KR100854198B1 - 섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인 - Google Patents

섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인 Download PDF

Info

Publication number
KR100854198B1
KR100854198B1 KR1020077004881A KR20077004881A KR100854198B1 KR 100854198 B1 KR100854198 B1 KR 100854198B1 KR 1020077004881 A KR1020077004881 A KR 1020077004881A KR 20077004881 A KR20077004881 A KR 20077004881A KR 100854198 B1 KR100854198 B1 KR 100854198B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fgf
muteins
delete delete
mutein
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020077004881A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070050454A (ko
Inventor
크리스토퍼 칼 프라이
리후아 후앙
라드밀라 미카노빅
Original Assignee
일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일라이 릴리 앤드 캄파니 filed Critical 일라이 릴리 앤드 캄파니
Publication of KR20070050454A publication Critical patent/KR20070050454A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100854198B1 publication Critical patent/KR100854198B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

본 발명은 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 섬유아세포 성장 인자 21의 신규 뮤테인에 관한 것이다. 본원에는 단백질 및 각각의 코딩 핵산 종이 둘 다 개시되어 있다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 서열의 증식 및 상기 뮤테인의 제조를 위한 벡터 및 숙주 세포를 포함한다. 추가로, 제2형 당뇨병, 비만, 또는 대사 증후군의 치료 방법이 개시되어 있다.
섬유아세포 성장 인자 (FGF), O-글리코실화, 뮤테인.

Description

섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인 {MUTEINS OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR 21}
본 발명은 효모에서 발현되는 경우 감소된 O-연결된 글리코실화를 나타내는 섬유아세포 성장 인자 21의 신규 뮤테인의 확인에 관한 것이다.
섬유아세포 성장 인자는 발생하는 조직 및 성체 조직에서 폭넓게 발현되는 대형 폴리펩티드이며 [Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991], 혈관신생, 유사분열생식, 패턴 형성, 세포 분화, 대사 조절 및 조직 손상 복구를 비롯한 여러 생리학적 기능에서 중요한 역할을 한다 [McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998]. 공개된 문헌에 따르면, 현재 FGF 족은 적어도 23개의 구성원, 즉 FGF-1 내지 FGF-23으로 구성된다 [Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)].
섬유아세포 성장 인자-21 (FGF-21)은 주로 간에서 발현되는 것으로 보고되어 왔으며 [Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206, 2000; WO01/36640; and WO01/18172], 허혈성 혈관 질환, 상처 치유, 및 폐, 기관지 또는 폐포 세포 기능의 손상과 관련된 질환 및 수많은 다른 장애들에 대한 치료제로서 기술되어 왔다. 보다 최근에, FGF-21은 인슐린의 존재 및 부재하에 장시간의 치료 (72 시간) 후 마우스 3T3-L1 지방세포에서 글루코스-수용을 자극하며, ob/ob 및 db/db 마우스 및 8 주령의 ZDF 래트에서 식후 및 공복 혈중 글루코스, 트리글리세라이드 및 글루카곤 수준을 투여량 의존적인 방식으로 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 당뇨병 및 비만의 치료를 위한 요법으로서 FGF-21의 사용에 관한 근간을 제공한다 (WO03/011213).
재조합 DNA 기술의 발달에 의해, FGF-21의 뮤테인과 같은 외래 생성물을 코딩하는 외생성 DNA 서열이 도입된 숙주 세포에서 상기 외래 생성물을 제조할 수 있게 되었다. 이 기술의 이점은 생성물을 고도의 정제된 형태로 고수율로 제조할 수 있으며 바이러스 오염과 같은 오염의 위험이 적다는 것이다. 이러한 재조합 기술은 진핵 숙주 세포뿐만 아니라 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질의 제조를 위해 널리 사용되어 왔다.
그러나, 이러한 외생성 DNA 서열의 발현 효율의 문제, 또한 벡터 불안정성 및 재조합 생성물을 제조하는 숙주 세포에 의한 상기 생성물의 세포내 분해로 인해, 상기 기술에 의한 재조합 생성물의 대규모 제조는 여전히 제한된다. 또한, 재조합 생성물은 흔히 그의 천연 대응물과 상이하다. 예를 들어, 이종 진핵 숙주에서 제조된 재조합 생성물은 일반적으로 글리코실화 함량에 있어서 그의 자연 발생적인 대응물과 차이가 난다. 이러한 차이는 임의의 탄수화물 구조의 존재와 부재, 생성물에서 상기 탄수화물 구조의 위치, 및 탄수화물의 특성과 관련이 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 효모-유래의 재조합 생성물은 흔히 그의 천연 대응물에 비해 추가의 비천연 O-글리칸을 보유하는 것으로 밝혀졌다 [Van den Steen, et al., Crit. Reviews in Biochem. and Mole. Biol. 33(3):151-208, 1998].
본 발명은 효모에서 발현되는 경우 야생형 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 양을 나타내는 FGF-21 뮤테인을 제공함으로써 효모-유래의 재조합 단백질과 관련된 비정상적 O-글리코실화의 문제를 해결한다. 본 발명자들은 감소된 O-글리코실화를 나타내는 FGF-21 뮤테인이 산업적 발효 조건에서 제조될 수 있으며 제2형 당뇨병, 비만, 및 대사 증후군을 포함하지만 이에 한정되지 않는 장애를 앓는 대상체를 치료하는데 필요한 유용한 생물학적 활성을 유지한다는 것을 밝혀냈다.
<발명의 요약>
제1 실시양태에서, 본 발명은 Ser167이 Ser 또는 Thr을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것을 포함하며, 아미노산의 번호체계는 서열 1을 기준으로 하고, 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다.
본 발명의 제2 실시양태는, Ser167이 Ser 또는 Thr을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것과 함께 아르기닌 19, 티로신 20, 류신 21, 티로신 22, 트레오닌 23, 아스파르테이트 24, 아스파르테이트 25, 알라닌 26, 글루타민 27, 글루타민 28, 알라닌 31, 류신 33, 이소류신 35, 류신 37, 발린 41, 글리신 42, 글리신 43, 글루타메이트 50, 글루타민 54, 류신 58, 발린 62, 류신 66, 글리신 67, 리신 69, 아르기닌 72, 페닐알라닌 73, 글루타민 76, 아르기닌 77, 아스파르테이트 79, 글리 신 80, 알라닌 81, 류신 82, 글리신 84, 세린 85, 프롤린 90, 알라닌 92, 세린 94, 페닐알라닌 95, 류신 100, 아스파르테이트 102, 티로신 104, 티로신 107, 세린 109, 글루타메이트 110, 프롤린 115, 히스티딘 117, 류신 118, 프롤린 119, 아스파라긴 121, 리신 122, 세린 123, 프롤린 124, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 아스파르테이트 127, 알라닌 129, 프롤린 130, 글리신 132, 알라닌 134, 아르기닌 135, 류신 137, 프롤린 138 또는 류신 139 중 둘 이상이 시스테인으로 치환된 것을 포함하며, 아미노산의 번호체계는 서열 1을 기준으로 하고, 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다.
본 발명의 제3 실시양태는, Ser167이 Ser 또는 Thr을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것과 함께 글리신 42, 글루타민 54, 아르기닌 77, 알라닌 81, 류신 86, 페닐알라닌 88, 리신 122, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 프롤린 130, 아르기닌 131,류신 139, 알라닌145, 류신 146, 이소류신 152, 알라닌 154, 글루타민 156, 글리신 161, 세린 163, 글리신 170 또는 세린 172 위치의 하나 이상의 아미노산이 하전된 아미노산 및/또는 극성이되 비하전된 아미노산으로 치환된 것을 포함하며, 아미노산의 번호체계는 서열 1을 기준으로 하고, 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다.
다른 실시양태는 제1, 제2 및 제3 실시양태의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 운반하는 숙주 세 포에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 폴리펩티드의 제조 방법, 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있는 세포의 제조 방법 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태는 비만, 제2형 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내증, 고혈당증, 또는 대사 증후군 중 하나 이상의 증상의 치료를 요하는 환자에게 치료 유효량의 제1, 제2 또는 제3 실시양태의 인간 FGF-21 뮤테인을 투여하는 것을 포함하는, 상기 하나 이상의 증상을 나타내는 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
본원에 개시 및 청구된 바와 같은 본 발명에서, 이하의 용어들은 하기 정의된 바와 같다.
인간 FGF-21은 27 아미노산 리더 서열을 함유하는 208 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 FGF-21은 마우스 FGF-21과 약 79％의 아미노산 동일성을 가지며 래트 FGF-21과 약 80％의 아미노산 동일성을 갖는다. 인간 FGF-21은 본 발명의 뮤테인에 대한 바람직한 폴리펩티드 주형이지만, 당업자라면 다른 포유동물 FGF-21 폴리펩티드 서열을 기초로 뮤테인을 용이하게 제조할 수 있는 것으로 인식된다.
본 발명의 뮤테인의 아미노산 위치는 하기 나타낸 바와 같이(서열 1) 성숙한 인간 181 아미노산 FGF-21 폴리펩티드로부터 결정된다:
Figure 112007017273281-pct00001
성숙한 인간 181 아미노산 FGF-21 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 DNA 서열은 아래와 같다 (서열 2):
Figure 112007017273281-pct00002
아미노산은 3-문자 코드를 사용하여 식별하거나 또는 별법으로는 표준 1-문자 코드를 사용하여 나타낸다. 돌연변이는 본래의 아미노산에 대한 3-문자 코드에 이어서 아미노산 번호를 표시하고, 그 뒤에 대체 아미노산에 대한 3-문자 코드를 표시한다. 각 뮤테인에 대한 수치적 표시는 성숙 야생형 인간 FGF-21의 181 아미노산 서열을 기초로 한다. 예를 들어, 위치 167의 세린 (즉, Ser167)을 비-극성/소수성 아미노산인 알라닌 (Ala)으로 치환한 것은 Ser167Ala 또는 S167A로 나타낸다. 유사한 방식으로, 위치 118의 류신 및 위치 134의 알라닌 (Leu118, Ala134)을 황 함유 아미노산인 시스테인 (Cys)으로 이중 치환한 것은 Leu118Cys/Ala134Cys 또는 L118C/A134C로 나타낸다.
본원에서 "아미노산"이라는 용어는 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 아미노산 유사체 및 유도체를 비롯하여 비-자연 발생적인 아미노산뿐만 아니라 자연 발생적인 아미노산도 포함한다. 아미노산 유사체 및 유도체는 아미노산 부분을 함유하는 분자를 포함한다. 당업자라면 이러한 넓은 정의를 고려해서 본원에서 아미노산이라고 언급하는 것은, 예를 들어 자연 발생적인 단백질성 L-아미노산; D-아미노산; 화학적으로 변형된 아미노산, 예를 들면 아미노산 유사체 및 유도체; 자연 발생적인 비-단백질성 아미노산, 예를 들면 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등; 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함하는 것임을 알 것이다.
인간 FGF-21 뮤테인은 야생형 성숙 단백질의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인간 FGF-21을 포함하는 것으로 정의된다. FGF-21 뮤테인의 예는 본원에 참고로 포함되는 미국 가특허 출원 제60/528,582호에 기재되어 있다. 일반적으로 말하면, 뮤테인은 야생형 단백질의 변경된 몇몇 구조적 또는 기능적 특성을 보유한다. 예를 들어, 뮤테인은 농축된 용액에서 증가 또는 개선된 물리적 안정성 (예, 소수성 매개 응집이 적음)을 가지면서 바람직한 생활성 프로필을 유지할 수 있다. 뮤테인은 약제 보존제 (예, m-크레졸, 페놀, 벤질 알콜)와 증가된 혼화성을 보유할 수 있으며, 따라서 저장 동안 단백질의 물리화학적 특성 및 생물학적 활성을 유지하는 보존된 제약 제제를 제조할 수 있다. 뮤테인은 효모에서 발현되는 경우 감소된 O-글리코실화를 나타낼 수 있다. 이러한 O-글리코실화는 단백질 상에 신규 면역학적 결정자를 도입할 수 있으며, 따라서 인간에게 투여되는 경우 항원성일 수 있고/있거나; 단백질의 약물동태학 특성을 변화시킬 수 있고/있거나; 단백질의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 야생형 FGF-21과 비교하는 경우 감소된 O-글리코실화를 나타내는, 효모에 의해 제조된 뮤테인은 면역원성이 적으며, 바람직한 약물동태학 프로필을 가지며, 생물학적 효능을 유지한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어들은 한정적인 것이 아니며, 주어진 뮤테인은 물론 야생형 단백질의 하나 이상의 변경된 특성을 가질 수 있다.
"치료 유효량"은 환자에게 치료 이점을 부여하는데 필요한 활성 물질의 최소량이다. 예를 들어, 제2형 당뇨병, 비만, 또는 대사 증후군으로 고통받거나 이들 질환으로 고통받기 쉬운 환자에 대한 또는 상기 질환을 예방하기 위한 "치료 유효량"은 병리학적 증상, 질환 진행, 상기 언급한 장애와 관련된 생리학적 증상 또는 이러한 장애를 앓는 것에 대한 저항성에서의 개선을 유도, 향상 또는 유발하는 양을 말한다. 본 발명에 있어서, "대상체" 또는 "환자"는 바람직하게는 인간이다.
제2형 당뇨병은 인슐린의 이용가능성에도 불구하고 과도한 글루코스 생성을 특징으로 하며, 글루코스가 적절히 제거되지 않음으로 인해 순환성 글루코스는 과도하게 높은 수준으로 남는다.
글루코스 불내증은 글루코스에 대한 비정상적인 감응성으로 정의될 수 있다.
고혈당증은 혈액 중에 당 (글루코스)의 양이 과량인 것으로 정의된다.
혈액 중 당이 적은 증상이라고도 부르는 저혈당증은 대상체의 혈중 글루코스 수준이 너무 낮게 하락하여 대상체의 신체 활성을 위한 에너지를 충분히 공급하지 못하는 경우에 발생한다.
고인슐린혈증은 혈액 중 인슐린의 수준이 정상보다 높은 것으로 정의된다.
인슐린 내성은 정상적인 양의 인슐린이 정상 미만의 생물학적 반응을 나타내는 증상으로 정의된다.
인간 대상체의 측면에서 비만은 주어진 집단 이상적인 체중보다 20 퍼센트를 넘는 체중으로 정의될 수 있다 [R.H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p.904-916].
대사 증후군은 하기 징후들 중 세 가지 이상의 묶음으로 정의될 수 있다: 복부 지방 - 대부분의 남성에서, 허리 둘레가 40-인치 이상; 높은 혈당 - 공복 후 데시리터 당 밀리그램(mg/dl)으로 110 이상; 높은 트리글리세라이드 - 혈류 중 150 mg/dL 이상; 낮은 HDL - 40 mg/dl 미만; 및 130/85 이상의 혈압.
본 발명은 천연 FGF-21에 비해 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 변화된 글리코실화 뮤테인을 제공한다. 이러한 실시양태 중 하나는 적은 수의 O-연결된 글리코실화 부위를 포함하는 FGF-21 뮤테인을 포함한다. O-연결된 글리코실화 부위를 식별하는 컨센서스 아미노산 서열은 없기 때문에, 이를 식별하는 것이란 어려운 일이다. 통상적으로, O-연결된 글리코실화는 세린 또는 트레오닌 잔기의 측쇄 상에서 일어난다. O-연결된 글리코실화 부위가 식별되면, 이 서열을 제거하는 아미노산 치환에 의해, 존재하는 O-연결된 탄수화물 쇄를 제거할 수 있다. 본 발명에서 확인된 O-연결된 글리코실화 부위로는 Ser163, Ser164, Ser167, Ser172 및 Ser176을 들 수 있다. O-글리코실화에 대한 주요 부위는 Ser167이다. 본 발명자들은 Ser167 부위를 제거하면 효모에 의해 발현된 뮤테인의 O-글리코실화가 상당히 감소한다는 사실을 밝혀냈다. Ser167은 O-글리코실화를 제거하는 돌연변이의 바람직한 부위이지만, 인간 FGF-21에서 O-글리코실화의 다른 부위 (Ser163, Ser164, Ser172 및 Ser176)에 대한 돌연변이도 본 발명의 범위 내이다.
따라서, 제1의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 Ser167이 Ser 또는 Thr을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것을 포함하며, 아미노산의 번호체계는 서열 1을 기준으로 하고, 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다. 제1 실시양태의 바람직한 뮤테인은 Ser167Ala, Ser167Glu, Ser167Asp, Ser167Asn, Ser167Gln, Ser167Gly, Ser167Val, Ser167His, Ser167Lys 및 Ser167Tyr이다.
본 발명의 제2 실시양태는, Ser167이 Ser 또는 Thr을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것과 함께 아르기닌 19, 티로신 20, 류신 21, 티로신 22, 트레오닌 23, 아스파르테이트 24, 아스파르테이트 25, 알라닌 26, 글루타민 27, 글루타민 28, 알라닌 31, 류신 33, 이소류신 35, 류신 37, 발린 41, 글리신 42, 글리신 43, 글루타메이트 50, 글루타민 54, 류신 58, 발린 62, 류신 66, 글리신 67, 리신 69, 아르기닌 72, 페닐알라닌 73, 글루타민 76, 아르기닌 77, 아스파르테이트 79, 글리신 80, 알라닌 81, 류신 82, 글리신 84, 세린 85, 프롤린 90, 알라닌 92, 세린 94, 페닐알라닌 95, 류신 100, 아스파르테이트 102, 티로신 104, 티로신 107, 세린 109, 글루타메이트 110, 프롤린 115, 히스티딘 117, 류신 118, 프롤린 119, 아스파라긴 121, 리신 122, 세린 123, 프롤린 124, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 아스파르테이트 127, 알라닌 129, 프롤린 130, 글리신 132, 알라닌 134, 아르기닌 135, 류신 137, 프롤린 138 또는 류신 139 중 둘 이상이 시스테인으로 치환된 것을 포함하며, 아미노산의 번호체계는 서열 1을 기준으로 하고, 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다. 바람직하게는, "둘 이상"이라는 구절은 상기 나타낸 위치들에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 개의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것을 의미한다. 더 바람직하게는, 이 구절은 상기 나타낸 위치들에서 2 또는 4 개의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것을 의미한다.
또한, 당업자라면 천연 시스테인인 시스테인 75 및 시스테인 93이 개선된 특성을 부여할 수 있는 신규 디술피드 결합을 도입하기 위한 로커스로서 이용될 수도 있음을 알 것이다. 구체적으로, 세린 85 또는 페닐알라닌 73을 시스테인으로 치환하는 것과 함께 부수적으로 각각 시스테인 93 또는 시스테인 75를 임의의 다른 아미노산으로 대체하는 변화를 도입하는 것이 고려된다.
Cys75-Cys93에서의 자연 발생적인 변화 이외에도 조작된 디술피드 결합을 갖는 FGF-21의 뮤테인은 미국 가특허 출원 제60/528,582호에 기재되어 있다. 제2 실시양태의 가장 바람직한 뮤테인은 Leu118Cys-Ala134Cys-Ser167Ala; Leu21Cys-Leu33Cys-Ser167Ala; Ala26Cys-Lys122Cys-Ser167Ala; 또는 Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys-Ser167Ala이다.
본 발명의 제3 실시양태는, Ser167이 Ser 또는 Thr을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것과 함께 글리신 42, 글루타민 54, 아르기닌 77, 알라닌 81, 류신 86, 페닐알라닌 88, 리신 122, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 프롤린 130, 아르기닌 131,류신 139, 알라닌145, 류신 146, 이소류신 152, 알라닌 154, 글루타민 156, 글리신 161, 세린 163, 글리신 170 또는 세린 172 위치의 하나 이상의 아미노산이 하전된 아미노산 및/또는 극성이되 비하전된 아미노산으로 치환된 것을 포함하며, 아미노산의 번호체계는 서열 1을 기준으로 하고, 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다.
하전된 아미노산은 양으로- 또는 음으로-하전된 아미노산으로 정의된다. 양으로 하전된 아미노산은 히스티딘, 리신, 아르기닌, 및 이들의 비-자연 발생적인 유사체 (예, 감마 아미노부티르산, 오르니틴 등)를 포함하는 것으로 정의된다. 음으로 하전된 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 이들의 비-자연 발생적인 유사체 (예, 아미노아디프산)를 포함하는 것으로 정의된다. 극성이되 비하전된 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 및 이들의 비-자연 발생적인 유사체를 포함하는 것으로 정의된다. 제3 실시양태의 바람직한 뮤테인은 Gln54Glu-Ser167Ala, Leu139Glu-Ser167Ala, Ala145Glu-Ser167Ala, Leu146Glu-Ser167Ala, Ile152Glu-Ser167Ala, Gln156Glu-Ser167Ala, Ser163Glu-Ser167Ala, 및 Ile152Glu-Ser163Glu-Ser167Ala이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명의 제1 실시양태, 본 발명의 제2 실시양태 및 본 발명의 제3 실시양태의 조합을 포함하며 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드를 제공한다.
본 발명의 실시양태는 효모에서 발현되는 경우 야생형 인간 FGF-21에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 갖는 FGF-21의 뮤테인에 관한 것이지만, 야생형 FGF-21에 비해 뮤테인의 생물학적 효능을 유지하는 것은 마찬가지로 중요한 고려 인자이다. 따라서, 본 발명의 뮤테인의 생물학적 효능은 시험관내 3T3-L1 세포 검정에서 측정된 글루코스 수용 (실시예 2) 및/또는 ob/ob 마우스 검정에서 생체내 측정된 혈장 트리글리세라이드 및 혈장 글루코스 수준의 저하 (실시예 3)에 영향을 주는 뮤테인의 능력으로 정의된다.
본 발명에 따라 투여된 FGF-21의 뮤테인은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성되고/되거나 단리될 수 있다. 뮤테인의 제조를 위한 가장 바람직한 방법은 재조합 DNA 방법에 의한 것이며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)]에 기술되어 있다.
추가로, 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 뮤테인으로부터 유도된 생물학적으로 활성인 펩티드를 포함하며, 이 펩티드는 기재된 치환들 중 하나 이상을 함유할 것이고, 돌연변이되지 않은 상응하는 펩티드에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 나타낼 것이며, 생물학적 활성을 보유할 것이다. 이러한 생물학적 활성은 시험관내 3T3-L1 세포 검정에서 측정된 글루코스 수용 (실시예 2) 및/또는 ob/ob 마우스 검정에서 생체내 측정된 혈장 트리글리세라이드 및 혈장 글루코스 수준의 저하 (실시예 3)에 영향을 주는 펩티드의 능력으로 정의된다. 상기 펩티드는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 수단의 예로는 효소적 절단, 화학적 합성 또는 재조합 DNA 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
임의의 섬유아세포 성장 인자의 펩티드 단편이 생물학적으로 활성이라는 것은 당업계에 확립된 사실이다. 예를 들어, 문헌 [Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988), and J. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987)]을 참조한다. 예를 들어, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)가 뉴로펩티드, 내분비 펩티드 및 사이토카인의 실활화에 관여하는 세린 유형 프로테아제라는 것은 공지되어 있다 [Damme et al. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)]. FGF-21의 N-말단 (HisProIlePro)은 잠재적으로 DPP-IV에 대한 기질일 수 있는 2개의 디펩티드를 함유하며, 이로써 N-말단에서 4개 이하의 아미노산이 말단절단된 FGF-21의 단편이 생성된다. 예상치 못하게도, 야생형 FGF-21의 이러한 단편, 즉 본 발명의 임의의 실시양태의 아미노산 치환과 함께 4개 이하의 아미노산이 N-말단에서 말단절단된 본 발명의 뮤테인은 생물학적 활성 (표 1)을 보유하는 것으로 입증되었다. 또한, 본 발명자들은 N-말단으로부터 5개 이상의 아미노산이 말단절단되는 것은 생물학적 활성에 부정적인 영향을 준다는 것을 밝혀냈다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 뮤테인을 코딩하며 RNA 또는 DNA 형태일 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 유전자 코드의 다의성(redundancy) 또는 축퇴성(degeneracy)의 결과로 본 발명의 뮤테인을 코딩하는 코딩 서열은 다양할 수 있다.
본 발명의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이하의 것들을 포함할 수 있다: 뮤테인에 대한 코딩 서열 단독, 뮤테인에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예를 들면 기능성 폴리펩티드, 또는 리더 또는 분비 서열 또는 프로-단백질 서열; 뮤테인에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예를 들면 뮤테인에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 비-코딩 서열 또는 인트론. 따라서, "뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 뮤테인에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
추가로, 본 발명은 지시된 치환을 함유하는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 인간 FGF-21 서열의 자연 발생적인 대립유전자 변이체, 비-자연 발생적인 변이체, 또는 말단절단된 변이체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 기재된 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 돌연변이되지 않은 상응하는 단편, 유도체 또는 유사체에 비해 O-글리코실화에 대해 감소된 능력을 나타내는 개시된 뮤테인의 단편, 유도체 또는 유사체를 코딩한다. 위 나타낸 제1, 제2 또는 제3 실시양태의 아미노산 치환들 중 하나 이상이 존재한다면, 상기 뉴클레오티드 변이체로는 결실 변이체, 치환 변이체, 말단절단된 변이체, 및 부가 또는 삽입 변이체를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 다음 숙주 세포에서 발현될 것이다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로 숙주 생물체에서 에피좀 또는 숙주 염색체 DNA의 전체 부분으로서 복제될 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하기 위해 선별 마커, 예를 들면 테트라사이클린, 네오마이신, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 진균 또는 효모 세포이다.
본 발명의 뮤테인을 발현시키기 위해 사용된 효모 세포로는 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(사카로마이세스), 및 피치아 안구스트(Pichia angust)를 들 수 있다. 효모 숙주 세포는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당(glycolytic) 효소를 비롯하여 프로모터와 같은 발현 조절 서열, 및 복제 기점 및 종결 서열 등 (필요에 따라)을 갖는 적합한 벡터를 함유한다. 본 발명의 바람직한 효모 숙주는 발현 벡터가 숙주 염색체 DNA로 통합된 피치아 패스토리스이다. 진균 숙주의 예로는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 트리코데마 리세이(Trichoderma reesei), 및 쉬조필룸 코뮨(Schizophyllum commune)이 있지만, 선택에 따라 다른 것들이 사용될 수도 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드 서열 (예, FGF-21의 뮤테인 및 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터는 잘 알려진 방법에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있는데, 그러한 방법은 숙주 세포의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 원핵 세포에 대하여 통상적으로 이용되지만, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 숙주 세포에 대하여 사용될 수 있다.
다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있으며, 이들 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)]에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은, 예를 들어 FGF-21의 뮤테인에 대해 사용된 제조 방법의 특성에 따라 달라질 것이다.
FGF-21 뮤테인-함유 조성물은 환자의 임상 증상, FGF-21 뮤테인 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 당업자에게 공지된 다른 인자들을 고려하여 양호한 의학적 실시와 일치하는 방식으로 제제화 및 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서 FGF-21 뮤테인의 "치료 유효량"은 그러한 고려사항에 의해 결정된다.
본 발명의 FGF-21 뮤테인의 제약 조성물은 제2형 당뇨병, 비만, 또는 대사 증후군을 치료하는 일반적으로 의도된 목적을 달성하는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 비경구이며, 본원에서 비경구 투여란 정맥내, 근육내, 복강내, 간내(intrastemal), 피하, 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭하는 것으로 정의된다. 투여되는 양은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재한다면 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 특성에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 범위 내에 드는 조성물은 FGF-21 뮤테인이 제2형 당뇨병, 비만, 또는 대사 증후군의 치료를 위한 목적하는 의료 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물이다. 개별적인 요구는 환자에 따라 달라질 수 있지만, 모든 성분들에 대한 최적 유효 범위의 결정은 통상의 기술을 갖는 임상의의 능력 범위내이다.
본 발명의 FGF-21의 뮤테인은 제약상 유용한 조성물의 제조를 위한 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 목적하는 제제는 임의의 제약상 허용되는 담체, 보존제, 부형제 또는 안정화제를 갖는 고순도의 수용액 또는 적절한 희석제로 재구성되는 안정한 동결건조 생성물인 것이다 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]. 본 발명의 뮤테인은 제약상 허용되는 완충액과 함께 합해질 수 있으며, pH는 허용되는 안정성 및 투여를 위해 허용되는 pH를 제공하도록 조절된다. 게다가, 본 발명의 뮤테인은 바이알, 카트리지, 펜(pen) 전달 장치, 주사기, 정맥내 투여 튜빙(tubing) 및 정맥내 투여 백으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용기에 넣을 수 있으며, 여기서 용기는 단위 투여 용기이다.
비경구 투여에서, FGF-21 뮤테인은 일반적으로 그의 하나 이상을 제약상 허용되는 담체, 즉 사용되는 투여량 및 농도에서 부형제에 대해 비독성이며 제제의 다른 성분과 혼화성인 것과 함께 단위 투여량 주사가능한 형태 (용액, 현탁액, 또는 에멀젼)로 혼합함으로써 제제화한다. 바람직하게는, 한가지 이상의 제약상 허용되는 항미생물제를 첨가할 수 있다. 페놀, m-크레졸, 및 벤질 알콜은 바람직한 제약상 허용되는 항미생물제이다.
임의로, 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 첨가하여 이온 농도 또는 등장성을 조절할 수 있다. 한가지 이상의 부형제를 첨가하여 제제의 등장성을 추가로 조절할 수 있다. 글리세린, 염화나트륨 및 만니톨은 등장성 조절용 부형제의 예이다.
당업자라면 양호한 의학적 실시 및 개별 환자의 임상 증상에 의해 결정되는 바와 같이 FGF-21 뮤테인을 포함하는 치료용 조성물에 대한 제약상 효과적인 투여량 및 투여 요법을 용이하게 최적화할 수 있을 것이다. 투여되는 FGF-21 뮤테인의 적절한 투여는 혈중 글루코스 수준을 저하시키고, 글루코스를 더 빠르고 더 효율적으로 이용해서 에너지 소비를 증가시키며, 따라서 제2형 당뇨병, 비만 및 대사 증후군을 치료하는데 유용할 것이다.
또한, FGF-21은 인슐린을 투여받은 래트에 비해 여윈 ZDF 래트에서 저혈당증을 유도하지 않았다 (WO03/011213). 이 데이터는 FGF-21이 혈장 글루코스 수준에 대해 인슐린 독립적인 방식으로 영향을 준다는 사실을 암시하며, 이는 본 발명의 FGF-21 뮤테인이 제1형 당뇨병의 치료에서 유용할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기재된 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드는 약물로서 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 유효량의 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성인 펩티드는 제2형 당뇨병, 비만, 또는 대사 증후군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 사용된다.
이하에서는 본 발명을 보다 상세히 기술하는데, 본 발명은 단지 예시를 목적으로 본원에 포함될 뿐이며 본 발명을 한정하기 위한 것은 아닌 하기 실시예를 참고로 보다 명확히 이해될 것이다.
본원에 언급된 모든 특허문헌 및 간행물은 명시적으로 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1
효모에서 FGF -21 뮤테인의 발현 및 정제
FGF-21 뮤테인을 효모, 예를 들면 피치아 패스토리스, 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica) 또는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시켰다. 피치아 패스토리스에서 제조하는 경우, 시판되는 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA)은 강력한 AOX1 (알콜 옥시다제) 프로모터를 갖는 벡터를 사용해서 재조합 단백질의 고 수준의 발현을 유도하였다. 별법으로, GAP 유전자 (글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제)로부터의 프로모터를 사용하는 벡터는 고 수준의 구성적인 발현을 위해 이용할 수 있었다. 여러 카피수의 피치아 발현 벡터에 의해 게놈으로 통합된 여러 카피수의 대상 유전자를 갖는 균주를 얻을 수 있었다. 재조합 피치아에서 대상 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 단백질 발현 수준을 증가시킬 수 있었다. 또 다른 효모 발현 시스템은 사카로마이세스 세레비지애이다. 발현 벡터는 GAL1 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서 서열을 함유하였다. GAL1 프로모터는 갈락토스를 사용한 유도시 그의 강한 전사 활성으로 인해 가장 널리 사용되는 효모 프로모터의 하나이다.
분석 특성화 (질량 스펙트럼 분석)는 피치아 패스토리스에서 발현된 FGF-21이 말단절단 (야생형 N-말단에서 아미노산 4개가 제거)된 것임을 나타내었다. 마우스 3T3-L1 지방세포 검정에서 검정되는 경우 (실시예 2 참조), FGF-21의 상기 말단절단된 변이체는 야생형 FGF-21과 동일한 수준으로 글루코스 수용을 자극하였다 (표 1).
실시예 2
마우스 3 T3 - L1 지방세포에서의 글루코스 수용
3T3-L1 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, Rockville, MD)으로부터 입수하였다. 둘베코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) 중 10％의 철-강화 소 태아 혈청을 함유하는 성장 배지 (GM)에서 세포를 배양하였다. 표준 지방세포 분화의 경우, 세포가 전면배양에 도달한 지 2일 후 (제0일 이라 함), 10％ 소 태아 혈청, 10 ㎍/ml의 인슐린, 1 μM 덱사메타손 및 0.5 μM 이소부틸메틸크산틴을 함유하는 분화 배지 (DM)에 세포를 48 시간 동안 노출시켰다. 이어서, 10％ 소 태아 혈청 및 10 ㎍/ml의 인슐린을 함유하는 분화 후 배지에서 세포를 유지하였다.
글루코스 운반 검정 - 0.1 mM 2-데옥시-D-[14C]글루코스의 축적에 의해 검정 되는 헥소스 수용을 다음과 같이 측정하였다: 12-웰 플레이트에서 3T3-L1 지방세포를 37 ℃로 가온되며 0.2％ BSA를 함유하는 KRP 완충액 (136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 10 mM NaPO4, 0.9 mM CaCl2, 0.9 mM MgSO4, pH 7.4)으로 2회 세척하고, 0.2％ BSA를 함유하는 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지 중에서 실(room) 공기 하에 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 0.2％ BSA 완충액을 함유하는 KRP로 다시 2회 세척하고, 실 공기 하에 37 ℃에서 30 분 동안 보르트마닌(wortmannin)의 부재 (Me2SO 단독) 또는 존재하에 KRP, 0.2％ BSA 완충액에서 인큐베이션하였다. 이어서, 인슐린을 15 분 동안 100 nM의 최종 농도로 첨가하고, 2-데옥시-D-[14C]글루코스의 수용을 마지막 4 분 동안 측정하였다. 10 μM 사이토칼라신 B의 존재하에 측정된 비특이적 수용을 모든 값으로부터 감산하였다. 피어스(Pierce) 비신코닌산 검정을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 각 실험을 통상적으로 3회 또는 4회 반복하여 수용을 측정하였다.
시험관내 효능을 야생형 FGF-21의 시험관내 활성으로 표준화하였는데, 이는 1.0의 표시로 제공되며 양성 대조군으로 사용되었다. 표 1에서는 본 발명의 FGF-21의 뮤테인의 시험관내 효능을 야생형 FGF-21과 비교하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 뮤테인은 야생형 FGF-21에 비해 다양한 정도로 생물학적 효능을 유지하였다.
FGF-21 뮤테인 발현 시스템 시험관내 효능*
야생형 이. 콜라이 1.0
△HPIP 말단절단된 야생형** 효모 0.9
△HPIP L118C, A134C 효모 0.2
△HPIP L118C, A134C, S167A 효모 0.2
* 효능은 이. 콜라이에 의해 제조된 야생형 FGF-21의 활성을 기초로 한 상대적인 값임 ** N-말단에서 아미노산 4개가 말단절단됨
실시예 3
Ob / ob 마우스 모델
수컷 ob/ob 마우스를 사용하는 비만 모델의 연구를 수행하여, FGF-21을 사용한 치료 후 혈장 글루코스 수준 및 트리글리세라이드 수준을 비히클 및 인슐린 대조군과 비교하여 모니터링하였다. 수컷 ob/ob 마우스 (7주령)의 시험군에 비히클 단독 (0.9％ NaCl) 또는 FGF-21 뮤테인 (0.125 mg/kg)을 7일 동안 (0.1 mL, 1일 1회) 피하로 주사하였다. 제7일에 마지막 화합물 주사 후 1시간의 시점에서 꼬리 클립 채혈에 의해 혈액을 수집하고, 표준 프로토콜을 사용하여 혈장 글루코스 수준을 측정하였다. 비히클 대조군에 비해 혈장 글루코스 수준을 저하시키는 FGF-21 뮤테인의 능력을 하기 표 2에 나타내었다. 표 2의 데이터는 본 발명의 뮤테인이 비히클 대조군에 비해 혈장 글루코스 수준을 저하시켰음을 나타낸다. 비히클 대조군에 비해 트리글리세라이드 수준을 저하시키는 FGF-21 뮤테인의 능력을 하기 표 3에 나타내었다.
FGF-21 뮤테인 혈장 글루코스 수준(대조군에 대한 ％)
야생형 62％
L118C-A134C 70％
L118C-A134C-S167A 62％
FGF-21 뮤테인 트리글리세라이드 수준(mg/dL)
비히클 대조군 210
야생형 116***
L118C-A134C 137**
L118C-A134C-S167A 153*
P 값 대 비히클 대조군: *p≤0.05; **p≤0.02; ***p≤0.001
실시예 4
FGF -21 뮤테인의 제약학적 안정성
모의 생리학적 및 제약 제제 조건하에 본 발명의 FGF-21 뮤테인의 안정성을 분석하였다. 생리학적 조건을 모방하기 위해, 10 mg/ml (pH 7.4)의 표적 단백질 농도 하에 실온 (RT)에서 PBS 중의 안정성에 대하여 뮤테인을 분석하였다. 제조 후 단백질의 회수율이 크기-배제 및/또는 역상 크로마토그래피에 의해 결정된 바로는 RT에서 90％를 초과하는 경우, PBS 중 뮤테인의 용해도/물리적 안정성은 만족스러운 것으로 고려되었다. 하기 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 뮤테인은 이러한 기준을 충족시켰다.
본 발명의 뮤테인의 제약 제제는 보존된 다수회 사용 제제일 수 있는 것으로 예상되었으며, 따라서 통상의 보존제와의 혼화성을 분석하였다. 제제 혼화성에 대하여 시험하기 위해, 보존제인 m-크레졸 (중성 pH 조건하에 보존제 효과에 대한 유럽 약전 기준 B를 충족시키는데 일반적으로 충분한 농도인 3 mg/mL의 최종 농도)을 실온에서 PBS 중 대략 10 mg/ml의 뮤테인을 함유하는 용액 (pH 7.4)에 가하였다. 실온에서 역상 및 크기 배제 크로마토그래피 후의 주요 크로마토그래피 피크의 단백질 회수를 측정함으로써 보존제 존재하의 물리적 안정성을 먼저 평가하였다. 또한, 37 ℃에서 DLS (동적 광 산란)에 의해 측정된 응집 정도를, 2 시간 후 m-크레졸 존재하의 평균 입자 직경으로서 야생형 FGF-21과 비교하여 나타냈다. 평균 직경이 더 큰 것은 단백질 회합 및/또는 응집의 정도가 증가한 것에 상응한다. (입자의 평균 직경 함수로서) 본 발명의 제1 및 제2 실시양태의 뮤테인의 보존제 혼화성을 야생형 FGF-21과 비교해서 하기 표 4에 나타냈다. 야생형 단백질은 이. 콜라이에서 발현되었지만, 뮤테인은 효모 (피치아 패스토리스)에서 발현되었다.
PBS 중에서 안정하며 보존제와 혼화성인 본 발명의 뮤테인은 야생형 FGF-21에 비해 약제 특성을 증강 또는 개선시키는 것으로 나타났다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 FGF-21에 비해 증강된 약제 특성을 나타내는 본 발명의 바람직한 뮤테인은 L118C-A134C 및 L118C-A134C-S167A이었다.
FGF-21 뮤테인 평균 입자 직경 (nm)*
실험 번호 1
야생형 FGF-21 1356
실험 번호 2
야생형 FGF-21 813
L118C-A134C 7
L118C-A134C-S167A 7
* 평균 입자 직경은 37 ℃에서 2시간의 인큐베이션 후 표적 농도 10 mg/ml의 단백질 용액, 3 mg/ml의 m-크레졸을 나타냄
실시예 5
O- 글리코실화 분석
FGF-21 뮤테인을 피치아 패스토리스에서 발현시키고, 40 ℃에서 조르박스(Zorbax), 330-SB C8, 4.6×50 mm, 3.5 ㎛ 입자 컬럼을 사용하는 HPLC (Waters 2695)(이동상 C: 10％ ACN 및 90％H2O 중 0.1％ TFA, D: ACN 중 0.1％ TFA)에 의해 배양 브로쓰로부터 정제하였다.
FGF-21의 정제된 뮤테인의 O-글리코실화 수준을 표준 LC/MS 분석에 의해 측정하였다. 대표적인 뮤테인에 대한 O-글리코실화의 퍼센트를 인간 야생형 FGF-21과 비교하여 표 5에 나타냈다. 바람직한 뮤테인 L118C-A134C-S167A의 O-글리코실화 수준은 야생형 FGF-21 또는 뮤테인 L118C-A134C에 대한 60％ 초과에 비해 단지 3％이었으며, 이는 S167A 뮤테인이 O-글리코실화 수준을 상당히 감소시킴을 명백히 입증한다.
FGF-21 뮤테인 O-글리코실화(％)
야생형 62％
L118C-A134C 63％
L118C-A134C-S167A 3％
서열목록 전자파일 첨부

Claims (26)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. Leu118Cys-Ala134Cys-Ser167Ala-인간 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-21인 뮤테인.
  4. 치료 유효량의 제3항의 뮤테인 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 비만, 제2형 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내증, 고혈당증 또는 대사 증후군의 치료를 위한 제약 조성물.
  5. 삭제
  6. △(His1Pro2Ile3Pro4)-Leu118Cys-Ala134Cys-Ser167Ala-인간 FGF-21인 생물학적으로 활성인 펩티드.
  7. 치료 유효량의 제6항의 생물학적으로 활성인 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 비만, 제2형 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내증, 고혈당증 또는 대사 증후군의 치료를 위한 제약 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
KR1020077004881A 2004-09-02 2005-07-26 섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인 KR100854198B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60680504P 2004-09-02 2004-09-02
US60/606,805 2004-09-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070050454A KR20070050454A (ko) 2007-05-15
KR100854198B1 true KR100854198B1 (ko) 2008-08-26

Family

ID=36036790

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077004881A KR100854198B1 (ko) 2004-09-02 2005-07-26 섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인

Country Status (21)

Country Link
US (1) US7582607B2 (ko)
EP (2) EP2161281A1 (ko)
JP (1) JP4809352B2 (ko)
KR (1) KR100854198B1 (ko)
CN (1) CN101010338B (ko)
AT (1) ATE444307T1 (ko)
AU (1) AU2005283025B2 (ko)
BR (1) BRPI0514790A (ko)
CA (1) CA2575753A1 (ko)
DE (1) DE602005016946D1 (ko)
DK (1) DK1789442T3 (ko)
EA (1) EA011390B1 (ko)
ES (1) ES2332057T3 (ko)
HR (1) HRP20090597T1 (ko)
IL (1) IL181573A0 (ko)
MX (1) MX2007002616A (ko)
NO (1) NO20071327L (ko)
PL (1) PL1789442T3 (ko)
PT (1) PT1789442E (ko)
SI (1) SI1789442T1 (ko)
WO (1) WO2006028595A2 (ko)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US8981061B2 (en) 2001-03-20 2015-03-17 Novo Nordisk A/S Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
CA2574953A1 (en) 2004-07-26 2006-02-09 Dow Global Technolgies Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
GB0426146D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Bioxell Spa Therapeutic peptides and method
KR101476472B1 (ko) 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
CN101688213A (zh) 2007-04-27 2010-03-31 陶氏环球技术公司 用于快速筛选微生物宿主以鉴定某些在表达异源蛋白质方面具有改善的产量和/或质量的菌株的方法
WO2009020802A2 (en) * 2007-08-03 2009-02-12 Eli Lilly And Company Treatment for obesity
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
US9279013B2 (en) 2008-10-10 2016-03-08 Amgen Inc. FGF-21 mutants comprising polyethylene glycol and uses thereof
US9120871B2 (en) 2009-01-23 2015-09-01 Novo Nordisk A/S Process for preparing FGF21 with low degree of O-glycosylation
US9480753B2 (en) 2009-01-23 2016-11-01 Novo Nordisk A/S FGF21 derivatives with albumin binder A-B-C-D-E- and their use
CN107188950B (zh) 2009-05-05 2021-09-28 安姆根有限公司 Fgf21突变体及其用途
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
CA2764835A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Amgen Inc. Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
US8372952B2 (en) * 2009-12-02 2013-02-12 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1C, human β-klotho and both human FGFR1C and human β-klotho
UA109888C2 (uk) * 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2359843A1 (en) 2010-01-21 2011-08-24 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
ES2543634T3 (es) * 2010-01-22 2015-08-20 Novo Nordisk A/S Proceso para preparación de FGF-21 con grado de O-glicosilación bajo
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
CA2796459C (en) 2010-04-16 2016-05-24 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf-1
JP2013533227A (ja) 2010-06-08 2013-08-22 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｆｇｆ２１類似体および誘導体
WO2012010553A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Novo Nordisk A/S N-terminal modified fgf21 compounds
BR112013011172A2 (pt) 2010-11-05 2017-06-06 Covx Tech Ireland Ltd compostos antidiabéticos
US9023791B2 (en) * 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
SG10201806648TA (en) 2011-07-01 2018-09-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
UY34346A (es) * 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de fusión para tratar trastornos metabólicos
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
MX2014007626A (es) 2011-12-22 2014-09-16 Pfizer Compuestos anti-diabetes.
ES2640268T3 (es) 2012-02-15 2017-11-02 Novo Nordisk A/S Anticuerpos que se unen a y bloquean un receptor desencadenante expresado en células mieloides 1 (TREM-1)
US9550830B2 (en) 2012-02-15 2017-01-24 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
US9663568B2 (en) 2012-02-15 2017-05-30 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1
US9475856B2 (en) 2012-03-02 2016-10-25 New York University Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
CA2871656A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
US9963494B2 (en) 2012-11-28 2018-05-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of using compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides for reducing glucose levels in a subject
CN105008548B (zh) 2012-12-27 2020-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态以及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
EP3060238A4 (en) 2013-10-21 2017-06-07 Salk Institute for Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
MX2016004822A (es) 2013-10-28 2016-08-17 Ngm Biopharmaceuticals Inc Modelos de cancer y metodos asociados.
LT3097122T (lt) 2014-01-24 2020-07-27 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Antikūnai, surišantys beta kloto domeną 2, ir jų panaudojimo būdai
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
CA2951153A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
KR20240029114A (ko) 2014-07-17 2024-03-05 노보 노르디스크 에이/에스 점도를 감소시키기 위한 trem-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
KR102637699B1 (ko) 2014-10-24 2024-02-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
RU2729011C2 (ru) 2014-12-23 2020-08-03 Ново Нордиск А/С Производные fgf21 и их применения
US11638745B2 (en) 2015-05-20 2023-05-02 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Cvctom of Hierher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
CA3002400A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (fgf) 1 analogs
CA3003616C (en) 2015-11-09 2020-07-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
TW201731867A (zh) 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
AU2017315459B2 (en) 2016-08-26 2023-06-29 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
MX2020002206A (es) 2017-09-08 2020-07-20 Bristol Myers Squibb Co Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (fgf-21) modificado para usarse en metodos para tratar la esteatohepatitis no alcoholica (nash).
WO2019119673A1 (zh) 2017-12-19 2019-06-27 北京吉源生物科技有限公司 一种双基因修饰的干细胞及其用途
US11679143B2 (en) 2018-02-08 2023-06-20 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. FGF21 variant, fusion protein and application thereof
AR117566A1 (es) 2018-04-02 2021-08-18 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-trem-1 y sus usos
PE20210632A1 (es) 2018-07-03 2021-03-23 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de fgf-21
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
WO2021094435A2 (en) * 2019-11-12 2021-05-20 Technische Universität München Homogeneous muteins of the human il-27 alpha-subunit
BR112022013172A2 (pt) 2020-01-08 2022-09-13 Bristol Myers Squibb Co Formulações de conjugados de fgf-21
CN113728013B (zh) 2020-01-11 2022-06-14 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物
JP2023538533A (ja) 2020-08-07 2023-09-08 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 線維症の処置のための、ｃｃｒ２／５拮抗剤と組み合わせたｆｇｆ２１
WO2022115597A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
CN113633756A (zh) * 2021-06-17 2021-11-12 温州医科大学 Fgf21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113606A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9301583D0 (sv) * 1993-05-07 1993-05-07 Kabi Pharmacia Ab Yeast strain and methods for expressing heterologous proteins in yeast
JP4334615B2 (ja) * 1994-08-12 2009-09-30 ワシントン・ユニバーシティ 糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態
CA2173750C (en) * 1994-08-12 2011-03-22 Irving Boime Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
PT1232264E (pt) * 1999-11-18 2009-11-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Gene fgf-21 humano e produtos da expressão do gene
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
WO2001038357A2 (en) 1999-11-22 2001-05-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US20040259780A1 (en) * 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
KR20060135648A (ko) * 2003-12-10 2006-12-29 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113606A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070050454A (ko) 2007-05-15
ATE444307T1 (de) 2009-10-15
DE602005016946D1 (de) 2009-11-12
WO2006028595A2 (en) 2006-03-16
EP1789442A2 (en) 2007-05-30
AU2005283025B2 (en) 2011-06-30
BRPI0514790A (pt) 2008-06-24
ES2332057T3 (es) 2010-01-25
CN101010338A (zh) 2007-08-01
NO20071327L (no) 2007-05-29
EA011390B1 (ru) 2009-02-27
JP4809352B2 (ja) 2011-11-09
EP2161281A1 (en) 2010-03-10
EA200700533A1 (ru) 2007-08-31
CA2575753A1 (en) 2006-03-16
DK1789442T3 (da) 2009-11-16
HRP20090597T1 (hr) 2009-12-31
US7582607B2 (en) 2009-09-01
WO2006028595A3 (en) 2007-01-18
CN101010338B (zh) 2011-06-15
MX2007002616A (es) 2007-05-16
JP2008511323A (ja) 2008-04-17
PL1789442T3 (pl) 2010-02-26
IL181573A0 (en) 2007-07-04
AU2005283025A1 (en) 2006-03-16
US20080103096A1 (en) 2008-05-01
SI1789442T1 (sl) 2010-01-29
EP1789442B1 (en) 2009-09-30
PT1789442E (pt) 2009-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100854198B1 (ko) 섬유아세포 성장 인자 21의 뮤테인
US7622445B2 (en) Muteins of fibroblast growth factor 21
US7655627B2 (en) Muteins of fibroblast growth factor 21
US7491697B2 (en) Muteins of fibroblast growth factor 21
JP6060167B2 (ja) 線維芽細胞増殖因子２１変異体
US7576190B2 (en) FGF-21 fusion proteins
JP6181752B2 (ja) 線維芽細胞増殖因子２１変異体
WO2010065439A1 (en) Variants of fibroblast growth factor 21
MXPA06006616A (en) Muteins of fibroblast growth factor 21

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20110728

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee