖ）に位置するようである。膜貫通ドメインの最後は
、５５２位（Ｖ）に位置するようである。必要とされる最小単位は、「成熟」ポ
リペプチドの細胞外ドメインであり、特に、２４（Ａ）、２５（Ａ）、２６（Ｇ
）、２７（Ｓ）、または２８（Ｇ）、または２９（Ｖ）〜アミノ酸５３１（Ａ）
である。従って、本発明によるヒトポリペプチドは、アミノ（Ｎ）末端メチオニ
ン残基を含むか含まない（−１）、以下のアミノ酸配列を有する任意のポリペプ
チドを含む。

【００２７】 （ａ）１〜６８５（配列番号４）、 （ｂ）２４〜５３１（配列番号２３）、 （ｃ）２５〜５３１（配列番号２４）、 （ｄ）２６〜５３１（配列番号２５）、 （ｅ）２７〜５３１（配列番号２６）、 （ｆ）２８〜５３１（配列番号２７）、 （ｇ）２９〜５３１（配列番号２８）、 （ｈ）２４〜５５２（配列番号２９）、 （ｉ）２５〜５５２（配列番号３０）、 （ｊ）２６〜５５２（配列番号３１）、 （ｋ）２７〜５５２（配列番号３２）、 （ｌ）２８〜５５２（配列番号３３）、 （ｍ）２９〜５５２（配列番号３４）、 （ｎ）２４〜６８５（配列番号３５）、 （ｏ）２５〜６８５（配列番号３６）、 （ｐ）２６〜６８５（配列番号３７）、 （ｑ）２７〜６８５（配列番号３８）、 （ｒ）２８〜６８５（配列番号３９）および、 （ｓ）２９〜６８５（配列番号４０）。

【００２８】 マウスにおける組織分布分析（以下の実施例５）は、ポリペプチドをコードす
る核酸の存在は完全に遍在し、遺伝子発現は肺で最も高く、次いで、心臓、腎臓
、骨格筋、および脳であり、脾臓および精巣ではより少ないことを示す。

【００２９】 本発明によれば、本発明の天然の（ヒトおよびマウス）ポリペプチド（その対
立遺伝子変異形を含む）の一次構造コンホメーション（すなわち、アミノ酸残基
の連続配列）の一部または全ておよび１つまたは複数の生物学的性質（例えば、
免疫学的性質および生物活性）および物理学的性質（例えば、分子量）を有する
精製および単離産物が得られる。本明細書中で使用される用語「精製された」お
よび「単離された」は、本発明のポリペプチドが意図する目的に有用であるよう
に所望しない物質を実質的に含まないことを意味する。例えば、ポリペプチドは
、他のヒト（またはマウス）タンパク質または病原因子を実質的に含まない組換
えポリペプチドを有することができる。これらのポリペプチドはまた、哺乳動物
細胞の産物または化学合成法の産物の存在もしくはゲノムもしくはｃＤＮＡクロ
ーニングまたは遺伝子合成によって得られた外因性ＤＮＡ配列の原核生物もしく
は真核生物宿主発現（例えば、培養における細菌、酵母、高等植物、昆虫、およ
び哺乳動物細胞による）の産物の存在によって特徴づけられる。典型的な酵母（
例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫、または
原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞における発現産物は、いかなる哺乳
動物タンパク質との関連も無い。脊椎動物（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯおよび
鳥類などの非ヒト哺乳動物）細胞における発現産物は、いかなるヒト（または）
マウスタンパク質とも関係が無い。使用した宿主および他の因子に依存して、本
発明のポリペプチドを、哺乳動物または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化
するか非グリコシル化することができる。グリコシル化部位を得られたポリペプ
チドに含有するように核酸を改変することができる。グリコシル化ポリペプチド
を部分的または完全に脱グリコシル化するように選択することができる。ポリペ
プチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基（成熟ポリペプチドの最初のアミ
ノ酸残基に関する−１位）を含んでも良い。

【００３０】 ポリペプチドの天然の対立遺伝子形態に加えて、本発明はまた、ポリペプチド
アナログなどの他の産物を含む。例えば、ｃＤＮＡおよびゲノム遺伝子の改変を
、周知の部位特異的変異誘発技術によって容易に行うことができ、それを使用し
て１つまたは複数の残基（例えば、置換、末端および中間への付加、および欠失
）の同定または位置付けに関して特定された本明細書中の一次コンホメーション
と異なるアナログを作製することができる。このような産物は、少なくとも１つ
の天然のポリペプチドの生物学的性質を共有するが、他とは異なり得る。例とし
て、本発明で考案された産物には、例えば欠失（すなわち、フラグメントまたは
部分配列）によって短縮された産物、加水分解に対してより安定な（従って、天
然の産物より明確でより長い持続効果を有しうる）産物、１つまたは複数の潜在
的なグリコシル化部位を欠くように改変されている（それにより、酵母産生産物
の活性がより高くなり得る）産物、例えばアラニン残基またはセリン残基によっ
て欠失または置換された１つまたは複数のシステイン残基を有し、微生物系由来
の活性形態において潜在的により容易に単離される産物、またはフェニルアラニ
ンによって置換された１つまたは複数のチロシン残基を有する産物、または改変
したリジン組成物を有する産物（誘導体化の目的で調製された産物など）が含ま
れる。酸性度、電荷、疎水性、極性、サイズ、または当業者に公知の任意の他の
特徴に関して保存的にアミノ酸置換したポリペプチドが含まれる。以下により詳
細に示すように、このような変更がタンパク質の全体的な折りたたみまたは活性
を保存する限り、選択したアミノ酸において変更することができる。アミノ末端
メチオニン残基などの小さなアミノ末端の延長、約２０〜２５残基までの小さな
リンカーペプチド、またはポリヒスチジン領域などの精製を促進する小さな範囲
、抗原エピトープもしくは結合ドメインもまた、存在し得る。一般的に、Ｆｏｒ
ｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ、２、９５〜１０７、１９９１を参照のこと。

【００３１】 ヒトまたはマウスの上記（ａ）のポリペプチドの水溶性形態を、膜貫通領域お
よび細胞内領域（これに関しては、上記（ｂ）を参照のこと）の除去によって調
製することもできる。

【００３２】 本明細書中で特に目的とされるのは、ヒトポリペプチド（配列番号４）ならび
にそのフラグメント、アナログ、および誘導体、ならびにこのようなポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ分子である。しかし、認められるように、マウス対応物（
配列番号２）もまた同一または類似の目的で有用であり得る。

【００３３】 ポリペプチドアナログ 上記の特定の配列のポリペプチドおよびそのフラグメントに加えて、生物学的
に等価であるかまたは１つまたは複数の生物学的性質を共有するこのようなポリ
ペプチドのアナログもまた本発明の一部として意図される。「生物学的に等価な
」とは、本明細書中に記載のポリペプチドと同一の性質を有することを意味する
。好ましくは、このようなアナログは、配列番号４（または配列番号２）のポリ
ペプチドに対して惹起する抗体と交叉反応する。

【００３４】 本発明のポリペプチドに適用される、用語「アナログ」は、全長ポリペプチド
配列番号４（配列番号２）のアミノ酸の直鎖由来の１つまたは複数のアミノ酸置
換、欠失、および／または添加を示し、かつ実質的に生物学的に等価でもあるか
または１つまたは複数の生物学的性質も共有する分子を意味することが特に意図
される。

【００３５】 本発明による特に好ましいポリペプチドアナログは、配列番号４（または配列
番号２）のポリペプチドまたはその８０％以上および最も好ましくは９０％以上
または９５％以上の相同性（すなわち、アミノ酸残基の同一性）を有するもので
ある。

【００３６】 ２つのそれぞれの配列の至適なアラインメントを作製するために、２つのポリ
ペプチドのアミノ酸の類似性を比較するために一般的に使用されている標準的な
方法によって配列同一性％を決定することができる。例示のために、ＢＬＡＳＴ
、ＢＬＡＳＴ２、またはＦＡＳＴＡなどのコンピュータアルゴリズムを使用して
、同一性％を決定すべき２つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の至適な適
合によって整列させる（「適合範囲」には、一方もしくは両方の配列の全長また
は一方または両方の配列の決定前部分を含み得る）。各コンピュータアルゴリズ
ムにより、「デフォルト」オープニングペナルティーおよび「デフォルト」ギャ
ップペナルティーならびにＰＡＭ２５０（ＦＡＳＴＡ）またはＢＬＳＵＭ６２（
ＢＬＡＳＴＡアルゴリズム）などのスコア行列が得られる。本発明の目的のため
に好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ２である。

【００３７】 コンピュータアルゴリズムと共に標準的なスコア行列を使用することができる
（Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５、増補第３版、１９７８を参照の
こと）。次いで、同一性％を、以下のように、ＦＡＳＴＡに含まれるアルゴリズ
ムを使用して同定することができる。

【００３８】 同一な適合の総数×１００／［適合範囲内でより長い長さ］＋［２つの配列を
配列させるためにより長い配列に組込まれたギャップの数］ 図４（または図２）の「野生型」配列に少なくとも８０％同一である本発明に
よるアナログポリペプチドは、典型的には、野生型と比較して１つまたは複数の
アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有する。通常、置換されても、ポリ
ペプチドの正味の電荷、極性、または疎水性の全体にほとんど影響を与えないか
全く影響を与えないように保存される。保存的置換の例を、以下に示す。

【００３９】 表１保存的アミノ酸置換 塩基性 アルギニン リジン ヒスチジン 酸性 グルタミン酸 アスパラギン酸 極性 グルタミン アスパラギン 疎水性 ロイシン イソロイシン バリン 芳香族 フェニルアラニン トリプトファン チロシン 小さなもの グリシン アラニン セリン トレオニン メチオニン。

【００４０】 野生型の天然の（すなわち「ネイティブ」）アミノ酸配列内の特定のアミノ酸
残基の置換（または除去）を行う場合、任意の実質的程度に所望の生物学的性質
に悪影響を与えないような比較的保存的な置換が好ましい。従って、例えば、レ
セプター特異性またはヘパリン結合に関与することが公知であるかそのように考
えられる残基または領域は、これらの部位の変更がこれらの性質を減少させる場
合、一般的に避けるべきである。

【００４１】 一般に、本発明のポリペプチドフラグメントおよびアナログは、配列番号４（
または配列番号２）のペプチドが有用である同一の目的で有用である。

【００４２】 核酸 本発明の別の態様により、ポリペプチドをコードする本明細書中に記載のＤＮ
Ａ配列は、原核生物および真核生物の宿主細胞（培養によって増殖させた細菌細
胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）を形質転換およびトラン
スフェクトした新規で有用なＤＮＡベクターの作製およびポリペプチドおよび関
連する産物の発現が可能なこのような宿主細胞の増殖培養法に有用である。

【００４３】 （ａ）図１Ａ〜図１Ｂ（配列番号１）および図３Ａ〜図３Ｂ（配列番号３）の
ＤＮＡ配列に加えて、（ｂ）同一のポリペプチドをコードする天然のその対立遺
伝子変異形、（ｃ）任意のこのようなＤＮＡ配列に選択的にハイブリッド形成す
るＤＮＡ分子、および（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ、（ａ）、（ｂ）、また
は（ｃ）のＤＮＡ分子とハイブリッド形成するＤＮＡ分子も本発明の一部として
意図される。

【００４４】 上記のＤＮＡ分子の相補配列またはその部分配列を使用して、組換え発現（ま
たは下記の改変）での使用のための配列番号１および配列番号３の核酸分子およ
び天然のその対立遺伝子変異形を単離するためにｃＤＮＡまたはゲノムライブラ
リーをスクリーニングすることができる。あるいは、同一のポリペプチドをコー
ドする核酸分子を、当業者に周知の方法（Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｇ
ｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．編、２８、７１６〜７３４、１９８９に記載の方法
など）を用いた化学合成によって調製することができる。このような方法には、
特に、核酸合成用のリン酸トリエステル法、亜リン酸アミダイド法、およびＨ−
リン酸法が含まれる。好ましい方法には、標準的な亜リン酸アミダイド化学を用
いたポリマー支持合成が含まれる。通常、本発明のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ分子は、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸分
子を、これらの方法によるいくつかのフラグメントとして合成することができ、
このフラグメントを互いにライゲート（連結）して全ポリペプチドをコードする
全長分子を形成することができる。

【００４５】 任意に、ポリペプチドのアミノ（Ｎ）末端をコードするＤＮＡの一部は、メチ
オニン残基をコードする「ＡＴＧ」コドンを含む。

【００４６】 天然の核酸と異なり、本発明によってポリペプチドアナログをコードする配列
を有する変異形核酸分子を、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または当業者に
公知の他の適切な方法を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、１９８９を参照のこと）。このような変異形には、発現用に使用された宿
主細胞のコドン選択の原因となるヌクレオチド置換を含む変異も含まれる。

【００４７】 本発明はまた、「天然」のプレ／プロ領域と代替可能な別のプレ／プロ領域（
すなわち、細胞膜を介したポリペプチドの分泌を担う配列）をコードする配列な
どの「成熟」ポリペプチド（すなわち、宿主から回収したプロセシングされた発
現産物）をコードする領域の５’または３’部分に隣接する更なるアミノ酸残基
をコードし得る核酸分子を含む。更なる配列はまた、宿主細胞に依存して転写ま
たは翻訳プロモーターなどの両節配列を含む非コード配列を構成することができ
る。核酸分子は、遺伝子内に生じることが公知の種々の内部非コード配列（イン
トロン）も含むことができる。

【００４８】 本発明の核酸分子（遺伝子またはｃＤＮＡのいずれか）を、標準的なライゲー
ション技術を用いて適切な発現ベクターまたは増幅ベクターに挿入することがで
きる。使用した特定の宿主中で機能的なベクターを選択する（すなわち、ベクタ
ーは、宿主細胞の機構に適合するので、ポリペプチドをコードする核酸の増幅お
よび／または発現が起こり得る）。ポリペプチド、フラグメント、またはアナロ
グを、宿主として原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／もしく
は真核生物宿主細胞またはトランスジェニック非ヒト動物種において発現させる
ことができる。宿主細胞の選択は、ポリペプチド発現産物がグリコシル化され、
そして／またはリン酸化するかどうかに少なくとも一部は依存する。グリコシル
化および／またはリン酸化が望ましい場合、酵母細胞はポリペプチドをグリコシ
ル化し、昆虫細胞または哺乳動物細胞は、「天然の」グリコシル化および／また
はリン酸化に類似の様式でポリペプチドをグリコシル化および／またはリン酸化
することができるという点で、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞の使用が望
ましい。

【００４９】 以下にさらに詳述するように、ポリペプチドを発現させるための任意の宿主細
胞で使用されるベクターはまた、５’フランキング配列（「プロモーター」とも
いう）および、発現すべき核酸分子（ＤＮＡ）に作動可能に連結した他の発現調
節エレメント、ならびにエンハンサー、複製起点エレメント、転写終結エレメン
ト、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を含む完全なイントロン配列
、シグナルペプチド配列、リボゾーム結合部位エレメント、発現すべきポリペプ
チドをコードする核酸挿入用のポリリンカー領域、および選択マーカーエレメン
トを含むことができる。

【００５０】 ５’フランキング配列 ５’フランキング配列は、天然の５’フランキング配列であり、同属由来（す
なわち、宿主と同一の種および／または株由来）、異種由来（すなわち、宿主細
胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、１つ以上の起源由来の
５’フランキング配列の組み合わせ）、または合成であり得る。５’フランキン
グ配列が宿主細胞機能において機能的で、かつそれによって活性化することがで
きる場合、５’フランキング配列の供給源は、任意の単細胞の原核生物または真
核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、または任意の植物であり得る。

【００５１】 本発明のベクターに有用な５’フランキング配列を、当該分野で周知のいくつ
かの任意の方法によって得ることができる。典型的には、フランキング配列以外
で本明細書中で有用な５’フランキング配列は、マッピングおよび／または制限
エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されているので、適切な制限エンド
ヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。いくつか
の場合、５’フランキング配列の全ヌクレオチド配列が公知であり得る。このよ
うな場合、５’フランキング配列を、上記の方法を用いて合成することができる
。

【００５２】 ５’フランキング配列の全部または一部のみが公知である場合、５’フランキ
ング配列をＰＣＲおよび／または同一または別の種由来の適切なオリゴヌクレオ
チドおよび／または５’フランキング配列フラグメントを用いたゲノムライブラ
リーのスクリーニングによって得ることができる。５’フランキング配列が公知
でない場合、５’フランキング配列を有するＤＮＡのフラグメントを、例えば、
コード配列またはさらに別の遺伝子を含み得るＤＮＡの大きな断片から単離する
ことができる。適切なＤＮＡフラグメントを単離するために１つまたは複数の慎
重に選択した酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離を行うこと
ができる。消化後、所望のフラグメントを、アガロースゲル精製または当業者に
公知の他の方法によって単離することができる。この目的を達成するための適切
な酵素の選択は、当業者に自明である。

【００５３】 複製起点エレメント 複製起点エレメントは、典型的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であ
り、宿主細胞におけるベクターの複製を援助する。いくつかの場合、ベクターの
一定のコピー数の複製は、ポリペプチドの至適な発現に重要であり得る。選択さ
れるベクターに複製起点部位が含まれていない場合、その部位を公知の配列に基
づいて化学合成し、ベクターにライゲートすることができる。

【００５４】 転写終結エレメント 転写終結エレメントは、典型的には、ペプチドコード配列の３’末端に位置し
、ポリペプチドの転写を終結するように作用する。通常、原核生物細胞における
転写終結エレメントは、後ろにポリＴ配列を有するＧ−Ｃリッチなフラグメント
である。エレメントがライブラリーから容易にクローン化されるか、ベクターの
一部として購入した場合、上記に記載のように核酸合成法を用いて容易に合成す
ることもできる。

【００５５】 選択マーカーエレメント 選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地での宿主細胞の生存および増
殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）真
核生物宿主細胞用の抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサ
イクリン、またはカナマイシン）耐性を付与するか、（ｂ）細胞の栄養要求欠乏
を補足するか、または（ｃ）天然培地から利用できない重要な栄養素を供給する
タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、
アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。

【００５６】 リボゾーム結合エレメント 一般にシャイン−ダルガルノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物
）と呼ばれるリボゾーム結合エレメントは、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。
このエレメントは、典型的には、合成されるポリペプチドのプロモーターの３’
側およびコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガルノ配列は変化する
が、典型的にはポリプリン（すなわち、高Ａ−Ｇ含有）である。多くのシャイン
−ダルガルノ配列が同定されており、それぞれ、上記の方法を用いて容易に合成
され、原核生物ベクターにおいて使用することができる。

【００５７】 シグナルペプチド配列 宿主細胞から分泌されるポリペプチドが望ましい場合、シグナル配列を使用し
て宿主細胞からポリペプチドを導くことができ、膜固着を防ぐためにポリペプチ
ドのカルボキシ（Ｃ）末端の一部を欠失させることができる。典型的には、シグ
ナル配列を、核酸配列のコード領域に位置付けるか、コード領域の５’末端に直
接位置付ける。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞中で
機能的なものはいずれも使用することができる。

【００５８】 転写プロモーター 遺伝子の転写を、ベクター中の１つまたは複数のイントロンの存在によって促
進することができる。ポリペプチドが真核生物の宿主細胞（特に、哺乳動物宿主
細胞）において産生された場合、特にあてはまる。使用したイントロンは、特に
、使用した遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、遺伝子
内に天然に存在し得る。（ほとんどのｃＤＮＡの場合のように）イントロンが遺
伝子内で天然に存在しない場合、イントロンを別の供給源から得ることができる
。イントロンは有効に転写されなければならないので、５’フランキング配列お
よびコード核酸配列に関するイントロンの位置は、一般的に重要である。そうい
うものとして、核酸がｃＤＮＡ分子である場合、イントロンの好ましい位置は、
転写開始部位の３’およびポリＡ転写終結配列の５’である。好ましくは、イン
トロンは、このコード配列を妨害しないようにｃＤＮＡの一方または他方（すな
わち、５’または３’）に位置付ける。イントロンが挿入される宿主細胞に適合
する場合、任意のウイルス、原核生物、および真核生物（植物または動物）を含
む任意の供給源由来の任意のイントロンを使用することができる。

【００５９】 上記の１つまたは複数のエレメントが未だ使用されるベクター中に存在しない
場合、エレメントを個別に得てベクターにライゲートすることができる。それぞ
れのエレメントを得るために使用した方法は、当業者に周知であり、上記の方法
（すなわち、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニングなど）に適合可能であ
る。

【００６０】 ベクターおよび宿主細胞 本発明の実施に好ましいベクターは、細菌、昆虫、および哺乳動物宿主細胞に
適合するベクターである。例として、このようなベクターには、ｐＣＲＩＩ、ｐ
ＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ｐＥＴ１５ｂ（
Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）
、およびｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ、Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）が含まれる。

【００６１】 ベクターを構築して、全長もしくは短縮ポリペプチドまたはそのアナログをベ
クターの適切な部位挿入した後、完成したベクターを、増幅またはポリペプチド
発現用の適切な宿主細胞に挿入することができる。

【００６２】 宿主細胞は、原核生物宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）または真核生物宿主細胞
（酵母、昆虫、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な栄養条件
で培養された場合、ポリペプチドを合成し、これをその後培養培地から単離して
回収するか（宿主細胞が培地にポリペプチドを分泌した場合）、宿主細胞から直
接回収する（分泌しない場合）ことができる。宿主細胞の細胞質および／または
核に存在するポリペプチドのために、典型的には、宿主細胞を最初に機械的に破
壊するか界面活性剤で破壊して細胞内成分を緩衝化溶液に放出させる。次いで、
ポリペプチドを、この溶液から回収することができる。回収後、ポリペプチドを
分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法
を用いて精製することができる。

【００６３】 ポリペプチド産生用の宿主細胞の選択は、ポリペプチドがグリコシル化される
かリン酸化されるかのいずれか（真核生物宿主細胞が好ましい場合）および宿主
細胞がその天然の３次元構造（例えば、ジスルフィド結合の適切な配向など）に
タンパク質を「折りたたむ」ことができる様式に一部依存し、その結果、生物学
的に活性なタンパク質が細胞によって調製される。宿主細胞が適切なコンホメー
ションでポリペプチドを合成しない場合でさえ、ポリペプチドを、以下に記載の
条件などの適切な科学的条件を用いた合成後に「折りたたむ」ことができる。

【００６４】 適切な細胞または細胞株は、哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞
（ＣＨＯ）または３Ｔ３細胞）であり得る。転写、培養、増幅、スクリーニング
および産物産生ならびに精製のための適切な哺乳動物宿主細胞の選択は、当該分
野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−
７細胞株ならびにＣＶ−１細胞株である。更なる例として、哺乳動物宿主細胞に
は、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が含まれる。
正常な二倍体細胞、一次組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、ならびに一
次移植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型が不完全
であり、優先的に活性な選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株には
、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓ
ｓ由来の３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハム
スター細胞株が含まれるが、これらに限定されない。

【００６５】 宿主細胞として同様に有用なものは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
の種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）
は、バイオテクノロジーの分野での宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の株もまた本方法で使用するこ
とができる。

【００６６】 当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた、本発明で使用される宿主細胞とし
て利用可能である。

【００６７】 選択された宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」または「トランスフェ
クション」ともいう）を、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、リポフェクション、またはＤＥＡＥ−デキストラン法などの
公知の物質または方法を用いて行うことができる。

【００６８】 宿主細胞培養 ベクターを含む宿主細胞を、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養するこ
とができる。通常、培地は、形質転換細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養
素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に適切な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏ
ｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真
核細胞培養に適切な培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、こ
れらの全ては、特定の細胞株の培養に必要とされる血清および／または成長因子
を補充することができる。昆虫細胞培養に適切な培地は、必要に応じて酵母エキ
ス、ラクトアルブミン加水分解物、および／またはウシ胎児血清を添加したＧｒ
ａｃｅ培地である。

【００６９】 典型的には、形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を
、添加物として増殖培地に添加する。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換
またはトランスフェクトされているプラスミドに存在する選択マーカーエレメン
トによって指向される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性の
場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンである。

【００７０】 宿主細胞において産生されるポリペプチド量を、当該分野で公知の標準的な方
法を用いて評価することができる。このような方法には、ウェスタンブロット分
析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ
分離、免疫沈澱、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイなどの活性アッ
セイが含まれるが、これらに限定されない。

【００７１】 発現産物の回収 溶液からの本発明のポリペプチドの精製を、種々の技術で行うことができる。
ポリペプチドをタグを含むように合成した場合、カラム基質がタグまたはポリペ
プチド（すなわち、ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体）に直
接的に高親和性を有する場合、アフィニティーカラムに溶液を通過させる１工程
で本質的に精製することができる。例えば、ニッケルに対して高い親和性および
特異性を有するポリヒスチジン結合、すなわち、ニッケルのアフィニティーカラ
ム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムなど）を精製に使用することがで
きる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５を参照のこと。

【００７２】 タグを付着させずリペプチドを調製し、かつ抗体が利用可能ではない場合、他
の周知の精製法を使用することができる。このような方法には、イオン交換クロ
マトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合
わせた未変性ゲル電気泳動、および等電点分離が含まれるが、これらに限定され
ない。

【００７３】 ポリペプチドをペリプラズム中の封入体として形成した場合、封入体は、細胞
内膜および／または細胞外膜にしばしば結合することができ、遠心分離後のペレ
ット物質に最初に見出される。次いで、ペレット物質を、グアニジンまたは尿素
などのカオトロピック剤で処理して封入体を放出、破壊、および溶解することが
できる。その時点で可溶形態のポリペプチドをゲル電気泳動、免疫沈澱などを用
いて分析することができる。ポリペプチドの単離を所望する場合は、Ｍａｒｓｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８２、２６４〜２７５、１９９０
に記載の方法などの標準的な方法を用いて単離を行うことができる。

【００７４】 ポリペプチドを部分的または完全に単離することが好ましい場合、当業者に周
知の標準的な方法を用いて精製を行うことができる。このような方法には、電気
泳動分離後の電気溶出、種々の型のクロマトグラフィー（免疫親和せ、分子ふる
い、および／またはイオン交換）および／または高速液体クロマトグラフィーが
含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、完全な精製のために、こ
れらの方法の１つを超える方法を使用することが好ましいであろう。

【００７５】 遺伝子治療 本発明で得られたヒトＤＮＡ分子（または対応するＲＮＡ）を、遺伝子治療に
使用することもできるが、これは生物活性および所望の効果に依存する。現在、
遺伝子治療に適切なベクター（遺伝子治療の目的で改変された純粋で薬学的に受
容可能なレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）を、例えば肺
への送達のために投与することができる。このようなベクターは、所望の位置で
の発現用に本発明のポリペプチドをコードする核酸を組込むことができる。遺伝
子治療は、所望のタンパク質または別の所望のタンパク質の１つを超える遺伝子
を含むことができる。

【００７６】 あるいは、宿主内での比較的安定な存在を促進するためにベクターを使用しな
くてもよい。例えば、本発明で得られたＤＮＡまたは適切な転写または翻訳調節
領域の相同的組換えは、宿主ゲノムへの組込みまたは宿主ゲノムからの発現を促
進することができる。（同様に、これを、産生目的で行うことができる、例えば
、１９９３年１２月２１日に発行された米国特許第５，２７２，０７１号、１９
９１年７月１１日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９５５）。細胞への取
り込みを促進するために、核酸を、薬学的に受容可能なキャリア（脂質溶液キャ
リア（例えば、電荷脂質）、リポソーム、またはポリペプチドキャリア（例えば
、ポリリジン）など）内に置くことができる。

【００７７】 従って、本発明により、本発明のポリペプチドを発現する細胞集団が得られる
。このような細胞は、治療目的で個体への体内移植または移植に適切であり得る
。例えば、ポリペプチドを過剰発現する細胞集団を調製することができる。次い
で、個体にこのような細胞を移植することができる。このような細胞は、例えば
、肝細胞、骨髄細胞、または臍帯由来の細胞であり得る。あるいは、血液前駆細
胞、Ｔ細胞、または他の血液細胞などの循環細胞の過剰発現に使用することがで
きる。ヒト細胞を使用することができる。細胞は、組織の形態であり得る。この
ような細胞を、移植または体内移植前に培養することができる。ｉｎ ｓｉｔｕ
発現を、例えば、上記の相同的組換え技術の使用などポリペプチドの発現のため
の調節機構の変更によって行うことができる。従って、内因性ポリペプチドＤＮ
Ａの発現が促進されるように改変された宿主細胞集団が得られる。

【００７８】 レシピエントに導入しようとする細胞は、適切ならば、このような細胞の成長
または増殖に栄養を与える１つまたは複数の因子を用いて培養することができる
。造血因子を、造血細胞の培養に使用することができる。このような因子には、
Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＭＧＤＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、リガンド、インターロイ
キン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、および当業者
が利用可能なそのアナログおよび誘導体が含まれる。

【００７９】 １つを超える所望のタンパク質を発現する細胞の移植を含む同時遺伝子治療も
存在し得る。

【００８０】 遺伝子治療の投薬量について、一般に、ベクター、発現系、レシピエントの年
齢、体重、および、健康状態、ならびに当業者に明白な他の因子に依存して、１
細胞あたり１コピーと数千コピーとの間の本発明の核酸が使用される。ポリペプ
チドの細胞送達は、選択した期間（数日間、数週間、数ヶ月、または数年間）持
続することが望ましい。有効期間の最後に、形質転換細胞のレシピエントに、別
の「用量」（例えば、細胞の移植）を投与することができる。細胞を、その寿命
、所望のポリペプチドの発現期間、個体から再単離される（すなわち、血液細胞
では、白血球搬出法を使用により、細胞表面に存在するマーカーを用いて形質転
換細胞を返還することができる）能力について選択することができる。同様に、
ベクターを、例えば、含有するＤＮＡの公知の発現期間を有するウイルスを用い
て設計することができる。

【００８１】 所望の細胞またはベクターを、当業者が適用できる技術（凍結など）を用いて
保存することができる。

【００８２】 従って、本発明はまた、個体へのポリペプチドの投与法を意図し、ポリペプチ
ド源は、（ｉ）ポリペプチドを発現する細胞集団および（ｉｉ）ポリペプチドを
発現するベクターの集団から選択される。このようなベクターは、ヒト細胞に感
染することができるウイルスベクターであり得る。細胞は、組織または個々の細
胞から選択することができる。各細胞は、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、末
梢血前駆細胞、赤血球、Ｔ細胞を含む白血球、および神経細胞の中から選択する
ことができる。

【００８３】 ポリペプチド誘導体 別のペプチド配列との融合分子を作製するために、上記のように調製した本発
明のポリペプチド（フラグメントおよびアナログを含む）を改変することができ
る。例えば、ポリペプチドを免疫原性ペプチドで「タグ化」したい場合、ＤＮＡ
を構築してこのような融合産物を得ることができる。タグは、Ｎ末端またはＣ末
端に存在し得る。例としては、ポリペプチドの「ＦＬＡＧタグ」バージョンであ
る。「タグ化」のこの型は、タグとして選択される抗体などの試薬を用いたポリ
ペプチドの結合に有用である。このような結合は、ポリペプチドの位置付けもし
くは量の検出またはポリペプチド捕獲プロセス用であり、例えば、アフィニティ
ーカラムを使用してタグを結合させ、所望のポリペプチドに結合させる。他の型
の検出標識（放射性同位元素、発光標識（例えば、蛍光または燐光性化合物）、
酵素分解性抗体、検出可能な抗体（またはその改変物）、または他の物質）を、
本発明のこのような標識化に使用することができる。

【００８４】 ヒトへの治療目的で、ポリペプチド部分への１つまたは複数の他の化学物質へ
の付着によって上記のポリペプチドを誘導化するのに有利であり得る。このよう
な化学物質を、種々の水溶性ポリマーから選択することができる。ポリマーは、
結合するポリペプチドが生理学的環境などの水溶性環境に混和することができる
ように水溶性であるべきである。水溶性ポリマーを、例えば、ポリエチレングリ
コール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリ−１，３−ジオキサン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／
マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムもし
くは非ランダムコポリマーのいずれか）（融合分子に関しては以下を参照のこと
）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリ
コール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレ
ンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリスチレンマレイン
酸塩およびポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。ポリエ
チレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定なので製造に有利であり
得る。

【００８５】 本発明による融合ポリペプチドを、ポリアミノ酸のポリペプチドへの付着によ
って調製することができる。例えば、ポリアミノ酸は、ポリペプチドの循環半減
期の増加に作用するキャリアタンパク質であり得る。誘導体がｉｎ ｖｉｖｏ治
療での使用を意図する場合、ポリアミノ酸は、中和抗原応答または他の有害応答
を行わないものであるべきである。ポリアミノ酸を、血清アルブミン（ヒト血清
アルブミン）、抗体もしくはその一部（抗体定常部、しばしば「Ｆｃ」と呼ばれ
る）、または他のポリアミノ酸からなる群から選択することができる。ポリアミ
ノ酸の付着位置は、ポリペプチドのＮ末端または他の場所であり、また、ポリペ
プチドへの化学的「リンカー」部分によって連結することができる。

【００８６】 ポリマーは、いかなる分子量であってもよく、かつ分岐していても分岐してい
なくても良い。ポリエチレングリコールでは、取り扱いおよび製造に容易な好ま
しい分子量は、約２キロダルトン（ｋＤａ）と約１００ｋＤａ（用語「約」は、
ポリエチレングリコールの調製の際、分子は記載の分子量を超えるかいくらか低
い分子量である場合があることを示す）との間である。所望の治療プロフィール
（例えば、所望の徐放持続時間、いくらかの生物活性に対する効果、取扱いやす
さ、抗原性の程度または欠如、および治療タンパク質に対するポリエチレングリ
コールの公知の他の効果）に依存して、他のサイズを使用することができる。

【００８７】 このような付着したポリマー分子数は変化し得るが、これは、当業者が機能に
対する効果を確認することができる。モノ誘導体化することができるか、同一ま
たは異なる化学部分を有するジ、トリ、テトラ、またはいくつかの誘導体の組み
合わせ（例えば、異なる分子量のポリエチレングリコールなどのポリマー）を得
ることができる。ポリペプチド分子に対するポリマー分子の比率は、反応混合物
のその濃度の変化に従って変化する。一般に、至適な比率（過剰な未反応ポリペ
プチドまたはポリマーが存在しないという点での反応効率に関して）は、所望の
誘導体化の程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、選択した分子量、ポリマーの
分岐の有無、および反応条件などの因子によって決定される。

【００８８】 ポリペプチドの機能的ドメインまたは抗原ドメインに対する効果を考慮して、
化学物質はポリペプチドに付着されるべきである。当業者に利用可能な多数の付
着法が存在する（例えば、欧州特許第０ ４０１ ３８４号（ＰＥＧとＧ−ＣＳ
Ｆとのカップリング）およびＭａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０、１０２８〜１０３５、１９９２（トレシル
クロリドを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化の報告）を参照のこと）。例示のために
、ポリエチレングリコールを、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応
基を介してアミノ酸残基により共有結合することができる。反応基は、活性化ポ
リエチレングリコール分子（または他の化学部分）に結合することができるもの
である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミ
ノ酸残基が含まれ得る。遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基には、アスパ
ラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が含まれ得る。ス
ルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）
の付着用の反応基として使用することができる。好ましい治療薬製造プロセスは
、Ｎ末端などでのリジン基へのアミノ基の付着である。レセプター結合を望む場
合、レセプター結合に重要な残基での付着は避けるべきである。

【００８９】 特に、Ｎ末端化学修飾誘導体を所望することができる。例示としてポリエチレ
ングリコールを使用して、種々のポリエチレングリコール分子（分子量分岐など
による）、反応混合物中でのポリペプチド分子に対するポリエチレングリコール
分子の比率、行われるペグ化の型、および選択されたＮ末端ペグ化ポリペプチド
の獲得法から選択することができる。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得法（すなわち、
必要ならば、他のモノペグ化部分からのこの部分の分離）は、ペグ化ポリペプチ
ド分子集団からのＮ末端ペグ化物質の精製であり得る。選択的なＮ末端化学修飾
を、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の一次アミノ基の
異なる反応性を利用する還元アルキル化によって行うことができる。１９９６年
４月２５日に発行されたＰＣＴ出願ＷＯ９６／１１９５３を参照のこと。適切な
還元条件下で、ポリマーを含むカルボニル基を用いたＮ末端でのポリペプチドの
実質的に選択的な誘導体化を行う。例えば、リジン残基のε−アミノ基とポリペ
プチドのＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａ差が有利になるｐＨで反応を
行うことによってポリペプチドのＮ末端を選択的にペグ化することができる。こ
のような選択的誘導体化によって、ポリペプチドへのポリマーの付着を調節する
。ポリマーとの複合は、ポリペプチドのＮ末端で優勢に起こり、リジン側鎖アミ
ノ基などの他の反応基の有意な改変は起こらない。還元アルキル化を用いると、
ポリマーは上記の型であり、ポリペプチドへのカップリングのための１つの反応
性アルデヒドを有するはずである。１つの反応性アルデヒドを含むポリエチレン
グリコールプロピオンアルデヒドを使用することができる。

【００９０】 一般に、Ｎ末端を化学修飾した誘導体は、治療薬の製造に容易な他の形態の化
学修飾より好ましい。産物の特徴づけとしての同種の産物を確認するＮ末端化学
修飾を、ジ、トリ、または他の多誘導体化法と比較して単純化する。商業製造に
容易なＮ末端を化学修飾した産物の調製用の上記の還元アルキル化の使用が好ま
しい。

【００９１】 本発明の化学修飾した誘導体を、動脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、静脈内、経
口、経鼻、肺、局所、または他の投与経路用にさらに処方することができ、これ
は、ポリペプチドの生物活性および所望の治療効果にさらに依存する。生物活性
タンパク質の化学修飾により、一定の環境下で更なる利点（治療タンパク質の安
定性および循環時間の増加ならびに免疫原性の減少）が得られることが見出され
た。例えば、１９７９年１２月１８日発行のＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．に付与さ
れた米国特許第４，１７９，３３７号、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、
「Ｅｎｚｙｍｅ ａｓ Ｄｒｕｇｓ」、Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂ
ｅｒｔｓ編、３６７〜３８３、１９８１を参照のこと。タンパク質精製および融
合タンパク質を記載した総説は、Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３、４〜１０、Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ、Ｍｏｕｎｔｖｉ
ｅｗ Ｃｏｕｒｔ、Ｆｒｉｅｒｎ Ｂａｒｎｅｔ Ｌａｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅ
ｎｇｌａｎｄ、１９９２である。好ましくは、最終製品調製の治療用途のために
、誘導体の化学物質は薬学的に受容可能である。

【００９２】 治療組成物 本発明の別の態様は、ヒトへの使用のための薬学的組成物および薬物の製造方
法における配列番号４のポリペプチドならびにそのアナログおよび誘導体を含む
。このような組成物は、注射による投与、経口、肺、鼻、経皮、または他の投与
形態であり得る。一般に、薬学的に受容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化
剤、アジュバント、および／またはキャリアと共に有効量の本発明のポリペプチ
ドまたは誘導体産物が含まれる薬学的組成物が本発明の範囲内である。「有効量
」は、測定することができる生物学的効果を得るのに十分な量を意味する。この
ような組成物には、種々の緩衝成分（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン
酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤、界面活性剤および可溶化剤（例えば
、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、抗酸化剤（例えば、ア
スコルビン酸、メタ亜硫酸水素酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメルソール
、ベンジルアルコール）、および充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）
などの添加物、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の特定の調製物
またはリポソームへの物質の組込みが含まれる。例えば、１９９６年１０月３日
に発行されたＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願ＷＯ９６／２９９８９
を参照のこと。ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環における
徐放持続時間を促進する効果を有し得る。このような組成物は、本発明のタンパ
ク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ
ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１４
３５〜１７１２、１９９０を参照のこと。組成物を、液体形態または凍結乾燥形
態などの乾燥粉末として調製することができる。移植可能な徐放性処方物も経皮
処方物として含まれる。

【００９３】 誘導体化ポリペプチドの上記の経口投薬形態もまた意図される。誘導体の経口
送達が有効となるようにタンパク質を化学修飾することができる。一般に、本発
明の目的として意図される化学修飾は、ポリペプチド分子への少なくとも１つの
部分の付着であり、この部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害および（ｂ）胃ま
たは腸からの血流への取り込みを可能にする。タンパク質全体の安定性の増加お
よび体内での循環時間の増加もまた所望される。１９９５年８月１７日に公開さ
れたＰＣＴ出願ＷＯ９５／２１６２９（Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ、「Ｏｒａｌ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ」）および１９９６年１１月１２日に発行のＨａｂｂｅｒｆｉｅｄ ｅ
ｔ ａｌ．に付与される米国特許第５，５７４，０１８号（「Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ ｏｆ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」）を参照の
こと。

【００９４】 このようなポリペプチドおよび誘導体の肺への送達もまた本明細書中で意図さ
れる。ポリペプチドまたはポリペプチドのアナログもしくは誘導体を、吸入によ
って哺乳動物の肺に送達させて、血流に繋がる肺上皮を経由して移動させる。例
として、１９９４年９月１５日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００６９、
Ｎｉｖｅｎ ｅｔ ａｌ．、「Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ
Ｆａｃｔｏｒ」を参照のこと。

【００９５】 ポリペプチド（またはアナログもしくは誘導体）の経鼻送達もまた可能である
。経鼻送達により、鼻への治療産物の投与後、肺に産物を沈着させることなく血
流へのポリペプチド（または誘導体）の通過が可能になる。経鼻送達用の処方物
には、デキストランまたはシクロデキストランなどの吸収促進剤が含まれる。他
の粘膜輸送を介した送達もまた意図される。

【００９６】 所望ならば、徐放性処方物または調製物中の本発明のポリペプチドを、全身投
与することもできる。徐放性調製物の適切な例には、形成加工した物質（例えば
、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマー基質が含まれる。
徐放性基質には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸塩、（１９７３年１１月
２０日発行の米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−
エチル−Ｌ−グルタミン（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｓ、２２、５４７〜５５６、１９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタク
リレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒ
ｅｓ．、１５、１６７〜２７７、１９８１、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔ
ｅｃｈ．、１２、９８〜１０５、１０８２）、エチレンビニルアセテート（Ｌａ
ｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸
が含まれる。徐放性組成物には、リポソームも含まれ、これは、当該分野で公知
の任意のいくつかの方法によって調製することができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、８２、３６８８〜３６９２、
１９８５およびＨｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、７７
、４０３０〜４０３４、１９８０を参照のこと 典型的には、ポリペプチドは、高度に精製された形態であり、組成物は、通常
、滅菌濾過膜などによる濾過などによって予め滅菌する。

【００９７】 ｉｎ ｖｉｖｏで有効なポリペプチドの量は、適用の性質に依存する。当業者
は、所望の治療効果の投与および観察によって有効投薬量を確認することができ
る。本発明の範囲で特に有効な用量は、治療する特定の障害または病状ならびに
レシピエントの年齢および身体全体の健康に依存し、これは、標準的な臨床手順
によって決定することができる。可能な場合、最初にバイオアッセイ系としてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでの薬学的組成物の用量反応曲線を決定し、その後ヒトでの試験
前にｉｎ ｖｉｖｏでの有用な動物モデル系において用量反応曲線を決定するこ
とが望ましい。当業者は、治療範囲、治療する障害の型、および他の適用因子を
考慮して、副作用の無い適切な投与を確認することができる。典型的には、実施
者は、投薬量が所望の効果に達するまでポリペプチド組成物を投与する。組成物
を、期間中に、単回用量、２回またはそれ以上の用量（同量のポリペプチドを含
んでも含まなくても良い）としてまたは連続して投与することができる。

【００９８】 診断物質および方法。本発明の核酸産物を、検出可能なマーカー（放射性標識
およびビオチンなどの非放射性標識）で標識化し、これをハイブリッド形成プロ
セスに使用して染色体地図中の遺伝子の位置および／または任意の関連遺伝子フ
ァミリーの遺伝子の位置を位置付けることができる。これらを、ＤＮＡレベルで
の遺伝子障害の同定ならびに隣接する遺伝子およびその障害の同定用の遺伝子マ
ーカーとして使用することもできる。このような核酸配列を、生物学的サンプル
由来のｍＲＮＡレベルの検出または測定に使用することができる。本発明では、
このような標識化物質を含むキットが意図される。

【００９９】 本発明で得られたポリペプチドおよび／または核酸を、キットの一部または製
品として実施することができる。例としては、充填物質および１つまたは複数の
本発明で得られた組成物の調製物を含む製品である。このような充填物質は標識
を含み、これは、ポリペプチドまたは核酸調製物が生物学的サンプル中のポリペ
プチドの量および生物学的サンプル中の欠損量の検出および／または定量に有用
であることを示す。そういうものとして、キットは、任意に、このような試験を
行うための物質（ＤＮＡもしくはＲＮＡハイブリッド形成分析または血液におけ
るＰＣＲ分析に有用な試薬、尿素、または組織サンプルなど）を含む。

【０１００】 本発明の更なる態様は、ポリクローナル抗体または、好ましくは、本発明のポ
リペプチドに選択的に結合するモノクローナル抗体などの結合分子である。Ｋｏ
ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１〜５１９、１９７６に最初に記載された
ハイブリドーマ技術は、多くの特定の抗原に対して高レベルのモノクローナル抗
体を分泌するハイブリッド細胞株を産生するために広く適用されている。組換え
抗体もまた調製することができる。Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２４６、１２７５、１９８９を参照のこと。このような組換え抗体を、親和性を
増加または変更するための相補性決定領域の改変、またはこのような抗体の「ヒ
ト化」、および治診断目的でのキットへの組込みなどによってさらに改変するこ
とができる。診断キットを使用して、個体中の本発明のポリペプチドの位置およ
び／または量を決定することができる。ポリペプチドが種々の変化の程度で結合
容量または結合能力が減少しているレセプターを個体が有するかどうかを診断キ
ットを使用して決定することもできる。このような抗体を、ポリペプチドの免疫
原性部分を用いて調製することができる。このような選択性結合分子自体をポリ
ペプチドに変化させることができ、薬学的用途のために処方することができる。

【０１０１】 このようなポリペプチドおよび／または核酸を、組織分布アッセイ（例えば、
以下の実施例で得られるもの）またはポリペプチドの発現パターンを決定するた
めの他のアッセイに使用することができる。

【０１０２】 本発明のポリペプチドの生物学的機能を、マウスなどの非ヒト動物における対
応遺伝子の発現を破壊して、この遺伝子の発現レベルを有意に減少させるか完全
に消滅させる（いわゆる「ノックアウト」動物）ことによってｉｎ ｖｉｖｏで
研究することができる。このような動物を、例えば、１９９６年９月１７日発行
の米国特許第５，５５７，０３２号に記載の技術および方法の使用によって調製
することができる。さらに、またはあるいは、過剰発現の効果を評価するために
ポリペプチドの遺伝子を過剰発現させたマウス（「トランスジェニック」動物）
を調製することができる。このようなトランスジェニック動物の適切な調製法は
、１９９６年２月６日発行の米国特許第５，４８９，７４３号および１９９４年
１２月８日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９４／２８１２２に記載されている。有用なト
ランスジェニック動物は、ポリペプチドの発現に関連する検出可能な表現型を示
す。

【０１０３】 本発明のポリペプチドの別の潜在的な用途は、ポリペプチドに結合するかポリ
ペプチドによって活性化されるレセプターの同定アッセイおよび同定法での使用
である。これを、例えば、表面上で本発明のポリペプチド（「リガンド」）を発
現する組換え宿主細胞（細菌、酵母など）と、レセプターに結合するかレセプタ
ーで活性化することができる条件下で同定されるレセプターとの接触およびこの
ような任意の結合または活性化の発生の検出によって行うことができる。このよ
うな「リガンド−レセプター」相互作用は、本発明の膜結合ポリペプチドが隣接
した細胞のレセプターとの接触によって相互作用すると考えられているので、細
胞−細胞間で起こり得る。従って、アッセイは、別の宿主細胞の表面上での「リ
ガンド」と「レセプター」との組換え発現を含み、その後、リガンド−レセプタ
ー結合またはレセプター活性化が起こるかどうかを決定するために近づけるかま
たは直接接触させる。次いで、結合または活性化を、リガンドまたはレセプター
のいずれかに付着している分析で検出可能なレベルの変化の測定またはレセプタ
ーの自己リン酸化の測定（後者は活性化の際リン酸化される場合）などの標準的
な手段によって検出する。

【０１０４】 あるいは、組換え発現し、宿主から回収された細胞外ドメイン（シグナルペプ
チド領域を含むか含まない）からなる、本発明のポリペプチドの「可溶性」ポリ
ペプチドバージョンを使用してアッセイを行うことができる。可溶性ポリペプチ
ドを、単独または誘導体化形態（例えば、上記（および以下に例示の）「Ｆｃ融
合」産物）で使用することができる。次いで、可溶性ポリペプチドまたは誘導体
を、同定されるべきレセプターに結合している基質に近づけるか接触させ、上記
と同一の様式で結合または活性を検出する。逆の手順（すなわち、適切な基質に
結合されている同定すべきレセプターおよびそれに接触されている非結合の可溶
性ポリペプチドまたは誘導体を用いる）を行うこともできる。

【０１０５】 本発明の精製ポリペプチドはまた、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの機能お
よび活性に影響を与える新規の薬物の合理的な設計手段としての構造的研究に有
用である。例えば、組換えタンパク質を使用して、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、または
関連タンパク質の公開された構造からのモデリングによってタンパク質構造を誘
導することができる。構造の知識は、ポリペプチドがどのように結合しているか
についての理解を深め、これにより、何を望むかに依存して、ポリペプチドの活
性を阻害するか模倣することができる化合物を設計または発見することができる
。

【０１０６】 特定の実施形態の説明 本発明は、例示の目的で以下の実施例に関してさらに詳述するが、これは、本
発明の限定を意図しない。

【０１０７】 実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの構築 正常な白色脂肪組織を、ＣＤ−１マウスから回収し、全ｍＲＮＡを、製造者の
指示に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａ
ｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて単離した。ポリＡ配列を
含むＲＮＡの比率を、ＤＮａｓｅ工程の省略以外は指示に従って実質的に単離し
た（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）。

【０１０８】 Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）によりこのｍ
ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ＮｏｔＩ制限部位を含むカ
スタムランダムオリゴヌクレオチドプライマーを第１の標準的な合成工程用に置
換し、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒ
ａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して第２の標準合成工程およびＳａｌＩアダ
プターライゲーション工程の産物を精製する以外は製造者のプロトコールに従っ
た。ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）を用いてサイズ分画し、
２００〜８００塩基対の産物を切り出した。次いで、これらのフラグメントを、
酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで予め消化したシャトルベクターｐＹＹＡ−４１Ｌ
にライゲートした。ベクターｐＹＹＡ−４１Ｌを、１９９８年２月１３日にＡｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓ
ｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａに寄託し、受諾番号２０９６３６を得た。

【０１０９】 ベクターｐＹＹＡ−４１Ｌは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
の選択用にそれぞれアンピシリン耐性遺伝子およびＴｒｐ１遺伝子を含む。さら
に、ベクターは、シグナルペプチド配列が欠失されている酵母アミラーゼ遺伝子
の上流に酵母プロモーターを含む。ベクターを、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ制限部位へ
の機能的シグナル配列の挿入により酵母細胞壁の外側へアミラーゼ遺伝子産物が
分泌されるように構築する。ライゲートしたベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１
０ｂ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）へ
の形質転換によって増幅し、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ
、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて単離した。

【０１１０】 得られたＤＮＡを使用し、酢酸リチウムを使用してＹＰＨ４９９酵母を形質転
換した。参考として、Ｇｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０、１４２５、１９９２を参照のこと。次いで、形質転換
酵母細胞を、デンプンアズールを含み、トリプトファンを欠く寒天（Ｓｉｇｍａ
、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）にプレートした。３０℃でのインキュ
ベーション後、アズールプレートの明澄部分に包囲された（アミラーゼ遺伝子の
分泌を示す）酵母コロニーを取り出した。個々の酵母コロニーを、プレートへの
再画線および液体培地での培養によって単離し、次いで、ベクターＤＮＡをＱｉ
ａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて単離した。ベクターインサートのＤＮＡ配列を、ベ
クター特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｓｕ
ｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、増幅ＤＮＡの精製（Ｑｉａｇｅｎ、
Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、および自動化ＤＮＡ配列決
定（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏ
ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって決定した。

【０１１１】 得られたＤＮＡ配列および推定タンパク質配列を、ヌクレオチド配列およびタ
ンパク質配列を含む利用可能な公的データベースで検索した。４０２塩基対から
なる１つの配列（配列番号４１）は、以前に単離したデルタ遺伝子ファミリーの
メンバーに有意な相同性を示した。

【０１１２】 実施例２ マウス遺伝子のクローニング ８００塩基対より長いマウス脂肪細胞ｃＤＮＡを、Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商
標）ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）および製造者のプロトコールを用いてアダプタープライマーにラ
イゲートした。最終ｃＤＮＡ産物を、非ライゲーションアダプタープライマーか
ら精製し（ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用
いたその後のｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）反応用のテンプレートとし
て使用した。

【０１１３】 ３’ＲＡＣＥ反応のために、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＰＣＲキット成
分（Ｃｌｏｎｔｈｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および以
下のプライマーを用いたｃＤＮＡテンプレートによってＰＣＲを行った： ＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＧＣＧＡＡＣＡ（配列番号４２）および
ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号４３）。

【０１１４】 変性（９４℃で１分間）後、増幅の手順を以下のように行った：９４℃で５秒
間および７２℃で４分間を５サイクル、９４℃で５秒間および７０℃で４分間を
５サイクル、および９４℃で５秒間および６８℃で４分間を２５サイクル。全反
応を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００ ＰＣＲマシン（Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。

【０１１５】 反応混合物を、１％アガロースゲルで電気泳動して、約３ｋｂに移動した１本
のバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、
Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）によって精製し、その後、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔプラスミ
ド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にライ
ゲートした。次いで、細菌宿主細胞を、このプラスミドで形質転換して一晩増殖
させる。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを
用いて細菌宿主細胞から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化して、インサ
ートの存在およびサイズを確認した。約３キロベース（配列番号４４）のインサ
ートを含むクローンを配列決定し、マウスポリペプチドをコードする新規のｃＤ
ＮＡを含むことが見出された。このＤＮＡ配列を使用して、５’ＲＡＣＥ反応用
のプライマーを設計した。

【０１１６】 ５’ＲＡＣＥ反応のために、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＰＣＲキット成
分（Ｃｌｏｎｔｈｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および以
下のプライマーを用いたｃＤＮＡテンプレートによってＰＣＲを行った： ＧＧＴＧＡＧＴＣＣＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣ（配列番号４５）および
ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号４３）。

【０１１７】 最初の変性（９４℃で１分間）後、増幅の手順を以下のように行った：９４℃
で５秒間および７２℃で４分間を５サイクル、９４℃で５秒間および７０℃で４
分間を５サイクル、および９４℃で５秒間および６８℃で４分間を２５サイクル
。

【０１１８】 反応混合物を、１％アガロースゲルで電気泳動して、約１．５キロベースに移
動した１本のバンドを切り出し、上記のように精製し、以下のオリゴヌクレオチ
ドを用いたＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＰＣＲキット成分を用いて再増幅し
た： ＧＡＣＡＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＴ（配列番号４６）および
ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号４３）。

【０１１９】 変性（９４℃で１分間）後、テンプレートを、９４℃で１０秒間ならびに７２
℃で２分間および３０秒間を３５サイクルで増幅した。

【０１２０】 反応混合物を、１％アガロースゲルで電気泳動して、約１．７ｋｂに移動した
１本のバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）カラムによって精製し
、その後、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ
、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にライゲートした。次いで、細菌宿主細胞を、このプ
ラスミドで形質転換して一晩増殖させる。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ
ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを用いて細菌宿主細胞から単離し、ＥｃｏＲＩで
消化して、インサートの存在およびサイズを確認した。約１．５キロベースのイ
ンサートを含む３つのクローンを配列決定し、９８２塩基対からなる５’マウス
ｃＤＮＡ配列（配列番号４７）をさらに含むことが見出された。

【０１２１】 この５’ＲＡＣＥクローン配列（配列番号４７）を、３’ＲＡＣＥクローン（
配列番号４４）に融合して全長マウスｃＤＮＡオープンリーディングフレーム配
列（図１Ａ〜１Ｂおよび配列番号１）を得た。

【０１２２】 配列番号１（上記）の全長マウスｃＤＮＡクローンを作製するために、Ａｄｖ
ａｎｔａｇｅ（登録商標）ＰＣＲキット成分および以下のオリゴヌクレオチドを
用いて、ＲＡＣＥ反応由来のマウス白色脂肪テンプレートに対してＰＣＲを行っ
た： ＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＣＧ（配列番号４８）および ＴＣＴＡＴＴＡＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＣＡＣ（配列番号４９）。

【０１２３】 変性（９４℃で１分間）後、テンプレートを、９４℃で１０秒間の加熱、５５
℃で１０秒間、ならびに７２℃で２分間および３０秒間を１０サイクル、その後
９４℃で１０秒間の加熱、６２℃で１０秒間、および７２℃で２分間および３０
秒間を２５サイクルで増幅した。

【０１２４】 反応混合物を、１％アガロースゲルで電気泳動して、約２．２ｋｂに移動した
１本のバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）カラムによって精製し
、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）にライゲートした。細菌宿主細胞を、このプラスミドで形質転
換して一晩増殖させる。次いで、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉ
ｐｒｅｐプロトコールを用いて細菌宿主細胞から単離し、ＥｃｏＲＩで消化して
、インサートの存在およびサイズを確認した。約２．２キロベースのインサート
を含む３つのクローンを配列決定し、完全なｃＤＮＡ分子（配列番号１、図１Ａ
〜１Ｂ）を含むことが示された。このｃＤＮＡ分子は、図２の推定アミノ酸配列
（配列番号２）を有するマウスポリペプチド（以後「Ｄ１１４」と呼ぶ）をコー
ドする。

【０１２５】 実施例３ ヒト遺伝子の同定 マウスＤＮＡ配列（配列番号１）を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって
検索して、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー由来の４０９塩基対配列（配列番号５０
）がマウスポリペプチドに対して８１．３７％の配列が同一であることが見出さ
れた。以下のオリゴヌクレオチドを、配列番号５０と配列番号１との間の高相同
性領域から設計した： ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号５１）および
ＡＴＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＧＧ（配列番号５２）。

【０１２６】 これらのオリゴヌクレオチドを使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＰＣ
Ｒキット成分（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
）を使用してＭａｒａｔｈｏｎヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を増幅した。最初の変性（９４
℃で１分間）後、増幅の手順を以下のように行った：９４℃で５秒間ならびに７
２℃で２分間および３０秒間を５サイクル、９４℃で５秒間および７０℃で２分
間および３０秒間を５サイクル、および９４℃で５秒間および６８℃で２分間お
よび３０秒間を５サイクル。

【０１２７】 反応混合物を、１％アガロースゲルで電気泳動して、約２４５塩基対に移動し
た１本のバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）カラムによって精製
し、同一の反応条件で再増幅した。

【０１２８】 得られた２４５塩基対の産物を、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｑｉａｇ
ｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、ＲｅｄｉＰｒ
ｉｍｅ（登録商標）ランダムプライム反応キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて、α−^３２Ｐ−ＤＣ
ＴＰ（ＲｅｄｉＶｕｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ
ｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で標識した。組込まれていない放射能を、サイズ排除ク
ロマトグラフィー（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒ
ａｄｏ）によって排除した。次いで、ヒト脂肪細胞５’伸長＋ｃＤＮＡλ ｇｔ
１０ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）を、このα−^３２Ｐ−ＤＣＴＰ標識プローブを用いてヒト遺伝子について
スクリーニングした。７２枚の濾紙を１００ｍｌのＲａｐｉｄＨｙｂ（登録商標
）緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉ
ｎｏｉｓ）中、標識ｃＤＮＡプローブと６５℃で約１６分間ハイブリッド形成し
た。次いで、濾紙を、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウ
ム／０．３Ｍクエン酸ナトリウム）中、室温で約３０分間２回洗浄し、その後０
．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃で３０分間２回洗浄した。濾紙を、オ
ートラジオグラフィーカセットに置き、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）に−８０℃で一晩
暴露した。フィルムを現像し、プローブとハイブリッド形成して１つのクローン
を同定した。

【０１２９】 このファージクローンを、標準的な方法を用いてプラーク精製し、Ｗｉｚａｒ
ｄ Ｌａｍｂｄａ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて単離し、
配列決定した。配列（破裂番号５３）は、このクローンがヒトポリペプチドの約
２１５塩基対の５’非翻訳領域および１９８０塩基対のコード領域を含むことを
示した。クローンはまた、コード領域の最後の８５塩基対を欠いていた。

【０１３０】 ヒト遺伝子の残りの３’末端を増幅するために、以下に示したオリゴヌクレオ
チドプライマーを、終止コドンの配列番号５０の下流のクローンおよび上記のヒ
トファージクローン配列（配列番号５３）から設計した： ＡＣＣＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴ（配列番号５４）および ＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号５５）。

【０１３１】 これらのオリゴヌクレオチドを使用し、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してＭａｒａｔｈｏ
ｎヒト肺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）を増幅した。９４℃で１分間の変性後、増幅を、９４℃で１
５秒間、６８℃で１５秒間、および７４℃で１分間を３０サイクルで行った。

【０１３２】 反応混合物を、１％アガロースゲルで電気泳動して、約３００塩基対に移動し
た１本のバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）カラムによって精製
し、その後、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にライゲートした。次いで、細菌宿主細胞を
、このプラスミドで形質転換して一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａ
ｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを用いて細菌宿主細胞から単離し、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化して、インサートの存在およびサイズを確認した。
約３００塩基対のインサートを含む３つのクローンを配列決定し、配列番号５０
および配列番号５３と比較した。１つのクローンを選択し、このクローンの３倍
をカバーする配列が配列番号５６の配列を有することが明らかとなった。

【０１３３】 配列（配列番号５６）および配列番号５３の配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒソフ
トウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を
用いて全長ヒトオープンリーディングフレーム配列（図３Ａ〜図３Ｂ、配列番号
３）に融合した。このＤＮＡ配列は、図４の推定アミノ酸配列（配列番号４）を
有するヒトポリペプチドをコードする。

【０１３４】 実施例４ マウス遺伝子の発現 マウスポリペプチドの遺伝子発現パターンを評価するために、ＧｅｎｅＡｍｐ
ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒ
ｗａｌｋ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）および以下のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて種々のマウス組織由来の１０ｎｇのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを
行った： ＡＡＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧ（配列番号５７）および ＡＧＡＴＴＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＡＣＧＡ（配列番号５８）。

【０１３５】 ６０℃で３０分間の第１のｃＤＮＡ鎖合成および９４℃で２分間の変性後、増
幅を、９４℃で１５秒間その後６６℃で１分間を３０サイクルで行った。反応を
、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００ ＰＣＲマシンで行った。次いで、反応
混合物を、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、各アリコートを１％アガロースゲルで
泳動したところ、ほとんどの組織で予想した２７５塩基対のフラグメントが認め
られた。最も高いレベルの発現は肺で認められ、次いで白色および褐色脂肪組織
で認められた。より低い発現レベルでマウスポリペプチドを発現した他の組織は
、副腎、脾臓、脳、眼、腎臓、および肝臓であった。この実験レベルでは、皮膚
および骨格筋はネガティブであった。

【０１３６】 これらの同一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、プローブとしてＰＣ
Ｒ Ｃｏｒｅキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎ
ａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を用いて配列番号４１のクローン由来の領域を
増幅した。最初の変性工程（９４℃で１分間）の後、増幅手順は、９４℃で１５
分間その後６６℃で１分間で３０サイクルからなる。反応混合物のアリコートを
１％アガロースゲルで電気泳動し、約２７５塩基対に移動した１本バンドが認め
られた。反応混合物の残りを、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ
、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、ＲｅｄｉＰｒｉｍ
ｅ（登録商標）ランダムプライム反応キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇ
ｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて、α−^３２Ｐ−ＤＣＴＰ
（ＲｅｄｉＶｕｅ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅ
ｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で標識した。組込まれていない放射能を、サイ
ズ排除クロマトグラフィー（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃ
ｏｌｏｒａｄｏ）によって排除した。

【０１３７】 このマウスプローブを使用して、１０ｍｌのＲａｐｉｄＨｙｂ（登録商標）緩
衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏ
ｉｓ）中の種々のマウス組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）由来のレーンあたり２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むノーザンブ
ロットをスクリーニングした。スクリーニングを、６５℃の温度で約１時間行っ
た。次いで、濾紙を、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で約３０分間２
回洗浄し、その後０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃で３０分間２回洗
浄した。次いで、ブロットを、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
に一晩暴露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８２０シ
ステムで現像した。

【０１３８】 マウス遺伝子発現レベルを示すノーザンブロット分析は、肺で最も高く、次い
で、心臓、腎臓、骨格筋、および脳であった。転写物は、脾臓および精巣ではわ
ずかに検出され、ＧＡＰＤＨへのハイブリッド形成により、これらのレーンでほ
とんどＲＮＡは認められなかった。

【０１３９】 実施例５ マウス遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成 正常な胚（Ｅ１０．５〜Ｅ１８．５）および成体マウス組織のパネルを、４％
パラホルムアミドで固定し、パラフィンで包埋して５μｍの切片にした。ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリッド形成の前に、組織を０．２Ｍ ＨＣｌで透過化処理をした
後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで消化し、トリエタノールアミンおよび無水酢酸
でアセチル化した。切片を、マウス配列の１〜２０５８ヌクレオチドに相当する
２０５８塩基対の^３３Ｐ標識リボプローブと５５℃で一晩ハイブリッド形成し、
次いで、５５℃の０．１×ＳＳＣ中での高ストリンジェンシーに供した。スライ
ドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２乳濁液（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅ
ｓｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に浸漬し、４℃で２〜３週間暴露し、現像し、ヘ
マトキシリン／エオシンで対比染色した。切片を、標準的（明視野）および暗視
野照明法で試験して組織形態およびハイブリッド形成シグナルを同時に評価した
。ヘマトキシリン／エオシンで分染した核および細胞質を、明視野照明下で細胞
形態を視覚化し目的の遺伝子を発現する細胞型を同定した。乳濁液オートラジオ
グラフィーにより、暗視野照明化でハイブリッド形成シグナル（ハイブリッド形
成放射性標識プローブ由来）を顕微鏡で評価し、現像された銀粒子が暗いバック
グラウンド上の明るい点として認められた。

【０１４０】 この様式で試験される組織には、以下が含まれる：ＧＩ（食道、胃、十二指腸
、空腸、回腸、近位および遠位の結腸）、脳（１つの矢状切片、２つの冠状切片
）、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺
、雄および雌の生殖器（雌の卵巣、卵管、および子宮ならびに雄の精巣、精巣上
体、前立腺、精嚢、および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲、卵
巣周囲または上衣）、骨（大腿骨）、皮膚、乳房、および骨格筋。

【０１４１】 成体マウス由来組織についての結果を図５および図６に示す。マウス胚につい
ての結果を図７に示す。写真の各々の対について、明視野照明法を上のパネルに
示し、暗視野照明法を下のパネルに示す。図５Ａおよび図５Ｂ：肺。図５Ｃおよ
び図５Ｄ：肝臓。図５Ｅおよび図５Ｆ：脳。図５Ｇおよび図５Ｈ：脈絡叢。図５
Ｉおよび図５Ｊ：腎臓。図５Ｋおよび図５Ｌ：副腎。図５Ｍおよび図５Ｎ：脾臓
。図５Ｏおよび図５Ｐ：胸腺。図６Ａおよび図６Ｂ：白色脂肪組織。図６Ｃおよ
び図６Ｄ：褐色脂肪組織。図６Ｅおよび図６Ｆ：骨格筋。図６Ｇおよび図６Ｈ：
皮膚。図６Ｉおよび図６Ｊ：十二指腸。図６Ｋおよび図６Ｌ：膵臓。図６Ｍおよ
び図６Ｎ：卵巣。図６Ｏおよび図６Ｐ：精巣。図７Ａおよび図７Ｂ：マウス胚。
図７Ｃおよび図７Ｄ：Ｅ１１．５マウス胚。（「Ｅ１０．５」および「Ｅ１１．
５」は、胚の発育日数を示す。「Ｈ」および「Ｌ」は、心臓および肺をそれぞれ
示す。） これらの写真が示すように、胚および成体のマウス由来の組織切片はいずれも
、プローブはバックグラウンドシグナルがほとんど無いか全く無く明確なシグナ
ルを示した。試験した胚の全ての段階および全ての成体組織で、シグナルは、血
管または毛細管における内皮型形態の細胞で制限された。心臓でのシグナルは、
微小血管系に限局された（図７を参照のこと）。

【０１４２】 実施例６ Ｆｃ融合誘導体の調製 本発明のポリペプチドの「Ｆｃ」融合誘導体（例として、マウス種を使用する
）およびポリアミノ酸を、以下のように調製することができる。

【０１４３】 マウスＤｅｌｔａ４のほとんどの細胞外領域（配列番号１のヌクレオチド１〜
１５８７および図１Ａ〜１Ｂ）を、５’末端にＳｐｅＩ部位および３’末端にＮ
ｏｔＩ部位を添加するために以下のオリゴを用いて増幅する： ＧＡＡＣＴＡＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＣＧ（配列番号５
９）および ＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡ（配列番号６０）
。

【０１４４】 ９４℃で１分間の最初の変性後、増幅を、９４℃で１５秒間、５８℃で１５秒
間、および７４℃で１分間を３０サイクルで行った。反応混合物を、１％アガロ
ースゲルで電気泳動して、約１６００塩基対に移動した１本のバンドを切り出し
、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ（登録商標）カラムによって精製した。このフラグメントを
、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｑｉａ
ｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、ＳｐｅＩお
よびＮｏｔＩで消化したヒトＩｇＧのＦｃ領域を含むプラスミドにライゲートし
た。ＮｏｔＩ部位は、マウスポリペプチドの細胞外領域の正常なアミノ酸配列の
５３０位、５３１位、および５３２位の「ＷＶＡ」に換えて３つのアラニン残基
を移入し、マウスポリペプチド配列とＦｃ配列との間にインフレームでライゲー
ションする。次いで、細菌宿主細胞を、このプラスミドで形質転換し、一晩増殖
させる。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを
用いて宿主細胞から単離し、次いで、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化してインサ
ートの存在およびサイズを確認する。約１．６ｋｂのインサートを含む１つのク
ローンを配列決定し、以下をコードすることが示された：ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域
をインフレームで有するマウスポリペプチドの細胞外領域のアミノ酸残基１〜５
２９（アミノ酸配列の５３３位で始まるＦｃ部分を有するそれぞれＤＮＡおよび
アミノ酸配列である配列番号６１および配列番号６２）。

【０１４５】 生検 上記のように、デルタ−Ｎｏｔｃｈシグナリングは、細胞発達、より詳細には
、より特徴づけられた細胞への内皮細胞の分化を調節することが公知である。実
施例４および実施例５に示した研究により、特に、ポリペプチドは、胚および成
体段階の両方で血管内皮に発現するので、器官発達に限定されないが成体の生態
と同様の役割を有することが明らかである。特に、血管新生の場合、デルタ−Ｎ
ｏｔｃｈシグナリングは、血管内への内皮の発達に影響を及ぼすと予想されるで
あろう。血管の発達が腫瘍成長の支持に重要であるので、ポリペプチドと血管新
生との関連により、その効果に適切なアゴニスト（刺激剤）およびアンタゴニス
ト（阻害剤）の同定および／または発生のためのプログラムに使用する「標的」
を得ることができる。

【０１４６】 影響され得る他の内皮細胞生物学の特定の例として、内皮細胞の増殖、移動、
走化性、血管の浸透性の変化（おそらく炎症に関連する）、他の因子（例えば、
メタロプロテイナーゼ、成長因子、および血管新生阻害剤）による内皮細胞産生
の刺激、およびアポトーシスが含まれる。

【０１４７】 上記の本発明は、以下の添付の特許請求の範囲で規定される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 本発明のマウスポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す図である。。

【図１Ｂ】 本発明のマウスポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す図である。マウス
ポリペプチドの膜貫通領域をコードする部分に下線を引いている。

【図２】 推定シグナルペプチド領域（アミノ酸１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２
５、１〜２６、または１〜２７）、推定細胞外ドメイン（アミノ酸２３〜５３２
、２４〜５３２、２５〜５３２、２６〜５３２、２７〜５３２、または２８〜５
３２）、膜貫通領域（アミノ酸５３３〜５５３）、および細胞内／細胞質部分（
アミノ酸配列５５４〜６８６）を含む、図１Ａ〜図１ＢのＤＮＡ分子によってコ
ードされるマウスポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。膜貫通領域に下
線を引いている。

【図３Ａ】 本発明のヒトポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す図である。

【図３Ｂ】 本発明のヒトポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す図である。ポリペプ
チドの膜貫通領域をコードする部分に下線を引いている。

【図４】 推定シグナルペプチド領域（アミノ酸１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２
６、１〜２７、または１〜２８）、推定細胞外ドメイン（アミノ酸２４〜５３１
、２５〜５３１、２６〜５３１、２７〜５３１、２８〜５３１、または２９〜５
３１）、膜貫通領域（アミノ酸５３２〜５５２）、および細胞内／細胞質部分（
アミノ酸配列５５３〜６８５）を含む、図３Ａ〜図３ＢのＤＮＡ分子によってコ
ードされるヒトポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。膜貫通領域に下線
を引いている。

【図５Ａ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（肺）である。

【図５Ｂ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（肺）である。

【図５Ｃ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（肝臓）である。。

【図５Ｄ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（肝臓）である。

【図５Ｅ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（脳）である。

【図５Ｆ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（脳）である。

【図５Ｇ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（脈絡叢）である。

【図５Ｈ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（脈絡叢）である。

【図５Ｉ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（腎臓）である。

【図５Ｊ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（腎臓）である。

【図５Ｋ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（副腎）である。

【図５Ｌ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（副腎）である。

【図５Ｍ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（脾臓）である。

【図５Ｎ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（脾臓）である。

【図５Ｏ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（胸腺）である。

【図５Ｐ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図（胸腺）である。

【図６Ａ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（白色脂肪組織）である。

【図６Ｂ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（白色脂肪組織）である。

【図６Ｃ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（褐色脂肪組織）である。

【図６Ｄ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（褐色脂肪組織）である。

【図６Ｅ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（骨格筋）である。

【図６Ｆ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（骨格筋）である。

【図６Ｇ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（皮膚）である。

【図６Ｈ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（皮膚）である。

【図６Ｉ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（十二指腸）である。

【図６Ｊ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（十二指腸）である。

【図６Ｋ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（膵臓）である。

【図６Ｌ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（膵臓）である。

【図６Ｍ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（卵巣）である。

【図６Ｎ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（卵巣）である。

【図６Ｏ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（精巣）である。

【図６Ｐ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、種々の成体マウスにおけるマウスポリペプチドのｍＲＮＡの発現
パターンを示す図（精巣）である。

【図７Ａ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、受精後１０日と半日目のマウス胚におけるマウスポリペプチドの
ｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。

【図７Ｂ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、受精後１０日と半日目のマウス胚におけるマウスポリペプチドの
ｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。

【図７Ｃ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、受精後１１日と半日目のマウス胚におけるマウスポリペプチドの
ｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。

【図７Ｄ】 「Ｐ標識リボプローブ」を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
って分析した、受精後１１日と半日目のマウス胚におけるマウスポリペプチドの
ｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 17/10 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:91） // Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 スターク，ケビン・エル アメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、 サウザンド・オークス、エマーソン・スト リート・777 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 BA42 BA63 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG00 AG27 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA72X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 BA41 BA53 BA57 CA40 DA01 DA75 EA20 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列
   番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号
   １４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１
   ９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２のポリペプチド、 （ｂ）配列番号４、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２
   ６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１
   、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、
   配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のポリペプチ
   ド、 （ｃ）前記の任意のポリペプチドフラグメント、 （ｄ）少なくとも８０％のアミノ酸配列が同一である、前記の任意のポリペプ
   チドアナログ、 （ｅ）Ｎ末端メチオニン残基も有する、前記の任意のポリペプチド からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む精製哺乳動物ポリペプチド。
2. 【請求項２】 Ｎ末端メチオニン残基を有するか有さない配列番号２６のア
   ミノ酸配列を含むヒトポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）のいずれか
   のアミノ酸配列と９０％またはそれ以上同一である、請求項１に記載のペプチド
   アナログ。
4. 【請求項４】 組換え発現によって作製された、請求項１、請求項２、また
   は請求項３に記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドの生物学的に活性な誘導体。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが合成水溶性ポリマー、検出可能な標識分
   子、またはポリアミノ酸に結合されている、請求項５に記載のポリペプチド誘導
   体。
7. 【請求項７】 前記合成水溶性ポリマーがポリエチレングリコールまたはデ
   キストランである、請求項６に記載のポリペプチド誘導体。
8. 【請求項８】 Ｆｃ融合産物である、請求項６に記載のポリペプチド誘導体
   。
9. 【請求項９】 （ａ）配列番号１または配列番号３のＤＮＡ分子、 （ｂ）同一のポリペプチドをコードする（ａ）のＤＮＡ分子の対立遺伝子変異
   形、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ分子と選択的にハイブリッド形成するＤＮ
   Ａ分子、および （ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のＤＮＡ分
   子とハイブリッド形成するＤＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１に記
   載のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ分子。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のＤＮＡ分子を含む、生物学的に機能的な
    ウイルスベクターまたはプラスミドベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のベクターを含む、原核生物宿主細胞ま
    たは真核生物宿主細胞。
12. 【請求項１２】 配列番号２もしくは配列番号４またはそのフラグメントも
    しくは天然の変異を有する内因性ポリペプチドの発現が促進されるように改変さ
    れた、宿主細胞。
13. 【請求項１３】 単離ヒト宿主細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
14. 【請求項１４】 前記ポリペプチドが発現するように前記ポリペプチドをコ
    ードするＤＮＡ分子を含む宿主細胞を適切な栄養条件で培養し、大量のポリペプ
    チドを作製し、任意に、前記ポリペプチドを含む組成物を調製する工程を包含す
    る、請求項１に記載のポリペプチドの作製法。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体。
16. 【請求項１６】 モノクローナルである、請求項１５に記載の抗体。
17. 【請求項１７】 結合および任意の結合の存在の検出を可能にする条件下で
    同定されるレセプターを有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプ
    チドに結合するレセプターの同定法。
18. 【請求項１８】 任意の細胞において請求項３に記載のＤＮＡを発現するこ
    とができるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。