JP2023538533A - 線維症の処置のための、ｃｃｒ２／５拮抗剤と組み合わせたｆｇｆ２１ - Google Patents

線維症の処置のための、ｃｃｒ２／５拮抗剤と組み合わせたｆｇｆ２１ Download PDF

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Abstract

本出願は、ＦＧＦ－２１ポリペプチドをＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせて投与することを含む、線維症および／または糖尿病を処置する方法を提供する。また、この方法は、ＮＡＳＨを処置するためにも使用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、そのすべてが本明細書中にその全体で参考として組み込まれている、２０２０年８月７日に出願の米国仮特許出願第６３／０６３，１８９号、２０２０年８月１３日に出願の第６３／０６５，４１４号、２０２０年８月１４日に出願の第６３／０６５，７４９号、２０２０年８月１４日に出願の第６３／０６５，９３５号、および２０２０年８月１８日に出願の第６３／０６７，１８４号の優先権を主張するものである。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出される配列表に対する言及
本出願と共に、電子的に提出される配列表（名称：３３３８＿２２７ＰＣ０５＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２８，７４０バイト、作成日：２０２１年８月５日）の内容は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
本出願は、とりわけ、線維症および／または糖尿病に関連する疾患または状態、例えば、ＮＡＳＨを、例えば、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えばＰＥＧ化ＦＧＦ－２１ポリペプチド（ＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート）と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとを含む組合せ療法によって処置または防止する方法に関する。
ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪性肝炎を表す。これは代謝障害の肝臓徴候として定義することができ、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の最も重篤な形態である。ＮＡＳＨは、肥満症、前糖尿病、および糖尿病の三重流行に密に関連している。しかし、その症状は多くの場合サイレントまたはＮＡＳＨに非特異的であり、診断を困難にしている。その結果、ＮＡＳＨ患者は、疾患の後期までその状態に気づかないままである場合がある。
患者はその肝臓状態に気づかないままでいる間に、ＮＡＳＨは、肝細胞の膨張および炎症によって駆動される、進行性線維症、硬変、肝不全、または肝臓癌などのより重篤な疾患段階へと進行する場合がある。
疾患の進行期では、肝臓移植が患者の唯一の選択肢でありうる。しかし、ドナーからの利用可能な健康な臓器の欠如が原因の長い順番待ちリスト、または患者の状態に関連する適格性の問題は言うまでもなく、この危険を伴う外科的処置は様々な合併症と関連している。したがって、ＮＡＳＨの有効な処置の必要性が存在する。
本開示は、対象に、有効量の繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ－２１）ポリペプチドをＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において線維症および／または糖尿病に関連する疾患または状態を処置または防止する方法を対象とする。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と逐次的に、任意の順序で投与する。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と同時発生的に投与する。
一部の態様では、疾患または状態は糖尿病、例えば２型糖尿病である。一部の態様では、疾患または状態は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。一部の態様では、対象へのＦＧＦ－２１ポリペプチドおよびＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与は、肝硬度を減少させるか、体脂肪率を減少させるか、体重を減少させるか、肝臓対体重比を減少させるか、肝脂質含量を減少させるか、肝線維症面積を減少させるか、空腹時グルコースレベルを低下させるか、空腹時トリグリセリドレベルを低下させるか、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるか、ＡｐｏＢレベルを低下させるか、ＡｐｏＣレベルを低下させるか、ＨＤＬコレステロールを増大させるか、またはこれらの任意の組合せである。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせたＦＧＦ－２１ポリペプチドの、対象への投与は、非処置対象もしくは医薬製剤の投与前における対象におけるレベル、または、ＦＧＦ－２１ポリペプチドもしくはＣＣＲ２／５二重拮抗剤のみで処置し、両方では処置していない対象におけるレベルと比較して、（ｉ）肝脂肪レベルの低減、（ｉｉ）肝損傷レベルの低減、（ｉｉｉ）線維症レベルの低減、（ｉｖ）線維症バイオマーカーである血清Ｐｒｏ－Ｃ３（Ｎ末端ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチド）レベルの低下、（ｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの低下、（ｖｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの低下、（ｖｉｉ）血清アディポネクチンレベルの上昇、（ｖｉｉｉ）血漿ＬＤＬレベルの低下、（ｉｘ）血漿ＨＤＬレベルの上昇、（ｘ）血漿トリグリセリドレベルの低下、（ｘｉ）肝硬度レベルの低減、または（ｘｉｉ）これらの任意の組合せを結果としてもたらす。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせたＦＧＦ－２１ポリペプチドの、対象への投与は、（ａ）肝臓単球数の低減、（ｂ）Ｆ４／８０陽性肝臓単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）数の低減、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を結果としてもたらす。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、半減期延長部分と連結またはコンジュゲートされている。一部の態様では、半減期延長部分はポリペプチド部分を含む。一部の態様では、半減期延長部分は、Ｆｃ領域、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリンもしくはＣＴＰ（ｈＣＧの２８個のアミノ酸のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）およびその４つのＯ－グリカン）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、半減期延長部分は非ポリペプチド部分を含む。一部の態様では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分とコンジュゲートされている（「ＦＧＦ－２１コンジュゲート」）。一部の態様では、ＦＧＦ－２１コンジュゲートは、
Figure 2023538533000001
 （式Ｉ）
を含み、ｎは任意の整数である。
一部の態様では、ＰＥＧ部分は、ＦＧＦ－２１ポリペプチド内の非天然アミノ酸へとコンジュゲートされる。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチド内の非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体である。一部の態様では、フェニルアラニン誘導体は、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンである。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号３、７、１１、または１５のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドはＦＧＦ－２１活性を有する。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の態様では、非天然アミノ酸は、配列番号３または１１に対応するアミノ酸残基１０９にある。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号１、５、９、または１３に明示される配列を含む。一部の態様では、ＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号２、６、１０、または１４の化合物に対応する。
一部の態様では、ｎは、約５００～約９００エチレングリコール単位、約６００～約８００エチレングリコール単位、約６５０～約７５０エチレングリコール単位、または約６７０～約６９０である。一部の態様では、ｎは、約６７０～約６９０の間、例えば、約６８１である。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号４、８、１２、または１６の化合物に対応する。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号４または１２に明示される配列を含む。一部の態様では、ＦＧＦ－２１コンジュゲートはＬコンホメーションにある。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、アミノポリカルボン酸陽イオンキレート剤、界面活性剤、アミノ酸バッファー剤、浸透圧調節剤、またはこれらの任意の組合せを用いて製剤化する。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤はポリペプチドである。一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は小分子である。一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、式（Ｘ）：
Figure 2023538533000002
 （Ｘ）
の化合物、または薬学的に許容されるその塩である
［式中、
Ｒ１は、水素またはＣ１～６アルキルであり、
Ｒ８およびＲ９は、独立して水素およびＣ１～６アルキルから選択され、
Ｒ１０はＣ１～６アルキルであり、
Ｈｅｔは、少なくとも１つの窒素原子を有する、適宜置換された３～１４員の単環または二環式のヘテロシクリルまたはヘテロアリール環であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ水素であるか、または一緒になってオキソ基を形成し、
Ｚは、ＮＨまたはＣＨ２である］。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物（Ａ）：
Figure 2023538533000003
 （Ａ）
である。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物（Ａ）の薬学的に許容される塩である。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物（Ｃ）：
Figure 2023538533000004
 （Ｃ）
である。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物（Ｃ）の薬学的に許容される塩である。
一部の態様では、対象はヒトである。特定の態様では、方法は、線維症および／または糖尿病に関連する疾患または状態を処置する。
一部の態様では、本開示は、ヒト対象に、有効量の（１）式ＩのＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート
Figure 2023538533000005
 （式Ｉ）
［式中、ｎが約６７０～約６９０である約３０ｋＤのＰＥＧ部分が、配列番号２または１０のＦＧＦ－２１ポリペプチドのパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンとコンジュゲートされている］を、
（２）化合物Ｃ
Figure 2023538533000006
 （化合物Ｃ）
と組み合わせて投与することを含む、それを必要とするヒト対象においてＮＡＳＨを処置する方法を提供する。一部の態様では、式ＩのＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲートは、化合物Ｃの薬学的に許容される塩と組み合わせる。
一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。一部の態様では、ｎは約６８１である。
一部の態様では、本方法に有用なＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物（Ｃ）：
Figure 2023538533000007
 である。
一部の態様では、本方法に有用なＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物Ｃ：
Figure 2023538533000008
 （Ｃ）
の薬学的に許容される塩である。
図１Ａ～１Ｅは、ＣＣＬ２およびＦＧＦ２１血清レベルの、ヒトＮＡＦＬＤの重篤度との相関を示す。血清試料は、生検で判明したＮＡＦＬＤを有する患者から得た（ｎ＝８５人）。データは平均±ＳＤとして提示する、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（図Ａ～Ｂでは独立スチューデントｔ検定、図Ｃ～Ｅではピアソンのｒおよび直線的相関分析のＰ値）。図１Ａおよび１Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定し、肝線維症および脂肪性肝炎の組織学的に評価した重篤度と相関させた、ＣＣＬ２およびＦＧＦ－２１血清レベルを示す。図１Ｃおよび１Ｄは、ＣＣＬ２血清濃度の、線維症のバイオマーカー（ＦＩＢ－４およびＧＧＴ）ならびにＦＧＦ－２１血清レベルとの相関を示す。図１Ｅは、ＦＧＦ－２１血清レベルの、脂肪性肝炎のバイオマーカー（ＣＫ－１８ Ｍ３０、ＧＧＴ、およびＡＳＴ）との関連を示す。 図２Ａ～２Ｇは、急性肝損傷における、ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害による単球およびマクロファージの肝臓浸潤の遮断を示す。肝損傷は、壊死面積割合ならびに血清アラニン（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸（ＡＳＴ）トランスアミナーゼレベルによって評価した。データは平均±ＳＤとして提示する（ｎ＝６～８匹／群）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（事後試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ）。図２Ａは、急性肝損傷が単一のＣＣｌ４注射によって誘導されたことを示す。マウスは、媒体（Ｖｈｃ）、ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤（ＣＣＲ２／５ｉ）、および／またはＰＥＧ－ＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１ｖ）を受けた。肝損傷および免疫細胞遊走は、損傷誘導の３６時間後に評価した。図２Ｂは、対照および処置群の代表的な肝臓切片のＨ＆ＥおよびＦ４／８０免疫組織化学染色を示す（×１０の拡大率、スケールバー＝１００μｍ）。図２Ｃおよび２Ｄは、Ｆ４／８０陽性面積割合の定量を示す。図２Ｅ～２Ｇは、血液（ＭＯ＝単球、Ｇｒａｎｕｌｏ＝顆粒球）および肝臓（ＭＯ＝単球、ＭｏＭＦ＝単球由来マクロファージ、ＫＣ＝クッパー細胞）の免疫細胞集団の代表的なフローサイトメトリープロット、ならびに対応する定量を示す。 図３Ａ～３Ｊは、二重ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害およびＦＧＦ２１作動による組合せ療法が、単一薬物処置よりも有効に脂肪性肝炎および線維症を改善することを示す。図３Ａは、脂肪性肝炎および線維症を誘導するために、ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤（ＣＣＲ２／５ｉ）および／またはＰＥＧ－ＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１ｖ）を用いた薬理学的処置を、１２週間のＣＤＡＨＦＤ（コリン欠乏アミノ酸調整（ｄｅｆｉｎｅｄ）高脂肪食）投与の最後の６週間にわたって実施したことを示す。図３Ｂは、すべての処置群の体重展開の折れ線グラフを示す（ｃｔｒｌ：対照食、Ｖｈｃ：媒体）。図３Ｃは、代表的なＨ＆Ｅ、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ、およびＦ４／８０免疫組織化学染色を示す（×１０の拡大率、スケールバー＝１００μｍ。図３Ｄ～３Ｆは、血清アラニントランスアミナーゼレベル（ＡＬＴ）による肝損傷の評価、ならびにＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ面積割合およびヒドロキシプロリン含有量および肝性トリグリセリド含有量の定量による肝線維症の評価を提示する。図３Ｇは、組織病理学的ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）の単一パラメータを示す。図３Ｈ～３Ｊは、Ｌｙ６Ｃ＋血液単球、肝臓単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）、およびクッパー細胞（ＫＣ）のフローサイトメトリーの定量、ならびにＦ４／８０陽性面積割合の定量を示す。すべてのデータは平均ＳＤとして提示する（ｎ＝６～８匹／群）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（事後試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ）。 図４Ａ～４Ｆは、短期的処置後の組合せ療法の有益な効果を示す。図４Ａは、脂肪性肝炎および線維症を、合計８週間の期間にわたるＣＤＡＨＦＤ（コリン欠乏アミノ酸調整高脂肪食）によって誘導したことを示す。薬理学的処置の効果を、損傷誘導の最後の２週間にわたるＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤（ＣＣＲ２／５ｉ）および／またはＰＥＧ－ＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１ｖ）の投与後に評価した。図４Ｂは、Ｈ＆Ｅ、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ、およびＦ４／８０免疫組織化学染色の代表的な肝臓切片を示す（×１０の拡大率、スケールバー＝１００μｍ）。図４Ｃおよび４Ｄは、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル、ＮＡＦＬＤ活性スコア、肝性トリグリセリド、およびヒドロキシプロリン含有量、ならびに肝臓表現型を表示するＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ面積割合の定量を示す。図４Ｅおよび４Ｆは、Ｆ４／８０陽性面積割合の定量ならびにフローサイトメトリーにより決定した単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）および肝臓クッパー細胞（ＫＣ）を示す。すべてのデータは平均ＳＤとして提示する（ｎ＝６～８匹／群）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（事後試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ）。 図５Ａ～５Ｆは、長期的処置後の組合せ処置の効果を示す。図５Ａは、慢性肝損傷を合計１２週間の期間にわたって誘導し、媒体（Ｖｈｃ）、ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤（ＣＣＲ２／５ｉ）、および／またはＰＥＧ－ＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１ｖ）を用いた薬理学的処置の効果を、１２週間の損傷誘導の最後の６週間にわたる投与後に評価したことを示す。図５Ｂ～５Ｄは、代表的なＦＡＣＳプロット、また、対応する血液（ＭＯ＝単球）ならびに肝臓免疫細胞（ＭｏＭＦ＝単球由来マクロファージ、ＫＣ＝クッパー細胞、および白血球）の定量を提示する。図５Ｅは、ＥＬＩＳＡによる血清ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、およびＣＸＣＬ１レベルの定量を示す。図５Ｆは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、全肝組織からの遺伝子発現レベルの変化の倍数を示す。すべてのデータは平均ＳＤとして提示する（ｎ＝６～８匹）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（事後試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ）。 図６Ａおよび６Ｂは、長期的慢性肝損傷におけるリンパ球集団を示す。図６Ａは、血液中のリンパ球免疫細胞集団（Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞）の定量を示す。図６Ｂは、肝臓中のリンパ球免疫細胞集団（Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞）の定量を示す。 本開示のＰＥＧ化ＦＧＦ－２１コンジュゲートの略図を示す。上の図は、ＦＧＦ－２１コンジュゲート中の非天然アミノ酸がパラ－アセチル－フェニルアラニン、例えばパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンであるＦＧＦ－２１コンジュゲートを示す。ｎは、ＰＥＧポリマー中に含有されるエチレングリコール単位の数を表す。下図は、部位特異的様式でＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、パラ－アセチル－フェニルアラニン、例えばパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンなどの非ネイティブアミノ酸を含むＦＧＦ－２１ポリペプチド）と融合またはコンジュゲートさせて、本開示のＦＧＦ－２１コンジュゲートをうることができる、６８１個のエチレングリコール単位を含む特異的なＰＥＧリンカーの略図である。
本開示は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ－２１）ポリペプチド、例えばＰＥＧ－ＦＧＦ－２１（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６）などを、ＣＣＲ２／５二重アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む、線維症および／または糖尿病を罹患している対象を処置する方法を提供する。
定義
本開示が、よりたやすく理解されうるために、ある特定の用語が、まず規定される。本出願で使用される通り、本明細書で、そうでないことが明示的に提示されない限りにおいて、以下の用語の各々は、下記で明示される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願を通して明示されるものとする。
本開示は、群の、正確に１つのメンバーが、所与の生成物中またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、または他の形で関連する態様を含む。本開示は、群のメンバーのうちの、１つを超えるメンバー、またはすべてのメンバーが、所与の生成物中またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、または他の形で関連する態様を含む。
単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が、明確にそうでないことを指示しない限りにおいて、複数の指示対象を含む。本明細書では、「ある（ａ）」、［または「ある（ａｎ）」］という用語のほか、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」という用語は、互換的に使用されうる。ある特定の態様では、「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」という用語は、「単一の」を意味する。他の態様では、「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」という用語は、「２つ以上」または「複数の」を含む。したがって、例えば、ある「ＦＧＦ－２１コンジュゲート」に対する言及は、１つまたは複数のこのようなタンパク質またはコンジュゲートに対する言及であり、当業者に公知の、これらの同等物などを含む。
さらに、本明細書で使用される場合の「および／または」は、他の特色または成分を伴うか、またはこれを伴わない、２つの指定された特色または成分の各々の、具体的な開示として理解されるものとする。したがって、本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などの語句中で使用される、「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句中で使用される、「および／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
本明細書で使用される、「約」という用語は、当業者により決定される特定の値または組成について、許容可能な誤差の範囲内にある値または組成を指し、これは、値または組成がどのようにして測定または決定されるのか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」とは、当技術分野における慣行に従い、１標準偏差またはこれを超える範囲内を意味しうる。代替的に、「約」とは、最大で２０％の範囲を意味しうる。さらに、特に、生体系または生物学的過程に関して述べると、用語は、値の最大で桁数の範囲内、または最大で５倍以内を意味しうる。特定の値または組成が、本出願および特許請求の範囲において提示される場合、そうでないことが言明されない限りにおいて、「約」の意味は、特定の値または組成について、許容可能な誤差の範囲内にあると仮定されるものとする。「約」という用語が、数値範囲と共に使用される場合、境界を、明示された数値を上回って、およびこれを下回って拡張することにより、この範囲を修飾する。したがって、「約１０～２０」とは、「約１０～約２０」を意味する。一般に、「約」という用語は、言明された値を上回る数値および下回る数値を、上方または下方（より高い、またはより低く）の、例えば１０パーセントのばらつきにより修飾しうる。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、すべての技術用語および学術用語は、本開示が関する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に、本開示において使用される用語の多くについての一般的な語釈を提供する。
本明細書で、態様について、「含むこと」という表現により記載されるいかなる場合においても、「からなること」および／または「から本質的になること」という用語により記載される、他の点では類似の態様もまた提供されることが理解される。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で許容される形態において表示される。数値範囲は、範囲規定数を包含する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、アミノ酸配列は、左から右へと、アミノからカルボキシへの向きに書かれる。本明細書で提示される小見出しは、全体としての本明細書を参照することにより与えられうる、本開示の多様な態様の限定ではない。したがって、すぐ下記で規定される用語は、その全体における本明細書を参照することにより、十分に規定される。
本明細書では、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される、一般に公知のそれらの３文字記号または１文字記号により言及される。そうでないことが指し示されない限りにおいて、アミノ酸配列は、左から右へと、アミノからカルボキシへの向きに書かれる。
アミノ酸置換：「アミノ酸置換」という用語は、親配列内または参照配列（例えば、野生型配列）内に存在するアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当技術分野で公知の組換え法を通して、親配列内または参照配列（例えば、野生型ポリペプチド配列）内で置換されうる。したがって、「Ｘ位における置換」に対する言及とは、Ｘ位に存在するアミノ酸の、代替的アミノ酸残基による置換を指す。一部の態様では、置換パターンは、スキームＡｎＹ［Ａは、ｎ位に天然で存在するか、または元来存在するアミノ酸に対応する１文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である］に従い記載されうる。他の態様では、置換パターンは、スキームＡｎ（ＹＺ）［Ａは、ｎ位に天然で存在するか、または元来存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、ＹおよびＺは、Ａを置き換えうる、代替的な置換アミノ酸残基である］に従い記載されうる。
本開示の文脈では、置換（アミノ酸置換と称される場合であってもなお）は、核酸レベルで行われる、すなわち、代替的アミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換は、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することにより行われる。
約：本明細書で、１つまたは複数の目的の値へと適用されて使用される、「約」という用語は、言明された参照値と同様の値を指す。ある特定の態様では、「約」という用語は、そうでないことが言明されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて（このような数が、可能な値の１００％を超える場合を除く）、いずれの方向（これを超えるか、またはこれ未満である）においても、言明された参照値の、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満以内に収まる値の範囲を指す。
と関連する：疾患に関して本明細書で使用される、「と関連する」という用語は、問題の症候、測定、特徴、または状態が、この疾患の診断、発症、存在、または進行と連関することを意味する。関連は、疾患と因果的に連関する場合もあるが、疾患と因果的に連関しなくてもよい。
生物学的に活性：本明細書で開示される分子、例えば、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば、配列番号２もしくは１０または配列番号４もしくは１２のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１に適用される、「生物学的に活性」という用語は、生物に関する、生物学的系、生物学的経路、生物学的分子、または生物学的相互作用の、任意の物理的特性または生化学的特性に影響を及ぼしうる、任意の物質を意味する。特に、本明細書で使用される、生物学的活性分子は、疾患もしくは状態、例えば、ヒトもしくは他の動物における線維症と関連する疾患もしくは状態の、診断、治癒、緩和、処置、もしくは防止、またはヒトもしくは動物の身体的健康もしくは精神的健康を、他の形で増強することが意図された、任意の物質を含むがこれらに限定されない。
ＣＣＲ２／５二重拮抗剤Ａ「ＣＣＲ２／５二重拮抗剤」とは、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５受容体と強力に結合し、そのそれぞれのコグネートリガンドに応答してカルシウム流および化学走性などのＣＣＲ２およびＣＣＲ５媒介性機能等のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）受容体媒介機能の強力な二重阻害を示す拮抗剤である。ＣＣＲ２／５二重阻害活性を有する化合物は、例えば、その全体で参考として組み込まれている米国特許第８，３８３，８１２号および第７，１６３，９３７号中に報告されている。
本明細書中で使用される「アルキル」という用語は、直鎖または分枝鎖状の飽和炭化水素に由来する基を指す。
本明細書中で使用される「ヘテロシクリル」という用語は、置換または非置換の非芳香族（これは部分的または完全に飽和でありうる）の、１～４個のヘテロ原子を有する３～１４員環を指す。そのような環は、３～７員の単環基、７～１１員の二環基、または１０～１４員の三環基でありうる。ヘテロ原子を含有するヘテロシクリル基のそれぞれの環は、１もしくは２個の酸素もしくは硫黄原子および／または１～４個の窒素原子を含有することができるが、ただし、それぞれの環中のヘテロ原子の合計数が４個以下であり、さらに、環は少なくとも１つの炭素原子を含有する。二環および三環基を完成させる縮合された環は１個のみの炭素原子を含有していてよく、飽和、部分的に飽和、または不飽和でありうる。窒素および硫黄原子は酸化されていてよく、窒素原子は四級化されていてよい。ヘテロシクリル基は、任意の利用可能な窒素または炭素原子で接合されていてよい。ヘテロシクリル環は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－ＣＦ３、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－ＯＣＦ３、－ＣＨＯ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１～Ｃ４アルキル、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－ＮＨＣＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｓ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）３ ＋、－ＳＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキレン）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキレン）ＮＨ（アルキル）、および／またはＣ（＝Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキレン）Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２から選択される０、１、２、または３個の置換基を含有しうる。例示的な複素環基としては、それだけには限定されないが、アゼチジニル ピロリジニル、オキセタニル、イミダゾリニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジル、ピペラジニル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジル、２－オキソピロロジニル、２－オキソアゼピニル、アゼピニル、４－ピペリドニル、エトラヒドロピラニル（ｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｙｌ）、モルホリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、１，３－ジオキソラン、キヌクリジニル、テトラヒドロ－１，１－ジオキソチエニルなどが挙げられる。
「ヘテロアリール」という用語は、環のうちの少なくとも１つ中にＯ、Ｓ、またはＮから選択される１～４個のヘテロ原子を有する置換および非置換の芳香族３～１４員環を指す。前記環は、５もしくは６員の単環基、９～１４員の二環基、または１１～１４員の三環基でありうる。ヘテロ原子を含有するヘテロアリール基のそれぞれの環は、１もしくは２個の酸素もしくは硫黄原子および／または１～４個の窒素原子を含有することができるが、ただし、それぞれの環中のヘテロ原子の合計数が４個以下であり、それぞれの環は少なくとも１つの炭素原子を有する。二環および三環基を完成させる縮合された環は１個のみの炭素原子を含有していてよく、飽和、部分的に飽和、または不飽和でありうる。窒素および硫黄原子は酸化されていてよく、窒素原子は四級化されていてよい。二環または三環状であるヘテロアリール基は少なくとも１つの完全に芳香性である環を含んでいなければならないが、他の縮合された環または複数の環は芳香族または非芳香族でありうる。ヘテロアリール基は、任意の環の任意の利用可能な窒素または炭素原子で接合されていてよい。ヘテロアリール環系は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－ＣＦ３、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－ＯＣＦ３、－ＣＨＯ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１～Ｃ４アルキル、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－ＮＨＣＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｓ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）３ ＋、－ＳＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキレン）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキレン）ＮＨ（アルキル）、および／またはＣ（＝Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキレン）Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２から選択される０、１、２、または３個の置換基を含有しうる。例示的なヘテロアリール基としては、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、クロモニル、クマリニルベンゾピラニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリルピロロピリジル、フロピリジルジヒドロイソインドリル、テトラヒドロキノリニルなどが挙げられる。具体的なヘテロアリール基としては、例えば、６置換のキナゾリン－４－イルおよび６－トリフルオロメチル－キナゾリン－４－イルが挙げられる。
保存的アミノ酸置換：「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。当技術分野では、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）を含む、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。したがって、ポリペプチド内のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーに由来する、別のアミノ酸で置き換えられる場合、アミノ酸置換は、保存的であると考えられる。別の態様では、アミノ酸の連なりは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる、構造的に類似する連なりで、保存的に置き換えられうる。
非保存的アミノ酸置換は、（ｉ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）が、電気陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）で、もしくはこれらにより置換される置換、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）で、もしくはこれらにより置換される置換、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが、他の任意の残基で、もしくはこれらにより置換される置換、または（ｉｖ）バルクの疎水性側鎖もしくは芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｒｐ）が、小型側鎖を有する残基（例えば、ＡｌａまたはＳｅｒ）、もしくは側鎖を有さない残基（例えば、Ｇｌｙ）で、もしくはこれらにより置換される置換を含む。
他のアミノ酸置換もまた使用されうる。例えば、アミノ酸であるアラニンについて、置換は、Ｄ－アラニン、グリシン、ベータ－アラニン、Ｌ－システイン、およびＤ－システインのうちのいずれか１つから採択されうる。リシンについて、置き換えは、Ｄ－リシン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチン、またはＤ－オルニチンのうちのいずれか１つでありうる。一般に、単離ポリペプチドの特性の変化を誘導することが期待されうる、機能的に重要な領域内の置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリン、もしくはトレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンで（またはこれらにより）置換される置換；（ｉｉ）システイン残基が、他の任意の残基で（またはこれらにより）置換される置換；（ｉｉｉ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性側鎖、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸を有する残基で（またはこれらにより）置換される置換；または（ｉｖ）バルク側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、このような側鎖を有さない残基、例えば、グリシンで（またはこれらにより）置換される置換である。前出の非保存的置換のうちの１つが、タンパク質の機能的特性を変更しうる可能性はまた、タンパク質の機能的に重要な領域に照らした置換位置とも相関しうる：したがって、一部の非保存的置換は、生物学的特性に対して、殆ど、または全く、影響を及ぼさない場合がある。
保存された：本明細書で使用される、「保存された」という用語は、それぞれが、比較される、２つ以上の配列の同じ位置において、変更されずに生じるアミノ酸残基である、ポリペプチド配列のアミノ酸残基を指す。比較的保存されたアミノ酸とは、配列内の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸より近縁の配列の中で、保存されているアミノ酸である。
一部の態様では、２つ以上の配列は、互いと、１００％同一である場合、「完全に保存されている」または「同一」であると言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、互いと、少なくとも７０％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、互いと、約７０％同一であるか、約８０％同一であるか、約９０％同一であるか、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」であると言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、互いと、少なくとも３０％同一であるか、少なくとも４０％同一であるか、少なくとも５０％同一であるか、少なくとも６０％同一であるか、少なくとも７０％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、互いと、約３０％同一であるか、約４０％同一であるか、約５０％同一であるか、約６０％同一であるか、約７０％同一であるか、約８０％同一であるか、約９０％同一であるか、約９５％同一であるか、約９８％同一であるか、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用される場合もあり、またはその部分、領域、もしくは特徴に適用される場合もある。
脱アミド化：「脱アミド化」という用語は、ポリペプチド内のアミノ酸残基が、脱アミド化反応を、自発的に受け、これにより、アミノ酸の化学構造を変化させ、ポリペプチドの機能に、潜在的に影響を及ぼす傾向を指す。脱アミド化を測定する例示的方法については、本明細書の実施例で開示される。脱アミド化の相対量は、例えば、脱アミド化を低下させているポリペプチドを同定するように、参照化合物に照らして決定されうる。脱アミド化の相対量はまた、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１が、脱アミド化を低減している製剤を同定するように、参照製剤に照らしても決定されうる。
線維症と関連する疾患：「線維症と関連する疾患」という用語は、線維症が生じることが観察されているか、または線維症が、疾患の病因、進行、もしくは症候と関連するか、もしくはこれに寄与することが公知であるか、もしくはそのように考えられるか、または疾患が進行するにつれて、線維症が、生じることが公知であるか、もしくはそのように考えられる疾患、障害、および状態を含む。
線維症は、膵臓、肺、心臓、腎臓、肝臓、眼、神経系、骨髄、リンパ節、心内膜、または後腹膜などの臓器または組織に影響を及ぼしうる。線維症と関連する例示的疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変前期、肝硬変、びまん性実質性肺疾患、嚢胞性線維症、肺（ｌｕｎｇまたはｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症、進行性塊状線維症、特発性肺線維症、注射部位線維症、腎（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）線維症、慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、筋線維症、心不全、代謝性心不全、心線維症、白内障性線維症、白内障、眼瘢痕化、膵線維症、皮膚線維症、腸線維症、腸狭窄、心内膜心筋線維症、心房線維症、縦隔線維症、クローン病、後腹膜線維症、ケロイド、腎原性全身性線維症、強皮症、全身性硬化症、関節線維症、ペイロニー症候群、デュピュイトラン拘縮、糖尿病性神経障害、癒着性関節包炎、アルコール性肝疾患、脂肪肝、ウイルス性肝炎、胆管疾患、原発性ヘモクロマトーシス、薬物関連肝硬変、特発性肝硬変、ウィルソン病、およびアルファ１アンチトリプシン欠損症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、ヒト線維性肺疾患、黄斑変性、腎性網膜症、硝子体網膜症、心筋線維症、グレーブス眼症、薬物誘導性エルゴチン中毒、心血管疾患、アテローム性動脈硬化／再狭窄、肥厚性瘢痕、原発性筋線維症または特発性筋線維症、および炎症性腸疾患（コラーゲン性大腸炎を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、肝線維症、腎（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）線維症、肺（ｌｕｎｇまたはｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症、および心（ｈｅａｒｔまたはｃａｒｄｉａｃ）線維症を含みうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、肝線維症でありうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、ＮＡＳＨでありうる。
有効量：本明細書中で使用される用語、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を含む製剤、またはＣＣＲ２／５二重拮抗剤の「有効量」は、有益もしくは所望の結果、例えば臨床結果をもたらすために十分な量であり、したがって「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、およびＮＡＳＨを処置するＣＣＲ２／５二重拮抗剤を投与する文脈では、有効量のＦＧＦ－２１ポリペプチドおよびＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、例えば、肝脂肪、肝損傷、または線維症を改善する（例えば、非処置対象におけるレベルに対する、もしくは処置の投与前の対象におけるレベルに対する、またはＦＧＦ－２１ポリペプチドの投与前であるがＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与後であるもしくはその逆である対象に対する、肝脂肪、肝損傷、または線維症の低減）ために十分な量である。
一部の態様では、有効量の本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、およびＮＡＳＨを処置するためのＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、非処置対象におけるレベルに対してまたは処置の投与前の対象におけるレベルに対して、１つまたは複数の線維症バイオマーカーのレベルを変化させることができ、例えば、血清Ｐｒｏ－Ｃ３を低下させる、ＡＬＴもしくはＡＳＴを低下させる、血清アディポネクチンを上昇させる、血漿ＬＤＬを低下させる、血漿ＨＤＬを上昇させる、血漿トリグリセリドレベルを低下させる、またはこれらの任意の組合せである。
「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」と互換的に使用されうる。
ＦＧＦ－２１活性：「ＦＧＦ－２１活性」という用語は、ＦＧＦ－２１ポリペプチドまたはＦＧＦ－２１コンジュゲート（例えば、本開示のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート）の、少なくとも１つの生物学的活性を指す。「生物学的活性」という用語は、分子、例えば、ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチドまたはＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１）の、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトを含むがこれらに限定されない生物に関する、生物学的系、生物学的経路、生物学的分子、または生物学的相互作用の、任意の物理的特性または生化学的特性に影響を及ぼす能力を指す。
例えば、生物学的活性は、野生型ＦＧＦ－２１により果たされる生物学的機能のうちのいずれかを含む。分子が、野生型ＦＧＦ－２１（配列番号３または１１の野生型ＦＧＦ－２１ポリペプチドなど）の少なくとも１つの生物学的活性を有するのかどうかを決定する例示的方法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１７／０１８９４８６号の実施例５および１７において開示されている方法を含む、当技術分野で公知である任意の機能的アッセイを含みうる。
同一性：本明細書で使用される、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリペプチド分子間における、全体的な単量体の保存を指す。さらなる限定詞を伴わない、「同一」という用語、例えば、タンパク質Ａが、タンパク質Ｂと同一であるとは、配列が、１００％同一であること（１００％の配列同一性）を含意する。２つの配列について、例えば、「７０％同一」と記載することは、それらについて、例えば、「７０％の配列同一性」を有すると記載することと同義である。
２つのポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適の比較を目的として、２つの配列をアライメントすることにより実施されうる（例えば、最適のアライメントのために、第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列の、一方または両方へと、ギャップが導入され、同一でない配列は、比較を目的として棄却される場合がある）。ある特定の態様では、比較を目的としてアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸が比較される。
第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸により占有されている場合、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の、最適のアライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮するときに、配列により共有される、同一な位置の数の関数である。２つの配列の間の配列の比較、および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達せられうる。
適切なソフトウェアプログラムは、多様な供給元から入手可能であり、タンパク質配列およびヌクレオチド配列の両方のアライメントのためのソフトウェアプログラムである。配列同一性パーセントを決定するのに適する、１つのプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによるＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能である、ＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部である、ｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列の間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮが、核酸配列を比較するのに使用されるのに対し、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するのに使用される。他の適切なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラムスイートの一部である、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、また、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにおける、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも入手可能である。配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなど、当技術分野で公知の方法を使用して行われうる。
ポリペプチドの参照配列とアライメントする、単一のポリペプチド標的配列内の異なる領域は、各々、それらの固有の配列同一性パーセントを有しうる。配列同一性パーセント値は、最も近い１０分の１位数へと丸められることが留意される。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４が、８０．１へと切り下げて丸められるのに対し、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は、８０．２へと切り上げて丸められる。長さの値は常に、整数となることもまた留意される。
ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列の、第２のアミノ酸配列に対する同一性百分率（ＩＤ％）は、ＩＤ％＝１００×（Ｙ／Ｚ）［式中、Ｙは、第１の配列と、第２の配列とのアライメント（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによりアライメントされた）において、同一なマッチとして評定されたアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列内の残基の総数である］として計算される。第１の配列の長さが、第２の配列より長い場合、第１の配列の、第２の配列に対する同一性パーセントは、第２の配列の、第１の配列に対する同一性パーセントより高くなる。
当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アライメントの生成が、もっぱら、一次配列データにより駆動される、二元的な配列間比較に限定されないことを認識するであろう。また、配列アライメントは、配列データを、構造的データ（例えば、結晶構造解析によるタンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異の位置）、または系統発生データなど、異種供給源に由来するデータと統合することにより生成されうることも認識されるであろう。異種データを統合して、複数の配列アライメントを生成するのに適するプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにおいて入手可能であり、代替的に、例えば、ＥＢＩからも入手可能である、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを計算するのに使用される、最終アライメントは、自動でキュレートされる場合もあり、手動でキュレートされる場合もあることも認識されるであろう。
インビボにおけるタンパク質分解性：「インビボにおけるタンパク質分解性」という用語は、前記生物内で生じるプロテアーゼから生じうる、生体系へと導入された場合における（例えば、生物へと注入された場合における）、ポリペプチドの切断を指す。タンパク質分解は、ポリペプチドの生物学的活性または半減期に潜在的に影響を及ぼしうる。例えば、野生型ＦＧＦ－２１は、切断型不活性ポリペプチドを結果としてもたらす、Ｃ末端における切断を受ける場合がある。
ＦＧＦ－２１のインビボにおけるタンパク質分解を測定する例示的方法は、米国出願公開第２０１７／０１８９４８６号の実施例１０に記載されている、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ベースのＥＣＬＩＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）である。インビボまたはインビトロにおけるタンパク質分解の相対量は、例えば、インビボにおけるタンパク質分解を低下させているポリペプチドを同定するように、参照化合物に照らして決定されうる。インビボにおけるタンパク質分解の相対量はまた、参照製剤に照らして、すなわち、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１のＦＧＦ－２１ポリペプチド部分が、インビトロにおけるタンパク質分解を低下させている製剤を同定するようにも決定されうる。
単離された：本明細書で使用される、「単離された」という用語は、それが会合していた（天然においてであれ、実験設定条件下においてであれ）成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体（例えば、ポリペプチド）を指す。単離物質（例えば、タンパク質）は、それらが会合していた物質に照らして、純度レベルが変動する場合がある。
連結された：「連結された」、「融合された」、「コンジュゲートされた」、および「接合された」という用語は、互換的に使用され、半減期延長部分、例えば共有結合的に融合されたまたはコンカテネートされたＰＥＧ部分（例えば約３０ｋＤのＰＥＧ部分）を指し、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば本明細書で開示される変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１、５、９、または１３のＦＧＦ－２１ポリペプチド）の内部に挿入されたものを含む。
本開示の文脈では、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば、本明細書で開示される変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１、５、９、または１３のＦＧＦ－２１ポリペプチド）と、ＰＥＧ部分とは、化学合成の結果として「融合」されうる。
本開示の文脈では、「コンジュゲートする」または「コンジュゲーション」という用語は、２つの分子実体（例えば、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば、本明細書で開示される変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド、およびＰＥＧなどのポリマー部分）が化学的に連結されていることを表示する。一部の特定の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドと、ＰＥＧ部分とは、例えば、本明細書で開示される式Ｉにおいて示される通り、オキシム連結を介して連結される。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
突然変異：本開示の内容では、上記で規定された、「突然変異」および「アミノ酸置換」という用語（場合によって単に、「置換」とも称される）は、互換的であると考えられる。
非天然アミノ酸：「非天然アミノ酸」とは、２０の一般的アミノ酸、またはピロリシンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。「非天然アミノ酸」という用語と同義に使用されうる、他の用語は、「非天然コードアミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、ならびにこれらの多様なハイフン付き形および非ハイフン付き形である。
「非天然アミノ酸」という用語はまた、天然コードアミノ酸（２０の一般的アミノ酸を含むがこれらに限定されない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）により生じるが、それら自体が、翻訳複合体により成長しつつあるポリペプチド鎖へと、天然で組み込まれることはないアミノ酸も含むがこれらに限定されない。このような非天然アミノ酸の例は、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－トレオニン、およびＯ－ホスホチロシンを含むがこれらに限定されない。本開示の具体的な一態様では、非天然アミノ酸は、パラ－アセチルフェニルアラニンである。本開示の具体的な一態様では、非天然アミノ酸は、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンである。本開示の具体的な一態様では、非天然アミノ酸は、パラ－アセチル－Ｄ－フェニルアラニンである。
患者：本明細書で使用される、「患者」とは、処置を求めうる対象、もしくは処置を必要としうる対象、処置を要求する対象、処置を施されている対象、処置を施されることになる対象、または特定の疾患または状態について訓練を受けた職業的従事者によるケア下にある対象を指す。
医薬組成物：「医薬組成物」という用語は、有効成分（例えば、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１）の生物学的活性が、有効となることを可能とするような形態にあり、組成物が投与される対象に対して、許容不可能な程度に毒性である、さらなる成分（例えば、賦形剤および水）を含有しない調製物を指す。このような組成物は、無菌でありうる。
薬学的に許容される：本明細書では、「薬学的に許容される」という語句は、穏当な医学的判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適する、妥当な利益／リスク比と釣り合う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように用いられる。一般に、動物における使用のためであり、より具体的には、ヒトにおける使用のための、連邦政府または州政府の規制機関による承認（または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方）は、これらの化合物、材料、組成物、および／または剤形が、薬学的に許容されることを含意する。治療目的に安全なものとして、一般に許容可能な、化合物、材料、組成物、および／または剤形は、「治療用に許容可能」である。
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される、「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書で記載される活性化合物以外（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることが可能なビヒクル）であり、対象において実質的に非毒性であり、非炎症性である特性を有する、任意の成分を指す。賦形剤は、例えば、キレート剤、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、抗酸化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、保存剤、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水を含みうる。治療目的に安全なものとして、一般に許容される賦形剤は、「治療用に許容可能な賦形剤」である。
薬学的に許容される塩：本開示はまた、本明細書で記載される化合物の、薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される、「薬学的に許容される塩」とは、開示される化合物の誘導体を指し、この場合、親化合物は、既存の酸部分または塩基部分を、その塩形態へと転換することにより（例えば、遊離塩基を、適切な有機酸と反応させることにより）修飾される。薬学的に許容される塩の例は、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などを含むがこれらに限定されない。
ポリペプチド：本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように、互換的に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含みうる。用語はまた、天然で、または介入により修飾されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作もしくは修飾も包含する。定義内にはまた、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸など、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、およびクレアチンを含む）のほか、当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。特定の態様では、本明細書で開示されるポリペプチドは、ＦＧＦ－２１ポリペプチドである。
本明細書で使用されるポリペプチドという用語は、任意のサイズ、構造、または機能の、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オーソログ、パラログ、断片、ならびに前出の他の同等物、変異体、および類似体を含む。ポリペプチドは、単一のポリペプチドの場合もあり、二量体、三量体、または四量体などの多分子複合体の場合もある。ポリペプチドはまた、単鎖ポリペプチドまたは多鎖ポリペプチドも含みうる。最も一般に、ジスルフィド連結は、多鎖ポリペプチド内に見出される。ポリペプチドという用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の、人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用されうる。一部の態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸以下の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さでありうる。
防止すること：本明細書で使用される、「防止すること」という用語は、疾患、障害、および／もしくは状態の発生を、部分的に、もしくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、および／もしくは状態の、１つもしくは複数の症候、特徴、もしくは臨床症状の発生を、部分的に、もしくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、および／もしくは状態の、１つもしくは複数の症候、特徴、もしくは症状の発生を、部分的に、もしくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、および／もしくは状態からの進行を、部分的に、もしくは完全に遅延させること；ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態と関連する病態を発症する危険性を減少させることを指す。一部の態様では、本出願で開示される医薬製剤は、ＮＡＳＨまたは糖尿病など、線維症と関連する疾患または状態の発生を防止するか、これらの症候を防止するか、またはこれらの合併症を防止するのに使用されうる。
予防法：本明細書で使用される、「予防法」とは、疾患もしくは状態の発生を防止する、または線維症と関連する疾患もしくは状態、例えば、ＮＡＳＨの症候を防止するか、もしくはこれらの発生を遅延させるのに使用される治療法または一連の措置を指す。一部の態様では、本出願で開示される医薬製剤は、予防的に使用されうる。
予防：本明細書で使用される、「予防」とは、健康を維持し、線維症と関連する疾患もしくは状態、例えば、ＮＡＳＨもしくは糖尿病を防止するか、もしくはこれらの発生を遅延させるか、または疾患もしくは状態と関連する症候を防止するか、もしくはこれらの発生を遅延させるために取られる方策を指す。
組換え：「組換え」ポリペプチドまたは「組換え」タンパク質とは、組換えＤＮＡ技術を介して作製されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。操作宿主細胞内で発現される、組換作製ポリペプチドおよび組換作製タンパク質は、任意の適切な技法により、分離されるか、分画されるか、または部分的に、もしくは実質的に精製された、天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的で、単離されていると考えられる。本明細書で開示される変異体ＦＧＦ－２１は、当技術分野で公知の方法を使用して、組換え作製されうる。本明細書で開示されるタンパク質およびペプチドはまた、化学合成される場合もある。
一部の態様では、本開示のために有用なＦＧＦ－２１ポリペプチドは（例えば、非天然アミノ酸を含むＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば、配列番号１、５、９、または１３のＦＧＦ－２１）、細菌宿主により組換え作製される。
類似性：本明細書で使用される、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリペプチド分子間における、全体的な類縁性を指す。ポリマー分子の、互いとの類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が、当技術分野で理解される保存的置換を考慮に入れることを除き、同一性パーセントの計算と同じ方式で実施されうる。
対象：「対象」または「個体」または「動物」または「哺乳動物」とは、それらについて、診断、予後診断、または治療が所望される、任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ、ｃｏｗｓ）などの、家畜、農場動物、動物園動物、競技動物、愛玩動物；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長動物；イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科動物；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科動物；クマ；ウシ、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯動物などを含むがこれらに限定されない。ある特定の態様では、哺乳動物は、ヒト対象である。他の態様では、対象は、ヒト患者である。特定の態様では、対象は、インビボにおいてであれ、インビトロにおいてであれ、エクスビボにおいてであれ、本明細書で記載される方法に適するヒト患者またはその細胞である。
患うこと：疾患、障害、および／または状態を「患っている」個体は、疾患、障害、および／または状態の、１つまたは複数の症候を伴うか、または提示すると診断されている。一部の態様では、本明細書で開示される医薬製剤は、ＮＡＳＨまたは糖尿病など、線維症と関連する疾患または状態を患う対象へと投与されうる。
罹患しやすい：疾患、障害、および／または状態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／もしくは状態を伴うと診断されておらず、かつ／または疾患、障害、および／もしくは状態の症候を呈さない場合もあるが、疾患またはその症候を発症する傾向を有する。一部の態様では、疾患、障害、および／または状態（例えば、がん）に罹患しやすい個体は、以下：（１）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、および／または状態と関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または減少；（４）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する習慣および／または生活様式；（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する微生物への曝露および／またはこれらの感染のうちの１つまたは複数により特徴づけられうる。
一部の態様では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。一部の態様では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症しないであろう。一部の態様では、本明細書で開示される医薬製剤は、ＮＡＳＨまたは糖尿病など、線維症と関連する疾患または状態に罹患しやすい対象へと投与されうる。
治療剤：「治療剤」または「薬剤」という用語は、対象へと投与されると、治療的効果、診断的効果、および／もしくは予防的効果を有し、かつ／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する分子的実体を指す。例えば、一部の態様では、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１）は、治療剤でありうる。一部の態様では、薬剤は、本明細書で開示される、少なくとも１つのＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１との組合せ療法の一部として共投与される別の分子である。
治療的に有効な転帰：本明細書で使用される、「治療的に有効な転帰」という用語は、感染症、疾患、障害、および／または状態を患うか、またはこれらに罹患しやすい対象において、感染症、疾患、障害、および／または状態を処置し、これらの症候を改善し、これらを診断し、防止し、および／またはこれらの発生を遅延させるのに十分な転帰を意味する。
処置する、処置、治療：本明細書で使用される、「処置する」もしくは「処置」もしくは「治療」という用語、またはこれらの文法的変化形は、線維症と関連する疾患または状態、例えば、ＮＡＳＨまたは糖尿病の、１つまたは複数の症候または特徴を、部分的に、または完全に防止し、緩和し、改善し（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ、ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、和らげ、これらの発生を遅延させ、これらの進行を阻害し、これらの重症度を軽減し、および／またはこれらの発生率を低減することを指す。例えば、線維症と関連する疾患を「処置すること」は、症候を防止すること、症候を改善すること、疾患もしくは状態またはその症候の発生を遅延させることなどを指す場合がある。処置は、疾患、障害、および／または状態と関連する病態を発症する危険性を減少させる目的で、疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈さない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期徴候だけを呈する対象へと投与されうる。
ｕｇ、ｕＭ、ｕＬ：本明細書で使用される、「ｕｇ」、「ｕＭ」、および「ｕＬ」という用語は、それぞれ、「μｇ」、「μΜ」、および「μＬ」と互換的に使用される。
本開示の多様な態様については、以下の小節において、さらに詳細に記載される。
Ｉ．本開示の方法
本開示はまた、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において線維症および／または糖尿病に関連する疾患または状態を処置または防止する方法も提供する。一部の態様では、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチドを、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と同時発生的に投与する。一部の態様では、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチドを、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と逐次的に投与する。一部の態様では、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチドを、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤の前に投与する。一部の態様では、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチドを、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤の後に投与する。
一部の態様では、疾患または状態は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。一部の態様では、疾患または状態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。一部の態様では、疾患または状態は非アルコール性脂肪酸疾患（ＮＡＦＡＤ）である。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドおよびＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、例えば安全シリンジまたは自己注射器を使用して皮下投与する。
一部の態様では、対象へのＦＧＦ－２１ポリペプチドおよびＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与は、肝硬度を減少させるか、体脂肪率を減少させるか、体重を減少させるか、肝臓対体重比を減少させるか、肝脂質含量を減少させるか、肝線維症面積を減少させるか、空腹時グルコースレベルを低下させるか、空腹時トリグリセリドレベルを低下させるか、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるか、ＡｐｏＢレベルを低下させるか、ＡｐｏＣレベルを低下させるか、ＨＤＬコレステロールを増大させるか、またはこれらの任意の組合せである。
一部の態様では、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとの、本明細書で開示される処置方法による、対象への投与は、非処置対象またはＦＧＦ－２１ポリペプチドおよび／もしくはＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与前の対象におけるレベルと比較して、（ｉ）肝脂肪レベルの低減、（ｉｉ）肝損傷レベルの低減、（ｉｉｉ）線維症レベルの低減、（ｉｖ）線維症バイオマーカーである血清Ｐｒｏ－Ｃ３（Ｎ末端ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチド）レベルの低下、（ｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの低下、（ｖｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの低下、（ｖｉｉ）血清アディポネクチンレベルの上昇、（ｖｉｉｉ）血漿ＬＤＬレベルの低下、（ｉｘ）血漿ＨＤＬレベルの上昇、（ｘ）血漿トリグリセリドレベルの低下、（ｘｉ）肝硬度レベルの低減、または（ｘｉｉ）これらの任意の組合せを結果としてもたらす。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとの、本明細書で開示される処置方法による、対象への投与は、ＦＧＦ－２１ポリペプチドまたはＣＣＲ２／５二重拮抗剤のみで処置し、両方では処置していない対象におけるレベルと比較して、（ｉ）肝脂肪レベルの低減、（ｉｉ）肝損傷レベルの低減、（ｉｉｉ）線維症レベルの低減、（ｉｖ）線維症バイオマーカーである血清Ｐｒｏ－Ｃ３（Ｎ末端ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチド）レベルの低下、（ｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの低下、（ｖｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの低下、（ｖｉｉ）血清アディポネクチンレベルの上昇、（ｖｉｉｉ）血漿ＬＤＬレベルの低下、（ｉｘ）血漿ＨＤＬレベルの上昇、（ｘ）血漿トリグリセリドレベルの低下、（ｘｉ）肝硬度レベルの低減、または（ｘｉｉ）これらの任意の組合せを結果としてもたらす。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１の、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせた、対象への投与は、非処置対象またはＦＧＦ－２１ポリペプチドおよび／もしくはＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与前の対象におけるレベルと比較して、（ａ）肝臓単球数の低減、（ｂ）Ｆ４／８０陽性肝臓単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）数の低減または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を結果としてもたらす。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１の、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせた、対象への投与は、ＦＧＦ－２１ポリペプチドまたはＣＣＲ２／５二重拮抗剤のみで処置し、両方では処置していない対象におけるレベルと比較して、（ａ）肝臓単球数の低減、（ｂ）Ｆ４／８０陽性肝臓単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）数の低減または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を結果としてもたらす。
一部の態様では、線維症と関連する疾患は、膵臓、肺、心臓、腎臓、肝臓、眼、神経系、骨髄、リンパ節、心内膜、および／または後腹膜などの臓器または組織に影響を及ぼしうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、肝線維症または肝硬変前期でありうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、びまん性実質性肺疾患、嚢胞性線維症、肺線維症、進行性塊状線維症、特発性肺線維症、注射部位線維症、腎線維症、慢性腎疾患、糖尿病性腎疾患、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、筋線維症、心不全、急性心不全、慢性心不全、代謝性心不全、心線維症、白内障性線維症、白内障、眼瘢痕化、膵線維症、皮膚線維症、腸線維症、腸狭窄、心内膜心筋線維症、心房線維症、縦隔線維症、クローン病、後腹膜線維症、ケロイド、腎原性全身性線維症、強皮症、全身性硬化症、関節線維症、ペイロニー症候群、デュピュイトラン拘縮、糖尿病性神経障害、癒着性関節包炎、アルコール性肝疾患、脂肪肝、ウイルス性肝炎、胆管疾患、原発性ヘモクロマトーシス、薬物関連肝硬変、特発性肝硬変、ウィルソン病、およびアルファ１アンチトリプシン欠損症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、ヒト線維性肺疾患、肝線維症、黄斑変性、腎性網膜症、硝子体網膜症、心筋線維症、グレーブス眼症、薬物誘導性エルゴチン中毒、心血管疾患、アテローム性動脈硬化／再狭窄、肥厚性瘢痕、原発性筋線維症または特発性筋線維症、および炎症性腸疾患（コラーゲン性大腸炎を含むがこれらに限定されない）から選択されうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、肺疾患、肺がん、薬物療法、化学療法、または放射線療法のうちの１つまたは複数から生じる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、老齢、心臓発作、脳卒中、心筋損傷、または左心室機能不全のうちの１つまたは複数から生じる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、腎線維症、糸球体腎炎、慢性腎疾患、慢性腎不全、および全身性エリテマトーデス、がん、物理的閉塞、毒素、代謝性疾患、免疫疾患、または糖尿病性腎症と関連する腎炎から選択されうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、外傷、脊髄損傷、感染、手術、虚血性損傷、心臓発作、火傷、環境汚染物質への曝露、肺炎、結核、または急性呼吸器逼迫症候群のうちの１つまたは複数から生じる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、肺線維症、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患、特発性肺線維症、肝線維症、心線維症、心筋線維症、黄斑変性、腎性網膜症、硝子体網膜症、グレーブス眼症、薬物誘導性エルゴチン中毒、心血管疾患、アテローム性動脈硬化／再狭窄、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、原発性筋線維症または特発性筋線維症、炎症性腸疾患、コラーゲン性大腸炎、眼瘢痕化および白内障性線維症から選択されうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、ＮＡＳＨ、肝線維症、および肝硬変から選択されうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、ＮＡＳＨでありうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、糖尿病性腎臓疾患、慢性腎疾患、および腎線維症から選択されうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、代謝性心不全および心線維症から選択されうる。一部の態様では、線維症と関連する疾患は、肺線維症でありうる。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとを投与することを含む、それを必要とする対象において肝脂肪割合を低下させる方法を提供し、対象は、ＮＡＳＨを発生する危険性がある、またはそれを診断されていてもよい。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとを含む、有効量の医薬製剤を投与することを含む、それを必要とする対象において、肝硬度を低下させる、体脂肪率を低下させる、体重を低下させる、肝臓対体重比を低下させる、肝脂質含量を低下させる、肝線維症面積を低下させる、空腹時グルコースレベル、空腹時トリグリセリドを低下させる、ＬＤＬコレステロールを低下させる、ＡｐｏＢを低下させる、ＡｐｏＣを低下させる、および／またはＨＤＬコレステロールを上昇させる方法を提供し、対象は、ＮＡＳＨを発生する危険性がある、またはそれを診断されていてもよい。本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、およびＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃはまた、ここにおいて、および本明細書中に記載のすべての他の例において、別々の医薬製剤としても投与しうる。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとを含む、有効量の医薬製剤を投与することを含む、それを必要とする対象においてアディポネクチンレベルを上昇させる方法を提供し、前記対象は、ＮＡＳＨを発生する危険性がある、またはそれを診断されていてもよい。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１と、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃとを含む、有効量の医薬製剤を投与することを含む、それを必要とする対象においてＮＡＳＨに関連する１つまたは複数の症状を処置する方法を提供する。
また、対象に、配列番号１、５、９、または１３を含む変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドであって、その非天然ｐ－アセチル－フェニルアラニン残基がオキシム連結を介して約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分と連結されている変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドを含む、治療上有効な量の本明細書で開示される医薬製剤を投与することを含む、それを必要とする対象においてＮＡＳＨを処置または防止する方法も、本明細書中に提供する。一部の態様では、非天然ｐ－アセチル－フェニルアラニンは、野生型ＦＧＦ－２１（配列番号３または配列番号１１）のグルタミン１０９を置換する。一部の態様では、非天然ｐ－アセチル－フェニルアラニンは、配列番号７または配列番号１５のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９を置換する。一部の態様では、ＰＥＧ部分は約３０ｋＤａの分子量を有する。一部の態様では、ＰＥＧ部分は約６００～約８００個のエチレングリコール単位を有する。一部の態様では、ＰＥＧ部分はＰＥＧ６８１である。
一部の具体的な態様では、本開示は、対象に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象においてＮＡＳＨを処置または防止する方法を提供する。
一部の態様では、対象は、任意選択で、肝生検により決定される、ＮＡＳＨ ＣＲＮによる線維症病期１～３を呈しうる。一部の態様では、処置の前に、対象は、少なくとも約６０の脂肪肝指数を呈しうる。一部の態様では、処置の前に、対象は、任意選択で、磁気共鳴イメージングにより決定される、少なくとも１０％の肝脂肪画分百分率を呈しうる。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において１型糖尿病または２型糖尿病を処置する方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において肥満症を処置する方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において、グルコースおよび脂質の恒常性、グルコースの取り込み、ＧＬＵＴ１の発現、ならびに／またはグルコース、トリグリセリド、インスリン、もしくはグルカゴンの血清濃度のうちの少なくとも１つを調節する方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において、インスリン感受性を上昇させる、アディポネクチンのレベルを上昇させる、血中グルコースのレベルを低減させる、グルカゴンのレベルを低減させる、トリグリセリドのレベルを低減させる、フルクトサミンのレベルを低減させる、低密度コレステロールのレベルを低減させる、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減させる方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において、肥満症、糖尿病、膵炎、インスリン抵抗症、高インスリン血症、グルコース不耐性、高血糖症、代謝症候群、耐糖能異常、グルコースクリアランス不十分、高血中グルコース、およびプラダー－ウィリー症候群から選択される状態または障害を処置する方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、対象に、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１を、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤、例えば化合物Ａまたは化合物Ｃと組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において、Ａ型インスリン抵抗症、Ｃ型インスリン抵抗症（別名ＨＡＩＲ－ＡＮ症候群）、ラブソン－メンデンホール症候群、ドナヒュー症候群もしくは妖精症、高アンドロゲン症、多毛症（ｈｉｒｓｕｉｔｉｓｍ）、または黒色表皮腫から選択されるインスリン関連の状態または障害を処置する方法を提供する。
ＩＩ．ＦＧＦ－２１ポリペプチド
本開示は、繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ－２１）ポリペプチドとＣＣＲ２／５二重拮抗剤との組合せ療法を対象とする。本方法に有用なＦＧＦ－２１ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ－２１ポリペプチドの任意の変異体または断片でありうる。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、異種部分とコンジュゲートされている（例えばＰＥＧ部分（「ＦＧＦ－２１コンジュゲート」））。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、異種ポリペプチドと連結されている。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、異種ポリペプチドと連結されており、異種部分とコンジュゲートされている。
「ＦＧＦ－２１コンジュゲート」という用語は、ＰＥＧ部分へと連結されたＦＧＦ－２１ポリペプチド部分を含むコンジュゲートを指す。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。「ＦＧＦ－２１ポリペプチド」という用語は、一般に、野生型ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号３または１１のポリペプチド）、および「変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド」（例えば配列番号７または１５のポリペプチド）の両方を指す。
本明細書で使用される、「ＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート」または「ＰＥＧ－ＦＧＦ－２１」という用語は、オキシム連結を介して、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド部分へと連結されたＰＥＧ部分を含む、ＰＥＧ化ＦＧＦ－２１形態を指す。本開示の例示的なＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲートは、以下の表１中において、配列番号２、４、６、および８に明示されている。配列番号２、４、６、および８に明示される配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを有さないポリペプチドの形態を含む、本開示のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１０、１２、１４、または１６に対応する。
一部の態様では、「ＦＧＦ－２１変異体」という用語は、野生型ＦＧＦ－２１の配列に対してＧｌｙ１７１Ｇｌｕ点突然変異および１２０－ＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧ－１３３（配列番号１７）＞ＧＳＧＲＧ（配列番号１８）の置換を含むＦＧＦ－２１ポリペプチドを指す。一部の態様では、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１変異体は、配列番号５もしくは配列番号７に明示されるＦＧＦ－２１配列、またはそのＮ末端メチオニンを有さない対応形態、すなわち配列番号１３および配列番号１５に対応する。一部の態様では、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１変異体は、配列番号６もしくは配列番号８に明示されるコンジュゲート、またはそのＮ末端メチオニンを有さない対応形態、すなわち配列番号１４および配列番号１６に対応する。
表１：例示的なＦＧＦ－２１配列（ｐＡＦ＝パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン）
Figure 2023538533000009
Figure 2023538533000010

Figure 2023538533000011
本明細書で開示される組成物、製剤、方法、またはキットにおいて、配列番号１の化合物または配列番号９のそのＮ末端メチオニンなしの形態は、配列番号５の化合物または配列番号１３のそのＮ末端メチオニンなしの形態で置き換えることができ、配列番号２の化合物または配列番号１０のそのＮ末端メチオニンなしの形態は、配列番号６の化合物または配列番号１４のそのＮ末端メチオニンなしの形態で置き換えることができ、配列番号３の化合物または配列番号１１のそのＮ末端メチオニンなしの形態は、配列番号７の化合物または配列番号１５のそのＮ末端メチオニンなしの形態で置き換えることができ、配列番号４の化合物または配列番号１２のそのＮ末端メチオニンなしの形態は、配列番号８の化合物または配列番号１６のそのＮ末端メチオニンなしの形態で置き換えることができる。
当技術分野で公知である、多数のＦＧＦ－２１は、本明細書で開示される、ＰＥＧ化ＦＧＦ－２１コンジュゲート製剤、例えば、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０１２，９３１号および同第９，４３４，７８８号において開示されている、ＰＥＧ化ＦＧＦ－２１コンジュゲート製剤において使用されうる。線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ－２１）については、文献［それらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000)；ＷＯ０１／３６６４０およびＷＯ０１／１８１７２；ならびに米国特許公開第２００４０２５９７８０号］において記載されている。他のＦＧＦと異なり、ＦＧＦ－２１は、増殖効果および腫瘍形成効果を及ぼさないことが報告されている［Ornitz and Itoh, Genome Biology 2001, 2(3):reviews3005.1-3005.12］。
ＦＧＦ－２１について、複数の多型が同定されている。米国特許公開第２００１００１２６２８号および米国特許第６，７１６，６２６号では、ロイシンまたはプロリンが、同じ位置に記載されている。１つのアミノ酸（ロイシン）が異なる、Ｎ末端のリーダー配列またはシグナル配列は、米国特許第６，７１６，６２６号および米国特許公開第２００４０２５９７８０号に示されている。ＦＧＦ－２１の変異体または突然変異体は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７１６，６２６号；米国特許公開第２００５／０１７６６３１号、同第２００５／００３７４５７号、同第２００４／０１８５４９４号、同第２００４／０２５９７８０号、同第２００２／０１６４７１３号、および同第２００１／００１２６２８号；ＷＯ０１／３６６４０；ＷＯ０３／０１１２１３；ＷＯ０３／０５９２７０；ＷＯ０４／１１０４７２；ＷＯ０５／０６１７１２；ＷＯ０５／０７２７６９；ＷＯ０５／０９１９４４；ＷＯ０５／１１３６０６；ＷＯ０６／０２８５９５；ＷＯ０６／０２８７１４；ＷＯ０６／０５０２４７；ＷＯ０６／０６５５８２；ＷＯ０６／０７８４６３；ＷＯ０１／０１８１７２；ＷＯ０９／１４９１７１；ＷＯ１０／０４２７４７；ＷＯ１２／０６６０７５；ＷＯ１１／１５４３４９；ＷＯ１３／０５２３１１；ＷＯ１３／１８８１８１において開示されている変異体または突然変異体を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される、「変異体ＦＧＦ－２１」および「変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸位置において、参照野生型ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号３の野生型ヒトＦＧＦ－２１または配列番号１１のそのＮ末端メチオニンなしの形態）と異なり、典型的に、線維芽細胞増殖因子２１の、少なくとも１つの生物学的活性を有するＦＧＦ－２１ポリペプチドのほか、それらの生物学的活性に関わらず、ＦＧＦ－２１類似体、ＦＧＦ－２１アイソフォーム、ＦＧＦ－２１模倣体、ＦＧＦ－２１断片、ハイブリッドＦＧＦ－２１タンパク質、これらの融合タンパク質、オリゴマーおよび多量体、相同体、グリコシル化パターン変異体、スプライス変異体、ならびにムテインを指す。この用語には、天然に存在する変異体および天然に存在しない変異体の両方、例えば、野生型ＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号３のポリペプチドまたは配列番号１１のそのＮ末端メチオニンなしの形態中のアミノ酸を、非天然アミノ酸（例えばパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン）で置換した結果としてもたらされる変異体の両方が包含される。置換は、例えば、組換え発現または化学的もしくは酵素的合成の結果でありうる。一部の態様では、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドもしくは配列番号９のそのＮ末端メチオニンなしの形態、または配列番号５のポリペプチドもしくは配列番号１３のそのＮ末端メチオニンなしの形態を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含むＦＧＦ－２１ポリペプチドを包含する。例えば、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、１つもしくは複数のアミノ酸の置換（例えば、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸による）、欠失（末端または内部の欠失）、または異種部分の接合（アミノ酸配列内の、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部における、挿間／挿入いずれかによる接合、または側鎖接合による接合）などの修飾を含む。変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語はまた、ＦＧＦ－２１の多型（例えば、天然に存在するＦＧＦ－２１の配列変異体）、例えば、Ｐ形態またはＬ形態も包含する。
天然に存在するＦＧＦ－２１ポリペプチド内の、多種多様なアミノ酸位置における置換について記載されている。可溶性または安定性をモジュレートするか、アゴニスト活性を増大させるか、インビボまたはインビトロにおける半減期を延長するか、プロテアーゼ抵抗性を増大させるか、ポリペプチドを、アンタゴニストへと転換するか、免疫原性もしくは毒性を低減するか、精製を容易とするか、もしくは製造可能性を促進するか、またはこれらの任意の組合せである置換を含むがこれらに限定されない置換もまた、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語により包含される。
変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語はまた、天然に存在するＦＧＦ－２１ポリペプチドの、生物学的活性断片、生物学的活性変異体、および立体異性体のほか、天然に存在するＦＧＦ－２１のアゴニスト、模倣体、およびアンタゴニスト変異体、ならびにこれらのポリペプチド融合体も含む。変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語により、アミノ末端、カルボキシル末端、またはこれらの両方において、さらなるアミノ酸を含む融合体が包含される。
例示的融合体は、例えば、メチオニンが、例えば、リーダーペプチドもしくはシグナルペプチドを欠く、ＦＧＦ－２１の成熟形態、またはその部分の組換え発現から得られる、ＦＧＦ－２１ポリペプチドのＮ末端へと連結された、メチオニルＦＧＦ－２１（メチオニンは、例えば、イー・コリ内の組換え発現から得られる、ＦＧＦ－２１のＮ末端へと連結される）、精製を目的とする融合体（ポリヒスチジンまたはアフィニティーエピトープを含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない。
変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語はまた、任意のアミノ酸位置においてグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドＮ結合型グリコシル化形態、またはＯ結合型グリコシル化形態などであるがこれらに限定されない、グリコシル化ＦＧＦ－２１ポリペプチドも含む。単一のヌクレオチド変化を含有する変異体もまた、ＦＧＦ－２１の生物学的活性変異体と考えられる。加えて、スプライス変異体もまた含まれる。
変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語はまた、化学的手段により連結されるか、または融合タンパク質として発現された、任意の１つまたは複数の非修飾ＦＧＦ－２１もしくは修飾ＦＧＦ－２１、または他の任意のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、低分子、リンカー、リガンド、または任意の種類の他の生物学的活性分子による、ＦＧＦ－２１のヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体、またはホモ多量体のほか、例えば、特異的な欠失または他の修飾を含有するが、なお生物学的活性を維持するポリペプチド類似体も含む。
一部の態様では、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、ＦＧＦ－２１ポリペプチドの、その受容体に対するアフィニティーを増大させる、付加、置換、または欠失を含む。同様に、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドという用語は、検出（ＧＦＰを含むがこれらに限定されない）、精製、組織膜もしくは細胞膜を通した輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、ＦＧＦ－２１ポリペプチドサイズの低減、またはポリペプチドの他の形質を改善する化学的もしくは酵素的切断配列、プロテアーゼにより切断された配列、反応性基、抗体結合性ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓを含むがこれらに限定されない）もしくは他のアフィニティーベースの配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどを含むがこれらに限定されない）もしくは連結分子（ビオチンを含むがこれらに限定されない）を含む。
一部の態様では、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１５のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドはＦＧＦ－２１活性を有する。
一部の態様では、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号９、１１、１３、もしくは１５のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるか、これから本質的になり、ポリペプチドはＦＧＦ－２１活性を有する。
この定義により包含される、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、例えば、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドを含む。一部の態様では、非天然アミノ酸は、アミノオキシ誘導体と反応すると、安定的なオキシム連結を形成しうるアミノ酸、例えば、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－（３－オキソブテノイル）－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－（２－アミノ－３－ヒドロキシエチル）フェニルアラニンなどである。一部の態様では、非天然アミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニンである。一部の態様では、非天然アミノ酸は、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンである。
一部の態様では、１つまたは複数の非天然アミノ酸は、野生型ＦＧＦ－２１の以下の位置：１位の前（すなわち、Ｎ末端に）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号３に対応するアミノ酸位置）のうちの１つまたは複数に組み込まれる。
一部の具体的な態様では、本開示の変異体ＦＧＦ－２１は、野生型ＦＧＦ－２１のグルタミン１０９が非天然パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンアミノ酸で置換されている、改変ＦＧＦ－２１ポリペプチド配列番号１または配列番号９、すなわち、配列番号３の野生型ＦＧＦ－２１、または配列番号１１のそのＮ末端メチオニンなしの形態の誘導体である。一部の具体的な態様では、本開示の変異体ＦＧＦ－２１は、ＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９が非天然パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンアミノ酸で置換されている、改変ＦＧＦ－２１ポリペプチド配列番号５または配列番号１３、すなわち、配列番号７のＦＧＦ－２１変異体、または配列番号１５のそのＮ末端メチオニンなしの形態の誘導体である。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、ＦＧＦ－２１部分および非ＦＧＦ－２１部分、例えば半減期延長部分を含む。例示的な非ＦＧＦ－２１部分としては、ポリペプチド部分または非ポリペプチド部分、例えば、Ｆｃ、ＸＴＥＮ、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリン、ＣＴＰ［ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の２８個のアミノ酸のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）およびその４つのＯ－グリカン］、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、およびアルブミン結合小分子が挙げられる。本開示の例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドとしては、例えば、ＦＧＦ－２１－Ｆｃポリペプチド、ＦＧＦ－２１－ＸＴＥＮポリペプチド、ＦＧＦ－２１－アルブミンポリペプチド、ＦＧＦ－２１－ＰＡＳポリペプチド、ＦＧＦ－２１－トランスフェリンポリペプチド、ＦＧＦ－２１－ＣＴＰポリペプチド、ＦＧＦ－２１－ＰＥＧポリペプチド、ＦＧＦ－２１－ＨＥＳポリペプチド、ＦＧＦ－２１－アルブミン結合ポリペプチドポリペプチド、およびＦＧＦ－２１－アルブミン結合小分子ポリペプチドが挙げられる。したがって、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは融合タンパク質でありうる。
上述のように、例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドは、１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドと融合されたＦＧＦ－２１を含む。その全体で本明細書中に参考として組み込まれているSchellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009)。ＸＴＥＮポリペプチドは、ＦＧＦ－２１のＮ末端またはＦＧＦ－２１のＣ末端のどちらかと融合させることができる。例示的なＸＴＥＮポリペプチドとしては、例えば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、ＷＯ ２００９／０２３２７０号、ＷＯ ２０１０／０９１１２２号、ＷＯ ２００７／１０３５１５号、ＵＳ ２０１０／０１８９６８２号、およびＵＳ ２００９／００９２５８２号中に開示されているものが挙げられる。
上述のように、例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドはまた、１つまたは複数のアルブミンポリペプチド、アルブミン結合ポリペプチド、またはアルブミン結合小分子と融合されたＦＧＦ－２１も含む。一実施形態では、アルブミンはヒトアルブミンである。アルブミンまたはアルブミン結合タンパク質は、ＦＧＦ－２１のＮ末端もしくはＦＧＦ－２１のＣ末端のどちらかと融合させるか、またはＦＧＦ－２１中の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。本開示において使用しうるアルブミンの例、例えばその断片は知られている。例えば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第７，５９２，０１０号、米国特許第６，６８６，１７９号、およびSchulte, Thrombosis Res. 124 Suppl. 2:S6-S8 (2009)である。
アルブミン結合ポリペプチドは、それだけには限定されないが、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンと結合することができるアルブミン結合抗体断片を含むことができる。Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996)およびLinhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)によって開示されているストレプトコッカスタンパク質Ｇからのドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１９）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えばDennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)を参照されたい。アルブミン結合抗体断片の例は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれているMuller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007)、Rooverset et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007)、およびHolt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)中に開示されている。
一部の態様では、本開示の組換えＦＧＦ－２１ポリペプチドは、そのアルブミンと結合することができる非ポリペプチド小分子、変異体、または誘導体のための少なくとも１つの接合部位を含む。そのようなアルブミン結合部分の一例は、Trusselet et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)によって開示されている２－（３－マレイミドプロパンアミド）－６－［４－（４－ヨードフェニル）ブタンアミド］ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
上述のように、例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドはまた、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）の少なくとも１つのβサブユニットと融合させたＦＧＦ－２１、またはその断片、変異体、もしくは誘導体も含む。ＣＴＰはＦＧＦ－２１と、ＦＧＦ－２１のＮ末端もしくはＦＧＦ－２１のＣ末端のどちらかと融合させる、またはＦＧＦ－２１中の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。組換えタンパク質内に融合または挿入された１つまたは複数のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期を上昇させることが知られている。例えば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたい。例示的なＣＴＰペプチドはまた、参考として組み込まれている米国特許出願公開第ＵＳ ２００９／００８７４１１ Ａ１号中にも見つけることができる。
上述のように、例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドはまた、少なくとも１つのＰＡＳ配列と融合させたＦＧＦ－２１、またはその断片、変異体、もしくは誘導体も含む。本明細書中で使用されるＰＡＳペプチドまたはＰＡＳ配列とは、主にアラニンおよびセリン残基を含む、または主にアラニン、セリン、およびプロリン残基を含み、生理的条件下でランダムコイルコンホメーションを形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質中の異種部分の一部として使用することができるアラニン、セリン、およびプロリンを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる、構成単位、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。アミノ酸ポリマーは、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基がＰＡＳ配列中に副構成要素として加えられた場合にもランダムコイルコンホメーションを形成することができる。「副構成要素」とは、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ＰＡＳ配列中に特定の度合まで、例えば、アミノ酸の約１２％、すなわちＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個まで、約１０％まで、約９％まで、約８％まで、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち約２％、または約１％で、加えることができることを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択することができる。生理的条件下では、ＰＡＳペプチドはランダムコイルコンホメーションを形成し、したがって本発明の組換えタンパク質に対するインビボおよび／またはインビトロ安定性の上昇を媒介することができ、凝血促進活性を有する。ＰＡＳ配列の例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２９２１３０ Ａ１号およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２００８／１５５１３４ Ａ１号、欧州特許ＥＰ２１７３８９０号から知られている。
上述のように、例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドはまた、少なくとも１つのトランスフェリンペプチドと融合させたＦＧＦ－２１、またはその断片、変異体、もしくは誘導体も含む。任意のトランスフェリンを、本発明の組換えＦＧＦ－２１タンパク質内に融合または挿入することができる。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、およそ７５ＫＤａ（グリコシル化を計算に入れない）の６７９個のアミノ酸のタンパク質であり、遺伝子重複が起源であると見られる２つのメインドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を有する。そのすべてが本明細書中にその全体で参考として組み込まれているＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７、およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたい。
トランスフェリンは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）媒介性のエンドサイトーシスを通じて鉄を輸送する。鉄がエンドソーム区画内に放出され、Ｔｆ－ＴｆＲ複合体が細胞表面へとリサイクルされた後、Ｔｆは、次の鉄輸送サイクルのために細胞外空間へと放出されて戻される。Ｔｆは１４～１７日間を超える長い半減期を持つ［Li et al., Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002)］。トランスフェリン融合タンパク質は、半減期の延長、癌療法のための標的化送達、経口デリバリー、およびプロインスリンの持続的活性化のために研究されている［Brandsma et al., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011)、Bai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005)、Kim et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010)、Wang et al., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)］。
上述のように、例示的なＦＧＦ－２１ポリペプチドはまた、少なくとも１つのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ポリマーと融合させたＦＧＦ－２１も含む。ＨＥＳは天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、身体内でアルファ－アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは有利な生物学的特性を示し、クリニックにおいて、血液量交換剤として、および血液希釈療法において使用されている。例えば、Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987)およびWeidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991)を参照されたい。
ＨＥＳは、分子量分布および置換度によって主に特徴づけられる。ＨＥＳは、１～３００ｋＤ、２～２００ｋＤ、３～１００ｋＤ、または４～７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、０．１～３、０．１～２、０．１～０．９、または０．１～０．８の分子置換度、およびヒドロキシエチル基に関して２～２０の範囲のＣ２：Ｃ６置換間の比をさらに示す場合がある。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ製のＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、例えば、治療の治療指標における血液量交換および血液量減少の予防のために用いられる人工コロイドである。当業者が利用可能ないくつかのＨＥＳ接合方法が存在し、例えば上述のものと同じＰＥＧ接合方法である。
上記で開示された通り、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分へと連結されうる。ＰＥＧの、本明細書で開示される変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１もしくは配列番号５のＦＧＦ－２１ポリペプチド、または配列番号９もしくは１３のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態）への連結は、非修飾形態と比べた、血清（インビボ）半減期の延長もしくはモジュレート、または治療半減期の延長もしくはモジュレート、免疫原性または毒性のモジュレート、凝集および多量体形成など、物理的会合特徴のモジュレート、受容体への結合の変更、１つまたは複数の結合パートナーへの結合の変更、ならびに受容体の二量体化または多量体化の変更を含むがこれらに限定されない変化を結果としてもたらしうる。一部の態様では、ＰＥＧの、本明細書で開示される変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１もしくは配列番号５のＦＧＦ－２１ポリペプチド、または配列番号９もしくは１３のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態）への連結は、吸収速度の増大、毒性の低減、可溶性の改善、タンパク質凝集の低減、ＰＥＧ化ＦＧＦ－２１の生物学的活性および／または標的選択性の増大、製造可能性の増大、および／または免疫原性の低減（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない、薬物動態特性または生物物理特性を、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１もしくは配列番号５のＦＧＦ－２１ポリペプチド、または配列番号９もしくは１３のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態）、または野生型ＦＧＦ－２１（例えば、配列番号３のＦＧＦ－２１ポリペプチド、または配列番号１１のそのＮ末端メチオニンなしの形態）の非コンジュゲート形態などの参照化合物と比較して改善または変更する。一部の態様では、少なくとも１つのリンカーが、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド部分と、ＰＥＧ部分との間に介在しうる。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
ＦＧＦ－２１またはＦＧＦファミリーメンバーの結晶構造、およびこれらの、ＦＧＦ受容体との相互作用の検討は、どの、ある特定のアミノ酸残基が、溶媒へと、完全に、または部分的にアクセス可能な側鎖を有するのかを指し示しうる。これらの位置における非天然アミノ酸の側鎖は、タンパク質表面から離れ、外側の溶媒へと向くので、ＰＥＧへと連結されうる。
ＰＥＧは、野生型ＦＧＦ－２１ポリペプチドまたは変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドの、以下のアミノ酸位置：１位の前（すなわち、Ｎ末端に）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号３に対応するアミノ酸位置）のうちの１つまたは複数へと連結されうる。一部の態様では、ＰＥＧは、非天然アミノ酸、例えば、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンなどのフェニルアラニン誘導体の側鎖へと接合され、上記で開示された位置のうちのいずれかにおいて、天然に存在するアミノ酸を置換する。
本開示のＰＥＧは、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、これらのＣ１～Ｃ１０モノアルコキシ誘導体またはＣ１～Ｃ１０モノアリールオキシ誘導体（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２５２，７１４号において記載されている）、モノメトキシポリエチレングリコール、離散型ＰＥＧ、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールとその誘導体とのコポリマー、またはこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。一部の態様では、ＰＥＧは、分枝状構造を有しうる。分枝状ＰＥＧについては、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996)；Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999)；およびCaliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)において記載されている。
一部の態様では、ＰＥＧの分子量は、約３０ｋＤａである。所望のプロファイル（例えば、所望される持続放出の持続時間、存在する場合、生物学的活性に対する影響、操作の容易さ、抗原性の程度または欠如、およびポリエチレングリコールの、タンパク質または類似体に対する他の公知の影響）に応じて、他のサイズも使用されうる。一部の態様では、ＰＥＧの分子量は、約２８ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３１ｋＤａ、または約３２ｋＤａである。一部の態様では、ＰＥＧの分子量は、約２８ｋＤａ～約２９ｋＤａの間、約２９ｋＤａ～約３０ｋＤａの間、約３０ｋＤａ～約３１ｋＤａの間、または約３１ｋＤａ～約３２ｋＤａの間である。
一部の態様では、ＰＥＧは、約６００エチレングリコール単位、約６１０エチレングリコール単位、約６２０エチレングリコール単位、約６３０エチレングリコール単位、約６４０エチレングリコール単位、約６５０エチレングリコール単位、約６６０エチレングリコール単位、約６７０エチレングリコール単位、約６８０エチレングリコール単位、約６９０エチレングリコール単位、約７００エチレングリコール単位、約７１０エチレングリコール単位、約７２０エチレングリコール単位、約７３０エチレングリコール単位、約７４０エチレングリコール単位、約７５０エチレングリコール単位、約７６０エチレングリコール単位、約７７０エチレングリコール単位、約７８０エチレングリコール単位、約７９０エチレングリコール単位、または約８００エチレングリコール単位を有する。
一部の態様では、ＰＥＧは、約６００エチレングリコール単位～約６１０エチレングリコール単位の間、約６１０エチレングリコール単位～約６２０エチレングリコール単位の間、約６２０エチレングリコール単位～約６３０エチレングリコール単位の間、約６３０エチレングリコール単位～約６４０エチレングリコール単位の間、約６４０エチレングリコール単位～約６５０エチレングリコール単位の間、約６５０エチレングリコール単位～約６６０エチレングリコール単位の間、約６６０エチレングリコール単位～約６７０エチレングリコール単位の間、約６７０エチレングリコール単位～約６８０エチレングリコール単位の間、約６８０エチレングリコール単位～約６９０エチレングリコール単位の間、約６９０エチレングリコール単位～約７００エチレングリコール単位の間、約７００エチレングリコール単位～約７１０エチレングリコール単位の間、約７１０エチレングリコール単位～約７２０エチレングリコール単位の間、約７２０エチレングリコール単位～約７３０エチレングリコール単位の間、約７３０エチレングリコール単位～約７４０エチレングリコール単位の間、約７４０エチレングリコール単位～約７５０エチレングリコール単位の間、約７５０エチレングリコール単位～約７６０エチレングリコール単位の間、約７６０エチレングリコール単位～約７７０エチレングリコール単位の間、約７７０エチレングリコール単位～約７８０エチレングリコール単位の間、約７８０エチレングリコール単位～約７９０エチレングリコール単位の間、または約７９０エチレングリコール単位～約８００エチレングリコール単位の間を有する。
一部の態様では、ＰＥＧは、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、または７００エチレングリコール単位を有する。
一部の具体的な態様では、ＰＥＧ部分は、オキシム連結を介して、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１もしくは配列番号５のＦＧＦ－２１ポリペプチド、または配列番号９もしくは配列番号１３のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態）と連結されている。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ分子の反応基（例えば、３０ｋＤａのメチルＰＥＧ６８１アミノオキシ分子のアミノオキシ基）と変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド中の非天然アミノ酸の反応基（例えばｐ－アセチル－フェニルアラニンのアセチル基、例えば、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドの配列のアミノ酸位置１０９のもの）との間で形成されたオキシム連結を介して、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド（例えば、配列番号１もしくは配列番号５の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチド、または配列番号９もしくは配列番号１３のＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態）と連結されている。一部の態様では、非天然アミノ酸は、配列番号３のＧｌｎ１０９または配列番号７のＧｌｎ１０９を置き換えるパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は直鎖状であるおよび／または遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号２のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、野生型ＦＧＦ－２１（配列番号３）のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号１のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、ＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば、約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１０のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、野生型ＦＧＦ－２１（配列番号１１）のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号９のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、ＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号２のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが、野生型ＦＧＦ－２１のグルタミン１０９（配列番号３）を置き換える、配列番号１のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介して、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンへと、共有結合的に接合されたＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａの間の分子量、例えば、約３０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧを含むＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１０のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが野生型ＦＧＦ－２１（配列番号１１）のグルタミン１０９を置き換える、配列番号９のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されたＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧを含む、ＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号４のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、野生型ＦＧＦ－２１のグルタミン１０９（配列番号３）が、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられており、６８１エチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分が、オキシム連結を介して、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンへと、共有結合的に接合されている、配列番号１のＦＧＦ－２１である。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１２のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、野生型ＦＧＦ－２１（配列番号１１）のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号９のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分である。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号４のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが、野生型ＦＧＦ－２１のグルタミン１０９（配列番号３）を置き換えた、配列番号１のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介して、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンへと、共有結合的に接合された、６８１エチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分を含むＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１２のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが野生型ＦＧＦ－２１（配列番号１１）のグルタミン１０９を置き換えた、配列番号９のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分を含む、ＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、配列番号７のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号５のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、ＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１４のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、配列番号１５のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号１３のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、ＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが配列番号７のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９を置き換える、配列番号５のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されたＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧを含む、ＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１４のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが配列番号１５のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９を置き換える、配列番号１３のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されたＰＥＧ部分、例えば、約２８ｋＤａ～約３２ｋＤａ、例えば約３０ｋＤａの分子量を有する直鎖状ＰＥＧを含む、ＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、配列番号７のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号５のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分である。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、配列番号１５のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンで置き換えられている、配列番号１３のＦＧＦ－２１、およびオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分である。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが配列番号７のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９を置き換えた、配列番号５のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分を含む、ＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、配列番号１６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、すなわち、（ｉ）パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンが配列番号１５のＦＧＦ－２１変異体のグルタミン１０９を置き換えた、配列番号１３のＦＧＦ－２１、および（ｉｉ）オキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を含む直鎖状ＰＥＧ部分を含む、ＦＧＦ－２１コンジュゲートである。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
したがって、本開示の一部の具体的な態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、（ｉ）配列番号１のＦＧＦ－２１ポリペプチド部分、および（ｉｉ）６８１エチレングリコール単位を伴う直鎖状ＰＥＧ部分、すなわち、分子量が約３０ｋＤａであるＰＥＧ部分であって、オキシム連結を介して、１０９位において、パラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンへと、共有結合的に接合されたＰＥＧ部分を含む。一部の態様では、ＰＥＧ部分は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
したがって、本開示の一部の具体的な態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、（ｉ）配列番号９のＦＧＦ－２１ポリペプチド部分、および（ｉｉ）位置１０９でオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を有する直鎖状ＰＥＧ部分、すなわち、およそ３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分を含む。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
したがって、本開示の一部の具体的な態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、（ｉ）配列番号５のＦＧＦ－２１ポリペプチド部分、および（ｉｉ）位置１０９でオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を有する直鎖状ＰＥＧ部分、すなわち、およそ３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分を含む。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
したがって、本開示の一部の具体的な態様では、本明細書で開示される製剤中のＦＧＦ－２１コンジュゲートは、（ｉ）配列番号１３のＦＧＦ－２１ポリペプチド部分、および（ｉｉ）位置１０９でオキシム連結を介してパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンと共有結合的に接合されている、６８１個のエチレングリコール単位を有する直鎖状ＰＥＧ部分、すなわち、およそ３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分を含む。一部の態様では、ＰＥＧ部分は遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
一部の態様では、オキシム連結は、変異体ＦＧＦ－２１内に存在する非天然アミノ酸の反応性基（例えば、ｐ－アセチルフェニルアラニンのアセチル基）と、ＰＥＧ分子の反応性基（例えば、遠位メトキシ基を含む、３０ｋＤａのＰＥＧ６８１アミノオキシ分子のアミノオキシ基）との化学的反応により形成される。一部の態様では、非天然アミノ酸は、組換えにより（例えば、原核細胞培養物中の発現により）、インビトロにおける転写および翻訳を使用して、化学合成を使用して、または当技術分野で公知である任意の方法を使用して、変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドへと組み込まれうる。一部の態様では、ＰＥＧ分子は、アミノ酸（例えば、ｐ－アセチル－フェニルアラニン）へと、化学的に連結され、その後、ＰＥＧ－アミノ酸は、例えば、化学合成を介して、ＦＧＦ－２１ポリペプチドへと組み込まれうる。一部の態様では、ＰＥＧ分子は、遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む。
酵母による発現を介する、ＦＧＦ－２１ポリペプチドの作製は、かつて、Ｏ結合型グリコシル化部位を除去するのに、部位特異的突然変異誘発を要求する、Ｏ結合型グリコシル化の存在により妨げられてきた。ＦＧＦ－２１ポリペプチドはまた、哺乳動物細胞培養物中の組換えにより作製された場合にも、実質的程度のグリコシル化を示す。したがって、一部の態様では、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、原核細胞培養物中の組換えにより作製される。したがって、一部の態様では、本開示の変異体ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、グリコシル化されない。
上記開示したように、本開示は、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、およびアミノポリカルボン酸陽イオンキレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含む、医薬製剤を提供した。「キレート剤」または「カチオンキレート剤」という用語は、互換的であり、元の金属イオンの化学的特性と異なる化学的特性を有する、新たな錯体イオンを形成することにより、金属イオンを、溶液系から除去することが可能な、任意の物質を指す。特に、本明細書で開示されるカチオンキレート剤は、二価金属、例えば、Ｃａ＋＋に特異的に結合するキレート剤である。
一部の具体的な態様では、アミノポリカルボン酸カチオンキレート剤は、ＤＴＰＡである。ペンテト酸またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）は、５つのカルボキシメチル基を伴う、ジエチレントリアミン骨格からなるアミノポリカルボン酸である。ＤＴＰＡの共役塩基は、金属カチオンに対して、高アフィニティーを有する。したがって、ペンタアニオンであるＤＴＰＡ５－は、各窒素中心および各ＣＯＯ－基が、配位結合のための中心としてみなされると仮定すると、潜在的に、オクタデンテートリガンドである。その錯体についての形成定数は、ＥＤＴＡについての形成定数より、約１００大きい。
キレート剤として、ＤＴＰＡは、最大で８つの結合を形成することにより、金属イオンを包み込む。しかし、遷移金属は、通例、８つ未満の配位結合を形成する。このため、ＤＴＰＡは、その誘導体であるペンデチドにより示される通り、金属との錯体を形成した後で、なおも、他の試薬に結合する能力を有する。例えば、銅（ＩＩ）とのその錯体内で、ＤＴＰＡは、３つのアミン中心、および５つのカルボキシレートのうちの３つを利用する、ヘキサデンテート様で結合する。
他の一部の態様では、アミノポリカルボン酸カチオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、または類縁の化合物、例えば、チウキセタン（その炭素骨格が、イソチオシアナトベンジル基およびメチル基を含有する、ＤＴＰＡの修飾形）など、別のアミノポリカルボン酸カチオンキレート剤でありうる。当技術分野で公知である、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡと類縁の他のキレート剤は、アミド基の窒素が、１つまたは複数のＣ１～Ｃ１８アルキル基で置換されたキレート剤、例えば、ＤＴＰＡ．ＢＭＡおよびＥＤＴＡ．ＢＭＡである。
一部の態様では、ＤＴＰＡカチオンキレート剤は、約１０μＭ～約１００μＭの間、１５μＭ～約９５μＭの間、約２０μＭ～約９０μＭの間、約２５μＭ～約８５μＭの間、約３０μＭ～約８０μＭの間、約３５μＭ～約７５μＭの間、約４０μＭ～約７０μＭの間、約４５μＭ～約６５μＭの間、約５０μＭ～約６０μＭの間、約２５μＭ～約７５μＭの間、約４０μＭ～約６０μＭの間、約３０μＭ～約７０μＭの間、または約４０μＭ～約７５μＭの間の量で存在する。
具体的な態様では、アミノポリカルボン酸カチオンキレート剤、例えば、ＤＴＰＡは、５０μＭの量で存在する。
一部の態様では、製剤のｐＨは、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、または約７．５である。一部の態様では、医薬製剤は、ｐＨが６．５である参照製剤より安定である。
一部の態様では、医薬製剤は、界面活性剤をさらに含む。本明細書で使用される、「界面活性剤」という用語は、水中もしくは水溶液中に溶解もしくは懸濁させられた場合に、表面張力を低減するか、または２つの液体の間の表面張力、もしくは液体と固体との間の表面張力を低減する、任意の化合物、典型的に、脂肪族分子を意味する。
本開示の文脈において、界面活性剤とは、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態を含む溶液中において、界面応力および剪断応力を低下させる任意の化合物である。
一部の態様では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、すなわち、中性溶液中で、正味の電荷を有さない傾向がある界面活性剤である。一部の態様では、非アニオン性界面活性剤は、ポリソルベートである。ポリソルベートは、タンパク質を、界面誘導性凝集に対して安定化し、タンパク質の表面吸着を最小化するように、タンパク質医薬において広く使用される、非イオン性界面活性剤の重要なクラスである［Wang W 2005. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics. Int J Pharm 289 (1-2):1-30］。ポリソルベートは、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタンの脂肪酸エステルから構成される、両親媒性の、非イオン性界面活性剤である。市販のポリソルベートは、主に、ソルビタンＰＯＥ脂肪酸エステルを含有する、化学的に多様な混合物である。
本明細書で使用される、「ポリソルベート」という用語は、典型的に、エチレンオキシドとコポリマー化される、ソルビトールのオレイン酸エステルおよびその無水物を指す。例示的ポリソルベートは、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ ２０；ＰＳ２０）［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート］；ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ ４０；ＰＳ４０）［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート］；ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ ６０；ＰＳ６０）［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート］；およびポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ ８０；ＰＳ８０）［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート］を含む。
「ポリオキシエチレン」部分に後続する数である２０は、分子内に見出されるオキシエチレン－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－基の総数を指す。「ポリソルベート」部分に後続する数は、分子のポリオキシエチレンソルビタン部分と会合する脂肪酸の種類に関する。モノラウレートは、２０により指し示され、モノパルミテートは、４０により指し示され、モノステアレートは、６０により指し示され、モノオレエートは、８０により指し示される。一部の態様では、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの場合、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌの量である、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を上回る量で存在する。Wan and Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p.136, 1974を参照されたい。本明細書を通して、界面活性剤濃度（％）は、（ｗ／ｖ）に対応する。
一部の態様では、ポリソルベートはポリソルベート８０（ＰＳ８０）である。
一部の態様では、医薬製剤は、アミノ酸緩衝剤をさらに含む。アミノ酸は、容易に代謝可能な天然存在物質であるため、医薬適用において、バッファーとして使用されると有利でありうる。さらに、バッファーとして使用されるアミノ酸はまた、製剤が凍結乾燥される場合に、アモルファス相にあるタンパク質も保護しうる。適切なアミノ酸バッファーは、ヒスチジン、リシン、および／またはアルギニンを含有しうる。ヒスチジンは、約ｐＨ７において、良好な緩衝能を有する。
本明細書で使用される、「ヒスチジン」という用語は、Ｌ－ヒスチジンまたはＤ－ヒスチジン、ヒスチジンの溶媒和形態、ヒスチジンの水和形態（例えば、一水和物）、もしくはヒスチジンの無水形態、またはこれらの混合物を含む。本開示の製剤中の、他の適切なバッファーは、少数を挙げれば、グルタミン酸、トリス、またはコハク酸である。
一部の具体的な態様では、アミノ酸緩衝剤は、Ｌ－ヒスチジンである。
一部の態様では、医薬製剤は、浸透圧調節剤（当技術分野ではまた、等張剤としても公知である）をさらに含む。本開示に従い、浸透圧調節剤（等張剤）は、ポリオール、糖、炭水化物、塩化ナトリウムなどの塩、またはこれらの混合物を含みうる。例示的ポリオールは、分子量が、約６００ｋＤ未満である（例えば、１２０～４００ｋＤの範囲にある）ポリオール、例えば、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、キシリトール、グリセロール、ラクチトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イノシトール、またはこれらの混合物を含む。
糖または炭水化物である浸透圧調節剤は、単糖、二糖、および多糖、またはこれらの混合物を含む。一部の態様では、糖または炭水化物は、果糖、グルコース、マンノース、スクロース、ソルボース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、水溶性グルカン、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
一部の態様では、浸透圧調節剤は、還元糖もしくは非還元糖、またはこれらの混合物の群から選択される糖を含む。一部の態様では、浸透圧調節剤または等張剤は、好ましくは、スクロース、トレハロース、またはこれらの混合物からなる群から選択される、非還元糖、糖である糖を含む。一部の具体的な態様では、非還元糖は、スクロースである。
一部の態様では、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１ポリペプチド、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態は、約１ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一部の態様では、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態は、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、または約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、皮下投与のために製剤化される。一部の態様では、ＦＧＦ－２１ポリペプチドは、例えば安全シリンジを用いて、皮下投与のために製剤化される。
一部の態様では、本開示は、（ｉ）本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）約１００ｍＭ～約１Ｍの濃度のスクロース、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）約１０μＭ～約１００μＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、製剤のｐＨが約６．７～約７．５である医薬製剤を提供する。
また、（ｉ）本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）約２０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）約６００ｍＭの濃度のスクロース、（ｉｖ）約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）約５０μＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７．１である医薬製剤も提供される。
また、（ｉ）本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）２０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）６００ｍＭの濃度のスクロース、（ｉｖ）０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）５０μＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、ｐＨが７．１である医薬製剤も提供される。
また、（ｉ）本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）約２０ｍＭの濃度のヒスチジン、および（ｉｉｉ）約６００ｍＭの濃度のスクロースを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７．０である医薬製剤も提供される。
また、（ｉ）本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）２０ｍＭの濃度のヒスチジン、および（ｉｉｉ）６００ｍＭの濃度のスクロースを含む医薬製剤であって、ｐＨが７．０である医薬製剤も提供される。
一部の具体的な態様では、本開示は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍＬの濃度の、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）約２０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）約６００ｍＭの濃度のスクロース、（ｉｖ）約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）約５０ｕＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７．１である医薬製剤を提供する。
また、（ｉ）約２０ｍｇ／ｍＬの濃度の本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）約２０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）約６００ｍＭの濃度のスクロース、（ｉｖ）約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）約５０ｕＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７．１である医薬製剤も提供される。
また、（ｉ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度の、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）２０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）６００ｍＭの濃度のスクロース、（ｉｖ）０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）５０ｕＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、ｐＨが７．１である医薬製剤も提供される。
また、（ｉ）２０ｍｇ／ｍＬの濃度の、本明細書で開示されるＦＧＦ－２１コンジュゲート、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６などのＮ末端メチオニンを有さないそのそれぞれの形態、（ｉｉ）２０ｍＭの濃度のヒスチジン、（ｉｉｉ）６００ｍＭの濃度のスクロース、（ｉｖ）０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｖ）５０ｕＭの濃度のＤＴＰＡを含む医薬製剤であって、ｐＨが７．１である医薬製剤も提供される。
具体的な態様では、本開示は、配列番号２のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１０のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号４のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１２のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号４のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１２のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号４のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１２のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号６のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１４のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号４のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭヒスチジン、６００ｍＭスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％ＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に、１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１２のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号８のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１６のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ７．１中に２０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号４のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
具体的な態様では、本開示は、配列番号１２のＦＧＦ－２１コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン、６００ｍＭのスクロース、５０ｕＭのＤＴＰＡ、および０．０５％のＰＳ８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１中に１０ｇ／Ｌの濃度で含む医薬製剤を提供する。
一部の態様では、製剤は、凍結されている。一部の態様では、製剤は、バッグ内、例えば、クラムシェル型バッグ内に保管される。一部の態様では、バッグ、例えば、クラムシェル型バッグは、６Ｌ～１２Ｌの間の容量を有する。
一部の態様では、製剤は、バイアル内に含有される。一部の態様では、製剤は、シリンジ内に含有される。一部の態様では、シリンジは、安全シリンジである。一部の態様では、シリンジは、予め充填可能なシリンジである。一部の態様では、シリンジは、ＢＤ ＮＥＯＰＡＫ（商標）予め充填可能なシリンジである。一部の態様では、製剤は、自己注射デバイス内に含有される。
ＩＩＩ．ＣＣＲ２／５二重拮抗剤
一部の態様では、本方法は、ＦＧＦ－２１ポリペプチドとＣＣＲ２／５二重拮抗剤との組合せ療法を含む。一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、ポリペプチド、例えば抗体、例えば二重特異性抗体である。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は小分子である。一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤とは、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５受容体と強力に結合し、そのそれぞれのコグネートリガンドに応答してカルシウム流および化学走性などのＣＣＲ２およびＣＣＲ５媒介性機能等のインビトロ受容体媒介性機能の強力な二重阻害を示す小分子拮抗剤を指す。ＣＣＲ２／５二重阻害活性を有する化合物は、例えば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第８，３８３，８１２号および第７，１６３，９３７号中に報告されている。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の等効力の二重拮抗剤である。一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、式（Ｘ）：
Figure 2023538533000012
 （Ｘ）
の化合物、または薬学的に許容されるその塩である
［式中、
Ｒ１は、水素またはＣ１～６アルキルであり、
Ｒ８およびＲ９は、独立して水素およびＣ１～６アルキルから選択され、
Ｒ１０はＣ１～６アルキルであり、
Ｈｅｔは、少なくとも１つの窒素原子を有する、適宜置換された３～１４員の単環または二環式のヘテロシクリルまたはヘテロアリール環であり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ水素であるか、または一緒になってオキソ基を形成し、
Ｚは、ＮＨまたはＣＨ２である］。
米国特許第７，１６３，９３７号（本明細書中に参考として組み込まれている）は、（Ｓ）－１－（（１Ｓ，２Ｒ，４Ｒ）－４－（イソプロピル（メチル）アミノ）－２－プロピルシクロヘキシル）－３－（（６－（トリフルオロメチル）キナゾリン－４－イル）アミノ）ピロリジン－２－オン（本明細書中で以降、化合物Ａと呼ぶ）を含むＣＣＲ２／５二重拮抗剤を開示する。ＣＣＲ２／５二重拮抗化合物（Ａ）の構造は、
Figure 2023538533000013
 （Ａ）
、または薬学的に許容されるその塩である。
一部の態様では、本方法に有用なＣＣＲ２／５二重拮抗剤は化合物Ａである。一部の態様では、本方法に有用なＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物Ａの薬学的に許容される塩である。化合物Ａが、ＣＣＲ２のリガンドであるＣＣＬ２と、マウスＣＣＲ２発現細胞との結合を強力に遮断すること、ＣＣＲ５のリガンドであるマウスＣＣＬ４とマウスＣＣＲ５発現細胞との結合を強力に遮断すること、マウスＣＣＬ２およびマウスＣＣＬ４誘導性機能（例えば、カルシウム流、インテグリンＣＤ１１ｂの上方調節）を強力に阻害すること、および化合物Ｃに薬理学的に関連していることが、以前に示されている。２０１９年７月２５日に公開の米国特許公開第２０１９／０２２４２０５号の表１を参照されたい。米国特許公開第２０１９／０２２４２０５号はその全体で参考として組み込まれている。
米国特許第８，３８３，８１２号（本明細書中に参考として組み込まれている）は、Ｎ－（（１Ｒ，２Ｓ，５Ｒ）－５－（ｔｅｒｔ－ブチルアミノ）－２－（（Ｓ）－３－（７－ｔｅｒｔ－ブチルピラゾロ［１，５－ａ］［１，３，５］トリアジン－４－イルアミノ）－２－オキソピロリジン－１－イル）シクロヘキシル）アセトアミド（本明細書中で以降、化合物Ｃと呼ぶ）を含むＣＣＲ２／５二重拮抗剤を開示する。ＣＣＲ２／５二重拮抗化合物（Ｃ）の構造は、
Figure 2023538533000014
 （Ｃ）
、または薬学的に許容されるその塩である。
一部の態様では、本方法に有用なＣＣＲ２／５二重拮抗剤は化合物Ｃである。一部の態様では、本方法に有用なＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、化合物Ｃの薬学的に許容される塩である。ＢＭＳ－８１３１６０としても知られる化合物Ｃは現在、ニボルマブと組み合わせて非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置するための第ＩＩ相臨床治験中である（ＮＣＴ０４１２３３７９）。
一部の態様では、ＣＣＲ２／５二重拮抗剤は、適切な投与のために製剤化することができる。
「発明の概要」節および「要約」節ではなく、「発明を実施するための形態」節が、特許請求の範囲を解釈するのに使用されることが意図されていることを認識されたい。「発明の概要」節および「要約」節は、本発明者（ら）により想定される、１つまたは複数の、本開示の例示的態様を明示しうるが、これらのすべてを明示しうるわけではなく、したがって、いかなる形であれ、本開示および付属の特許請求の範囲を限定することは意図されない。
上記では、指定されたその機能および関係の実施を例示する、機能的構成要素を一助として、本開示について記載された。本明細書では、これらの機能的構成要素の境界は、記載の便宜のために、任意に規定されている。指定されたその機能および関係が、適切に実施される限りにおいて、代替的な境界が規定されうる。
具体的な態様についての前出の記載は、他の実施者が、当技術分野の技術の範囲内にある知見を適用することにより、本開示の概念から逸脱せず、不要な実験を伴わずに、このような具体的な態様を、多様な適用のために、たやすく改変し、および／または適合させうる、本開示の一般的性格を完全に明らかにするであろう。したがって、このような適合および改変は、本明細書で提示される教示および指針に基づき、開示された態様の均等物の意味および範囲の内にあることが意図される。本明細書における表現法または用語法は、本明細書の用語法または表現法が、教示および指針に照らして、当業者により解釈されるように、記載を目的とするものであり、限界を目的とするものではないことが理解されるものとする。
本開示の幅および範囲は、上記で記載された例示的態様のうちのいずれによっても限定されず、以下の特許請求の範囲およびこれらの均等物だけにより規定されるものとする
本出願を通して引用されうる、引用されるすべての参考文献（参考文献、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、それらの中で引用された参考文献と同様に、任意の目的で、参照によりそれらの全体において本明細書に明示的に組み込まれる。
［実施例１］
組合せ療法
新しい潜在的な薬物標的が出現する中、組合せ療法は、ＮＡＳＨおよび線維症を処置するために魅力的に見える。ケモカイン受容体ＣＣＲ２（Ｃ－Ｃケモカイン受容体２型）／ＣＣＲ５（Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型）拮抗剤は、単球浸潤を低減させ、肝臓中のマクロファージ部分組を変更することによって、線維症を改善することができる。繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、脂質およびグルコース代謝を変調することによって、ならびに肝脂肪症、炎症、および線維症を低下させることによって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を改善する潜在性を有する。したがって、本発明者らは、急性および慢性肝損傷のマウスモデルにおいて、単一薬物処置の効果を組合せ療法と比較した。
要約：生検で判明したＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪肝疾患）を有する８５人の患者からの血清試料を分析した。ＣＣＲ２／５阻害剤（４５ｍｐｋ ｂｉｄまたは１５ｍｐｋ ｂｉｄの組合せ）およびｐｅｇ化したＦＧＦ２１作動剤（０．６ｍｐｋ ｂｉｗ ＳＣ）を、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて試験した。急性損傷を四塩化炭素（ＣＣｌ４）によって誘導し、慢性脂肪性肝炎および線維症を１２週間までのコリン欠乏アミノ酸調整高脂肪食（ＣＤＡＡ－ＨＦＤ）によって誘導した。化合物投薬を６週間のＣＤＡＡ－ＨＦＤ後に開始し、効果を短期的（２週間）または長期的（６週間）の処置後に評価した。
ＮＡＦＬＤ患者では、ケモカインＣＣＬ２およびＦＧＦ２１の血清レベルは炎症性血清マーカーと相関していたが、ＣＣＬ２のみが進行性ヒト肝線維症と有意に関連していた。実験的急性肝損傷では、ＣＣＲ２／５阻害剤で処置したマウスは、有意により低い数の循環および肝臓のＬｙ６Ｃ＋単球および単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）を示した。ＦＧＦ２１処置の際、肝臓ＭｏＭＦ数は影響を受けないまま保たれたが、ＦＧＦ２１は急性損傷肝臓においてＡＬＴおよび壊死を低減させた。
慢性脂肪性肝炎（ＣＤＡＡ－ＨＦＤ）では、ＦＧＦ２１は、体重増加、トリグリセリド、脂肪症、およびＮＡＳＨ活性を低減させた一方で、ＣＣＲ２／ＣＣＲ５の拮抗は、ＭｏＭＦ、炎症性マーカー、および肝線維症を低減させた。組合せ処置は、短期的および長期的に両療法の側縁を反映しており、したがって、脂肪性肝炎および線維症のすべての側面に対する有益な効果が増幅された。ＣＣＲ２／ＣＣＲ５拮抗およびＦＧＦ２１作動の組合せは、２週間の処置後に既にＮＡＦＬＤ活性スコア、ＡＬＴレベル、および脂肪症を改善した一方で、線維症に対する有意な変化はより長い処置期間を必要とした。
ＣＣＲ２／５阻害は炎症性単球の浸潤を遮断し、ＦＧＦ２１作動は肥満症関連の代謝障害を改善した（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）。しかし、組合せ療法は進行性の脂肪性肝炎および線維症を相乗的に改善し（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ）、その結果、単一薬物処置よりも強力な治療的作用がもたらされ、したがって、ＮＡＳＨを有する患者においてこれら２つの手法を組み合わせることの治療効果が確認された。
材料および方法
患者コホート
以前に記載されているように、生検で判明したＮＡＦＬＤを有する患者を、ベルギーのヘント大学（Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）病院にて、２０１１年から２０１８年の間に採用を見込んだ［Lefere S, Van de Velde F, Devisscher L, Bekaert M, Raevens S, Verhelst X, et al. Serum vascular cell adhesion molecule-1 predicts significant liver fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. Int J Obes (Lond). 2017;41(8):1207-13］。アルコール誘導性または薬物誘発性肝疾患、ウイルスまたは自己免疫肝炎、代謝性および胆汁うっ滞性肝疾患を含む、他の病因による肝疾患の適切な排除を、特定の臨床的、生化学的、組織学的、および／またはＸ線像の基準を使用して行った。≦２０ｇの平均１日消費量によって示されるように、すべての患者はアルコール乱用の経歴が陰性であった。いずれの対象もコルチコステロイドまたはインスリンを用いた処置を受けていなかった。これらの排除基準を適用した後、本発明者らは、８５人の患者を分析用に含めた。
終夜の絶食後に血液試料を採取した。すべての試料を遠心分離し、分画し、さらなる分析まで－８０℃で保存した。実験室評価は、標準の肝臓生化学（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ））、全血球数、トリグリセリド、および総血清コレステロールを含んでいた。体重指数（ＢＭＩ）を体重／身長２（ｋｇ／ｍ２）として計算した。真性糖尿病は、米国糖尿病協会の基準に従って定義した［American Diabetes A. 2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2018. Diabetes Care. 2018;41(Suppl 1):S13-S27］。
ヒト肝臓生検をルーチン的に処理し、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄで染色した。熟練の病理学者が患者特徴を盲目にして生検を評価した。少なくとも６つの完全な門脈管を有する生検のみを、十分な組織学的評価に適切であるとみなした。組織学的特長は、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ）の採点システムに従ってスコア付けした［Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2005;41(6):1313-21］。
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）の診断は、肝細胞の≧５％が大滴性の脂質滴を含有していた場合に行った一方で、ＮＡＳＨの診断は、脂肪症、肝細胞の膨張、および小葉炎症の共同存在に基づいていた［Kleiner DE, Brunt EM. Nonalcoholic fatty liver disease: pathologic patterns and biopsy evaluation in clinical research. Semin Liver Dis. 2012;32(1):3-13、Bedossa P, Consortium FP. Utility and appropriateness of the fatty liver inhibition of progression (FLIP) algorithm and steatosis, activity, and fibrosis (SAF) score in the evaluation of biopsies of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2014;60(2):565-75］。
線維症は、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワークの線維症段階決定システムを使用して評価した［Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2005;41(6):1313-21］。
研究プロトコルはヘント大学病院倫理委員会によって認可され、ヘルシンキ宣言の理念に従って実施した。参加者はそのインフォームドコンセントを書面で提出し、これは倫理審査委員会によって認証された。
動物実験
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ野生型（ＷＴ）マウスは、アーヘン（Ａａｃｈｅｎ）大学病院の動物施設にて特定病原体除去の環境で、１２時間の明／暗サイクルで収容し、食料および水を自由に摂取させた。インビボ動物実験は、８週齢の雄のマウスを用いて、適切な施設および政府の当局によって認可された条件下で、ドイツの法的要件（自然、環境、および消費者保護の州当局（Ｓｔａｔｅ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｎａｔｕｒｅ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）、ノルトライン・ヴェストファーレン州、ＬＡＮＵＶ ＮＲＷ）に従って行った。
薬理学的処置および肝損傷の誘導。
どちらの薬理学的化合物も、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂによって提供された。ＣＣＲ２／５拮抗剤（化合物Ａ）を、０．５％のメチルセルロース（４００ｃｐｓ）および０．１％のＴｗｅｅｎ－８０を含有するｐＨ３の滅菌水中に溶かした。ＣＣＲ２／５拮抗剤は、経口胃管栄養法（ＰＯ）を介して、４５ｍｇ／ｋｇの体重（ＢＷ）のｂ．ｉ．ｄ．で単一薬物処置において、または１５ｍｇ／ｋｇのＢＷのｂ．ｉ．ｄ．で組合せ処置においてのいずれかで投与した。ＰＥＧ－ＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１ｖ、本明細書中ではＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖとも）（３０ｋＤのＰＥＧ部分を有する配列番号６のＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート）を、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび２５０ｍＭのスクロースを含有するｐＨ８．３の媒体中に懸濁させた。ＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖは、皮下（ＳＣ）注射によって、０．６ｍｇ／ｋｇのＢＷで、週に２回投与した。
トウモロコシ油中に溶かした四塩化炭素（ＣＣｌ４）（Ｍｅｒｃｋ、ドイツＤａｒｍｓｔａｄｔ）を１回、腹腔内（ＩＰ）に０．６ｍＬ／ｋｇのＢＷで注射して、急性肝損傷を誘導した。３６時間後にすべてのマウスを屠殺し、肝臓および血液試料を分析のために回収した。
慢性肝損傷には、マウスに２％のコレステロールを富化したコリン欠乏Ｌ－アミノ酸調整高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）（Ｅ１５６７３－９４０、Ｓｓｎｉｆｆ、ドイツＳｏｅｓｔ）を１２週間まで給餌した。薬理学的処置は、６週間の食餌投与後に、単一薬物または組合せ療法として開始した。マウスを２または６週間の処置後に屠殺して、最終分析を行った。
表現型の評価およびモデルのエンドポイント
確立されたプロトコルに従って慣用のヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色を行い、壊死面積割合をＩｍａｇｅＪで定量した［Mossanen JC, Krenkel O, Ergen C, Govaere O, Liepelt A, Puengel T, et al. Chemokine (C-C motif) receptor 2-positive monocytes aggravate the early phase of acetaminophen-induced acute liver injury. Hepatology. 2016;64(5):1667-82］。ＮＡＦＬＤ活性スコアは、処置群に対して盲目の調査員によって評価し、比色試験をヒドロキシプロリンについて実施した。Ｆ４／８０（Ａｂｃａｍ）についての免疫組織化学染色を、パラフィン包埋した肝臓切片に対して行った［Bartneck M, Fech V, Ehling J, Govaere O, Warzecha KT, Hittatiya K, et al. Histidine-rich glycoprotein promotes macrophage activation and inflammation in chronic liver disease. Hepatology. 2016;63(4):1310-24］。血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性を測定した（３７℃でのＵＶ試験）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｄｕｌａｒ事前分析システム、スイスＲｏｔｋｒｅｕｚ）。記載されているように、ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した多色フローサイトメトリーによって肝臓および血液の白血球を分析した［Mossanen JC, Krenkel O, Ergen C, Govaere O, Liepelt A, Puengel T, et al. Chemokine (C-C motif) receptor 2-positive monocytes aggravate the early phase of acetaminophen-induced acute liver injury. Hepatology. 2016;64(5):1667-82］。
酵素結合免疫吸着アッセイ
ヒト血清中における血清ＣＣＬ２およびＦＧＦ２１の濃度を、特定のキット（それぞれＤＣＰ００およびＤＦ２１００、Ｒ＆Ｄ、英国Ｏｘｏｎ）を使用して、製造者のプロトコルに従って決定した。Ｍ３０ ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ ＥＬＩＳＡキット（ＴＥＣＯｍｅｄｉｃａｌ、オランダＮｉｊｋｅｒｋ）を使用してヒトサイトケラチン－１８ Ｍ３０断片を測定した。
統計学
統計分析は、ＳＰＳＳ ２５．０（ＳＰＳＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、米国ニューヨーク州Ａｒｍｏｎｋ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用して行った。適切なパラメトリックまたはノンパラメトリック試験を適用した。両側性Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。連続変数は分布の正規性に応じて中央値（四分位範囲）または平均±標準偏差（ＳＤ）として提示した。
患者データの分析には、有意な相関を、ピアソンの相関係数を計算することによって決定した。変数に対する多変量の二値ロジスティック回帰分析は一変量分析における進行性線維症と有意に関連しており、続いて段階的後方変数除去を行って、進行性線維症の存在と独立して関連する要因を同定した。
マウスからのすべての実験データを平均±ＳＤとして表す。群間の相違は、両側独立スチューデントｔ検定、事後試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ、およびピアソンの直線的相関分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）によって評価した。
結果
ＣＣＬ２およびＦＧＦ２１血清レベルはヒトＮＡＦＬＤの様々な側面と相関した
ヒトにおいてＣＣＲ２／ＣＣＬ２およびＦＧＦ２１を標的化する関連性を確立するために、血清ＣＣＬ２およびＦＧＦ－２１レベルを、生検で確認されたＮＡＦＬＤを有する８５人の患者において分析した。マウスモデルおよびヒト患者において示されているように、ＣＣＬ２または単球化学誘引物質タンパク質－１（ＭＣＰ－１）は、線維症の進行中に様々な肝細胞によって発現および分泌される［Weiskirchen R, Tacke F. Liver Fibrosis: From Pathogenesis to Novel Therapies. Dig Dis. 2016;34(4):410-22、Haukeland JW, Damas JK, Konopski Z, Loberg EM, Haaland T, Goverud I, et al. Systemic inflammation in nonalcoholic fatty liver disease is characterized by elevated levels of CCL2. J Hepatol. 2006;44(6):1167-74］。ＦＧＦ２１は肝臓から合成および分泌され、複数の代謝効果を有する［Kharitonenkov A, Shiyanova TL, Koester A, Ford AM, Micanovic R, Galbreath EJ, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. J Clin Invest. 2005;115(6):1627-35］。ＦＧＦ２１の欠乏または異常はＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに関連しており、ＦＧＦ２１血清レベルの上昇はマウスおよびヒトにおいて肝臓の脂肪含有量と相関している（Tucker B, Li H, Long X, Rye KA, Ong KL. Fibroblast growth factor 21 in non-alcoholic fatty liver disease. Metabolism. 2019;101:153994中に総説］。非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ、ｎ＝３１人）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ、ｎ＝５４人）の存在は、専門病理学者によって評価し（表２）、臨床的および生化学的な患者特徴によって確認した（表３）。
表2. 診断による組織学的特長
Figure 2023538533000015
表3. 患者特徴
Figure 2023538533000016
線維症は、７３人の患者において非存在、軽度、または中等度（Ｆ０～Ｆ２）であった一方で、１２人の患者は線維症の進行性レベル（Ｆ３～Ｆ４）へと進行していた。ＣＣＬ２血清レベルは、進行性線維症を有さない患者と比較して、有する患者において有意に上昇しており（Ｐ＜０．００１）、また、ＦＩＢ－４スコアとも相関していた（図１Ａ、１Ｃ、表４）。
Figure 2023538533000017
ＣＣＬ２レベルは、ＮＡＦＬまたはＮＡＳＨを有する患者間で有意差がなかった（図１Ａ）。ＦＧＦ２１血清レベルが線維症の段階と相関がなく、また、ＣＣＬ２濃度もＦＧＦ２１血清レベルと相関がなかった図１Ｂおよび１Ｄ）。逆に、ＦＧＦ２１は脂肪性肝炎のバイオマーカー（ＣＫ－１８ Ｍ３０、γＧＴ、ＡＳＴ）と関連していた（図１Ｅ）。多変量分析では、進行性線維症（Ｆ３～Ｆ４）とＣＣＬ２レベルとの間の関連は、本発明者らのコホートにおいて進行性線維症と独立して関連していた唯二つの他の要因であったＡＳＴ／ＡＬＴ比および２型糖尿病の存在について調節した後に、有意に保たれた（Ｐ＝０．０１７）（表５）。
Figure 2023538533000018
結論として、これらのデータは、肝線維症および慢性脂肪性肝炎の病因におけるＣＣＲ２－ＣＣＬ２およびＦＧＦ２１経路の異なる役割を示し、それぞれの経路を薬理学的に標的化することの潜在的な明確に異なる恩恵を確証している。
急性肝損傷における単球の肝臓浸潤に対するＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害およびＦＧＦ２１作動の効果
ＣＣＬ２は、ＣＣＲ２を介して単球を損傷部位へと誘引し、単球のＭｏＭＦへの分化をもたらし、これは、肝臓炎症を駆動し、肝星細胞（ＨＳＣ）を活性化し、それによって線維症の進行を悪化させる［Weiskirchen R, Tacke F. Liver Fibrosis: From Pathogenesis to Novel Therapies. Dig Dis. 2016;34(4):410-22、Baeck C, Wei X, Bartneck M, Fech V, Heymann F, Gassler N, et al. Pharmacological inhibition of the chemokine C-C motif chemokine ligand 2 (monocyte chemoattractant protein 1) accelerates liver fibrosis regression by suppressing Ly-6C(+) macrophage infiltration in mice. Hepatology. 2014;59(3):1060-72］。単球浸潤の遮断に対するＣＣＲ２／５阻害剤（ＣＣＲ２／５ｉ）の有効性を調査し、ＰＥＧ－ＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１ｖ）との組合せ療法がこの機構に影響を与えないことを実証するために、マウスにおける四塩化炭素（ＣＣｌ４）の単回注射によって誘導した急性肝損傷モデルを使用した。免疫細胞集団および肝損傷をＣＣｌ４注射の３６時間後に評価した（図２Ａ）。ＣＣＲ２／５阻害は、肝臓単球およびＦ４／８０陽性肝臓単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）（図２Ｂ、２Ｃ、および２Ｇ）ならびに血液単球（図２Ｆ）の数の有意な低減に関連していた。壊死面積割合の定量（図２Ｂおよび２Ｃ）ならびに血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベル（図２Ｄ）によって評価して、単球およびＭｏＭＦの低減には肝損傷の有意な改善が伴っていた。注目すべきは、ＣＣＲ２／５阻害が他の骨髄またはリンパ系免疫細胞集団に影響を与えなかったことである（データ示さず）。これらの発見を確証して、組合せ療法は、ＣＣＲ２／５ｉ単一処置によっても見られた急性損傷肝臓内への単球浸潤の阻害を反映した。ＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖ処置は、壊死面積割合に対する影響を伴わない（図２Ｃ）、血液顆粒球レベルの低下（図２Ｆ）ならびに有意により低いＡＳＴおよびＡＬＴ血清レベル（図２Ｄ）に向かう傾向と関連していた。これらの発見は、ＣＣＲ２／５阻害が急性肝損傷における単球浸潤を遮断することを支持した。重要なことに、この効果はＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖとの組合せ処置によって影響を受けず、これは、両化合物の異なる作用機構を強調している。したがって、この異なる作用機構について、脂肪肝疾患の慢性モデルにおいて組み合わせて評価した。
二重ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害およびＦＧＦ２１作動による組合せ療法が、単一薬物処置よりも有効に脂肪性肝炎および線維症を改善した
マウスおよびヒトにおいて、慢性損傷肝臓内への単球の浸潤およびＭｏＭＦの蓄積はＣＣＲ２／５拮抗剤によって阻害することができる一方で［Puengel T, Krenkel O, Kohlhepp M, Lefebvre E, Luedde T, Trautwein C, et al. Differential impact of the dual CCR2/CCR5 inhibitor cenicriviroc on migration of monocyte and lymphocyte subsets in acute liver injury. PLoS One. 2017;12(9):e0184694、Krenkel O, Puengel T, Govaere O, Abdallah AT, Mossanen JC, Kohlhepp M, et al. Therapeutic inhibition of inflammatory monocyte recruitment reduces steatohepatitis and liver fibrosis. Hepatology. 2018;67(4):1270-83］、繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、脂質およびグルコース代謝に影響を与えることによってＮＡＳＨおよび線維症の病理学的駆動因子を改善することができる［Markan KR, Naber MC, Ameka MK, Anderegg MD, Mangelsdorf DJ, Kliewer SA, et al. Circulating FGF21 is liver derived and enhances glucose uptake during refeeding and overfeeding. Diabetes. 2014;63(12):4057-63、Coskun T, Bina HA, Schneider MA, Dunbar JD, Hu CC, Chen Y, et al. Fibroblast growth factor 21 corrects obesity in mice. Endocrinology. 2008;149(12):6018-27］。ＣＤＡＨＦＤ肝損傷モデルを使用して脂肪性肝炎および肝線維症を合計１２週間の期間にわたって誘導し、最後の６週間にわたる半分の時間から薬理学的処置を開始した（図３Ａ）。血清中のＣＣＬ２およびＣＣＬ５レベルの対抗制御的な上昇により、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の効率的な薬理学的阻害が確認された（図５Ｅ）。対照動物は連続的な体重増加を経時的に示した一方で、ＣＤＡＨＦＤを給餌したマウスはその体重をある程度維持した。ＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖを受けたマウスは、ＣＣＲ２／５阻害剤で処置したマウスと比較して中等度の体重減少を実証した。組合せ処置は、マウスが全体的に最も低い体重を示したため、相加効果を示した（図３Ｂ）。ＣＣＲ２／ＣＣＲ５の阻害は、有意に低減したレベルの肝臓マクロファージ（図３Ｃおよび３Ｉ）、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベル（図３Ｄ）、ならびに肝線維症（図３Ｃおよび３Ｅ）が伴っていた。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）構成要素の評価により、より低い肝性トリグリセリド含有量によって確認された、肝脂肪症に対するＦＧＦ２１投与の有益な効果が明らかとなった一方で、ＣＣＲ２／５処置は小葉炎症の低減と関連していた（図３Ｂ、３Ｅ、および３Ｆ）。ＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖ処置後にＡＬＴの低下が観察された一方で、肝線維症はＣＣＲ２／５阻害によって特に軽減された（図３Ｂ～３Ｄ）。
ＣＣＲ２／５拮抗剤およびＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖを用いた組合せ処置は、体重変化、肝性トリグリセリド含有量、組織学的肝損傷、および線維症に関して、両方の単一薬物処置の有益な効果を反映した。さらに、組合せ療法は、肝細胞の膨張およびＮＡＳ全体に対して相乗効果を有していた。陽性の相乗効果は、炎症（Ｔｎｆ、Ｍｃｐ１）および線維症（Ｔｇｆβ、αｓｍａ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１）に関連する遺伝子発現レベルに対しても明らかとなった（図５Ｆ）。ＣＣｌ４実験と同様、ＣＣＲ２／５阻害剤で処置した動物は、常在肝臓マクロファージ（図３Ｉ）またはリンパ球集団（図６Ａおよび６Ｂ）に影響を与えずに、血液単球の強力な阻害（図３Ｈ）ならびにＦ４／８０陽性ＭｏＭＦの蓄積（図３Ｃ、３Ｉ、および３Ｊ）を実証した。これらのデータは、ＣＣＲ２／５阻害およびＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖ処置の組合せが単一薬物処置単独よりも強力であったことを示しており、ＮＡＳＨおよび線維症を有する患者における、これらの機構の組合せ処置の臨床研究の正当化を提供している。
組合せ療法の強力な相乗効果は初期疾患段階で既に活性であった
６週間の処置モデルにおける組織学的エンドポイントに対する単一および組合せ療法の効果に基づいて、ＣＤＡＨＦＤマウスモデルにおける薬理学的療法の初期効果を調査した。長期的モデルとは対照的に、肝損傷は、２週間のみの薬理学的処置後、したがって損傷誘導の８週間後に評価した（図４Ａ）。組織学的分析では、８週間のＣＤＡＨＦＤ後に中等度レベルの線維症および脂肪性肝炎が示された（図４Ｂ）。際立つことに、疾患表現型のすべての側面は、組合せ処置において最も有効に改善されていた（図４Ｂ～４Ｅ）。血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）によって評価した肝損傷は、ＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖを受けたマウスにおいて有意に低減していた。肝損傷は、ＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖをＣＣＲ２／５拮抗剤と組み合わせた場合に最も有意に改善されていた（図４Ｃ）。同様に、肝臓トリグリセリドはＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖで中等度に（非有意）低減していたが、組合せ処置において有意に低下していた（図４Ｃ）。単一薬物処置は、この時点で線維症レベル低減に向かう傾向（非有意）を引き起こしたが（図４Ｄ）、ＣＣＲ２／５拮抗剤およびＰＥＧ－ＦＧＦ２１ｖを用いた組合せ療法の際により強力な線維症の低減を引き起こした。同様に、すべての治療レジメンがＮＡＳを有意に低減させたが、組合せ処置がＮＡＳの側面について最も有効であった（図４Ｃおよびデータ示さず）。
肝臓免疫細胞区画の組成物に対するＣＣＲ２／５拮抗剤の具体的な効果は、単一ＣＣＲ２／５ｉまたは組合せ療法において存在していた。長期的処置と同様、単球および単球由来マクロファージは、薬理学的処置の際に、常在肝臓クッパー細胞またはリンパ系免疫細胞に影響を与えずに、有意に低減した（図４Ｆ、およびデータ示さず）。総合すると、明確に異なる薬物標的化の個々の側面が組合せ処置において保たれたままである一方で、複数の薬理学的経路の標的化は、肝疾患の表現型の改善について単一薬物処置よりも強力であると見られる。
考察
ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの有病率は上昇しており、今後数十年のうちに世界の多くの地域において、肝臓関連罹患率および死亡率が劇的に上昇するであろうという予測をもたらしている［Estes C, Anstee QM, Arias-Loste MT, Bantel H, Bellentani S, Caballeria J, et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. J Hepatol. 2018;69(4):896-904］。現在、生活習慣の改変が治療推奨の中心である一方で、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療に利用可能な具体的な薬理学的処置はない［European Association for the Study of the Liver. EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the management of non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2016;64(6):1388-402］。代謝、炎症、および線維形成における複数の経路を標的化する多くの薬物が開発中であるため、いくつかの薬物が近い将来に認可されるであろうことを予想することができる［Friedman SL, Neuschwander-Tetri BA, Rinella M, Sanyal AJ. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nat Med. 2018;24(7):908-22、Rinella ME, Tacke F, Sanyal AJ, Anstee QM, participants of the AEW. Report on the AASLD/EASL joint workshop on clinical trial endpoints in NAFLD. J Hepatol. 2019;71(4):823-33］。それにもかかわらず、オベチコール酸、セニクリビロック、およびペグベルフェルミン（ｐｅｇｂｅｌｆｅｒｍｉｎ）を含む多くの化合物は、これらの薬物に曝露させた患者の部分組における調査エンドポイントのみを改善している［Younossi ZM, Ratziu V, Loomba R, Rinella M, Anstee QM, Goodman Z, et al. Obeticholic acid for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis: interim analysis from a multicentre, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet. 2019;394(10215):2184-96、Ratziu V, Sanyal A, Harrison SA, Wong VW, Francque S, Goodman Z, et al. Cenicriviroc Treatment for Adults with Nonalcoholic Steatohepatitis and Fibrosis: Final Analysis of the Phase 2b CENTAUR Study. Hepatology. 2020、Sanyal A, Charles ED, Neuschwander-Tetri BA, Loomba R, Harrison SA, Abdelmalek MF, et al. Pegbelfermin (BMS-986036), a PEGylated fibroblast growth factor 21 analogue, in patients with non-alcoholic steatohepatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2a trial. Lancet. 2019;392(10165):2705-17］。ＮＡＦＬＤにおける多くの病態生理学的機構の関与およびそれら間のクロストークは、単一の経路の標的化が不十分でありうることの理由を部分的に説明することができる。したがって、組合せ処置はこれらの問題を克服するための魅力的な可能性であるが、具体的な組合せを示唆するための証拠は現在わずかしか存在しない。
本研究は、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５ケモカイン受容体の阻害を通じて炎症性経路を標的化することと、ｐｅｇ化したＦＧＦ２１類似体を通じて脂質代謝を修復することとの組合せが、マウスにおいて肝線維症を含むＮＡＳＨのすべての組織学的特長を改善したことを実証した。この具体的なレジメンは、単一化合物の使用と比較して相乗効果を有していた。データは、両方の化合物について明確に異なる病態生理学的な作用機構を反映していた、肝臓免疫細胞の分析、肝臓脂肪含有量、血清ＣＣＬ２、およびＦＧＦ２１レベルによってさらに立証された。
ＣＣＲ２／５阻害剤セニクリビロックを、第２ｂ相ＣＥＮＴＡＵＲ治験において調査し、セニクリビロックは、１年間の処置後に線維症の回帰を達成した患者の割合を有意に上昇させた［Friedman SL, Ratziu V, Harrison SA, Abdelmalek MF, Aithal GP, Caballeria J, et al. A randomized, placebo-controlled trial of cenicriviroc for treatment of nonalcoholic steatohepatitis with fibrosis. Hepatology. 2018;67(5):1754-67］。本研究では、新規経口ＣＣＲ２／５拮抗剤を使用したＣＣＲ２／５阻害がＭｏＭＦの数を強く低減させ、肝線維症の改善をもたらした。ＣＥＮＴＡＵＲ治験の２年目の経過観察からの結果は、場合によっては根底にある代謝ストレスが緩和されていないことが原因で、セニクリビロックの抗線維性効果が長期的には耐久性がない可能性があることを示唆している［Ratziu V, Sanyal A, Harrison SA, Wong VW, Francque S, Goodman Z, et al. Cenicriviroc Treatment for Adults with Nonalcoholic Steatohepatitis and Fibrosis: Final Analysis of the Phase 2b CENTAUR Study. Hepatology. 2020］。
提示した結果により、ＣＣＲ２／５拮抗剤と代謝性の抗脂肪症薬（ＦＧＦ２１作動剤など）との組合せが、いずれかの薬物単独よりも、ヒト患者においてＮＡＳＨおよび線維症をより有効に改善することができることが示された［Lefere S, Devisscher L, Tacke F. Targeting CCR2/5 in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and fibrosis: opportunities and challenges. Expert Opin Investig Drugs. 2020:1-4］。
進行中の臨床治験により、ＦＧＦ２１作動剤で処置したＮＡＳＨ患者において、プラセボ群と比較して有意に低減された肝性トリグリセリドの含有量が実証された［Sanyal A, Charles ED, Neuschwander-Tetri BA, Loomba R, Harrison SA, Abdelmalek MF, et al. Pegbelfermin (BMS-986036), a PEGylated fibroblast growth factor 21 analogue, in patients with non-alcoholic steatohepatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2a trial. Lancet. 2019;392(10165):2705-17］。ＦＧＦ２１類似体ペグベルフェルミンの有効性および安全性は、ＮＡＳＨおよび段階３線維症を有する患者（ＦＡＬＣＯＮ１、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０３４８６８９９）ならびにＮＡＳＨ硬変を有する患者（ＦＡＬＣＯＮ２、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０３４８６９１２）における第２ｂ相臨床研究において現在評価が行われている。
結論として、本研究は、脂肪性肝炎および線維症の実験モデルにおいてＣＣＲ２／５拮抗剤およびＦＧＦ２１作動剤の治療上の有効性を確認した。炎症性および代謝経路を同時に標的化することで、単一薬物処置単独よりも高い程度でＮＡＦＬＤの様々な側面が改善され、組合せ療法が疾患進行の経過に対して相乗効果を有する可能性があることが示された。
［実施例２］
組合せ療法の臨床評価
ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを有する対象を、ＣＣＲ２／５拮抗剤（例えば化合物Ｃまたは薬学的に許容されるその塩）およびＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート（例えば配列番号２または配列番号４）を用いて、６カ月間処置する。安全性および薬力学的な評価のために、対象を研究の前、研究中の治療中に一定間隔で、および治療の最後の用量の後に評価する。有効性、例えば肝脂肪の低減を決定するために、対象の肝臓のＭＲＩを治療中および治療の完了後に撮影する。

Claims (50)

  1. 対象に、有効量の繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ－２１）ポリペプチドをＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせて投与することを含む、それを必要とする対象において線維症および／または糖尿病に関連する疾患または状態を処置または防止する方法。
  2. ＦＧＦ－２１ポリペプチドをＣＣＲ２／５二重拮抗剤と逐次的に、任意の順序で投与する、請求項１に記載の方法。
  3. ＦＧＦ－２１ポリペプチドをＣＣＲ２／５二重拮抗剤と同時発生的に投与する、請求項１に記載の方法。
  4. 疾患または状態が糖尿病である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 糖尿病が、２型糖尿病である、請求項４に記載の方法。
  6. 疾患または状態が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 疾患または状態が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 対象へのＦＧＦ－２１ポリペプチドおよびＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与が、肝硬度を減少させるか、体脂肪率を減少させるか、体重を減少させるか、肝臓対体重比を減少させるか、肝脂質含量を減少させるか、肝線維症面積を減少させるか、空腹時グルコースレベルを低下させるか、空腹時トリグリセリドレベルを低下させるか、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるか、ＡｐｏＢレベルを低下させるか、ＡｐｏＣレベルを低下させるか、ＨＤＬコレステロールを増大させるか、またはこれらの任意の組合せである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせたＦＧＦ－２１ポリペプチドの、対象への投与が、非処置対象またはＦＧＦ－２１ポリペプチドおよび／もしくはＣＣＲ２／５二重拮抗剤の投与前の対象におけるレベル、あるいは、ＦＧＦ－２１ポリペプチドまたはＣＣＲ２／５二重拮抗剤のみで処置し、両方では処置していない対象におけるレベルと比較して、
    （ｉ）肝脂肪レベルの低減、
    （ｉｉ）肝損傷レベルの低減、
    （ｉｉｉ）線維症レベルの低減、
    （ｉｖ）線維症バイオマーカーである血清Ｐｒｏ－Ｃ３（Ｎ末端ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチド）レベルの低下、
    （ｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの低下、
    （ｖｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの低下、
    （ｖｉｉ）血清アディポネクチンレベルの上昇、
    （ｖｉｉｉ）血漿ＬＤＬレベルの低下
    （ｉｘ）血漿ＨＤＬレベルの上昇、
    （ｘ）血漿トリグリセリドレベルの低下、
    （ｘｉ）肝硬度レベルの低減、
    （ｘｉｉ）これらの任意の組合せ
    を結果としてもたらす、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤と組み合わせたＦＧＦ－２１ポリペプチドの、対象への投与が、
    （ａ）肝臓単球数の低減、
    （ｂ）Ｆ４／８０陽性肝臓単球由来マクロファージ（ＭｏＭＦ）数の低減、または
    （ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方
    を結果としてもたらす、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、半減期延長部分と連結またはコンジュゲートされている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 半減期延長部分がポリペプチド部分を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 半減期延長部分が、Ｆｃ領域、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリンもしくはＣＴＰ（ｈＣＧの２８個のアミノ酸のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）およびその４つのＯ－グリカン）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 半減期延長部分が非ポリペプチド部分を含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 半減期延長部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分とコンジュゲートされている（「ＦＧＦ－２１コンジュゲート」）、請求項１４に記載の方法。
  17. ＦＧＦ－２１コンジュゲートが、
    Figure 2023538533000019
     （式Ｉ）
    を含み、ｎが任意の整数である、請求項１６に記載の方法。
  18. ＰＥＧ部分がＦＧＦ－２１ポリペプチド中の非天然アミノ酸とコンジュゲートされている、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. ＦＧＦ－２１ポリペプチド中の非天然アミノ酸がフェニルアラニン誘導体である、請求項１８に記載の方法。
  20. フェニルアラニン誘導体がパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンである、請求項１９に記載の方法。
  21. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、配列番号３、７、１１、または１５のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドがＦＧＦ－２１活性を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、欠失、挿入、および／または置換を有する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 非天然アミノ酸が、配列番号３に対応するアミノ酸残基１０９にある、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、配列番号１、５、９、または１３に明示される配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. ＦＧＦ－２１コンジュゲートが、配列番号２、６、１０、または１４の化合物に対応する、請求項１７に記載の方法。
  26. ｎが、約５００～約９００個のエチレングリコール単位、約６００～約８００個のエチレングリコール単位、約６５０～約７５０個のエチレングリコール単位、または約６７０～約６９０である、請求項１７に記載の方法。
  27. ｎが、約６７０～約６９０、例えば約６８１である、請求項２６に記載の方法。
  28. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、配列番号４、８、１２、または１６の化合物に対応する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、配列番号４または１２に明示される配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  30. ＦＧＦ－２１コンジュゲートがＬコンホメーションにある、請求項１から２９に記載の方法。
  31. ＦＧＦ－２１ポリペプチドを、アミノポリカルボン酸陽イオンキレート剤、界面活性剤、アミノ酸バッファー剤、浸透圧調節剤、またはこれらの任意の組合せを用いて製剤化する、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. アミノポリカルボン酸陽イオンキレート剤がジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項３１に記載の方法。
  33. 製剤のｐＨが、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、または約７．５である、請求項３１または３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. ＦＧＦ－２１ポリペプチドが、例えば、約２０ｍｇ／ｍｌで、
    （ｉ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約２０ｍＭの濃度のヒスチジン、
    （ｉｉ）約１００ｍＭ～約１Ｍ、例えば約６００ｍＭの濃度のスクロース、
    （ｉｉｉ）約０．０１％～約０．１％（ｗ／ｖ）、例えば約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および
    （ｉｖ）約１０μＭ～約１００μＭ、例えば約５０μＭの濃度のＤＴＰＡ
    を用いて製剤化され、
    製剤のｐＨが約６．７～約７．５、例えば約７．１であり、
    ＦＧＦ－２１ポリペプチドが式Ｉ：
    Figure 2023538533000020
     （式Ｉ）
    ［式中、ｎは、約６７０～約６９０、例えば約６８１である］を含み、ＦＧＦ－２１ポリペプチドが配列番号１または配列番号９を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤がポリペプチドである、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤が小分子である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤が、式（Ｘ）：
    Figure 2023538533000021
     （Ｘ）
    の化合物、または薬学的に許容されるその塩である
    ［式中、
    Ｒ１は、水素またはＣ１～６アルキルであり、
    Ｒ８およびＲ９は、独立して水素およびＣ１～６アルキルから選択され、
    Ｒ１０はＣ１～６アルキルであり、
    Ｈｅｔは、少なくとも１つの窒素原子を有する、適宜置換された３～１４員の単環または二環式のヘテロシクリルまたはヘテロアリール環であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ水素であるか、または一緒になってオキソ基を形成し、
    Ｚは、ＮＨまたはＣＨ２である］、
    請求項３６に記載の方法。
  38. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤が、化合物（Ａ）：
    Figure 2023538533000022
     （Ａ）
    、または薬学的に許容されるその塩である、請求項３６に記載の方法。
  39. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤が、化合物（Ｃ）：
    Figure 2023538533000023
     （Ｃ）
    、または薬学的に許容されるその塩である、請求項３６に記載の方法。
  40. （ｉ）ＦＧＦ－２１ポリペプチドおよび／またはＣＣＲ２／５二重拮抗剤と、（ｉｉ）請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法による使用説明書とを含むキットまたは製品。
  41. 対象がヒトである、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 線維症および／または糖尿病に関連する疾患または状態を処置する、請求項４１に記載の方法。
  43. ヒト対象に、有効量の（１）式ＩのＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート
    Figure 2023538533000024
     （式Ｉ）
    ［式中、ｎが約６７０～約６９０である約３０ｋＤのＰＥＧ部分が、配列番号２または配列番号１０のＦＧＦ－２１ポリペプチドのパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンとコンジュゲートされている］を、
    （２）化合物Ｃ
    Figure 2023538533000025
     （化合物Ｃ）
    と組み合わせて投与することを含む、それを必要とするヒト対象においてＮＡＳＨを処置する方法。
  44. ＰＥＧ部分が遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. ｎが約６８１である、請求項４４に記載の方法。
  46. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤が化合物（Ｃ）：
    Figure 2023538533000026
     （Ｃ）
    である、請求項３６に記載の方法。
  47. ＣＣＲ２／５二重拮抗剤が、化合物Ｃ：
    Figure 2023538533000027
     （Ｃ）
    の薬学的に許容される塩である、請求項３６に記載の方法。
  48. ヒト対象に、有効量の（１）式ＩのＰＥＧ－ＦＧＦ－２１コンジュゲート
    Figure 2023538533000028
     （式Ｉ）
    ［式中、ｎが約６７０～約６９０である約３０ｋＤのＰＥＧ部分が、配列番号２または配列番号１０のＦＧＦ－２１ポリペプチドのパラ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニンとコンジュゲートされている］を、
    （２）化合物Ｃ
    Figure 2023538533000029
     （化合物Ｃ）
    の薬学的に許容される塩と組み合わせて投与することを含む、それを必要とするヒト対象においてＮＡＳＨを処置する方法。
  49. ＰＥＧ部分が遠位メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）基を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. ｎが約６８１である、請求項４９に記載の方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240123031A1 (en) * 2020-11-25 2024-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
WO1990009800A1 (en) 1989-02-21 1990-09-07 Washington University Modified forms of reproductive hormones
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
JP2003516731A (ja) 1999-11-18 2003-05-20 カイロン コーポレイション ヒトｆｇｆ−２１遺伝子および遺伝子発現産物
AU2002322394A1 (en) 2001-07-30 2003-02-17 Eli Lilly And Company Method for treating diabetes and obesity
EP2277889B1 (en) 2001-12-21 2014-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and interferon beta
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
ATE385806T1 (de) 2003-06-12 2008-03-15 Lilly Co Eli Fusionsproteine
US7163937B2 (en) 2003-08-21 2007-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity
KR20060135648A (ko) 2003-12-10 2006-12-29 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인
US20090111742A1 (en) 2004-01-26 2009-04-30 Alexei Kharitonenkov Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
US20070265200A1 (en) 2004-03-17 2007-11-15 Eli Lilly And Company Glycol Linked Fgf-21 Compounds
DK1751184T3 (da) 2004-05-13 2009-11-23 Lilly Co Eli FGF-21 fusionsproteiner
KR100854198B1 (ko) 2004-09-02 2008-08-26 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인
US7622445B2 (en) 2004-09-02 2009-11-24 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
ES2572779T3 (es) 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF)
JP2008522617A (ja) 2004-12-14 2008-07-03 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
US20080261875A1 (en) 2005-01-21 2008-10-23 Eli Lilly And Company Method For Treating Cardiovascular Disease
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
CA2644712C (en) 2006-03-06 2016-09-13 Amunix, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
ATE554785T1 (de) 2007-03-30 2012-05-15 Ambrx Inc Modifizierte fgf-21 polypeptide und ihre verwendung
ATE502114T1 (de) 2007-06-21 2011-04-15 Univ Muenchen Tech Biologisch aktive proteine mit erhöhter in-vivo- und/oder in-vitro-stabilität
KR20100058541A (ko) 2007-08-15 2010-06-03 아뮤닉스 인코포레이티드 생물학적 활성 폴리펩티드의 특성을 변경하기 위한 조성물 및 방법
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
EA032727B1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Мутантный резистентный к протеолизу полипептид fgf21 и его применение
CN116925238A (zh) 2009-02-03 2023-10-24 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
WO2011154349A2 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Novo Nordisk A/S Fgf21 analogues and derivatives
US8383812B2 (en) 2009-10-13 2013-02-26 Bristol-Myers Squibb Company N-((1R,2S,5R)-5-(tert-butylamino)-2-((S)-3-(7-tert-butylpyrazolo[1,5-A][1,3,5]triazin-4-ylamino)-2-oxopyrrolidin-1-yl)cyclohexyl)acetamide, a dual modulator of chemokine receptor activity, crystalline forms and processes
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
US9434788B2 (en) 2012-07-11 2016-09-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Bio-based fiber gums (BFGs) and processes for producing BFGs
WO2014144878A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Scripps Research Institute Novel thiol & amino modifying reagents for protein chemistry and methods of use thereof
CA2941411A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Tobira Therapeutics, Inc. Cenicriviroc for the treatment of fibrosis
EA036697B1 (ru) 2014-10-24 2020-12-09 Бристол-Майерс Сквибб Компани Модифицированные полипептиды fgf-21 и их применение
CN110352059A (zh) * 2016-12-28 2019-10-18 超逸生物医药有限公司 非酒精性脂肪性肝炎(nash)和肝纤维化的联合疗法
EA202091751A1 (ru) 2018-01-22 2020-11-06 Бристол-Маерс Сквибб Компани Композиции и способы лечения рака
MX2022008336A (es) * 2020-01-08 2022-08-08 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de conjugados del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (fgf-21).

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