ES2332100T3 - Proteinas de fusion del fgf-21. - Google Patents

Proteinas de fusion del fgf-21. Download PDF

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ES2332100T3 ES05742237T ES05742237T ES2332100T3 ES 2332100 T3 ES2332100 T3 ES 2332100T3 ES 05742237 T ES05742237 T ES 05742237T ES 05742237 T ES05742237 T ES 05742237T ES 2332100 T3 ES2332100 T3 ES 2332100T3
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Rohn Lee Junior Millican
Yu Tian
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Abstract

Una proteína de fusión heteróloga que comprende un primer polipéptido con un extremo N y un extremo C condensado con un segundo polipéptido con un extremo N y un extremo C, en la que el primer polipéptido es un compuesto de FGF-21 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 4:. en la que: **(Ver fórmula)** Xaa en la posición 11 es Pro; Xaa en la posición 16 es Pro o Glu; Xaa en la posición 17 es Phe, Val, o Ala; Xaa en la posición 18 es Leu, Glu, o Ala; Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente, y en la que (i) el extremo C del primer polipéptido está condensado con el extremo N del segundo polipéptido a través de un ligante, o (ii) en el que el extremo N del primer polipéptido está condensado con el extremo C del segundo péptido a través de un ligante, en el que el ligante en (i) o (ii) se selecciona de: a) SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 o SEC ID Nº: 9; b) un péptido rico en glicina.

Description

Proteínas de fusión del FGF-21.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos del factor de crecimiento de fibroblastos 21 condensados con proteínas que tienen el efecto de extender la semivida in vivo de los polipéptidos. Estas proteínas de fusión se pueden usar para tratar la diabetes mellitus no dependiente de insulina, la obesidad y el síndrome metabólico.
Antecedentes de la invención
Los factores de crecimiento de fibroblastos son polipéptidos de tamaño grande que se expresan ampliamente en el desarrollo en tejidos adultos (Baird y col., Cancer Cells, 3: 239-243, 1991) y desempeñan papeles cruciales en múltiples funciones fisiológicas, incluidas la angiogénesis, la mitogénesis, la formación del patrón, la diferenciación celular, la regulación metabólica y la reparación de lesiones tisulares (McKeehan y col., Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998). De acuerdo con la bibliografía, la familia de FGF consta ahora de veintidós miembros (Reuss y col., Cell Tissue Res. 313:39-157 (2003)).
Se ha comunicado que el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21) se expresa, preferentemente, en el hígado y se describe como un tratamiento para la enfermedad vascular isquémica, la cicatrización de heridas y las enfermedades asociadas con la pérdida de función de las células pulmonares, bronquiales o alveolares y otros numerosos trastornos (Nishimura y col., Biochimica et Biophysica Acta, 1492: 203-206) (2000); documentos US 6.716.626 y WO01/18172). Más recientemente, se ha demostrado que el FGF-21 estimula la captación de glucosa en adipocitos de ratón 3T3-L1 en presencia o ausencia de insulina, y que disminuye los niveles de glucosa en sangre, en ayunas y sin ayunar, en ratones oblob y db/db y ratas ZDF de 8 semanas de edad de un modo dependiente de la dosis, lo que proporciona la base para el uso de FGF-21 como terapia para tratar la diabetes de tipo 2 y la obesidad (documento WO03/011213).
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la fusión de una proteína con una semivida en circulación prolongada, tal como la porción Fc de una inmunoglobulina o albúmina, a un compuesto de FGF-21 tiene como resultado una proteína de fusión de FGF-21 biológicamente activa con una semivida de eliminación ampliada y menor aclaramiento cuando se compara con el del FGF-21 nativo.
Las proteínas de fusión del FGF-21 de la presente invención tienen mayor utilidad como agente terapéutico, así como mayor comodidad de uso que el FGF-21 salvaje porque conservan toda o una porción de la actividad biológica del FGF-21 salvaje, aunque tienen un tiempo de acción prolongado en comparación con el del FGF-21 salvaje.
Por tanto, las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención son útiles para tratar sujetos con trastornos, incluidos, entre otros, diabetes de tipo 2, obesidad y síndrome metabólico, siendo ventajas concretas que las proteínas de fusión del FGF-21 de la presente invención tienen mejor eficacia debido a la constante exposición y requieren menos dosis, lo que aumenta la comodidad para un sujeto que necesite tal terapia y la probabilidad del cumplimiento terapéutico de un sujeto con requisitos de dosificación.
El documento 01/72957 desvela nuevos polipéptidos similares al FGF y moléculas de ácido nucleico que los codifican. Estos polipéptidos pueden condensarse con una segunda proteína plasmática.
El documento WO 02/46227 desvela compuestos 1 similares al glucagón condensados con proteínas que tienen el efecto de extender la semivida in vivo de los péptidos.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención se proporciona una proteína de fusión heteróloga que comprende un primer polipéptido con un extremo N y un extremo C condensados con un segundo polipéptido con un extremo N y un extremo C, en la que el primer polipéptido es un compuesto de FGF-21 y un segundo polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 4:
1
100
en la que:
\global\parskip1.000000\baselineskip
Xaa en la posición 11 es Pro;
Xaa en la posición 16 es Pro o Glu;
Xaa en la posición 17 es Phe, Val, o Ala;
Xaa en la posición 18 es Leu, Glu, o Ala;
Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y
Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente,
y en la que
(i) el extremo C del primer polipéptido está condensado con el extremo N del segundo polipéptido,
o (ii) en el que el extremo N del primer polipéptido está condensado con el extremo C del segundo péptido a través de un ligante seleccionado de:
a) un péptido ligante seleccionado de SEC ID Nº: 6, SEc ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 9; b) un péptido rico en glicinas; c) un péptido que tiene la secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{n} en la que n es 1, 1.5, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Preferentemente, la proteína de fusión heteróloga de la presente invención se selecciona de: L118C/A134C/S167A-1LIgG4 S228P; L118C/A134C/S167A-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A; L118C/A134C/S167A-IL-IgG4 S228P,
N297A; L118C/A134C/S167A -1L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; L118C/A134C/S167A-1,5L-IgG4 S228P;
L118C/A134C/S167A-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A; L118C/A134C/S167A-1,5L-IgG4 S228P, N297A; L118C/
A134C/S167A-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; L118C/A134C/S167A-2L-IgG4 S228P; L118C/A134C/
S167A-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A; L118C/A134C/S167A-2L-IgG4 S228P, N297A; y L118C/A134C/S167A-
2L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A.
Más preferentemente, la proteína de fusión heteróloga de la presente invención se selecciona de: L118C/A134C-1LIgG4 S228P; L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A; L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, N297A; L118C/
A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P; L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A; L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, N297A; L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; L118C/A134C-2L-IgG4 S228P; L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A; L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, N297A; y L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A.
Preferentemente, la proteína de fusión heteróloga de la presente invención se selecciona de: I152E/S163E/L118C/
A134C-1L-IgG4 S228P; I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A; I152E/S163E/L118C/
A134C-1L-IgG4 S228P, N297A; I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; I152E/S163
E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P; I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A; I152E/S163E/
L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, N297A; I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P; I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A; I152E/
S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, N297A; y I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A,
N297A.
La presente invención también incluye polinucleótidos que codifican la proteína de fusión heteróloga descrita en la presente memoria descriptiva, los vectores que comprenden estos polinucleótidos y las células huésped transfeccionadas o transformadas con los vectores descritos en la presente memoria descriptiva. También se incluye un procedimiento para producir una proteína de fusión heteróloga, que comprende las etapas de transcribir y traducir un polinucleótido descrito en la presente memoria descriptiva en condiciones en las que la proteína de fusión heteróloga se expresa en cantidades detectables.
Otra forma de realización de la presente invención abarca las composiciones farmacéuticas de las proteínas de fusión del FGF-21 y procedimientos para tratar a un paciente que sufra diabetes de tipo 2, obesidad o síndrome metabólico, que comprenda administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión heteróloga descrita en la presente memoria descriptiva.
Descripción detallada de la invención
Para los propósitos de la presente invención, tal como se divulga y reivindica en la presente memoria descriptiva, los términos siguientes son como se define a continuación.
El FGF-21 es un polipéptido de 208 aminoácidos que contiene una secuencia líder de 27 aminoácidos. El FG-21 humano tiene una identidad de aminoácidos del \sim79% con el FGF-21 de ratón y una identidad de aminoácidos del \sim80% con el FGF-21 de rata. El FGF-21 humano o una muteína del mismo es el molde polipeptídico preferido para las proteínas de fusión del FGF-21 de la presente invención, pero se reconoce que un experto en la técnica podría fabricar fácilmente proteínas de fusión basadas en una secuencia polipeptídica alternativa de FGF-21 de mamíferos.
Las posiciones de los aminoácidos de la presente invención se determinan a partir del polipéptido de FGF-21 de 181 aminoácidos de tipo salvaje o nativo, humano, maduros como se muestra a continuación (SEC ID Nº 1):
\vskip1.000000\baselineskip
2
La correspondiente secuencia de ADN que codifica el polipéptido de FGF-21 de 181 aminoácidos humano maduro es (Sec ID Nº: 2):
3
El FGF-21 útil en los procedimientos de la presente invención es, preferentemente, una muteína, análogo o derivado del FGF-21 humano, como se muestra en la SEC ID Nº 1, el lo sucesivo denominado en conjunto compuestos de FGF-21. Los compuestos de FGF-21 tienen suficiente homología con el FGF-21 de modo que los compuestos tienen la capacidad de unirse al receptor de FGF-21 e iniciar una vía de transducción de señal, que tiene como resultado la estimulación de la captación de glucosa u otros efectos fisiológicos tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, los compuestos de FGF-21 se pueden analizar para determinar la actividad de captación de glucosa usando un ensayo basado en células como el que se describe en el Ejemplo 1.
Un "sujeto" o "paciente" es un mamífero, preferentemente un ser humano.
La diabetes de tipo 2 (diabetes mellitus no insulina dependiente (DMNID)) se caracteriza por un exceso en la producción de glucosa a pesar de la disponibilidad de insulina y los niveles circulantes de glucosa permanecen excesivamente altos como resultado de un aclaramiento inadecuado de la glucosa.
La intolerancia a la glucosa puede definirse como una sensibilidad excepcional a la glucosa.
La hiperglucemia se define como un exceso de azúcar (glucosa) en sangre.
La hipoglucemia, también denominado niveles bajos de azúcar en sangre, se produce cuando su nivele de glucosa en sangre desciende demasiado como para proporcionar suficiente energía para sus actividades corporales.
La hiperinsulinemia se define como un nivel superior a lo normal de la insulina en sangre.
La resistencia a la insulina se define como un estado en el que una cantidad normal de insulina produce una respuesta biológica por debajo de lo normal.
Síndrome metabólico puede definirse como un grupo de al menos tres de los signos siguientes: grasa abdominal en la mayoría de los varones, una cintura de 101,6 cm o mayor; niveles elevados de azúcar en sangre al menos 110 miligramos por decilitro (mg/dl) después de ayunar; niveles elevados de triglicéridos, al menos 150 mg/dl en el torrente sanguíneo; niveles bajos de HDL, menos de 40 mg/dl; y presión arterial de 130/85 o mayor.
Nativo o salvaje se refiere al polipéptido FGF-21 de 181 aminoácidos humano maduro como se muestra en la SEC ID Nº: 1. Con el término "nativo" o "salvaje" se pretende abarcar las variantes alélicas del polipéptido en cuestión.
El término "aminoácido" se usa en la presente memoria descriptiva en su sentido más amplio e incluye aminoácidos naturales así como aminoácidos no naturales, incluidos variantes y derivados de aminoácidos. Un experto en la técnica reconocerá, en vista de esta amplia definición, que la referencia a un aminoácido en la presente memoria descriptiva incluye, por ejemplo, aminoácidos L proteogénicos naturales; aminoácidos D; aminoácidos químicamente modificados tales como variantes y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos naturales tales como norleucina, \beta-alanina, ornitina etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica como característicos de los aminoácidos. Ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen \alpha-metil aminoácidos (p. ej., (\alpha-metil alanina), D-aminoácidos, aminoácidos similares a la histidina (p. ej., 2-amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina y \alpha-meti-histidina), aminoácidos que tienen un metileno adicional en la cadena lateral (aminoácidos "homo") y aminoácidos en los que un grupo funcional de ácido carboxílico en la cadena lateral se sustituye con un grupo de ácido sulfónico (p. ej. ácido cisteico). Preferentemente, no obstante, los compuestos de FGF-21 de la presente invención sólo comprenden aminoácidos naturales, excepto si en la presente memoria descriptiva se proporcione específicamente lo contrario.
En la nomenclatura usada en la presente memoria descriptiva para designar los compuestos de FGF-21, los aminoácidos se identifican usando el código de tres letras o, como alternativa, usando el código estándar de una letra. Las mutaciones se designan con el código de tres letras para el aminoácido original, seguido por el número de aminoácido, seguido por el código de tres letras para el aminoácido de sustitución. Las designaciones numéricas de cada muteína se basan en la SEC ID Nº 1. Por ejemplo, una sustitución por leucina en la posición 118 (es decir, Leu118 o L118) con cisteína (Cys) se designa como Leu118Cys o L118C. De un modo similar, la sustitución doble por isoleucina en la posición 152 y serina en la posición 163 (Ile152/Ser163) con el aminoácido con carga negativa glutamato (Glu) se designa como Ile152Glu/Ser163Glu o I152E/S163E.
"Potencia in vitro", como se usa en la presente memoria descriptiva, es la medida de la captación de glucosa de una proteína de fusión de FGF.21 en un ensayo basado en células y es una medida de la potencia biológica de un compuesto de FGF-21. La potencia in vitro se expresa como la "CE_{50}", que es la concentración eficaz de compuesto que tiene como resultado el 50% de la actividad en un experimento de respuesta a una única dosis. Para los fines de la presente invención, la potencia in vitro se determina usando un ensayo de la captación de glucosa que emplea células 3T3-L1 (Ejemplo 1).
El término "semivida en plasma" se refiere al tiempo en el cual la mitad de las moléculas relevantes circulan en plasma antes de su aclaración. Un término que se usa como alternativa es "semivida de eliminación". Los términos "acción de tiempo extendido" o "acción de tiempo más prolongado" usado en el contexto de semivida en plasma o semivida de eliminación indica que existe un incremento estadísticamente significativo en la semivida de una proteína de fusión de FGF-21 respecto a la de la molécula de referencia (p. ej., la forma sin fusión del polipéptido o el polipéptido nativo), como se determina en condiciones comparables. Preferentemente, una proteína de fusión de FGF-21 de la presente invención tiene una semivida de eliminación superior o comparable a la del compuesto de FGF-21. La semivida comunicada en la presente memoria descriptiva en el Ejemplo 3 es la semivida de eliminación; es lo que corresponde a la velocidad de eliminación terminal en regresión log-lineal. Los expertos en la técnica apreciaran que la semivida es un parámetro derivado que cambia como función del aclaramiento y del volumen de distribución.
El aclaramiento es la medida de la capacidad del cuerpo para eliminar un fármaco. A medida que el aclaramiento disminuye debido a, por ejemplo, modificaciones en un fármaco, cabría esperar que la semivida aumentara. No obstante, esta relación recíproca sólo es exacta cuando no hay cambios en el volumen de distribución. Una relación aproximada útil entre la semivida terminal log-lineal (t_{1/2}), el aclaramiento (C) y el volumen de distribución (V) viene dada por la ecuación: t_{1/2} \approx 0,693 (V/C). El aclaramiento no indica cuánto fármaco se está eliminando sino el volumen de fluido biológico, como sangre o plasma, que tendría que estar completamente libre de fármaco para representar la eliminación. El aclaramiento se expresa en forma de volumen por unidad de tiempo (véase el Ejemplo 3).
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención comprenden un compuesto de FGF-21 condensadas a la porción de Fc de una inmunoglobulina, un análogo de la porción de Fc de una inmunoglobulina, albúmina humana, un análogo de la albúmina humana o un fragmento de la albúmina humana. El extremo C del compuesto de FGF-21 puede condensarse directamente, o condensarse a través del ligante peptídico, al extremo N de una albúmina o proteína Fc. Por el contrario, el extremo N del compuesto de FGF-21 puede condensarse directamente, o condensarse a través del ligante peptídico, al extremo C de una albúmina o proteína Fc. Estas proteínas de fusión heterólogas son biológicamente activas y tienen una mayor semivida en comparación con el FGF-21 nativo.
Una "muteína del FGF-21" humana se define como que comprende FG-21 humano en el que al menos un aminoácido de la proteína salvaje madura se ha sustituido por otro aminoácido. Ejemplos de muteínas de FGF-21 se describen en las solicitudes de patente de EE.UU. 60/528.582, 60/606.805, 60/606.830 y 60/635.882. En general, una muteína posee alguna propiedad modificada, estructural o funcional, de la proteína salvaje. Por ejemplo, la muteína puede haber potenciado o mejorado la estabilidad física en soluciones concentradas (p. ej., agregación mediada menos hidrófoba) mientras que mantiene un perfil de bioactividad favorable. La muteína puede poseer mayor compatibilidad con conservantes farmacéuticas (p. ej., m-cresol, fenol, alcohol bencílico), lo que permite la preparación de una formulación farmacéutica conservada que mantiene las propiedades fisioquímicas y la actividad biológica de la proteína durante el almacenamiento. La muteína puede tener una menor O-glicosilación cuando se expresa en levaduras. La muteína puede tener menos desamidación cuando se compara con el FGF-21 salvaje. Como se usa en la presente memoria descriptiva, estos términos no son limitantes, siendo completamente posible que una muteína dada tenga una o más propiedades modificadas de la proteína salvaje.
Ejemplos de muteínas de FGF-21 con estabilidad farmacéutica potenciada incluyen la sustitución con un aminoácido cargado y/o polar pero sin carga por uno o más de los siguientes: glicina 42, glutamina 54, arginina 77, alanina 81, leucina 86, fenilalanina 88, lisina 122, histidina 125, arginina 126, prolina 130, arginina 131, leucina 139, alanina145, leucina 146, isoleucina 152, alanina 154, glutamina 156, glicina 161, serina 163, glicina 170 o serina 172, en las que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº 1. Un aminoácido cargado se define como un aminoácido con carga positiva o negativa. Un aminoácido con carga positiva se define como aquel que incluye histidina, lisina, arginina y análogos no naturales de los mismos (p. ej. ácido gamma aminobutírico, ornitina etc.). Una aminoácido con carga negativa se define como aquel que incluye aspartato, glutamato y análogos no naturales de los mismos (p. ej., ácido aminoadípico). Un aminoácido polar pero sin carga se define como aquel que incluye serina, treonina, asparagina, glutamina y análogos no naturales de los mismos. Muteínas preferidas son Gln54Glu, Leu139Glu, Ala145Glu, Leu146Glu, Ile152Glu, Gln156Glu, Ser163Glu y Ile152Glu-Ser163Glu
Muteínas adicionales del FGF-21 con una estabilidad farmacéutica potenciada incluyen FGF-21 con la sustitución de una cisteína por dos o más de los siguientes: arginina 19, tirosina 20, leucina 21, tirosina 22, treonina 23, aspartato 24, aspartato 25, alanina 26, glutamina 27, glutamina 28, alanina 31, leucina 33, isoleucina 35, leucina 37, valina 41, glicina 42, glicina 43, glutamato 50, glutamina 54, leucina 58, valina 62, leucina 66, glicina 67, lisina 69, arginina 72, fenilalanina 73, glutamina 76, arginina 77, aspartato 79, glicina 80, alanina 81, leucina 82, glicina 84, serina 85, prolina 90, alanina 92, serina 94, fenilalanina 95, leucina 100, aspartato 102, tirosina 104, tirosina 107, serina 109, glutamato 110, prolina 115, histidina 117, leucina 118, prolina 119, asparagina 121, lisina 122, serina 123, prolina 124, histidina 125, arginina 126, aspartato 127, alanina 129, prolina 130, glicina 132, alanina 134, arginina 135, leucina 137, prolina 138, o leucina 139, en la que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº1.
Muteínas específicas del FGF-21 con puentes disulfuro introducidos mediante ingeniería, además del natural en Cys75-Cys93, son las siguientes: Gln76Cys-Ser109Cys, Cys75-Ser85Cys, Cys75-Ala92Cys, Phe73Cys-Cys93, Ser123Cys-His125-Cys, Asp102Cys-Tyr104Cys, Asp127Cys-Gly132Cys, Ser94Cys-Glu110Cys, Pro115Cys-His
117Cys, Asn121Cys-Asp127Cys, Leu100Cys-Asp102Cys, Phe95Cys-Tyr107Cys, Arg19Cys-Pro138Cys, Tyr20Cys-
Leu139Cys, Tyr22Cys-Leu137Cys, Arg77Cys-Asp79Cys, Pro90Cys-Ala92Cys, Glu50Cys-Lys69Cys, Thr23Cys-Asp
25Cys, Ala31Cys-Gly43Cys, Gln28Cys-Gly43Cys, Thr23Cys-Gln28Cys, Val41Cys-Leu82Cys, Leu58Cys-Va162Cys, Gln54Cys-Leu66Cys, Ile35Cys-Gly67Cys, Gly67Cys-Arg72Cys, Ile35Cys-Gly84Cys, Arg72Cys-Gly84Cys, o Arg77
Cys-Ala81Cys, en las que la numeración de los aminoácidos se basan en la SEC ID Nº1. Muteínas preferidas con puentes disulfuro introducidos mediante ingeniería son Tyr22Cys-Leu139Cys; Asp24Cys-Arg135Cys; Leu118Cys-Gly132Cys; His117Cys-Pro130Cys; His117Cys-Ala129Cys; Leu82Cys-Pro119Cys; Gly80Cys-Ala129Cys; Gly43
Cys-Pro124Cys; Gly42Cys-Arg126Cys; Gly42Cys-Pro124Cys; Gln28Cys-Pro124Cys; Gln27Cys-Ser123Cys; Ala26
Cys-Lys122Cys; o Asp25Cys-Lys122Cys. Muteínas más preferida con puentes disulfuro introducidos mediante ingeniería son Leu118Cys-Alal34Cys; Leu21Cys-Leu33Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys; Ile152Glu-Ser163Glu/Leu118Cys-Ala134Cys; y Leu118Cys-Ala134Cys/Ser167Ala.
Ejemplos de muteínas de FGF-21 humano, o un péptido del mismo biológicamente activo, con menor capacidad de O-Glicosilación cuando se expresan en levaduras en comparación con el FGF-21 humano salvaje incluyen la sustitución de cualquier aminoácido, excepto Ser o Thr por Ser 167, en combinación con la sustitución de una cisteína por dos o más de los siguientes: arginina 19, tirosina 20, leucina 21, tirosina 22, treonina 23, aspartato 24, aspartato 25, alanina 26, glutamina 27, glutamina 28, alanina 31, leucina 33, isoleucina 35, leucina 37, valina 41, glicina 42, glicina 43, glutamato 50, glutamina 54, leucina 58, valina 62, leucina 66, glicina 67, lisina 69, arginina 72, fenilalanina 73, glutamina 76, arginina 77, aspartato 79, glicina 80, alanina 81, leucina 82, glicina 84, serina 85, prolina 90, alanina 92, serina 94, fenilalanina 95, leucina 100, aspartato 102, tirosina 104, tirosina 107, serina 109, glutamato 110, prolina 115, histidina 117, leucina 118, prolina 119, asparagina 121, lisina 122, serina 123, prolina 124, histidina 125, arginina 126, aspartato 127, alanina 129, prolina 130, glicina 132, alanina 134, arginina 135, leucina 137, prolina 138, o leucina 139, en la que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº1. Las muteínas más preferidas con menor capacidad de O-glicosilación cuando se expresan en levaduras en comparación con el FGF-21 humano son Leu118Cys-Ala134Cys-Ser167Ala; Leu21Cys-Leu33Cys-Ser167Ala; Ala26Cys-Ser167Ala; o Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys-Ser167Ala.
Un compuesto de FGF-21 también incluye un "derivado de FGF-21", que se define como una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos de FGF-21 o un análogo de FGF-21, pero que además tiene una modificación química de uno o más de sus grupos laterales aminoacídicos, átomos de \alpha-carbono, grupo amino terminal o grupo terminal de ácido carboxílico. Una modificación química incluye, entre otros, añadir restos químicos, creando enlaces nuevos y eliminando restos químicos.
Entre las modificaciones en los grupos laterales de aminoácidos se incluyen, sin limitaciones, acilación de grupos lisina \varepsilon-amino, N-alquilación de arginina, histidina o lisina, alquilación de grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico y desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitaciones, las modificaciones desamino, N-alquilo menor, N-dialquilo menor y N-acilo. Entre las modificaciones del grupo carboxi terminal se incluyen, sin limitaciones, las modificaciones amida, alquilamida menor, dialquilamida o éster de alquilo menor. Además, uno o más grupos laterales o grupos terminales pueden protegerse con grupos protectores conocidos para el químico experto en proteínas. El \alpha-carbono de un aminoácido puede estar mono o dimetilado.
Las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención tienen una actividad biológica in vitro que es comparable a la del FGF-21 nativo. Aunque algunas de las proteínas de fusión de FGF-21 de la invención pueden tener actividad biológica menor que la del FGF-21 nativo medido en un ensayo concreto, esta disminución de actividad se compensa con la extendida semivida del compuesto y/o el menor valor de aclaramiento, y puede incluso ser una característica favorable para un compuesto de FGF-21 con una semivida de eliminación extendida.
Las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención pueden comprender sitios de glicosilación. La glicosilación es una modificación química en la que se añaden restos de azúcar a la proteína en sitios específicos. La glicosilación de proteínas desempeña un papel en asegurar la carga correcta, confirmación y estabilidad de la proteína en maduración y puede dirigir la proteína hacia la superficie de la célula y la secreción eventual de la proteína. Más importante es el hecho de que la glicosilación afecta a la velocidad de aclaramiento in vivo de muchas proteínas. Los azúcares pueden unirse a través de un O o de un N. Generalmente, los azúcares unidos con O se añaden al oxígeno del grupo hidroxilo de serina y treonina, mientras que los azúcares unidos con N se añaden al nitrógeno amida de asparagina. El sitio consenso para la N-glicosilación es Asn X1 X2 en la que X1 es cualquier a aminoácido a excepción de Pro y X2 es Ser o Thr.
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Proteínas de fusión Fc heterólogas
Los compuestos de FGF-21 descritos en lo que antecede se pueden condensar directamente o a través de un ligante peptídico a la porción Fc de una inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas son moléculas que contienen cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro, que normalmente tienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (V) tiene una secuencia aminoacídica variable dependiendo de la especificidad de anticuerpos de la molécula. Los otros dominios (C) tienen una secuencia bastante constante común a moléculas de la misma clase.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, la porción Fc de una inmunoglobulina tiene el significado proporcionado habitualmente al término en el campo de la inmunología. Específicamente, este término se refiere a un fragmento de anticuerpo que se obtiene eliminando las dos regiones de unión a antígeno (los fragmentos Fab) del anticuerpo. Un modo de eliminar los fragmentos Fab es digerir la inmunoglobulina con la proteasa papaína. Por tanto, la porción Fc está formada por fragmentos de aproximadamente el mismo tamaño de la región constante procedente de ambas cadenas pesadas, que se asocian mediante interacciones no covalentes y puentes disulfuro. La porción Fc puede incluir las regiones bisagra y extenderse a través de los dominios CH2 y CH3 hasta el extremo C del anticuerpo. Regiones bisagra representativas de inmunoglobulinas humanas y de ratón se pueden encontrar en Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed., W.H. Freeman y Co., 1992. La porción Fc puede además incluir uno o más sitios de glicosilación. La secuencia de aminoácidos de una proteína Fc representativa que contiene una región bisagra, dominios CH2 y CH3, y un sitio de glicosilación en la posición 82 se muestra a continuación:
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Hay cinco tipos de regiones Fc de inmunoglobulina humana con diferentes propiedades efectoras y farmacocinéticas: IgG, IgA, IgM, IgD y IgE. La IgG es la inmunoglobulina más abundante en suero. La IgG también tiene la semivida más prolongada en suero de las inmunoglobulinas (23 días). Al contrario que otras inmunoglobulinas, la IgG se recircula de forma eficiente tras la unión a un receptor de Fc. Hay cuatro subclases de IgG, G1, G2, G3 y G4, cada una de las cuales tiene diferentes efectos o funciones. Estas funciones efectoras generalmente están mediadas por la interacción con el receptor de Fc (Fc\gammaR) o mediante la unión a C1q y la fijación del complemento. La unión a Fc\gammaR puede producir citolisis mediada por células dependientes de anticuerpos, mientras que la unión a factores del complemento puede conducir a lisis celular mediada por complemento. Al diseñar las proteínas de fusión de Fc heterólogas en las que la porción Fc se está utilizando únicamente por su capacidad para extender la semivida, es importante minimizar cualquier función efectora. Todas las subclases de IgG son capaces de unirse a los receptores de Fc (CD16, CD32, CD64), siendo G1 y G3 más eficaces que G2 y G4. La región de unión al receptor de Fc de IgG está formado por los residuos localizados en las regiones bisagra y carboxi terminal del dominio CH2.
Dependiendo del efecto que se desea in vivo, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden contener cualquiera de los isotipos descritos en lo que antecede o pueden contener regiones Fc mutadas en las que el complemento y/o las funciones de unión al receptor de Fc se han alterado. Por tanto, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden contener toda la porción de Fc de una inmunoglobulina, fragmentos de la porción Fc de una inmunoglobulina, o análogos de la mismo condensados con un compuesto de FGF-21.
Las proteínas de fusión de la presente invención pueden consistir en proteínas monocatenarias o polipéptidos multicadena. Se pueden producir dos o más proteínas de fusión de Fc de modo que interaccionen a través de puentes disulfuro que se forman de modo natural entre las regiones Fc. Estos multímeros pueden ser homogéneos con respecto al compuesto de FGF-21 o pueden contener diferentes compuestos de FGF-21 condensados en el extremo N de la porción Fc de la proteína de fusión.
Con independencia de la estructura final de la proteína de fusión, la región Fc o similar a Fc debe servir para prolongar la semivida plasmática in vivo del compuesto de FGF-21 condensado en el extremo C o el extremo N. Además, el compuesto de FGF-21 condensado debe conservar alguna actividad biológica. La actividad biológica puede determinarse mediante procedimientos in vitro e in vivo conocidos en la técnica. En los ejemplos 1 u 2 se describen ensayos biológicos representativos.
Es preferible que la región Fc usada para las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención derive de una región Fc de IgG1 o IgG4. Es todavía más preferible que las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención contengan una porción Fc que deriva de IgG4 humana, pero comprende una o más sustituciones en comparación con la secuencia humana salvaje. Como se usa en la presente memoria descriptiva, la porción Fc de una inmunoglobulina tiene el significado proporcionado habitualmente al término en el campo de la inmunología. Específicamente, este término se refiere a un fragmento de anticuerpo que no contiene las dos regiones de unión al antígeno (los fragmentos Fab) del anticuerpo. La porción Fc consiste en la región constante de un anticuerpo de ambas cadenas pesadas, que se asocian a través de interacciones no covalentes y puentes disulfuro. La porción Fc puede incluir las regiones bisagra y extenderse a través de los dominios CH2 y CH3 hasta el extremo C del anticuerpo. La porción Fc puede además incluir uno o más sitios de glicosilación.
Por tanto, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención derivan de la región Fc de IgG4 humano por su capacidad reducida para unirse al Fc\gammaR y factores del complemento en comparación con los otros subtipos de IgG. La porción Fc de IgG4 humana de una inmunoglobulina condensada con un compuesto de FGF-21 de la presente invención comprende la secuencia SEC ID Nº 4.
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en la que:
Xaa en la posición 11 es Pro o Ser;
Xaa en la posición 16 es Pro o Glu;
Xaa en la posición 17 es Phe, Val, o Ala;
Xaa en la posición 18 es Leu, Glu, o Ala;
Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y
Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente.
Además, la región Fc de IgG4 que es parte de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención puede contener una o más de las sustituciones siguientes que eliminan el efecto o la función: Sustitución de prolina por serina en el residuo 228; sustitución de prolina por glutamato en el residuo 233; alanina o valina por fenilalanina en el residuo 234; y alanina o glutamato por leucina en el residuo 235 (numeración UE, Kabat, E.A. y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publicación nº 91-3242). Estos residuos corresponden a las posiciones 11, 16, 17 y 18 en la Sec ID Nº 4, respectivamente. Además, eliminar el sitio de glicosilación unido mediante N en la región Fc de IgG4 mediante la sustitución de Ala por Asn en el residuo 297 (numeración de la UE) que corresponde a la posición 80 de la SEC ID Nº 4 es otro modo de asegurar que se elimina el efecto o actividad residuo en el contexto de una proteína de fusión heteróloga.
El residuo de lisina en el extremo C presente en la molécula nativa puede eliminarse en la porción Fc derivada de IGG4 de las proteínas de fusión heterólogas que se tratan en la presente memoria descriptiva (posición 230 de la Sec ID Nº 4; la lisina eliminada se denomina des.K). Las proteínas de fusión que se expresan en algunos tipos celulares (tales como células NSO), en los que lisina está codificada por el codón en el extremo C son heterogéneas en cuanto a que una porción de las moléculas tienen lisina como aminoácido en el extremo C y una porción tienen la lisina eliminada. La deleción se debe a la acción proteasa durante la expresión en algunos tipos de células de mamífero. Por tanto, para evitar esta heterogeneidad, se prefiere que los constructos de expresión de fusión de Fc carezcan de un aminoácido en el extremo C del codón terminal de FGF para lisina.
Se prefiere que el aminoácido en el extremo C del compuesto de FGF-21 tratado en la presente memoria descriptiva esté condensado con el extremo N de la porción análoga de Fc de IgG4 a través de un ligante rico en glicina (rico en G), designado con una L, en el que el número inmediatamente precedente a la L hace referencia al número de ligantes que separa el compuesto de FGF-21 de la porción Fc. La función y estabilidad in vivo de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se pueden optimizar añadiendo los ligantes de péptido pequeño para prevenir las interacciones de dominios potencialmente indeseados. Además, un ligante rico en G proporciona alguna flexibilidad estructural de modo que el compuesto de FGF-21 pueda interaccionar de forma productiva con el receptor sobre las células diana. No obstante, estos ligantes pueden incrementar de forma significativa el riesgo de que la proteína de fusión sea inmunogénica in vivo. Por tanto, se prefiere que la longitud ya no sea necesaria para prevenir las interacciones indeseadas entre dominios y/u optimizar la actividad y/o estabilidad biológicas- Aunque se pueden usar más copias de este ligante en las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención, se prefiere usar una única copia de este ligante para minimizar el riesgo de inmunogenicidad asociada con la administración prolongada y repetida.
El compuesto de FGF-21 y la porción Fc o HSA de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se condensan juntos, preferentemente, a través de 1, 1,5 o 2 repeticiones del ligante peptídico rico en G. El ligante rico en glicina más preferido se designa 1L y comprende la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID Nº 5). Ligantes peptídicos adicionales preferidos incluyen un ligante especificado como 1,5L, Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:6); un ligante especificado como 2L, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID Nº: 7); [un ligante especificado como H1, Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys (SEC ID Nº 8); y un ligante especificado como S1, Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg (SEC ID Nº 9).] En algunos casos se pueden utilizar 3, 4, 5 o incluso 6 repeticiones del ligante peptídico rico en G.
En las proteínas de fusión heterólogas que se indican más adelante, IgG4 se refiere a un análogo de la secuencia de Fc de IgG4 humana especificada como SEc ID Nº 4. Las sustituciones en la porción Fc de IgG2 de la proteína de fusión heteróloga se indican entre paréntesis. El aminoácido salvaje se especifica con su abreviatura común, seguida por el número de posición en el contexto de toda la secuencia de IgG4 usando el sistema de numeración de la UE, seguido por el aminoácido que se está sustituyendo en la posición especificada por su abreviatura común.
Proteínas de fusión heterólogas de Fc-FGF-21 preferidas de la presente invención incluyen las siguientes proteínas: I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P), I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P, N297A), I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P, F234A,
L235A, N297A), I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P), I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P, N297A), I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P), I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P, N297A), y I152E/S163E/L118C/
A134C-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A).
Proteínas de fusión heterólogas de Fc-FGF-21 más preferidas de la presente invención incluyen las siguientes proteínas: L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P), L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P, N297A), L118C/A134C-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P), L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P, N297A), L118C/A134C-1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P), L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P, N297A), y L118C/A134C-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A).
Proteínas de fusión heterólogas de Fc-FGF-21 todavía más preferidas de la presente invención incluyen las proteínas siguientes: L118C/A134C/S167A-1L-IgG4 (S228P); L118C/A134C/S167A -1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), L118C/A134C/S167A -1L-IgG4 (S228P, N297A), L118C/A134C/S167A -1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), L118C/A134C/S167A -1,5L-IgG4 (S228P), L118C/A134C/S167A -1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), L118C/
A134C/S167A -1,5L-IgG4 (S228P, N297A), L118C/A134C/S167A 1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), L118C/A134C/S167A -2L-IgG4 (S228P), L118C/A134C/S167A -2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), L118C/A134C/
S167A-2L-IgG4 (S228P, N297A) y L118C/A134C/S167A 2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A).
Debe entenderse que las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención incluyen compuestos de FGF-21 que están acoplados a cualquier proteína de albúmina, incluidos fragmentos, análogos y derivados, en la que tal proteína de fusión es biológicamente activa y tiene una semivida en plasma más prolongada que el compuesto de FGF-21 solo. Se conocen o se pueden generar fragmentos, análogos y derivados que tienen semividas más prolongadas o que tienen semividas intermedias con respecto a la de la albúmina humana nativa y el compuesto de FGF-21 de
interés.
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención abarcan proteínas que tienen sustituciones conservadoras de aminoácidos en el compuesto de FGF-21 y/o la porción Fc de la proteína de fusión. Una "sustitución conservadora" es la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene la misma carga electrónica neta y aproximadamente el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticos alifáticas o sustituidas tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus cadenas laterales difiere en no más de aproximadamente cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramas en sus cadenas laterales difiere en no más de uno. Se considera que los aminoácidos con grupos fenil o fenil sustituidos en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el mismo tamaño y forma. Excepto si en la presente memoria descriptiva se proporciona específicamente de otro modo, las sustituciones conservadoras se efectúan, preferentemente, con aminoácidos naturales.
Como se ha indicado en lo que antecede, las sustituciones de aminoácidos en las proteínas de fusión de la presente invención se pueden basar en la similitud relativa de los sustituyentes en la cadena lateral de aminoácidos, tamaño etc. Además, las sustituciones se pueden realizar sobre la base de la propensión a la estructura secundaria. Por ejemplo, un aminoácido helicoidal puede sustituirse con un aminoácido que conserve la estructura helicoidal. Ejemplos de sustituciones que tienen en cuanta varias de las características anteriores con el fin de producir cambios conservadores de aminoácidos que tienen como resultado cambios silentes dentro de los presentes péptidos etc. se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido natural. Los aminoácidos se pueden dividir en los cuatro grupos siguientes: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos neutros polares; y (4) aminoácidos neutros apolares.
Los compuestos de FGF-21 de la presente invención pueden generarse y/o aislarse por cualquier medio conocido en la técnica. Debido al tamaño de las proteínas de fusión se prefieren procedimientos recombinantes tales como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989).
Se pueden emplear varios procedimientos de purificación proteica y tales procedimientos se conocen y se describen en la técnica en, por ejemplo, Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán de, por ejemplo, la naturaleza del procedimiento de producción usado para el FGF-21.
Las proteínas IgG4 humanas salvajes se pueden obtener de diversas fuentes. Por ejemplo, estas proteínas se pueden obtener de una biblioteca de ADNc preparada a partir de células que expresan el ARNm de interés a un nivel detectable. Las bibliotecas se pueden someter a detección selectiva con sondas diseñadas usando el ADN publicado o la secuencia de proteínas para la proteína de interés concreta. Por ejemplo, las regiones constantes de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina se describen en Adams y col. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, y col. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby, y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031; Rice y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862-7862; Falkner, y col. (1982) Nature 298:286-288; y Morrison, y col. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256.
La detección selectiva de una biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede realizarse usando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Un medio alternativo para aislar un gen que codifica una proteína inmunoglobulina es usar la metodología PCR [Sambrook y col., ant.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. Los cebadores para PCR se pueden diseñar sobre la base de secuencias publicadas.
Generalmente, las secuencias salvajes de longitud completa clonadas a partir de una biblioteca concreta pueden servir como molde para crear los fragmentos análogos de la Fc de IgG4 de la presente invención que conservan la capacidad para conferir una semivida en plasma más larga al compuesto de FGF-21 que es parte de la proteína de fusión.
Los fragmentos análogos de la Fc de IgG4 se pueden generar usando técnicas de PCR con cebadores diseñados para hibridar con las secuencias correspondientes a los extremos diseñados del fragmento. También se pueden diseñar cebadores para PCR para crear sitios para la enzima de restricción para facilitar la clonación en los vectores de expresión.
Después se puede construir el gen codificador de una proteína de fusión ligando el ADN que codifica un compuesto de FGF-21 en el mismo marco con el ADN que codifica las proteínas de Fc de IgG descritas en la presente memoria descriptiva. El ADN que codifica el compuesto de FGF-21 y los fragmentos de Fc de IgG4 puede ser mutado antes de la unión o dentro del contexto de un ADNc codificador de una proteína de fusión completa. En la técnica se conocen bien diversas técnicas de mutagénesis. El gen que codifica el compuesto de FGF-21 y el gen que codifica la proteína análoga
de Fc de IgG4 también se pueden unir en el marco a través de un ADN que codifica un péptido ligante rico en G.
Los compuestos de FGF-21 tienen diversas actividades biológicas. El FGF-21 es particularmente prometedor como tratamiento de la diabetes mellitus no insulina dependiente (DMNID, tipo 2), ya que no supone riesgo de hipoglucemia como los actuales tratamientos para la DMNID. El FGF-21 también se contempla como tratamiento de la obesidad y del síndrome metabólico.
También se considera que un uso de las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención incluye el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2, la obesidad y el síndrome metabólico. Las proteínas de fusión de FGF-21 se pueden combinar con otras modificaciones conocidas en la técnica para incrementar la semivida del FGF-21 y, de este modo, incrementar la semivida del compuesto todavía más que una proteína de fusión sola o el otro procedimiento de modificación solo.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, el "compuesto de FGF-21" también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos que se describen en la presente memoria descriptiva. Un compuesto de FGF-21 de esta invención puede poseer grupos funcionales suficientemente ácidos, suficientemente básicos o ambos, y, de acuerdo con esto reaccionar con cualquiera de un número de bases inorgánicas, y ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal.
Las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención son particularmente adecuadas para administración parenteral, pueden también administrarse por vía oral, mediante administración nasal o mediante inhalación.
La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, administración sistémica tal como inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea o intraperitoneal.
Las proteínas de fusión de FGF-21 pueden administrarse al sujeto junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutico aceptable como parte de una composición farmacéutica para tratar las enfermedades que se han comentado en lo que antecede. La composición farmacéutica puede ser una solución o, si se administra por vía parenteral, una suspensión del FGF-21. Los vehículos farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes que no interaccionan con el péptido o derivado peptídico. Pueden emplearse técnicas de formulación farmacéutica estándar tales como las que se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Entre los vehículos farmacéuticos adecuados para administración parenteral se incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución fisiológica salina, solución salina bacteriostática (solución salina que contiene 0,9% mg/ml de alcohol bencílico), solución salina tamponada con fosfato, solución de Hank, Ringer lactato y similares. Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol y manitol.
Las proteínas de fusión de FGF-21 de la invención pueden formularse para administración de modo que los niveles en plasma sanguíneo se mantienen dentro del intervalo eficaz durante prolongados periodos de tiempo.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una proteína de fusión de FGF-21 es la cantidad que tiene como resultado un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado sin causar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de los siguientes: 1) una mitigación de el(los) síntoma(s)
asociado(s) con la enfermedad o dolencia; 2) un retraso en el inicio de los síntomas asociados con la enfermedad o dolencia; 3) aumento de longevidad en comparación con la ausencia del tratamiento; y 4) mayor calidad de vida en comparación con la ausencia de tratamiento. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" de una proteína de fusión de FGF-21 para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 es la cantidad que tendría como resultado un mayor control de la concentración de glucosa en sangre que en ausencia de tratamiento, lo que tiene como resultado un retraso en el inicio de complicaciones diabéticas tales como retinopatía, neuropatía o nefropatía. Una "cantidad eficaz" de una proteína de fusión de FGF-21 para la prevención de la diabetes es la cantidad que retrasaría, en comparación con la ausencia de tratamiento, el inicio de niveles elevados de glucosa en sangre que requieren tratamiento con fármacos anti-hipoglucémicos tales como sulfonilureas, tiazolidinodionas, insulina y/o bisguanidinas. Además, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de la proteína de fusión de FGF-21 administrada a un sujeto también dependerá del tipo y gravedad de la enfermedad y de las características del sujeto, tal como estado de salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a los fármacos.
Los expertos en la técnica pueden optimizar fácilmente las dosis farmacéuticamente eficaces y los regímenes de administración para las composiciones terapéuticas, que comprenden una proteína de fusión de FGF-21, según lo determine la buena práctica médica y la afección clínica del paciente individual. U intervalo de dosis típico para las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención variará de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal. Preferentemente, la dosis varía de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Más preferentemente, la dosis es de aproximadamente 1-5 mg/kg de peso corporal. La dosis adecuada de una proteína de fusión de FGF-21 administrada tendrá como resultado la disminución de los niveles de glucosa en sangre y el incremento del gasto de energía mediante la utilización más rápida y más eficiente de la glucosa y, por tanto, es útil para tratar la diabetes de tipo 2, la obesidad y el síndrome metabólico. La frecuencia de la dosis se determina con la razón semivida plasmática/aclaramiento de la proteína de fusión de FGF-21. Preferentemente, la administración de la dosis será aproximadamente cada 2 días. Más preferentemente, la administración de la dosis será de aproximadamente dos veces a la semana. Incluso más preferentemente, la administración de la dosis será de aproximadamente una vez a la semana. Más preferentemente, la administración de la dosis será de aproximadamente dos veces al mes.
Habiendo descrito la presente invención con detalle, la misma se entenderá claramente con referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen en la presente con fines ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes de la invención.
Preparación 1
Expresión y purificación de una proteína de fusión de FGF-21 en células HEK293EBNA
Como alternativa, las proteínas de fusión de FGF-21 se producen en un sistema de expresión de células de mamíferos usando células HEK293EBNA (Edge Biosystems, Gaiethersburg, MD). Las proteínas de fusión de FGF-21 se subclonan en el vector de expresión patentado que representa una modificación del pEAK10 disponible comercialmente, entre los sitios de restricción NheI y XbaI en el MCS. La secuencia de ADNc que codifica una proteína de fusión de FGF-21 se condensa INFRAME con la secuencia líder lg\kappa para potencial la secreción del producto deseado en el medio de cultivo tisular. La expresión está dirigida por el fuerte promotor viral del CMV. Las células HEK293EBNA son transfeccionadas transitoriamente usando un reactivo de transfección estándar tal como Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis IN, EE.UU.) y la cantidad adecuada del plásmido recombinante, bien como una monocapa o como cultivo de suspensión, a la adecuada densidad celular. Las células se incuban a 37ºC y 5% de CO_{2}, en medio sin suero, y las recolecciones se realizan todos los días durante 5 días. Normalmente, el nivel de expresión en el cultivo de suspensión HEK293EBNA es -30 mg/l. La expresión de una proteína de fusión de FGF-21 en células de mamífero da la secuencia natural en el extremo N, HPIP, es decir sin un residuo de metionina en el extremo N.
Para purificar una proteína de fusión de FGF-21 de las células HEK293EBNA, el sobrenadante concentrado del cultivo celular se carga en una columna de 5 ml HiTrap rProtein A FF (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) equilibrada en PBS a pH 7,4, y las proteínas eluyen con ácido cítrico 50 mM, a pH 3,3. Las fracciones se neutralizan inmediatamente con Tris y NaOH 0,5M. El grupo de la fracción se concentra con dispositivos de filtro Millipore 30K Amicon ultra centrifugal (UFC903024) y se cargan en una columna 26/60 Superdex 200 (Amersham Bioscience AB, Uppsala, Suecia) equilibrada en PBS, a pH 7,4. Las fracciones se analizan mediante SDS PAGE, se agrupan y se concentran mediante dispositivos de filtro Millipore 30K Amicon ultra centrifugal y filtros esterilizados usando un filtro de 0,22 \mum MILLEX-GV (Millipore SLGVR25CS). La concentración final se determina mediante la absorbancia a 280 nm (corregida por dispersión). Para confirmar la proteína se usan MALDI y secuencia del extremo N.
Para purificar una proteína de fusión de HSA FGF-21 de células HEK293EBNA, el sobrenadante concentrado del cultivo celular se carga en una columna autoempaquetada de 20 ml FF Q Sepharose equilibrada en Tris 20 mM, a pH 7,5. La proteína eluye usando un gradiente lineal de NaCl a 0-500 mM, las fracciones adecuadas se agrupan, se añade acetonitrilo con TFA 0,1% hasta una concentración final del 20% y el material se carga en una columna Vydac proteica C4 10x 250 mm (nº cat. 214TP510) equilibrada con TFA 0,1% en agua. La proteína se eluye usando un gradiente lineal de 20 a 50% de acetonitrilo. El grupo de la fracción se concentra con dispositivos de filtro Millipore 30K Amicon ultra centrifugal (UFC903024) y se carga en una columna 26/60 Superdex 200 (Amersham Bioscience AB, Uppsala, Suecia) equilibrada en PBS, a pH 7,4. Las fracciones se analizan mediante SDS PAGE, se agrupan, se concentran y se esterilizan mediante filtración. La concentración final se determina mediante la absorbancia a 280 nm (corregida por dispersión). Para confirmar la proteína se usan MALDI y secuencia del extremo N.
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Preparación 2
Expresión de una proteína de fusión de FGF-21 en levaduras
Otro sistema más de expresión para la producción de una proteína de fusión de FGF-21 es una levadura, tal como Pichia pastoris, Pichia methanolica o Saccharomyces cerevisiae. Para la producción en Pichia pastoris, un sistema comercialmente disponible (Invitrogen, Carlsbad, CA) usa vectores con los potentes promotores AOX1 (alcohol oxidasa) para dirigir la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes. Como alternativa, los vectores que usan el promotor del gen GAP (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) están disponibles para la expresión constitutiva de alto nivel. Los vectores de expresión multicopia de Pichia permiten obtener cepas con múltiples copias del gen de interés integrado en el genoma. El incremento del número de copias del gen de interés en una cepa recombinante de Pichia puede incrementar los niveles de expresión proteica.
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Ejemplo 1 Captación de glucosa en adipocitos de ratón 3T3-L1
Las células 3T3-L1 se obtienen de la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD). Las células se cultivan en medio de crecimiento (MC) que contiene 10% de suero bovino fetal enriquecido con hierro en medio Eagle modificado de Dulbecco. Para la diferenciación de adipocitos estándar, dos días después de que las células alcanzaran la confluencia (denominado día 0), las células se exponen a medio de diferenciación (MD) que contiene 10% de suero bovino fetal, 10 \mug/ml de insulina, dexametasona 1 \muM e isobutilmetilxantina 0,5 \muM durante 48 horas. Después, las células se mantienen en pos-diferenciación que contiene 10% de suero bovino fetal y 10 \mug/ml de insulina.
Ensayo de transporte de glucosa- La captación de hexosa, analizado mediante la acumulación de 2-desoxi-D-[^{14}C] glucosa 0,1 mM se mide del siguiente modo: Los adipocitos 3T3-L1 en placas de 12 pocillos se lavan dos veces con tampón KRP (NaCl 136 mM, KCl 4,7 mM, NaPO_{4} 10 mM, CaCl_{2} 0,9 mM, MgSO_{4} 0,9 mM, pH 7,4) calentado hasta 37ºC y que contiene 0,2% de BSA, se incuban en medio de Leibovitz L-15 que contiene 0,2% de BSA durante 2 horas a 37ºC a aire ambiente, se lavan dos veces de nuevo con KRP que contiene 0,2% de tampón BSA y se incuban en KRP, 0,2% de tampón BSA en ausencia (únicamente Me_{2}SO) o presencia de wortmanina durante 30 minutos a 37ºC a aire ambiente. A continuación se añade insulina hasta una concentración final de 100 nM durante 15 min y la captación de 2-D-desoxi-D-[^{14}C]glucosa se mide durante los últimos 4 minutos. La captación inespecífica, medida en presencia de citocalasina B 10 \muM, se resta de todos los valores. Las concentraciones proteicas se determinan con el ensayo de ácido bicinconínico de Pierce. La captación se mide de forma rutinaria por triplicado o cuadruplicado para cada experimento.
La potencia in vitro (CE_{50}) se compara con la actividad in vitro del FGF-21 salvaje. La potencia in vitro de las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención se compara con el FGF-21 salvaje en la Tabla 1. Como se indica en la Tabla 1, las proteínas de fusión de FGF-21 de la presente invención tienen menor potencia in vitro hasta varios grados en comparación con el FGF-21 salvaje. No obstante, es probable que la disminución de la potencia in vitro se compense con el incremento de la extensión de tiempo (semivida en plasma) de la proteína de fusión de
FGF-21.
TABLA 1 
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7 
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Ejemplo 2 Análisis in vivo de proteínas de fusión de FGF-21-Fc en el modelo de ratón Oblob
El modelo de ratón Ob/ob es un modelo animal para hiperglucemia, resistencia a insulina y obesidad. Los ratones ob/ob macho se usan para monitorizar los niveles plasmáticos de glucosa y de triglicéridos tras tratamiento con proteínas de fusión de FGF-21 en comparación con el FGF-21 solo. Los grupos de prueba de ratones ob/ob macho (7 semanas de edad) son: (1) vehículo control sc (NaCl 0,9%, 0,1 ml/ratón) durante siete días; (2) FGF-21, 11 \mug/día, administrados mediante infusión continua durante siete días (bombas Alzet 1007D, 100 mcl, 0,5 mcl/h); (3) proteína de fusión de FGF-21-Fc, 2,55 nM, administrados el día 0 únicamente; (4) proteína de fusión de FGF-21-Fc, 1,5 nM, administrados el día 0 únicamente.; (5) proteína de fusión de FGF-21-Fc, 0,5 nM, administrados el día 0 únicamente. La proteína de fusión de FGF-21-Fc se administra s.c en 0,1 ml.
Los niveles de glucosa en sangre se miden a diario durante 7 días, 1 hora después de la dosis, usando un protocolo estándar. El tiempo de acción extendido de las proteínas de fusión de FGF-21-Fc está indicado en la Tabla 2, en la que una dosis única el día 0 disminuye los niveles de glucosa en sangre durante 6 días.
TABLA 2
8
En otro experimento, los ratones ob/ob macho se usan para monitorizar los niveles de glucosa en plasma tras un tratamiento único con una proteína de fusión de FGF-21 condensada con un péptido ligante en comparación con la infusión continua del FGF-21 solo. Los grupos de prueba de ratones ob/ob macho (7 semanas de edad) son: (1) vehículo control (NaCl 0,9%) mediante infusión continua durante siete días (bombas Alzet 1007D, 100 mcl, 0,5 mcl/h); (2) FGF-21, 3,4 nM mediante infusión continua durante siete días; (3) proteína de fusión FGF-21-L-Fc, 3,4 nM; administrad s.c. en 0,1 ml sólo el día 0; y (4) proteína de fusión Fc-L-FGF-21, 3,4 nM administrada s.c. en 0,1 ml sólo el día 0; (5) proteína de fusión FGF-21-L-HSA, 3,4 nM administrada s.c. en 0,1 ml sólo el día 0. L es el péptido ligante, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_{3}, en las proteínas de fusión anteriores.
A los animales de los grupos (1) y (2) se les administra la dosis mediante infusión continua durante 7 días y a los grupos (3) a (5) se les administra la dosis sólo el día 0. Los niveles de glucosa en sangre se miden a diario durante 7 días, 1 hora después de la dosis, usando un protocolo estándar. El tiempo de acción extendido superior de las proteínas de fusión de FGF-21 se demuestra en la Tabla 3, en la que una dosis única el día 0 disminuye los niveles de glucosa en sangre durante 7 días.
Además, los niveles de triglicéridos en plasma se miden el día 7 del experimento. El tiempo de acción extendido superior de las proteínas de fusión de FGF-21 se demuestra en la Tabla 4, en la que una dosis única el día 0 disminuye los niveles de triglicéridos en plasma durante 7 días.
TABLA 3
9
TABLA 4
11
Ejemplo 3 Análisis farmacocinético de las proteínas de fusión FGF-21
Las proteínas de fusión de FGF-21 se administran a ratones CD-1por vías intravenosa (IV) o subcutánea (SC) a una dosis de 0,4 mg/kg. Se extrae sangre de los animales a varios tiempos entre 0 y 336 horas después de la administración de la dosis. El plasma se recoge de cada muestra y se analiza mediante radioinmunoensayo. Los parámetros farmacocinéticos se calculan usando procedimientos dependientes (datos IV) e independientes (datos SC) de modelo (WinNonlin Pro) y se indican en la Tabla 5 más adelante. Mediante administración IV, la proteína de fusión de FGF-21-Fc tiene una semivida de eliminación de aproximadamente 53,9 horas en comparación con una semivida de eliminación de 0,5 horas para FGF-21 nativo. Mediante administración SC, la proteína de fusión de FGF-21-Fc tiene una semivida de eliminación de aproximadamente 24 horas en comparación con una semivida de eliminación de 0,6 horas para el FGF-21 nativo. Mediante ambas vías de administración, la proteína de fusión de FGF-21-Fc demuestra un tiempo de acción prolongada cuando se compara con el FGF-21 nativo
Mediante administración IV, la proteína de fusión de FGF-21-HSA tiene una semivida de eliminación de aproximadamente 14,3 horas en comparación con una semivida de eliminación de 0,5 horas para FGF-21 nativo. Mediante administración SC, la proteína de fusión de FGF-21-HSA tiene una semivida de eliminación de aproximadamente 8 horas en comparación con una semivida de eliminación de 0,6 horas para el FGF-21 nativo. Mediante ambas vías de administración, la proteína de fusión de FGF-21-HSA demuestra un tiempo de acción prolongada cuando se compara con el FGF-21 nativo.
TABLA 5 
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12 
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<110> Eli Lilly & Company
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<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE FGF-21
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<130> x16740
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<150> US 60.570.908
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<151> 2007-05-13
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
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<170> PatentIn version 3.2
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<210> 1
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip1cm14 
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<210> 2
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<211> 543
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<400> 2
\hskip1cm15 
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<210> 3
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<211> 232
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm16
\hskip1cm17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 230
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (11)..(11)
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<223> Xaa en la posición 11 = Pro o Ser
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (16)..(16)
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<223> Xaa en la posición 16 = Pro o Glu
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (17)..(17)
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<223> Xaa en la posición 18 = Phe, Val, o Ala;
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (18)..(18)
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<223> Xaa en la posición 18 = Leu, Glu o Ala;
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(80)
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<223> Xaa en la posición 80 = Asn o Ala
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (230)..(230)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 230 = Lys o está ausente,
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<400> 4
\hskip1cm18 
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<210> 5
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm19 
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<210> 6
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<211> 22
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm20 
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm24
\hskip1cm25
\hskip1cm26

Claims (10)

1. Una proteína de fusión heteróloga que comprende un primer polipéptido con un extremo N y un extremo C condensado con un segundo polipéptido con un extremo N y un extremo C, en la que el primer polipéptido es un compuesto de FGF-21 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº 4:.
27
en la que:
Xaa en la posición 11 es Pro;
Xaa en la posición 16 es Pro o Glu;
Xaa en la posición 17 es Phe, Val, o Ala;
Xaa en la posición 18 es Leu, Glu, o Ala;
Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y
Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente,
y en la que
(i) el extremo C del primer polipéptido está condensado con el extremo N del segundo polipéptido a través de un ligante, o
(ii) en el que el extremo N del primer polipéptido está condensado con el extremo C del segundo péptido a través de un ligante, en el que el ligante en (i) o (ii) se selecciona de:
a)
SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 o SEC ID Nº: 9;
b)
un péptido rico en glicina.
2. Una proteína de fusión heteróloga de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionada de: FGF21-L118C/A134C/
S167A-1L-IgG4 S228P; FGF21-L118C/A134C/S167A-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-L118C/A134C/
S167A -1L-IgG4 S228P, N297A; FGF21-L118C/A134C/S167A-1-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; FGF21-L118C/A134C/S167A-1,5LIgG4 S228P; FGF21-L118C/A134C/S167A-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-L118C/A134C/S167A-1,5LIgG4 S228P, N297A; FGF21-L118C/A134C/S167A-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; FGF21-L118C/A134C/S167A-2L-IgG4 S228P; FGF21-L118C/A134C/S167A-2L-IgG4 S228P, F234A,
L235A; FGF21-L118C/A134C/S167A-2L-IgG4 S228P, N297A; y FGF21-L118C/A134C/S167A-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A.
3. Una proteína de fusión heteróloga de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionada de: FGF21-L118C/A134C-1L-IgG4 S228P; FGF21-L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, N297A; FGF21-L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; FGF21-L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P; FGF21-L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, N297A; FGF21-L18C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; FGF21-L118C/A134C-2L-IgG4 S228P; FGF21-L118C/
A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, N297A; y FGF21-L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A.
4. Una proteína de fusión heteróloga de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionada de: FGF21-I152E/S163E/
L118C/A134C-1L-IgG4 S228P; FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-I152
E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, N297A; FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-1L-IgG4 S228P, F234A,
L235A, N297A; FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P; FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-1,5L-IgG4 S228P, N297A; FGF21-I152E/S163E/
L118C/A134C-1,5LIgG4 S228P, F234A, L235A, N297A; FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P;
FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A; FGFZ1-I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, N297A; y FGF21-I152E/S163E/L118C/A134C-2L-IgG4 S228P, F234A, L235A, N297A.
5. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.
7. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.
8. Una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de un paciente que exhibe una o más de obesidad, diabetes de tipo 2 o síndrome metabólico, que comprende los siguientes:
(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y
(b) un transportador farmacéutico aceptable.
9. Una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para usar como medicamento.
10. Una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para usar en el tratamiento de obesidad, diabetes de tipo 2 o síndrome metabólico.
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