ES2332057T3 - Muteinas del factor de crecimiento de fibroblastos 21. - Google Patents

Muteinas del factor de crecimiento de fibroblastos 21. Download PDF

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ES2332057T3 ES05775749T ES05775749T ES2332057T3 ES 2332057 T3 ES2332057 T3 ES 2332057T3 ES 05775749 T ES05775749 T ES 05775749T ES 05775749 T ES05775749 T ES 05775749T ES 2332057 T3 ES2332057 T3 ES 2332057T3
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Abstract

Una muteína del FGF-21 humano, en la que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº1, en la que dicha muteína es deltaHisProIlePro/Leu118Cys/Ala134Cys/Ser167Ala.

Description

Muteínas del factor de crecimiento de fibroblastos 21.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a la identificación de nuevas muteínas del factor de crecimiento de fibroblastos 21 que tienen una glicosilación unida por O cuando se expresan en levaduras.
Descripción de la técnica relacionada
Los factores de crecimiento de fibroblastos son polipéptidos de tamaño grande que se expresan ampliamente en el desarrollo en tejidos adultos (Baird y col., Cancer Cells, 3: 239-243, 1991) y desempeñan papeles cruciales en múltiples funciones fisiológicas, incluidas la angiogénesis, la mitogénesis, la información del patrón, la diferenciación celular, la regulación metabólica y la reparación de lesiones tisulares (McKeehan y col., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59: 135-176, 1998). De acuerdo con la literatura publicada, la familia de FGF consta de al menos veintitrés miembros, FGF-1 a FGF-23 (Reuss y col., Cell Tissue Res. 313: 139-157 (2003). Se ha comunicado que el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21) se expresa, preferentemente, en el hígado (Nishimura y col., Biochimica et Biophysica Acta, 1492: 203-206, 2000); documentos WO01/36640 y WO01/18172) y se describe como un tratamiento para la enfermedad vascular isquémica, la cicatrización de heridas y las enfermedades asociadas con la pérdida de función de las células pulmonares, bronquiales o alveolares y otros numerosos trastornos. Más recientemente, se ha demostrado que el FGF-21 estimula la captación de glucosa en adipositos de ratón 3T3-L1 tras tratamiento prolongado (72 h), en presencia y ausencia de insulina, y que disminuye los niveles de glucosa, triglicéridos y glucagón en sangre, en ayunas y sin ayunar, en ratones ob/ob y db/db y ratas ZDF de 8 semanas de edad de un modo dependiente de la dosis, lo que proporciona la base para el uso de FGF-21 como tratamiento para tratar la diabetes y la obesidad (documento WO03/011213).
El desarrollo de tecnología de ADN recombinante ha posibilitado la producción de productos extraños tales como muteínas del FGF-21 en células huésped en las que se han introducido secuencias de ADN exógeno que codifican dichos productos. La ventaja de esta tecnología es que los productos se pueden producir en rendimientos elevados, en forma altamente purificada, con un bajo riesgo de contaminación tal como contaminación viral. Estas técnicas recombinantes se han usado ampliamente para la producción de proteínas recombinantes en células huésped procarióticas así como eucarióticas.
No obstante, la producción a gran escala de productos recombinantes mediante estas técnicas todavía es limitada debido a problemas de la eficiencia de la expresión de estas secuencias de ADN exógeno, debido también a la inestabilidad del vector y a la degradación intracelular de los productos recombinantes por la célula huésped en las que se fabrican. Además, a menudo los productos recombinantes son diferentes de sus homólogos naturales. Por ejemplo, los productos recombinantes producidos en huéspedes eucarióticos heterólogos normalmente difieren de su homólogo natural en su contenido de glicosilación. Esto puede afectar a la presencia frente a la ausencia de cualquier estructura de hidratos de carbono, la localización de dicha estructura de hidratos de carbono sobre el producto, así como la naturaleza del hidrato de carbono. Más específicamente, se ha demostrado que los productos recombinantes derivados de levaduras a menudo llevan O-glicanos no naturales adicionales en comparación con su homólogo natural (Van den Steen, y col., Crit. Reviews in Biochem. y Mole. Biol. 33(3): 151-208, 1998).
La presente invención resuelve el problema de la O-glicosilación anómala asociada con proteínas recombinantes derivadas de levaduras proporcionando una muteína del FGF-21 que tiene una cantidad reducida de la O-glicosilación en comparación con el FGF-21 cuando se expresa en levaduras. Los solicitantes han descubierto que las muteínas del FGF-21 con O-glicosilación reducida pueden producirse en condiciones de fermentación industrial y que mantienen la actividad biológica necesaria para ser útil para tratar a sujetos con trastornos, incluidos, entre otros, diabetes de tipo II, obesidad y síndrome metabólico.
Resumen de la invención
En una primera forma de realización, la presente invención proporciona una muteína de FGF-21 humano, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº 1, en la que dicha muteína es \DeltaHisProIlePro/Leu118Cys/
Ala134Cys/Ser167Ala.
Otra forma de realización lleva a un procedimiento para producir la muteína de la presente invención, que comprende:
(a) transformar una célula huésped con un vector que contiene ADN que codifica dicha muteína;
(b) cultivar dicha célula huésped en un medio adecuado para expresar dicha muteína; y
(c) aislar dicha muteína del medio de cultivo.
Otra forma de realización más lleva al uso de la muteína de FGF-21 de la presente invención para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente que exhiben uno o más de obesidad, diabetes de tipo II, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia o síndrome metabólico.
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Descripción detallada de la invención
Para los propósitos de la presente invención, tal como se divulga y reivindica en la presente memoria descriptiva, los términos siguientes son como se define a continuación.
El FGF-21 es un polipéptido de 208 aminoácidos que contiene una secuencia líder de 27 aminoácidos. El FG-21 humano tiene una identidad de aminoácidos del \sim79% con el FGF-21 de ratón y una identidad de aminoácidos del \sim80% con el FGF-21 de rata. El FGF-21 humano es el molde polipeptídico para la muteína de la presente invención, pero se reconoce que un experto en la técnica podría fabricar fácilmente muteínas basadas en una secuencia polipeptídica alternativa de FGF-21 de mamíferos.
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Las posiciones de los aminoácidos de la muteína de la presente invención se determinan a partir polipéptido de FGF-21 de 181 aminoácidos como se muestra a continuación (SEC ID Nº 1):
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1 
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La correspondiente secuencia de ADN que codifica el polipéptido de FGF-21 de 181 aminoácidos es (Sec ID Nº: 2):
3
Los aminoácidos se identifican usando el código de tres letras o, como alternativa, se designan usando el código estándar de una letra. Las mutaciones se designan con el código de tres letras para el aminoácido original, seguido por el número de aminoácido, seguido por el código de tres letras para el aminoácido de sustitución. Las designaciones numéricas de cada muteína se basan en la secuencia de 181 aminoácidos del FGF-21 humano salvaje maduro. Por ejemplo, una sustitución por serina en la posición 167 (es decir, Ser167) con el aminoácido apolar/hidrófobo alanina (Ala) se designa como Ser167Ala o S167A. De un modo similar, la sustitución doble por leucina en la posición 118 y alanina en la posición 134 (Leu118, Ala134) con el aminoácido que contiene azufre cisteína (Cys) se designa como Leu118Cys/A1a134Cys o L118C/A134C.
El término "aminoácido" se usa en la presente memoria descriptiva en su sentido más amplio e incluye aminoácidos naturales así como aminoácidos no naturales, incluidos análogos de aminoácidos y derivados. Este último incluye moléculas que contienen un resto aminoácido. Un experto en la técnica reconocerá, en vista de esta amplia definición, que la referencia a un aminoácido en la presente memoria descriptiva incluye, por ejemplo, aminoácidos L proteogénicos naturales; aminoácidos D; aminoácidos químicamente modificados tales como análogos y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos naturales tales como norleucina, \beta-alanina, ornitina etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica como característicos de los aminoácidos.
Una muteína del FGF-21 humano se define como que comprende FG-21 humano en el que al menos un aminoácido de la proteína salvaje madura se ha sustituido por otro aminoácido. Ejemplos de muteínas de FGF-21 se describen en la solicitud de patente internacional WO 2005/061712. En general, una muteína posee alguna propiedad modificada, estructural o funcional, de la proteína salvaje. Por ejemplo, la muteína puede haber potenciado o mejorado la estabilidad física en soluciones concentradas (p. ej., agregación mediada menos hidrófoba) mientras que mantiene un perfil de bioactividad favorable. La muteína puede poseer mayor compatibilidad con conservantes farmacéuticas (p. ej., m-cresol, fenol, alcohol bencílico), lo que permite la preparación de una formulación farmacéutica conservada que mantiene las propiedades fisioquímicas y la actividad biológica de la proteína durante el almacenamiento. La muteína puede tener una menor O-glicosilación cuando se expresa en levaduras. Tal O-glicosilación puede introducir determinantes inmunológicos nuevos en una proteína y, por tanto, puede ser antigénica cuando se administra a seres humanos; puede alterar las propiedades farmacocinéticas de una proteína y/o puede afectar a la actividad biológica de una proteína. En consecuencia, las muteínas producidas en levaduras con O-glicosilación reducida cuando se comparan con un FGF-21 salvaje, son menos inmunogénicas y tienen un perfil farmacocinético favorable mientras mantienen su potencia biológica. Como se usa en la presente memoria descriptiva, estos términos no son limitantes, siendo enteramente posible que una muteína dada tenga una o más propiedades modificadas de la proteína salvaje.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad mínima de un agente activo necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un paciente. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" para un paciente que sufra, o tiende a sufrir, o para evitar que sufra, diabetes de tipo II, obesidad o síndrome metabólico es tal que una cantidad que induce, alivia o de otro modo causa una mejora en los síntomas patológicos, la progresión de la enfermedad, afecciones fisiológicas asociadas con o la resistencia a sucumbir a los trastornos mencionados en lo que antecede. Para los propósitos de la presente invención, un "sujeto" o "paciente" es, preferentemente, un ser humano.
La diabetes de tipo II se caracteriza por un exceso en la producción de glucosa a pesar de la disponibilidad de insulina y los niveles circulantes de glucosa permanecen excesivamente altos como resultado de un aclaramiento inadecuado de la glucosa.
La intolerancia a la glucosa puede definirse como una sensibilidad excepcional a la glucosa.
La hiperglucemia se define como un exceso de azúcar (glucosa) en sangre.
La hipoglucemia, también denominado niveles bajos de azúcar en sangre, se produce cuando su nivele de glucosa en sangre desciende demasiado como para proporcionar suficiente energía para sus actividades corporales.
La hiperinsulinemia se define como un nivel superior a lo normal de la insulina en sangre.
La resistencia a la insulina se define como un estado en el que una cantidad normal de insulina produce una respuesta biológica por debajo de lo normal.
La obesidad, en términos del sujeto humano, puede definirse como el peso corporal por encima del 20 por ciento por encima del peso corporal ideal para una población dada (R.H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916).
Síndrome metabólico puede definirse como un grupo de al menos tres de los signos siguientes: grasa abdominal en la mayoría de los varones, una cintura de 101,6 cm o mayor; niveles elevados de azúcar en sangre al menos 110 miligramos por decilitro (mg/dl) después de ayunar; niveles elevados de triglicéridos, al menos 150 mg/dl en el torrente sanguíneo; niveles bajos de HDL, menos de 40 mg/dl; y presión arterial de 130/85 o mayor.
La presente invención proporciona una muteína de glicosilación en la que el número y/o tipo de puntos de glicosilación está alterado en comparación con el FGF-21 nativo. Las muteínas del FGF-21 pueden comprender un número menor para sitios de glicosilación por unión a O.
No hay una secuencia de aminoácidos consenso para identificar los sitios de glicosilación unida por O, lo que hace de dicha identificación una tarea difícil. Normalmente, la glicosilación unida por O se produce en la cadena lateral de un residuo de serina o de treonina. Una vez que se identifica un sitio de glicosilación unida por O, las sustituciones de aminoácidos para eliminar esta secuencia pueden eliminar una cadena de hidratos de carbono unida por O existente. Los sitios de glicosilación unida por O identificados incluyen Ser163, Ser164, Ser 167, Ser 172 y Ser 176. El sitio principal para la glicosilación-O es Ser167. Los solicitantes han descubierto que eliminar el sitio de Ser167 tiene como resultado una reducción significativa para la O-glicosilación de la muteína expresada en levadura.
Por tanto, en una primera forma de realización de preferencia, la presente invención proporciona una muteína de FGF-21 humano, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº 1, en la que dicha muteína es \DeltaHisProIlePro/Leu118Cys/Ala134Cys/Ser167Ala.
Un experto en la técnica reconocerá que las cisteínas nativas, cisteína 75 y cisteína 93m también podrían utilizarse como loci para introducir un nuevo puente disulfuro que puede impartir propiedades mejoradas. Específicamente se contempla la introducción de una sustitución de cisteína en la serina 85 o la fenilalanina 73, acoplada con un cambio concomitante en la cisteína 93 o la cisteína 75, respectivamente, en la que los últimos sitios se sustituyen con cualquier otro aminoácido. Las muteínas del FGF-21 con puentes disulfuro sometidos a ingeniería, además del natural en Cys75-Cys93 se describen en la solicitud de patente internacional WO 2005/061712.
Aunque las formas de realización de la presente invención se refieren a una muteína del FGF-21 con capacidad reducida para la glicosilación-O cuando se expresa en levaduras en comparación con el FGF-21 humano salvaje, el mantenimiento de la potencia biológica de la muteína en comparación con el FGF-21 salvaje también es un factor importante a considerar.
Por tanto, la potencia biológica de la muteína de la presente invención se define por la capacidad de la muteína para afectar a la captación de glucosa medida en el ensayo con células 3T3-L1 in vitro (Ejemplo 2) y/o la disminución de los niveles de glucosa en plasma, así como los niveles de triglicéridos en plasma, medidos con el ensayo in vivo en ratones ob/ob (Ejemplo 3).
La muteína del FGF-21 administrada de acuerdo con esta invención puede generarse y/o aislarse por cualquier medio conocido en la técnica. El procedimiento más preferido para producir la muteína es mediante metodologías de ADN recombinante y es bien conocido para los expertos en la técnica. Dichos procedimientos se describen en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.).
Péptidos biológicamente activos derivados de la muteína descrita en la presente memoria descriptiva contendrán al menos una de las sustituciones descritas, exhibirán menor capacidad para la O-glicosilación en comparación con el correspondiente péptido no mutado y poseerá actividad biológica. Esta actividad biológica se define por la capacidad del péptido para afectar a la captación de glucosa medida en el ensayo con células 3T3-L1 in vitro (Ejemplo 2) y/o la disminución de los niveles de glucosa en plasma, así como los niveles de triglicéridos en plasma, medidos con el ensayo in vivo en ratones ob/ob. (Ejemplo 3) El péptido puede producirse por cualquier medio conocido para los expertos en la técnica, ejemplos de los cuales incluyen, entre otros, digestión enzimática, síntesis química o metodologías de ADN recombinante.
En la técnica está establecido que fragmentos de péptidos de ciertos factores de crecimiento de fibroblastos son biológicamente activos. Véase, por ejemplo, Baird y col., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85 2324-2328 (1988), y J. Cell. Phys. Suppl. 5: 101-106 (1987). Por ejemplo, se sabe que la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IC) es una proteasa de tipo serina implicada en la inactivación de neuropéptidos, péptidos endocrinos y citocinas (Damme y col. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)). El extremo N del FGF-21 (HisProIlePro) contiene dos dipéptidos que potencialmente podrían ser sustratos de la DPP-IV, lo que tiene como resultado un fragmento de FGF-21 truncado en el extremo N en hasta 4 aminoácidos. Inesperadamente, se ha demostrado que este fragmento del FGF-21 salvaje conserva actividad biológica (Tabla 1), por tanto, la muteína de la presente invención está truncada en el extremo N en 4 aminoácidos. Además, los solicitantes han descubierto que el truncamiento de 5 aminoácidos o más desde el extremo N afecta de forma negativa a la actividad biológica.
Se describen polinucleótidos que codifican la muteína anterior que puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, en el que el ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. La secuencia codificadora que codifica la muteína de la presente invención puede variar como resultado de la redundancia o degeneración del código genético.
Los polinucleótidos que codifican la muteína de la presente invención pueden incluir lo siguiente: Sólo la secuencia de codificación de la muteína, la secuencia de codificación de la muteína y secuencia de codificación adicional tal como un polipéptido funcional, o una secuencia líder o secretora o una secuencia de pro-proteína; la secuencia de codificación de la muteína y la secuencia no codificadora, tal como intrones o secuencia no codificadora en 5' y/o en 3' de la secuencia de codificación de la muteína. Por tanto, el término "polinucleótido que codifica una muteína" abarca un polinucleótido que puede incluir no sólo la secuencia de codificación de la muteína sino también un polinucleótido, que incluye secuencia adicional de codificación y/o no codificadora.
Se divulgan variantes de los polinucleótidos descritos que codifican fragmentos, análisis y derivados del polipéptido que contienen las sustituciones indicadas. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica natural de la secuencia del FGF-21 humano, una variante no natural, o una variante truncada tal como se ha descrito en lo que antecede. Por tanto, en la presente memoria descriptiva se divulgan polinucleótidos que codifican las muteínas descritas en lo que antecede, así como variantes de dichos polinucleótidos, variantes que codifican un fragmento, derivado o análogo de la muteína descrita que exhiben menor capacidad de O-glicosilación en comparación con el correspondiente fragmento, derivado o análogo no mutado. Tales variantes nucleotídicas incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución, variantes truncadas y variantes de adición o inserción, con la condición de que al menos una de las sustituciones aminoacídicas indicadas esté presente.
Los polinucleótidos se expresarán en una célula huésped después de que las secuencias se hayan unido operablemente a una secuencia de control de la expresión. Normalmente, estos vectores de expresión son replicables en los organismos huésped bien como epitomas o como parte integral del ADN del cromosoma del huésped. Habitualmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo tetraciclina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas. Preferentemente, la célula huésped es una célula fúngica o de levadura.
Las células de levadura usadas para expresar la muteína de la presente invención incluyen Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia angust. Las células huésped de levadura contienen vectores con secuencias de control de la expresión tal como promotores, incluida 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares tal como se desee. El huésped de levadura preferido es Pichia pastoris, en el que el vector de expresión está integrado en el ADN del cromosoma del huésped. Aspergillus niger, Trichoderitia reesei; and Schizophyllun: commune, son ejemplos de huéspedes fúngicos, aunque también se pueden emplear otros, es cuestión de gustos.
Los vectores que contienen las secuencias polinucleotídicas de interés (p. ej., las muteínas del FGF-21 y secuencias de control de la expresión) se pueden transferir a la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, que varían en función del tipo de huésped celular. Por ejemplo, para células procarióticas normalmente se utiliza la transfección con cloruro cálcico, mientras que para otros huéspedes celulares se pueden usar tratamiento con fosfato cálcico o electroporación.
Se pueden emplear varios procedimientos de purificación proteica y tales procedimientos se conocen y se describen en la técnica en, por ejemplo, Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9. (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán de, por ejemplo, la naturaleza del procedimiento de producción usado para la muteína del FGF-21.
Las composiciones que contienen muteína de FGF-21 deberían formularse y dosificarse de un modo consistente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la afección clínica del paciente, el punto de administración de la muteína del FGF-21, la composición, el procedimiento de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos para aquéllos que la practican. Por tanto, la "cantidad terapéuticamente eficaz" de la muteína del FGF-21 para los propósitos de la presente memoria descriptiva se determina mediante dichas consideraciones.
Las composiciones farmacéuticas de la muteína del FGF-21 de la presente invención se pueden administrar por cualquier medio conocido en la técnica que alcanza el propósito pretendido generalmente para tratar la diabetes de tipo II, la obesidad o el síndrome metabólico. La vía de administración preferida es parenteral, definida en la presente memoria descriptiva en referencia a los modos de administración que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraestemal, subcutánea e intraarticular e infusión. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, en su caso, frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Las composiciones dentro del ámbito de la invención incluyen todas las composiciones en las que la muteína de FGF-21 está presente en una cantidad que es eficaz para alcanzar el efecto médico deseado para el tratamiento de la diabetes de tipo II, la obesidad o el síndrome metabólico. Aunque las necesidades individuales pueden variar de un paciente a otro, la determinación de los intervalos ópticos de las cantidades eficaces de todos los componentes está dentro de la capacidad del clínico experto.
La muteína del FGF-21 de la presente invención se puede formular de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar las composiciones farmacéuticamente útiles. Una formulación deseada sería una que es un producto liofilizado estable que se reconstituye con un diluyente adecuado o una solución acuosa de pureza elevada, con transportadores, conservantes, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]. La muteína de la presente invención puede combinarse con un tampón farmacéuticamente aceptable y el pH ajustarse para proporcionar una estabilidad aceptable, y un pH aceptable para administración. Además, la muteína de la presente invención puede colocarse en un contenedor seleccionado del grupo constituido por un vial, cartucho o dispositivo de liberación en lápiz, una jeringuilla, tubos para administración intravenosa y una bolsa para administración intravenosa, en el que el contenedor es un contenedor de monodosis.
Para administración parenteral, la muteína del FGF-21 puede formularse, generalmente, mezclándola al grado de pureza deseado, en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión o emulsión), con un transportador farmacéuticamente aceptable, es decir uno que no es tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleados y que es compatible con otros ingredientes de la formulación. Preferentemente, pueden añadirse uno o más agentes antimicrobianos farmacéuticamente aceptables. Agentes antimicrobianos farmacéuticamente aceptables de preferencia son fenol, m-cresol y alcohol bencílico.
Opcionalmente se pueden añadir una o más sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la fuerza iónica o la tonicidad. Se pueden añadir uno o más excipientes para ajustar después la isotonicidad de la formulación. Glicerina, cloruro sódico y manitol son ejemplos de un excipiente ajustador de la isotonicidad.
Los expertos en la técnica pueden optimizar fácilmente las dosis farmacéuticamente eficaces y los regímenes de administración para las composiciones terapéuticas, que comprenden la muteína del FGF-21, según lo determine la buena práctica médica y la afección clínica del paciente individual. La dosis adecuada de la muteína del FGF-21 administrada tendrá como resultado la disminución de los niveles de glucosa en sangre y el incremento del gasto de energía mediante la utilización más rápida y más eficiente de la glucosa y, por tanto, es útil para tratar la diabetes de tipo 2, la obesidad y el síndrome metabólico.
Además, el FGF-21 no indujo hipoglucemia en ratas ZDF flacas cuando se compararon con ratas a las que se administraron dosis de insulina (documento WO 03/01121). Estos datos indican que el FGF-21 afecta a los niveles de glucosa en plasma de un modo independiente de la insulina, lo que sugiere que la muteína del FGF-21 de la presente invención también puede ser útil en el tratamiento de la diabetes de tipo I.
En otro aspecto de la presente invención, la muteína del FGF-21 humano descrito en la presente memoria descriptiva se usa como medicamento.
En otro aspecto más de la presente invención, una cantidad eficaz de la muteína del FGF-21 descrita en la presente memoria descriptiva se usa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una o más afecciones seleccionadas de diabetes de tipo II, obesidad o síndrome metabólico.
Habiendo descrito la presente invención con detalle, la misma se entenderá claramente con referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen en la presente con fines ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes de la invención.
Ejemplo 1
Expresión y purificación de las muteínas del FGF-21 en levaduras
Las muteínas del FGF-21 se expresan en levaduras, tales como Pichia pastoris, Pichia methanolica o Saccharomyces cerevisiae. Para la producción en Pichia pastoris, un sistema comercialmente disponible (Invitrogen, Carlsbad, CA) usa vectores con los potentes promotores AOX1 (alcohol oxidasa) para dirigir la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes. Como alternativa, los vectores que usan el promotor del gen GAP (gliceraldehído-2-fosfato deshidrogenasa) están disponibles para la expresión constitutiva de alto nivel. Los vectores de expresión multicopia de Pichia permiten obtener cepas con múltiples copias del gen de interés integrado en el genoma. El incremento del número de copias del gen de interés en una cepa recombinante de Pichia puede incrementar los niveles de expresión proteica. Otro sistema más de expresión en levaduras es Saccharomyces cerevisiae. Los vectores de expresión contienen las secuencias del promotor y potenciadotas del gen GAL1. El promotor de GAL1 es uno de los promotores de levaduras más ampliamente usados por su fuerte actividad transcripcional tras inducción con galactosa.
La caracterización analítica (análisis en espectro de masas) indica que el FGF-21 expresado en Pichia pastoris está truncado (eliminación de cuatro aminoácidos en el extremo N salvaje). Cuando se analiza en el ensayo de adipositos 3T3-L1 de ratón (véase el Ejemplo 2), esta variante truncada del FGF-21 estimula la captación de glucosa al mismo nivel que el FGF-21 de tipo salvaje (Tabla 1).
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Ejemplo 2
Captación de glucosa en adipocitos de ratón 3T3-L1
Las células 3T3-L1 se obtienen de la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD). Las células se cultivan en medio de crecimiento (MC) que contiene 10% de suero bovino fetal enriquecido con hierro en medio Eagle modificado de Dulbecco. Para la diferenciación de adipocitos estándar, dos días después de que las células alcanzaran la confluencia (denominado día 0), las células se exponen a medio de diferenciación (MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 10 \mug/ml de insulina, dexametasona 1 \muM e isobutilmetilxantina 0,5 \muM durante 48 horas. Después, las células se mantienen en pos-diferenciación que contiene 10% de suero bovino fetal y 10 \mug/ml de insulina.
Ensayo de transporte de glucosa- La captación de hexosa, analizado mediante la acumulación de 2-desoxi-D-[^{14}C] glucosa 0,1 mM se mide del siguiente modo: Los adipocitos 3T3-L1 en placas de 12 pocillos se lavan dos veces con tampón KRP (NaCl 136 mM, KCl 4,7 mM, NaPO_{4} 10 mM, CaCl_{2} 0,9 mM, MgSO_{4} 0,9 mM, pH 7,4) calentado hasta 37ºC y que contiene 0,2% de BSA, se incuban en medio de Leibovitz L-15 que contiene 0,2% de BSA durante 2 horas a 37ºC a aire ambiente, se lavan dos veces de nuevo con KRP que contiene 0,2% de tampón BSA y se incuban en KRP, 0,2% de tampón BSA en ausencia (únicamente Me_{2}SO) o presencia de wortmannin durante 30 minutos a 37ºC a aire ambiente. A continuación se añade insulina hasta una concentración final de 100 nM durante 15 min y la captación de 2-D-desoxi-D-[^{14}C]glucosa se mide durante los últimos 4 minutos. La captación inespecífica, medida en presencia de citocalasina B 10 \muM, se resta de todos los valores. Las concentraciones proteicas se determinan con el ensayo de ácido bicinconínico de Pierce. La captación se mide de forma rutinaria por triplicado o cuadruplicado para cada experimento.
La potencia in vitro se normaliza a la actividad in vitro del FGF-21 salvaje, al que se le proporciona una designación de 1,0 y se usa como control positivo. La potencia in vitro de las muteínas del FG-21 se compara con el FGF-21 salvaje en la tabla 1.
Como se indica en la Tabla 1, las muteínas mantuvieron la potencia biológica hasta varios grados en comparación con el FGF-21 salvaje.
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TABLA 1
4
Ejemplo 3
Modelo de ratón ob/ob
Se realiza un estudio en un modelo de obesidad usando ratones macho ob/ob para monitorizar los niveles de glucosa y los niveles de triglicéridos en plasma tras el tratamiento con FGF-21, en comparación con los grupos control con insulina y vehículo. A los grupos de prueba de ratones macho ob/ob (de 7 semanas de edad) se les inyecta solo vehículo (0,9% de NaCl) o muteína de FGF-21 (0,125 mg/kg) por vía subcutánea (0,1 ml una vez al día) durante siete días. La sangre se recoge mediante extracción con clip en la cola el día 7, una hora después de la inyección del último compuesto y los niveles de glucosa en plasma se mide usando un protocolo estándar. La capacidad de las muteínas del FGF-21 para disminuir los niveles de glucosa en plasma en comparación con el vehículo control se muestra en la Tabla 2. Los datos en la Tabla 2 indican que las muteínas disminuyeron los niveles de glucosa en plasma en comparación con el vehículo control. La capacidad de las muteínas del FGF-21 para disminuir los niveles de triglicéridos en comparación con el vehículo control se muestra en la Tabla 3.
TABLA 2
5 
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TABLA 3
6
Ejemplo 4
Estabilidad farmacéutica de las muteínas del FGF-21
La estabilidad de las muteínas del FGF-21 se analiza en condiciones simuladas fisiológicas y de formulación farmacéutica. Para simular las condiciones fisiológicas, la muteína se analiza para determinar la estabilidad en PBS a temperatura ambiente (TA) a una concentración proteica diana de 10 mg7ml, ph 7,4. La estabilidad de la solubilidad/física de las muteínas en PBS se considera satisfactoria si la recuperación de proteínas tras la preparación tuvo como resultado >90% de recuperación a TA determinado mediante cromatografía de exclusión por tamaño y/o de fase inversa. Como se indica en las Tablas 4 y 5, las muteínas cumplen este criterio.
Se ha previsto que una formulación farmacéutica de una muteína será, probablemente, una formulación multi-usos conservada, por tanto, se analiza la compatibilidad con un conservante habitual. Para analizar la compatibilidad de la formulación, a una solución que contiene la muteína a aproximadamente 10 mg/ml en PBS, Ph 7,4 se añade un conservante, m-cresol, (concentración final de 3 mg/ml, una concentración normalmente suficiente para cumplir los criterios de la Farmacopea europea B para la eficacia de los conservantes en condiciones de pH neutro), a temperatura ambiente. Inicialmente, la estabilidad física en presencia de conservante se accede determinando la recuperación de proteína del principal pico cromatográfico tras la cromatografía de fase inversa y de exclusión por tamaño a TA. Además, la extensión de la agregación medida mediante DLS (dispersión dinámica de luz) a 37ºC se muestra como el diámetro medio de las partículas en presencia de m-creso tras dos horas en comparación con el FGF-21 salvaje. Un diámetro medio mayor corresponde a un incremento del grado de asociación y/o agregación proteica. La compatibilidad del conservante (como función del diámetro medio de las partículas) de las muteínas en comparación con el FGF-21 salvaje se muestra en la Tabla 4. La proteína salvaje se expresa en E. coli, mientras que las muteínas se expresan en levaduras (Pichia pastori).
Las muteínas que son estables en PBS y compatibles con conservante se designan de modo que tienen propiedades farmacéuticas potenciadas o mejoradas en comparación con el FGF-21 salvaje. Como se muestra en la Tabla 4, las muteínas que poseen propiedades farmacéuticas potenciadas en comparación con el FGF-21 salvaje son L118C-A134C y L118C-A134C-S167A.
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TABLA 4
7 
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Ejemplo 5
Análisis de la O-glicosilación
Las muteínas del FGF-21 se expresan en Pichia pastoris y se purifican en el caldo de cultivo mediante HPLC (Waters 2695) usando una columna de partículas de 3,5 \mu Zorbax, 330-SB C8,4.6x50 mm a 40ºC (Fase móvil C: 0,1% de TFA en 10% de ACN y 90% de H_{2}O, D: 0,1% de TFA en ACN).
Los niveles de O-glicosilación de las muteínas purificadas del FGF-21 se miden mediante análisis CL/EM estándar. El porcentaje de O-glicosilación para las muteínas representativas se muestra en la Tabla 5 en comparación con el FGF-21 salvaje. Los niveles de O-glicosilación de la muteína L118C-A134C-S167A son sólo del 3% en comparación con > 60% para el FGF-21 salvaje o la muteína L118C-A134C, que claramente demuestran que la muteína s167a reduce de forma significativa el nivel de O-glicosilación.
TABLA 5
9
<110> Eli Lilly and Company
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<120> Muteínas del factor de crecimiento de fibroblastos 21
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X-16824
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<140> PCT/2005/26398
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2005-07-26
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<150> 60/606,805
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-09-02
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<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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<400> 1
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10 
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<210> 2
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<211> 543
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<400> 2
11

Claims (5)

1. Una muteína del FGF-21 humano, en la que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº1, en la que dicha muteína es
\DeltaHisProIlePro/Leu118Cys/Ala134Cys/Ser167Ala.
2. Un procedimiento de producir la muteína de la reivindicación 1, que comprende:
(a) transformar una célula huésped con un vector que contiene ADN que codifica dicha muteína;
(b) cultivar dicha célula huésped en un medio adecuado para expresar dicha muteína; y
(c) aislar dicha muteína del medio de cultivo.
3. Una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de un paciente que exhibe una o más de obesidad, diabetes de tipo II, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia o síndrome metabólico, que comprende las siguientes:
(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de la muteína del FGF-21 de la reivindicación 1; y
(b) un transportador farmacéutico aceptable.
4. Una muteína del FGF-21 humano, o un péptido biológicamente activo del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, para usar como medicamento.
5. Una muteína del FGF-21 humano, o un péptido biológicamente activo del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, para usar en el tratamiento de la obesidad, la diabetes de tipo II, la resistencia a la insulina, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la hiperglucemia o el síndrome metabólico.
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