CN111195349B - 一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体来说涉及一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，该制剂包括FGF21‑Fc融合蛋白，保护剂，缓冲剂，增溶剂；本发明还对该制剂的制备方法特别是冻干工艺进行优化，得到稳定的FGF21‑Fc融合蛋白冻干制剂。本发明制备的冻干制剂辅料少，进一步降低了临床用药的安全隐患，所得制剂外形饱满，质地均匀，复溶迅速，水分含量低于1％，稳定性好，方便储存和运输。

Description

一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂
技术领域
本发明属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体涉及一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂。
背景技术
成纤维细胞生长因子是在发育中的组织和成体组织中表达的多肽。存在超过20种成纤维细胞生长因子的整个家族(FGF家族)。FGF家族的三个成员(包括FGF19、FGF21和FGF23)构成了一个亚家族，起着充当内分泌因子参与代谢调节的作用。成纤维细胞生长因子21或FGF-21，分子量为19.5KDa，由181个氨基酸组成，且与鼠源FGF21有75％同源性。FGF21是细胞代谢的一种调节因子，在体内和体外展现多种有利的影响，比如抑制肝葡萄糖生成，刺激脂肪组织葡萄糖摄取，增加褐色脂肪组织产热，保护胰岛素质量和胰岛素水平且无促有丝分裂效应和其他副作用。FGF21可作为胰岛素和GLP-1类似物的替代物，是治疗II型糖尿病药物中极具前景的一种。
长期的研究和临床实践表明FGF21和其他蛋白药物一样，存在稳定性差，储存期短等缺点，影响其治疗效果。专利CN107088224A公开了一种人FGF21冻干制剂，稳定性有所提高，制剂含水量较高，制剂在37℃下放置3个月，活性和纯度发生明显的变化，不能从根本上解决FGF21长期储存稳定性差的问题。
天然FGF21很难被开发成临床治疗用生物制剂，主要原因包括：1、FGF21蛋白稳定性差，易受蛋白酶水解或酶促降解；2、天然FGF21构象非常不稳定，易发生聚集，低稳定性同时也增加了FGF21在大规模生产中的难度；3、天然FGF21半衰期非常短，人FGF21在小鼠体内半衰期只有0.5-1小时，在食蟹猴体内半衰期2-3小时。多种蛋白长效化技术被报道用于延长重组FGF21的体内半衰期。例如，专利WO2005091944，WO2006050247，WO2008121563、WO2012066075公开了FGF21与PEG分子链接，增加分子量，降低肾小球滤过率，延长体内滞留时间；WO2010084169和WO2012010553公开了FGF21与脂肪酸长链融合(能够结合血清蛋白)；WO2011071783、WO2011130417，WO2012158704，WO2012170438公开了能与FGFR/FGFR/β-klotho复合物特异性的结合的激动剂抗体模拟FGF21作用机制，来激活FGF/FGFR信号通路；WO2004110472，WO2005113606，WO2009149171等公开了通过与Fc片段融合来改善FGF半衰期。
在蛋白药物长效化技术领域，Fc融合技术运用最广泛，因为他具有更小的临床副作用(例如，不易诱发过敏反应或因半衰期延长而加剧药物的毒性作用)。开发FGF21-Fc长效融合蛋白药物关键在于以下几点：其一、能否保持FGF21的生物学活性。FGF21的C-末端含有β-Klotho的结合位点，因而Fc融合于FGF21C-末端会使其活性大幅降低，而融合在N-末端能最大程度地保留它与β-Klotho的结合亲和力。故现有技术中Fc片段大多融合与FGF21N-末端(Fc-FGF21)；其二，融合Fc后能显著改善FGF21的药动学特性，有效延长其半衰期以满足临床上每周两次甚至每周一次给药的用药需求；因FGF21的C-末端还含有蛋白酶水解位点，极易发生降解，其水解代谢物的体外活性下降近200倍。据Fc-FGF21药代动力学研究结果显示，其半衰期改善并不显著，这是因为融合蛋白中FGF21的C末端暴露，不能被Fc保护，因而易受蛋白酶攻击而发生降解。其三、如何降低接头序列或引入突变位点诱发免疫反应发生的风险；其四、融合Fc和/或引入突变位点是否可以改善FGF21的稳定性及其在高浓缩状态下的易聚合性。所以，理想的FGF21-Fc融合蛋白，一方面FGF21C-末端的抗蛋白酶水解能力增强，并且获得显著延长的半衰期；再一方面，FGF21C-末端与β-Klotho的结合亲和力不会因Fc的位阻效应而明显下降，导致其活性大幅度下降；同时，融合配体及连接肽的引入还不增加其免疫源性，且还能改善其稳定性。
FGF21-Fc融合蛋白克服了野生型FGF21相关的生理学不稳定性的显著障碍。但重组人FGF21-Fc融合蛋白有容易聚集的倾向。对于重组人FGF21-Fc融合蛋白的制剂鲜有报道，因此，需要开发一种FGF21-Fc融合蛋白的制剂来满足临床用药需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种代谢调节融合蛋白的冻干制剂，该制剂配方简单，蛋白体系稳定，便于大规模生产、贮存和运输，临床给药方便。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种注射用重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，包括重组FGF21-Fc融合蛋白、保护剂、增溶剂、缓冲剂。
优选地，所述保护剂可选自糖、氨基酸、醇、盐类，进一步优选所述保护剂选自蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸和EDTA-二钠中的一种或几种；更加优选地，所述保护剂为甘露醇、蔗糖或海藻糖。
优选地，所述的增溶剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80，更加优选地，所述增溶剂为聚山梨酯80。
优选地，所述的缓冲剂选自Tris/盐酸组氨酸缓冲体系或Tris/盐酸缓冲体系，所述缓冲体系的pH优选为7.5～8.5。
在一个优选的实施方案中，一种注射用重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，包括如下组分：
FGF21-Fc融合蛋白 20～50mg/ml
保护剂 50～300mM
增溶剂 0.02～0.06％(W/V)
缓冲剂 10～50mM
pH 7.5～8.5
本发明所述药物组合物包含治疗有效量的重组人FGF21-Fc融合蛋白和选择适于给药方式的药学上或生理学上可接受的辅料。可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性。本发明的处方筛选过程如下：
缓冲体系的筛选：
结合重组人FGF21-Fc融合蛋白分子特性，蛋白制剂工艺常用的缓冲体系进行筛选，制剂配方及检测结果分别见表1。将重组人FGF21-Fc融合蛋白溶解在缓冲体系中，逐渐升温测定蛋白溶液的熔化温度Tm值。结果见表2。
表1、重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂缓冲体系筛选
Figure BDA0001867972160000031
表2、不同缓冲体系的重组人FGF21-Fc融合蛋白的Tm值结果
Figure BDA0001867972160000032
Figure BDA0001867972160000041
Tm值表示蛋白热转变中点温度，对于多结构域蛋白可以有多个Tm值，它是蛋白质热稳定性的重要指标，上移代表了稳定性的增强，可以用来评估聚体的形成趋势。Tm onset是去折叠起始的温度。由表2结果可知，Tris/盐酸组氨酸和Tris/盐酸缓冲体系的Tm值较高，Tm值较高表明该缓冲体系下，FGF21-Fc融合蛋白比较稳定。因此我们选择Tris/盐酸或Tris/组氨酸作为本发明的缓冲体系。
缓冲体系pH的筛选：
我们将不同pH的Tris/盐酸作为缓冲体系，分别测定体系的Tm值。配方和测定结果分别见表3、表4。
表3重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂缓冲体系pH筛选
Figure BDA0001867972160000042
表4、不同pHTris/盐酸的重组人FGF21-Fc融合蛋白的Tm值结果
T<sub>m onset</sub>/℃ T<sub>m1</sub>/℃ T<sub>m2</sub>/℃
处方7 35.90 57.83 72.74
处方8 37.10 58.54 73.41
处方9 38.24 59.66 74.19
处方10 38.48 59.70 74.55
从表4可以看出，随着缓冲体系pH的增大，蛋白溶液的Tm值也增大，但是pH8.5的Tris/盐酸缓冲溶液与pH9.0相比，Tm值增大有限，考虑人体耐受pH，我们选择优选pH7.5～8.5的缓冲体系。
保护剂的筛选：
我们选择将蔗糖，海藻糖，山梨醇，甘露醇以及甘露醇分别与蛋氨酸或EDTA-二钠的组合物作为保护剂，筛选重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂最为合适的辅料。蛋氨酸或EDTA-二钠的加入量以质量体积百分比计，制剂配方及检测结果分别见表5、表6。
表5、重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂辅料配方筛选
Figure BDA0001867972160000051
将上述配方配制成溶液后，放置于2～8℃和25±2℃环境下4周，分别于第0周，第1周、第2周和第4周取样，采用SEC-HPLC检测其中聚体含量。结果见表6。
表6、各处方重组人FGF21-Fc融合蛋白的SEC-HPLC聚体结果
Figure BDA0001867972160000052
Figure BDA0001867972160000061
由表6结果可见，各处方分别在2～8℃和25±2℃放置4周后，处方15-16分别加入甘露醇与蛋氨酸或EDTA-二钠的组合作为保护剂，聚体含量与处方14相比并没有降低，从制剂的安全性考虑，辅料成分加入越少临床用药越相对安全，因此我们不优选甘露醇与蛋氨酸或EDTA-二钠组合作为保护剂。处方11～13在2～8℃放置四周后聚体含量与处方14相比差别不大，但在25±2℃条件下放置4周后处方13聚体含量明显增大。处方11～12和14分别采用蔗糖、海藻糖与甘露醇作为保护剂，与其他处方相比，聚体含量明显降低，稳定性高。从保护剂成本及蛋白制剂稳定性来考虑，我们优选甘露醇、蔗糖或海藻糖作为保护剂；更加优选地，选择甘露醇或蔗糖作为保护剂。
本发明采用甘露醇或蔗糖作为保护剂，既可以作为制剂的赋性剂还可以作为蛋白稳定剂，包围在蛋白周围，使大分子物质的运动受阻，维持蛋白质分子的空间结构，阻止蛋白分子的沉淀，从而增加蛋白的稳定性。
增溶剂的筛选：
分别选择聚山梨酯20和聚山梨酯80作为增溶剂，聚山梨酯的加入量为0.02～0.08％(W/V)，考察不同含量的增溶剂对重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂的影响。制剂配方见表7。
表7、重组人FGF21-Fc融合蛋白制剂增溶剂筛选
Figure BDA0001867972160000062
Figure BDA0001867972160000071
按照上述处方配制成FGF21-Fc融合蛋白溶液，检测各处方的MFI结果。将上述配方中的重组FGF21-Fc融合蛋白溶液进行反复冻融(-80℃至室温解冻)3次和反复冻融6次试验，分别检测MFI结果，检测结果见表8。
表8、重组人FGF21-Fc融合蛋白的MFI结果
Figure BDA0001867972160000072
从表8结果可以看出，处方17不加表面活性剂的MFI检测颗粒会明显增多，处方18和19为分别加入相同含量的聚山梨酯20和聚山梨酯80，然而处方19的不溶性微粒数明显少于处方18的不溶性微粒数，因此我们优选聚山梨酯80作为增溶剂。处方19～22是分别加入不同含量的聚山梨酯80，结果显示聚山梨酯80含量为0.02～0.08％时，随着增溶剂用量的增加，制剂不溶性微粒减少，但是当聚山梨酯80含量为0.08％时，不溶性微粒降低有限，因此我们优选0.02～0.06％聚山梨酯80为增溶剂。
本发明中加入增溶剂聚山梨酯80为非离子表面活性剂，在一定剂量范围内能减少制剂中的抗体的聚集、颗粒在制剂中的形成及吸附，优选0.02％～0.06％的聚山梨酯80。
在一个优选的实施方案中，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂，包括如下组分：
FGF21-Fc融合蛋白 20～50mg/ml
保护剂 50～300mM
聚山梨酯80 0.02～0.06％(W/V)
缓冲剂 10～50mM
pH 7.5～8.5
进一步优选地，所述保护剂为甘露醇或蔗糖，所述缓冲剂为Tris盐酸缓冲体系或Tris盐酸组氨酸缓冲体系。
更加优选地，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂，包括如下组分：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
甘露醇或蔗糖 100～300mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20～50mM
pH 8.0
进一步地优选，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂，包括如下组分：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
甘露醇或蔗糖 225mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.0
本发明的另一方面还提供了一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的制备方法，该方法具体包括如下步骤：
称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸或盐酸组氨酸调整pH，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的保护剂，增溶剂和重组人FGF21-Fc融合蛋白加入到Tris缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、冻干。
本发明所提供的一种FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的配方选用常用的辅料，辅料种类少，制剂成本低，经过本发明优化的制剂配方所得制剂产品的水分含量低，采用同样的冻干工艺，不同的制剂配方，所得冻干制剂的水分含量明显不同，本发明所述的配方水分含量低于其他配方制剂的水分含量。
发明人在实验中进一步发现，制剂的水分含量对制剂的稳定性有重大影响，为此发明人对冻干工艺进行了优化来进一步降低冻干制剂的水分含量。
本发明另一方面还提供一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的冻干工艺，包括冷冻控制、一次干燥和解析干燥三个步骤；具体来说包括如下步骤：
(1)冷冻控制：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白的西林瓶置于冻干机隔板上，5℃预冻，维持15～60min，再降温至-45～-40℃，维持2～6h进行冷冻；
(2)一次干燥：将隔板体系温度升温至-20～-15℃，维持40～50h，再升温至0～5℃，维持8～10h，完成一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板体系温度升温至20～30℃，维持8～10h进行解析干燥，完成冻干工艺。
优选地，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的冻干工艺，具体来说包括以下步骤：
(1)冷冻控制：将装入重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于隔板上设定温度5℃保持15～60min，然后再将隔板温度设定为-45～-40℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持2～6h，冷冻控制步骤结束；
(2)一次干燥：在极限真空条件下对体系进行一次干燥，设定隔板温度为-20～-15℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持40～50h，然后再将隔板温度设定为0～5℃，设定时间30～40min达到预设温度并维持8～10h，完成第一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板温度设定为20～30℃，设定时间40～60min达到预设温度，进行解析干燥，并维持8～10h完成冻干工艺。
试验中发明人意外发现，冷冻步骤中增加退火步骤，并将退火温度控制在-30～-25℃时，维持1～3h，再将隔板温度降低至冷冻温度，可明显降低冻干制剂的水分含量。
更加优选地，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的冻干工艺，具体来说包括以下步骤：(1)冷冻控制：将装入重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于隔板上设定温度5℃保持15～60min，然后再将隔板温度设定为-45～-40℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持2～6h，再将隔板温度设定为-30～-25℃，设定时间30～40min达到预设温度，维持1～3h，最后将隔板温度恢复设定为-45～-40℃，设定时间30～40min达到预设温度，维持2～3h，冷冻控制步骤结束；
(2)一次干燥：在极限真空条件下对体系进行一次干燥，设定隔板温度为-20～-15℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持40～50h，然后再将隔板温度设定为0～5℃，设定时间30～40min达到预设温度并维持8～10h，完成第一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板温度设定为20～30℃，设定时间40～60min达到设定温度，箱体压力在0.1～0.2mbar条件下解析干燥8～10h完成冻干工艺。
在一个实施方案中，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的冻干工艺如下：
Figure BDA0001867972160000091
Figure BDA0001867972160000101
在另一个实施方案中，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的冻干工艺如下：
Figure BDA0001867972160000102
在另一个实施方案中，一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的冻干工艺如下：
Figure BDA0001867972160000103
经过本发明的冻干工艺，可使得FGF21-Fc融合蛋白冻干粉的水分含量控制在1％以下，保证了FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂的长期储存的稳定性。
本发明通过对缓冲液，保护剂，增溶剂含量的优化选择较优处方后进行冻干工艺的优化，最终提供了一种适用于皮下给药的冻干粉制剂。其在储存期间能保持稳定性，具有较低的聚体及片段化。本发明的适用于皮下注射的融合蛋白的冻干粉制剂能够有效的运用于治疗糖尿病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病和代谢综合症中。本发明在优化制剂配方的同时，进一步对冻干工艺进行改进，得到一种配方简单，冻干制剂水分含量低，稳定性好的重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂。
本发明重组FGF21-Fc融合蛋白冻干制剂辅料少，进一步为降低了临床用药的安全隐患，所得重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂水分含量低，稳定性好，外形饱满，质地均匀，复溶迅速，其pH、澄清度与颜色、纯度，无菌等多项指标均符合质量标准并优于现有技术。本发明FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂制备工艺简单、适于放大，且能够保证质量稳定可控，干燥效果好，产品水分含量低，方便储存和运输。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，所列案例只是制剂筛选试验的部分，并不能因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中稳定性试验，相关生物学检验按照中国药典的规范进行。实施例中所述的试剂均为药用级，均可通过商业途径获得。
实施例1
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
蔗糖 250mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸组氨酸 20mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸组氨酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，蔗糖和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/盐酸组氨酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照下表所述的表9的冻干程序冻干。
表9实施例1冻干程序
Figure BDA0001867972160000111
Figure BDA0001867972160000121
实施例2
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 30mg/ml
海藻糖 50mM
聚山梨酯80 0.04％(W/V)
Tris/盐酸 10mM
pH 8.5
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.5，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，海藻糖和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表10的冻干程序冻干。
表10实施例2冻干程序
Figure BDA0001867972160000122
实施例3
配方：
Figure BDA0001867972160000123
Figure BDA0001867972160000131
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸组氨酸调整pH至7.5，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，甘露醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表11所述冻干程序冻干。
表11实施例3冻干程序
Figure BDA0001867972160000132
实施例4
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 30mg/ml
甘露醇 100mM
聚山梨酯80 0.06％(W/V)
Tris/盐酸 50mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，甘露醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表12所述冻干程序冻干。
表12实施例4冻干程序
Figure BDA0001867972160000133
Figure BDA0001867972160000141
实施例5
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
甘露醇 225mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，甘露醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表13所述冻干程序冻干。
表13实施例5冻干程序
Figure BDA0001867972160000142
实施例6
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 20mg/ml
甘露醇 150mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，甘露醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表14所述冻干程序冻干。
表14实施例6冻干程序
Figure BDA0001867972160000151
对比实施例1
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
山梨醇 250mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，山梨醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表13所述冻干程序冻干。
对比实施例2：
配方：
Figure BDA0001867972160000152
Figure BDA0001867972160000161
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，甘露醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表15所述的冻干程序冻干。
表15对比实施例2冻干程序
Figure BDA0001867972160000162
对比实施例3：
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
右旋糖酐 225mM
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，右旋糖酐和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表16所述的冻干程序冻干。
表16对比实施例3冻干程序
Figure BDA0001867972160000171
对比实施例4
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
甘露醇 250mM
精氨酸 1％(W/V)
聚山梨酯20 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.5
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯20，甘露醇、精氨酸和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表17所述冻干程序冻干。
表17对比实施例4冻干程序
Figure BDA0001867972160000172
Figure BDA0001867972160000181
对比实施例5
配方：
FGF21-Fc融合蛋白 50mg/ml
蔗糖 250mM
EDTA-二钠 0.03％(W/V)
聚山梨酯80 0.02％(W/V)
Tris/盐酸 20mM
pH 8.0
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，EDTA-二钠、蔗糖和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照表18所述冻干程序冻干。
表18对比实施例5冻干程序
Figure BDA0001867972160000182
对比实施例6
配方：
Figure BDA0001867972160000183
Figure BDA0001867972160000191
制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的聚山梨酯80，甘露醇和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris-盐酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装、按照下述冻干条件冻干既得。
冻干条件：
将西林瓶置于隔板上2小时，其室温和隔板温度为-40℃，膛内压力排空至70mTorr，随后隔板温度以2.5℃/min的速率从-40℃升至-20℃，并维持此温度30小时进行第一次干燥。第一次干燥结束时，隔板温度以0.3℃/min从-20℃升至24℃，并维持此温度2小时做第二次干燥。第二次干燥完成后，膛室内回填干燥的氮气，然后加塞。最后西林瓶用铝盖进行密封。
对比实施例7
配方：
Figure BDA0001867972160000192
制备工艺：将FGF21-Fc融合蛋白用20mM，pH7.4PB缓冲液透析，随后4℃离心浓缩到6mg/ml；再将上述处方辅料用20mM PB缓冲液溶解混合，将pH调至7.4，再定容使其浓度为终浓度的两倍得辅料储液。然后将FGF21-Fc融合蛋白溶液和辅料储液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；并且蛋白溶液和辅料储液以1∶1得比例混合，使得蛋白浓度为3mg/ml，混匀后，量取1ml溶液置于5ml西林瓶中，在2～8℃条件进行。西林瓶半塞橡胶塞置于冻干机中按照表19冻干程序冻干。
表19对比实施例7冻干程序
Figure BDA0001867972160000193
Figure BDA0001867972160000201
对比实施例8
配方：
Figure BDA0001867972160000202
制备工艺：将FGF21-Fc融合蛋白用20mM，pH7.4PB缓冲液透析，随后4℃离心浓缩到6mg/ml；再将上述处方辅料用20mM PB缓冲液溶解混合，将pH调至7.4，再定容使其浓度为终浓度的两倍得辅料储液。然后将FGF21-Fc融合蛋白溶液和辅料储液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；并且蛋白溶液和辅料储液以1∶1得比例混合，使得蛋白浓度为3mg/ml，混匀后，量取1ml溶液置于5ml西林瓶中，在2～8℃条件进行。西林瓶半塞橡胶塞置于冻干机中按照下述冻干条件冻干。
冻干条件：
将西林瓶置于隔板上2小时，其室温和隔板温度为-40℃，膛内压力排空至70mTorr，随后隔板温度以2.5℃/min的速率从-40℃升至-20℃，并维持此温度30小时进行第一次干燥。第一次干燥结束时，隔板温度以0.3℃/min从-20℃升至24℃，并维持此温度2小时做第二次干燥。第二次干燥完成后，膛室内回填干燥的氮气，然后加塞。最后西林瓶用铝盖进行密封。
验证实施例
稳定性试验
分别按照实施例1-6及对比实施例1-8制备样品，各取200瓶，采用加速稳定性试验和长期试验考察贮存稳定性。加速试验在25℃±2℃的条件下进行，时间为12个月。所用设备能控制温度±2℃，并对实际温度进行监测。在试验期间第0个月、3个月、6个月、12个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。长期试验在2～8℃的条件下进行，分别于0个月、3个月、6个月、12个月、24个月末按稳定性重点考察项目进行检测；(其中纯度检查按照《2015版中国药典》通则0514分子排组色谱法和通则0542毛细管电泳法测定，活性按照基于生物发光的报告基因法确定)；水分含量测定采用梅特勒-扎利多DL37卡尔费休滴定仪按照《2015版中国药典》第三部通则中规定的库伦法来测定。结果见表20、表21。
表20 2～8℃长期稳定性试验结果
Figure BDA0001867972160000211
Figure BDA0001867972160000221
Figure BDA0001867972160000231
表21、25±2℃加速稳定性试验结果
Figure BDA0001867972160000232
Figure BDA0001867972160000241
Figure BDA0001867972160000251

Claims (7)

1.一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下组分：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述的保护剂为甘露醇、蔗糖或海藻糖；
所述的缓冲剂为Tris/盐酸缓冲体系或Tris/盐酸组氨酸缓冲体系；
所述的增溶剂为聚山梨酯80；
所述冻干制剂经过如下的冻干工艺制备：
(1)冷冻控制：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白的西林瓶置于冻干机隔板上，5℃预冻，维持15～60min，再降温至-45～-40℃，维持2～6h进行冷冻；
(2)一次干燥：将隔板体系温度升温至-20～-15℃，维持40～50h，再升温至0～5℃，维持8～10h，完成一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板体系温度升温至20～30℃，维持8～10h进行解析干燥，完成冻干工艺。
2.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，缓冲体系的pH为7.5～8.5。
3.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，缓冲体系的pH为8.0。
4.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下组分：
Figure 322029DEST_PATH_IMAGE002
。
5.根据权利要求1所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下步骤：
(1)冷冻控制：将装入重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于隔板上设定温度5℃保持15～60min，然后再将隔板温度设定为-45～-40℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持2～6h，冷冻控制步骤结束；
(2)一次干燥：在极限真空条件下对体系进行一次干燥，设定隔板温度为-20～-15℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持40～50h，然后再将隔板温度设定为0～5℃，设定时间30～40min达到预设温度并维持8～10h，完成第一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板温度设定为20～30℃，设定时间40～60min达到预设温度，进行解析干燥，并维持8～10h完成冻干工艺。
6.根据权利要求5所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下步骤：
(1)冷冻控制：将装入重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于隔板上设定温度5℃保持15～60min，然后再将隔板温度设定为-45～-40℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持2～6h，再将隔板温度设定为-30～-25℃，设定时间30～40min达到预设温度，维持1～3h，最后将隔板温度恢复设定为-45～-40℃，设定时间30～40min达到预设温度，维持2～3h，冷冻控制步骤结束；
(2)一次干燥：在极限真空条件下对体系进行一次干燥，设定隔板温度为-20～-15℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持40～50h，然后再将隔板温度设定为0～5℃，设定时间30～40min达到预设温度并维持8～10h，完成第一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板温度设定为20～30℃，设定时间40～60min达到设定温度，箱体压力在0.1～0.2mbar条件下解析干燥8～10h完成冻干工艺。
7.根据权利要求6所述的一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，包括如下步骤：
(1)冷冻控制：将装入重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于隔板上设定温度5℃保持15～60min，然后再将隔板温度设定为-45℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持2～6h，再将隔板温度设定为-30～-25℃，设定时间30～40min达到预设温度，维持1～3h，最后将隔板温度恢复设定为-45℃，设定时间30～40min达到预设温度，维持2～3h，冷冻控制步骤结束；
(2)一次干燥：在极限真空条件下对体系进行一次干燥，设定隔板温度为-20℃，设定时间40～60min达到预设温度，并维持40～50h，然后再将隔板温度设定为0℃，设定时间30～40min达到预设温度并维持8～10h，完成第一次干燥；
(3)解析干燥：将隔板温度设定为25℃，设定时间40～60min达到设定温度，箱体压力在0.1～0.2mbar条件下解析干燥8～10h完成冻干工艺。
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Assignor: Anyuan Pharmaceutical Technology (Shanghai) Co.,Ltd.

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Denomination of invention: A freeze-dried powder preparation of fusion protein for metabolic regulation

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