ES2298785T3

ES2298785T3 - Proteinas de fusion.

Info

Publication number: ES2298785T3
Application number: ES04753440T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Glaesner; Rohn Lee Millican, Jr.; Yu Tian; Sheng-Hung Rainbow Tschang; Andrew Mark Vick
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2024-06-10
Also published as: EP1641483B1; MXPA05013564A; CA2526169A1; EP1641483A2; DE602004011770T2; CY1107248T1; BRPI0411112A; AU2004247042A1; JP2007505643A; WO2004110472A2; PT1641483E; PL1641483T3; DK1641483T3; US20070253966A1; DE602004011770D1; CN1802167A; SI1641483T1; WO2004110472A3; ATE385806T1

Abstract

Una proteína de fusión heteróloga que comprende un péptido terapéutico activo fusionado a la parte de Fc de una inmunoglobulina, comprendiendo la parte de Fc la secuencia de SEC ID NO: 1 (Ver secuencia) en la que: Xaa en la posición 1 es Ala o está ausente; Xaa en la posición 16 es Pro o Glu; Xaa en la posición 17 es Val o Ala; Xaa en la posición 18 es Ala; Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente.

Description

Proteínas de fusión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión heterólogas que comprenden un péptido terapéutico activo y una parte de cadena pesada constante (Fc) de una inmunoglobulina que tiene el efecto de aumentar la semivida in vivo del péptido terapéutico activo. Estas proteínas de fusión heterólogas pueden usarse para tratar enfermedades humanas así como una variedad de otras afecciones o trastornos.

Muchos péptidos terapéuticos activos muestran ser prometedores en ensayos clínicos para el tratamiento de diversas enfermedades. Sin embargo, la utilidad de la terapia que implica estos péptidos ha sido limitada por el hecho de que muchos péptidos son poco activos, se aclaran rápidamente in vivo o tienen semividas in vivo extremadamente cortas. Se han emprendido diversos enfoques para aumentar la semivida de eliminación de estos péptidos o reducir el aclaramiento de estos péptidos del cuerpo mientras se mantiene la actividad biológica. Un enfoque implica fusionar un péptido terapéutico activo a la parte de cadena pesada constante (Fc) de una inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas tienen normalmente semividas circulantes duraderas in vivo. Por ejemplo, las moléculas de IgG pueden tener una semivida en seres humanos de hasta 23 días. La parte de Fc de la inmunoglobulina es responsable, en parte, de esta estabilidad in vivo. Estas proteínas de fusión heterólogas aprovechan la estabilidad proporcionada por la parte de Fc de una inmunoglobulina mientras conservan la actividad biológica de los péptidos.

El documento WO 97/00319 describe proteínas quiméricas que comprenden leptina o un mutante o variante de la misma fusionada a un dominio de inmunoglobulina humana. El documento WO 96/04388 describe proteínas solubles que tienen actividad antagonista parcial o antagonista de interleucina humana (IL4) y/o interleucina 13 humana (IL13) que comprenden un mutante o variante de IL4 fusionado a al menos un dominio constante de inmunoglobulina humana o fragmento del mismo. El documento WO 97/28267 describe proteínas de fusión que comprenden un péptido que tiene actividad CTLA4 fusionado a una región constante de inmunoglobulina.

Aunque este enfoque es viable para productos terapéuticos peptídicos (véase, por ejemplo, el documento WO 02/46227 que describe proteínas de fusión heterólogas que comprenden un compuesto de GLP-1 y la parte de Fc de una inmunoglobulina o análogo o fragmento de la misma), hay una preocupación general referente a la formación de semi-anticuerpos, función efectora no deseada, sitios de glicosilación y expresión de heterogenicidad.

Angal, et al., Mol. Immun. (1993) 30 (1): 105-108 describe cómo la inmunoglobulina G4 humana (IgG4) existe en dos formas moleculares: el tetrámero H_{2}L_{2} y el "semi-anticuerpo" HL, debido a la heterogenicidad de los puentes disulfuro entre cadena pesada. Se encontró que una sustitución de un único residuo en la posición 241 (sistema de numeración de Kabat) conducía a la producción de un anticuerpo homogéneo. Reddy, et al., J. Immun. (2000) 164: 1925-1933 trata el anticuerpo monoclonal de CD4 clenoliximab, que comprende una IgG4 modificada que contiene dos sustituciones de un único residuo diseñadas para estabilizar los puentes disulfuro entre cadena pesada y destruir la unión a receptor de Fc residual.

La presente invención busca superar los problemas descritos anteriormente identificando y sustituyendo aminoácidos en diversas posiciones en la parte de Fc de la molécula que reducen los semi-anticuerpos y minimizan o eliminan la función efectora. Además, la presente invención también proporciona la identificación y sustitución de aminoácidos en diversas posiciones en la parte de Fc de la molécula que no tienen sitios de glicosilación y tienen una heterogenicidad reducida durante la expresión. Además, se desea que la identificación y sustitución de aminoácidos en diversas posiciones en la parte de Fc de la molécula no induzcan una respuesta inmunitaria tras la administración repetida y prolongada de la proteína de fusión heteróloga.

Los compuestos de la presente invención incluyen proteínas de fusión heterólogas que comprenden un péptido terapéutico activo fusionado a la parte de Fc de una inmunoglobulina, comprendiendo la parte de Fc la secuencia de SEC ID NO: 1

1

en la que:

Xaa en la posición 1 es Ala o está ausente;

Xaa en la posición 16 es Pro o Glu;

Xaa en la posición 17 es Val o Ala;

Xaa en la posición 18 es Ala;

Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y

Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente.

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La parte de péptido y la parte de Fc de la presente invención se fusionan juntas directamente o mediante un conector. Un ejemplo de un conector es un conector peptídico rico en G que tiene la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 2). Otros ejemplos de conectores incluyen, pero no se limitan a, Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (1,5L) (SEC ID NO: 4); Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (2L) (SEC ID NO: 6); Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys (SEC ID NO: 7) y Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg (SEC ID NO: 8).

El extremo C-terminal de la parte de péptido y el extremo N-terminal de la parte de Fc se fusionan juntos. Como alternativa, el extremo N-terminal de la parte de péptido y el extremo C-terminal de la parte de Fc se fusionan juntos. Adicionalmente, el extremo C-terminal de la parte de péptido se fusiona al extremo N-terminal de la parte de Fc y el extremo N-terminal de otra molécula peptídica se fusiona al extremo C-terminal de la parte de Fc, dando como resultado una proteína de fusión péptido-Fc-péptido.

La presente invención también incluye polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención, así como vectores y células huésped que comprenden tales polinucleótidos. Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden usarse para tratar pacientes que padecen enfermedades humanas así como una variedad de otras afecciones o trastornos.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención comprenden una parte de péptido terapéutico activo y una parte de Fc. La parte de Fc comprende substituciones en la secuencia de IgG4 humana que proporcionan a la proteína de fusión heteróloga una estabilidad in vivo aumentada en comparación con el péptido terapéutico activo no fusionado a una secuencia de Fc.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención contienen una parte de Fc que se deriva de IgG4 humana, pero que comprende sustituciones particulares en comparación con la secuencia humana de tipo natural. Tal como se usa en el presente documento, la parte de Fc de una inmunoglobulina tiene el significado acordado comúnmente para la expresión en el campo de la inmunología. Específicamente, esta expresión tiene se refiere a un fragmento de anticuerpo que no contiene las dos regiones de unión a antígeno (los fragmentos Fab) del anticuerpo. La parte de Fc está constituida por la región constante de un anticuerpo de ambas cadenas pesadas, que se asocian mediante puentes disulfuro e interacciones no covalentes. La parte de Fc puede incluir las regiones bisagra y extenderse a través de los dominios CH2 y CH3 hasta el extremo C-terminal del anticuerpo. La parte de Fc puede incluir además uno o más sitios de glicosilación.

Hay cinco tipos de inmunoglobulinas humanas con diferentes funciones efectoras y propiedades farmacocinéticas. IgG es el más estable de los cinco tipos que tiene una semivida en suero en seres humanos de aproximadamente 23 días. Hay cuatro subclases de IgG (G1, G2, G3 y G4) cada una de las cuales tiene diferentes funciones biológicas conocidas como funciones efectoras. Estas funciones efectoras están generalmente mediadas mediante la interacción con el receptor gamma de Fc (Fc\gammaR) o mediante la unión de un subcomponente del complemento 1 (C1q) que reconoce y se une a la cadena pesada de inmunoglobulina G o inmunoglobulina M iniciando la vía clásica del complemento. La unión a FcyR puede conducir a una citolisis mediada por células dependiente de anticuerpos, mientras que la unión a factores del complemento puede conducir a lisis celular mediada por el complemento. En el diseño de proteínas de fusión heterólogas en las que la parte de Fc se utiliza únicamente por su capacidad para aumentar la semivida, es importante minimizar cualquier función efectora. Por tanto, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se derivan de la región de Fc de IgG4 humana debido a su reducida capacidad para unirse a Fc\gammaR y factores del complemento en comparación con otros subtipos de IgG. Sin embargo, se ha mostrado que IgG4 reduce las células diana en seres humanos [Issacs et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 106: 427-433]. Debido a que las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se dirigen a células en diversos órganos en el cuerpo, usando una región derivada de IgG4 en una proteína de fusión heteróloga puede iniciarse una respuesta inmunitaria frente a las células mediante la interacción de la proteína de fusión heteróloga con receptores presentes sobre las células diana. Por tanto la región de Fc de IgG4 que es parte de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención contiene sustituciones que eliminan la función efectora. La parte de Fc de IgG4 de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención contiene las siguientes sustituciones: fenilalanina por alanina o valina en el residuo 234 y leucina por alanina en el residuo 235 (numeración de la UE, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5ª Ed. Departamento de salud y servicios humanos de los EE.UU., Bethesda, MD, publicación NIH nº 91-3242). Además, puede sustituirse el glutamato por prolina en el residuo 233. Los residuos 233, 234 y 235 corresponden a las posiciones 16, 17 y 18 en la SEC ID NO: 1. Además, eliminar el sitio de glicosilación unido a N en la región de Fc de IgG4 sustituyendo Asn por Ala en el residuo 297 (numeración de la UE) lo que corresponde a la posición 80 de la SEC ID NO: es otra manera de garantizar que se elimina la actividad efectora residual en el contexto de una proteína de fusión heteróloga.

Además, la parte de Fc de IgG4 de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención contiene una sustitución que estabiliza la formación de dímero de cadena pesada y evita la formación de semi-cadenas de Fc de IgG4. Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención existen preferiblemente como dímeros unidos entre sí mediante puentes disulfuro y diversas interacciones no covalentes. La IgG4 de tipo natural contiene un motivo Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys (SEC ID NO: 3) que comienza en el residuo 224 (numeración de la UE). Este motivo en una única cadena Fc de péptido terapéutico activo forma puentes disulfuro con el motivo correspondiente en otra cadena Fc de péptido terapéutico activo. Sin embargo, la presencia de serina en el motivo provoca la formación de proteínas de fusión heterólogas monocatenarias. La presente invención abarca proteínas de fusión heterólogas en las que la secuencia de IgG4 está modificada adicionalmente de manera que la serina en la posición 228 (numeración de la UE) está sustituida por prolina (residuo de aminoácido 11 en la SEC ID NO: 1).

El residuo de lisina C-terminal presente en la molécula nativa puede delecionarse en la parte de Fc derivada de IgG4 de las proteínas de fusión heterólogas tratadas en el presente documento (posición 230 de la SEC ID NO: 1; lisina delecionada denominada desK). Las proteínas de fusión heterólogas expresadas en algunos tipos de células (tales como células NOS) en los que la lisina se codifica por el codón C-terminal son heterogéneas porque una parte de las moléculas tienen lisina como aminoácido C-terminal y una parte tienen la lisina delecionada. La deleción se debe a la acción proteasa durante la expresión en algunos tipos de células de mamíferos. Por tanto, para evitar esta heterogenicidad, se prefiere que los constructos de expresión de fusión heterólogos carezcan de un codón C-terminal para lisina.

Se prefiere que el aminoácido C-terminal de la parte de péptido terapéutico activo se fusione al extremo N-terminal de la parte de análogo de Fc de IgG4 mediante un conector rico en glicina. La función y estabilidad in vivo de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden optimizarse añadiendo pequeños conectores peptídicos para evitar posibles interacciones de dominio no deseadas. Además, un conector rico en glicina proporciona cierta flexibilidad estructural de manera que la parte de péptido terapéutico activo puede interaccionar de manera productiva con su receptor sobre células diana. Sin embargo, estos conectores pueden aumentar significativamente el riesgo de que la proteína de fusión heteróloga sea inmunogénica in vivo. Por tanto, se prefiere que la longitud no sea superior a la necesaria para evitar interacciones de dominio no deseadas y/u optimizar la actividad biológica y/o estabilidad. El conector rico en glicina preferido comprende la secuencia: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 2). Aunque pueden usarse más copias de este conector en las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención, se prefiere que se use una única copia de este conector para minimizar el riesgo de inmunogenicidad asociada con la administración prolongada y repetida.

Un péptido terapéutico activo puede ser, sin limitación, una enzima, un inhibidor enzimático, un antígeno, un anticuerpo, una hormona, un factor implicado en el control de la coagulación, un interferón, una citocina, un factor de crecimiento y/o factor de diferenciación, un factor implicado en la génesis/resorción de tejidos óseos, un factor implicado en la motilidad o migración celular, un factor bactericida o antifúngico, un factor quimiotáctico, un factor citostático, una molécula adhesiva plasmática o intersticial o matrices extracelulares, o como alternativa cualquier secuencia peptídica que es un antagonista o agonista de interacciones moleculares y/o intercelulares implicadas en las patologías de los compartimientos circulatorio e intersticial y por ejemplo la formación de trombos en arterias y venas, metástasis cancerosas, angiogénesis tumoral, choque inflamatorio, enfermedades autoinmunitarias, patologías óseas y osteoarticulares y similares. Los ejemplos de péptidos terapéuticos activos incluyen, pero no se limitan a, G-CSF, GM-CSF, CSF de eosinófilos (EOS), CSF de macrófagos (M), multi-CSF, eritropoyetina (EPO), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7 IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-18, ligando c-kit, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 21, factor de células madre (SCF), factor de crecimiento de mastocitos, actividad potenciadora de eritroides (EPA), lactoferrina (LF), subunidad H de ferritina (es decir, isoferritina ácida), prostaglandina (PG) E1 y E2, factor de necrosis tumoral (TNF)-\alpha, -\beta (es decir linfotoxina), interferón (IFN)-\alpha (1b 2a y 2b), -\beta, -\omega y -\gamma; factor de crecimiento transformante (TGF)-\beta, activina, inhibina, factor inhibitorio leucémico, oncostatina M, proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1-\alpha (es decir inhibidor de células madre), proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1\beta, proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-2-\alpha (es decir, GRO-\beta), GRO-\alpha, MIP-2-\beta (es decir, GRO-\gamma), factor plaquetario-4, factor activador y quimiotáctico de macrófagos, IP-10, calcitonina, hormona del crecimiento, PTH, TR6, BLyS, anticuerpo monocatenario frente a BLyS, resistina, factor liberador de la hormona del crecimiento, VEGF-2, KGF-2, D-SLAM, KDI, TR2, péptido 1 tipo glucagón (GLP-1), exendina 4 y polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) neuropeptídico, o uno de sus receptores PAC-1, VPAC-1 o VPAC-2, o análogos, fragmentos o derivados activos de cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente.

La nomenclatura usada en el presente documento para referirse a proteínas de fusión heterólogas específicas se define tal como sigue: L se refiere a un conector con la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 2). El número que precede inmediatamente a la L se refiere al número de conectores que separan la parte de péptido terapéutico activo de la parte de Fc. Un conector especificado como 1,5L se refiere a la secuencia Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 4). Un conector especificado como 2L se refiere a la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID NO: 6). IgG4 se refiere a un análogo de la secuencia de Fc de IgG4 humana especificada como SEC ID NO: 1. Las sustituciones en la parte de Fc de IgG4 de la proteína de fusión heteróloga se indican entre paréntesis. El aminoácido de tipo natural se especifica mediante su abreviatura común seguida por el número de la posición en el contexto de la secuencia de IgG4 entera usando el sistema de numeración de la UE seguido por el aminoácido por el que está sustituyéndose en esa posición especificada mediante su abreviatura común.

Aunque las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden realizarse mediante una variedad de procedimientos diferentes, debido al tamaño de la proteína de fusión heteróloga, se prefieren procedimientos recombinantes. Para los fines de la presente invención, tal como se describe y reivindica en el presente documento, los siguientes términos y abreviaturas de biología molecular general se definen a continuación.

"Par de bases" o "pb" tal como se usa en el presente documento se refiere a ADN o ARN. Las abreviaturas A, C, G y T corresponden a las formas de monofosfato en 5' de los desoxiribonucleósidos (desoxi)adenosina, (desoxi)citidina, (desoxi)guanosina y timidina, respectivamente, cuando se producen en moléculas de ADN. Las abreviaturas U, C, G y A corresponden a las formas de monofosfato en 5' de los ribonucleósidos uridina, citidina, guanosina y adenosina, respectivamente, cuando se producen en moléculas de ARN. En ADN bicatenario, un par de bases puede referirse a la relación de A con T o C con G. En un heterodúplex de ADN/ARN, par de bases puede referirse a la relación de A con U o C con G. (Véase la definición de "complementario", a continuación).

"Digestión" o "restricción" de ADN se refiere a la rotura catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias en el ADN ("endonucleasas específicas de secuencia"). Las diversas enzimas de restricción usadas en el presente documento están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron tal como sabrá un experto en la técnica. Los tampones apropiados y cantidades de sustrato para enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante o pueden encontrarse fácilmente en la bibliografía.

"Acoplamiento" se refiere al procedimiento de formar puentes fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenario. A menos que se proporcione de otro modo, el acoplamiento puede lograrse usando condiciones y tampones conocidos con una ADN ligasa, tal como ADN ligasa de T4.

"Plásmido" se refiere a un elemento genético extracromosómico (normalmente) autoreplicante.

"Vector de clonación de ADN recombinante" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier agente de replicación autónoma, incluyendo, pero sin limitarse a, plásmidos y fagos, que comprende una molécula de ADN a la que pueden añadirse, o se han añadido, uno o más segmentos de ADN adicionales.

"Vector de expresión de ADN recombinante" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier vector de clonación de ADN recombinante en el que se ha incorporado un promotor para controlar la transcripción del ADN insertado.

"Transcripción" se refiere al procedimiento mediante el cual se transfiere la información contenida en una secuencia de nucleótidos de ADN a una secuencia de ARN complementaria.

"Transfección" se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula huésped tanto si realmente se expresa o no cualquier secuencia codificante. El experto en la técnica conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, transfección de liposomas y electroporación. La transfección satisfactoria se reconoce generalmente cuando se produce cualquier indicación del funcionamiento de este vector en la célula huésped.

"Transformación" se refiere a la introducción de ADN dentro de un organismo de manera que el ADN puede replicarse, ya sea como elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Los procedimientos de transformación de huéspedes bacterianos y eucariotas se conocen bien en la técnica, muchos de tales procedimientos, tales como inyección nuclear, fusión de protoplastos o mediante tratamiento con calcio usando cloruro de calcio se resumen en J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; (1989). Generalmente, cuando se introduce ADN en levaduras, se usa el término transformación como opuesto al término transfección.

"Traducción" tal como se usa en el presente documento se refiere al procedimiento mediante el cual la información genética del ARN mensajero (ARNm) se usa para la síntesis específica y directa de una cadena polipeptídica.

"Vector" se refiere a un compuesto de ácido nucleico usado para la transfección y/o transformación de células en la manipulación génica que lleva secuencias de polinucleótido correspondientes a moléculas de proteína apropiadas que, cuando se combinan con secuencias control apropiadas, confieren propiedades específicas a la célula huésped que va a transfectarse y/o transformarse. Los plásmidos, virus y bacteriófagos son vectores adecuados. Los vectores artificiales se construyen cortando y uniendo moléculas de ADN de diferentes fuentes usando enzimas de restricción y ligasas. El término "vector" tal como se usa en el presente documento incluye vectores de clonación de ADN recombinante y vectores de expresión de ADN recombinante.

"Complementario" o "complementariedad", tal como se usan en el presente documento, se refieren a pares de bases (purinas y pirimidinas) que se asocian mediante puentes de hidrógeno en un ácido nucleico bicatenario. Los siguientes pares de bases son complementarios: guanina y citosina; adenina y timina; y adenina y uracilo.

"Cebador" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona como sustrato iniciador para el alargamiento enzimático o sintético.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ADN que dirige la transcripción de ADN para dar ARN.

"Sonda" se refiere a un compuesto de ácido nucleico o un fragmento del mismo que se hibrida con otro compuesto de ácido nucleico.

"Secuencia líder" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede retirarse enzimática o químicamente para producir el polipéptido deseado de interés.

"Secuencia de señal de secreción" se refiere a una secuencia de aminoácidos generalmente presente en la región N-terminal de un polipéptido mayor que funciona para iniciar la asociación de ese polipéptido con los compartimientos de la membrana celular tales como el retículo endoplasmático y la secreción de ese polipéptido a través de la membrana plasmática.

Pueden obtenerse proteínas de IgG4 humana de tipo natural a partir de una variedad de fuentes. Por ejemplo, estas proteínas pueden obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de células que expresan el ARNm de interés a un nivel detectable. Pueden explorarse bibliotecas con sondas diseñadas usando la secuencia de proteína o ADN publicada para la proteína particular de interés. Por ejemplo, se describen regiones constantes de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina en Adams, et al. (1980) Biochemistry 19: 2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19: 2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nature 298: 286-288; y Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Inmunol. 2: 239-256.

La exploración de una biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede realizarse usando procedimientos habituales, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Un medio alternativo para aislar un gen que codifica una proteína de inmunoglobulina es usar la metodología de PCR [Sambrook et al., citado anteriormente; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. Pueden diseñarse cebadores de PCR basándose en secuencias publicadas.

Generalmente, las secuencias de tipo natural de longitud completa clonadas a partir de una biblioteca particular pueden servir como molde para crear los fragmentos de análogo de Fc de IgG4 de la presente invención que conservan la capacidad de conferir una semivida plasmática más duradera al péptido terapéutico activo que es parte de la proteína de fusión heteróloga. Los fragmentos de análogo de Fc de IgG4 pueden generarse usando técnicas de PCR con cebadores diseñados para hibridarse a secuencias que corresponden a los extremos deseados del fragmento. También pueden diseñarse cebadores de PCR para crear sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación en vectores de expresión.

El ADN que codifica los péptidos terapéuticos activos de la presente invención puede prepararse mediante una variedad de procedimientos diferentes que incluyen procedimientos de clonación tales como los descritos anteriormente así como ADN químicamente sintetizado. La síntesis química puede ser atractiva dada la corta longitud del péptido codificado. Generalmente, se conoce la secuencia de aminoácidos para los péptidos terapéuticos activos y está publicada [Lopez, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 5485-5489; Bell, et al. (1983) Nature, 302: 716-718; Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115: 2176-2181; Ghiglione, M., et al. (1984) Diabetologia 27: 599-600].

El gen que codifica una proteína de fusión heteróloga puede construirse entonces acoplando ADN que codifica una proteína terapéutica activa en marco con ADN que codifica las proteínas de Fc de IgG descritas en el presente documento. El ADN que codifica una proteína terapéutica activa y fragmentos de Fc de IgG4 puede mutarse antes del acoplamiento o bien en el contexto de un ADNc que codifica una proteína de fusión heteróloga entera. En la técnica se conoce bien una variedad de técnicas de mutagénesis. El gen que codifica la proteína terapéutica activa y el gen que codifica la proteína análoga de Fc de IgG4 también pueden unirse en marco mediante ADN que codifica un péptido conector rico en G. Se proporciona un ejemplo de una secuencia de ADN que codifica una de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención, Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, des K), como SEC ID NO: 5:

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Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para la producción de proteínas de fusión heterólogas y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse por el experto en la técnica sin experimentación excesiva. En general, pueden encontrarse principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook, et al., citado anteriormente. El experto en la técnica conoce procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Se han descrito aspectos generales de transformaciones en sistema de huésped de células de mamífero en la patente estadounidense número 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo normalmente según el procedimiento de van Solingen et al., J Bact. 130 (2): 946-7 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (8): 3829-33 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo, polibreno o poliomitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamíferos, véase Keown, et al., Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) y Mansour, et al., Nature 336 (6197): 348-52 (1988).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ácido nucleico (por ejemplo, ADN) en los vectores en el presente documento incluyen levaduras o células eucariotas superiores.

Los microbios eucariotas tales como levaduras u hongos filamentosos son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores de proteína de fusión heteróloga. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1995]; huéspedes de Muyveromyces [patente estadounidense número 4.943.529; Fleer, et al., Bio/ Technology 9 (10): 968-75 (1991)] tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2): 737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K wickeramii (ATCC 24.178), K waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (2): 135-9 (1990)]; K. thermotoierans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070) [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28 (4): 265-78 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa [Case, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 76 (10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentulis (documento EP 394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112 (1): 284-9 (1983)]; Tilburn, et al., Gene 26 (2-3): 205-21 (1983); Yelton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (5): 1470-4 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J. 4 (2): 475-9 (1985)]. Se seleccionan levaduras metilotróficas de los géneros constituidos por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotoruia. Puede encontrarse una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras en C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982).

Las células huésped adecuadas para la expresión de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como S2 de Drosophila y Spodoptera Sp, high5 de Spodoptera así como células vegetales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles incluyen células de mieloma NSO, células de ovario de hámster chino (CHO), SP2 y COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano [células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham, et al., J. Gen Virol., 36 (1): 59-74 (1977)]; células de ovario de hámster chino/-DHFR [CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (7): 4216-20 (1980)]; células de Sértoli de ratón [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1): 243-52 (1980)]; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) y tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Una línea celular preferida para la producción de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención es la línea celular de mieloma NSO disponible de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, nº de catálogo 85110503) y descrita en Galfre, G. y Milstein, C. ((1981) Methods in Enzymology 73 (13): 3-46; y Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y.).

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden producirse recombinantemente de manera directa, o como una proteína que tiene una secuencia señal u otras secuencias adicionales que crean un sitio de rotura específico en el extremo N-terminal de la proteína de fusión heteróloga madura. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica la proteína de fusión heteróloga que se inserta en el vector. Para la secreción por levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de invertasa de levaduras, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor cc de Saccharomyces y Kluyveromyces, éstos últimos descritos en la patente estadounidense número 5.010.182), o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179), o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamíferos, pueden usarse secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas así como líderes secretores virales.

Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Los vectores de expresión y clonación contendrán normalmente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión heteróloga, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo natural es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe [Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (7): 4216-20 (1980)]. Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb, et al., Nature 282 (5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al., Gene 7 (2): 141-52 (1979); Tschumper, et al., Gene 10 (2): 157-66 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC número 44076 o PEPC1 [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)].

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión heteróloga para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen bien promotores reconocidos por una variedad de posibles células huésped. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-80 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzima Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17 (23): 4900-7 (1978)], tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas catalíticas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en el documento EP 73.657. La transcripción de ARNm que codifica proteína de fusión heteróloga a partir de vectores en células huésped de mamíferos puede controlarse, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped.

La transcripción de un polinucleótido que codifica una proteína de fusión heteróloga por eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, de manera habitual desde aproximadamente 10 hasta 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-ketoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede cortarse y empalmarse dentro del vector en una posición en 5' o 3' con respecto a la secuencia que codifica la proteína de fusión heteróloga pero preferiblemente se sitúa en un sitio en 5' desde el promotor.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas en 5' y en ocasiones en 3' de ADNc o ADN virales o eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica la proteína de fusión heteróloga.

Pueden recuperarse diversas formas de una proteína de fusión heteróloga a partir de un medio de cultivo o a partir de lisados de células huésped. Si está unida a membrana, puede liberarse de la membrana usando una disolución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante rotura enzimática. Las células empleadas en la expresión de una proteína de fusión heteróloga pueden alterarse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de lisis celular.

Una vez expresadas las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención en la célula huésped apropiada, pueden aislarse y purificarse los análogos. Los siguientes procedimientos son a modo de ejemplo de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento sobre carboximetilcelulosa; filtración en gel tal como Sephadex G-75; resina de intercambio aniónico tal como DEAE o Mono-Q; intercambio catiónico tal como CM o Mono-S; columnas quelatantes de metales para unirse a formas marcadas con epítopo del polipéptido; HPLC de fase inversa; cromatoenfoque; gel de sílice; precipitación en etanol y precipitación en sulfato de amonio.

Pueden emplearse diversos procedimientos de purificación de proteínas y tales procedimientos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n) de la naturaleza del procedimiento de producción usado y la proteína de fusión heteróloga particular producida. Por ejemplo, pueden purificarse eficazmente proteínas de fusión heterólogas que comprenden un fragmento de Fc usando una matriz de afinidad de proteína A o proteína G. Pueden usarse tampones de pH alto o bajo para eluir la proteína de fusión heteróloga de la matriz de afinidad. Las condiciones de elución leves ayudarán a evitar la desnaturalización irreversible de la proteína de fusión heteróloga.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden formularse con uno o más excipientes. Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden combinarse con un tampón farmacéuticamente aceptable, y ajustarse el pH para proporcionar estabilidad aceptable, y un pH aceptable para la administración tal como administración parenteral. Opcionalmente, pueden añadirse uno o más agentes antimicrobianos farmacéuticamente aceptables. Meta-cresol y fenol son agentes microbianos farmacéuticamente aceptables. Pueden añadirse una o más sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la fuerza iónica o tonicidad. Pueden añadirse o más excipientes para ajustar adicionalmente la isotonicidad de la formulación. La glicerina es un ejemplo de un excipiente de ajuste de la isotonicidad. Farmacéuticamente aceptable significa adecuado para la administración a un ser humano u otro animal y por tanto no contiene elementos tóxicos ni contaminantes no deseables y no interfiere con la actividad de los principios activos en la misma.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden formularse como una formulación en disolución o como polvo liofilizado que puede reconstituirse con un diluyente apropiado. Una forma de dosificación liofilizada es una en la que la proteína de fusión heteróloga es estable, con o sin capacidad de tamponamiento para mantener el pH de la disolución a lo largo de la vida útil de almacenamiento prevista del producto reconstituido. Es preferible que la disolución que comprende las proteínas de fusión heterólogas tratadas en el presente documento antes de la liofilización sea sustancialmente isotónica para permitir la formación de disoluciones isotónicas tras la reconstitución.

Una forma de sal farmacéuticamente aceptable de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención está dentro del alcance de la invención. Los ácidos comúnmente empleados para formar sales de adición de ácido son ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido p-toluensulfónico, ácido metansulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético y similares. Las sales de adición de ácido preferidas son aquellas formadas con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico y ácido bromhídrico.

Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas, tales como hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos y similares de amonio o de metales alcalinos o alcalinotérreos. Por tanto, tales bases útiles en la preparación de las sales de esta invención incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de potasio y similares.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención tienen actividad biológica. Actividad biológica se refiere a la capacidad de la proteína de fusión heteróloga para unirse a, y activar, un receptor in vivo y provocar una respuesta. Se sometió a prueba un número representativo de proteínas de fusión heterólogas para determinar la actividad in vitro así como in vivo. Los ejemplos 1 y 2 proporcionan una representación de la actividad in vitro basándose en la capacidad de la proteína de fusión heteróloga para interaccionar con, y activar, el receptor de GLP-1 humano. En ambos conjuntos de experimentos, se usan células HEK293 que sobreexpresan el receptor de GLP-1 humano. La activación del receptor de GLP-1 en estas células provoca la activación de la adenilil ciclasa lo que a su vez induce la expresión de un gen indicador activado por un elemento de respuesta al AMP cíclico (CRE). El ejemplo 1 (tabla 1) proporciona datos representativos en los que el gen indicador es beta lactamasa, y el ejemplo 2 (tabla 2) proporciona datos representativos en los que el gen indicador es luciferasa. El ejemplo 3 proporciona datos representativos generados tras la administración de una proteína de fusión heteróloga de la presente invención a ratas. El ejemplo 4 (tabla 6) proporciona datos representativos generados tras la administración de una proteína de fusión heteróloga de la presente invención a monos. El ejemplo 5 (tabla 7) proporciona datos representativos de la evaluación de la posible formación de anticuerpos tras inyecciones subcutáneas repetidas de una proteína de fusión heteróloga. El ejemplo 6 (tabla 8) proporciona datos representativos de un estudio farmacodinámico tras una inyección de una proteína de fusión heteróloga a monos. El ejemplo 7 (tabla 9) proporciona datos representativos de un estudio farmacodinámico tras inyecciones de tres dosis diferentes a ratas. El ejemplo 8 (tabla 10) proporciona datos representativos generados tras la administración de una proteína de fusión heteróloga diferente de la presente invención a ratones. Juntos, los datos representativos muestran que las proteínas de fusión heterólogas pueden unirse a, y activar, su receptor, parecen más potentes que el péptido terapéutico activo, son activas in vivo y tienen una semivida más duradera que el péptido terapéutico activo, no son inmunogénicas y son sensibles a la dosis.

La administración de las proteínas de fusión heterólogas puede realizarse mediante cualquier vía que se sabe que es eficaz por el médico experto en la técnica. La vía parenteral periférica es un procedimiento de este tipo. La administración parenteral se entiende comúnmente en la bibliografía médica como la inyección de una forma de dosificación dentro del cuerpo mediante una jeringuilla estéril o algún otro dispositivo mecánico tal como una bomba de infusión. Las vías parenterales periféricas pueden incluir vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención también pueden ser susceptibles de administración mediante las vías oral, rectal, nasal o las vías respiratorias inferiores, que son vías no parenterales. De estas vías no parenterales, se prefieren las vías respiratorias inferiores y la vía oral.

Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden usarse para tratar una amplia variedad de enfermedades y afecciones.

Una cantidad eficaz de las proteínas de fusión heterólogas descritas en el presente documento es la cantidad que da como resultado un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado sin provocar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto que necesita la estimulación del receptor por el péptido terapéutico activo. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de los siguientes: 1) una mejora del/de los síntoma(s) asociado(s) con la enfermedad o afección; 2) un retraso de la aparición de los síntomas asociados con la enfermedad o afección; 3) aumento de la longevidad en comparación con la ausencia de tratamiento; y 4) mejor calidad de vida en comparación con la ausencia de tratamiento.

Es preferible que las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se administren una vez cada dos semanas o bien una vez por semana. Dependiendo de la enfermedad que está tratándose, puede ser necesario administrar la proteína de fusión heteróloga con mayor frecuencia tal como de dos a tres veces por semana.

La presente invención se describirá ahora sólo a modo de ejemplo no limitativo con referencia a los siguientes ejemplos.

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Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo de activación del receptor de GLP-1 in vitro

Se siembran células HEK-293 que expresan el receptor de GLP-1 humano, usando un sistema CRE-BLAM, a de 20.000 a 40,000 células/pocillo/100 \mul de medio DMEM con FBS al 10% en una placa de fondo transparente, negra de 96 pocillos recubierta con poli-d-lisina. El día después de la siembra, se elimina rápidamente el medio y se añaden 80 \mul de medio DMEM libre de plasma. El tercer día tras la siembra, se añaden 20 \mul de medio DMEM libre de plasma con BSA al 0,5% que contiene diferentes concentraciones de diversas proteínas de fusión heterólogas GLP-1-Fc a cada pocillo para generar una curva de respuesta a la dosis. Generalmente, se usan catorce diluciones que contienen desde 3 nanomolar hasta 30 nanomolar o proteína de fusión GLP-1-Fc heteróloga para generar una curva de respuesta a la dosis a partir de la cual pueden determinarse valores de CE_{50}. Tras 5 horas de incubación con la proteína de fusión, se añaden 20 \mul de sustrato de \beta-lactamasa (CCF2/AM, PanVera LLC) y se continúa la incubación durante 1 hora momento en el cual se determina la fluorescencia en un instrumento Cytofluor. El ensayo se describe adicionalmente en Zlokarnik, et al. (1998), Science, 278: 84-88. Se someten a prueba diversas proteínas de fusión GLP-1-Fe y los valores de CE_{50} se representan en la tabla 1. Los valores son con respecto a valores determinados para Val^{8}-GLP-1(7-37)OH que se realiza como control interno con todos los experimentos.

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TABLA 1

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Ejemplo 2 Ensayo de activación del receptor de GLP-1 in vitro

Se siembran células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor de GLP-1 humano, usando un sistema de CRE-Luciferasa, a 30.000 células/pocillo/80 \mul de medio DMEM F 12 bajo en suero en placas de 96 pocillos. El día después de la siembra, se mezclan alícuotas de 20 \mul de la proteína de prueba disueltas en BSA al 0,5% y se incuban con las células durante 5 horas. Generalmente, se preparan 12 diluciones que contienen desde 3 pM hasta 3 nM a una concentración de 5X para cada proteína de prueba antes de la adición a las células para generar una curva de respuesta a la dosis a partir de la cual se determinan los valores de CE_{50}. Tras la incubación, se añaden 100 \mul de reactivo de luciferasa directamente a cada placa y se mezclan suavemente durante 2 minutos. Se colocan las placas en un luminómetro Tri-lux y se calcula la producción de luz resultante de la expresión de luciferasa. Se someten a prueba diversas proteínas de fusión GLP-1-Fc y los valores de CE_{50} se representan en la tabla 2. Los valores son con respecto a valores determinados para Val^{8}-GLP-1(7-37)OH que se realiza como control interno con cada experimento. Dado que las proteínas de fusión heterólogas sometidas a prueba a continuación son dímeros, se corrigen los valores teniendo en cuenta una diferencia de dos veces en la molaridad.

TABLA 2

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Ejemplo 3 Prueba de la tolerancia a la glucosa intravenosa en ratas

Se evalúa la proteína de fusión heteróloga, Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), en una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT) en ratas. Se incluyen al menos cuatro ratas en cada uno de tres grupos. El grupo I recibe vehículo (tabla 3), el grupo II recibe 1,79 mg/kg de Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A; L235A) como una única inyección subcutánea (tabla 4) y el grupo III recibe 0,179 mg/kg de Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) como una única inyección subcutánea (tabla 5). Se inyecta a las ratas por vía subcutánea la mañana del día 1. Veinticuatro horas tras la primera inyección, se realiza una infusión en bolo de 1 \mul de glucosa (D50) por gramo de peso corporal de rata. Se extraen muestras de sangre a los 2, 4, 6, 10, 20 y 30 minutos tras la infusión en bolo de glucosa.

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5

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Ejemplo 4 Estudio farmacocinético tras una única inyección subcutánea a monos cynomolgus

Se realiza un estudio para caracterizar la farmacocinética (PK) de la proteína de fusión heteróloga, Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), cuando se administra como 0,1 mg/kg mediante inyección subcutánea (s.c.) a monos cynomolgus macho. El anticuerpo de RIA es específico para la parte central de GLP. El ELISA usa un anticuerpo de captura específico del extremo N-terminal y un anticuerpo de detección específico de Fc.

Las concentraciones en plasma resultantes tanto de ELISA como de RIA se usan para determinar los valores de parámetros farmacocinéticos representados.

En la tabla 6 se resume una representación de los valores de parámetro de PK resultantes. La PK de s.c. de una única dosis del RIA está asociada con una C_{max} media de 446,7 ng/ml con una T_{max} correspondiente de 17,3 horas. La semivida de eliminación media es de aproximadamente 79,3 horas (3,3 días). La PK del ELISA está asociada con una C_{max} media de 292,2 ng/ml con una T_{max} correspondiente de 16,7 horas. La semivida de eliminación media es de aproximadamente 51,6 horas (2,2 días).

TABLA 6

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Ejemplo 5 Evaluación de la posible formación de anticuerpos tras inyecciones subcutáneas repetidas

Se someten a prueba muestras de suero designadas de monos cynomolgus para determinar la formación de anticuerpos frente a Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) usando un formato de ELISA directo. Se recubren placas de microtitulación con Gly^{8}-Glu^{22}-Gly^{36}-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) a una concentración de 0,1 \mug/ml. Se diluyen muestras de suero de mono 50, 500,1000 y 5000 veces en disolución de bloqueo, y se incuban 0,05 ml de muestra/pocillo durante aproximadamente una hora. Se diluye anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-Fab'2 humano conjugado con peroxidasa (con un 75% de reactividad cruzada frente a seres humanos), 10.000 veces en bloque y se añade a 0,05 ml/pocillo y se incuba durante aproximadamente una hora. Se lee el desarrollo de color usando sustrato de tetrametilbencidina (TMB) a una densidad óptica de 450 nm-630 nm. Se calcula el promedio de lecturas por duplicado. Se usó un anticuerpo de GLP-1 como control positivo y un conjugado de (H+L) de cabra anti-ratón y peroxidasa es el anticuerpo secundario usado para la detección. Se recogen muestras de suero puntuales antes de la dosificación, a las 24 horas tras la segunda dosis y a las 168 horas tras la primera y segunda dosis s.c. para una evaluación de posible inmunogenicidad. La presencia de títulos de anticuerpo frente a G8E22-CEX-L-hIgG4 se interpreta mediante comparación con muestras de suero antes de la dosis y control positivo. En la tabla 7 se presenta una representación de los resultados.

TABLA 7

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Ejemplo 6 Estudio farmacodinámico tras una única inyección subcutánea a monos cynomolgus en estado de ayuno y durante una infusión de glucosa intravenosa graduada

En la fase 1 (día 1 del estudio) se administra una inyección subcutánea de vehículo. Entonces se administra una infusión de glucosa intravenosa graduada (dextrosa al 20%) de 5, 10, y 25 mg/kg/min. inmediatamente tras la inyección de vehículo. En la fase 2 (día 3 del estudio), se administra una inyección subcutánea de una proteína de fusión de GLP-1 (0,1 mg/kg). En la fase 3, se realiza una infusión de glucosa intravenosa graduada aproximadamente 96 horas tras la inyección de fusión de GLP-1.

Los procedimientos de infusión de glucosa intravenosa graduada se realizan en monos sedados tras un ayuno durante la noche de 16 horas. Para ambas infusiones de glucosa intravenosa, se extraerán muestras de nivel inicial cada 10 min. durante 20 min. para definir el nivel inicial. Se inicia una infusión de glucosa escalonada a los +20 min. a una tasa de 5 mg/kg/min., seguido por infusiones de 10 mg/kg/min. y 25 mg/kg/min. Cada tasa de infusión se administra durante un periodo de 20 minutos. Se extraen muestras de sangre a intervalos de 10 minutos para la medición de la glucosa, insulina y glucagón. Se recoge aproximadamente 1,0 ml de sangre a los -20, -10 min., 0 antes de las infusiones de glucosa, y a los 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos tras la infusión de glucosa para las fases 1 y 3.

En la tabla 8 se muestra una representación de los datos.

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TABLA 8

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Ejemplo 7 Estudio farmacodinámico tras inyecciones subcutáneas únicas de tres dosis diferentes a ratas en estado de ayuno durante una infusión de glucosa intravenosa graduada

Se asignan ratas con cánulas permanentes a control de vehículo (solución salina) o bien uno de 3 grupos de tratamiento (proteína de fusión de GLP-1; 0,0179 mg/kg, 0,179 mg/kg o 1,79 mg/kg). La proteína de fusión de GLP-1 y el vehículo se administran mediante inyección subcutánea. Veinticuatro horas tras el tratamiento, se sometieron ratas que se habían sometido a ayuno durante la noche (16 h) a una prueba de infusión de glucosa intravenosa graduada. La prueba de infusión de glucosa graduada consiste en un periodo de infusión de solución salina inicial (20 min.), seguido por dos fases de infusión de glucosa de 30 min. a 5 y 15 mg/kg/min., respectivamente. Se recogen muestras de plasma a los -20, -10 min., 0 antes de las infusiones de glucosa (nivel inicial), y a los 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos. En la tabla 9 se muestra una representación de los datos.

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TABLA 9

14

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Ejemplo 8 Análisis farmacocinético de proteína de fusión de FGF-21

Se administran proteínas de fusión de FGF-21 mediante vías intravenosa (i.v.) o subcutánea (s.c.) a una dosis de 0,4 mg/kg a ratones CD-1. Se extrae sangre de los animales en diversos momentos entre 0 y 336 horas tras la dosificación. Se recoge plasma de cada muestra y se analiza mediante radioinmunoensayo. Se calculan parámetros farmacocinéticos usando procedimientos dependientes del modelo (datos de i.v.) e independientes del modelo (datos de s.c.) (WinNonlin Pro) y se notifican en la tabla 10 siguiente. Mediante administración i.v., la proteína de fusión FGF-21-Fc tiene una semivida de eliminación de aproximadamente 53,9 horas en comparación con una semivida de eliminación de 0,5 horas para la FGF-21 nativa. Mediante administración s.c. la proteína de fusión FGF-21-Fc tiene una semivida de eliminación de aproximadamente 24 horas en comparación con una semivida de eliminación de 0,6 horas para la FGF-21 nativa. Mediante ambas vías de administración la proteína de fusión FGF-21-Fc demuestra una acción de tiempo prolongado en comparación con la FGF-21 nativa.

TABLA 10

15

<110> Eli Lilly and Company

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<120> Proteínas de fusión

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<130> X-16821

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<150> Documento 60/477880

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<151> 12-06-2003

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<150> Documento 60/570908

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<151> 13-05-2004

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 230

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(1)

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<223> Xaa en la posición 1 es Ala o está ausente

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

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<222> (16)..(16)

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<223> Xaa en la posición 16 es Pro o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (17)..(17)

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<223> Xaa en la posición 17 es Phe, Val o Ala

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (18)..(18)

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<223> Xaa en la posición 18 es Leu, Glu o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (80)..(80)

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<223> Xaa en la posición 80 es Asn o Ala

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (230)..(230)

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<223> Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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16

17

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<210> 2

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Pro Pro Cys Pro Ser Cys}

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<210> 4

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly}

\sac{Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly}

\sac{Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 7

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\sa{Asp Ala Ala Ala Lys Gly Ala Ala Ala Lys Asp Ala Ala Ala Arg Glu}

\sac{Ala Ala Ala Arg Asp Ala Ala Ala Lys}

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<210> 8

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 8

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\sa{Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg}

Claims

1. Una proteína de fusión heteróloga que comprende un péptido terapéutico activo fusionado a la parte de Fc de una inmunoglobulina, comprendiendo la parte de Fc la secuencia de SEC ID NO: 1

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22

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en la que:

Xaa en la posición 1 es Ala o está ausente;

Xaa en la posición 16 es Pro o Glu;

Xaa en la posición 17 es Val o Ala;

Xaa en la posición 18 es Ala;

Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y

Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente.

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2. La proteína de fusión heteróloga según la reivindicación 1, en la que el aminoácido C-terminal del péptido terapéutico activo está fusionado al residuo N-terminal de la parte de Fc mediante un conector peptídico que comprende una secuencia seleccionada de:

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23

24

3. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión heteróloga según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Un vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 3.

5. Una célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que expresa la proteína de fusión heteróloga según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

7. La célula huésped según la reivindicación 6, en la que la célula huésped es una célula CHO.

8. La célula huésped según la reivindicación 6, en la que la célula huésped es una célula NSO.

9. Un procedimiento para producir una proteína de fusión heteróloga que comprende las etapas de transcribir y traducir un polinucleótido según la reivindicación 3 en condiciones en las que la proteína de fusión heteróloga se expresa en cantidades detectables.

10. La proteína de fusión heteróloga según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso como medicamento.