JP2010213705A - 線維芽細胞増殖因子様ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

【課題】診断および治療において利点を有する新規のポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を同定する。
【解決手段】単離された核酸分子であって、以下：（ａ）特定のヌクレオチド配列（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列（ｃ）特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ｄ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、新規の線維芽細胞増殖因子様（ＦＧＦ様)ポリペプチドおよびそれをコード
する核酸分子に関する。本発明はまた、ベクター、宿主細胞、抗体、およびＦＧＦ様ポリペプチドを産生する方法に関する。ＦＧＦ様ポリペプチドに関連した疾患の診断および処置のための方法もまた提供される。
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現および操作における技術の進歩は、ヒトゲノムの解読に基づいた新規の治療の発見を大いに加速した。急速な核酸配列決定技術は、現在、空前の速度で配列情報を生じ得、そしてコンピューターを使用した分析と結び付いて、ゲノム全体への重複配列の組立ておよびポリペプチドコード領域の同定を可能にする。公知のアミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の顕著な特徴に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。改変体およびその誘導体を産生するための、核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療薬剤として使用するための産物に対して有利な特性を与え得る。
しかし、過去１０年にわたるゲノム研究におけるかなりの技術進歩にかかわらず、ヒトゲノムに基づく新規の治療薬剤の開発可能性は、まだ大部分実現されていない。潜在的に有益なタンパク質治療薬剤をコードする遺伝子、または治療分子について「標的」として作用し得るポリぺプチドをコードする遺伝子は、同定されていない。さらに、多くのヒト遺伝子からのポリペプチド産物の構造的および機能的分析は、行われていない。
従って、本発明の目的は、診断および治療において利点を有する新規のポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を同定することである。
本発明によって、以下が提供される：
（項目１） 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号３に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目２） 単離された核酸分子であって、以下:
（ａ）配列番号２または配列番号４に示すポリペプチドに対して少なくとも約８０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３または（ａ）に示すヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の一領域であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、腫瘍形成活性を有するか、または抗体を生成するための抗原として役立つ、一領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３または（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかのヌクレオチド配列の一領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目３） 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）カルボキシル末端短縮化および／またはアミノ末端短縮化を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮化およびアミノ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）いずれかのヌクレオチド配列の一領域；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目４） 項目１、２または３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目５） 項目４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目６） 真核生物細胞である、項目５に記載の宿主細胞。
（項目７） 原核生物細胞である、項目５に記載の宿主細胞。
（項目８） ＦＧＦ様ポリペプチドを産生するプロセスであって、項目５に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で培養する工程、および必要に応じて、該ポリペプチドを該培養物から単離する工程を包含する、プロセス。
（項目９） 項目８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチド。
（項目１０） 前記核酸分子が、ネイティブなＦＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブなＦＧＦ様ポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、項目８に記載のプロセス。
（項目１１） 前記パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、項目２に記載の単離された核酸分子。
（項目１２） 化合物が、ＦＧＦ様ポリペプチド活性またはＦＧＦ様ポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、項目５、６または７に記載の細胞を、該化合物に曝露する工程、および該細胞中でのＦＧＦ様ポリペプチド活性またはＦＧＦ様ポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
（項目１３） 単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列；および
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６のＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１４） 単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号５または配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のいずれかのオルソログについてのアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約８０パーセント同一であるアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列のフラグメントであって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、腫瘍形成活性を有するか、または抗体の生成のための抗原として役立つ、フラグメント；および
（ｅ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６のＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列；（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１５） 単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１６） 項目１、２または３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
（項目１７） 前記パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、項目１４に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１８） 配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドで動物を免疫することによって産生される、抗体。
（項目１９） 項目１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
（項目２０） モノクローナル抗体である、項目１９に記載の抗体。
（項目２１） 配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
（項目２２） 項目１８、１９もしくは２０のいずれかに記載の抗ＦＧＦ様抗体またはそれらのフラグメントを用いて、ＦＧＦ様ポリペプチドを検出するかまたはＦＧＦ様ポリペプチドの量を定量する方法。
（項目２３） 項目１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
（項目２４） 前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤または抗酸化剤である、項目２３に記載の組成物。
（項目２５） 前記ポリペプチドが、配列番号２に示す成熟アミノ酸配列を含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２６） 項目１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
（項目２７） 水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変されている、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８） 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールまたはデキストランからなる群より選択される、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目２９） 異種のアミノ酸配列に融合された項目１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
（項目３０） 前記異種のアミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、項目２９に記載の融合ポリペプチド。
（項目３１） 医学的状態を処置、予防または改善するための方法であって、患者に、項目１３、１４もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは項目１、２もしくは３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
（項目３２） 医学的状態を処置、予防または改善するための方法であって、患者に、項目１３、１４もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチド、または項目１、２もしくは３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドの生物学的活性のアゴニストもしくはアンタゴニストを、投与する工程を包含する、方法。
（項目３３） 前記処置、予防または改善される医学的状態が、肝硬変または肝臓の他の毒性傷害；炎症性腸疾患、粘膜炎、クローン病または他の胃腸管異常；糖尿病；肥満；神経変性疾患；創傷；角膜上皮、水晶体または網膜組織に対する損傷；急性尿細管壊死の結果としての、尿細管に対する損傷；化学療法後の造血細胞再構築；るいそう症候群（例えば、癌関連悪液質）、多発性硬化症、筋障害；低身長、成熟遅延、過成長（例えば、末端肥大症）、早熟成熟；脱毛症；アンドロゲン標的器官の疾患または異常；乳児性呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、急性呼吸促進症候群または他の肺の異常；眼または他の組織の腫瘍；アテローム性動脈硬化；高コレステロール血症；糖尿病；肥満；発作；骨粗鬆症；変形性関節症；変形性関節病；筋萎縮；低筋肉症；除脂肪体重の減少；禿頭症；しわ；疲労増大；スタミナ減少；心機能低下；免疫系機能不全；癌；パーキンソン病；老年痴呆；アルツハイマー病；および認知機能低下である、項目３１または３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４） 身体の成長または成熟または寿命を調節するための方法であって、患者に、項目１３、１４もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチド、または項目１、２もしくは３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチド、またはそれらの活性のアゴニストもしくはアンタゴニストを、投与する工程を包含する、方法。
（項目３５） 被験体における、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）項目１３、１４もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは項目１、２もしくは３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の、サンプル中での存在または量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
（項目３６） デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適切な膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞が、項目１３、１４または１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞
を備え、該膜が、該タンパク質産物に対して透過性であり、そして該細胞に対して有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
（項目３７） ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）項目１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３８） 前記化合物に結合した場合の前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であって、項目１、２、３または４のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目４０） 項目１、２、３または４のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目４１） 化合物が、ＦＧＦ様ポリペプチド活性またはＦＧＦ様ポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、項目４０に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する工程、および該哺乳動物中でのＦＧＦ様ポリペプチド活性またはＦＧＦ様ポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
（発明の要旨）
本発明は、新規のＦＧＦ様核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
本発明は、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：
（ａ）配列番号１または配列番号３に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
本発明はまた、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：
（ａ）配列番号２または配列番号４に示すポリペプチドに対して少なくとも約８０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３または（ａ）に示すヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の一領域であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、腫瘍形成活性を有するか、または抗体を生成するための抗原として役立つ、一領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３または（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかのヌクレオチド配列の一領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）カルボキシル末端短縮化および／またはアミノ末端短縮化を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮化およびアミノ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）いずれかのヌクレオチド配列の一領域；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列；および
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列。
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号５または配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のいずれかのオルソログについてのアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約８０パーセント同一であるアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列のフラグメントであって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、腫瘍形成活性を有するか、または抗体の生成のための抗原として役立つ、フラグメント；および
（ｅ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列；（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列。
本発明はさらに、単離されたポリペプチドを提供し、この核酸分子は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、１以上のＦＧＦレセプターを活性化するか、肝臓もしくは膵臓内の細胞の増殖および分化を調節するか、肝臓もしくは膵臓からの分泌後に他の細胞型を調節するか、肝臓もしくは膵臓走化性において役割を果たすか、または腫瘍形成活性を有する、アミノ酸配列。
本発明はまた、上記の核酸分子を含む発現ベクター、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、ならびにこの宿主細胞を培養する工程および必要に応じてこのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含するＦＧＦ様ポリペプチドを産生する方法を提供する。
ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた本発明によって包含される。ＦＧＦ様核酸分子は、発現および増大したレベル（これは、増大した循環レベルを含み得る）のＦＧＦ様ポリペプチドを可能にする様式で動物中に導入される。あるいは、ＦＧＦ様核酸分子は、内因性ＦＧＦ様ポリペプチドの発現を妨害するような様式で動物中に導入される（すなわち、ＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する)。トランスジェニック非ヒト動物は
、好ましくは哺乳動物であり、そしてより好ましくはげっ歯動物（例えば、ラットまたはマウス)である。好ましくは、ＦＧＦ様導入遺伝子は、アポリポタンパク質のＥプロモー
ターの制御下で肝臓において、またはβ−アクチンプロモーターの制御下で普遍的に発現される。
本発明のＦＧＦ様ポリペプチドの誘導体、本発明のＦＧＦ様ポリペプチドの融合ポリペプチド、および本発明のＦＧＦ様ポリペプチドを特異的に結合する抗体もまた提供される。
本発明のヌクレオチドまたはポリペプチド、およびキャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤もしくは抗酸化剤、または薬学的に受容可能な他の薬剤を含む組成物もまた本発明によって包含される。この組成物としては、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物およびこのポリペプチドおよび核酸分子を用いる方法が挙げられ得る。
驚くべきことに、ＦＧＦ様ポリペプチドは、肝臓（ノーザン分析）および膵島（インサイチュ分析）において主に発現されるようであり、それにより、これは、ＦＧＦファミリーの他の全てのメンバーとは区別される。それゆえ、本発明のポリペプチドおよびその有用な核酸中間体は、肝臓細胞または膵島細胞をバックグラウンドから分化させる際に有用性を有し得る。さらに、ＦＧＦ様ポリペプチド発現の局在、ＦＧＦファミリーのメンバーに対するＦＧＦ様ポリペプチドの構造的類似性、およびＦＧＦ様ポリペプチドが血流（ここで、このポリペプチドは、遠位の部位に効果を発揮し得る）中に分泌される可能性を考慮すると、本発明のポリペプチドは、特に、治療薬学的組成物として、肝臓内もしくは肝臓近傍の細胞の刺激、腸の細胞活性の調節、膵島内もしくは膵島近傍の細胞の刺激、ニューロン細胞の調節、血管新生の刺激もしくは阻害、肉芽組織の上皮もしくは間葉成分の刺激、角膜上皮、水晶体もしくは網膜組織の刺激、尿細管の再生、造血細胞の調節、毛包増殖の調節、肺上皮の調節、または上皮、間葉、造血、またはニューロンの細胞もしくは組織いずれかの刺激において利益を提供し得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドはまた、増殖または脂肪沈着インヒビターとして有用であり得、それゆえ、過成長（例えば、末端肥大症）、早熟成熟、肥満または糖尿病の処置において有用であり得る。ＦＧＦ様ポリペプチドとそれらのレセプターとの相互作用を妨害するインヒビター（例えば、抗体、結合タンパク質または低分子）は、身体の成長および成熟を刺激する際に有用であり得る。それゆえ、このようなインヒビターは、低身長、成熟遅延または成長ホルモンもしくはそのメディエーターであるインスリン様増殖因子のシグナル伝達の欠損に一般的に関連している他の状態の処置において有用であり得る。
本発明のＦＧＦ様ポリペプチドおよび核酸分子、またはそれらの生物学的活性のアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下のような医学的状態を処置、予防および／または検出するために治療または診断の目的で使用され得る：肝硬変または肝臓の他の毒性傷害；炎症性腸疾患、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、クローン病、または他の胃腸管異常；糖尿病；肥満；神経変性疾患；創傷；角膜上皮、水晶体または網膜組織に対する損傷；急性尿細管壊死の結果としての、尿細管に対する損傷；化学療法後の造血細胞再構築；るいそう症候群（例えば、癌関連悪液質）、多発性硬化症、筋障害；低身長、成熟遅延、過成長（例えば、末端肥大症）、早熟成熟；脱毛症；アンドロゲン標的器官の疾患または異常；乳児性呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、急性呼吸促進症候群または肺の他の異常；眼または他の組織の腫瘍；アテローム性動脈硬化；高コレステロール血症；糖尿病；肥満；発作；骨粗鬆症；変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；変形性関節病（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ）；筋萎縮；低筋肉症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）；除脂肪体重の減少；禿頭症；しわ；疲労増大；スタミナ減少；心機能低下；免疫系機能不全；癌；パーキンソン病；老年痴呆；アルツハイマー病；および認知機能低下。本発明は、ＦＧＦ様ポリペプチドを動物に投与する工程を包含する、障害の処置、予防または改善を提供する。本発明はまた、動物におけるそのような障害またはそのような障害に対する感受性を診断する方法を提供し、この方法は、ＦＧＦ様ポリペプチドの発現の存在または量を決定する工程、およびＦＧＦ様ポリペプチドの発現の存在または量に基づいてこのような障害またはこのような障害に対する感受性を診断する工程の両方を含む。この動物は、好ましくは哺乳動物であり、そしてより好ましくはヒトである。本発明はまた、上記のような障害の処置のための医薬の製造のための方法に関する。
本発明はまた、上記に列挙した同じ疾患の処置のための、および腫瘍の処置のための、抗体、またはＦＧＦ様ポリペプチドのそのレセプターに対する結合の他のインヒビターの使用を提供する。
本発明はまた、ＦＧＦ様ポリペプチドに結合する試験分子を同定する方法を提供し、ここで、この方法は、ＦＧＦ様ポリペプチドを試験分子と接触させる工程、およびこのポリペプチドに対する試験分子の結合程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＦＧＦ様ポリペプチドのアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを決定する工程を包含する。
本発明はまた、ＦＧＦ様ポリペプチドの発現またはＦＧＦ様ポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
ＦＧＦ様ポリペプチドの発現を調節し、そしてＦＧＦ様ポリペプチドのレベルを調節する（すなわち、増大または減少させる）方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法では、ＦＧＦ様ポリペプチドの発現を調節するエレメントを含む核酸分子が投与され得る。これらの方法の例としては、遺伝子治療およびアンチセンス治療が挙げられる。
図１は、マウスＦＧＦ様遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびマウスＦＧＦ様タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号４）を図示する。 図２Ａ〜図２Ｂは、ヒトＦＧＦ様遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＦＧＦ様タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を図示する。 図２Ａ〜図２Ｂは、ヒトＦＧＦ様遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＦＧＦ様タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を図示する。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＦＧＦ様タンパク質（ｈＡｇｐ−２６２５７；配列番号２）、マウスＦＧＦ様タンパク質（ｍＡｇｐ−２６２５７；配列番号４）、ヒトＦＧＦ−１４（Ｈｆｇｆｌ４；配列番号１６）、マウスＦＧＦ−１４（Ｍｆｇｆｌ４；配列番号２６）、ヒトＦＧＦ−１２（Ｈｆｇｆｌ２；配列番号１５）、マウスＦＧＦ−１３（Ｍｆｇｆｌ３；配列番号２５）、ヒトＦＧＦ−５（Ｈｆｇｆ５；配列番号２０）、マウスＦＧＦ−５（Ｍｆｇｆ５；配列番号３０）、ヒトＦＧＦ−６（Ｈｆｇｆ６；配列番号２１）、マウスＦＧＦ−６（Ｍｆｇｆ６；配列番号３１）、ヒトＦＧＦ−４（Ｈｆｇｆ４；配列番号１９）、マウスＦＧＦ−４（Ｍｆｇｆ４；配列番号２９）、ヒトＦＧＦ−３（Ｈｆｇｆ３；配列番号１８）、マウスＦＧＦ−３（Ｍｆｇｆ３；配列番号２８）、ヒトＦＧＦ−７（Ｈｆｇｆ７；配列番号２２）、マウスＦＧＦ−７（Ｍｆｇｆ７；配列番号３２）、ヒトＦＧＦ−９（Ｈｆｇｆ９；配列番号２３）、マウスＦＧＦ−９（Ｍｆｇｆ９；配列番号３３）、ヒトＦＧＦ−１、（Ｈｆｇｆ１；配列番号１４）、マウスＦＧＦ−１（Ｍｆｇｆ１；配列番号２４）、ヒトＦＧＦ−２（Ｈｆｇｆ２；配列番号１７）、マウスＦＧＦ−２（Ｍｆｇｆ２；配列番号２７）および得られるＦＧＦコンセンサス配列（ｃｏｎｓ）のアミノ酸配列整列を図示する。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＦＧＦ様タンパク質（ｈＡｇｐ−２６２５７；配列番号２）、マウスＦＧＦ様タンパク質（ｍＡｇｐ−２６２５７；配列番号４）、ヒトＦＧＦ−１４（Ｈｆｇｆｌ４；配列番号１６）、マウスＦＧＦ−１４（Ｍｆｇｆｌ４；配列番号２６）、ヒトＦＧＦ−１２（Ｈｆｇｆｌ２；配列番号１５）、マウスＦＧＦ−１３（Ｍｆｇｆｌ３；配列番号２５）、ヒトＦＧＦ−５（Ｈｆｇｆ５；配列番号２０）、マウスＦＧＦ−５（Ｍｆｇｆ５；配列番号３０）、ヒトＦＧＦ−６（Ｈｆｇｆ６；配列番号２１）、マウスＦＧＦ−６（Ｍｆｇｆ６；配列番号３１）、ヒトＦＧＦ−４（Ｈｆｇｆ４；配列番号１９）、マウスＦＧＦ−４（Ｍｆｇｆ４；配列番号２９）、ヒトＦＧＦ−３（Ｈｆｇｆ３；配列番号１８）、マウスＦＧＦ−３（Ｍｆｇｆ３；配列番号２８）、ヒトＦＧＦ−７（Ｈｆｇｆ７；配列番号２２）、マウスＦＧＦ−７（Ｍｆｇｆ７；配列番号３２）、ヒトＦＧＦ−９（Ｈｆｇｆ９；配列番号２３）、マウスＦＧＦ−９（Ｍｆｇｆ９；配列番号３３）、ヒトＦＧＦ−１、（Ｈｆｇｆ１；配列番号１４）、マウスＦＧＦ−１（Ｍｆｇｆ１；配列番号２４）、ヒトＦＧＦ−２（Ｈｆｇｆ２；配列番号１７）、マウスＦＧＦ−２（Ｍｆｇｆ２；配列番号２７）および得られるＦＧＦコンセンサス配列（ｃｏｎｓ）のアミノ酸配列整列を図示する。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＦＧＦ様タンパク質（ｈＡｇｐ−２６２５７；配列番号２）、マウスＦＧＦ様タンパク質（ｍＡｇｐ−２６２５７；配列番号４）、ヒトＦＧＦ−１４（Ｈｆｇｆｌ４；配列番号１６）、マウスＦＧＦ−１４（Ｍｆｇｆｌ４；配列番号２６）、ヒトＦＧＦ−１２（Ｈｆｇｆｌ２；配列番号１５）、マウスＦＧＦ−１３（Ｍｆｇｆｌ３；配列番号２５）、ヒトＦＧＦ−５（Ｈｆｇｆ５；配列番号２０）、マウスＦＧＦ−５（Ｍｆｇｆ５；配列番号３０）、ヒトＦＧＦ−６（Ｈｆｇｆ６；配列番号２１）、マウスＦＧＦ−６（Ｍｆｇｆ６；配列番号３１）、ヒトＦＧＦ−４（Ｈｆｇｆ４；配列番号１９）、マウスＦＧＦ−４（Ｍｆｇｆ４；配列番号２９）、ヒトＦＧＦ−３（Ｈｆｇｆ３；配列番号１８）、マウスＦＧＦ−３（Ｍｆｇｆ３；配列番号２８）、ヒトＦＧＦ−７（Ｈｆｇｆ７；配列番号２２）、マウスＦＧＦ−７（Ｍｆｇｆ７；配列番号３２）、ヒトＦＧＦ−９（Ｈｆｇｆ９；配列番号２３）、マウスＦＧＦ−９（Ｍｆｇｆ９；配列番号３３）、ヒトＦＧＦ−１、（Ｈｆｇｆ１；配列番号１４）、マウスＦＧＦ−１（Ｍｆｇｆ１；配列番号２４）、ヒトＦＧＦ−２（Ｈｆｇｆ２；配列番号１７）、マウスＦＧＦ−２（Ｍｆｇｆ２；配列番号２７）および得られるＦＧＦコンセンサス配列（ｃｏｎｓ）のアミノ酸配列整列を図示する。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＦＧＦ様タンパク質（ｈＡｇｐ−２６２５７；配列番号２）、マウスＦＧＦ様タンパク質（ｍＡｇｐ−２６２５７；配列番号４）、ヒトＦＧＦ−１４（Ｈｆｇｆｌ４；配列番号１６）、マウスＦＧＦ−１４（Ｍｆｇｆｌ４；配列番号２６）、ヒトＦＧＦ−１２（Ｈｆｇｆｌ２；配列番号１５）、マウスＦＧＦ−１３（Ｍｆｇｆｌ３；配列番号２５）、ヒトＦＧＦ−５（Ｈｆｇｆ５；配列番号２０）、マウスＦＧＦ−５（Ｍｆｇｆ５；配列番号３０）、ヒトＦＧＦ−６（Ｈｆｇｆ６；配列番号２１）、マウスＦＧＦ−６（Ｍｆｇｆ６；配列番号３１）、ヒトＦＧＦ−４（Ｈｆｇｆ４；配列番号１９）、マウスＦＧＦ−４（Ｍｆｇｆ４；配列番号２９）、ヒトＦＧＦ−３（Ｈｆｇｆ３；配列番号１８）、マウスＦＧＦ−３（Ｍｆｇｆ３；配列番号２８）、ヒトＦＧＦ−７（Ｈｆｇｆ７；配列番号２２）、マウスＦＧＦ−７（Ｍｆｇｆ７；配列番号３２）、ヒトＦＧＦ−９（Ｈｆｇｆ９；配列番号２３）、マウスＦＧＦ−９（Ｍｆｇｆ９；配列番号３３）、ヒトＦＧＦ−１、（Ｈｆｇｆ１；配列番号１４）、マウスＦＧＦ−１（Ｍｆｇｆ１；配列番号２４）、ヒトＦＧＦ−２（Ｈｆｇｆ２；配列番号１７）、マウスＦＧＦ−２（Ｍｆｇｆ２；配列番号２７）および得られるＦＧＦコンセンサス配列（ｃｏｎｓ）のアミノ酸配列整列を図示する。 図４Ａは、（Ａ）マウスＦＧＦ様ポリペプチド発現のノーザンブロット分析の結果を図示する。 図４Ｂは、（Ｂ）ヒトＦＧＦ様ポリペプチド発現のノーザンブロット分析の結果を図示する。 図４Ｃは、（Ｃ）ヒトＦＧＦ様ポリペプチド発現のドットブロット分析の結果を図示する。
（発明の詳細な説明）
本明細書におけるセクションの見出しは、組織化の目的のみのためであり、そこに記載される対象物を限定すると解釈されるべきではない。本出願において引用される全ての参考文献は明らかに、本明細書中に参考として援用される。
（定義）
用語「ＦＧＦ様核酸分子」とは、配列番号１もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列から本質的になる核酸分子、配列番号２もしくは配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２もしくは配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的になる核酸分子、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を含むか、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６２６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列から本質的になる核酸分子、あるいはこれらに関連する核酸分子をいう。
関連する核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列と約８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこのようなヌクレオチド配列から本質的になるか、あるいは配列番号２もしくは配列番号４に示されるポリペプチドと約８０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこのようなヌクレオチド配列から本質的になる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に、約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるか、あるいはこのヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号４に示されるポリペプチド配列に、約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるポリペプチドをコードする。関連する核酸分子はまた、上記のＦＧＦ様核酸分子のフラグメントを含み、このフラグメントは、少なくとも約１６連続したヌクレオチド、または約１８、または約２０、または約２５、または約５０、または約７５、または約１００、または約１００より多く連続したヌクレオチドである。関連する核酸分子はまた、上記のＦＧＦ様核酸分子のフラグメントを含み、このフラグメントは、少なくとも約２５のアミノ酸残基、または約５０、または約７５、または約１００、または約１００より多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする。
関連する核酸分子はまた、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つのＦＧＦ様ポリペプチド活性を保持する、ヌクレオチド配列、または少なくとも１つのアミノ酸の挿入を有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つのＦＧＦ様ポリペプチド活性を保持する、ヌクレオチド配列、または少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つのＦＧＦ様ポリペプチド活性を保持する、ヌクレオチド配列を含む。関連する核酸分子はさらに、Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つのＦＧＦ様ポリペプチド活性を保持する、ヌクレオチド配列を含む。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される改変の組合せを有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このポリペプチドは、少なくとも１つのＦＧＦ様ポリペプチド活性を保持する、ヌクレオチド配列を含む。
関連するＦＧＦ様核酸分子は、本明細書に定義される中程度または高度にストリンジェントな条件下で、上記の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むような分子を含む。好ましい実施形態では、関連する核酸分子は、中程度もしくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号３に示される配列とハイブリダイズする配列、またはポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号２または４に示される配列を含む）をコードする分子とハイブリダイズする配列、または上記に定義される核酸フラグメントとハイブリダイズする配列、または上記に定義されるポリペプチドをコードする核酸フラグメントとハイブリダイズする配列を含む。関連する核酸分子が上記の核酸のいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含むこと、そして上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含むこともまた理解される。
用語「単離された核酸分子」とは、天然で会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子を含まない、そして好ましくは、タンパク質産生またはその治療的使用もしくは診断的使用におけるその使用を妨害する何の他の夾雑哺乳動物核酸分子をも実質的に含まない、本発明の核酸分子をいう。
用語「対立遺伝子改変体」とは、生物または生物集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める、いくつかの可能性のある天然に存在する別の形態の遺伝子の１つをいう。
用語「スプライス改変体」とは、ＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される核酸分子（通常、ＲＮＡ）をいう。
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞における増殖に適切であり、かつ挿入された異種核酸配列の発現を指向および／または制御する核酸配列を含む、ベクターをいう。発現は、転写、翻訳およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスを含むがこれらに限定されない。
用語「高度なストリンジェンシーの条件」とは、以下の条件をいう：(1)洗浄に関して
低イオン強度試薬および高温（例えば、５０℃にて０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ＮａＤｏｄＳＯ4（ＳＤＳ））を用いる条件、ま
たは（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドのような変性剤を用いる条件（例えば、４２℃での、０．１％ウシ血清アルブミン、０．２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸ナトリウムを有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド）。別の例は、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での４２℃での洗浄を伴う、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸の使用である。
用語「中程度なストリンジェンシーの条件」とは、上記よりもストリンジェントの低い、洗浄溶液およびハイブリダイゼーションの条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳの百分率）の使用を一般に含む条件を言う。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｌ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーション、続いて、約３７℃〜５０℃での１×ＳＳＣ中での洗浄のような条件である。当業者は、プローブの長さなどの要因に適合するように必要に応じて温度、イオン強度などをどのようにして調整するかを認識する。
オリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする特定の好ましい実施形態では、標的配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの融解温度（Ｔm）に依存する高ストリンジェンシー条件が用いられる。Ｔmは、以下の式（Ｂｏｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８：１３９０（１９６２））を用いて評価され得る：
Ｔm＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／
Ｎ）
ここで、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション（または洗浄）溶液中でのナトリウムイオン濃度であり；
％Ｇ＋Ｃは、オリゴヌクレオチドプローブ中でのグアニンおよびシトシンの含有量であり；そして
Ｎは、ヌクレオチド中のプローブの長さである。
高ストリンジェンシー溶液の一例は、オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存して、３５℃〜６３℃の温度での６×ＳＳＣおよび０．０５％ピロリン酸ナトリウムである。例えば、特定の実施形態によれば、１４塩基対のプローブは３５℃〜４０℃で洗浄され、１７塩基のプローブは４５℃〜５０℃で洗浄され、２０塩基対のプローブは５２℃〜５７℃で洗浄され、そして２３塩基対のプローブは５７℃〜６３℃で洗浄される。バックグラウンドの非特異的結合が高く出現する場合、温度を２℃〜３℃上昇させ得る。第２の高ストリンジェンシー溶液は、オリゴヌクレオチドプローブを洗浄するために塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を利用する。１つのストリンジェントな洗浄溶液は、３Ｍ ＴＭＡＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０および０．２％ ＳＤＳである。この溶液を用いた洗浄温度は、プローブの長さの関数である。例えば、１４塩基対のプローブは３５℃〜４０℃で洗浄され、１７塩基対のプローブは約４５℃〜５０℃で洗浄され、２０塩基対のプローブは５２℃〜５７℃で洗浄され、そして２３塩基対のプローブは５７℃〜６３℃で洗浄される。
用語「ＦＧＦ様ポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４および関連するポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。関連するポリペプチドとしては、以下が挙げられる：対立遺伝子改変体；スプライス改変体；フラグメント；誘導体；置換改変体、欠失改変体、および挿入改変体；融合ポリペプチド；ならびにオルソログ。ＦＧＦ様ポリペプチドは、本明細書に定義されるような成熟ポリペプチドであり得、そしてこれらを調製する方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
用語「ＦＧＦ様ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列番号４に示されるＦＧＦ様ポリペプチドの全長未満のアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドをいう。このようなフラグメントは、例えば、アミノ末端での短縮化、カルボキシル末端の短縮化、および／またはアミノ酸配列からの残基の内部欠失から生じ得る。ＦＧＦ様フラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングからか、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。
用語「ＦＧＦ様ポリペプチド改変体」とは、配列番号２または配列番号４に記載のＦＧＦ様ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列を含むＦＧＦ様ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在し得るか、または人工的に構築され得る。このようなＦＧＦ様ポリペプチド改変体は、このような改変体をコードする対応する核酸分子から調製され得る。この核酸分子は、配列番号１または配列番号３に記載の野生型ＦＧＦ様ポリペプチドについてのＤＮＡ配列から、それに応じて変化しているＤＮＡ配列を有する。
用語「ＦＧＦ様融合ポリペプチド」とは、ＦＧＦ様ポリペプチド、そのフラグメント、改変体または誘導体と、異種ペプチドまたはポリペプチドとの融合物をいう。
用語「ＦＧＦ様ポリペプチド誘導体」とは、例えば、１つ以上のポリマー（水溶性ポリマー、Ｎ結合型糖質、Ｏ結合型糖質、糖、リン酸、および／または他のこのような分子を含むがこれらに限定されない）の共有結合によって、化学的に修飾されている、ＦＧＦ様ポリペプチド、その改変体またはフラグメントをいう。この誘導体は、ポリペプチドに結合した分子の種類または位置のいずれかの点で、天然に存在するＦＧＦ様ポリペプチドとは異なる様式で改変される。誘導体はさらに、ＦＧＦ様ポリペプチドに天然に結合された１つ以上の化学基の欠失を含む。
用語「生物学的に活性なＦＧＦ様ポリペプチド」、「生物学的に活性なＦＧＦ様ポリペプチドフラグメント」、「生物学的に活性なＦＧＦ様ポリペプチド改変体」、および「生物学的に活性なＦＧＦ様ポリペプチド誘導体」とは、ＦＧＦ様ポリペプチドの少なくとも１つの活性の特徴（例えば、肝臓内もしくは肝臓近傍の細胞の刺激、腸の細胞活性の調節、膵島内または膵島近傍の細胞の刺激、ニューロン細胞の調節、血管新生の刺激もしくは阻害、肉芽組織の上皮もしくは間葉成分の刺激、角膜上皮、水晶体もしくは網膜組織の刺激、尿細管の再生、造血細胞の調節、毛包増殖の調節、肺上皮の調節、または上皮、間葉、造血、ニューロンのいずれかの細胞もしくは組織の刺激）を有するＦＧＦ様ポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む）をいう。一般に、ＦＧＦ様ポリペプチド、ならびにその改変体、フラグメントおよび誘導体は、上記に列挙した活性のような、ＦＧＦ様ポリペプチドの少なくとも１つの活性の特徴を有する。さらに、ＦＧＦ様ポリペプチドは、免疫原として活性であり得る（すなわち、このポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む）。
「天然に存在する」とは、生物学的材料（例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞など）に関連して使用される場合、天然に見出されるが、ヒトによって操作されていないものをいう。
用語「単離されたポリペプチド」とは、その天然の環境において見出される少なくとも１つの夾雑ポリペプチドを含まない、好ましくはタンパク質産生またはその治療的使用もしくは診断的使用におけるその使用を妨害する何の他の夾雑哺乳動物ポリペプチドをも実質的に含まない、本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、本発明の核酸分子をいう。
用語「オルソログ」とは、異なる種から同定されたポリペプチドに対応するポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＦＧＦ様ポリペプチドは、互いにオルソログとみなされる。
用語「成熟ＦＧＦ様ポリペプチド」とは、リーダー配列を欠くポリペプチドをいい、そしてポリペプチドの他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解プロセシング、より大きな前駆体からの、より小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化、ならびに当業者によって理解される他の翻訳後修飾もまた含み得る。
用語「有効量」および「治療的に有効な量」とは、上記のＦＧＦ様ポリペプチドの観察可能なレベルの１つ以上の生物学的活性を支持するために有用な、または必要なＦＧＦ様ポリペプチドの量をいう。
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、当該分野で公知のように、２つ以上のポリペプチド分子の配列間の関係、または２つ以上の核酸分子の配列間の関係であって、これらの配列を比較することによって決定される、関係をいう。当該分野では、「同一性」はまた、場合によって、ヌクレオチド配列のストリング間またはアミノ酸配列のストリング間の一致により決定された、ポリペプチド分子配列間または核酸分子配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の算術モデルのコンピュータープログラム（すなわち、アルゴリズム）によって扱われた、ギャップ整列を伴った２つ以上の配列の間の同一の一致のパーセントを測定する。
用語「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、関連した概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一の一致および保存的置換の一致の両方を含む類似性の尺度をいう。保存的置換はポリペプチドに適用され、そして核酸分子には適用されないので、類似性は、ポリペプチド配列の比較のみを扱う。２つのポリペプチド配列が、例えば、２０個のうちの１０個が同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換であるならば、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、さらに５つの位置において保存的置換があるならば、同一性パーセントは、５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（２０のうちの１５）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド配列の間の類似性の程度は、これらの２つの配列の間の同一性パーセントよりも高い。
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響のないような、非ネイティブな残基による、ネイティブなアミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基の、任意の他の非極性残基による置換から生じる。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載された（Ｃｕｎｎｉｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−８５（１９８９））ように、アラニンで置換され得る。保存的アミノ酸置換についての一般的法則を、表Ｉに示す。
Figure 2010213705
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって代表的に取り込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含する。これらとしては、ペプチド模倣物、および他の逆形態（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｆｏｒｍ）または逆転した形態（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｆｏｒｍ）のアミノ酸部分が挙げられる。
アミノ酸配列に対する保存的な改変（およびコードするヌクレオチドに対する対応する改変）は、天然に存在するＦＧＦ様ポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴に類似した機能的特徴および化学的特徴を有するＦＧＦ様ポリペプチドを生成すると予想される。対照的に、ＦＧＦ様ポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成され得る：（ａ）置換領域における分子骨格の構造（例えば、シートコンホメーションもしくはらせんコンホメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）大部分の側鎖。天然に存在する残基は、側鎖の共通の特性に基づいてグループに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーへの交換を含み得る。このような置換された残基は、ヒトＦＧＦ様ポリペプチドのうちの非ヒトＦＧＦ様ポリペプチドと相同性である領域、またはこの分子のうちの非相同性領域に導入され得る。
関連した核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、以下に記載される方法を含むがこれらに限定されない、公知の方法によって容易に算出され得る：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄａｔａ（第１部，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）。
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間で最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化される。２つの配列の間の同一性および類似性を決定するために好適なコンピュータープログラム方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージ。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，前出）から公に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために用いられ得る。
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を使用して、配列同一性パーセントが決定されるべき２つのポリペプチドは、それらのそれぞれのアミノ酸の最適の一致（このアルゴリズムによって決定したときの「一致したスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）について整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均ダイアゴナルの３倍として計算され；「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリクスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリクスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（これは、通常ギャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリクスがこのアルゴリズムとともに使用される。標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスについてＤａｙｈｏｆｆら、５ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３ １９７８）を参照のこと；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスについてＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ
８９：１０９１５−１９（１９９２）を参照のこと）もまたこのアルゴリズムによって使用される。
ポリペプチドの配列比較に好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３（１９７０）、
比較マトリクス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ ６２、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.８９：１０９１５
−１９（１９９２）より、
ギャップペナルティー（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２、
ギャップレングスペナルティー（Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）：４、
類似性の閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０。
ＧＡＰプログラムは、上記パラメーターについて有用である。上記パラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを使用してポリペプチド比較についてのデフォルトパラメーター（末端ギャップについてペナルティーなしで）である。
核酸分子の配列比較について好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３（１９７０）、
比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０、
ギャップペナルティー：５０、
ギャップレングスペナルティー：３。
ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメーターについて有用である。上記パラメーターは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメーターである。
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリクス、類似性の閾値などが当業者によって使用され得、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ９，１９９７年９月に記載されるものを含む。なされる特定の選択は、なされる特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、タンパク質−タンパク質間、タンパク質−ＤＮＡ間）；さらに、比較が所定の配列対の間でなされる（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）か、一つの配列と大きな配列データベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）でなされるか）に依存する。
単離されたマウスｃＤＮＡ（マウスＦＧＦ様タンパク質；配列番号３）の配列分析は、これが、ＦＧＦファミリーのタンパク質の新規のメンバーをコードすることを示した。マウスＦＧＦ様遺伝子は、２１０アミノ酸のタンパク質をコードする６３０ｂｐのオープンリーディングフレームを含む（図１）。このマウス配列を用いて、ヒトＦＧＦ様オルソログを同定した。４つのヒトＦＧＦ様ポリペプチドｃＤＮＡクローンの配列分析は、ヒトＦＧＦ様遺伝子が、２０９アミノ酸のタンパク質をコードする６２７ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことを示した（図２Ａ〜図２Ｂ）。
図３Ａ〜図３Ｄは、ヒトＦＧＦ様タンパク質、マウスＦＧＦ様タンパク質およびＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列整列を図示する。ＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースのＦＡＳＴＡプログラムを用いた推定マウスＦＧＦ様ポリペプチドのコンピューター分析は、このタンパク質がマウスＦＧＦ−６、ＦＧＦ−１５およびＦＧＦ−４に最も密接に関連していることを示した。ＧＡＰプログラムを用いて、マウスＦＧＦ様ポリペプチドは、マウスＦＧＦ−６に対して３２％同一であり、そしてマウスＦＧＦ−４に対して２８％同一であることが見出された。コンピューター分析はまた、マウスＦＧＦ様ポリペプチドが、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−１５と同様に、しかし、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２とは対照的に、そのアミノ末端に潜在的シグナルペプチドを保有することを示した。マウスＦＧＦ様ポリペプチドは、ヒトＦＧＦ様タンパク質に対して７９％同一である。
（核酸分子）
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）に記載される方法である。
本発明は、本明細書中に記載される核酸分子およびこのような分子を得るための方法を提供する。ＦＧＦ様ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする遺伝子またはｃＤＮＡがゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによって、またはＰＣＲ増幅によって得られ得る。ハイブリダイゼーションによってライブラリーをスクリーニングするために有用なプローブまたはプライマーは、同じ遺伝子ファミリーまたは関連した遺伝子ファミリーからの他の公知の遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、保存されたモチーフなど）についての配列情報に基づいて作製され得る。さらに、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子が一つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部は、他の種からの対応する遺伝子(オルソログ）また
は同じ種からの関連する遺伝子（ホモログ）を同定するためのプローブとして使用され得る。プローブまたはプライマーは、ＦＧＦ様遺伝子を発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配列番号１または配列番号３に示す配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングして、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度または高度のストリンジェンシーの条件は、スクリーニングのために使用されてスクリーニングから得られた偽陽性の数を最小にする。
ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸分子はまた、発現クローニング（これは、発現されたタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を使用する）によって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、発現されそして宿主細胞表面に提示されたクローン化タンパク質への抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、検出可能な標識を用いて修飾されて、所望のクローンを発現する細胞が同定される。
ＦＧＦ様ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４（１９８９）に記載される化学合成のような、当業者に周知の方法を使用する化学合成である。これらの方法としては、特に、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、およびＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用するポリマー支持合成である。代表的には、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドよりも長い核酸は、これらの方法を使用していくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、このフラグメントは一緒に連結されて、全長ＦＧＦ様ポリペプチドを形成し得る。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧ（これは、メチオニン残基をコードする）を有する。このメチオニンは、宿主細胞中で産生されるポリペプチドが、その細胞から分泌されるように設計されるか否かに依存して、ＦＧＦ様ポリペプチドの成熟形態に存在してもよいし存在しなくてもよい。
いくつかの場合、ＦＧＦ様ポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望され得る。改変体をコードする核酸分子は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅または他の適切な方法を用いて産生され得、ここで、プライマーは、所望の点変異を有する（変異誘発技術の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出およびＡｕｓｕｂｅｌら，前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら，前出によって記載される方法を用いた化学合成もまた、このような改変体を調製するために用いられ得る。当業者に公知の他の方法もまた使用され得る。
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＦＧＦ様ポリペプチドの最適な発現のために変更されているコドンを含む。特定のコドンの変更は、発現について選択されるＦＧＦ様ポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって、例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって行われ得る。高度に発現される細菌遺伝子のコドンの優先度についての「Ｅｃｏｈｉｇｈ． Ｃｏｄ」のようなコドン頻度の表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって提供されている。他の有用なコドン頻度の表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
他の実施形態において、核酸分子は、上で定義されるような保存的アミノ酸置換をともなうＦＧＦ様改変体、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位またはＯ結合型グリコシル化部位の付加および／または欠失を含むＦＧＦ様改変体、一つ以上のシステイン残基の欠失および／または置換を含むＦＧＦ様改変体、あるいは上記のＦＧＦ様ポリペプチドフラグメントをコードする。さらに、核酸分子は、本明細書中に記載されるＦＧＦ様改変体、フ
ラグメント、および融合ポリペプチドの任意の組み合わせをコードし得る。
（ベクターおよび宿主細胞）
ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。ベクターは、代表的には、使用される特定の宿主細胞において機能的である（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように宿主細胞機構と適合性である）ように選択される。ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＦＧＦ様ポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）されるか否かに一部依存する。そうなら、酵母、昆虫または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、１８５ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
代表的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（特定の実施形態において集合的に「隣接配列」と呼ばれる）は、代表的には、以下のヌクレオチドのうちの１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位およびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメント。これらの配列の各々は以下に議論される。
必要に応じて、ベクターは、「タグ」配列、すなわちＦＧＦ様ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得；このオリゴヌクレオチド分子は、ポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）、あるいは市販の抗体が存在する、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）インフルエンザウイルス）またはｍｙｃのような他の「タグ」をコードする。このタグは、代表的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、そしてタグは宿主細胞からのＦＧＦ様ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリクスとして使用してカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは後に、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＦＧＦ様ポリペプチドから除去され得る。
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（すなわち、宿主細胞の種または株とは異なる種または株由来）、ハイブリッド（すなわち、１つより多い供給源由来の隣接配列の組み合わせ）もしくは合成であり得るか、または隣接配列は、ＦＧＦ様発現を制御するように通常機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、隣接配列が宿主細胞機構において機能的であり活性化され得るならば、任意の原核生物、任意の真核生物、任意の脊椎動物生物、任意の無脊椎動物生物、または任意の植物であり得る。
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、ＦＧＦ様遺伝子に隣接する配列以外の本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、１以上の隣接配列の全ヌクレオチド配列が公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングについて上記で記載される方法を使用して合成され得る。
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、隣接配列は、ＰＣＲを使用して、そして／またはゲノムライブラリーを同じかもしくは別の種由来の適切なオリゴヌクレオチドおよび／もしくは隣接配列フラグメントでスクリーニングすることによって得られ得る。
隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子でさえ含み得る、より大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡフラグメントを産生し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）カラムクロマトグラフィー、または当業者に公知の他の方法を使用して単離することによって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
複製起点は、代表的に、商業的に購入される原核生物発現ベクターの一部であり、この開始点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合には、ＦＧＦ様ポリペプチドの最適の発現に重要であり得る。選り抜きのベクターが複製起点部位を含まない場合、これは、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）あるいはＨＰＶまたはＢＰＶのようなパピローマウイルス）が、哺乳動物細胞におけるベクターをクローニングするために有用である。一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（例えば、ＳＶ４０の起点は、しばしば、初期プロモーターを含むという理由だけで使用される）。
転写終結配列は、代表的に、ポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結させるために役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントであり、これにはポリＴ配列が続く。この配列はライブラリーから容易にクローニングされるかまたはベクターの一部として商業的に購入さえされるが、この配列は上記に記載されるような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、以下のタンパク質をコードする：（ａ）原核生物宿主細胞に抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質；または（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子はまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択に使用され得る。
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の生成に非常に必要である遺伝子が、組換え細胞の連続的生成の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみがベクターに存在する選択遺伝子によって生存するのに独特に適合する淘汰圧下に配置する。培地中の選択因子の濃度が連続的に変化する条件下で形質転換された細胞を培養し、それによって選択遺伝子とＦＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導くことによって、淘汰圧がかせられる。
結果として、増加した量のＦＧＦ様ポリペプチドが増幅されたＤＮＡから合成される。
リボソーム結合部位は、通常ｍＲＮＡの転写開始に必要とされ、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）により特徴付けられる。このエレメントは典型的に、プロモーターに対して３’に位置し、そして発現されるＦＧＦ様ポリペプチドのコード配列に対して５’に位置する。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、変化するが典型的にはポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が同定されており、これらのそれぞれは、上記の方法および原核生物ベクターにおいて使用される方法を使用して、容易に合成され得る。
リーダー配列またはシグナル配列は、ＦＧＦ様ポリペプチドを宿主細胞から外に出すことを指向するために使用され得る。代表的に、シグナル配列は、ＦＧＦ様核酸分子のコード領域に配置されるか、またはＦＧＦ様ポリペプチドコード領域の５’末端に直接配置される。多くのシグナル配列が同定されており、そして選択された宿主細胞において機能的であるこれらのいずれかが、ＦＧＦ様の遺伝子またはｃＤＮＡとともに使用され得る。従って、シグナル配列は、ＦＧＦ様の遺伝子またはｃＤＮＡに対して同種（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、上記の方法を使用して化学的に合成され得る。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を介する宿主細胞からのＦＧＦ様ポリペプチドの分泌は、ＦＧＦ様ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよいし、またはこれはベクターに挿入されるＦＧＦ様ＤＮＡの一部であってもよい。
本発明の範囲内には、ＦＧＦ様コード領域に連結されたネイティブなＦＧＦ様シグナル配列、およびＦＧＦ様コード領域に連結された異種シグナル配列が含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞により認識されそしてプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるべきである。ネイティブなＦＧＦ様シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩのリーダーの群から選択される原核生物リーダーにより置換され得る。酵母分泌において、ネイティブなＦＧＦ様シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸性ホスファターゼのリーダーにより置換される。哺乳動物細胞発現について、ＦＧＦ様ポリペプチドのネイティブなシグナル配列は十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において所望されるようないくつかの場合、種々のプレ配列を操作してグリコシル化または収率を改良し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するかまたはプロ配列を付加し得、これはまた、グリコシル化に影響を与え得る。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に取り除かれていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に結合されたペプチダーゼ切断部位において見出される１または２つのアミノ酸を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合、所望のＦＧＦ様ポリペプチドの、わずかに短縮された形態を生じ得る。
多くの場合、核酸分子の転写は、ベクター中の１以上のイントロンの存在により増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合に特にあてはまる。使用されるイントロンは、ＦＧＦ様遺伝子（特に、使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合）内に天然に存在し得る。イントロンが、遺伝子（ほとんどのｃＤＮＡに関して）天然に存在しない場合、そのイントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＦＧＦ様遺伝子に関するイントロンの位置は、イントロンは有効であるように転写されなければならないので、一般に重要である。従って、ＦＧＦ様ｃＤＮＡ分子が発現されるべき場合、イントロンについての好ましい位置は、転写開始部位に対して３’であり、かつポリＡ転写終結配列に対して５’である。好ましくは、イントロンは、ｃＤＮＡの一方の側または他方の側（すなわち、５’または３’）に位置し、その結果、イントロンは、そのコード配列を中断しない。イントロンが挿入される宿主細胞と適合するならば、任意の供給源（任意のウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）の生物体が挙げられる）由来の任意のイントロンを使用して、本発明を実施し得る。また、本明細書中には、合成イントロンが含まれる。必要に応じて、１より多くのイントロンをベクターにおいて使用し得る。
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、それぞれ代表的には、宿主生物により認識され、そしてＦＧＦ様ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子（一般的には、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対して上流（５’）に位置する、非翻訳配列である。プロモーターは従来、２つのクラス（誘導性プロモーターおよび構成性プロモーター）のうちの一方に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件下でいくらかの変化（例えば、栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化）に応答して、それらの制御下のＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。種々の潜在的な宿主細胞により認識される大量のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを取り除き、そしてベクターへ所望のプロモーター配列を挿入することにより、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＦＧＦ様プロモーター配列は、ＦＧＦ様コードＤＮＡの増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、異種プロモーターがネイティブプロモーターと比較して、発現タンパク質のより多い転写およびより高収率を可能にする場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合する場合、異種プロモーターが好ましい。
原核生物宿主を用いる使用に適切なプロモーターとしては、以下が挙げられる：β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター。他の公知の細菌性プロモーターもまた適切である。これらの配列は、公開されており、それにより、当業者が、任意の必要な制限部位を供給する必要がある場合に、リンカーまたはアダプターを使用して所望のＤＮＡ配列にそれらを連結することを可能にする。
酵母宿主を用いる使用に適切なプロモーターもまた、当該分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物細胞との使用に適切なプロモーターは、周知であり、そして以下が挙げられる：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
ＦＧＦ様遺伝子発現を制御する際の目的のプロモーターであり得るさらなるプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０（１９８１））；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７（１９８０））；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：１４４４−４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））、β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１（１９７８））；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５（１９８３））。以下の動物転写制御領域もまた目的のものであり、これらは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，Ｃｅｌｌ
３８：６３９−４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５（１９８７））；膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−２２（１９８５））；リンパ系細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４（１９８７））；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５（１９８６））；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．，１：２６８−２７６，１９８７）；肝臓において活性であるαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８（１９８７））；肝臓において活性であるα１アンチトリプシン遺伝子制御配列（Ｋｅｌｓｅｙら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１（１９８７））；骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４，１９８６）；脳中の稀突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２（１９８７））；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−８６（１９８５））；および視床下部において活性化される性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８（１９８６））。
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明のＦＧＦ様タンパク質をコードするＤＮＡの転写を増加させるためにベクターへ挿入され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐ長であり、これは、プロモーターに対して作用し、その転写を増加させる。エンハンサーは比較的、配向依存性でありそして位置依存性である。エンハンサーは、転写単位に対して５’側および３’側に見出されてきた。哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である。しかし、代表的に、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化についての例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＦＧＦ様ＤＮＡに対して５’位または３’位でベクターへスプライスされ得るが、エンハンサーは、代表的には、プロモーターから５’部位に配置される。
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでも含まなくてもよい。上記の隣接配列のうちの１以上が、使用されるべきベクター中にまだ存在しない場合、これらは、それぞれ入手され、そしてベクターへ連結され得る。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
本発明を実施するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞および哺乳動物宿主細胞と適合するベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が挙げられる。
さらに可能なベクターとしては、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。しかし、このベクター系が選択された宿主細胞と適合しなければならない。このようなベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１ベースのファージミド，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅されたＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯTM ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ，ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のようなプラスミド、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションまたは公知の他の技術を介して宿主細胞に導入され得る。
ベクターが構築され、そしてＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成されたベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞へ挿入され得る。
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。適切な条件下で培養された場合、宿主細胞は、ＦＧＦ様ポリペプチドを合成し、これはその後培養培地から収集され得るか（宿主細胞がＦＧＦ様ポリペプチドを培地中に分泌する場合）、またはＦＧＦ様ポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集される（ＦＧＦ様ポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因（例えば、所望の発現レベル、活性にとって所望であるかまたは必要であるポリペプチド改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの簡便性）に依存する。
多数の適切な宿主細胞が当該分野で公知であり、そして多くのものがＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７：４２１６−２０（１９８０））、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞もしくは２９３Ｔ細胞または３Ｔ３細胞であり得る。適切な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株ならびにＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、形質転換された細胞株を含む、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植片もまた適切である。候補細胞は、遺伝子型的に選択遺伝子が欠損していてもよいし、または優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３株またはＢＨＫハムスター細胞株もしくはＨａＫハムスター細胞株。各々これらの細胞株は、タンパク質発現の分野の当業者に公知であり、そしてタンパク質発現の分野の当業者にとって利用可能である。
本発明に適切な宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の株もまた、本方法において使用され得る。
当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０〜１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４〜７２（１９９３）；およびＬｕｃｋｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６〜７９（１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
選択された宿主細胞へのＦＧＦ様ポリペプチドについての発現ベクターの形質転換またはトランスフェクションは、周知の方法（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチンまたはＤＥＡＥ−デキストラン法を含む）により達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型と相関関係にあるものである。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
グリコシル化ＦＧＦ様ポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、ウシまたはヤギ）を使用し得、そしてその動物の乳汁中の本発明のグリコシル化ポリペプチドを入手し得る。ＦＧＦ様ポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、一般に、植物中で生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞にて産生されるものと異なり、そしてヒト治療用途に適切でないグリコシル化産生物を生じ得る。
（ポリペプチド産生）
ＦＧＦ様ポリペプチド発現ベクターを含む（すなわち、形質転換またはトランスフェクトされた）宿主細胞が、当業者に周知の標準培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、その細胞の増殖および生存に必要な栄養素すべてを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するのに適切な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真核生物細胞を培養するのに適切な培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらすべては、培養される特定の細胞株により必要とされる血清および／または増殖因子が補充され得る。昆虫培養に適切な培地は、必要な場合にはイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培地である。
代表的には、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、この培地に補充物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントにより決定される。例えば、その選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが挙げられる。
宿主細胞により産生されるＦＧＦ様ポリペプチドの量は、当該分野で公知の標準的方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定はしないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／または活性アッセイ（例えば、ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ）が挙げられる。
ＦＧＦ様ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地にて見出され得る。しかし、ＦＧＦ様ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、ＦＧＦ様ポリペプチドは細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
宿主細胞の細胞質および／または核に存在するＦＧＦ様ポリペプチドについては、宿主細胞は代表的に、最初に機械的にまたは界面活性剤を用いて破壊されて、細胞内含有物が緩衝化溶液中に放出される。次いで、ＦＧＦ様ポリペプチドは、この溶液から単離され得る。
溶液からのＦＧＦ様ポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドがそのカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（ＦＧＦ様ポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそのタグにまたはそのポリペプチドに直接高い親和性を有する（すなわち、ＦＧＦ様ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体）アフィニティーカラムにその溶液を通すことによって、本質的に１工程のプロセスで精製され得る。例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で結合し、従ってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、ＦＧＦ様ポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９３）を参照のこと。
タグが結合されずにＦＧＦ様ポリペプチドが調製され、そして抗体が利用可能でない場合、他の周知の精製手順が用いられ得る。このような手順としては、限定はしないが、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせたネイティブゲル電気泳動、ならびに分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以上のこれらの技術が、純度の上昇を達成するために組み合わされ得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドが細胞内で産生される場合、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得、それに続いて遠心分離され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドが細胞質ゾルにおいて封入体を形成した場合、その封入体は、しばしば、内側細胞膜および／または外側細胞膜に結合し得、従って、遠心分離後に、主にペレット物質中に見出される。次いで、このペレット物質は、極端なｐＨ状態で処理され得るか、またはカオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体）を還元剤（例えば、ジチオスレイトール（アルカリ性ｐＨ）もしくはトリスカルボキシエチルホスフィン（酸性ｐＨ））の存在下で用いて処理されて、封入体を遊離、ばらばらにおよび可溶化し得る。ここで可溶化形態のＦＧＦ様ポリペプチドは、次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＦＧＦ様ポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、以下に記載される方法およびＭａｒｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８２：２６４−７５（１９９０）に記載される方法のような、標準的方法を使用して達成され得る。
いくつかの場合において、ＦＧＦ様ポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でないかもしれない。そのポリペプチドを「リフォールディング」する、すなわち、その３次構造に変換してジスルフィド結合を生じるための種々の方法が、生物学的活性を回復するために使用され得る。このような方法は、可溶化されたポリペプチドを通常は７を超えるｐＨに、特定の濃度のカオトロープの存在下で曝すことを包含する。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択に非常に類似するが、通常このカオトロープは、より低い濃度で使用され、そして可溶化に使用されるカオトロープと必ずしも同じではない。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤を含むかまたは還元剤に加えてその酸化形態を特定の比で含んで、特定の酸化還元ポテンシャルを生じ、それによりそのタンパク質のシステイン架橋の形成を生じるようなジスルフィドシャッフリングを可能にする。一般的に使用される酸化還元カップルのいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合、共溶媒が、リフォールディングの効率を高めるために使用され得るかまたは必要であり得、そしてこの目的に使用されるさらに一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
封入体が、ＦＧＦ様ポリペプチドの発現の際に有意な程度まで形成されない場合は、そのポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。そのポリペプチドは、以下に記載されるような方法を使用して、上清からさらに単離され得る。
夾雑物を部分的または実質的に含まないように、ＦＧＦ様ポリペプチドを部分的または完全に精製することが好ましい状況では、当業者に公知の標準的な方法が用いられ得る。このような方法としては、限定しないが、以下が挙げられる：電気泳動による分離とそれに続く電気溶出、種々の種類のクロマトグラフィー(アフィニティー、イムノアフィニテ
ィー、分子ふるい、および／またはイオン交換)、および／または高圧液体クロマトグラ
フィー。いくつかの場合、完全な精製のためにこれらの方法のうちの１より多くを使用することが好適であり得る。
ＦＧＦ様ポリペプチド、そのフラグメント、および／または誘導体もまた、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２（１９８５）、ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るし、または含まずに合成され得る。化学的に合成されたＦＧＦ様ポリペプチドまたはフラグメントは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。ＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメントもしくは誘導体は、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメントもしくは誘導体に匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＦＧＦ様ポリペプチドもしくは天然のＦＧＦ様ポリペプチドと互換可能に使用され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドを得る別の手段は、そのＦＧＦ様ポリペプチドが天然で見出される生物学的サンプル（例えば、供給源組織および／または流体）からの精製を介する。このような精製は、上記のようなタンパク質精製のための方法を使用して実行され得る。精製の間のＦＧＦ様ポリペプチドの存在は、例えば、組換え産生されたＦＧＦ様ポリペプチドもしくはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用して、モニターされ得る。
（ポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、単離されたＦＧＦ様ポリペプチドおよびそれに関するポリペプチド（本明細書中上記規定されるような、フラグメント、改変体、融合ポリペプチドおよび誘導体を含む）を包含する。
本発明のＦＧＦ様ポリペプチドフラグメントは、例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）の短縮化、カルボキシル末端の短縮化、および／またはポリペプチドの内部欠失から生じ得る。好ましい実施形態において、短縮および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または１００アミノ酸より多いアミノ酸を含む。このように産生されたポリペプチドフラグメントは、約２５連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＦＧＦ様ポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。
本発明のＦＧＦ様ポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号４と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含む。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００を超える、アミノ酸置換、挿入、付加および／もしくは欠失を有し、ここでその置換は、上記のように保存的であり得るか、または非保存的であり得るか、あるいはその組み合わせであり得、そしてここでＦＧＦ様ポリペプチド改変体は、ＦＧＦ様活性を保持している。これらの改変体は、カルボキシ末端においてかまたはアミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかにおいてアミノ酸残基の付加を有し得る。
好ましいＦＧＦ様ポリペプチド改変体としては、グリコシル化改変体が挙げられ、ここで、グリコシル化部位の数および／または種類は、ネイティブなＦＧＦ酸様ポリペプチドと比較して変更されている。１つの実施形態において、ＦＧＦ様改変体は、多いかまたは少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、「Ｘ」として示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のタイプのアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を除去する置換は、存在するＮ結合型糖鎖を除く。また、Ｎ結合型糖鎖の再配列が提供され、ここで、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的には、天然にある部位）が除去されてそして一つ以上の新しいＮ結合型部位が作製される。さらなる好ましいＦＧＦ様改変体としては、システイン改変体が挙げられ、ここで、一つ以上のシステイン残基が、欠失されているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）を置換している。システイン改変体は、ＦＧＦ様ポリペプチドが、不溶性封入体の単離の後のように、生物学的に活性なコンホメーションに折り畳まれなければならない場合に有用である。システイン改変体は、一般的に、ネイティブなタンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、そして代表的には、不対システインから生じる相互作用を最少化するために偶数を有する。
当業者は、周知の技術を使用して、ネイティブのＦＧＦ様ポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。例えば、生物学的活性を破壊することなく変化され得る分子を適切な領域を推定し得る。また、当業者は、生物学的活性または構造に重要であり得る領域さえも、その生物学的活性を破壊することもしくはそのポリペプチド構造に不利に影響することなく、保存的アミノ酸置換に供され得ることを認識する。
活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を予測するために、当業者は、活性に重要であると考えられていない領域を標的化し得る。例えば、同じ種または他の種由来の類似の活性を有する類似のポリペプチドが公知である場合、当業者は、ＦＧＦ様ポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を行った後、当業者は、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を決定し得る。当業者は、保存されないＦＧＦ様分子の領域での変化が生物学的活性および／または構造に不利に影響しそうにないことを知っている。当業者はまた、比較的保存された領域においてさえ、活性を保持しつつ、天然に存在する残基に代わって化学的に類似するアミノ酸でおそらく置換し得る（保存的アミノ酸残基置換）。
また、当業者は、活性もしくは構造について重要な類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を検討し得る。このような比較を考慮して、当業者は、類似のポリペプチド中の活性もしくは構造に重要なアミノ酸残基に対応するＦＧＦ様ポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＦＧＦ様ポリペプチドのこのような推定された重要なアミノ酸残基に代わる化学的に類似のアミノ酸置換を選択し得る。
利用可能な場合、当業者はまた、３次元構造、およびその構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。その情報を考慮して、当業者は、その３次元構造に関するＦＧＦ様ポリペプチドのアミノ酸残基の整列を予測でき得る。当業者は、そのタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を作製しないように選択し得る。なぜなら、そのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験改変体を作製し得た。この改変体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得た。そのような改変体を使用して、適切な改変体に関する情報を集め得る。例えば、当業者は、特定のアミノ酸残基に対する変更が、崩壊された活性を生じることを発見した場合、そのような変更を有する改変体は、回避される。言い換えると、そのような実験から集められた情報に基づいて、さらなる受容可能な改変体を見出すことを試みる場合、当業者は、さらなる置換が単独または他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を知る。
本発明のＦＧＦ様融合ポリペプチドは、異種ペプチドもしくはタンパク質に融合された、ＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメント、改変体もしくは誘導体を含む。異種ペプチドおよびタンパク質としては、ＦＧＦ様融合ポリペプチドの検出および／もしくは単離を可能にするエピトープ、膜貫通レセプタータンパク質もしくはその部分（例えば、細胞外ドメイン、または膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）、または膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドもしくはその部分、触媒活性な酵素もしくはその部分、オリゴマー化を促進するタンパク質もしくはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）、および安定性を増大させるタンパク質もしくはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）が挙げられるが、これらに限定されない。ＦＧＦ様ポリペプチドは、それ自体またはそのフラグメント、改変体もしくは誘導体に融合され得る。融合は、ＦＧＦ様ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかでなされ得、そしてリンカーまたはアダプター分子なしで直接であり得るし、あるいはリンカーまたはアダプター分子（例えば、１つ以上のアミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基まで、もしくは約５０アミノ酸残基まで）を介してであり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするように、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼについてまたはプロテアーゼについての切断部位を含んで設計され得る。
本発明のさらに好ましい実施形態において、ＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメント、改変体および／または誘導体を、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合させる。１つの例において、当業者に公知の方法を使用して、ヒトＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を、ＦＧＦ様ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合させ得る。別の例において、ヒンジ領域の一部ならびにＣＨ２およびＣＨ３領域を、融合し得る。このように産生されたＦＧＦ様 Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラムを用いて精製され得る。さらに、Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、その融合されていない対応物よりも実質的に大きい、インビボでの半減期を示すことが見い出されている。また、Ｆｃ領域への融合は、この融合ポリペプチドのダイマー化／マルチマー化を可能にする。このＦｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療的品質、循環時間、凝集の減少などのような、特定の質を改善するように変更され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチド誘導体は、本発明の範囲に含まれる。このような誘導体は、ＦＧＦ様ポリペプチドがポリマーに連結されている、化学的に改変されたＦＧＦ様ポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは、代表的には水溶性であり、その結果、そのポリマーに連結されているタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的環境）下で沈殿しない。このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝されていても分枝されていなくてもよい。ポリマーの混合物が、ＦＧＦ様ポリペプチドポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
水溶性ポリマーまたはそれらの混合物としては、例えば、以下からなる群より選択される：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤ）のデキストラン）、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。共有結合されたＦＧＦ様ポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性ＰＥＧ架橋分子もまた、本発明に含まれる。
アシル化反応について、選択されるポリマーは、１つの反応エステル基を有するべきである。還元アルキル化について、選択されるポリマーは、１つの反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水溶性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
ＦＧＦ様ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるように、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかにより行われ得る：Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３、４〜１０（１９９２）；欧州特許第０ １５４ ３１６号；同第０ ４０１ ３８４号および米国特許第４，１７９，３３７号。ペグ化は、以下に記載するように反応性ポリエチレングリコール分子（または、同種反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われ得る。
本明細書中での使用のための１つの水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールであり、ＰＥＧと省略される。本明細書中で使用される場合、ポリエチレングリコールは、他のタンパク質（例えば、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態のいずれかを含むことを意図する。
一般に、化学的な誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で行われ得る。ペグ化ＦＧＦ様ポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）ＦＧＦ様ポリペプチドが、１以上のＰＥＧ基に結合されるような条件下でポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きいほど、ポリ−ペグ化生成物の割合が高くなる。
好ましい実施形態において、ＦＧＦ様ポリペプチド誘導体は、アミノ末端で単一のＰＥＧ部分を有する。米国特許第５，２３４，７８４号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
一般に、本発明のＦＧＦ様ポリペプチド誘導体の投与によって緩和または調節され得る状態としては、ＦＧＦ様ポリペプチドについて本明細書中で記載される状態が挙げられる。しかし、本明細書中に開示されるＦＧＦ様ポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較して、さらなる活性、増強または減少された生物学的活性、または他の特徴（例えば、増加または減少された半減期）を有し得る。
（抗体）
ＦＧＦ様ポリメラーゼ、フラグメント、変異体および誘導体は、当該分野で公知の方法を使用して、抗体を調製するために使用され得る。従って、ＦＧＦ様ポリペプチドを結合する抗体および抗体フラグメントは、本発明の範囲内である。抗体は、ポリクローナル、単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、ヒト化、完全ヒト、単鎖および／または二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり得る。
ＦＧＦ様ポリメラーゼに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＦＧＦ様ポリペプチドおよびアジュバントを複数回の皮下注射または腹腔内注射することにより動物（ウサギまたはマウス）において誘起される。ＦＧＦ様ポリペプチドあるいはその改変体、フラグメントまたは誘導体を、キャリアタンパク質に結合体化することが有用であり得、このキャリアタンパク質は、免疫される種において免疫原性である（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）。また、凝集因子（例えば、ミョウバン）も、免疫応答を増強するために使用される。免疫後、動物を採血し、そして血清を、抗ＦＧＦ様抗体力価についてアッセイする。
ＦＧＦ様ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養物中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５のハイブリドーマ法、およびＫｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１、１９８４；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９８７）のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法が挙げられる。
ＦＧＦ様ポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、ここで、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列のフラグメントと、同一であるかまたは相同であり、一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同である。このような抗体のフラグメントもまた、それらが、所望の生物学的活性を示す限り、含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５、１９８５を参照のこと）。
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来のそのヒト化抗体に導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、齧歯目の相補的決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域で置換することによる、当該分野で公知の以下の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７）１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、行われ得る。
ＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメント、改変体および／または誘導体を結合する、完全ヒト抗体もまた、本発明に含まれる。このような抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）の（必要に応じてキャリアに結合体化された）ＦＧＦ様抗原で免疫することによって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）を参照のこと。ヒト抗体もまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的には、組換え方法により生成される。これらの抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入され、そして本明細書中上記される材料および方法を用いて産生される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において発現される。完全ヒト抗体は、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によるか、または上記のハイブリドーマ細胞における発現により生成され得る。
診断適用に関しては、特定の実施形態において、抗ＦＧＦ様抗体は、代表的には検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生じ得る任意の部分である。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓまたは125Ｉ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビベルオキシダーゼ）であり得る。Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−１６３（１９９０）。
本発明の抗ＦＧＦ様抗体は、ＦＧＦ様ポリペプチドの検出および定量について、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８７））において用いられ得る。この抗体は、使用されるアッセイ法について適切な親和性でＦＧＦ様ポリペプチドを結合する。
競合結合アッセイは、限定された量の抗ＦＧＦ様抗体との結合について試験サンプル分析物（ＦＧＦ様ポリペプチド）と競合する標識された標準物質（例えば、ＦＧＦ様ポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＦＧＦ様ポリペプチドの量は、この抗体に結合する標準物質の量に逆比例する。結合する標準物質の測定を容易にするために、この抗体は、代表的には、競合の前または後に不溶化され、その結果、この抗体に結合する標準物質および分析物は、結合しないままの標準物質および分析物から簡単に分離され得る。
サンドイッチアッセイは、２つの抗体（各々、検出され、そして／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分または、エピトープに結合し得る）の使用に関する。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分析物は、代表的には、固体支持体に固定化された第１の抗体、その後第２の抗体が分析物に結合し、このようにして不溶性の３部分で構成される複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体検出可能な部分で標識され得るか（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、この検出可能な部分は酵素である。
本発明の抗ＦＧＦ様抗体はまた、インビボ画像化のために有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に（好ましくは、血流に）投与され得、そして宿主における標識化抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、動物において（核磁気共鳴、放射線学または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかで）検出可能な任意の部分で標識され得る。
本発明はまた、抗ＦＧＦ様抗体および生物学的サンプルにおいてＦＧＦ様ポリペプチドレベルを検出するに有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬としては、以下が挙げられ得る：２次活性、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性コントロールサンプルおよび陰性コントロールサンプル、ならびに検出試薬。
本発明の抗体は、治療剤として使用され得る。これらの治療的抗体は、一般に、それらがＦＧＦ様ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを増強または減少するかのいずれかであるという点で、それぞれ、アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメント、改変体および／または誘導体に特異的に結合し得、そしてＦＧＦ様ポリペプチドの機能的活性をインビボまたはインビトロで阻害または排除し得る抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、アンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ様ポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％阻害する。別の実施形態において、アンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ様結合パートナーと相互作用し、それによりインビトロまたはインビボでＦＧＦ様活性を阻害または排除し得る抗体であり得る。アゴニスト抗ＦＧＦ様抗体およびアンタゴニスト抗ＦＧＦ様抗体は、以下に記載のスクリーニングアッセイにより同定される。
（遺伝子操作した非ヒト動物）
ネイティブＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子が破壊（すなわち「ノックアウト」）されて、その結果、ＦＧＦ様ポリペプチドの発現レベルが、有意に減少されているかまたは完全に消失されている、非ヒト動物（例えば、マウス、ラットまたは他の齧歯目、ウサギ、ヤギまたはヒツジ、あるいは他の家畜動物）も、本発明にさらに含まれる。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
本発明はさらに、その動物についてネイティブな形態のＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子または異種ＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子が、その動物によって過剰発現されている（それによって「トランスジェニック」動物が作製される）非ヒト動物（例えば、マウス、ラットまたは他の齧歯目、ウサギ、ヤギまたはヒツジ、あるいは他の家畜動物）を包含する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１２２に記載のような、周知の方法を使用して調製され得る。
本発明はさらに、本発明の１以上のＦＧＦ様ポリペプチドに対するプロモーターが、活性化または不活性化されて（例えば、以下に記載されるような相同組換え法を使用することによって）１以上のネイティブＦＧＦ様ポリペプチドの発現レベルが変更されている非ヒト動物を包含する。
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングに使用され得る。動物に対する薬物候補の影響が測定され得る。例えば、薬物候補は、ＦＧＦ様遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＦＧＦ様ポリペプチドまたはＦＧＦ様ポリペプチドフラグメントの量は、薬物候補への動物の曝露後に測定され得る。特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少する薬物候補の能力または病理学的状態を防止または阻止する能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生が、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少する薬物候補の能力または病理学的状態を防止または阻止する能力を試験し得る。
（ＦＧＦ様ポリペプチド活性のモジュレーター）
いくつかの状況において、ＦＧＦ様ポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドを調節する天然または合成の分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるようなもの）を用いて同定され得る。そのような分子は、エキソビボでの様式もしくはインビボでの様式のいずれかで、または局所もしくは静脈内注射、または経口送達、移植デバイスなどにより、投与され得る。
以下の定義が、アッセイを記載するために本明細書中で使用される。
「試験分子」とは、ＦＧＦ様ポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）させる能力について評価される状態にある分子をいう。最も一般的には、試験分子は、ＦＧＦ様ポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、ＦＧＦ様遺伝子発現に影響を与えることにより、またはＦＧＦ様結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することにより、ＦＧＦ様ポリペプチド活性を間接的に調節し得ることもまた企図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０-6Ｍ、好ましくは約１０-8Ｍ、より好ましくは約１０-9Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０-10
Ｍの親和性定数でＦＧＦ様ポリペプチドに結合する。
ＦＧＦ様ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明に包含される。特定の実施形態において、ＦＧＦ様ポリペプチドは、試験分子と、その試験分子がそのＦＧＦ様ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、インキュベートされ、そしてその相互作用の程度が測定され得る。この試験分子は、実質的に精製された形態で、または粗混合物中でスクリーニングされ得る。この試験分子は、核酸分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子の有機もしくは無機化合物であり得る。１セットの分子がＦＧＦ様ポリペプチドと相互作用すると同定された場合、この分子がＦＧＦ様ポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。
試験分子と、ＦＧＦ様ポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形式で行われ得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイおよび免疫アッセイが含まれる。一般的に、試験分子は、特定時間にわたり、ＦＧＦ様ポリペプチドとインキュベートされ、そしてＦＧＦ様ポリペプチド活性は、生物学的活性を測定する１つ以上の本明細書中で記載されるアッセイにより決定される。
試験分子とＦＧＦ様ポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて直接アッセイされ得る。あるいは、上記のようなエピトープタグを含む、改変された形態のＦＧＦ様ポリペプチドは、溶液および免疫アッセイにおいて使用され得る。
特定の実施形態において、ＦＧＦ様ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子であって、ＦＧＦ様ポリペプチドと相互作用してその活性を調節するものであり得る。ＦＧＦ様ポリペプチドの潜在的なタンパク質アンタゴニストとしては、ポリペプチドの活性領域と相互作用する抗体およびＦＧＦ様ポリペプチドの少なくとも１つを阻害または排除する抗体が挙げられる。ＦＧＦ様ポリペプチド発現を調節する分子としては、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、またはＦＧＦ様ポリペプチドの発現を指向または制御する核酸配列に相補的であり、そして発現のアンチセンスレギュレーターとして作用する核酸が挙げられ得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドが結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して生物学的活性を提示する事象において、種々のインビトロアッセイを使用して、ＦＧＦ様ポリペプチドの対応する結合パートナーへの結合を測定し得る。これらのアッセイを使用して、試験分子を、それらがＦＧＦ様ポリペプチドのその結合パートナーへの結合の速度および／または程度を増加もしくは減少させる能力について、スクリーニングし得る。１つのアッセイにおいて、ＦＧＦ様ポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェルの底部への付着によって固定される。次いで、放射標識されたＦＧＦ様結合パートナー（例えば、ヨウ化ＦＧＦ様結合パートナー）および試験分子は、１回にいずれか一方を（いずれの順番でも）または同時にそのウェルに加えることができる。インキュベーション後、そのウェルを洗浄し得、そして放射能について計数して（シンチレーションカウンターを用いて）その結合パートナーがＦＧＦ様ポリペプチドへ結合した結合の程度を決定し得る。代表的に、その分子は、ある範囲の濃度にわたって試験され得、そしてその試験アッセイの１つ以上の要素を欠く一連のコントロールウェルを、その結果の評価における精確さのために使用し得る。この方法の代替としては、そのタンパク質の「位置」を反転させること（すなわち、ＦＧＦ様結合パートナーを、マイクロタイタープレートウェルに固定すること）、その試験分子および放射標識されたＦＧＦ様ポリペプチドとインキュベートすること、ならびにＦＧＦ様結合の程度を決定すること（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９５の第１８章を参照のこと）が含まれる。
放射標識の代替として、ＦＧＦ様ポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いでビオチン化タンパク質の存在は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしくはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジン（これは、比色測定で検出され得る）またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって、検出され得る。ＦＧＦ様ポリペプチドまたはＦＧＦ様結合体パートナーに対して指向され、そしてビオチンと結合体化された抗体もまた使用され得、そしてＡＰまたはＨＲＰに結合した酵素結合ストレプトアビジンとのインキュベーション後に、検出され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドおよびＦＧＦ様結合パートナーもまた、アガロースビーズ、アクリルビーズまたは他の型のそのような不活性固相基体への付着によって固定され得る。この基体−タンパク質複合体は、その相補タンパク質およびその試験化合物を含む溶液中に配置され得る。インキュベーション後、そのビーズは、遠心分離によって沈降され得、そしてＦＧＦ様ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合量を上記の方法を用いて検討し得る。あるいは、その基体−タンパク質複合体は、カラムに固定され得、そしてその試験分子および相補タンパク質は、そのカラムを通過させられ得る。次いで、ＦＧＦ様ポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成は、上記の技術（すなわち、放射標識、抗体結合など）のいずれかを用いて検討され得る。
別のインビトロアッセイであって、ＦＧＦ様結合タンパク質とＦＧＦ様結合パートナーとの複合体の形成を増加または減少する試験分子を同定するために有用であるアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器系（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。Ｂｉａｃｏｒｅ系は、製造業者のプロトコルを用いて実施され得る。このアッセイは、本質的に、ＦＧＦ様またはＦＧＦ様結合パートナーのいずれかを、デキストランコーティングされたセンサーチップであって、検出器に配置されているものへの共有結合を包含する。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質は、同時または連続的のいずれかでそのセンサーチップを含むチャンバーへと注射され得る。相補タンパク質の結合量は、そのセンサーチップのデキストランコーティングされた側と物理的に結合した分子量の変化に基づいて評価され得、分子量における変化は、その検出器系によって測定され得る。
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、それらがＦＧＦ様ポリペプチドとＦＧＦ様結合パートナー複合体との複合体の形成を増加または減少する能力について、評価することが所望され得る。これらの場合において、上記のアッセイは、そのようなさらなる試験化合物を、第一の試験化合物と同時またはその後のいずれかで加えることによって、容易に改変され得る。このアッセイにおける残りの工程は、上記のとおりである。
インビトロアッセイ（例えば、上記のようなアッセイ）は、ＦＧＦ様およびＦＧＦ様結合パートナーによる複合体形成に対する効果について、大多数の化合物を迅速にスクリーニングするために有利に使用され得る。このアッセイは、ファージディスプレイにおいて生成された化合物、合成ペプチドおよび化学合成ライブラリーをスクリーニングするように自動化され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドとＦＧＦ様結合パートナーとの複合体の形成を増加または減少させる化合物もまた、ＦＧＦ様ポリペプチドまたはＦＧＦ様結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を用いて細胞培養物中においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から入手され得るが、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類、イヌ、または齧歯類起源由来であり得る。ＦＧＦ様ポリペプチドの、表面にＦＧＦ様結合パートナーを発現する細胞への結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度は、例えば、ＦＧＦ様結合パートナーへのビオチン化抗体を用いたフローサイトメトリーにより決定され得る。細胞培養アッセイは、上記のタンパク質結合アッセイにおいて陽性と評価される化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
細胞培養物は薬物候補の効果をスクリーニングするために用いられ得る。例えば、薬物候補は、ＦＧＦ様遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＦＧＦ様ポリペプチドの量は、その細胞培養物をその薬物候補へ暴露した後に測定され得る。特定の実施形態において、その細胞培養物に対する実際の効果が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、その細胞培養物に対して特定の効果を有し得る。そのような場合、薬物候補がその遺伝子の発現を増加または減少する能力、あるいはそれがその細胞培養物に対する特定の効果を妨害または阻害する能力が試験され得る。他の実施例において、特定の代謝産物の生成（例えば、ポリペプチドのフラグメント）は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。そのような場合、薬物候補が細胞培養物においてそのような代謝産物の生成を減少する能力が試験され得る。
（ＦＧＦ様ポリペプチドを使用する細胞源の同定）
特定の実施形態に従って、特定の細胞型の供給源を決定し得ることが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択するのに援助し得る疾患または病理状態の起源を決定することが有用であり得る。ＦＧＦ様ポリペプチドは、肝臓で特異的に発現（そして肺で弱く発現）する。特定の実施形態において、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用され、このようなプローブを用いて細胞の核酸をクローニングすることによって肝臓由来細胞を同定し得る。他の実施形態において、ＦＧＦ様ポリペプチドに特異的な抗体を産生するためにＦＧＦ様ポリペプチドを使用し得る。このような抗体を使用して、細胞中のＦＧＦ様ポリペプチドの存在について試験し、そしてこのように、これらの細胞が肝臓から誘導されたどうかを決定するための手段として試験し得る。
（ＦＧＦ様ポリペプチド組成物および投与）
ＦＧＦ様のポリペプチドの薬学的組成物は、本発明の範囲内である。そのような組成物は、治療有効量のＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメント、改変体または誘導体を、薬学的に受容可能な薬剤（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）と混合されて含み得る。このキャリア剤は、注射用水、好ましくは、哺乳動物への投与のために溶液中で他の物質と共に添加され得る。代表的には、ＦＧＦ様ポリペプチドを含む治療的化合物は、精製されたポリペプチド、フラグメント、改変体または誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能な薬剤とともに含む組成物の形態で投与される。中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、例示の適切なキャリアである。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的な薬学的に受容可能な試薬（例えば、キャリア、希釈剤および賦形剤）は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
ＦＧＦ様ポリペプチド薬学的組成物は、代表的に、治療的または予防的有効量のＦＧＦ様タンパク質を、投薬の形態での適切性のために選択された１以上の薬学的および生理学的に受容可能な処方剤と混合して含む。適切な処方物質または薬学的に受容可能な薬剤には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示のビヒクルである。本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、薬学的組成物としてＦＧＦ様タンパク質の送達を、達成するかまたは増強するために適切な１つ以上の処方材料をいう。
組成物における主要な溶媒は、天然で水性または非水性のいずれかであり得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、その組成物は、ＦＧＦ様タンパク質の放出速度を改変または維持するため、またはＦＧＦ様タンパク質の吸収もしくは透過を促進するためのさらなる処方物材料を含み得る。
ＦＧＦ様ポリペプチド組成物は、非経口的に投与され得る。あるいは、その組成物は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払えば、当業者の範囲内である。
本発明を実施するために有用なＦＧＦ様ポリペプチド組成物の治療処方物は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ
Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そしてこのましくは、以下が挙げられる：緩衝液（リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
最適な薬学的処方物は、意図された投与経路、送達形式および所望の投薬量に依存して、当業者により容易に決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４３５−１７１２（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）。このような組成物は、例えば、本発明のＦＧＦ様タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出の早さ、およびインビボでのクリアランスの早さに影響し得る。
治療的に用いられるＦＧＦ様ポリペプチド組成物の有効量は、例えば、ＦＧＦ様ポリペプチド組成物が使用される適応症（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、投与経路、および患者の状態のような治療目的に依存する。従って、治療専門家が投薬量を滴定し、そして最適な治療効果を得るために必要とされる投与経路を変更することは、必要なことであり得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、この投薬量は、１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。代表的には、医師は、投薬量が所望の効果に達するまで、組成物を投与する。従って、この組成物は、経時的に、または移植デバイスまたはカテーテルを介した連続注入によって、単一用量または２以上の用量として投与され得る（これらは、同じ量のＦＧＦ様ポリペプチドを含んでいてもよいし、そうでなくともよい）。
さらに研究を行うにつれて、種々の患者における種々の状態の処置のための適切な投薬レベルに関する情報が明らかになり、そして当業者は、治療状況、処置中の障害の型、レシピエントの年齢および一般的健康状態を考慮して、適切な投薬を確認し得る。
インビボでの非経口投与のために使用されるＦＧＦ様ポリペプチド組成物は、代表的には、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。この組成物が凍結乾燥されている場合、これらの方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行われ得る。非経口投与のための組成物は、通常、凍結乾燥された形態でまたは溶液で保存される。
治療的組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアル）に入れられる。
効果的な投与形態（例えば、（１）徐放性処方物、（２）吸入ミスト、または（３）経口的に活性な処方物）もまた想到される。このＦＧＦ様ポリペプチド薬学的組成物はまた、非経口投与のために処方され得る。このような非経口投与治療組成物は、代表的には、薬学的に受容可能なビヒクル中にＦＧＦ様ポリペプチドを含む、発熱物質を含まない、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。このＦＧＦ様ポリペプチド薬学的組成物はまた、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒子状の調製物、またはリポソームへのＦＧＦ様ポリペプチドの導入物を含み得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環中の持続期間を助長する効果を有し得る。
非経口注射のために特に適切なビヒクルは、適切に保護された滅菌等張性溶液としてＦＧＦ様ポリペプチドが処方された、滅菌蒸留水である。なお別の調製物は、タンパク質産物の制御されたかまたは持続した放出を提供し、次いで、蓄積注射（ｄｅｐｏｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）として送達され得る、因子（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子もしくはビーズ、またはリポソーム）を伴うＦＧＦ様ポリペプチドの処方物を含み得る。ＦＧＦ様ポリペプチドの導入のための他の適切な手段としては、ＦＧＦ様ポリペプチドを含む、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
本発明の調製物は、当該分野で周知のように、他の成分（例えば、非経口的に受容可能な保存剤、張度（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、抗酸化剤および界面活性剤）を含み得る。例えば、適切な張度増強剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としては、アルカリ金属ハライド（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などが挙げられるがこれらに限定されない。過酸化水素もまた、保存剤として用いられ得る。適切な共溶媒は、例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールである。適切な錯化剤は、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。適切な界面活性剤または湿潤剤としては、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）などが挙げられる。緩衝剤は、従来の緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ）であり得る。
処方物成分は、投与部位に受容可能である濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理学的ｐＨにまたはわずかに低いｐＨに（代表的には、約５〜約８のｐＨ範囲内に）維持するために用いられ得る。
薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＦＧＦ様ポリペプチドは、吸入のための乾燥散剤として処方され得る。ＦＧＦ様ポリペプチド吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための液化プロペラント中に処方され得る。なお別の処方物において、溶液が噴霧化され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドを含む特定の処方物が経口投与され得ることもまた意図される。この様式で投与されるＦＧＦ様ポリペプチドは、固体投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル剤）の調合において習慣的に用いられるキャリアを伴ってまたは伴わずに処方され得る。例えば、カプセル剤は、胃腸管にある時点で（このとき、バイオアベイラビリティが最大にされ、そして全身以前（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）の分解が最少にされる）処方物の活性な部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤は、ＦＧＦ様ポリペプチドの吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた用いられ得る。
別の調製物は、錠剤の製造に適切である非毒性賦形剤を伴う混合物中で有効量のＦＧＦ様ポリペプチドを含み得る。滅菌水または他の適切なビヒクル中に錠剤を溶解することによって、溶液は、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；または滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石）が挙げられるがこれらに限定されない。
さらなるＦＧＦ様ポリペプチド処方物は、当業者に明らかであり、１以上の他の治療剤と組み合わせてＦＧＦ様ポリペプチドを含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達手段または制御送達手段を処方するための技術（例えば、リポソームキャリア、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注射）もまた、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｐｅｒｓａｘｏらの薬学的組成物の送達のための制御放出多孔性ポリマー性微粒子の記載を参照のこと（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５７２２号を参照のこと）。この開示は、本明細書中に参考として援用される。
投与の様式に拘わらず、体重、体表面積、または生物のサイズに従って、特定の用量が計算され得る。上記の処方物の各々が関連する処置のための適切な投薬量を決定するために必要なこの計算のさらなる改良は、当業者により慣用的に行われ、そして彼らにより慣用的に行われる仕事の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データを用いることにより確認され得る。
組成物の投与経路は、公知の方法（例えば、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変内経路によるか、または必要に応じてカテーテルの使用を含み得る、徐放系もしくは移植デバイスによる注射または注入）に従い得る。所望であれば、この組成物は、注入、ボーラス注射によるか、または移植デバイスにより連続的に投与され得る。
当業者は、本発明の薬学的組成物を、肺投与によってさらに投与し得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９４／２００６９号を参照のこと。国際公開第ＷＯ ９４／２００６９号は、化学的に改変されたタンパク質の肺性送達を開示し、本明細書中に参考として援用される。肺送達については、粒子の大きさは、肺の遠位への送達に適切であるべきである。例えば、粒子の大きさは、１μｍ〜５μｍであり得る。しかし、例えば、各粒子がかなり多孔性であれば、より大きな粒子が用いられ得る。
あるいは、またはさらに、この組成物は、罹患した領域への、ＦＧＦ様ポリペプチドが吸収またはカプセル化された膜、スポンジまたは他の適切な材料の移植を介して局所投与され得る。
移植デバイスが用いられる場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そしてＦＧＦ様ポリペプチドの送達は、ボーラスを介して、または連続投与を介して、または連続注入を用いたカテーテルを介して、デバイスを通して直接的であり得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドは、徐放性処方物または調製物中で投与され得る。徐放性調製物の適切な例としては、成型品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放性放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ特許５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６，１９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ特許１３３，９８８号）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得る。リポソームは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ特許３６，６７６号；ＥＰ特許８８，０４６号；およびＥＰ特許１４３，９４９号を参照のこと）。
ＦＧＦ様ポリペプチド、そのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、ともに、または他の薬学的組成物と組み合わせて用いられ得る。ＦＧＦ様ポリペプチド、フラグメント、改変体および誘導体は、処置される適応症について適切である場合、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み合わせて用いられ得る。
いくつかの場合、ＦＧＦ様ポリペプチド薬学的組成物をエキソビボの様式で使用することが所望され得る。このような場合には、患者から取り出された細胞、組織または器官がＦＧＦ様ポリペプチド組成物に曝露され、その後、この細胞、組織および／または器官が続いて、その患者に移植し戻される。
他の場合、ＦＧＦ様ポリペプチドは、方法（例えば、本明細書中に記載された方法）を用いて、このポリペプチド、フラグメント、改変体または誘導体を発現および分泌するように遺伝子操作された特定の細胞を患者に移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物またはヒトの細胞であり得、そして患者自身の組織または別の供給源（ヒトまたは非ヒトのいずれか）に由来し得る。必要に応じて、この細胞は、不死化され得る。しかし、免疫学的応答の機会を減少させるために、この細胞がカプセル化されて、周囲の組織の浸潤を回避し得ることが好ましい。カプセル化物質は代表的に、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子によるこの細胞の破壊を妨げる、生体適合性の半透性ポリマー性の被包物（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）または膜である。
細胞の膜カプセル化のために使用される方法は、当業者に熟知され、そしてカプセル化された細胞の調製および患者中でのそれらの移植は、過度の実験を伴わずに達成され得る。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きている細胞をカプセル化するための系は、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０４２５号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。種々の他の持続送達手段または制御送達手段を処方するための技術（例えば、リポソームキャリア、生体侵食性粒子またはビーズ）もまた当業者に公知であり、記載される。カプセル化を伴うかまたは伴わない細胞は、患者の適切な身体組織または器官に移植され得る。
上記で考察されるように、１以上のＦＧＦ様ポリペプチド、改変体、誘導体および／またはフラグメントを用いて、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、白血球、赤血球、骨髄、軟骨細胞、ニューロン、膵島、肝細胞など）を処置することが所望され得る。このことは、単離された細胞を、このポリペプチド、改変体、誘導体またはフラグメントに直接曝露することによって達成され得、ここで、これらは、細胞膜に透過性または細胞膜に作用する形態である。
本発明のさらなる目的は、相同組換えによる治療的タンパク質のインビトロ産生、ならびに遺伝子治療による治療的タンパク質の産生および送達の両方のための方法に関する。
ＦＧＦ様タンパク質が相同組換えにより、またはＦＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡをすでに含む細胞へ導入された制御エレメントを利用する組換え生成方法を用い得ることは、さらに想到される。例えば、相同組換え方法を用いて、正常には転写的にサイレントなＦＧＦ様遺伝子または過少発現される遺伝子を含む細胞を改変し、それによって、治療的に効力のある量のＦＧＦ様ポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または正すために遺伝子を標的化するために元々開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１，１９８９）。基本的技術は、特定の変異を、哺乳動物ゲノムの特定の領域へ導入するための方法として（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８５８３−８５８７（１９８８））、または欠損遺伝子内の特定の変異を正すための方法として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８（１９８７））開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号、ＥＰ特許９１ ９０ ３０５１号、ＥＰ公開第５０５ ５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９５５に記載される。
相同組換えを通して、ゲノム中に挿入されるべきＤＮＡ配列は、標的化ＤＮＡにこのＤＮＡ配列を結合することによって目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ領域に相補的である（相同である）ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である、標的化ＤＮＡの小片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖と接触させられる。ハイブリダイズする、それゆえ、共有された相同領域を通して内因性ＤＮＡの他の小片と組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、新たなＤＮＡ配列が、テンプレートとして役立つことが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノム内に組み込まれる。
標的化ＤＮＡのこれらの小片に結合されるのは、ＦＧＦ様タンパク質の発現と相互作用し得るＤＮＡ領域である。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサーまたは外因性転写調節エレメントは、所望のＦＧＦ様タンパク質をコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分に近位でかつ十分な方向で、意図される宿主細胞のゲノムに挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム中に存在する一部のＤＮＡを制御する。従って、ＦＧＦ様タンパク質の発現は、ＦＧＦ様遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、ＦＧＦ様タンパク質の転写について認識可能なシグナルと内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合された標的化ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成され得る。
例示的な方法では、細胞内の所望の標的化された遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞性遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ導入によって、予め選択された部位での細胞ゲノムへの相同組換えによって変更される。これらの成分は、事実上、これらの成分が、新たな転写単位（ここでは、ＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エキソおよびスプライスドナー部位が内因性遺伝子に作動的に連結される）の産生をもたらす様式で染色体（ゲノム）ＤＮＡ中に導入される。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
変更された遺伝子発現は、本明細書中に記載されるように、得られたときの細胞において通常サイレントな（発現されない）遺伝子を活性化すること（または発現させること）、遺伝子の発現を増大させること（得られたときの細胞において生理学的に有意なレベルで発現されない遺伝子を発現させることを包含する）、得られたときの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なるように調節または誘導のパターンを変更すること、ならびに得られたときの細胞において発現される遺伝子の発現を減少させること（除去することを含む）を包含する。
本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用な、ＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態においては、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）標的化配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（ｄ）非対性スプライスドナー部位。このＤＮＡ構築物における標的化配列は、細胞内の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の取り込みを、エレメント（ｂ）〜（ｄ）が内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結するよう指向する。別の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位；ここで、この標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の取り込みを、（ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結するよう指向する。この標的化配列は、細胞染色体ＤＮＡの、相同組換えが起こる予め選択された部位に相同である。この構築物において、エキソンは、一般に、調節配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、エキソンの３’側である。
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中に提示されるＦＧＦ様ポリペプチドの核酸配列）が既知である場合には、この遺伝子の選択された位置に相補的なＤＮＡ片が、例えば、天然のＤＮＡの、目的の領域に結合している特異的な認識部位における適切な制限によって合成され得るか、または他の様式で得られ得る。この片は、細胞への取り込みの際の標的化配列として働き、そしてゲノム内のその相同領域とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に起こる場合には、このＤＮＡ片、およびこのＤＮＡ片に付着した任意のさらなる配列が、岡崎フラグメントとして働き、そして新に合成されたＤＮＡの娘鎖に取り込まれる。従って、本発明は、ＦＧＦ様分子をコードするヌクレオチドを包含し、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
ＦＧＦ様ポリペプチド細胞治療（例えば、ＦＧＦ様ポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた、本発明に含まれる。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＦＧＦ様ポリペプチドを合成および分泌し得る構築物を患者の細胞に移植することを包含する。このようなＦＧＦ様ポリペプチド産生細胞は、ＦＧＦ様ポリペプチドの天然の産生者である細胞であり得るか、またはＦＧＦ様ポリペプチドを産生するその能力が所望のＦＧＦ様分子をコードする遺伝子もしくはＦＧＦ様ポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換することによって増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、その遺伝子を送達するため、ならびにその発現および分泌を促進するために適したベクターによって、達成され得る。外来種のＦＧＦ様ポリペプチドまたはタンパク質を投与される患者において潜在的な免疫学的反応を最小化するためには、ＦＧＦ様ポリペプチドを産生する天然の細胞がヒト起源であること、およびヒトＦＧＦ様タンパク質を産生することが好ましい。同様に、ＦＧＦ様ポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＦＧＦ様分子をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが、好ましい。
移植される細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物の細胞が、ＦＧＦ様ポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系によるかまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する、生体適合性の半透過性のポリマー性被包物または膜内で、患者に移植され得る。あるいは、ＦＧＦ様ポリペプチドを産生するようにエキソビボで形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしに、患者に直接移植され得る。
生存細胞をカプセル化するための技術は、当該分野において公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびこれらの患者への移植は、過度の実験なしに達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５／０５４５２（この開示は、本明細書中によって参考として援用される））は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のための、遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。これらのカプセルは生体適合性であり、そして容易に回収可能である。これらのカプセルは、プロモーターに作動可能に連結した生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化し、これらは、哺乳動物宿主への移植の際に、インビボでのダウンレギュレーションに曝されない。このデバイスは、生存細胞からレシピエント内の特異的な部位への分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するための系は、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの国際公開番号ＷＯ ９１／１０４２５に記載される。Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの国際公開番号ＷＯ ９１／１０４７０；Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−２９，１９９１，Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−７５，１９９１；およびＴｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３，１９９２を参照のこと。
ＦＧＦ様ポリペプチドの、インビボおよびインビトロでの遺伝子治療送達もまた、想定される。インビボ遺伝子治療は、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子を、ポリヌクレオチド分子または他の適切な送達ベクターの局所的注射によって、細胞に導入することによって、達成され得る（Ｈｅｆｔｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５，１９９４）。例えば、ＦＧＦ様タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、標的化された細胞への送達のために、アデノ随伴ウイルスベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開番号ＷＯ ９５／３４６７０；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは、代表的に、機能的プロモーターに作動可能に連結したＦＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復、およびポリアデニル化配列を含む。
代替のウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクターおよびパピローマウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボのウイルスにより媒介される遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、患者に治療タンパク質を提供するためのプロセスの例を、提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられる。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導的プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的取り込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全性の尺度）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、ベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびにベクター作製の方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実施のための、このようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術）；国際公開番号ＷＯ ９６／４０９５８（核リガンド）；米国特許第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を考慮する）；米国特許第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）；米国特許第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する）；および米国特許第４，９４５，０５０号（ここで、生物学的に活性な粒子が、細胞において、この粒子がこの細胞の表面を貫通する速度で推進され、そしてこの細胞の内側に取り込まれる）に記載されている。発現制御技術としては、化学的に誘導される調節（例えば、国際公開番号ＷＯ ９６／４１８６５およびＷＯ ９７／３１８９９を参照のこと）、改変されたステロイドホルモンレセプター系におけるプロゲステロンアンタゴニストの使用（例えば、米国特許第５，３６４，７９１号を参照のこと）、エクジソン制御系（例えば、国際公開番号ＷＯ ９６／３７６０９を参照のこと）ならびにポジティブテトラサイクリン制御可能トランスアクチベーター（例えば、米国特許第５，５８９，３６２号；米国特許第５，６５０，２９８号；および米国特許第５，６５４，１６８号を参照のこと）が挙げられる。
ＦＧＦ様ポリペプチドの遺伝子治療または細胞治療が、第二のタンパク質の送達をさらに含み得ることもまた、考慮される。例えば、宿主細胞が、ＦＧＦ様ポリペプチドと第２のタンパク質（例えば、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１））を発現し、そして放出するように、改変され得る。あるいは、ＦＧＦ様ポリペプチドおよび第２タンパク質の両方は、別の細胞において発現され、そしてその細胞から放出され得る。このような細胞は
、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）内に含まれ得る。
遺伝子治療が適用され得る１つの様式は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターに作動可能に連結され得るＦＧＦ様遺伝子（ＦＧＦ様ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡ、あるいはそのフラグメント、改変体、または誘導体のいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内因性ＦＧＦ様遺伝子に対して相同であっても異種であってもよいが、但し、この構築物が挿入される細胞または組織型において、このプロモーターは活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分としては、以下：部位特異的取り込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性隣接配列）、組織特異的なプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標的として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびにベクターの製造を可能にする因子が挙げられ得る。
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、患者の細胞に（エキソビボまたはインビボでのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、ウイルスベクターを介する。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の送達のための遺伝子治療に代表的に使用される適切なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのベクターの内のいくつか（例えば、レトロウイルスベクター）は、遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞の染色体ＤＮＡへ送達し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、染色体ＤＮＡへ組み込まれ得る；他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
遺伝子治療によって、細胞における内因性ＦＧＦ様ポリペプチド発現を増加させるための別の手段は、１つ以上のエンハンサーエレメントをＦＧＦ様ポリペプチドプロモーターに挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、ＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子の転写活性を増加させるよう作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望である組織に基づいて、選択される−この組織においてプロモーター活性化を与えることが公知であるエンハンサーエレメントが、選択される。例えば、ＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「オンにされる」場合には、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、添加される転写エレメントの機能性部分が、標準的なクローニング技術を使用して、ＦＧＦ様ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクター、ならびに／または５’隣接配列および／もしくは３’隣接配列などに挿入される）。次いで、この構築物（「相同組換え構築物」として公知）が、エキソビボでかまたはインビボでのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
遺伝子治療は、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、ＦＧＦ様ポリペプチド発現を減少させるために、使用され得る。このような改変は、代表的に、相同組換え法を介して達成される。例えば、不活化のために選択されたＦＧＦ様遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーター片を除去および／または置換するように、操作され得る。ここで例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写アクチベーターの結合部位が、標準的な分子生物学の技術を使用して、欠失され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、これによって、対応するＦＧＦ様遺伝子の転写を抑制する。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節されるＦＧＦ様遺伝子と同じ種かまたは関連する種由来の）ＦＧＦ様ポリペプチドプロモーターの全てまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって、達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して、変異される。その結果、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性が減少しているか、または完全に不活性にされている。この構築物はまた、代表的に、改変されたプロモーターセグメントに近接するネイティブな（内因性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む。この構築物は、直接的にかまたは本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してかのいずれかで、適切な細胞に（エキソビボでかまたはインビボでかのいずれかで）導入され得る。代表的に、細胞のゲノムＤＮＡへの、この構築物の取り込みは、相同組換えを介し、ここで、プロモーター構築物における５’および３’ＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションを介する内因性染色体ＤＮＡへの改変されたプロモーター領域の取り込みを補助するよう作用し得る。
他の遺伝子治療方法がまた、１つ以上のＦＧＦ様ポリペプチドの活性を阻害することが望ましい場合、使用され得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これは、選択されたＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）が、細胞へ導入され得る。代表的には、そのようなアンチセンス分子各々は、各選択されたＦＧＦ様遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。次いで、アンチセンス分子が対応するＦＧＦ様ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。
あるいは、遺伝子治療が使用されて、１つ以上のＦＧＦ様ポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターが作製され得る。この場合、各選択されたＦＧＦ様ポリペプチドの変異体全長または短縮ポリペプチドをコードするＤＮＡが、調製され得、そして上記のようなウイルス方法または非ウイルス方法のいずれかを用いて患者の細胞へ導入され得る。このような変異体の各々は、代表的には、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
（ＦＧＦ様核酸およびポリペプチドの用途）
本発明の核酸分子を使用して、ＦＧＦ様遺伝子および関連する遺伝子の位置を、染色体上にマップし得る。マッピングは、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーションのような、当該分野において公知の技術によって、なされ得る。
核酸分子はまた、ＦＧＦ様ポリペプチド発現のアンチセンスインヒビターとして使用される。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＦＧＦ様ｍＲＮＡに相補的であり、そしてこれらとハイブリダイズする核酸分子によって、生じ得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＦＧＦ様遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術によって、設計され得る。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるＦＧＦ様ポリペプチドの減少または非存在に関連する情報を提供する。
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるようなＦＧＦ様遺伝子配列を用いて調製され得、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを関連配列に関してスクリーニングし得る。既知の配列に対して有意な同一性を示すＦＧＦ様ポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、上記に開示される配列アラインメントアルゴリズムを用いて用意に決定され、そしてこれらの領域は、スクリーニングのためのプローブを設計するために使用され得る。
本発明の核酸分子は、遺伝子治療に使用され得る。インビボでＦＧＦ様ポリペプチドを発現する核酸分子は、細胞または生物におけるこのポリペプチドの効果に関連する情報を提供する。
それ自身は生物学的に活性なポリペプチドをコードしないＦＧＦ様の核酸分子、フラグメント、改変体および／または誘導体は、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得、定性的または定量的に、哺乳動物の組織サンプルまたは体液サンプルにおけるＦＧＦ様ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在に関して試験する。
ＦＧＦ様のポリペプチド、フラグメント、改変体および／または誘導体は、以下を予防または処置するために使用され得る；肝硬変または肝臓の他の毒性傷害；炎症性腸疾患、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、クローン病または他の胃腸管異常；糖尿病；肥満；神経変性疾患；創傷；角膜上皮、水晶体または網膜組織に対する損傷；急性尿細管壊死の結果としての、尿細管に対する損傷；化学療法後の造血細胞の再構築；るいそう症候群（例えば、癌関連悪液質）、多発性硬化症、筋障害；低身長、成熟遅延、過成長（例えば、末端肥大症）、早熟成熟；脱毛症；アンドロゲン標的器官の疾患または異常；乳児性呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、急性呼吸促進症候群または他の肺の異常；眼または他の組織の腫瘍；アテローム性動脈硬化症；高コレステロール血症；糖尿病；肥満；発作；骨粗鬆症；変形性関節症；変形性関節病；筋萎縮症；低筋肉症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）；除脂肪体重の減少；禿頭症；しわ；疲労増大；スタミナ減少；心機能低下；免疫系機能不全；癌；パーキンソン病；老年痴呆；アルツハイマー病；および認知機能低下。
ＦＧＦ様ポリペプチドフラグメント、改変体、および／または誘導体は、生物学的に活性であるか否かに関わらず、ＦＧＦ様ポリペプチドに結合する抗体を調製するために有用である。この抗体は、インビボおよびインビトロの診断目的のために使用され得、これらには、体液サンプルまたは細胞サンプルにおけるＦＧＦ様ポリペプチドの存在を検出するための標識形態での使用が挙げられるが、これに限定されない。この抗体はまた、ＦＧＦ様ポリペプチドの発現または活性における増加と関連し得る状態を予防または処置するために使用され得る。この抗体は、ＦＧＦ様ポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を消滅またはブロックするために、ＦＧＦ様ポリペプチドに結合し得るか、または活性を増加するためのポリペプチドへ結合し得る。
ＦＧＦ様ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に、１９９９年９月３日になされ、登録番号ＰＴＡ−６２６を有する。
以下の実施例は、例示目的のみであることが意図され、そしてどのようにも本発明の範囲を限定するとして構築されるべきではない。
（実施例１：マウスＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される材料および方法を使用して、ラットＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子をクローン化および分析した。
マウスＦＧＦ様ポリペプチドをコードする配列は、マウス再生肝ｃＤＮライブラリーから、ｋＦＧＦシグナルトラップシステムにおいてライブラリーをスクリーニングすることによって、単離した（米国特許出願番号０９／０２６，９５８）。この一次スクリーニング技術は、分泌タンパク質を含むシグナルペプチドをコードするクローンに関して富化した。
一次ライブラリー（Ｔｍｒｌ１）を、以下のようにｋＦＧＦベクターに構築した。再生マウス肝臓を、部分肝切除の２４時間後に取り除き、そしてポリＡ＋ＲＮＡを、市販のＲＮＡ抽出キットおよびｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて調製した。ｃＤＮＡライブラリーは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）をいくらか改変して用いて調製した。第１鎖の反応を、３μｇのポリＡ＋ＲＮＡおよび５００μｇのプライマー５’−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−３’（配列番号３４）を用いて実施した。第２鎖合成の後に、ｃＤＮＡを、Ｓａｌ Ｉアダプターに連結し、Ｎｏｔ Ｉを用いて消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画した。分画されたｃＤＮＡ（０．２〜０．８ｋｂの範囲のサイズ）を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、次いで、以下のようにｋＦＧＦベクターへ連結した。２０μｌの反応において、５０μｇのベクターＤＮＡ（Ｓａｌ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて事前に消化した）を、２０μｇの精製ｃＤＮＡ、１×リガーゼ緩衝液、および１ｍｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼと１６℃で２０時間混合した。
この連結産物を、沈澱させ、そしてエレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉに導入し、この後、形質転換された細菌細胞を、５ｍｌのＳＯＣ培地中、３７℃で１時間増殖させ、次いで、１０％グリセロール中−８０℃で凍結した。これは、一次Ｔｍｒｌ１ライブラリーを構築した。一次Ｔｍｒｌ１ｃＤＮＡライブラリー由来のプラスミドＤＮＡを、標準的な手順を用いてＬＢ／アガープレート上に増殖された５０，０００個のコロニーのプールから調製した。１０個のプールを調製し、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎマキシプレップキットを用いてこのプールから単離した。
収集されたプラスミドＤＮＡを、引き続き、カルシウムリン酸トランスフェクションによってＮＩＨ３Ｔ３細胞へ導入した。各反応において、各プール由来の１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用して、１枚の３５ｍｍプレートに約２×１０5細胞をトランスフェク
トした。２４時間後、次いでこの細胞を５枚の１００ｍｍプレートに分け、通常培地中で一日増殖させ、次いで、低血清培地で１３日間増殖させた。約４０００個の全コロニーを、低血清培地における増殖に続いて得た。
シグナルペプチド富化された再生ｃＤＮＡ分子を、以下のようにトランスフェクトされた細胞から回収した。２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡの添加、および３７℃で５分間のインキュベーション、続いて、温和に渦を巻くことによって、細胞をプレートから解放させた。解放された細胞を、２ｍｌのウシ胎仔血清を有する５０ｍｌのコニカルチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞をペレットにした。わずか１ｇの細胞ペレットを、２０ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（ＢＲＬ）を用いて溶解し、３０秒間ホモジナイズし、次いで、４ｍｌのクロロホルムを用いて抽出した。このチューブを、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、そして水相を、新しいチューブに移した。ＲＮＡを、１０ｍｌのイソパノールを添加し、混合し、次いで、３０分間４２００ｒｐｍで遠心分離することによって沈澱させた。ＲＮＡペレットを、１０ｍｌの７０％エタノールを用いて洗浄し、簡単に乾燥させ、次いで、このペレットを、０．５ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ポリＡ＋ＲＮＡを、市販のｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによって調製した。７５０μｌのＴＥ緩衝液中ポリＡ＋ＲＮＡをカラムから溶出した後、次いでこのサンプルを、４０μｌのサンプル緩衝液および１ｍｌのエタノールを添加し、一晩−７０℃でインキュベートすることによって、２つの１．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブ中でエタノール沈澱させた。
陽性クローンのｃＤＮＡ挿入物を、以下のようにＲＴ−ＰＣＲによってレスキューした。第１の鎖合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM前増幅システム（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＢＲＬ）を用いて実施した。選択された３Ｔ３コロニー由来の１５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含む混合物および１５μｌ（２μＭ）のベクタープライマー（５’−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−３’；配列番号３５）を、調製し、次いで、７０℃で１０分間インキュベートし、続いて、５０℃で平衡させた。次いで、２．５μｌ １０×緩衝液、２．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．３μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ、および２．５μ
ｌ ０．１Ｍジチオトレイトールを含む前混合物を、ポリＡ＋ＲＮＡ／プライマー混合物に添加し、この後、１．２μｌの逆転写酵素を添加し、そしてこの反応物を、５０℃で１時間インキュベートした。この反応物を、７０℃で１５分間加熱することによって停止した。
第１鎖合成のあと、ＲＮＡを、１μｌのＲＮａｓｅ Ｈを用いて３７℃で２０分間で消化した。ＰＣＲを、以下のように、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施した。１００μｌの総容量において、２μｌの第１鎖反応物を、１×Ｐｆｕ緩衝液、０．５μＭの各増幅プライマー（５’−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−３’；配列番号３６；および５’−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号３７）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、５％ ＤＭＳ、および２．５ユニットのＰｆｕポリメラーゼに添加した。この増幅反応は、９５℃で１分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、６６℃で４５秒間、および７２℃を３０サイクル；ならびに７２℃で１０分間を１サイクルで実施した。ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルム抽出、続くエタノール沈澱によって精製し、次いで、Ｎｏｔ
ＩおよびＳａｌ Ｉを用いて消化した。Ｓｍａｌ Ｉ消化産物およびＰＣＲプライマーを、ＳｉｚｅＳｅｐ ４００Ｓｐｕｎカラムを用いてこの反応物から除去した。
一次スクリーニングにおいて同定されたクローンを、引き続き２次分泌アッセイにおいて分析した。この二次スクリーニング技術は、短縮型胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）を含むベクター（ここで、ネイティブなシグナルペプチドは、取り除かれている）を分泌レポーター遺伝子として使用した。異種ｃＤＮＡフラグメントを、個々の配列を短縮ＰＬＡＰ遺伝子のすぐ上流に挿入し、次いで、この試験構築物を用いてＣＯＳ７細胞をトランスフェクトすることによって、シグナルペプチド分泌配列の存在に関して試験した。シグナルペプチドをコードする挿入されたｃＤＮＡ配列は、ＰＬＡＰレポーター配列とインフレームで挿入された場合、トランスフェクト細胞から分泌され得る融合タンパク質の形成を導く。
ＰＬＡＰレポーター構築物は、以下のように作製された。ヒト胎盤ＲＮＡを、標準的な条件下でＲＴ／ＰＣＲ増幅に供し、短縮ヒトＰＬＡＰタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを作製した。ＲＮＡを、オリゴｄ（Ｔ）をプライマーとして使用した逆転写酵素によって転写し、次いで、ＰＬＡＰ特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、アミノ酸２２〜５３６に対応するＰＬＡＰ配列をコードするＲＮＡ産物を生成した（Ｍｉｌｌａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（７）：３１１２−１５（１９８６））。ＰＬＡＰ増幅プライマー（５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号３８；および５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号３９）を、それぞれ、Ｎｏｔ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位を含むように設計し、これは、ＰＬＡＰフラグメントのｐｃＤＮＡ３．１ベクターへの連結を容易にする（ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＰＬＡＰを作製する）。
Ｔｍｒｌ１二次ライブラリーを、以下のようにｐｃＤＮＡ３．１／ＰＬＡＰ中に構築した。一次Ｔｍｒｌ１ライブラリー中のクローン由来のｃＤＮＡ挿入物を、ＰＣＲ増幅プライマーおよび上記の条件を用いて３Ｔ３細胞のコロニーから回収した。回収されたＰＣＲ産物を、次いで、Ｘｈｏ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限酵素で消化されたｐｃＤＮＡ３．１／ＰＬＡＰベクター中に連結した。次いで、連結産物を、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換し、二次Ｔｍｒｌ１ライブラリーを作製した。
シグナルペプチド分泌配列の存在について異種ｃＤＮＡフラグメントをアッセイするために、個々のコロニーを、最初に、低密度でプレートした寒天プレートの二次Ｔｍｒ１ライブラリーから選択し、そして細菌増殖培地を含む標準的な９６ウェルのプレートのウェルに配置した。次いで、培養物を飽和するまで増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを標準的な手順によってそれぞれの培養物から調製した。このように調製されたプラスミドＤＮＡを使用して以下に記載のようにＣＯＳ７細胞をトランスフェクトした。
ＣＯＳ７細胞を、ＤＭＥＭ−ＨＧ、１０％ウシ胎仔血清および１×ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン）からなる２００μｌの増殖培地中１ウェル当たり６０００個の細胞の濃度で９６ウェルの平底プレートに播種した。ＣＯＳ７細胞の播種に続いて、プレートをＣＯ2インキュベーター中で３７℃で２４時間インキュベート
した。それぞれのウェルの細胞を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する選択二次Ｔｍｒ１ライブラリークローンから回収した５００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション反応を、二時間進行させ、その後、トランスフェクトされた細胞を、２００μｌのフェノールレッドを含まない、無血清ＤＭＥＭを用いて洗浄し、次いで、１００μｌのフェノールレッドを含まない血清を含まないＤＭＥＭおよびグルタメートとともにＣＯ2インキュベーター中で３７℃で２４時間インキュベー
トした。インキュベーションに続いて、１Ｍジエタノールアミン、１０ｍＭホモアルギニン、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中の２００μＭ ４−メチルウン
ベリ−フェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉ−ｆｅｒｙｌ）ホスフェート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む１００μｌの溶液をそれぞれのウェルに加え、インキュベーションを１時間３７℃で続けた。次いで、アルカリホスファターゼ反応の生成物を蛍光計で３６０／４６０ｎｍで読んだ。
単一のクローン（ｔｍｒｌ１−００００１−ｅ９）（ＰＬＡＰアッセイで読み取られた蛍光の増加を生じ、そしてコンピュータ予測されたシグナルペプチド配列を有し、ＦＧＦファミリーに相同である）を、二次Ｔｍｒｌ１ライブラリースクリーンで同定した。続いて、このクローンをプローブとして使用してマウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーからマウスＦＧＦ様ポリペプチドについて全長ｃＤＮＡを単離した。マウス肝臓全長ｃＤＮＡライブラリーを標準的技術を使用して構築した。基本的に、オリゴｄ（Ｔ）を使用して、再生マウス肝臓から単離したｍＲＮＡから最初の鎖合成をプライムし、次いで全長ｃＤＮＡ配列を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用してｐＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）にクローン化した。
マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーの一次スクリーンにおいて、５０，０００コロニーをＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレートにプレートし、次いで、ニトロセルロースフィルターに移した。フィルターをｋＦＧＦシグナルトラップおよび分泌アッセイスクリーニングにおいて同定されたクローンから誘導されるプローブの混合物でスクリーニングした。このプールのプローブは、ｔｍｒｌ１−００００１−ｅ９クローンから単離された３３９ｂｐ Ｎｏｔ Ｉ−Ｘｂａ Ｉフラグメントを含んだ。フィルターを、最初に５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液中で２時間４２℃でプレハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを、新鮮なハイブリダイゼーション溶液中で４２℃で１晩、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブとともにインキュベートした。次いでフィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄し、続いて−８０℃で１晩オートラジオグラフィによって分析した。この最初のスクリーンから、９２の陽性のクローンを同定した。
一次スクリーンで単離された陽性クローンをプールし、そして３３９ｂｐのｔｍｒｌ１−００００１−ｅ９フラグメントのみを再スクリーニングした。この二次スクリーニングにおいて、クローンプールから誘導された６０００コロニーをＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレートにプレートし、次いでニトロセルロースフィルターに移した。二次スクリーンに使用されるハイブリダイゼーション条件は、一次スクリーンに使用した条件と同じであった。３つの個々のクローン（１Ｅ、１Ｅ−４、および１Ｅ−６）を二次スクリーンで同定した。
二次スクリーンで同定された３つの個々のクローンの制限消化は、それぞれが１．６ｋｂの挿入物を含んだことを示した。この挿入物によってコードされるコード配列の５’末端（５’−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号７）および３’末端（５’−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−３’；配列番号８）に対応するプライマーを設計し、続いてクローン１Ｅの部分配列分析を行った。これらのプライマーを、クローン１ＥプラスミドＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用した。増幅反応を９４℃で一分間１サイクル；９４℃１５秒間および６５℃で１．５分間３５サイクル；ならびに７２℃で１０分間１サイクルを行った。約６５０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅に続いて得た。
Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用する１％アガロースゲルからの精製に続いて、ＰＣＲ産物を配列決定した。この増幅産物の配列分析は、ＰＣＲプライマーが誘導されるｃＤＮＡクローンが２１０アミノ酸のタンパク質をコードする６３０ｂｐのオープンリーディングフレームを含む遺伝子を含むことを示した。図１は、マウスＦＧＦ様遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびマウスＦＧＦ様タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。クローン１Ｅの引き続く配列分析はまた、二次スクリーニングにおいて同定されるｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレームが２つのイントロン配列によって中断されていることを確立した。ＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースのＦＡＳＴＡプログラムを使用するコンピュータ分析は、このオープンリーディングフレームがＦＧＦ−６（図３Ａ〜３Ｄ）に最も関連した（３９％同一）ポリペプチドをコードすることを示した。
ＳＩＧＮＡＬＰプログラム（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用するコンピュータ分析はまた、マウスＦＧＦ様ポリペプチドがそのアミノ末端に潜在的なシグナルペプチド（Ｍ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｒ−Ｓ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ｙ−Ｑ−Ａ；配列番号４０；図１で下線が引かれる）を保有したことを示した。マウスＦＧＦ様ポリペプチドの最初の翻訳産物は、可能な翻訳後修飾を含まないで２３，２３７の計算された分子量を有する。推定の２９アミノ酸シグナルペプチド配列の除去の後に、１８１アミノ酸の残りの推定成熟タンパク質が１９，８７６の計算された分子量を有する。推定されるＮ連結グリコシル化部位は、このタンパク質において同定されず、このタンパク質は、ニ塩基プロテアーゼプロセシング部位を保有しない。
（実施例２：ヒトＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら上述に記載される物質および方法を使用して、ヒトＦＧＦ様ポリペプチドをコードする遺伝子をクローン化および分析した。
ヒトＦＧＦ様ポリペプチドをコードする配列は、マウスＦＧＦ様ポリペプチド遺伝子から誘導されるプローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離された。４６０ｂｐのプローブを、32Ｐ−ｄＣＴＰを含む反応物において、以下のプライマー：５’−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号７）および３’（５’−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号９）を使用してマウスＦＧＦ様ポリペプチドｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって作製した。増幅反応を９４℃で一分間１サイクル；９４℃で１５秒間および６５℃で１．５分間３５サイクル；ならびに７２℃で１０分間１サイクルを行った。
４６０ｂｐのマウスプローブを使用して、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからヒトＦＧＦ様ポリペプチドに対する全長ｃＤＮＡを単離した。ヒト肝臓全長ｃＤＮＡライブラリーを、標準的技術を使用して構築した。基本的に、オリゴｄ（Ｔ）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から得たｍＲＮＡから最初の鎖合成をプライムし、次いで全長ｃＤＮＡ配列を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用してｐＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）にクローン化した。
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーの一次スクリーンにおいて、５５０，０００コロニーをＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレートにプレートし、次いで、ニトロセルロースフィルターに移した。フィルターをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中３０分間６０℃でプレハイブリダイズし、次いで、新鮮なＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液で６０℃で１晩32Ｐ−ｄＣＴＰ標識マウスＦＧＦ様ｃＤＮＡプローブとともにインキュベーションした。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温で３０分間２回、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６０℃で３０分間２回、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間２回洗浄し、次いで、フィルターを−８０℃で１晩オートラジオグラフィによって分析した。次いで一次スクリーンにおいて同定される陽性クローンを再スクリーニングし、４つの独立したクローンを二次スクリーニングの後に回収した。これらの４つのクローンに対するプラスミドＤＮＡを調製し配列決定した。
配列分析は、４つのクローンが１．２ｋｂまたは１．８ｋｂのいずれかの挿入物を含んだことを示した。１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入物は、２０９アミノ酸のタンパク質をコードする６２７ｂｐのオープンリーディングフレームを含む遺伝子を含んだ。図２Ａ〜２Ｂは、ヒトＦＧＦ様遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＦＧＦ様タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。１．８ｋｂのｃＤＮＡ挿入物が１．２ｋｂ挿入物によってコードされるものと同じオープンリーディングフレームを含むが、この挿入物のオープンリーディングフレームは、さらに実施例１で単離されたマウスｃＤＮＡクローンのいくつかに見出される第２のイントロンに対する位置に対応するイントロンによって中断された。
図３Ａ〜３Ｄは、ヒトＦＧＦ様タンパク質、マウスＦＧＦ様タンパク質、およびＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列の整列を示す。ヒトＦＧＦ様ポリペプチドは、マウスＦＧＦ様タンパク質に７６％同一である。ＳＩＧＮＡＬＰプログラム（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用するコンピュータ分析は、ヒトＦＧＦ様ポリペプチドがまた、そのアミノ末端に潜在的なシグナルペプチド（Ｍ−Ｄ−Ｓ−Ｄ−Ｅ−Ｔ−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｗ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｑ−Ａ；配列番号４１；図２Ａ〜２Ｂで下線が引かれる）を保有することを示した。ヒトＦＧＦ様ポリペプチドの最初の翻訳産物は、２２，２８４の計算された分子量を有し、可能な翻訳後修飾を含まない。推定の２８アミノ酸シグナルペプチド配列の除去の後に、１８１アミノ酸の残りの推定成熟タンパク質が１９，３９５の計算された分子量を有する。推定されるＮ連結グリコシル化部位は、このタンパク質において同定されず、このタンパク質は、ニ塩基プロテアーゼプロセシング部位を保有しない。
（実施例３：ＦＧＦ様ｍＲＮＡ発現）
マウスＦＧＦ様ｍＲＮＡの発現は、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識マウスＦＧＦ様ｃＤＮＡプローブを使用してマウスの複数の組織に対してノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で試験した。３９１ｂｐのフラグメントからなるプローブは、Ｘｂａ
ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いた制限消化によってｔｍｒｌ１−００００１−ｅ９クローンから単離した。ブロットを最初に５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液中で２時間４２℃でプレハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを、新鮮なハイブリダイゼーション溶液中で４２℃で１晩、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識マウスＦＧＦ様ｃＤＮＡプローブとともにインキュベートした。次いでフィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄し、続いて−８０℃で１晩オートラジオグラフィによって分析した。約１．３５ｋｂおよび１．８ｋｂの２つの転写物を、マウス肝臓（図４Ａ）において検出した。１．３５ｋｂ転写物は、顕著の発現を示した。
ヒトＦＧＦ様ｍＲＮＡの発現を、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識ヒトＦＧＦ様ｃＤＮＡプローブを使用して、Ｈｕｍａｎ ＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＢｌｏｔTM（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびヒトの複数の組織のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で試験した。プローブは、以下のプライマー：５’−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−ＴＡ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−３’；配列番号１２；および５’Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号１３、ならびに鋳型として上記のヒトｃＤＮＡクローンを使用して、ヒトＦＧＦ様タンパク質コード領域から誘導された６６０ｂｐのＰＣＲ産物からなる。増幅反応を、９４℃で１分間１サイクル；９４℃で１５秒間、６０℃で１５秒間および７２℃で１分間３５サイクル；および７２℃で１０分間１サイクルで行った。ブロットを最初にＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中１時間６５℃でプレハイブリダイズし、次いで、新鮮なＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液で６５℃で１晩32Ｐ−ｄＣＴＰ標識ヒトＦＧＦ様ｃＤＮＡプローブとともにインキュベーションした。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温で３０分間２回、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間２回洗浄し、次いで、フィルターを−８０℃で１晩オートラジオグラフィによって分析した。約１．２ｋｂおよび２ｋｂの２つの転写物を複数の組織ノーザンブロット９（図４Ｂ）におけるヒト肝臓において検出した。成体肝臓における強い発現ならびに肺および胎児肝臓における弱い発現は、Ｈｕｍａｎ ＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＢｌｏｔTMで検出された（図４Ｃ）。
（実施例４：ＦＧＦ様ｍＲＮＡインサイチュ分析）
インサイチュハイブリダイゼーションを、マウスＦＧＦ様ポリペプチドのコード領域にわたる６４８ｂｐのアンチセンスＲＮＡプローブで行った。プローブは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび33Ｐ−ＵＴＰを使用するＦＧＦ様ｃＤＮＡ挿入物を含む線形化されたｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯから転写された。
正常な胚および成体のマウス組織のパネルを、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに埋め込み、そして５μｍで切り出した。インサイチュハイブリダイゼーションの前に、組織を０．２Ｍ ＨＣｌで透過性にし、続いてプロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化した。区画を33Ｐ標識リボプローブで１晩５５℃でハイブリダイズし、次いで０．１×ＳＳＣ中で６０℃で高ストリンジェンシーに供した。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２乳濁液に浸し、４℃で２〜３週間曝露し、現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。区画を暗視野および標準的な照射で調べて組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルの同時評価を可能にした。
最も強い全発現は、膵臓において認められ、強いシグナルが島にわたって検出され、より少なくより拡散したシグナルが膵臓の腺房部分にわたって検出された。肝臓は、中程度のレベルの拡散シグナルを示し、ＦＧＦ様ポリペプチドの中程度の肝細胞発現を示す。有意なシグナルはまた、精巣の精細管内の精原細胞および胸腺髄質における細胞にわたって存在した。低いレベルの拡散シグナルは、腎臓、脾臓、下垂体および白色および褐色脂肪組織において検出された。
（実施例５：哺乳動物細胞におけるＦＧＦ様ポリペプチドの産生）
ヒトとマウスのＦＧＦ様ポリペプチドは両方とも、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域を有する融合タンパク質としてそれらのカルボキシ末端において発現される。ヒトまたはマウスＦＧＦ様ポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を、配列の５’末端および３’末端（表ＩＩ）に対応するプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ヒトまたはマウスＦＧＦ様ポリペプチドのいずれかのコード領域に対応し、翻訳終結コドンを欠く。さらに、プライマーは、ＰＣＲ産物の５’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および産物の３’末端にＮｏｔ Ｉ部位を組み込むように設計された。
Figure 2010213705
ヒトおよびマウスＦＧＦ様タンパク質Ｆｃ融合構築物は、最初に、ＰＣＲ産物をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔ Ｉで切断し、次いでインフレームでフラグメントをヒト免疫グロブリンＩｇＧのＨＦｃ鎖をコードするＤＮＡフラグメントにライゲートすることによって作製された。次いで、ＦＧＦ様タンパク質Ｆｃ挿入物をｐＣＥＰ４哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートした。これらのライゲーションを、エレクトロポレーションおよびアンピシリン耐性について選択された形質転換体によるＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ１０に形質転換した。選択された形質転換体の配列分析に続いて、大スケールのプラスミドストックを、組織培養トランスフェクションのために調製した。選択されたアンピシリン耐性コロニーに対するプラスミドＤＮＡを調製し配列決定して、クローンが所望の挿入物を含むことを確認した。
ＦＧＦ様タンパク質に対する機能研究を行うために、ヒトまたはマウスＦＧＦ様タンパク質融合発現構築物を、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔTMトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２９３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞に導入した。馴化培地を一過性トランスフェクションの４８時間後に収集した。抗ヒトＦｃ抗体を使用するウエスタンブロット分析は、馴化培地がヒトまたはマウスＦＧＦ様／Ｆｃ融合ポリペプチドを含んだことを確認した。
馴化培地が、以下に記載のようにアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。培地を最初に０．２μｍのフィルターを通した。プロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｇｅｎｔｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で平衡化し、次いで、濾過した培地で充填した。カラムを、２８０ｎｍの吸収が基線に達するまで、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｇｅｎｔｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄した。ＦＧＦ様／Ｆｃタンパク質をＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｇｅｎｔｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いてカラムから溶出した。ＦＧＦ様／Ｆｃタンパク質を含む画分をプールし、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で透析し、続いてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で透析し、そして４℃で保存した。ゲル電気泳動分析は、プールされた画分が予期された分子量の約６０ｋＤの精製されたタンパク質を含んだことを確認した。
（実施例６：ＦＧＦ様ポリペプチドを過剰発現するトランスジェニックマウスの作製および分析）
ヒトアポリポタンパク質ＥプロモーターからのマウスＦＧＦ様ポリペプチド（配列番号４）を過剰発現するトランスジェニックマウスを、以前に記載されたように作製した（Ｓｉｍｏｎｅｔら，１９９７，Ｃｅｌｌ ８９：３０９−１９を参照のこと）。７匹のマウス（４匹のオスおよび３匹のメス）（これは、マウスＦＧＦ様遺伝子（配列番号３）についてトランスジェニックであり、そして５匹の非トンスジェニック同腹仔（２匹がオスそして３匹がメス）である）は、６〜８週齢で剖検および病理分析を受けた。全てのマウスに、収集の１時間前に５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵを注射し、次いでＸ線写真をとり、屠殺した。身体および選択された器官の重さを測定し、血液を血液学および血清化学のために引きぬき、器官を組織学的分析およびＢｒｄＵ標識化のために収集した。
全てのトランスジェニックマウスは、２０ｇｍ以下の体重であったが、全ての非トランスジェニックマウスは、２０ｇｍ以上の体重であった（ｐ＜０．０００１）。さらに、トランスジェニックマウスは、非トランスジェニックの対応のものよりも統計的に有意に少ない肝臓の重さ（ｐ＝０．００１１）および脾臓の重さ（ｐ＝０．００３９）ならびに多い胸腺の重さ（ｐ＝０．０１１８）（体重のパーセンテージとして）を有した。トランスジェニックマウスについて、体重は、野生型の６７％であった。肝臓、脾臓および胸腺の重さは、体重のパーセンテージとして、それぞれ、野生型の８５％、６３％および１７０％であった。すべての雌性トランスジェニックマウスはまた、小さな子宮および卵管ならびに黄体を欠く卵巣を有し、そしてほとんど卵胞発生を示さなかった。要約すると、トランスジェニックマウスは、小さな肝臓、脾臓および乏しく発達した卵巣を伴う発育阻止された成長、ならびに拡大された（おそらく退縮（ｉｎｖｏｌｕｔｅｄ）していない）胸腺を最も特徴とする表現型を有する。これらの変化は、年齢の一致した非トランスジェニック同腹仔と比較して、阻害されたかまたは遅延した成熟を引き起こすトランスジェニックにおけるＦＧＦ様ポリペプチドの過剰発現と最も一致する。
（実施例７：１才齢のＦＧＦ様ポリペプチドトランスジェニックマウスの分析）
剖検および病理学的分析を、実施例６に記載される実験で作製された１才齢のＦＧＦ様ポリペプチドトランスジェニック（５匹のオスおよび５匹のメス）ならびに非トランスジェニック（３匹のオスおよび２匹のメス）同腹仔で実行した。ＦＧＦ様ポリペプチドトランスジェニックは、阻害されたかまたは遅延した成熟として一般的に特徴付けられる異常な表現型を示し続けた。これらの観測された効果は、減少した体重（野生型の４８％）、雌性においては乏しく発達した卵巣（有意な卵胞発達を欠く）を含んだ。体重のパーセンテージとしての肝臓、脾臓および胸腺の重さは、非トランスジェニック同腹仔において見出されるものに対して正規化された。１才齢の非トランスジェニックコントロールマウスのいくつかが、肥満であることを見出し、少なくとも一つのコントロールが、ＩＩ型糖尿病の発生と一致する変化を示した。しかし、１才齢のトランスジェニックマウスは、肥満も糖尿病を発生する証拠も示さなかった。従って、ＦＧＦ様ポリペプチドトランスジェニックが、通常加齢に伴いマウスにおいて見られる年齢に関連した変化の少なくともいくつかを発生せず、実際、本発明のＦＧＦ様遺伝子が加齢プロセスを遅らせるのに役立ち得るようである。
これらの発見は、有意であり、本発明のＦＧＦ様ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、加齢関連の疾患、障害、または状態の処置または診断に有用であり得るという結論を支持する。例示として、このような疾患、障害または状態としては、限定しないが、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、糖尿病、肥満、脳卒中、骨粗鬆症、変形性関節症、変形性関節病、筋萎縮、低筋肉症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、除脂肪体重の減少、禿頭症、しわ、疲労増大、スタミナ減少、心臓機能低下、免疫系機能不全、癌、パーキンソン病、老年痴呆、アルツハイマー疾患、および認識機能低下が挙げられる。さらに一般的には、本発明の分子は、寿命の向上または増加のために適用可能であり得る。
本発明は、好ましい実施形態に関して記載されているが、改変および変更が当業者に生じることが理解される。従って、特許請求される本発明の範囲内になるこのような等価な改変すべてを添付の請求項がカバーすることを意図する。
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