CN107088224B

CN107088224B - 人fgf21冻干制剂

Info

Publication number: CN107088224B
Application number: CN201710074149.8A
Authority: CN
Inventors: 王晓杰; 李校堃; 惠琦; 余丙洁
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: CN107088224A

Abstract

本发明提供了人FGF21的冷冻干燥(冻干)制剂，其包括人FGF21和辅料，其中辅料包括海藻糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和/或泊洛沙姆。

Description

人FGF21冻干制剂

技术领域

本发明属于蛋白质或多肽药物技术领域，具体而言，本发明涉及人FGF21的冷冻干燥(冻干)制剂。

技术背景

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的一员，与FGF19和FGF23同属于一个亚家族，分子量为19.5KDa，由181个氨基酸组成，且与鼠源FGF21有75％同源性。FGF21是细胞代谢的一种调节因子，在体内和体外展现多种有利的影响，比如抑制肝葡萄糖生成，刺激脂肪组织葡萄糖摄取，增加褐色脂肪组织产热，保护胰岛质量和胰岛素水平且无促有丝分裂效应或其他副作用。FGF21可作为胰岛素和GLP1类似物的替代物，是治疗II型糖尿病药物中极具前景的一种。

然而，长期的研究和临床实践表明FGF21和其他蛋白药物一样，存在稳定性差、贮藏期短等缺点，影响其治疗效果(Wen-Bing Y,Gui-Ping R,Yang H,et al.Expression andpharmacological evaluation of fusion protein FGF21-L-Fc[J].Acta PharmaceuticaSinica,2011,46(7):787-792)。

本发明人没有在现有技术的困难面前退缩，经过艰苦努力，从大量研究中发明了一种人FGF21的冻干制剂，其在冻干和储存过程中尽可能地对FGF21起到保护作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供可行的人FGF21冻干制剂，其包括人FGF21和辅料，其中辅料包括海藻糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和/或泊洛沙姆。其中优选泊洛沙姆是泊洛沙姆188。

优选在本发明的制剂中，人FGF21和海藻糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和泊洛沙姆的重量比为0.1-1.0：1.8-3.2：1.8-4.2：4.8-5.2：0.08-0.62：0.04-0.06：0.08-0.12。

也优选本发明的制剂包括人FGF21、海藻糖、甘露醇、精氨酸、和泊洛沙姆。更优选其中，人FGF21、海藻糖、甘露醇、精氨酸和泊洛沙姆的重量比为0.1-1.0：1.8-2.2：3.8-4.2：0.08-0.12：0.08-0.12。

也优选本发明的制剂包括人FGF21、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、和泊洛沙姆。更优选其中，人FGF21、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和泊洛沙姆的重量比为0.1-1.0：1.8-2.2：1.8-2.2：0.04-0.06：0.08-0.12。

另外优选本发明的制剂还含有水，其中水含量低于5％(w/w)，如低于4％(w/w)，优选为1-3％(w/w)。

另外也优选本发明的制剂还含有pH调节剂，优选含有磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。更优选其中，人FGF21、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的重量比为0.1-1.0：2.2-2.4：0.4-0.6。优选本发明的制剂的pH为7.2-7.5，优选为7.4。

还优选本发明的制剂由人FGF21、水、pH调节剂和选自海藻糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和泊洛沙姆的一种或多种辅料组成。例如，本发明的制剂可以由人FGF21、水、pH调节剂和海藻糖、甘露醇、精氨酸和泊洛沙姆组成。又如，本发明的制剂可以由人FGF21、水、pH调节剂和海藻糖、甘露醇、甘氨酸和泊洛沙姆组成。

本发明具有以下有益效果：获得的优选配方含水量、Tg指标优异，稳定性强，在4℃储存期间，FGF21的活性、纯度和聚合率几乎没有改变，对冷冻干燥引起FGF21二级结构变化的保护作用大，再水化保留更多的天然二级结构和活性等。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了不同配方中FGF21的FSD和拟合光谱，其中，A-D)配方1-4中FGF21冻干样品的红外光谱；E)空白对照(无辅料FGF21冻干样品)的光谱红外。叠加实线代表傅里叶自去卷积(红色)光谱和曲线拟合光谱(黑色)，虚线代表曲线拟合的各个子峰。

图2显示了稳定性试验的活性和纯度结果，其中，A)37℃冻干样品的活性；B)4℃冻干样品的活性；C)37℃样品的纯度；D)4℃冻干样品的活性；“*”，0.01<P<0.05；“**”,0.001<P<0.01；“***”,P<0.001。

图3显示了稳定性试验的SDS-PAGE电泳结果，其中，1-5泳道依次代表空白对照(无辅料FGF21冻干样品)和配方1-4的FGF21冻干样品。电泳蛋白标准品从上到下分子量依次是：97.2、66.4、44.3、29.0、20.1和14.3Kd.A)第0个月FGF21冻干样品；B)第1个月37℃的FGF21冻干样品；C)第2个月37℃的FGF21冻干样品；D)第3个月37℃的FGF21冻干样品；E)第1个月4℃的FGF21冻干样品；C)第2个月4℃的FGF21冻干样品；D)第3个月4℃的FGF21冻干样品。

图4显示了不同配方置于37℃3个月后FGF21聚合率的变化，其中，“*”，0.01<P<0.05；“**”,0.001<P<0.01；“***”,P<0.001。

具体实施方式

1.实验仪器和材料

1.1实验仪器

pH计：上海精密科学仪器有限公司SNB-4型酸度计

CO₂培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司BB15

电子分析天平：上海方瑞仪器有限公司FA2204

冻干机：上海东富龙20

多功能酶标仪：美国MD SpectraMax M3

渗透压仪：美国Advanced Fiske 110

水分测定仪：Mettler DL37

电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司DRP-9052

红外光谱测定仪：美国Nicolet Magna 560ESP

差示扫描量热仪：美国TA DSC Q-600

电泳仪、凝胶成像仪：Bio-Rad公司

高效液相：Agilent 1200

立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂YXQ-LS-70A

1.2实验试剂

FGF21及其标准品：浙江格鲁斯特生物科技有限公司

泊洛沙姆188：BASF SE

海藻糖：日本林源

精氨酸：无锡晶海氨基酸有限公司

甘氨酸：天津天药制药有限公司

山梨醇和甘露醇：Sigma公司

GOD-POD试剂盒：长春汇林生物技术有限公司

胎牛血清：Sigma公司

RPI-1640基础培养基：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司

三抗：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司

胰酶(含EDTA)：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司

1.3主要溶液

非还原性SDS-PAGE电泳所需的溶液

1)凝胶贮液

丙烯酰胺 29.2g

甲叉双丙烯酰胺 0.8g

定容至1000ml，过滤，4℃保存

2)1.5M Tris-HCl pH8.8

Tris-base 18.15g

80ml水溶解后调pH至8.8，然后定容至100ml，4℃保存

3)1.0M Tris-HCl pH6.8

Tris-base 12.1g

60ml水溶解后调pH至6.8，然后定容至100ml，4℃保存

4)10％AP(过硫酸胺)：AP 0.1g，溶于1ml重蒸水中，4℃保存

5)10％SDS：SDS 10g，定容至100ml，室温保存

6)凝胶配方：

7)4×非还原上样缓冲液(non-reducing loading buffer)

加超纯水溶解定容至100ml，室温储存

8)1×电泳缓冲液

Tris-base 3.02g

甘氨酸 18.9g

SDS 1.0g

定容至1000ml，4℃保存

9)染色液

考马斯亮蓝 1.0g

甲醇 400ml

冰乙酸 100ml

定容至1000ml，室温保存

脱色液

甲醇 400ml

冰乙酸 100ml

定容至1000ml，室温保存

HL7702细胞培养基

1)完全培养基

FBS 15％

三抗 1％

加入RPMI-1640基础培养基至规定体积，4℃保存

2)饥饿培养基

FBS 0.5％

三抗 1％

加入RPMI-1640基础培养基至规定体积，4℃保存

3)PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)：

用蒸馏水加至1000ml，经121℃、15min高压灭菌

PB缓冲液(20mM，pH 7.4)：

磷酸氢二钠 1.15g

磷酸二氢钠 0.23g

用蒸馏水加至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌。

SEC-HPLC流动相：

NaCl 0.585g

用20mM PB缓冲液(pH7.4)加至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌，超声除气。

2实验方法

2.1冻干配方的初步筛选

我们选择了甘氨酸，精氨酸，甘露醇，山梨醇，泊洛沙姆188和海藻糖6种辅料，设计了4种L9(3⁴)正交表(表1和表2)。然后根据正交表的配方，制备相应的冻干制剂，以FGF21活性和纯度为指标，每个处方检测4个样品，通过极差分析和方差分析筛选出4种最优组合。

表1正交试验的辅料

表2辅料的不同浓度水平

2.1.1冻干制剂的制备

2.1.1.1冻干制剂溶液的配制

1)FGF21用20mM，pH7.4PB缓冲液透析，随后4℃离心浓缩到6mg/ml。

2)根据设计的处方制备辅料储液：4种辅料用20mM PB缓冲液溶解混合，将pH调至7.4，再定容使其浓度为终浓度的两倍。

3)然后蛋白溶液和辅料储液用0.22μm无菌PVDF滤器进行过滤。

4)蛋白溶液和辅料储液以1:1的比例混合，使蛋白浓度为3mg/ml。

5)混匀后，量取1ml溶液置于5ml西林瓶中，在2-8℃条件进行。

6)西林瓶半塞橡胶塞置于冻干机进行冻干

2.1.1.2冻干条件

1)冻干西林瓶装入1ml蛋白溶液。

2)西林瓶置于搁板上2小时，其室温和搁板温度为-40度。

3)膛内压力排空至70mTorr，随后搁板温度以2.5℃/min的速率从-40℃升至-20℃，并维持此温度30小时进行第一次干燥。

4)第一次干燥结束时，搁板温度以0.3℃/min从-20℃升至24℃，并维持此温度2小时做第二次干燥。

5)第二次干燥完成后，膛室内回填干燥的氮气，然后加塞。最后西林瓶用铝盖进行密封。

2.1.2正交试验

冻干制剂制备完成后，立即检测FGF21的活性和纯度。我们利用FGF21具有促进HL7702细胞对葡萄糖的吸收作用的能力，通过GOP-POD法来检测其生物活性；利用非还原性SDS-PAGE电泳检测其纯度。

GOP-POD法的原理：依据Trinder反应原理，葡萄糖被葡萄糖氧化酶(GOD)催化生成葡萄糖酸和过氧化氢；而后过氧化氢被过氧化物酶(POD)催化，从而色原物质(4-氨基安替比林)变成醌亚胺，此时葡萄糖浓度与颜色的深浅呈正比。

2.1.2.1活性检测

1)细胞培养：HL-7702(人肝细胞)用含15％FBS的RPMI 1640完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养条件下培养。

2)细胞接种：HL-7702细胞用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，取足量处于对数生长期的HL-7702细胞，用0.25％胰酶-EDTA消化并收集细胞计数，随后用完全培养液将细胞浓度调至1.6×10⁵个细胞/ml，再接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。24小时后换含0.5％FBS的RPMI 1640维持培养液(即饥饿培养基)每孔100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。

3)给药：弃去96孔板中旧的维持液，每孔再加入90ul新的维持培养液。FGF21冻干样品和标准品用饥饿培养基溶解，并稀释至800μg/ml，然后吸取30ul加入给药孔中，做4倍系列梯度稀释，6个浓度梯度(分别为200、50、12.5、3.125、0.78125和0.1953125μg/ml)，每个浓度做2个孔，稀释后，于37℃、5％二氧化碳条件下培养48小时。

4)葡萄糖含量检测：取新的一块96孔细胞培养板每孔加入葡萄糖试剂盒(GOD-POD)配置的葡萄糖显色液200μl，加入对应孔的HL-7702细胞上清培养液4μl，37℃、5％二氧化碳孵育15分钟，混匀后，放入酶标仪，于波长510nm处测定吸光度，记录检测结果。

5)FGF21活性计算：通过公式1计算FGF21生物活性

Ps(IU/mg)＝Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

公式1

Pr:FGF21标准品的活性，IU/mg；Ps：样品的活性；Dr：FGF21标准品的预稀释倍数；Ds：样品的预稀释倍数；Er：FGF21标准品达到其ED50时的稀释倍数；Es：样品达到其ED50时的稀释倍数。

2.1.2.2非还原性SDS-PAGE电泳

1)制胶：根据配方配制15％的分离胶，待分离胶聚合凝固后(约0.5h)，吸去上面的水层，再灌入5％浓缩胶，立即将样品梳插上，避免气泡出现。

2)样品处理：FGF21冻干粉用蒸馏水溶解，再稀释至取800μg/ml，然后吸取90μl加入30μl4×非还原上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟。

3)上样：待浓缩胶聚合凝固后立即拔出样品梳，将电泳槽的前后槽注满电泳缓冲液，于加样孔中加入30μl处理好的样品和10μl蛋白Marker。

4)电泳：接通电源，先80V恒压(约20min)，至待检样品进入分离胶后，将电压调至120V，直至溴酚蓝至胶底部，停止电泳。

5)染色：将电泳后的凝胶取下，浸入考马斯亮蓝染液中，在摇床上染色2h左右。

6)脱色：将凝胶自染色液中取出，浸入脱色液中，摇床上脱色30min换一次脱色液，重复操作3次，再置于水中脱至凝胶底色至无色为止。

7)最后所得凝胶用Bio-Rad凝胶成像仪扫描，并用Quantity one软件进行相应的条带分析，计算纯度。

2.2冻干配方的评估

将通过正交试验初步筛选出的4种冻干配方，再通过下面几项实验检测对其作进一步评估。

2.2.1水分含量测定

测量原理：梅特勒-托利多DL37卡尔费休滴定仪采用库仑法测定水分含量。当依据卡尔费休方法测定水分含量时，在有甲醇(CH₃OH)和碱(RN)存在时，水会按照下列化学反应式与碘(I₂)和二氧化硫(SO₂)进行化学反应。

H₂O+I₂+SO₂+CH₃OH+3RN→[RNH]SO₄CH₃+2[RNH]I (1)

2I^-→I2+2e (2)

当双针头铂电池在阳极液中检测一丝额外的碘时，则碘的生成立即停止，表示所有的水分完全被反应。根据法拉弟定律碘的生成与产生的电流成正比，就可以通过计算电量的消耗得到总的水含量，仪器就能自动得出结果。

操作方法：

1)溃夜：打开电源开关，界面选择手动→滴定→溃夜。

2)返回界面，选择KF，点击开始。仪器预热30min以上，至基线平衡即漂移值<50，才开始标定。

3)标定：点击标定，微量取样器吸取10μl蒸馏水，从注射口注入，并按Enter确认。重复标定3次，标定值需在3mg/ml～5.6mg/ml范围内。

4)称样：用电子分析天平，称取0.1g左右冻干粉。

5)测量：点击开始测定，立即将样品从加样口注入，搅拌90s，输入样品质量，并按Enter确认。每个配方测量3次。

6)记录结果。

2.2.2渗透压测定

1)校准：将仪器电源打开，预热30min。当仪器呈现“Osmometer Ready”状态时，即可按下[CALIB]键进行校准，再待“50mOsm Calibration”字样出现，立即用50mOsm校准液进行校准。最后屏幕显示“Calibration Complete”时则表示校准结束。

2)冻干样品加入1ml注射用水复溶，用20μl吸液管吸取待测样品加入到取样试管，使之完全处于试管底部。随后将盛有样品的试管小心地放置到样品阱中，再将测试探头完全地插入取样试管。最后按下[TEST]键，开始测试。每个配方检测3次。

3)大约90s待测试结束后，记录实验数值。

4)提高测试探针使之处于抬升的状态，随后取出取样试管扔掉；同时用探针清洁器将残留在探针上的样品清除。

2.2.3玻璃化转变温度(Tg)测定

冻干样品的玻璃化转变温度用差示扫描量热仪检测。待冻干样品制备完成后，立即精确称取大约5-10mg样品转入铝锅并密封。空铝锅作为空白对照。铝锅以5℃/min的线性的加热速率将温度从-40℃加热至80℃^[38]。最后启动DSC系统，记录并保存升温过程中的热流曲线和数据。热流曲线用TA Universal Analysis 2000软件分析，确定玻璃化转变温度。每个处方，独立分析3个样品

2.2.4傅里叶变换红外光谱检测

实验分为2个大组：空白组(不加保护剂)，实验组。待冻干样品制备完成后，立即取适量的冻干样品(大约200μg蛋白)与500mg的KBr缓慢混合研磨，然后转入不锈钢模具压成颗粒。用Nicolet Magna 560ESP光谱仪记录红外光谱，每一个光谱为256扫描干涉图，分辨率为4cm^-1，检测范围为4000-1000cm^-1。

所有光谱用OMNIC 8.0软件进行自动水汽校正，并进行基线校正。用二阶导数，傅里叶自去卷积和曲线拟合方法进行分析[39-46]。冻干样品中FGF21不同二级结构的比例变化通过各自指定峰与酰胺I带中所有有效峰的峰面积比的变化加以评估[39-41]。每个处方，独立分析3个样品。

2.2.5稳定性试验

将4种配方的冻干样品置于4℃和37℃。在不同的时间点(0,1,2和3月)，检测FGF21活性和纯度。同时在第0月和第3个月通过SEC-HPLC检测FGF21的聚合程度。每个处方，每次检测3个样品，以平均值和标准差统计。

2.2.5.1活性和纯度检测：步骤同前面。

2.2.5.2 SEC-HPLC检测

色谱柱：TSKgel G2000SW_xL

流动相：0.01M NaCl，pH7.4，20mM PB缓冲液

流速：0.8ml/min，

柱温：25℃，

上样量：30μl，

检测波长：280nm

洗脱方式：等度

洗脱方法：先用蒸馏水冲洗洗柱子1h，再用流动相平衡柱子30min以上，

最后进样用流动相等度洗脱25min。

3结果

3.1正交试验结果

正交试验的数据用SPSS 18.0软件分析。每个实验因素对实验指标的影响大小和显著水平分别用极差分析和方差分析的方法加以确定。P<0.01(**)为高度显著，0.01<P<0.05(*)为一般显著，P>0.05(—)为无显著。

3.1.1正交试验Ⅰ的结果

表3所示的是正交试验Ⅰ的极差和方差分析结果，从各因素的P值、极差和均值可以看出：就活性而言，泊洛沙姆188(0.01<P<0.05)对其影响一般显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是泊洛沙姆188>精氨酸>甘露醇>海藻糖。海藻糖的浓度水平2>1>3，甘露醇的浓度应选择水平1>3>2，精氨酸的浓度应选择水平2>1>3，泊洛沙姆188的浓度应选择水平3>1>2。同时就纯度而言，泊洛沙姆188(P<0.01)对其影响高度显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是泊洛沙姆188>精氨酸>甘露醇>海藻糖。海藻糖的浓度应选水平1>3>2，甘露醇的浓度应选择水平3>2>1，精氨酸的浓度应选择水平3>1>2，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>2>3。

我们综合活性和纯度的分析结果，再考虑其他地方如成本等，得出正交试验Ⅰ的最优组合为：海藻糖水平1、甘露醇水平3、精氨酸水平1和泊洛沙姆188水平1，即2％海藻糖、4％甘露醇、0.1％精氨酸和0.1％泊洛沙姆188。

表3正交试验Ⅰ的极差和方差分析结果

3.1.2正交试验Ⅱ的结果

表4所示的是正交试验Ⅱ的极差和方差分析结果，从各因素的P值、极差和均值可以看出：就活性而言，泊洛沙姆188(0.01<P<0.05)和甘氨酸(0.01<P<0.05)对其影响一般显著，海藻糖(P<0.01)对其高度显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是海藻糖>泊洛沙姆188>甘氨酸>甘露醇。海藻糖的浓度水平1>3>2，甘露醇的浓度应选择水平2>1>3，甘氨酸的浓度应选择水平1>2＝3，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>2>3。同时就纯度而言，甘氨酸(0.01<P<0.05)对其影响一般显著，海藻糖(P<0.01)和泊洛沙姆188(P<0.01)对其影响高度显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是海藻糖>泊洛沙姆188>甘氨酸>甘露醇。海藻糖的浓度应选水平1>2>3，甘露醇的浓度应选择水平1>3>2，甘氨酸的浓度应选择水平1>2>3，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>2>3。

我们综合活性和纯度的分析结果，再考虑其他地方如成本等，得出正交试验Ⅱ的最优组合为：海藻糖水平1、甘露醇水平1、甘氨酸水平1和泊洛沙姆188水平1，即2％海藻糖、2％甘露醇、0.05％甘氨酸和0.1％泊洛沙姆188。

表4正交试验Ⅱ的极差和方差分析结果

注：a/b:活性指标的相关数值/纯度指标的相关数值

3.1.3正交试验Ⅲ的结果

表5所示的是正交试验Ⅲ的极差和方差分析结果，从各因素的P值、极差和均值可以看出：就活性而言，海藻糖(0.01<P<0.05)对其影响一般显著，泊洛沙姆188(P<0.01)对其高度显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是泊洛沙姆188>海藻糖>山梨醇>甘氨酸。海藻糖的浓度水平3>2>1，山梨醇的浓度应选择水平2>3>1，甘氨酸的浓度应选择水平1>3>2，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>2>3。同时就纯度而言，泊洛沙姆188(0.01<P<0.05)对其影响一般显著，海藻糖(P<0.01)对其影响高度显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是海藻糖>泊洛沙姆188>甘氨酸>山梨醇。海藻糖的浓度应选水平1>2>3，山梨醇浓度应选择水平3>1>2，甘氨酸的浓度应选择水平1>2>3，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>3>2。

我们综合活性和纯度的分析结果，再考虑其他地方如成本等，得出正交试验Ⅲ的最优组合为：海藻糖水平2、山梨醇水平3、甘氨酸水平1和泊洛沙姆188水平1，即3％海藻糖、5％山梨醇、0.05％甘氨酸和0.1％泊洛沙姆188。

表5正交试验Ⅲ的极差和方差分析结果

注：a/b:活性指标的相关数值/纯度指标的相关数值

3.1.4正交试验Ⅳ的结果

表6所示的是正交试验Ⅳ的极差和方差分析结果，从各因素的P值、极差和均值可以看出：就活性而言，海藻糖(P<0.01)对其影响高度显著，精氨酸(0.01<P<0.05)对其影响一般显著，其他辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是海藻糖>精氨酸>泊洛沙姆188>山梨醇。海藻糖的浓度水平2>3>1，山梨醇的浓度应选择水平3>2>1，精氨酸的浓度应选择水平3>2>1，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>2＝3。同时就纯度而言，各种辅料对其影响不明显，且影响顺序依次是精氨酸>山梨醇>海藻糖>泊洛沙姆188。海藻糖的浓度应选水平3>1>2，山梨醇浓度应选择水平3>2>1，精氨酸的浓度应选择水平2>3>1，泊洛沙姆188的浓度应选择水平1>3>2。

我们综合活性和纯度的分析结果，再考虑其他地方如成本等，得出正交试验Ⅳ的最优组合为：海藻糖水平2、山梨醇水平3、精氨酸水平3和泊洛沙姆188水平1，即3％海藻糖、5％山梨醇、0.6％精氨酸和0.1％泊洛沙姆188。

表6正交试验Ⅳ的极差和方差分析结果

注：a/b:活性指标的相关数值/纯度指标的相关数值

3.2冻干配方的评估结果

3.2.1水分含量检测结果

表7所示的是不同配方中FGF21冻干样品剩余水分含量。从中可以看出4种冻干制品水分含量都约在2.5-4.0％之间，且无论是在37℃还是在4℃，随着时间的变化都没有发生显著的改变。但是配方1的水分含量>3.0％，略显高。此外，虽然其他3种配方的水分含量都小于3％，但是都很接近，这表明冻干工艺需要进一步优化。

表7不同配方的水分含量

A

B

注：不同配方的FGF21冻干样品置于37℃和4℃，3个月期间不同时间点的水分含量。A)4℃样品；B)37℃样品

3.2.2渗透压检测结果

表8不同配方的渗透压和Tg

注：“─”,no data.

冻干注射制剂的渗透压必须等于或稍高于人体血液渗透压285-310mOsm/kg。正如表9所示，配方1的渗透压满足要求，配方2的渗透压太低需要用渗透压调节剂来调节，配方3和4的渗透压相对偏高。

3.2.3玻璃化转变温度检测结果

玻璃化转变温度是冻干制剂特征参数中一种重要的过程参数。如表8所示，配方1和2的Tg值大约为51℃，这意味着其可以长期储存在低温(4℃)和高温(37℃)环境以及利于在第一次和第二次干燥中选择干燥温度。然而，我们没有检测出配方3和4的Tg值，这可能没有形成无定形结构或其Tg值太高超出我们所用方法的检测范围。

3.2.4傅里叶变换红外光谱结果

表9不同配方中FGF21红外酰胺Ⅰ带的分析结果

注：a:傅里叶自去卷积后曲线拟合光谱的拟合峰的波长(cm^-1)；b:不同拟合峰峰面积百分比(％)；c:无序结构包括无规卷曲、转角和伸展链

我们通过检测FGF21红外酰胺Ⅰ带的变化来显示其二级结构的变化。从表9和图1中，可以看出对于空白对照(无辅料FGF21冻干蛋白)而言，其1614cm^-1，1625cm^-1和1695cm^-1处峰归属于分子间β-折叠，1634cm^-1处峰归属于分子内β-折叠，这些都归属于β-折叠；1651cm^-1处峰归属于α-螺旋，其余的峰归属于无序结构(即β转角，无规卷曲和伸展链)^{[39-41,46,48-51]}。此外，不同配方冻干制剂中FGF21的高斯曲线拟合子峰的频率和峰归属于与空白对照相似。根据表9，通过统计可以看出，FGF21在不同配方中α-螺旋含量的大小的顺序为：配方2(11.83％)>配方3(10.86％)>配方1(10.38％)>配方4(10.29％)>空白对照(9.97％)；β-折叠的含量大小顺序为：空白对照(45.98％)>配方4(40.52％)>配方3(40.51％)>配方1(39.36％)>配方2(39.17％)。

3.2.5稳定性试验结果

3.2.5.1 FGF21的活性和纯度变化结果

从图2B，图2D和图3A和图3E-G中可以明显看出空白对照样品和实验组样品置于4℃三个月期间，活性和纯度几乎没有发生明显的改变，且实验组样品的活性和纯度明显比空白对照样品高。此外，还可以发现4种配方中，冻干配方2中FGF21的纯度和活性最高，与FGF21蛋白原液(140IU/mg,99％)最相近。

从图2A，图2C和图3A-D中可以明显看出空白对照样品和实验组样品置于37℃三个月期间，活性和纯度发生了明显的改变，且实验组样品变化程度都要小于空白对照样品。此外，还可以发现4种配方中，配方2中FGF21的纯度和活性依旧相对最高，同时其变化程度也是相对最小的。

3.2.5.2 FGF21的聚合程度

从图4中可以看出，冻干样品置于37℃三个月后，FGF21的聚合率都有不同程度的增加；置于4℃三个月后，FGF21的聚合率几乎没有变化(数据未显示)。与空白对照样品相比，实验组样品在冷冻干燥和37℃放置三个月后其蛋白聚合率都明显较小。同时，在储存过程中，实验组样品的蛋白聚合率的变化程度也明显小于空白对照样品，且冻干配方2的变化程度最小。

4分析与讨论

FGF21作为一种生物蛋白分子，存在稳定性差和储存期短等缺点，从而影响其储存和药物使用。冷冻干燥技术作为一种稳定的生物制剂制备方法，但是其本身会产生引起蛋白质不同程度变性的应力，再者冻干制剂的剩余含水量、辅料种类及浓度等也会对蛋白质稳定性产生一定影响。

本研究的第一阶段(即正交试验)中，我们选择了甘氨酸，甘露醇，精氨酸，海藻糖，山梨醇和泊洛沙姆188作为辅料。

研究第二阶段，我们对正交试验筛选的4种配方作了进一步的评估，确定其可行性。冻干制剂中的残留水分含量，对多肽类药物稳定性影响很大，特别对其活性的复性影响很大，国家药典规定冻干制剂的剩余含水量一般要求为1～3％。Tg作为冻干制剂一个重要特性参数，在第一次、第二次干燥及储存过程中，药物温度都必须低于与其浓度变化相应的Tg。通常认为含水量越低，Tg就越高，药品的长期储存稳定性也越好。从实验结果中，可以看出4种配方中，配方2的两项指标(2.9％和51.56℃)，都符合要求；配方1的水分含量>3％；配方3和4的水分含量虽然<3％，但是其Tg可能由于大于80℃或没有形成玻璃态，没有被检测出。所以从这两项指标考虑优先选择配方2。

稳定性研究的结果显示，在4℃储存期间，FGF21的活性、纯度和聚合率几乎没有改变；在37℃储存期间，它们发生了显著的改变且实验组样品变化程度都要小于空白对照样品。此外4种配方中，配方2的这三相指标基本上都保持最优且变化程度最小，其次是配方1。所以从FGF21冻干制剂的储存稳定性考虑，优先选择配方2，其次是配方1。

通过对FGF21红外酰胺Ⅰ带的分析，我们可以得到不同配方对冷冻干燥引起FGF21二级结构变化的保护作用差异。Costantino H.R.等人发现冷冻干燥会使蛋白质的β-折叠增加，并伴随α-螺旋结构的减少，而α-螺旋结构转变为β-折叠，则表明了蛋白质聚集或是分子间相互作用增强。实验结果分析显示实验组样品中α-螺旋含量比空白对照高，β-折叠含量比空白对照低，这表明4种配方对冷冻干燥引起FGF21二级结构变化都起到了保护作用。其中配方2中FGF21α-螺旋含量最高(11.83％)，β-折叠含量最低(39.17％)，则表明配方2的保护作用最佳。

同时我们通过FGF21结构保留程度(如α-螺旋含量)和再水化后活性之间的比较，发现蛋白质保留更多的天然二级结构则其活性更高，如配方2中FGF21的α-螺旋含量(11.83％)大于配方4(10.29％)，则配方2中FGF21活性明显大于配方4活性。此外，不同配方中FGF21的β-折叠含量与其聚集程度有类似的趋势。例如配方2中FGF21β-折叠含量小于配方3，则样品置于37℃三个月后其聚合率变化程度明显小于配方3。除此之外，FGF21经冷冻干燥后，配方2中其活性和纯度最高，且与蛋白原液的活性和纯度相差不大。所以从配方对冷冻干燥引起蛋白活性、聚合率和二级结构变化的保护作用考虑，优先选择配方2，其次是配方1。

因此，综合以上几项评价指标的结果，我们确定了相对最优的FGF21冻干配方为配方2即：2％(w/v)海藻糖，2％(w/v)甘露醇，0.05％(w/v)甘氨酸和0.1％(w/v)泊洛沙姆188。其次可以考虑配方1。

Claims

1.人FGF21冻干制剂，其由人FGF21、水、pH调节剂、海藻糖、甘露醇、精氨酸和泊洛沙姆188组成，其pH为7.2-7.5，其中人FGF21、海藻糖、甘露醇、精氨酸和泊洛沙姆188的重量比为0.3：2：4：0.1：0.1。

2.权利要求1所述的制剂，其中水含量为1-3％w/w。

3.权利要求1所述的制剂，其中pH调节剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。

4.权利要求3所述的制剂，其中人FGF21、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的重量比为0.3：2.2-2.4：0.4-0.6。

5.权利要求1所述的制剂，其pH为7.4。

6.人FGF21冻干制剂，其由人FGF21、水、pH调节剂、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和泊洛沙姆188组成，其pH为7.2-7.5，其中人FGF21、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和泊洛沙姆188的重量比为0.3：2：2：0.05：0.1。

7.权利要求6所述的制剂，其中水含量为1-3％w/w。

8.权利要求6所述的制剂，其中pH调节剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。

9.权利要求8所述的制剂，其中人FGF21、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的重量比为0.3：2.2-2.4：0.4-0.6。

10.权利要求6所述的制剂，其pH为7.4。