TWI710377B - Ｍｉｃ－１化合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於MIC-1化合物。更特定言之，其係關於包含具有N端胺基酸延伸部分及延長子的MIC-1多肽之化合物，其中該延伸部分由3至36個胺基酸殘基組成，且其中該MIC-1多肽及該N端胺基酸延伸部分一起之計算pI低於6.5。本發明之化合物具有MIC-1活性。本發明亦關於包含此類化合物及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組成物以及該等化合物之醫療用途。
Description
本發明係關於MIC-1化合物及其醫藥用途。
序列表之參考併入
名稱為「SEQUENCE LISTING」的序列表為203,256位元組，其創建於2017年5月23日且以引用的方式併入本文中。
巨噬細胞抑制性細胞介素-1(Macrophage Inhibitory Cytokine-1，MIC-1)首先描述於基於展示於活化巨噬細胞中之表現增加的實驗之1997(Bootcov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.Oct 1997)中。MIC-1隨後已由其他人鑑別出及給予若干額外名稱，諸如胎盤轉型生長因子β(placental transforming growth factor beta，PTGF-β)、胎盤骨形態生成蛋白、生長分化因子-15(growth differentiation factor-15，GDF15)、前列腺衍生因子(prostate derived factor，PDF)、非類固醇消炎藥活化基因(non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene，NAG-1)及PL74。MIC-1係TGF-β超家族(與細胞生長及分化有關之肽激素之家族)之較遠的成員。MIC-1以分子量為24.5kDa之富含半胱胺酸之同二聚體形式循環。人類野生型MIC-1具有短半衰期，意謂用野生型MIC-1進行之治療需要每日投予以維持功效。
積聚的證據支撐MIC-1在諸如肥胖症及糖尿病之代謝障礙中之治療效用。來自患有晚期癌症之患者之資料顯示與MIC-1循環量相關之重量損 失(Johnen等人，Nat Med.，2007年11月)。過度表現MIC-1之轉殖基因小鼠經正常低脂膳食及高脂膳食之重量及體脂肪增加較少(Macia等人，PLoS One,Apr,2012)。此外，分別經低與高脂肪膳食兩者餵養之過度表現MIC-1之轉殖基因小鼠與用類似膳食之野生型動物相比具有改良之葡萄糖耐受性。
WO 2005099746涉及一種藉由投予MIC-1調節劑來調節食慾及/或體重之方法。
本發明係關於MIC-1化合物，其包含具有N端胺基酸延伸部分及連接於該胺基酸延伸部分之延長子的MIC-1多肽。在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物包含具有N端胺基酸延伸部分及連接於該胺基酸延伸部分之延長子的MIC-1多肽，其中該胺基酸延伸部分包含3至36個胺基酸殘基，且具有該胺基酸延伸部分之該MIC-1多肽之計算pI低於6.5。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物具有有一個半胱胺酸殘基之N端胺基酸延伸部分，其中該延長子連接於該半胱胺酸殘基。在此等具體實例中，延長子包含或由化學式1、化學式2、化學式3及化學式4組成；其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*，化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*，及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*，其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數；其中化學式2選自： 化學式2A：*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*，化學式2B：*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*，及化學式2C：*-(NH-(CH2)m-環己基-CO)k-*，其中m為1至5範圍內之整數，且k為0至4範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l，其中k為1至10範圍內之整數，n為1至5範圍內之整數，且l為0至5範圍內之整數；其中化學式4選自化學式4A：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，化學式4B：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，化學式4C：*-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*，及 化學式4D：
其中m為1至5範圍內之整數，且n為2至6範圍內之整數；及其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使化學式之*-NH端連接至另一化學式之CO-*端，且其中化學式4連接至該胺基酸延伸部分之半胱胺酸殘基之硫原子。
化學式中之星號(*)表示連接點。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸及組胺酸)之數目相比酸性胺基酸殘基(天冬胺酸及麩 胺酸)過剩至少3、4、5或6個之N端延伸部分。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物包含由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成之N端延伸部分：A、E、G、P、S、T、Q、N及D，其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
在一些具體實例例中，本發明之MIC-1化合物包含顯示與SEQ ID NO：1之MIC-1至少85%、90%、95%或98%之序列一致性之MIC-1多肽。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含與SEQ ID NO：1之MIC-1相比缺失前三個殘基(MIC-1-△1-3)或缺失天冬醯胺3(des-N3)的MIC-1多肽。
在本發明之一特定具體實例中，MIC-1化合物包含具有根據SEQ ID NO：87、90、92、93、94、97、98、99、100、101、102、108、109或164之胺基酸序列的MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物保持MIC-1受體效力及對降低食物攝入及體重之活體內功效。此等MIC-1化合物因此可用於治療諸如肥胖症、糖尿病、心血管病(如血脂異常及動脈硬化)及其他病症(諸如脂肪肝炎(steatohepatitis)及糖尿病性腎病)之代謝障礙。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之MIC-1化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個態樣中，本發明提供一種MIC-1化合物，其用於預防及/或治療代謝病症，其中該代謝病症為肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
在一個態樣中，本發明提供一種MIC-1化合物，其用於預防及/或治療血脂異常、動脈硬化、非酒精性脂肪肝炎或糖尿病性腎病。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有長期血漿暴露，亦即與人類野生型MIC-1相比延長之半衰期。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有改良之溶解度。在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有改良之化學穩定性。
圖1：N延伸部分具有單一12聚體構築嵌段之MIC-1多肽之表現。所有細胞在37℃下生長於TB中且在OD600達到1.0之後藉由添加0.5mM IPTG誘發蛋白質表現。在隔夜之後收集細胞且藉由將總溶胞物裝載於SDS-PAGE上來檢驗表現量。裝載野生型人類MIC-1(MIC-1)作為陽性對照。
圖2：N延伸部分具有雙12聚體構築嵌段之MIC-1多肽之表現。所有細胞在37℃下生長於TB中且在OD600達到1.0之後藉由添加0.5mM IPTG誘發蛋白質表現。在隔夜之後收集細胞且藉由將總溶胞物裝載於SDS-PAGE上來檢驗表現量。裝載MIC-1作為陽性對照。
圖3：a)比較具有由12聚體-(4+2+_)、-(4+4+_)及-4+3+_)起始之N延伸部分的MIC-1多肽間之表現量。應注意，帶有12聚體-(4+3_)之組及由圓點指示之構築體在MIC-1多肽序列中含有M57L。b)延伸之12聚體對表現量之影響。另外，3.6組中之最低數據點為含有M57L之MIC-1多肽。在此圖中，「1.6末尾」表示TSTEEG，「2.6」表示TSESAT，「3.6」表示TSTEPS且「4.6」表示SEPATS。
圖4：帶有12聚體-(4+2+_)、12聚體-(4+3+_)+M57L、12聚體-(三個重複序列)及12聚體-(四個重複序列)之代表的SDS-PAGE。T：總蛋白質，S：可溶性洗提份，P：細胞集結粒(包涵體)。
圖5：具有序列內突變之MIC-1多肽。在此圖中，MIC-1多肽序 列為MIC-1 △1-3。T：總蛋白質，S：可溶性洗提份，P：細胞集結粒(包涵體)。
圖6：豬中之藥效動力學(PD)研究期間隨時間推移之體重變化。01：化合物01；05：化合物05
本發明係關於MIC-1化合物，其包含具有N端胺基酸延伸部分及連接於該胺基酸延伸部分之延長子的MIC-1多肽。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物包含具有N端胺基酸延伸部分及連接於該胺基酸延伸部分之延長子的MIC-1多肽，其中該胺基酸延伸部分由3至200個胺基酸殘基組成，且該MIC-1多肽及該胺基酸延伸部分一起之計算pI低於6.5。
本發明之MIC-1化合物具生物學活性。舉例而言，其強效，與MIC-1相比保持充分效力，且此外，其具有長期血漿暴露概況，亦即具有延長之半衰期。需要強效及長半衰期之特定組合。
MIC-1
如本文所用，術語「MIC-1」意謂巨噬細胞抑制性細胞介素-1(MIC-1)，亦稱為生長分化因子15(GDF-15)、胎盤骨形態生成蛋白(PLAB)及非類固醇消炎藥活化基因(NAG-1)。MIC-1合成為62kDa細胞內同二聚體前驅蛋白，其隨後藉由弗林蛋白酶樣蛋白酶裂解成24.5kDa同二聚體。全長野生型人類MIC-1蛋白之序列可以寄存編號Q99988自UNIPROT資料庫獲得。308胺基酸前驅序列包括信號肽(胺基酸1-29)、前肽(胺基酸30-196)及MIC-1單體序列(胺基酸197-308)。本文中包括為SEQ ID NO：1之112胺基酸MIC-1單體序列。MIC-1單體含有九個半胱胺酸殘基，其使得形成4個鏈內二 硫鍵及一個鏈間二硫鍵以產生共價連接之24.5kDa同二聚體。已描述與MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)中之H6D對應的天然產生之突變。
如本文所用，術語「MIC-1化合物(MIC-1 compound)」係指包含MIC-1多肽、N端胺基酸延伸部分及延長子之化合物。MIC-1化合物典型地呈同二聚體形式。
如本文所用，術語「MIC-1多肽(MIC-1 polypeptide)」係指SEQ ID NO：1之人類MIC-1單體序列或其類似物。若不另外陳述，則特定MIC-1殘基之數值參考係指112胺基酸單體序列(亦即殘基1為丙胺酸(A1)，且殘基112為異白胺酸(I112))。
如本文所用，術語「MIC-1類似物(MIC-1 analogue)」或「MIC-1之類似物(analogue of MIC-1)」係指MIC-1多肽，其為SEQ ID NO：1之單體MIC-1序列之胺基酸變異體。換言之，MIC-1類似物為與人類MIC-1(SEQ ID NO：1)相比時多個胺基酸殘基已變化之MIC-1多肽。此等變化可獨立地表示一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失。
MIC-1類似物可參考變化之胺基酸殘基、胺基酸殘基數目(亦即MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)中之對應位置)及變化(例如胺基酸殘基變化)進行描述。
在一個態樣中，MIC-1類似物為SEQ ID NO：1之MIC-1之功能變體。在本發明之一個態樣中，MIC-1類似物顯示與SEQ ID NO：1之MIC-1至少85%、90%或95%之序列一致性。作為測定兩種類似物之間的序列一致性之方法的實例，比對SEQ ID NO：1之兩個肽H6D MIC-1及MIC-1。H6D MIC-1類似物相對於SEQ ID NO：1之MIC-1之序列一致性藉由經比對相同之殘基的數目除以SEQ ID NO：1之MIC-1中之比對殘基的總數目給出。因此，在該實施例中，序列一致性百分比為(112-1)/112×100。在MIC-1類似物之序列一致性之測定中， 不包括N端胺基酸延伸部分。適合比對程式可用為「尼德(needle)」之適合比對程式測試，其為尼德曼-翁施比對(Needleman-Wunsch alignment)。用於此比對程式之演算法描述於Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48：443-453中。
在本發明之另一態樣中，MIC-1類似物包含相對於SEQ ID NO：1之人類MIC-1小於15、10或5個胺基酸修飾(取代、缺失、添加(包括插入)及其任何組合)。本申請案全文所用之術語「胺基酸修飾」用於意謂與單體MIC-1(SEQ ID NO：1)相比之胺基酸的修飾。此修飾可為肽之胺基酸之缺失、胺基酸之添加、用另一胺基酸或共價連接於胺基酸的取代基取代一個胺基酸的結果。
取代：在一個態樣中，胺基酸可經保守取代來取代。如本文所用，術語「保守取代(conservative substitution)」指示一或多個胺基酸經另一生物類似殘基置換。實例包括用類似特徵取代胺基酸殘基，該等類似特徵為例如較小胺基酸、酸性胺基酸、極性胺基酸、鹼性胺基酸、疏水性胺基酸及芳族胺基酸。
在一個態樣中，胺基酸可藉由非保守取代來取代。如本文所用，術語「非保守取代(non-conservative substitution)」指示一或多個胺基酸經具有不同特徵之另一胺基酸置換。實例包括用酸性胺基酸殘基取代鹼性胺基酸殘基、用芳族胺基酸殘基取代極性胺基酸殘基等。在一個態樣中，非保守取代為將編碼胺基酸取代成具有不同特徵之另一編碼胺基酸。在一個態樣中，MIC-1類似物可包含將一或多個非天然及/或非胺基酸(例如胺基酸模擬物)取代至MIC-1之序列中。
在本發明之一個態樣中，與單體MIC-1序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺取代成絲胺酸(N3S)、麩胺酸(N3E)、丙胺酸 (N3A)或麩醯胺酸(N3Q)。在本發明之一個態樣中，與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺取代成麩胺酸(N3E)。
本發明之一個態樣中，與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之2位對應之位置的精胺酸已取代成丙胺酸(R2A)，且與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺已取代成麩胺酸(N3E)。
在本發明之一個態樣中，與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之2位對應之位置的精胺酸已取代成麩胺酸(R2E)，且與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺已取代成絲胺酸(N3S)。
缺失及截短：在一個態樣中，本發明之MIC-1類似物可具有一或多個胺基酸殘基自MIC-1之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)缺失，其為單獨的或與一或多個插入或取代組合。
具有胺基酸缺失之MIC-1類似物可由「des」，引用缺失之胺基酸殘基，之後為缺失之胺基酸編號(亦即單體MIC-1(SEQ ID NO：1)中之對應位置)描述。在本發明之一些具體實例中，缺失與人類單體MIC-1(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺(MIC-1 des-N3，SEQ ID NO：2)。在本發明之一些具體實例中，缺失與人類單體MIC-1(SEQ ID NO：1)之1位對應之位置的丙胺酸(MIC-1，des-A1)。
在N或C端截短一或多個胺基酸殘基之MIC-1類似物可藉由「MIC-1-△」及引用缺失之胺基酸殘基之編號(亦即單體MIC-1(SEQ ID NO：1)中之對應位置描述)。在本發明之一些具體實例中，缺失N端之前三個殘基(A1、R2、N3)(MIC-1-△1-3，SEQ ID NO：3)。
插入：在一個態樣中，本發明之MIC-1類似物具有一或多個胺基酸殘基插入至人類MIC-1之胺基酸序列中，其係單獨的或與一或多個缺失及/ 或取代組合。
在一個態樣中，本發明之MIC-1類似物包括一或多個非天然胺基酸及/或非胺基酸插入至MIC-1之序列中。
如本文所用，術語「蛋白質(protein)」或「多肽(polypeptide)」係指包藉由醯胺(或肽)鍵互連之含一系列胺基酸之化合物。胺基酸為含有胺基及羧酸基及視情況存在之一或多個通常稱為側鏈之額外基團的分子。
術語「胺基酸(amino acid)」包括編碼(或蛋白型或天然)胺基酸(在彼等中20個標準胺基酸)以及未編碼(或非蛋白型或非天然)胺基酸。編碼胺基酸為天然併入至蛋白質中之胺基酸標準胺基酸為藉由基因密碼而編碼之胺基酸。非編碼胺基酸在蛋白質中未發現，或不藉由標準細胞機制產生(例如其可已經受轉譯後修飾)。在下文中，未陳述光學異構體之MIC-1蛋白質之所有胺基酸應理解為意謂L-異構體(除非另外說明)。
如自以上實例顯而易見，可藉由胺基酸殘基之全稱、其單字碼及/或其三字碼鑑別胺基酸殘基。此三種方式完全等效。為讀者方便起見，下文提供單及三字母胺基酸代碼： 甘胺酸：G及Gly；脯胺酸：P及Pro；丙胺酸：A及Ala；纈胺酸：V及Val；白胺酸：L及Leu；異白胺酸：I及Ile；甲硫胺酸：M及Met；半胱胺酸：C及Cys；苯丙胺酸：F及Phe；酪胺酸：Y及Tyr；色胺酸：W及Trp；組胺酸：H及His；離胺酸：K及Lys；精胺酸：R及Arg；麩醯胺酸：Q及Gin；天冬醯胺：N及Asn；麩胺酸：E及Glu；天冬胺酸：D及Asp；絲胺酸：S及Ser；及蘇胺酸：T及Thr。
N端胺基酸延伸部分
本發明之MIC-1化合物包含N端胺基酸延伸部分。
如本文所用，術語「N端胺基酸延伸部分」意謂MIC-1多肽之N端經由肽鍵連接於N端胺基酸延伸部分之C端。本文中，術語「N端胺基酸延伸部分(N-terminal amino acid extension)」、「N端延伸部分(N-terminal extension)」及「N延伸部分(N-extension)」意謂相同物體且可互換使用。在一個具體實例中，本發明化合物包含在N端(亦即1位之丙胺酸(A1))經由肽鍵連接有胺基酸延伸部分之人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)。
在本發明之一些具體實例中，N端胺基酸延伸部分之長度多達200個胺基酸殘基。在本發明之一特定具體實例中，N端胺基酸延伸部分具有3至36個胺基酸殘基。
在本發明之一個態樣中，N端胺基酸延伸部分中與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸及組胺酸)數目相比酸性胺基酸殘基(天冬胺酸及麩胺酸)過剩至少3、4、5或6個。酸性胺基酸殘基「過剩」意謂酸性殘基之數目超過鹼性殘基之數目。酸性胺基酸殘基過剩之定義值如下計算：酸性殘基之數目減去鹼性殘基之數目。
甲硫胺酸為用於原核細胞(例如細菌，例如大腸桿菌)中蛋白質表現之初始胺基酸。在本發明之一些具體實例中，在蛋白質表現期間自蛋白質移除初始甲硫胺酸。因此，初始甲硫胺酸不包括在MIC-1化合物之N延伸部分之序列中。然而，熟習此項技術者已知，編碼初始甲硫胺酸之起始密碼子係蛋白質轉譯起始所需要的且應併入核苷酸序列正前方以無例外地用於蛋白質表現。
同時，可理解，N延伸部分具有初始甲硫胺酸之該等MIC-1化合物亦屬於本發明之範疇。
延長子
本發明之MIC-1化合物包含延長子。延長子共價連接於MIC-1多 肽之特異性胺基酸殘基或N端胺基酸延伸部分。
術語「延長子(protractor)」係關於傳送延長血漿暴露之特性(「半衰期延長部分」)，且在本文中應瞭解，係指連接於胺基酸位點鏈官能基(諸如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2)之化學基團，該等官能基結合至該等MIC-1時可增加MIC-1之活體內循環半衰期。延長子之實例包括(但不限於)：脂肪酸及其衍生物、羥烷基澱粉(HAS)(例如羥乙基澱粉(HES))、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n(HAP)、玻尿酸(HA)、肝素前體聚合物(HEP)、基於磷酸膽鹼之聚合物(PC聚合物)、柔性水泥、聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、Fc域、運鐵蛋白、白蛋白、彈性蛋白樣肽、非結構化及重複胺基序列(例如XTEN聚合物)、白蛋白結合肽、CTP肽及其任何組合。
在本發明之一些具體實例中，延長子能夠與白蛋白形成非共價締合物，由此增加MIC-1化合物之血液/血漿暴露時間，且亦具有延長MIC-1化合物之作用時間的效果，因為MIC-1化合物及白蛋白之締合物僅緩慢分解以釋放活性醫藥成分。
在一些具體實例中，包含本發明之延長子之脂肪酸能夠與白蛋白形成非共價締合物，且由此與人類野生型MIC-1相比延長MIC-1化合物之血漿半衰期。
在本發明之一些具體實例中，延長子共價連接於MIC-1多肽之N端胺基酸延伸部分之半胱胺酸殘基。在一具體實例中，延長子包含鹵乙醯胺基團，其在形成亦稱為硫醚鍵之共價硫-碳鍵下與半胱胺酸殘基之硫醇基反應(此製程稱為Cys烷基化)。在另一具體實例中，延長子包含順丁烯二醯亞胺基，其在形成共價硫-碳鍵下與半胱胺酸殘基之硫醇基反應。
在本發明之一些具體實例中，延長子共價連接N端胺基酸延伸 部分之N端胺基酸。
包含延長子之脂肪酸
在本發明之一態樣中，延長子包含或由各化學式1、化學式2、化學式3及化學式4中之至少一者組成：其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*，化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*，及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*，其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數；其中化學式2選自：化學式2A：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*，化學式2B：*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*，及化學式2C：*-NH-(CH2)m-環己基-CO-*，其中m為1至5範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k為1至10範圍內之整數，n為1至5範圍內之整數；且其中化學式4選自化學式4A：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，化學式4B：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，化學式4C：*-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*，及 化學式4D：
其中m為1至5範圍內之整數，且n為2至6範圍內之整數或其中化學式4為以下式I、II或III中之一者：
其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使化學式之*-NH末端連接至另一化學式之CO-*末端。
在一些具體實例中，本發明之延長子包含一個化學式1、一個化學式4及化學式2及化學式3中之一或多者。舉一非限制性實施例，延長子由一個化學式1要素、兩個化學式2要素、兩個化學式3要素及一個化學式4要素組成。
要素化學式2與化學式3持有-NH-及CO-末端，使其藉由醯胺鍵彼此連接且連接至化學式1或化學式4之-CO-或-NH-。化學式4具有-NH-末端(能夠與化學式2或化學式3形成醯胺鍵)。化學式4進一步具有-NH-CO-CH2-末端，其呈未反應形式且為能夠與半胱胺酸殘基之硫醇基反應之鹵乙醯胺，或(- N*-CO-CH2-CH**-CO)-末端，括號表示環狀結構，其呈未反應形式且為能夠與半胱胺酸之硫醇基反應之順丁烯二醯亞胺；或能夠在還原性烷基化反應中與N端胺基反應之醛。
藉由x或y界定之化學式1之碳鏈之長度的x可在12至20變化且y在5至15變化。對於不同類型之延長子，更短或更長之形式可為有利的。在化學式1A之一特定具體實例中，*-(CH2)x-*係指直鏈伸烷基，其中x為12至20範圍內之整數，諸如14至18，或諸如16。
此化學式1可簡單稱為C18二酸，亦即具有18個碳原子之脂肪二羧酸。當x=16時，此連接子要素之結構與化學式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*相對應。
在其他具體實例中，化學式1選自以下之群：化學式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*，化學式1b：HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*化學式1c：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO-*，及化學式1d：(1H-四唑-5-基)-(CH2)15-CO-*，
在其他具體實例中，化學式2選自以下之群：化學式2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，化學式2b：*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*及化學式2c：*-NH-CH2-環己基-CO-*。
在本發明之一態樣中，延長子連接於半胱胺酸殘基；且延長子包含或由各化學式1、化學式2、化學式3及化學式4中之至少一者組成；其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*， 化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*，及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*，其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數；其中化學式2選自：化學式2A：*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*，化學式2B：*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*，及化學式2C：*-(NH-(CH2)m-環己基-CO)k-*，其中m為1至5範圍內之整數，且k為0至4範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l，其中k為1至10範圍內之整數，n為1至5範圍內之整數，且l為0至5範圍內之整數；其中化學式4選自化學式4A：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，及化學式4B：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，其中m為1至5範圍內之整數；且其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使化學式之*-NH端連接至另一化學式之CO-*端，且其中化學式4在其CH2-*端連接至該胺基酸延伸部分之半胱胺酸殘基之硫原子。
在本發明之一態樣中，延長子連接於N端胺基酸，且包含或由各化學式1、化學式2、化學式3及化學式4中之至少一者組成； 其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*，化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*，及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數；其中化學式2選自：化學式2A：*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*，化學式2B：*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*，及化學式2C：*-(NH-(CH2)m-環己基-CO)k-*，其中m為1至5範圍內之整數，且k為0至4範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l，其中k為1至10範圍內之整數，n為1至5範圍內之整數，且l為0至5範圍內之整數；其中化學式4為以下式I、II或III中之一者：
其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使化學式之*-NH端連接至另一化學式之CO-*端，且其中化學式4在其CH2-*端連接至該胺基酸延伸部分之N端之α胺基。
命名法如此項技術中一般，例如在上式中，*-CO-*係指羰基(*-C(=O)-*)。苯係指在化學式1C中在C1及C3或C4處分別經-O-(CH2)x-*及-COOH取代之環結構。HO-S(=O)2-*描述磺酸基團。
本發明之化合物/延長子可以具有相同分子式及鍵結原子序列，但僅在其原子於空間中之三維取向中不同的不同立體異構形式存在。使用標準命名法在實驗部分中以名稱以及結構形式指定本發明之例示化合物/延長子之立體異構性。除非另外說明，否則本發明係關於主張之化合物/延長子之所有立體異構形式。
等電點(pI)
具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽之計算pI定義為具有N延伸部分之MIC-1多肽之淨計算電荷為零之pH值。隨pH值而變之具有N延伸部分之MIC-1多肽之計算電荷使用表1中所述之胺基酸殘基之pKa值及B.Skoog及A.Wichman(Trends in Analytical Chemistry,1986，第5卷，第82-83頁)所述之方法獲得。半胱胺酸(Cys)之側鏈pKa僅包括在具有自由硫氫基之半胱胺酸之電荷計算中。舉例而言，呈同二聚體之人類野生型MIC-1之計算pI值為8.8。
如本文所述，對同二聚體進行關於具有N延伸部分之MIC-1多肽 之pI計算。
功能特性
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有良好的生物物理學特性。
本發明之MIC-1化合物具生物學活性。舉例而言，其強效，結合至MIC-1受體複合物且使MIC-1受體複合物活化。MIC-1化合物亦展現長期血漿暴露，定義為更長半衰期。舉例而言，與MIC-1(SEQ ID 1)相比，MIC-1化合物在向大鼠及/或小型豬靜脈內投予時具有明顯更長之血漿半衰期。可能極需保持之受體效力及長血漿半衰期之特定組合。
試管內活性
在一個態樣中，相對於人類MIC-1(SEQ ID NO：1)，本發明化合物仍保持MIC-1受體效力。可在用人類MIC-1受體(hGFRAL，GDNF家族受體α樣)及其信號傳導輔受體hRET(原癌基因酪胺酸蛋白質激酶受體Ret)轉染之哺乳動物細胞中量測受體效力及功效。如實施例6中所述，受體複合物之MIC-1化合物活化藉由細胞外信號調節之激酶(ERK)之磷酸化來量測。
如本文所述，量測呈同二聚體之MIC-1化合物之受體效力及功效。
活體內生物活性
在一個態樣中，本發明化合物在活體內有效，其可如此項技術中已知以任何適合之動物模型來測定。
非肥胖史泊格多利大鼠為適合的動物模型之一個實施例，且可在此類大鼠中活體內確定食物攝入之變化，例如如實施例14中所述。在一個態樣中，在非肥胖型史泊格多利大鼠中本發明化合物抑制活體內食物攝入。
活體內血漿半衰期
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物為長期的，且具有延長之活體內血漿半衰期，其可在適合的藥物動力學活體內研究中確定。
延長血漿暴露可確定為向諸如大鼠或小型豬之動物靜脈內投予後之血漿半衰期(T½)。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物在向大鼠靜脈內投予後之血漿半衰期為至少10小時，更佳25與50小時之間，或最佳至少50小時，如實施例16中所述確定。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物在向小型豬靜脈內投予後之血漿半衰期為至少50小時，更佳在50與200小時之間，甚至更佳至少200小時，或最佳至少300小時，如實施例17中所述確定。
根據第三態樣，本發明化合物為長期的且同時保持活體內效力。可能極需保持之效力及長血漿半衰期之特定組合。
溶解度
人類野生型MIC-1為疏水性蛋白質，其基於同二聚體之計算pI為8.8。因此，野生型MIC-1僅可於中性pH水性緩衝液系統中溶解至約0.5mg/ml。MIC-1之低溶解度明顯妨礙其調配特性及治療用途，因此研發溶解度改良之工MIC-1化合物將極大改良治療劑效用。
在一個態樣中，相對於SEQ ID NO：1之人類MIC-1，本發明之具有N延伸部分之MIC-1多肽具有改良之溶解度(亦即更可溶)。
如本文所述，如實施例4中所述量測溶解度。
在某些具體實例中，本發明之具有N延伸部分之MIC-1多肽在pH 8.0之Tris緩衝液中之溶解度為至少1mg/ml。在其他具體實例中，本發明之具有N延伸部分之MIC-1多肽在pH 8.0之Tris緩衝液中之溶解度為至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少30mg/ml、或至少40mg/ml。
添加延長子來製造MIC-1化合物並不明顯改變對應具有N延伸部分之MIC-1多肽(實施例12)所量測之改良之溶解度。
如本文所述，量測呈同二聚體之具有N延伸部分之MIC-1化合物及MIC-1多肽之溶解度。
穩定性
人類野生型MIC-1序列為化學不穩定的且胺基酸序列之若干殘基可在儲存期間進行修飾，包括3位之天冬醯胺(N3)之去醯胺化及甲硫胺酸M43、M57及M86之氧化。某些殘基之化學不穩定性可影響醫藥特性，因此研發化學穩定之MIC-1化合物將為製造MIC-1治療性化合物之另一重要部分。
在一個態樣中，本發明之化合物具有相對於人類SEQ ID NO：1 之MIC-1改良之化學穩定性。
術語「化學穩定性(chemical stability)」係指導致形成相比於完整多肽潛在地具有降低之生物活性、減小之溶解度及/或增加之免疫原性效應之化學降解產物的多肽結構中之化學變化。可藉由在暴露於不同環境條件之後在各種時間點量測化學降解產物之量(例如藉由SEC-HPLC及/或RP-HPLC)來評估化學穩定性。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之某些殘基例如藉由取代進行修飾，以增加MIC-1化合物之化學穩定性。為避免去醯胺化，N3缺失或經其他胺基酸(例如E或Q)取代。為減少氧化，甲硫胺酸經其他胺基酸(例如E或L)取代。
免疫原性
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有低免疫原性風險。
產生方法
本發明之具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽可藉助於熟習此項技術者已知之重組蛋白技術產生。一般而言，編碼相關蛋白質或其功能變體之核酸序列經修飾以編碼所需具有N延伸部分之MIC-1多肽。此經修飾之序列隨後插入表現載體中，其又轉型或轉染成表現宿主細胞。
編碼一種N延伸部分之MIC-1多肽之核酸構築體可適當地具有基因組、cDNA或合成來源。藉由用熟知技術修飾基因密碼來實現胺基酸序列改變。
編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽之DNA序列通常插入至重組載體中，該載體可為任何載體，其可適宜地經受重組DNA程序，且載體之選擇將通常視其欲引入之宿主細胞而定。因此，載體可為自主複製載體，亦即以染色體外實體形式存在之載體，載體之複製獨立於染色體複製，例如質體。或 者，載體可為當引入宿主細胞中時整合至宿主細胞基因組中且連同其已整合之染色體進行複製之載體。
載體較佳為表現載體，其中編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽之DNA序列可操作地連接於轉錄DNA所需的額外區段。術語「可操作地連接(operably linked)」指示區段經排列以使得其共同為了其預期目的起作用，例如在啟動子中起始轉錄且經由編碼多肽之DNA序列進行直至其在終止子內終止。
因此，用於表現具有N延伸部分之MIC-1多肽之表現載體將包含能夠起始及引導選殖基因或cDNA轉錄之啟動子。啟動子可為任何DNA序列，其於所選宿主細胞中顯示轉錄活性且可衍生自編碼與宿主細胞同源或異源之蛋白質之基因。
另外，表現具有N延伸部分之MIC-1多肽之表現載體亦包含終止子序列，一種宿主細胞識別終止之轉錄之序列。終止序列可操作地連接於編碼多肽之核酸序列之3'端。在所選宿主細胞中具有功能之任何終止子均可用於本發明中。
具有N延伸部分之MIC-1多肽之表現之目的可為宿主細胞之細胞溶質中之細胞內表現或可針對至生長介質中之細胞外表現之分泌路徑。
細胞內表現為默認路徑且需要DNA序列包含啟動子、之後為編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽之DNA序列、之後為終止子之表現載體。
為將具有N延伸部分之MIC-1多肽之序列導引至宿主細胞之分泌途徑中，需要分泌信號序列(亦稱為信號肽或預序列)作為MIC-1序列之延伸部分。編碼信號肽之DNA序列接合於適當閱讀框架中編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽之DNA序列之5'端。信號肽可通常與蛋白質相關或可來自編碼另一分泌蛋白之基因。
熟習此項技術者已熟知用以分別接合編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽之DNA序列、啟動子、終止子及/或分泌信號序列及將其插入至含有複製所必須之資訊的適合載體中之程序(參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)。
其中引入編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽的DNA序列之宿主細胞可為能夠細胞內或細胞外表現具有N延伸部分之MIC-1多肽的任何細胞。具有N延伸部分之MIC-1多肽可藉由在允許表現具有N延伸部分之MIC-1多肽之條件下在適合培養基中培養含有編碼具有N延伸部分之MIC-1多肽之DNA序列且能夠表現具有N延伸部分之MIC-1多肽的宿主細胞而產生。適用於表現具有N延伸部分之MIC-1多肽之宿主細胞的非限制性實例為：大腸桿菌、釀酒酵母以及人胚腎(HEK)、嬰兒倉鼠腎(BHK)或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。若需要轉譯後修飾，則適合宿主細胞包括酵母、真菌、昆蟲及高等真核細胞(諸如哺乳動物細胞)。
一旦具有N延伸部分之MIC-1多肽已表現於宿主生物體中，則其可藉由習知技術回收且純化至所需品質。此類習知回收及純化技術之非限制性實例為離心、溶解、過濾、沈澱、離子交換層析、固定金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography；IMAC)、逆相-高效液相層析(RP-HPLC)、凝膠過濾及冷凍乾燥。
MIC-1蛋白質之重組表現及純化之實例可見於例如Cordingley等人，J.Virol.1989,63，第5037-5045頁；Birch等人，Protein Expr Purif.,1995,6，第609-618頁及WO2008/043847中。
MIC-1蛋白質之微生物表現及純化之實例可見於例如Chich等人，Anal.Biochem,1995,224，第245-249頁及Xin等人，Protein Expr.Purif.2002,24，第530-538頁。
實驗部分包括製備多種本發明之具有N延伸部分之MIC-1多肽之方法之特定實施例。
包涵體及蛋白質表現
具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽可表現於諸如大腸桿菌之細菌中。在本發明之上下文中，該具有N延伸部分之MIC-1多肽之大規模蛋白質產生可使用包涵體(IB)進行，因為此表示對於控制製程回收率、蛋白質純度、蛋白酶降解及通用蛋白質穩定性有利的方法。此情況對於大規模蛋白質產生特別重要。對於IB之品質十分重要的是部分藉由計算pI控制之具有N延伸部分之MIC-1多肽溶解度及IB形成之平衡。
投藥模式
投藥途徑可為將本發明化合物有效輸送至身體中之所需或適當位置的任何途徑，諸如非經腸，例如皮下、肌肉內或靜脈內。或者，可經口、經肺、經直腸、經皮、經頰、舌下或經鼻投予本發明化合物。
待投予之本發明化合物之量、多久投予本發明化合物之確定及投予何種本發明化合物(視情況與另一醫藥活性劑一起)之選擇與熟悉肥胖症及相關病症之治療的醫師協商決定。
醫藥組成物
包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組成物可如此項技術中已知來製備。
術語「賦形劑(excipient)」大體上係指除活性治療成分以外的任何組分。賦形劑可為惰性物質、非活性物質及/或非醫藥活性物質。
賦形劑可用於各種目的，例如作為載劑、媒劑、稀釋劑、錠劑助劑及/或用以改良活性物質之投予及/或吸收。
用不同賦形劑調配醫藥活性成分在此項技術中已知，參見例如 Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)，及任何隨後版本)。
組合治療
用根據本發明之化合物進行之治療亦可與一或多種藥理活性物質(例如選自減肥藥劑、食慾調節劑及用於治療及/或預防由肥胖症引起或與肥胖症相關之併發症及病症的藥劑)組合。
醫藥適應症
在一個態樣中，本發明係關於用作藥劑之本發明化合物。
在特定具體實例中，本發明化合物可用在特定具體實例中，本發明化合物可用於以下醫學治療：
(i)例如藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及誘導飽腹感來預防及/或治療飲食障礙，諸如肥胖症。
(ii)預防及/或治療高血糖症、抗胰島素症及/或葡萄糖耐受性異常。
(iii)預防及/或治療血脂異常。
在一些具體實例中，本發明係關於一種體重管理之方法。在一些具體實例中，本發明係關於一種降低食慾之方法。在一些具體實例中，本發明係關於一種減少食物攝入之方法。
一般而言，患有肥胖症之所有個體亦視為遭受超重。在一些具體實例中，本發明係關於一種治療或預防肥胖症之方法。在一些具體實例中，本發明係關於本發明之MIC-1化合物用於治療或預防肥胖症之用途。在一些具體實例中，罹患肥胖症之個體為人類，諸如成人或孩童(包括嬰兒、兒童及青少年)。身體質量指數(BMI)為基於高度及體重之體脂肪之量度。計算公式係BMI=體重(以公斤計)/身高(以平方公尺計)。患有肥胖症之人類個體之BMI可為
30；此個體亦可稱為肥胖。在一些具體實例中，罹患肥胖症之人類 個體之BMI可為
35或BMI在
30至<40之範圍內。在一些具體實例中，肥胖症為重度肥胖症或病態肥胖症，其中人類個體之BMI可為
40。
在一些具體實例中，本發明係關於一種治療或預防超重(視情況在至少一種重量相關之共生病症存在下)之方法。在一些具體實例中，本發明係關於本發明之MIC-1化合物用於治療或預防超重(視情況在至少一種體重相關之共生病症存在下)之用途。
在一些具體實例中，罹患超重之個體為人類，諸如成人或孩童(包括嬰兒、兒童及青少年)。在一些具體實例中，罹患超重之人類個體之BMI為
25，諸如BMI
27。在一些具體實例中，罹患超重之人類個體之BMI在25至<30之範圍內或在27至<30之範圍。在一些具體實例中，體重相關之共生病症選自由以下組成之群：高血壓、糖尿病(諸如2型糖尿病)、血脂異常、高膽固醇及阻塞型睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnoea)。
在一些具體實例中，本發明係關於一種減輕體重之方法。在一些具體實例中，本發明係關於本發明之MIC-1化合物用於減輕體重之用途。根據本發明之待經受體重減輕之人類之BMI為
25，諸如BMI
27或BMI
30。在一些具體實例中，根據本發明之待經受體重減輕之人類之BMI為
35或BMI
40。
在一些具體實例中，本發明係關於一種治療或預防如動脈硬化之心血管病及諸如脂肪肝炎及糖尿病性腎病之其他病症的方法。
本文使用冠詞「一(a/an)」指代該冠詞之語法對象中之一者或多於一者(亦即至少一者)。舉例而言，「MIC-1多肽」意謂一種MIC-1多肽或超過一種MIC-1多肽。
化學式中之星號(*)表示連接點。
特定具體實例
本發明藉由本發明之以下非限制性具體實例進一步描述：
1.一種MIC-1化合物，其包含具有N端胺基酸延伸部分及延長子之MIC-1多肽，其中該延長子連接於該胺基酸延伸部分。
2.如具體實例1所述之化合物，其中該化合物為同二聚體。
3.如具體實例1或2所述之化合物，其中該N端胺基酸延伸部分具有一個半胱胺酸殘基，且其中該延長子連接於該半胱胺酸殘基。
4.如具體實例3所述之化合物，其中該延長子包含或由化學式1、化學式2、化學式3及化學式4組成；其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*，化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*，及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數；其中化學式2選自：化學式2A：*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*，化學式2B：*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*，及化學式2C：*-(NH-(CH2)m-環己基-CO)k-*，其中m為1至5範圍內之整數，且k為0至4範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l，其中k為1至10範圍內之整數， n為1至5範圍內之整數，且l為0至5範圍內之整數；其中化學式4選自化學式4A：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，及化學式4B：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，化學式4C：*-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*，及 化學式4D：
其中m為1至5範圍內之整數，且n為2至6範圍內之整數；且其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使化學式之*-NH端連接至另一化學式之CO-*端，且其中化學式4在其CH2-*端連接至該胺基酸延伸部分之該半胱胺酸殘基之硫原子。
5.如具體實例1或2所述之化合物，且其中該延長子連接於該胺基酸延伸部分之該N端胺基酸。
6.如具體實例5所述之化合物，其中該延長子包含或由化學式1、化學式2、化學式3及化學式4組成；其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*，化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*，及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數； 其中化學式2選自：化學式2A：*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*，化學式2B：*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*，及化學式2C：*-(NH-(CH2)m-環己基-CO)k-*，其中m為1至5範圍內之整數，且k為0至4範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l，其中k為1至10範圍內之整數，n為1至5範圍內之整數，且l為0至5範圍內之整數；其中化學式4為以下式I、II或III中之一者：
其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使化學式之*-NH端連接至另一化學式之CO-*端，且其中化學式4在其CH2-*端連接至該胺基酸延伸部分之該N端之胺基。
7.如具體實例4及6中任一項所述之化合物，其中化學式1選自以下之群： 化學式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*，化學式1b：HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*化學式1c：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO-*，及化學式1d：(1H-四唑-5-基)-(CH2)15-CO-*。
8.如具體實例4、6及7中任一項所述之化合物，其中化學式2選自以下之群：化學式2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，化學式2b：*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*及化學式2c：*-NH-CH2-環己基-CO-*。
9.如具體實例4、6及7中任一項所述之化合物，其中化學式2-化學式3為以下式IV：
其中n為0至3且m為0至3
10.如具體實例4及7至9中任一項所述之化合物，其中化學式4為以下中之一者：化學式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*及化學式4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
11.如具體實例4及7至9中任一項所述之化合物，其中化學式4為以下式V、VI或VII中之一者：
其中n為1至4。
12.如具體實例4及7至9中任一項所述之化合物，其中化學式4為以下式VIII：
其中p為1至5，且q為1至5。
13.如具體實例1至3及5中任一項所述之化合物，其中該延長子為以下式IX、X、XI、XII及XIII中之一者：
14.如具體實例1至3及5中任一項所述之化合物，其中該延長子選自以下之群：生物相容性脂肪酸及其衍生物、羥烷基澱粉(HAS)(例如羥乙基澱粉(HES))、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n(HAP)、玻尿酸(HA)、肝素前體聚合物(HEP)、基於磷酸膽鹼之聚合物(PC聚合物)、柔性水泥、聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、Fc域、運鐵蛋白、白蛋白、彈性蛋白樣肽(ELP)、XTEN聚合物、白蛋白結合肽、CTP肽及其任何組合。
15.如前述具體實例任一項所述之化合物，其中具有該胺基酸延伸部分之該MIC-1多肽之計算pI低於6.5。
16.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI低於6.1。
17.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI低於6.0。
18.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI低於6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3或5.2、5.1或5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1或4.0。
19.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI高於4.7。
20.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI高於4.8。
21.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI高於4.9。
22.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI高於5.0。
23.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI高於5.1。
24.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI在6.5-3.0、6.5-3.5、6.5-4.0、6.1-3.0、6.1-3.5、6.1-4.0、6.1-4.7、6.1-4.9、6.1-5.0、6.1-5.1、6.0-3.0、6.0-3.5、6.0-4.0、5.9-3.0、5.9-3.5、5.9-4.0、5.9-5.0、5.9-5.1、5.8-3.0、5.8-3.5、5.8-4.0、5.8-5.1、5.8-5.2、5.5-3.0、5.5-3.5、5.5-4.0或5.0-4.0範圍內。
25.如具體實例15所述之化合物，其中該計算pI在5.8-5.2範圍內。
26.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分由3至200個胺基酸殘基組成。
27.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分之長度在3-100、3-50、3-40、3-30、5-100、5-50、5-40、5-30、10-100、10-50、10-40、10-30、3-36、3-30、3-25、3-24、3-12、4-36、4-30、 、4-24、4-12、5-36、5-30、5-24、5-12、6-36、6-30、6-24、6-12、7-36、 、7-30、7-24、7-12、8-36、8-30、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32個胺基酸殘基之範圍內。
28.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分之長度在3-36或30-32個胺基酸殘基之範圍內。
29.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分中與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸或組胺酸)之數目相比酸性胺基酸殘基(天冬胺酸或麩胺酸)過剩至少3、4、5、6、7、8、9或10個。
30.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸及組胺酸)數目相比酸性胺基酸殘基(天冬胺酸及麩胺酸)過剩至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%或75%。
31.如具體實例30所述之化合物，其中該延伸部分包含至少10%酸性胺基酸殘基。
32.如具體實例30所述之化合物，其中該延伸部分包含至少15%酸性胺基酸殘基。
33.如具體實例11所述之化合物，其中該延伸部分包含至少25%酸性胺基酸殘基。
34.如具體實例1至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成：A、C、E、G、P、S、T、Q、N及D，且其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
35.如具體實例34所述之化合物，其中該由胺基酸殘基A、C、E、G、P、S及T構成。
36.如具體實例35所述之化合物，其中該延伸部分包含至少三個E及至少一個P。
37.如具體實例36所述之化合物，其中該延伸部分包含至少6個Ser、4個Pro、4個Gly、4個Thr、4個Glu及2個Ala。
38.如具體實例37所述之化合物，其中該延伸部分包含兩個選自由以下組成之群的序列：SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG及 SEPATSGSETPG，且其中該延伸部分中之胺基酸中之一者經半胱胺酸置換。
39.如具體實例38所述之化合物，其中該延伸部分進一步包含6至8個SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG或SEPATSGSETPG中之連續胺基酸，諸如前6至8個胺基酸殘基，後6至8個殘基或內部6至8個殘基，且其中該延伸部分中之胺基酸中之一者經半胱胺酸置換。
40.如具體實例3至39中任一項所述之化合物，其中半胱胺酸位於該N端胺基酸延伸部分之任何位置。
41.如具體實例40所述之化合物，其中該N端延伸部分之該半胱胺酸殘基與該MIC-1多肽之該N端胺基酸之間的距離為至少1、3、5、10、15、19、23、26、29或32個胺基酸(包括該N端延伸部分之半胱胺酸殘基，但不包括MIC-1多肽之N端胺基酸)。
42.如具體實例40所述之化合物，其中該N端延伸部分之半胱胺酸殘基與該MIC-1多肽之該N端胺基酸之間的距離為至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32個胺基酸(包括該N端延伸部分之半胱胺酸殘基，但不包括MIC-1多肽之N端胺基酸)。
43.如具體實例42所述之化合物，其中該N端延伸部分之半胱胺酸殘基與該MIC-1多肽之N端胺基酸之間的距離為26至29個胺基酸(包括該N端延伸部分之半胱胺酸殘基，但不包括MIC-1多肽之N端胺基酸)。
44.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分以S開始。
45.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分以SE開始。
46.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分以SEP開始。
47.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者： SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：223)，SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：224)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：225)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：240)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTE(SEQ ID NO：241)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：242)，SEPCTSGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO：243)，SEPCTSGSETPG(SEQ ID NO：244)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(SEQ ID NO：245)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(SEQ ID NO：246)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(SEQ ID NO：247)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(SEQ ID NO：248)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(SEQ ID NO：249)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(SEQ ID NO：250)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(SEQ ID NO：251)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(SEQ ID NO：252)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(SEQ ID NO：253)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(SEQ ID NO：254)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO：255)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(SEQ ID NO：256)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(SEQ ID NO：257)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(SEQ ID NO：258)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(SEQ ID NO：259)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(SEQ ID NO：260)， SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(SEQ ID NO：261)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(SEQ ID NO：262)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(SEQ ID NO：263)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(SEQ ID NO：264)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(SEQ ID NO：265)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(SEQ ID NO：266)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(SEQ ID NO：267)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(SEQ ID NO：268)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：269)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：270)，SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：271)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：272)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：273)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：274)，SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：275)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：276)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：277)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：278)，SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：279)，SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：280)，SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：281)，SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：282)，SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：283)，GPCEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(SEQ ID NO：284)， GECPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(SEQ ID NO：285)，PACEEEDDPDGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：286)，PDECTEEETEGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：287)，SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：226)，SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：227)，SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：229)，SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：230)，SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：231)，SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：232)，SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：233)，SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：234)，SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：235)，SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：236)，SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：237)，SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEG(SEQ ID NO：238)，SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEG(SEQ ID NO：239)。
48.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成：A、E、G、P、S、T、D、N及Q，且其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
49.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成：A、E、G、P、S、T、Q及D，其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
50.如具體實例48或49所述之化合物，其中該延伸部分包含至少三個E及至少一個P。
51.如具體實例50所述之化合物，其中該延伸部分進一步包含S、G、T及A。
52.如具體實例51所述之化合物，其中該延伸部分包含6個Ser、4個Pro、4個Gly、4個Thr、4個Glu及2個Ala。
53.如具體實例51所述之化合物，其中該延伸部分包含兩個選自由以下組成之群的序列：SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG及SEPATSGSETPG。
54.如具體實例53所述之化合物，其中該延伸部分進一步包含6至8個SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG或SEPATSGSETPG中之連續胺基酸，諸如前6至8個胺基酸殘基，後6至8個殘基或內部6至8個殘基。
55.如具體實例48至54中任一項所述之化合物，其中該延伸部分以S開始。
56.如具體實例55所述之化合物，其中該延伸部分以SE開始。
57.如具體實例56所述之化合物，其中該延伸部分以SEP開始。
58.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SPAGSP(SEQ ID NO：4)、TSESAT(SEQ ID NO：5)、TSTEPE(SEQ ID NO：6)、SEPATS(SEQ ID NO：7)、TSTEEG(SEQ ID NO：8)、PESGPG(SEQ ID NO：9)、SGSAPG(SEQ ID NO：10)、GSETPG(SEQ ID NO：11)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：12)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：13)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：14)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(SEQ ID NO：15)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(SEQ ID NO：16)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(SEQ ID NO：17)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(SEQ ID NO：18)、 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(SEQ ID NO：19)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(SEQ ID NO：20)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(SEQ ID NO：21)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(SEQ ID NO：22)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(SEQ ID NO：23)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(SEQ ID NO：24)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO：25)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(SEQ ID NO：26)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(SEQ ID NO：27)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(SEQ ID NO：28)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(SEQ ID NO：29)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(SEQ ID NO：30)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(SEQ ID NO：31)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(SEQ ID NO：32)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(SEQ ID NO：33)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(SEQ ID NO：34)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(SEQ ID NO：35)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(SEQ ID NO：36)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(SEQ ID NO：37)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(SEQ ID NO：38)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：70)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：71)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：39)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：40)、 SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：41)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：42)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：43)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：44)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：45)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：46)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：47)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：48)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：49)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：50)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：51)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：52)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：53)、GEPS(SEQ ID NO：118)、GPSE(SEQ ID NO：119)、GPES(SEQ ID NO：120)、GSPE(SEQ ID NO：121)、GSEP(SEQ ID NO：122)、GEPQ(SEQ ID NO：123)、GEQP(SEQ ID NO：124)、GPEQ(SEQ ID NO：125)、GPQE(SEQ ID NO：126)、GQEP(SEQ ID NO：127)或GQPE(SEQ ID NO：128)、PEDEETPEQE(SEQ ID NO：129)、PDEGTEEETE(SEQ ID NO：130)、PAAEEEDDPD(SEQ ID NO：131)、AEPDEDPQSED(SEQ ID NO：132)、AEPDEDPQSE(SEQ ID NO：133)、AEPEEQEED(SEQ ID NO：134)、AEPEEQEE(SEQ ID NO：135)、GGGS(SEQ ID NO：136)、GSGS(SEQ ID NO：137)、GGSS(SEQ ID NO：138)及SSSG(SEQ ID NO：139)。
59.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、 PESGPG、SGSAPG、GSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG、 SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS，及SSSG。
60.如具體實例1至2及5至33中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之任何2至6者之任何組合：SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
61.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、 GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
62.如具體實例61之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之2至9者之任何組合：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
63.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
64.如具體實例63所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之2至9者之任何組合：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
65.如具體實例64所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(SEQ ID NO：140)、GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(SEQ ID NO：141)、GPESGPESGPESGPESGPES(SEQ ID NO：142)、GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(SEQ ID NO：143)及GSEPGSEPGSEPGSEPGSEP(SEQ ID NO：144)。
66.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
67.如具體實例66所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之2至9者之任何組合：GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
68.如具體實例67所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(SEQ ID NO：145)、GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(SEQ ID NO：146)、 GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(SEQ ID NO：147)、GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(SEQ ID NO：148)、GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(SEQ ID NO：149)及GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(SEQ ID NO：150)。
69.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED及AEPEEQEE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
70.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之兩者至三者之任何組合：PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、AEPEEQEE及AEEAEEAEEAEEAEE。
71.如具體實例1至2及5至33中任一項所述之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194及SEQ ID NO：195。
72.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分在N端包含1至3個丙胺酸胺基酸殘基。
73.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分在C端包含1個4甘胺酸及絲胺酸胺基酸殘基。
74.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分在C端包含(Gly-Ser)n或(Ser-Gly)n序列，其中n為1與8之間的整數。
75.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該延伸部分在C端包含GGGS、GSGS、GGSS或SSSG。
76.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽展示與野生型MIC-1(SEQ ID NO：1)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性。
77.如具體實例70所述之化合物，其中該MIC-1多肽展示與野生型MIC-1(SEQ ID NO：1)至少95%之序列一致性。
78.如具體實例1至70中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽具有最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸修飾。
79.如具體實例1至72中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽具有最多7、6、5、4、3或2個胺基酸修飾。
80.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與野生型MIC-1(SEQ ID NO：1)相比，該MIC-1多肽包含以下取代中之一或多者：P11E、H18E、R21E、A30E、M43L、M43E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86F、M86L、Q90E、T92E、L105E、K107E、K69R、K107R及K91R。
81.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含以下取代中之一或多者：R2S、R2A、R2E、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y或N3Q。
82.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含N3之缺失(des-N3)。
83.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含M57E或M57L取代。
84.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含M86L或M86F取代。
85.如具體實例84所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽進一步包含Q90E或T92E取代。
86.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含H66E取代。
87.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含R67E取代。
88.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含前3、4、5或6個殘基之缺失。
89.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含前3個殘基之缺失。
90.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：154之序列(M43L/des-N3)。
91.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：155之序列(M43L/△1-3)。
92.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：156之序列(M57E/H66E/des-N3)。
93.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：157之序列(M57L/△1-3)。
94.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：158之序列(M57L/des-N3)。
95.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：159(M86L/△1-3)。
96.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：160(M86L/des-N3)或SEQ ID NO：222(M57L、M86L/des-N3)之序列。
97.如具體實例1至75中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：1之序列。
98.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中該MIC-1多肽及該N端胺基酸延伸部分一起包含根據以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、164、 
(SEQ ID NO： 288)、 
(SEQ ID NO： 289)、 
(SEQ ID NO： 290)、 
(SEQ ID NO： 291)、
99.如具體實例1所述之MIC-1化合物，其具有下式中之一者：
100.如前述具體實例中任一項所述之化合物，展示與SEQ ID NO：1之MIC-1相比延長之血漿半衰期。
101.如前述具體實例中任一項所述之化合物，展示與SEQ ID NO：1之MIC-1相比改良之血漿半衰期，如藉由向大鼠靜脈內投予該化合物且自隨時間推移化合物之電漿濃度變化估計終半衰期所量測。
102.如前述具體實例中任一項所述之化合物，展示與SEQ ID NO：1之MIC-1相比維持之效力。
103.如前述具體實例中任一項所述之化合物，展示與SEQ ID NO：1之MIC-1相比保持之功效，如藉由向大鼠皮下投予化合物且量測每日食物攝入變化所 量測。
104.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該具有胺基酸延伸部分之MIC-1多肽具有可接受之溶解度。
105.如具體實例1至99中任一項所述之化合物，其中如在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下所量測，該具有胺基酸延伸部分之MIC-1多肽之溶解度為0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml。
106.如具體實例1或2所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含N3之缺失(des-N3)，其中該延伸部分具有以下序列SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：225)，且其中該延長子具有下式：
且其中該延長子連接於該延伸部分之該半胱胺酸。
107.如具體實例1或2所述之化合物，其中該具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：288之序列，且該延長子具有下式具有
且其中該延長子連接於該延伸部分之該半胱胺酸。
108.如具體實例1至107中任一項所述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯。
109.如前述具體實例中任一項所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該化合物對於減少食物攝入及/或減輕體重具有改良之活體內功效。
110.如具體實例1至109中任一項之化合物，其用作藥劑。
111.如具體實例1至109中任一項所述之化合物，其用於預防及/或治療代謝病症。
112.如具體實例111所述之化合物，其用於預防及/或治療代謝病症，其中該代謝病症係肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
113.如具體實例1至107中任一項所述之化合物，其用於預防及/或治療飲食障礙，諸如肥胖症。
114.如具體實例113所述之化合物，其用於藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及/或誘發飽腹感預防及/或治療肥胖症。
115.如具體實例1至109中任一項所述之化合物，其用於預防及/或治療心血管疾病。
116.如具體實例115所述之化合物，其用於預防及/或治療血脂異常、動脈硬化、脂肪肝炎或糖尿病性腎病。
117.一種醫藥組成物，其包含如具體實例1至109中任一項所述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
118.一種如具體實例1至109中任一項所述之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療代謝病症之藥劑，其中該代謝病症係肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
119.一種如具體實例1至109中任一項所述之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療飲食障礙之藥劑。
120.一種如具體實例1至109中任一項所述之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療肥胖症之藥劑。
121.一種如具體實例1至109中任一項所述之化合物的用途，其用於製造用以藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及誘發飽腹感而預防及/或治療肥胖症之藥劑。
122.一種如具體實例1至109中任一項所述之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療心血管疾病之藥劑。
123.一種如具體實例1至109中任一項所述之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療血脂異常、動脈硬化、脂肪肝炎或糖尿病性腎病之藥劑。
124.一種治療及/或預防代謝病症之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項之化合物而實現，其中該代謝病症為肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
125.一種治療及/或預防飲食障礙之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項所述之化合物而實現。
126.一種治療及/或預防肥胖症之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項所述之化合物而實現。
127.一種藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及/或誘發飽腹感來治療及/或預防肥胖症之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項所述之化合物而實現。
128.一種治療及/或預防心血管疾病之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項所述之化合物而實現。
129.一種治療及/或預防血脂異常、動脈硬化、脂肪肝炎或糖尿病性腎病之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項所述之化合物而實現。
130.一種聚核苷酸分子，其編碼如具體實例1至109中任一項所述之化合物。
131.一種藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及/或誘發飽腹感來治療及/或預防超重之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至109中任一項所述之化合物而實現。
實施例
縮寫清單
「主峰(main peak)」係指純化層析圖中具有以毫吸收度單位計之最高UV強度且含有融合蛋白之峰。
HPLC為高效液相層析。
SDS-PAGE為十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。
IMAC為固定化金屬親和層析。
SEC為尺寸排阻層析。
MS為質譜分析。
在本說明書中，希臘字母可由其符號或對應書面名稱表示，例如：α=alpha；β=beta；ε=epsilon；γ=g amma；δ=delta；ω=omega等。此外，希臘字母μ可由「u」表示，例如在μl=ul或μM=uM中。
具有改良之溶解度之MIC-1多肽
在本發明之一態樣中，MIC-1多肽經設計具有增加之溶解度。
在本發明之一態樣中，此舉藉將N端「酸性」胺基酸延伸部分添加至MIC-1多肽中由來達成。
在本發明之一態樣中，藉由修飾MIC-1多肽之胺基酸序列溶解度增加且穩定性改良。舉例而言，修飾在MIC-1多肽之胺基酸序列內實現(序列內突變)。
具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽可表現於諸如大腸桿菌之細菌中。在本發明之上下文中，該具有N延伸部分之MIC-1多肽之大規模蛋白質產生可使用包涵體(IB)進行，因為此表示對於控制製程回收率、蛋白質純度、蛋白酶降解及通用蛋白質穩定性有利的方法。此情況對於大規模蛋白質產生特別重要。對於IB之品質十分重要的是具有N延伸部分之MIC-1多肽溶解度及IB形成之間的平衡。
N延伸部分設計：
在N端胺基酸延伸部分之設計中，排除F、I、L、M、V、W及Y，因為其可造成蛋白質聚集。亦排除H、K及R，因為其可導致不合需要之結合於細胞膜上。對於N延伸部分序列，A、C、E、G、P、S、T、D、N及Q較佳。E及D尤其較佳，因為其藉由降低化合物之pI值會增加溶解度。C可提供可用於延長目的之-SH基團，諸如脂肪酸結合及聚乙二醇化。特定言之，當具有N延伸部分之MIC-1多肽表現於大腸桿菌中時，對於一些N延伸部分，在極N端添加一或兩個額外丙胺酸、甘胺酸或絲胺酸以增加初始甲硫胺酸移除效率。
不同N端胺基酸延伸部分基於以上原理進行設計。一些N延伸部分包含源自人類蛋白質之序列(人類化序列)；一些包含人工設計之序列(例如GS、SG、AEE、AES、GEPQ(SEQ ID NO：123)、GEPS(SEQ ID NO：118))；一些包含人類化序列或人工序列之若干重複序列；一些包含以上之組合。設計若干6殘基序列(6聚體)。N延伸部分可包含6聚體、6聚體中之一部分(例如6聚體中之1至5個殘基)或以上之組合中之一或多者。人工序列之胺基酸殘基(包括6聚體)及人類化序列可以任何次序排列。
一些代表性6聚體及6聚體之組合列於表2中：
序列內突變：
MIC-1(SEQ ID NO：1)之某些內部殘基例如由取代修飾。舉例而言，為增加MIC-1化合物之溶解度，MIC-1之疏水性殘基可經親水性殘基、較佳經酸性殘基取代；帶正電荷殘基可經酸性殘基等取代等。為減少氧化，甲硫胺酸可經其他胺基酸(例如E、F或L)取代。
用於增加溶解度之序列內突變包括(但不限於)：P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、Q90E、T92E、L105E及K107E。
用於減少氧化之序列內突變包括(但不限於)：M43L、M43E、M57E、M57L、M86F及M86L。
用於增加化學穩定性之序列內突變包括(但不限於)：N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y及N3Q。
用於結合之序列內突變包括(但不限於)：K69R、K107R及K91R。
其他序列內突變包括(但不限於)N3之缺失(des-N3)及前3個殘基之缺失。
pI計算
具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽之計算pI界定為具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽之淨計算電荷為零之pH值。隨pH值而變之具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽之計算電荷使用表1中所述之胺基酸殘基之pKa值及B.Skoog及A.Wichman(Trends in Analytical Chemistry,1986，第5卷，第82-83頁)所述之方法獲得。半胱胺酸(Cys)之側鏈pKa僅包括在具有自由硫氫基之半胱胺酸之電荷計算中。N延伸部分可含有一個半胱胺酸突變。舉例而言，呈同二聚體之人類野生型MIC-1之計算pI值為8.8。
在本文中，且在整個本文檔中，若不另外陳述，則對同二聚體進行關於具有N端胺基酸延伸部分之MIC-1多肽之pI計算。
材料及方法
一般製備方法
實施例-1：MIC-1多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽之表現及醱酵
將MIC-1多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽之cDNA次選殖至pET11b源載體中。在大腸桿菌中當細胞密度達到OD600為1.0時，藉由0.5mM異丙基Mβ-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導呈包涵體之MIC-1f多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽之過度表現。在37℃下於TB中連續生長20h之後，收集細胞且製備用於LC/MS與UPLC之樣品以確定分子量。
在作為補充劑之限定化學成分培養基中經分批進料方法進行醱酵。醱酵收率主要視不同多肽而定，多肽間之醱酵收率在1g/L至8g/L間變化。
實施例-2：純化及再摺疊：
MIC-1多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽如下進一步純化：將大腸桿菌於10mM Tris緩衝液(pH 8.0)中之漿料(20% w/v)超聲處理(3秒開/關間隔，於冰中，持續5分鐘)且MIC-1多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽藉由離心(10,000 x g，持續30分鐘)集結。包涵體於20mM Tris(pH 8.0)中藉由8M尿素再溶解，且藉由離心(10,000 x g，持續30分鐘)移除殘渣。收集所得上清液中之MIC-1多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽，且稀釋於再摺疊緩衝液(50mM Tris，pH 8.5，及10% DMF或10% DMSO)中，達至0.1mg/ml之最終濃度。再摺疊方法於冷室中持續48小時。所得溶液藉由0.4μm過濾器過濾且裝載於使用Q Sepharose快速流動樹脂(GE Healthcare)之疏水性相互作用管柱或陰離子交換層析(50mM Tris，pH 8.0，0-500mM NaCl)上，如Protein Purification.Principles and Practice Series：Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes,Robert K.第3版，1994(第6及9章)。在一些情況下，進一步 純化藉由尺寸排阻層析使用經50mM Tris(pH 8.0)及200mM NaCl操作之HiLoad 26/60 Superdex pg 75管柱(GE Healthcare)實現。為儲存，將MIC-1多肽或具有N端延伸部分之MIC-1多肽之轉移至DPBS中且冷凍儲存。
實施例-3：具有N端延伸部分之MIC-1多肽之pH值依賴性溶解度
此實驗之目的為篩檢溶解度改良之具有N延伸部分之MIC-1多肽，且確定調配之最佳pH窗口。
將具有N端延伸部分之MIC-1多肽溶解於水及乙醇(60%水及40%乙醇)之混合物中使濃度範圍在3mg/ml至10mg/ml之間。溶劑由SpeedVac(Concentrator Plus，Eppendorf)蒸發6小時，以獲得該具有N端延伸部分之MIC-1多肽之集結粒。
對於此pH依賴性溶解度曲線分析使用以下緩衝液：乙酸鹽緩衝液(pH 3至pH 6)；Tris緩衝液(pH 7至pH 9)；CAPS緩衝液(pH 10至pH 11)。
將緩衝液連同具有N端延伸部分之MIC-1多肽一起添加至96孔盤之各孔中。使用量可能非完全相同，但所有均靶向12-18mg/ml內之理論濃度。具有N端延伸部分之MIC-1多肽於上清液中之濃度藉由UPLC確定(表6)。基於該等結果，與wtMIC-1相比，在pH 6至9之間，本發明之具有N端延伸部分之 MIC-1多肽之溶解度顯著改良。具有N延伸部分之MIC-1多肽之最佳pH窗口屬於對於調配較佳之pH範圍，例如pH 6.5-8.5。
實施例4：具有N端延伸部分之MIC-1多肽在pH 8下之最大溶解度
為測試最大溶解度，將具有N端延伸部分之MIC-1多肽溶解於水及乙醇之混合物(60%水及40%乙醇)中使濃度範圍在3mg/ml至10mg/ml之間。接著，將溶液(各孔150μL)等分至96孔盤(Corning)中。溶劑由SpeedVac(Concentrator Plus，Eppendorf)蒸發6小時，以獲得具有N端延伸部分之MIC-1多肽之集結粒。將Tris緩衝液(pH 8.0，無賦形劑)添加至96孔盤之各孔中。添加至孔中之緩衝液之量少於溶解孔中之整個集結粒所需之量，以使得獲得最大濃度。盤於盤振盪器上在800rpm(MixMate，Eppendorf)下振盪2小時。集結粒在3600g下短暫離心5min。將上清液轉移至深96孔盤中且用40%乙醇稀釋20倍。接著，使所有樣本經受UPLC(Acquity，Waters)、盤讀取器(Infinite M200 pro，Tecan)及UV光譜儀(NanoDrop 8000，Thermo Scientific)以確定濃度(表7)
基於該等結果，在pH 8.0下本發明之具有N端延伸部分之MIC-1多肽之溶解度明顯改良。特別言之，具有N端延伸部分之MIC-1多肽在pH 8.0下獲得大於30mg/ml之溶解度。
在MIC-1化合物中保持具有N延伸部分之MIC-1多肽之溶解度改良，亦即添加延長子不顯著降低溶解度(實施例12)。
試管內活性篩檢之通用方法
實施例5：BHK21-hGFRAL-IRES-hRET細胞系之建立
此實施例之目的為建立用於測試MIC-1活性之基於細胞之試管內分析。哺乳動物細胞經轉染且穩定表現全長MIC-1受體(hGFRAL)及其全信號傳導輔受體hRET51。
表現全長hGFRAL及全長hRET51之質體藉由將編碼全長hGFRAL及全長hRET51之合成之DNA核苷酸插入至哺乳動物表現載體pEL中來構築。IRES(內部核糖體入口部位)為兩個DNA序列之間的常用連接子，以使得兩個DNA序列可同時轉譯至mRNA中。pEL載體主鏈藉由Taihegene CRO公司提供。
將兩百萬個BHK21細胞接種於10cm皮氏培養皿(petri dish)中且於培養基(DMEM+10% FBS+1% PS)中培養隔夜。細胞用pEL-hGFRAL- IRES-hRET質體轉染。將經轉染細胞以不同密度分離至新穎10cm培養皿中且生長於選擇培養基(DMEM+10% FBS+1% PS+1mg/ml G418)中大於2週，得到單個純系。將單個純系轉移至6孔盤中且培養至100%匯合。hGFRAL及hRET之mRNA表現藉由qPCR來量測。獲取成功轉染之純系且針對MIC-1結合測試(圖15及表13)。
實施例6：基於MIC-1細胞之試管內活性分析
wtMIC-1與具有N端延伸部分之MIC-1多肽均在BHK21-hGFRAL-IRES-hRET穩定細胞中誘導ERK1/2之磷酸化(表8)。自結果可推斷出MIC-1、GFRAL及RET之三元複合物使RET蛋白質酪胺酸激酶磷酸化以藉由ERK1/2之磷酸化經由包含ERK/MAPK路徑之信號路徑誘導MIC-1之活體內活性。
使用BHK21-hGFRAL-IRES-hRET篩檢具有N端延伸部分之MIC-1多肽之結果示於表8中。僅具有N延伸部分之MIC-1多肽或具有序列內突變之MIC-1類似物僅獲得等於或甚至高於wtMIC-1之試管內活性。此外，N延伸部分及序列內突變之組合亦可得到類似活性。
活體內功效
實施例7：瘦弱史泊格多利大鼠中具有N端延伸部分之MIC-1多肽對食物攝入之影響
在9至11週齡瘦弱雄性史泊格多利大鼠中量測具有N端延伸部分之MIC-1多肽之活體內功效。動物每日一次在黑暗階段開始之前以8奈莫耳/公斤體重之劑量注射1-2小時。在適當緩衝溶液中皮下投予化合物(1-4ml/kg)。食物攝入之變化藉由自動食物監測系統(對於大鼠為BioDAQ系統及HM2系統)來量測。在BioDAQ系統中，動物單個圈養；且在HM2系統中，動物在每 個籠3隻動物下以群組圈養。在n=4-8個動物中測試各化合物。在實驗之前使動物適應至少7天。所收集之資料表示為自開始各每日12小時黑暗階段至隨後黑暗階段量測之每日食物攝入(24小時食物攝入)。藉由自治療組之平均每日食物攝入減去媒劑組之平均每日食物攝入來計算回應於所投予化合物之食物攝入之每日變化。若使用雙尾史都登氏t測試(two-tailed student's t-test)p<0.1，則變化視為顯著的。結果表示為與研究時段期間記錄之媒劑(百分比)相比，食物攝入之「最大減少」。資料亦表示為食物攝入之「積累減少」，其呈研究時段期間食物攝入之顯著(p<0.1)每日降低(百分比)之總和的形式。
本發明人出人意料地發現此等具有N延伸部分之MIC-1多肽不僅使溶解性分子增加，且亦使功效等於或甚至優於wtMIC-1(表9)。舉例而言，根據SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：106之化合物具有最大及積累活體內功效，該功效在皮下給藥下大於wtMIC-1 40-50%。功效增加此外與溶解度增加相關，因為與wtMIC-1相比，根據SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：106之化合物均具有升高的溶解度且活體內功效顯著較大。此相關性似乎並非藉由試管內Emax變化來闡述，因為除根據SEQ ID NO：105之化合物外，相比於wtMIC-1，表10中之所有化合物具有Emax。實際上，化合物SEQ ID NO：105具有與wtMIC-1相比較低的Emax且與wtMIC-1相比仍更活體內有效。此外，在化合物之間試管內效力類似，因為化合物均不具有不同於wtMIC-1之EC50。因此，增加之活體內功效與增加之溶解度之間的相關性出人意料且不可藉由增加之試管內受體活化之變化來簡單闡述。
實施例8：不同12聚體嵌段之MIC-1表現及初始Met移除效率
在人體中，N-甲醯基-甲硫胺酸藉由免疫系統識別為外來物質，或作為由受損細胞釋放之報警信號，且刺激身體對抗可能的感染(Pathologic Basis of Veterinary Disease5：Pathologic Basis of Veterinary Disease,By James F.Zachary,M.Donald McGavin)。另外，甲硫胺酸為可容易氧化之不穩定的殘基。因此，N-Met裂解效率對於MIC-1表現極為重要。
存在4種不同類型的12聚體，且其所有均由3個Ser、2個Pro、2個Gly、2個Thr、2個Glu及1個Ala組成。然而，各重複序列中之12個殘基以不同方式排列。
關於不同12聚體對表現量及N-Met裂解效率之影響所知甚少。因此，分別由單個及雙12聚體起始之MIC-1多肽之系統研究非常必要。
將具有N端延伸部分之MIC-1多肽之cDNA次選殖至pET11b源載 體中。在大腸桿菌中當細胞密度達到OD600為1.0時，藉由0.5mM異丙基Mβ-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導呈包涵體或可溶性蛋白之具有N端延伸部分之MIC-1多肽之過度表現。在37℃下於TB中連續生長20h之後，收集細胞且於緩衝液A(20mM Tris，pH 8.0)中超聲處理。在10,000g下離心所得混合物20min且藉由LC/MS及SDS-PAGE分析以確定分子量。
在作為補充劑之限定化學成分培養基中經分批進料方法進行醱酵。醱酵收率主要視不同化合物而定，化合物間之醱酵收率在1g/L至8g/L間變化。
經設計用於單個12聚體測試之化合物及結果示於表10及圖1中。
帶有雙12聚體之化合物列於表11中，且亦展示結果(參見表11及圖2)。
總之，以12聚體-1嵌鍛開始之N延伸部分不在大腸桿菌中表現。對於其他12聚體嵌段，蛋白質表現得以實現，但僅作為初始序列之12聚體-4致使甲硫胺酸完全裂解。另外，12聚體-2系列之N-met裂解效率比12聚體-3系列更佳。
實施例9：具有2×或2.5×12聚體N延伸部分之MIC-1多肽之表現量及包涵體比率
(1)具有2.5 × 12聚體N延伸部分之MIC-1多肽之表現
關於蛋白質產生方法，參見實施例8。結果示於表12、圖3及圖4 中。
儘管延長之12聚體(6aa)位於遠離N端24aa處，但在不同群組中具有N端延伸部分之MIC-1多肽之表現量變化較大。來自12聚體-1之片段明顯不適用於表現，其與先前結果一致。12聚體-(4+_+3.6)及-(4+_+4.6)之平均表現量比其他相對高。
(2)具有2×或2.5×12聚體N延伸部分之MIC-1多肽之包涵體比率
對於大規模蛋白質產生，包涵體通常視為良好選擇，主要歸因於其較佳的放大特性，其主要包括：高表現量、簡單回收步驟及高純度、蛋白酶抗性及良好過程穩定性。
具有N端延伸部分之MIC-1多肽可表現包涵體或可溶性形式，其主要視化合物之pI及延伸部分長度而定。結果示於表13及圖4中。
具有序列內突變之MIC-1多肽之溶解度示於表14及圖5中(MIC-1多肽序列為MIC-1 △1-3)。
研究以12聚體-(4+2+_)、12聚體-(4+4+_)及12聚體-(4+3+_)起始之MIC-1多肽表現包涵體之能力。展示當pI>5.1時，包涵體比率>90%。另外，具有序列內突變M57E/H66E之MIC-1多肽主要表現可溶性洗提份。
實施例9：包括Cys突變之具有N端延伸部分之MIC-1多肽之產生
為增加具有N端延伸部分之MIC-1多肽之半衰期，用於延長之不同脂肪酸鏈經由烷基化結合至N端延伸部分，該烷基化藉由定點突變引入之半胱胺酸介導。Cys突變之位置全身性定位且將所得具有N端延伸部分之MIC-1多肽根據實施例8中所述之方法再摺疊且純化。
1.將Cys突變引入至N端延伸部分中以進行延長
使用PCR方法由定點突變產生總計20種不同半胱胺酸突變體且構築體列為表15。
其展示具有Cys突變之具有N端延伸部分之MIC-1多肽之表現量與無Cys突變者類似。
2.包括Cys突變之具有N端延伸部分之MIC-1多肽之再摺疊及純化
WtMIC-1同二聚體含有總計9對二硫鍵，且理論上，引入新穎半胱胺酸藉由二硫鍵擾亂將干擾原始二硫鍵匹配，由此可進一步降低再摺疊量。儘管在吾人之實驗中，出人意料地發現在與用於wtMIC-1再摺疊之相同的再摺疊緩衝液中測試列舉之此等Cys突變體且展示與wtMIC-1或所述溶解度經改造之具有N端延伸部分之MIC-1多肽類似之再摺疊量(約50%至60%)。
3.包括Cys突變之具有N端延伸部分之MIC-1多肽之pH依賴性溶解度及最大溶解度
pH值依賴性溶解度及最大溶解度藉由與實施例4中所述相同的方法確定。結果示於表16及表17中。
可見Cys突變不影響藉由將N端胺基酸延伸部分添加至MIC-1多肽中獲得之改良之溶解度。
實施例10：用於MIC-1化合物之延長子之製備
實施例10.1：製備17-[(S)-1-羧基-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-甲醯基苯甲基胺甲醯基)甲氧基]乙氧基}乙基胺甲醯基)甲氧基]乙氧基}乙基胺甲醯基)丙基胺甲醯基]十七烷酸
t-Bu-N-(4-甲醯基苯甲基)胺基甲酸酯(100mg)用TFA/DCM(DCM(1：1)處理1小時。混合物真空濃縮且與甲苯共同濃縮(兩次)。將殘餘物溶解於THF(2.5mL)中且添加17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基胺甲醯基}乙氧基)乙氧基]乙基胺甲醯基}丙基胺甲醯基)十七烷酸(320mg，如先前WO2009/083549中所描述製備)於THF(5ml)中之溶液。緩慢添加DIPEA(0.5ml)。130min後，真空濃縮混合物。將殘餘物溶解於EtOAc及1N HCl中。用1N HCl及鹽水萃取有機層。脫水(Na2SO4)有機層且真空濃縮，得到呈白色固體狀之標題化合物，其不經進一步純化即使用。
產量234mg(72%)
LCMS2：理論質量：851.0，實驗值：851.5(M+1)。
實施例10.2(C16)：製備16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-16-側氧基-十六烷酸
固相合成方案：
經2小時將N-(苯甲氧基羰氧基)丁二醯亞胺(ZOSu，100g，401mmol)於二氯甲烷(500mL)中之溶液逐滴添加至乙二胺(1,189mL，2.81mol)於二氯甲烷(750mL)中之溶液中。在30分鐘之後，過濾懸浮液且用二氯甲烷洗滌固體。濾液蒸發至乾燥且用甲苯(1.00L)及水(0.50L)稀釋殘餘物。過濾所得混合物且分離濾液，得到兩個相。含有產物之水相；因此將其用二氯甲烷(2×250mL)萃取。合併所有有機相，經無水硫酸鈉脫水，過濾且真空濃縮。用甲苯(750mL)稀釋殘餘物且用2M鹽酸水溶液(500mL)及1M鹽酸水溶液(100mL)萃取。合併水相水相且用氫氧化鈉(60.0g，1.50mol)於水(90mL)中之溶液鹼化。所得混合物用二氯甲烷(4×200mL)萃取，經無水硫酸鈉脫水，過濾，真空濃縮且用己烷(200mL)稀釋。將鹽酸於醚(100mL，400mmol)中之4M溶液添加至溶液中，所得懸浮液真空濃縮且用己烷(1.00L)稀釋。過濾沈澱之固體，用己烷洗滌且真空乾燥，得到呈白色粉末狀之(2-胺基-乙基)-胺基甲酸苯甲酯鹽酸鹽。
產量：62.62g(68%)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇4：1)：0.25(游離鹼)。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH)：7.42-7.26(m,5 H)；5.16(s,2 H)；3.60(t,J=5.7Hz,2 H)；3.32(t,J=5.7Hz,2 H)。
使2-氯三苯甲基樹脂100-200目1.7mmol/g(3，40.1g，68.1mmol)在無水二氯甲烷(250mL)中膨脹20分鐘。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，17.5g，45.4mmol)及N,N-二異丙基乙胺(30.1mL，173mmol)於無水二氯甲烷(50mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪5小時。過濾樹脂且用N,N-二異丙基乙胺(15.8mL，90.8mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(4：1，250mL，2×5min)中之溶液處理。接著用N,N-二甲基甲醯胺(2×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×250mL)洗滌樹脂。藉由用含20%哌啶之二甲基甲醯胺(1×5min，1×10min，1×30min，3×250mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×250mL)、2-丙醇(2×250mL)及二氯甲烷(300mL，2×250mL)洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，26.3g，68.1mmol)、四氟硼酸O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基
(TCTU，24.2g，68.1mmol)及N,N-二異丙基乙胺(21.4mL，123mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(140mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(2×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)及N,N-二甲基甲醯胺(250mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之二甲基甲醯胺(1×5min，1×10min，1×30min，3×250mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×250mL)、2-丙醇(2×250mL)及二氯甲烷(300mL，2×250mL)洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-戊二酸1-第三丁酯(Fmoc-Glu-OtBu，29.0g，68.1mmol)、四氟硼酸O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基
(TCTU，24.2g，68.1mmol)及N,N-二異丙基乙胺(21.4mL，123mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(140mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(2×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)及N,N-二甲基甲醯胺(250mL)洗滌。藉由用含20%哌啶 之二甲基甲醯胺(1×5min，1×10min，1×30min，3×250mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×250mL)、2-丙醇(2×250mL)及二氯甲烷(300mL，2×250mL)洗滌樹脂。將16-(第三丁氧基)-16-側氧基十六烷酸(23.3g，68.1mmol)、四氟硼酸O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基
(TCTU，24.2g，68.1mmol)及N,N-二異丙基乙胺(21.4mL，123mmol)於N,N-二甲基甲醯胺/二氯甲烷混合物(4：1，200mL)中之溶液添加至樹脂中。將樹脂振盪1小時，過濾且用N,N-二甲基甲醯胺(3×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)、甲醇(2×250mL)及二氯甲烷(350，6×250mL)洗滌。藉由用2,2,2-三氟乙醇(250mL)處理18小時自樹脂裂解產物。濾出樹脂且用二氯甲烷(2×250mL)、2-丙醇/二氯甲烷混合物(1：1，2×250mL)、2-丙醇(250mL)及二氯甲烷(3×250mL)洗滌。合併溶液；蒸發溶劑且粗產物藉由急驟管柱層析(Silicagel 60，0.040-0.060mm；洗提劑：二氯甲烷/甲醇1：0-9：1)純化。真空乾燥純(S)-22-(第三丁氧基羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四側氧基-3,6,12,15,40-五側氧基-9,18,23-三氮雜正四十二烷酸且獲得淡黃色黏稠黃色油狀物。
產量：30.88g(83%)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇4：1)：0.30。
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.36(t,J=5.7Hz,1 H)；7.02(t,J=5.4Hz,1 H)；6.55(d,J=7.7Hz,1 H)；4.46(m,1 H)；4.18(s,2 H)；4.02(s,2 H)；3.83-3.36(m,16 H)；2.44-2.12(m,7 H)；2.02-1.86(m,1 H)；1.60(m,4 H)；1.47(s,9 H)；1.45(s,9 H)；1.36-1.21(m,20 H)。
LC-MS方法4：
純度：100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)：3.60min。
實驗值m/z,z=1：818.7(M+H)+
隨後將六氟磷酸2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基
(HATU，11.4g，30.1mmol)及三乙胺(8.77mL，62.9mmol)添加至(S)-22-(第三丁氧基羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四側氧基-3,6,12,15,40-五側氧基-9,18,23-三氮雜正四十二烷酸(22.4g，27.4mmol)於無水二氯甲烷(110mL)中之溶液中。將三乙胺(5.72mL，41.0mmol)添加至(2-胺基-乙基)-胺基甲酸苯甲酯鹽酸鹽(6.94g，30.1mmol)於無水二氯甲烷(165mL)中之懸浮液中且將所得混合物添加至以上溶液中。在室溫下攪拌混合物隔夜，且接著蒸發至乾燥。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯(500mL)中；用1M鹽酸水溶液(2×200mL)、碳酸鈉之5%水溶液(2×200mL，各相極緩慢分離)、1M鹽酸水溶液(8×200mL)及鹽水洗滌；經無水硫酸鈉脫水且真空蒸發至乾燥。殘餘物藉由急驟管柱層析(Silicagel 60，0.040-0.060mm；溶離劑：二氯甲烷/甲醇95：5)純化，得到呈淡黃色黏稠油狀之15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-苯甲氧基羰基胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-第三丁氧羰基-丙基胺甲醯基]-十五烷酸第三丁酯。
產量：23.84g(88%)
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9：1)：0.35
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.39-7.26(m,6 H)；7.19(t,J=6.3Hz,1 H)；6.91(t,J=5.7Hz,1 H)；6.52(d,J=7.5Hz,1 H)；5.83(t,J=5.5Hz,1 H)；5.09(s,2 H)；4.41(ddd,J=12.3,4.6及4.3Hz,1 H)；3.99(s,2 H)；3.97(s,2 H)；3.71-3.30(m,20 H)；2.33-2.08(m,7 H)；1.97-1.83(m,1 H)；1.67-1.51(m,4 H)；1.45(s,9 H)；1.44(s,9 H)；1.35-1.20(m,20 H)，。
LCMS方法4
純度：100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)：4.18min。
實驗值m/z,z=1：994.9(M+H)+
將鈀/碳(10%，1.27g，1.20mmol)添加至以上化合物(23.8g，24.0mmol)於甲醇(350mL)中之溶液中且在正常壓力下將所得混合物氫化4小時。濾出催化劑且將濾液蒸發至乾燥。自二氯甲烷蒸發殘餘物若干次，以移除甲醇殘餘物，且真空乾燥，產生呈黏稠無色油狀之(S)-1-胺基-25-(第三丁氧基羰基)-4,13,22,27-四側氧基-6,9,15,18-四氧雜-3,12,21,26-四氮雜正四十二烷-42-酸第三丁酯。
產量：20.50g(99%)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9：1)：0.05。
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.54(t,J=5.7Hz,1 H)；7.41(t,J=5.6Hz,1 H)；7.14(t,J=5.5Hz,1 H)；6.68(d,J=7.5Hz,1 H)；5.25(bs,2 H)；4.39(td,J=8.3及4.2Hz,1 H)；4.01(s,4 H)；3.74-3.39(m,18 H)；2.96(t,J=5.7Hz,2 H)；2.34-2.06(m,7 H)；1.97-1.83(m,1 H)；1.68-1.50(m,4 H)；1.45(s,9 H)；1.43(s,9 H)；1.37-1.19(m,20 H)。
LCMS方法4
純度：100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)：1.43min。
實驗值m/z,z=1：860.8(M+H)+
在-30℃下在氬氣下將N,N-二異丙基乙胺(4.98mL，28.6mmol)添加至以上胺(6，20.5g，23.8mmol)於無水二氯甲烷(290mL)中 之溶液中。逐滴添加溴乙醯溴(2.48mL，28.6mmol)且在-30℃下再攪拌所得溶液3小時。移除冷卻浴，在室溫下攪拌反應混合物1小時；且接著真空移除溶劑。將殘餘物再溶解於乙酸乙酯(450mL)中且用5%檸檬酸水溶液(300mL)洗滌。在1小時內分離各相。用水(300mL)洗滌有機層且使所得乳液分離隔夜，得到3相。移除澄清水層且在添加飽和溴化鉀水溶液(100mL)下振盪剩餘2相。使各相分離隔夜，接著移除水相且有機相經無水硫酸鈉脫水。真空移除溶劑且殘餘物藉由急驟管柱層析(Silicagel 60，0.040-0.060mm；洗提劑：二氯甲烷/甲醇95：5)純化，得到呈無色固體狀之(S)-1-溴-28-(第三丁氧基羰基)-2,7,16,25,30-五側氧基-9,12,18,21-四氧雜-3,6,15,24,29-五氮雜四十五烷-45-酸第三丁酯。
產量：19.46g(83%)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9：1)：0.25
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.46(m,1 H)；7.33(t,J=5.9Hz,1 H)；7.21(t,J=5.1Hz,1 H)；6.92(t,J=5.2Hz,1 H)；6.50(d,J=7.5Hz,1 H)；4.41(ddd,J=12.2,4.5及4.2Hz,1 H)；4.01(s,4 H),3.85(s,2 H)；3.75-3.40(m,20 H),2.36-2.08(m,7 H)；1.99-1.84(m,1 H)；1.68-1.51(m,4 H),1.46(s,9 H)；1.44(s,9 H)；1.38-1.19(m,20 H)
LCMS方法4
純度：100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)：3.51min。
實驗值：m/z,z=1：980.9,982.9(M+H)+
將以上化合物(19.5g，19.8mmol)溶解於三氟乙酸(120mL)中且在室溫下攪拌所得溶液1.5小時。真空移除三氟乙酸且自二氯甲烷 (6×200mL)蒸發殘餘物。將乙醚(200mL)添加至油性殘餘物中且攪拌混合物隔夜，得到懸浮液。過濾固體產物，用乙醚及己烷洗滌且真空乾燥，得到呈白色粉末狀之標題產物15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十五烷酸。
產量：16.74g(97%)。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,dH)：4.61(dd,J=8.8及4.8Hz,1 H)；4.12(s,2 H),4.10(s,2 H)；3.96(s,2 H)；3.77-3.39(m,20 H),2.49-2.18(m,7 H)；2.16-1.04(m,1 H)；1.71-1.56(m,4 H),1.30(bs,20 H)
LCMS方法4：
純度：100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)：3.51min
理論值m/z,z=1：869,8，實驗值：m/z,z=1：868.7,870.7
實施例10.3(C14)：製備14-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-14-側氧基-十四烷酸
13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙醯胺基)乙基胺甲醯基]甲氧基}-乙氧基)乙基胺甲醯基]甲氧基}乙氧基)乙基胺甲醯基]丙基胺甲醯基}十 三烷酸藉由與實施例10.2中所述相同的方法製備，產生黏稠黃色油狀物。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,dH)：4.61(dd,J=8.9及4.9Hz,1 H)；4.13(s,2 H)；4.11(s,2 H)；3.96(s,2 H)；3.77-3.40(m,20 H)；2.49-2.18(m,7 H)；2.16-2.07(m,1 H)；1.70-1.56(m,4 H)；1.31(bs,16 H)。
LCMS方法4：
純度：100%(ELSD)
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：2.94min
理論值m/z,z=1：841.9，實驗值：m/z,z=1：841.7,843.7
實施例10.4(C18)：製備18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸
溶液相合成方案：
步驟1：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-苯甲氧羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸苯甲酯
在0℃下經75min向乙二胺(8.5ml ml)於DCM(80ml)及三乙胺(5.2ml)中之溶液中逐滴添加如WO10029159中所述製備之18-[[(1S)-1-苯甲氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基-2-側氧基-乙氧基]乙 氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸苯甲酯(26g)於DCM(320ml)中之溶液。在攪拌2小時之後，濾出沈澱物。向濾液中添加水(200ml)及異丙醇(50ml)。萃取混合物。有機層使用MgSO4脫水。藉由過濾移除MgSO4且真空乾燥濾液，得到標題化合物20,07g(81%)LCMS：理論質量：956.2；實驗值m/z,z=1：957.0
步驟2：18-[[(1S)-1-苯甲氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸苯甲酯
將氯乙酸(0,19g)溶解於DCM(15ml)中。添加N-羥基丁二醯亞胺(0.22g)及EDAC HCl(0.42g)。在攪拌2.5小時之後，添加於DCM(5ml)中之18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙胺基)-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-苯甲氧羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸苯甲酯(1.5g)。在室溫下攪拌隔夜之後，用1M HCl(2×20ml)及水/鹽水2：1(30ml)萃取混合物。使有機層脫水(MgSO4)，過濾且真空濃縮，得到澄清油狀物，1.37g(84%)
LCMS：理論質量：1032.7；實驗值m/z,z=1：1033.1
步驟3：18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸
在氮氣通氣之後，向18-[[(1S)-1-苯甲氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸苯甲基酯(10,5g)於丙酮(140ml)中之溶液中添加10% Pd/C(1.0g)。在氫化6小時之後，將混合物加熱至40至50℃，之後過濾。分離冷濾液中之沈澱物，且用丙酮洗滌 且乾燥，得到標題化合物，7.42g(85%)。
步驟4：8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-羧基-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸
向18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-18-側氧基-十八烷酸於丙酮(60ml)中之懸浮液中添加溴化鈉(5當量，1.21g)。在室溫下在黑暗中攪拌混合物。在2小時之後再添加溴化鈉(10當量，2.41g)。在2天之後，再添加溴化鈉(5當量，1.21g)。在5天之後，濃縮混合物。向一半殘餘物中添加DCM(30ml)、10%抗壞血酸(20mL)及水30ml。向乳液中添加異丙醇(50ml)及水(30ml)。分離有機相且用10%抗壞血酸(20mL)及異丙醇(10mL)之混合物洗滌兩次。有機層脫水(MgSO4)，過濾且濃縮，得到固體油狀物，其於丙酮中結晶且藉由過濾分離，得到受起始物質污染之標題化合物，0.80g(72%)。
LCMS：理論質量：896.9。實驗值m/z,z=1：898.9(M+1)
實施例10.5(C12)：製備12-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-甲醯基苯基)甲胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁基]胺基]-12-側氧基-十二烷酸
化合物藉由與實施例10.1所述相同的方法製備。
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.39-7.29(m,1 H)；7.03-6.93(m,1 H)；6.59-6.51(m,1 H)；4.49-4.37(m,1 H)；4.15(s,2 H)；4.01(s,2 H)；3.78-3.39(m,16 H)；2.36-2.10(m,7 H)；2.01-1.85(m,1 H)；1.68-1.50(m,4 H)；1.48-1.41(m,18 H)；1.34-1.22(m,12 H)。
實施例10.6：製備(2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-5-側氧基-2-(16-磺基十六醯基胺基)戊酸
使2-氯三苯甲基樹脂100-200目1.5mmol/g(18.0g，27.0mmol)在無水二氯甲烷(160mL)中膨脹20分鐘。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，6.94g，18.0mmol)及N,N-二異丙基乙胺(12.5mL，72.0mmol)於無水二氯甲烷(100mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪隔夜。過濾樹脂且用N,N-二異丙基乙胺(4.12mL，23.7mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(4：1，2×5min，2×100mL)中之溶液處理。接著用N,N-二甲基甲醯胺(2×100mL)、二氯甲烷(2×100mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)洗滌樹脂。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×5min，1×30min，2×100mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)、2-丙醇(2×100mL)及二氯甲烷(3×100mL)洗滌樹脂。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH， 10.4g，27.0mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，9.60g，27.0mmol)及N,N-二異丙基乙胺(8.50mL，48.6mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(100mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪2小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(2×100mL)、二氯甲烷(2×100mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×5min，1×30min，2×100mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)、2-丙醇(2×100mL)及二氯甲烷(3×100mL)洗滌樹脂。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-戊二酸1-第三丁酯(Fmoc-gGlu-OtBu，11.5g，27.0mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，9.60g，27.0mmol)及N,N-二異丙基乙胺(8.50mL，48.6mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(100mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪2小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(2×100mL)、二氯甲烷(2×100mL)及N,N-二甲基甲醯胺(2×100mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×5min，1×30min，2×100mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)、2-丙醇(2×100mL)及二氯甲烷(3×100mL)洗滌樹脂(2)。將樹脂分成4等份且用原始量之四分之一(4.50mmol)持續此合成。將16-磺基十六烷酸鈉(3，6.16g，17.2mmol，製備描述於合成化合物REaD-22296之程序中，批號195-257-1)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻(PyBOP，8.95g，17.2mmol)及N,N-二異丙基乙胺(6.00mL，34.0mmol)於二甲亞碸(180mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪4小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(2×100mL)、N,N-二甲基甲醯胺/水(2：1，2×100mL)、二甲亞碸(2×100mL)、水(2×100mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)洗滌。藉由用1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(80mL)處理2小時自樹脂裂解產物。濾出樹脂且用二氯甲烷(4×100 mL)洗滌。合併溶液，蒸發揮發物且粗物質(S)-22-(第三丁氧基羰基)-10,19,24-三側氧基-39-磺基-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十九烷酸(4)未經進一步純化即用於下一步驟。
產量：定量(基於ELSD)。
LC-MS純度：96%。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×100mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：3.07min。
LC-MS m/z：812.9(M+H)+。
隨後將1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(V)(HATU，1.87g，4.92mmol)及三乙胺(3.43mL，24.6mmol)添加至(S)-22-(第三丁氧基羰基)-10,19,24-三側氧基-39-磺基-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十九烷酸(4.5mmol)於無水二氯甲烷(40mL)之中溶液中。將三乙胺(1.82mL，13.1mmol)添加至(2-胺基-乙基)-胺基甲酸苯甲酯鹽酸鹽(5，1.93g，8.37mmol)於無水二氯甲烷(20mL)中之懸浮液中且將所得混合物添加至以上溶液中。在室溫下攪拌混合物隔夜。在16小時之後，添加另一部分1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(V)(HATU，0.38g，1mmol)、三乙胺(2.00mL，14.3mmol)及(2-胺基-乙基)-胺基甲酸苯甲酯鹽酸鹽(5，0.40g，1.70mmol)且再攪拌混合物2小時。溶液用1M鹽酸水溶液(2×100mL)及鹽水(50mL)洗滌，經無水硫酸鈉脫水且蒸發至乾燥。粗物質(S)-29-(第三丁氧基羰基)-3,8,17,26,31-五側氧基-1-苯基-2,10,13,19,22-五側氧基-4,7,16,25,30-五氮雜四十六烷-46-磺酸(6)未經進一步純化即用於下一步驟。
產量：定量(基於ELSD)。
LC-MS純度：83%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：3.35min。
LC-MS m/z：989.1(M+H)+。
將鈀/碳(10%，0.22g，0.20mmol)添加至以上化合物(4.50mmol)於甲醇(100mL)中之溶液中且將所得混合物在正常壓力下氫化16小時，且接著在40℃下在音波處理器中1小時。經CeliteTM濾出催化劑且減壓蒸發濾液至乾燥。殘餘物藉由製備型HPLC(Column DeltaPak C18，15m；50×500mm；在80min期間乙腈/水30：70+0.05% TFA)純化，且冷凍乾燥，得到呈無色固體狀之(S)-1-胺基-25-(第三丁氧基羰基)-4,13,22,27-四側氧基-6,9,15,18-四氧雜-3,12,21,26-四氮雜四十二烷-42-磺酸(7)。
產量：1.95g(45%，來自1)。
LC-MS純度：98%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：2.87min。
LC-MS m/z：854.7(M+H)+。
在0℃下在氬氣下將2,4,6-三甲基吡啶(1.60mL，12.0mmol)添加至以上胺(7，2.06g，2.11mmol)於無水N,N-二甲基甲醯胺(20mL)中之溶液中。添加2-溴乙酸酐(0.68g，2.61mmol)且在0℃下攪拌所得溶液1小時。接著將反應混合物減壓蒸發至乾燥且用乙醚(2×10mL)濕磨殘餘物。殘留化合物(S)-1-溴-28-(第三丁氧基羰基)-2,7,16,25,30-五側氧基-9,12,18,21-四氧雜-3,6,15,24,29-五氮雜四十五烷-45-磺酸(8)未經進一步純化即用於下一步驟。
產量：定量(基於ELSD)。
LC-MS純度：95%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0 +0.1% FA)：3.04min。
LC-MS m/z：976.9(M+H)+。
將以上化合物(8，2.00mmol)溶解於二氯甲烷(20mL)、水(2mL)及三氟乙酸(25mL)中，且攪拌所得溶液2小時。減壓移除三氟乙酸且殘餘物與二氯甲烷(3×80mL)共蒸發。殘餘物藉由製備型HPLC(Column DeltaPak C18，15m；50×500mm；在70min期間乙腈/水30：70+0.05% TFA)純化，且冷凍乾燥，得到呈無色固體狀之(S)-1-溴-2,7,16,25-四側氧基-28-(16-磺基十六碳醯胺基)-9,12,18,21-四氧雜-3,6,15,24-四氮雜二十九烷-29-酸(9)。
產量：1.92g(98%，經2個步驟)。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,80C,dH)：4.68-4.58(m,1 H)；4.20-4.08(m,4 H)；3.94(s,2 H)；3.82-3.64(m,12 H)；3.60-3.46(m,8 H)；3.20-3.10(m,2 H)；2.51(t,J=7.2Hz,2 H)；2.37(t,J=7.3Hz,2 H)；2.26(bs,1 H)；1.92-1.80(m,2 H)；1.73-1.62(m,2 H)；1.55-1.44(m,2 H)；1.43-1.29(m,21 H)。
LC-MS純度：95%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：2.73min。
LC-MS m/z：920.9(M+H)+。
實施例10.7：製備(2S)-6-[(2-溴乙醯基)胺基]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-四唑-5-基)十七醯基胺磺醯基]丁醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]己酸
用DMF(60mL)使Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.29mmol/g(17.24g，5.0mmol)且洗滌7×5分鐘。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(2×60mL，2×15min)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(6×60ml)洗滌。稱出Fmoc-OEG-OH用於兩個反應(2×20mmol，15.416g)。溶解於120mL具有Oxyma之DMF(0.3M)中，且分出2×53mL之體積。將Fmoc-OEG-OH及Oxyma於DMF中之溶液(53.2mL，0.3M)與DIC(26.6mL，0.6M)於DMF中混合。活化AA 10min，接著添加至樹脂中，且將混合物振盪8小時。
排出樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×60mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(2×60mL，2×15min)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(6×60mL)洗滌。將Fmoc-OEG-OH及Oxyma於DMF中之溶液(53.2mL，0.3M)與DIC(26.6mL，0.6M)於DMF中混合。活化AA 10min，接著添加至樹脂中，且將混合物振盪8小時。排出樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×60mL)且接著用乙腈(2×60mL，2×8h)洗滌。
使以上樹脂0.27mmol/g(2.46g，0.66mmol)於DMF(12mL，3×5min)中膨脹。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(2×12mL，1×15min，1×30min)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(2×15mL)、DCM(2×15mL)、DMF(2×15mL)洗滌樹脂。
製造4-[17-(1H-四唑--5-基)十七醯基胺磺醯基]丁酸(0.966g，1.98mmol)、Oxyma(0.281g，1.98mmol)及DIC(0.309mL)於N,N-二甲基甲醯胺(15mL)中之溶液且靜置大致10分鐘以使胺基酸活化。接著將混合物添加至反應管道且振盪隔夜。
排出樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(2×15mL)、DCM(5×15mL)洗滌。MTT基團藉由1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇/DCM/三異丙基矽烷80/18/2， 3×20ml(各處理之間DCM洗滌為3×20min)裂解且接著用4×20mL DCM洗滌。將於10mL DMF中之溴乙酸(1.10g，7.92mmol)及DIC(0.62mL，3.96mmo)添加至樹脂中且振盪1小時。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×20mL)及二氯甲烷(5×20mL)洗滌。
用TFA(98%)、水(2%)(20mL持續1小時及20mL持續半小時)自樹脂裂解產物。用20mL DCM洗滌樹脂。蒸發溶劑，得到黃色油狀物。將油狀物溶解於EtOAc(50mL)中且用水(2×100mL)洗滌。在EtOAc層中沈澱出白色固體。真空減少一定量之EtOAc且過濾。用EtOAc洗滌沈澱物且在過濾器上乾燥，得到270mg白色固體。
LC-MS m/z：1026.39(M+H)+。
實施例10.8：製備4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[(2-溴乙醯基)胺基]-5-羧基戊基]胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-羧基-4-側氧基丁基]胺基]-10-側氧基癸氧基]苯甲酸
使2-氯三苯甲基樹脂100-200目1.5mmol/g(1，2.70g，4.05mmol)在無水二氯甲烷(40mL)中膨脹30分鐘。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，1.04g，2.70mmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.82mL，10.3mmol)於無水二氯甲烷(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪隔夜。過濾樹脂且用N,N-二異丙基乙胺(0.94mL，5.40mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(4：1，2×5min，2×40mL)中之溶液處理。接著用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)洗滌樹脂。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10 min，1×30min，2×40mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)、2-丙醇(2×40mL)、二氯甲烷(3×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)洗滌。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，3.18g，8.20mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，2.93g，8.20mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.87mL，16.4mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×40mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)、2-丙醇(2×40mL)、二氯甲烷(3×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)洗滌。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-戊二酸1-第三丁酯(Fmoc-L-Glu-OtBu，3.50g，8.20mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，2.93g，8.20mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.87mL，16.4mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×40mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)、2-丙醇(2×40mL)、二氯甲烷(3×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)洗滌。10-(4-(第三丁氧基羰基)苯氧基)癸酸酸(CNB，3.00g，8.20mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，2.93g，8.20mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.87mL，16.4mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、 二氯甲烷(4×40mL)、N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)及二氯甲烷(10×40mL)洗滌。
產物藉由用2,2,2-三氟乙醇(40mL)處理隔夜而自樹脂裂解。濾出樹脂且用二氯甲烷(4×40mL)洗滌。蒸發溶劑至乾燥，得到呈黃色油狀之純(S)-22-(第三丁氧基羰基)-33-(4-(第三丁氧基羰基)苯氧基)-10,19,24-三側氧基-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十三烷酸。
產量：2.26g(100%)。
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.95-7.87(m,2 H)；7.41-7.32(m,1 H)；7.05-6.95(m,1 H)；6.92-6.82(m,2 H)；6.61(d,J=7.7Hz,1 H)；4.49-4.37(m,1 H)；4.15(s,2 H)；4.04-3.95(m,4 H)；3.76-3.36(m,17 H)；2.39-2.09(m,5 H)；2.04-1.85(m,1 H)；1.84-1.70(m,2 H)；1.67-1.52(m,10 H)；1.50-1.39(m,11 H)；1.37-1.24(m,8 H)。
LC-MS純度：100%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)：4.49min。
LC-MS m/z：841.2(M+H)+。
使Wang-Fmoc-Lys(Mtt)-OH樹脂0.33mmol/g(3，4.15g，1.37mmol)在二氯甲烷(50mL)中膨脹30分鐘。藉由用含80% 1,1,1,3,3,3-六氟丙-2-醇之二氯甲烷(2×5min，2×10min，1×15min，1×30min，6×50mL)處理來移除Mtt基團。樹脂3用二氯甲烷(4×70mL)、含10% N,N-二異丙基乙胺之二氯甲烷(1×50mL)及二氯甲烷(2×50mL)洗滌。
將(S)-22-(第三丁氧基羰基)-33-(4-(第三丁氧基羰基)苯氧基)-10,19,24-三側氧基-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十三烷酸(2，2.30g，2.73mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧 化物四氟硼酸酯(TCTU，0.97g，2.73mmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.20mL，6.85mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪隔夜。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)、二氯甲烷(4×50mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×50mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×50mL)、2-丙醇(2×50mL)、二氯甲烷(3×50mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×50mL)洗滌。將溴乙酸(0.76g，5.48mmol)、N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC，0.85mL，5.48mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(0.91mL，5.48mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)、二氯甲烷(4×50mL)、N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)及二氯甲烷(10×40mL)洗滌。藉由用三氟乙醇/二氯甲烷混合物(2：1，30mL)處理3小時自樹脂裂解產物(4)。濾出樹脂且用二氯甲烷(4×40mL)洗滌。蒸發溶劑至乾燥，得到呈黃色油狀之純(2S,29S)-29-(2-溴乙醯胺基)-2-(10-(4-羧基苯氧基)癸醯胺基)-5,14,23-三側氧基-9,12,18,21-四氧雜-6,15,24-三氮雜三十烷二酸(4)。
產量：1.33g(100%)。
1H NMR譜圖(300MHz,DMSO-d6+DCl,dH)：7.93-7.76(m,2 H)；7.05-6.89(m,2 H)；4.16-4.05(m,3 H)；4.05-3.93(m,2 H)；3.93-3.79(m,5 H)；3.60-3.48(m,9 H)；3.46-3.32(m,4 H)；3.30-3.21(m,2 H)；3.21-3.12(m,2 H)；3.10-3.00(m,2 H)；2.19-1.77(m,6 H)；1.77-1.49(m,7 H)；1.48-1.22(m,12 H)。
LC-MS純度：95%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：3.02min。
LC-MS m/z：977.3(M+H)+。
實施例10.9：製備4-[12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(6S)-6-[(2-溴乙醯基)胺基]-6-羧基己基]胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-羧基-4-側氧基丁基]胺基]-12-側氧基十二烷氧基]苯甲酸
使2-氯三苯甲基氯樹脂100-200目1.5mmol/g(2.60g，3.90mmol)在無水二氯甲烷(40mL)中膨脹30分鐘。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，1.02g，2.60mmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.75mL，10.0mmol)於無水二氯甲烷(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪隔夜。過濾樹脂且用N,N-二異丙基乙胺(0.90mL，5.20mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(4：1，2×5min，2×40mL)中之溶液處理。接著用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)洗滌樹脂。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×40mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)、2-丙醇(2×40mL)、二氯甲烷(3×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)洗滌。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，3.06g，7.90mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，2.82g，7.90mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.76mL，15.0mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×40mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)、2-丙醇(2×40 mL)、二氯甲烷(3×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)洗滌。將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-戊二酸1-第三丁酯(Fmoc-L-Glu-OtBu，3.40g，7.90mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，2.82g，7.90mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.76mL，15.0mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×40mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)、2-丙醇(2×40mL)、二氯甲烷(3×40mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×40mL)洗滌。12-(4-(第三丁氧基羰基)苯氧基)十二烷=酸(CUB，3.12g,7.90mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，2.82g，7.90mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.76mL，15.0mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)、二氯甲烷(4×40mL)、N,N-二甲基甲醯胺(4×40mL)及二氯甲烷(10×40mL)洗滌。
產物藉由用2,2,2-三氟乙醇(40mL)處理隔夜而自樹脂裂解。濾出樹脂且用二氯甲烷(4×40mL)洗滌。蒸發溶劑至乾燥，得到呈黃色油狀之純(S)-22-(第三丁氧基羰基)-35-(4-(第三丁氧基羰基)苯氧基)-10,19,24-三側氧基-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十五烷酸。
產量：1.93g(86%)。
LC-MS純度：100%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：4.88min。
LC-MS m/z：869.2(M+H)+。
使Wang-Fmoc-Lys(Mtt)-OH樹脂0.33mmol/g(3.40g，1.11mmol)在二氯甲烷(50mL)中膨脹30分鐘。藉由用含80% 1,1,1,3,3,3-六氟丙-2-醇之二氯甲烷(2×5min，2×10min，1×15min，1×30min，6×50mL)處理來移除Mtt基團。樹脂用二氯甲烷(4×70mL)、含10% N,N-二異丙基乙胺之二氯甲烷(1×50mL)及二氯甲烷(2×50mL)洗滌。
將(S)-22-(第三丁氧基羰基)-35-(4-(第三丁氧基羰基)苯氧基)-10,19,24-三側氧基-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十五烷酸(1.93g，2.22mmol)、5-氯-1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸酯(TCTU，0.79g，2.22mmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.86mL，6.66mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪隔夜。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)、二氯甲烷(4×50mL)及N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×10min，1×30min，2×50mL)處理來移除Fmoc基團。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(3×50mL)、2-丙醇(2×50mL)、二氯甲烷(3×50mL)及N,N-二甲基甲醯胺(3×50mL)洗滌。將溴乙酸(0.62g，4.44mmol)、N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC，0.69mL，4.44mmol)及2,4,6-三甲基吡啶(0.59mL，4.44mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)中之溶液添加至樹脂中且將混合物振盪1小時。過濾樹脂且用N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)、二氯甲烷(4×50mL)、N,N-二甲基甲醯胺(4×50mL)及二氯甲烷(10×40mL)洗滌。藉由用三氟乙醇/二氯甲烷混合物(2：1，30mL)處理3小時自樹脂裂解產物。濾出樹脂且用二氯甲烷(4×40mL)洗滌。蒸發溶劑至乾燥，得到呈黃色油狀之純(2S,29S)-29-(2-溴乙醯胺基)-2-(12-(4-羧基苯氧基)十二碳醯胺基)-5,14,23-三側氧基-9,12,18,21-四氧雜-6,15,24-三氮雜三十烷二酸。
產量：1.10g(99%)。
1H NMR譜圖(300MHz,DMSO-d6+DCl,dH)：7.93-7.74(m,2 H)；7.06-6.86(m,2 H)；4.20-3.93(m,5 H)；3.92-3.78(m,6 H)；3.54(s,9 H)；3.46-2.94(m,12 H)；2.19-1.84(m,5 H)；181-1.52(m,6 H)；1.51-1.23(m,15 H)。
LC-MS純度：97%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：3.20min。
LC-MS m/z：1005.3(M+H)+。
實施例10.10：製備(2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙醯基)胺基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙胺基]-5-側氧基-2-[16-(1H-四唑-5-基)十六醯基胺基]戊酸
將1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCHCl，6.25g，32.6mmol)添加至16-(1H-四唑-5-基)十六烷酸酸(1，5.28g，16.3mmol)及N-羥基丁二酸醯亞胺(HOSu，3.75g，32.6mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(70mL)中之攪拌溶液中且攪拌混合物隔夜。用1M氫氯酸水溶液(400mL)稀釋反應混合物。粗產物用乙酸乙酯(4×400mL)萃取且有機相經無水硫酸鈉脫水。在過濾之後，減壓移除溶劑。將2-丙醇(100mL)添加至油狀殘餘物中且濾出沈澱之白色固體。藉由自2-丙醇(70mL)再結晶獲得呈白色微晶固體狀之純產物(2)。
產量：4.73g(69%)。
RF(SiO2，乙酸乙酯)：0.35。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,dH)：3.02(t,J=7.7Hz,2 H)；2.86(s,4 H)；2.62(t,J=7.3Hz,2 H)；1.90-1.63(m,4 H)；1.30(bs,22 H)。
使結合2-氯三苯甲基樹脂之Fmoc-gGlu(tBu)-OEG-OEG-(11.5mmol，製備描述於實施例10.6之延長子合成之程序中)在二氯甲烷(100mL)中膨脹20分鐘。樹脂用N,N-二甲基甲醯胺(2×100ml)洗滌。藉由用含20%哌啶之N,N-二甲基甲醯胺(1×5min，1×30min，2×100mL)處理來移除Fmoc基團。用N,N-二甲基甲醯胺(3×100mL)、2-丙醇(2×100mL)及二氯甲烷(8×100mL)洗滌樹脂。藉由用含1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇之二氯甲烷(2：8，80mL)處理2小時自樹脂裂解產物。濾出樹脂且用二氯甲烷(2×80mL)洗滌。合併溶液；蒸發溶劑，以獲得呈淺棕色油狀之產物(4)。粗產物含有2當量之1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇。
產量：9.49g(99%，對具有2當量HFIP之加成物進行計數)。
1H NMR譜圖(300MHz,CDCl3,dH)：7.72-7.64(m,1 H)；7.59-7.50(m,1 H)；4.00(s,2 H)；3.94(s,2 H)；3.94-3.85(m,1 H)；3.71-3.32(m,16 H)；2.56-2.45(m,2 H)；2.42-2.26(m,1 H)；2.16-2.02(m,1 H)；1.49(s,9 H)。
向以上酸(6.10g，7.93mmol)於四氫呋喃(50mL)及16-(1H-四唑-5-基)十六烷酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-酯(2，3.33g，7.93mmol)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(6.91mL，39.6mmol)且攪拌反應混合物隔夜。接著減壓移除溶劑且殘餘物藉由急驟管柱層析(Silicagel 60，0.040-0.063mm；洗提劑：二氯甲烷/甲醇/乙酸15：1：0.2至5：1：0.2)純化。藉由冷凍乾燥自乙腈/水混合物(1：1)移除剩餘乙酸，得到呈灰白色固體狀之純(5)。
產量：1.39g(22%)。
1H NMR譜圖(300MHz,DMSO-d6,dH)：8.13-8.07(m,1 H)；8.01-7.93(m,1 H)；7.74-7.68(m,1 H)；4.11-3.99(m,1 H)；3.88(s,2 H)；3.82(s,2 H)；3.62-3.49(m,8 H)；3.49-3.37(m,4 H)；3.33-3.15(m,4 H)；2.73-2.65(m,2 H)；2.18-2.03(m,4 H)；1.94-1.81(m,1 H)；1.80-1.67(m,1 H)；1.66-1.53(m,2 H)；1.53-1.41(m,2 H)；1.38(s,9 H)；1.23(s,22 H)。
向以上化合物(1.39g，1.73mmol)、1-((二甲胺基)(二甲亞胺基)甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(V)(HATU，657mg，1.73mmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.21mL，6.90mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(30mL)中之溶液中添加(2-胺基乙基)胺基甲酸苯甲酯(6，400mg，1.73mmol)且攪拌反應混合物隔夜。接著減壓移除溶劑且殘餘物藉由急驟管柱層析(Silicagel 60，0.040-0.063mm；洗提劑：乙酸乙酯/甲醇/乙酸15：1：0.2至二氯甲烷/甲醇/乙酸15：1：0.2)純化，得到呈淺棕色黏稠固體狀之純產物(7)。
產量：1.63g(97%)。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,dH)：7.35(bs,5 H)；5.25-5.12(m,2 H)；4.50-4.42(m,1 H)；4.14(s,2 H)；4.09(s,2 H)；3.79-3.30(m,20 H)；3.02(t,J=7.6Hz,2 H)；2.46-2.27(m,4 H)；2.26-2.09(m,1 H)；2.05-1.92(m,1 H)；1.88-1.72(m,2 H)；1.72-1.53(m,2 H)；1.47(s,9 H)；1.29(bs,22 H)。
在氫氣層下向以上化合物(1.63g，1.67mmol)於甲醇中之溶液中添加鈀/碳(10%，0.25g，0.23mmol)且劇烈攪拌反應混合物2小時。接著反應混合物經由短矽藻土襯墊過濾且用甲醇洗滌。減壓移除溶劑，得到呈白色固體泡沫體之純產物(8)。
產量：1.32g(94%)。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,dH)：4.50-4.42(m,1 H)；4.16-4.10(m,4 H)；3.71-3.61(m,14 H)；3.59-3.51(m,2 H)；3.51-3.45(m,2 H)；3.40-3.32 (m,2 H)；3.02(t,J=7.6Hz,2 H)；2.45-2.28(m,4 H)；2.27-2.12(m,1 H)；2.05-1.93(m,1 H)；1.89-1.74(m,2 H)；1.70-1.58(m,2 H)；1.47(s,9 H)；1.30(bs,22 H)。
將以上化合物(1.32g，1.57mmol)溶解於三氟乙酸(90mL)及水(10mL)之混合物中。在90分鐘之後，減壓移除揮發物且有甲苯(3×50mL)下蒸發殘餘物。將殘餘物溶解於N,N-二甲基甲醯胺(15mL)中且冷卻至0℃。添加溴乙酸酐(678mg，2.61mmol)及碳酸氫鈉(2.02g，24.0mmol)，同時攪拌，且使反應混合物升溫至環境溫度。在60分鐘之後，再添加溴乙酸酐(200mg，0.77mmol)以完成反應。在30分鐘之後，減壓移除溶劑，得到不可與二氯甲烷、乙酸乙酯及水混溶之淺棕色液體。將殘餘物置放於分液漏斗中且試圖溶解於乙酸乙酯(50mL)及水(50)中。產生三個相。移除乙酸乙酯相及水相，且第三相藉由製備型HPLC(Column labio DeltaPak C18，15mm，50×500mm，乙腈/水25：75至50：50+0.05% TFA)純化。將所得溶液冷凍乾燥，得到呈白色固體狀之標題產物(9)。
產量：210mg(15%)。
1H NMR譜圖(300MHz,AcOD-d4,dH)：4.64-4.56(m,1 H)；4.12(s,2 H)；4.10(s,2 H)；3.95(s,2 H)；3.77-3.59(m,12 H)；3.59-3.37(m,8 H)；3.02(t,J=7.6Hz,2 H)；2.44(t,J=7.8Hz,2 H)；2.34(t,J=8.0Hz,2 H)；2.28-2.18(m,1 H)；2.15-2.04(m,1 H)；1.86-1.70(m,2 H)；1.70-1.56(m,2 H),1.29(bs,22 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt(Kinetex C18,4.6mm×50mm，乙腈/水20：80至100：0+0.1% FA)：3.35min。
LC-MS m/z：908.8(M+H)+。
實施例11：製備具有延長子之MIC-1化合物
實施例11.1：化合物01
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
將30mg延長子(實施例10.4，8當量)溶解於1.5mL飽和NaHCO3中且添加至於PBS緩衝液(pH 7.4)中之108mg具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：288)中，2.1mg/mL。添加19mg雙(對磺酸根基苯基)苯膦鉀鹽二水合物，Sigma-Aldrich 698539(8當量)。在室溫下靜置24小時之後，蛋白質經C4逆相管柱使用10-50%乙醇/磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)梯度來純化。在純化之後產量為約20%。
理論質量：32006.3；實驗值：32006.5。
實施例11.2：化合物02
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2- [[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物02使用實施例11.1中所述之程序使用具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：291)製備。
理論質量：31974.3；實驗值：31974.0
實施例11.3：化合物03
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-27,GlyA-26,SerA- 25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物03使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.2中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：291)製備。
理論質量：31918.2；實驗值：31918.0。
實施例11.4：化合物04
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-27,GlyA-26,SerA- 25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物04使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.3中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：291)製備。
理論質量：31862.1；實驗值：31862.0。
實施例11.5：化合物05
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物05使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.4中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：289)製備。
理論質量：31962.2；實驗值：31962.0。
實施例11.6：化合物06
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA- 7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物06使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.4中所述之 延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：303)製備。
理論質量：31902.1；實驗值：31902.0
實施例11.7：化合物07
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物07使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.4中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：292)製備。
理論質量：31874.1；實驗值：31873.0。
實施例11.8：化合物08
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙 胺基]-2-側氧基乙基]CysA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物08使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.4中所述之 延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：293)製備。
理論質量：31902.1；實驗值：31901.0
實施例11.9及實施例11.10：化合物09及化合物10
化合物09：
N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物10：
N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB- 19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
將溶解於2mL 40%羥丙基-β-環糊精中之20mg延長子(實施例10.1，8當量)添加至於40mL PBS緩衝液(pH 7.4)中之75mg具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：164)中。添加100μL甲硼烷吡啶複合物(8M)。在室溫下靜置24小時之後，再添加20mg延長子及100μL甲硼烷試劑。
在48小時之後，單及二烷基化蛋白質混合物經C4逆相管柱使用 10-50%乙醇/磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)梯度純化。在純化之後產生約19%單烷基化蛋白質(化合物09)及6%二烷基化蛋白質(化合物10)。
化合物09：理論質量：31073.0；實驗值：31073.5
化合物10：理論質量：31908.1；實驗值：31908.5
實施例11.11：化合物11
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物11使用實施例11.1中所述之程序使用實施例10.4中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：290)製備。
理論質量：31934.1；實驗值：31938.5。
實施例11.12及實施例11.13：化合物12及化合物13
化合物12：
N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基- GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
化合物13：
N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
化合物12及13使用實施例11.10中所述之程序使用實施例10.1中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：311)製備。
化合物12：理論質量：28212.3；實驗值：28211.9
化合物13：理論質量：27377.2；實驗值：27376.8
實施例11.14：化合物14
N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB- 9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
化合物14使用實施例11.10中所述之程序使用實施例10.5中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：311)製備。
理論質量：28043.9；實驗值：28043.6。
實施例11.15及實施例11.16：化合物15及化合物16
化合物15：
N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯 基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,ArgB91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物16：
N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]甲基]苯基]甲基-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,ArgB91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物15及16使用實施例11.10中所述之程序使用實施例10.1中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：312)製備。
化合物15：理論質量：31241.1；實驗值：31242.0。
化合物16：理論質量：32076.0；實驗值：32075.0。
實施例11.17：化合物17
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
將4mL 2M TRIS緩衝液添加至於15mM檸檬酸/450mM氯化鈉(pH 3)中之176mg具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：288)中，2.2mg/mL。將實施例10.6中所述之延長子溶解於飽和碳酸氫鈉中至20mg/L，8當量。接著將延長子添加至多肽溶液中。添加12.4mg雙(對磺酸根基苯基)苯膦鉀鹽二水合物，Sigma-Aldrich 698539溶解於水(0.1mg/mL)中且輕輕振盪反應混合物10秒。在6小時之後，化合物經C4管柱使用C4逆相管柱使用10-50%乙醇/磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)純化。
理論質量：32050.3；實驗值：32050.0。
實施例11.18：化合物18
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[[(5S)-5-羧基-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-四唑-5-基)十七醯基胺磺醯基]丁醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[[(5S)-5-羧基-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-四唑-5-基)十七醯基胺磺醯基]丁醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物18使用實施例11.17中所述之程序使用實施例10.7中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：288)製備。
理論質量：32266.6；實驗值：32266.0。
實施例11.19：化合物19
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[[(1S)-1-羧基-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA- 19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[[(1S)-1-羧基-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物19使用實施例11.17中所述之程序使用實施例10.8中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：288)製備。
理論質量：32166.3；實驗值：32166.0。
實施例11.20：化合物20
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[[(1S)-1-羧基-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[[(1S)-1-羧基-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物20使用實施例11.17中所述之程序使用實施例10.9中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：288)製備。
理論質量：32222.4；實驗值：32222.0。
實施例11.21：化合物21
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[16-(1H-四唑-5-基)十六醯基胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{β}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[16-(1H-四唑-5-基)十六醯基胺 基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙胺基]-2-側氧基乙基]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物21使用實施例11.17中所述之程序使用實施例10.10中所述之延長子及具有N延伸部分之MIC-1多肽(SEQ ID NO：288)製備。
理論質量：32026.3；實驗值：32026.0。
化合物01至21之結構概述於表18中。
實施例12：MIC-1化合物之溶解度
MIC-1化合物之樣品在PBS緩衝液(pH 7.4)中，之後高濃縮該樣品至高於35mg/ml來製備。
於PBS中之MIC-1化合物樣品經Vivaspin 20 10kDa MWCO(Sartorius)根據Vivaspin手冊中之描述來濃縮。在4000rpm(3310 x g)下使用配備有擺桶轉子之Heraus Multifuge X3R離心機(Thermo Scientific)濃縮MIC-1化合物樣品。濃度隨後藉由經Nanodrop 2000(Thermo Scientific)量測280nm下之UV來確定。所量測之濃度呈現於表19中。
可見連接各個延長子並不影響藉由將N端胺基酸延伸部分添加至MIC-1多肽中獲得之改良之溶解度。
實施例13：具有延長子之MIC-1化合物之試管內效力及結合活性分析
細胞系
穩定細胞系BHK21-hGFRAL-IRES-hRET在Novo Nordisk由在螢光素酶報導子前面添加具有血清反應元素(Serum Response Element，SRE)之載體產生(參見實施例5)。在Uniprot獲得人類GFRAL及人類RET之序列：UniProtKB-Q6UXV0(GFRAL_HUMAN)及UniProtKB-P07949(RET_HUMAN)。此細胞系用於官能性螢光素酶分析以及閃爍近接分析(Scintillation proximity assay；SPA)結合之膜製備。
螢光素酶分析：用hGFRAL、hRET受體及SRE-螢光素酶報導基因穩定轉染之BHK21細胞藉由不同濃度之MIC-1化合物處理。受體之活化藉由螢光素酶活性之定量化來量測，且化合物之效力藉由EC50計算。
SPA結合：BHK21-hGFRAL-IRES-hRET之細胞膜、SRE-螢光素酶細胞藉由50pM具有不同濃度之MIC-1化合物的I125標記之MIC-1處理來分離。MIC-1化合物之結合效力藉由位移曲線之IC50計算。
螢光素酶分析
將具有冷凍細胞之小瓶快速解凍且使細胞移動至具有10ml預溫熱完全培養基之50ml康寧管道中，該培養基由具有高葡萄糖及丙酮酸鈉之DMEM、加熱不活化10%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素、1mg/ml G418-遺傳黴素及400μg/ml潮黴素組成。細胞以1200rpm離心且丟棄上清液。重複此洗滌程序一次，使得細胞洗滌2次。將細胞再懸浮於完全培養基中達濃度為1.2×106個細胞/毫升。細胞以每孔1.2×105個細胞(100微升/孔)接種於96孔經聚-D-離胺酸塗佈之分析盤中。在+34℃下使細胞附著於孔之底表面4-6小時，之後培養基變為80μl由具有15mM HEPES之RPMI培養基組成之饑餓培養基。細胞在+34℃下在具有5% CO2之潮濕環境中培育隔夜。測試化合物用由有或無5%人類血清 白蛋白(HSA)之RPMI、15mM HEPES及0.5%卵白蛋白組成之分析培養基連續稀釋。將20μl含有測試化合物之分析緩衝液添加至各孔中，使得0.1%卵白蛋白、1% HSA及測試化合物之最終濃度在30000pM至3pM之範圍內，包括一空白。盤在+37℃下在具有5% CO2之潮濕環境中培育4小時。在培育之後，將100μl螢光素酶基質溶液添加至各孔中且密封。使板培育15分鐘，之後讀取螢光。螢光之強度量測用於藉由S形劑量反應曲線之非線性回歸分析計算EC50值。
SPA結合
BHK21-hGFRAL-IRES-hRET細胞在+37℃下在具有5% CO2之潮濕氛圍中在完全培養基中培養，該完全培養基由具有高葡萄糖及丙酮酸鈉之DMEM、加熱不活化10%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素、1mg/ml G418-遺傳黴素及400ug/ml潮黴素組成。細胞用冰冷達爾伯克氏磷酸鹽緩衝之生理食鹽水(Dulbecco's phosphate-buffered saline；DPBS)洗滌兩次且藉由刮擦以機械方式分離，於冰冷DPBS中轉移至錐形離心管中且在+20℃下以1500rpm離心5min。使細胞集結粒再懸浮於總量10ml之冰冷均質化緩衝液A(50mM Tris、2.5mM EDTA，每50ml用一個無EDTA之蛋白酶抑制劑混合物錠調節為pH 7.4)中且均質化20秒。在+4℃下以16000rpm使勻漿離心20分鐘。丟棄上清液且用10ml均質化緩衝液B(50mM Tris、320mM蔗糖，每50ml用一個無EDTA之蛋白酶抑制劑混合物錠調節為pH 7.4)將集結粒復原且均質化20秒，且在+4℃下以16000rpm離心20分鐘。再重複此程序一次。丟棄上清液且集結粒用3ml均質化緩衝液B復原且在低速下均質化10秒。蛋白質濃度藉由標準布拉福方法(Bradford method)確定且以每管1.5mg蛋白質/等分至冷凍管且在-80℃下儲存。在白色96孔盤中在每孔200μl之總體積中執行結合分析。麥胚凝集素SPA珠粒用分析緩衝液(50mM Tris/HCl、4.5mM MgCl2、0.02% Tween 20及0.25%卵白蛋白，pH 7.4)復原且將與膜製劑混合，得到最終濃度每孔0.5mg SPA珠粒 及10μg總蛋白質。與50pM之濃度對應，添加每孔每分鐘五萬計數之放射配位體人類[125I]-MIC-1(在Novo Nordisk產生)。待測試MIC-1化合物用分析緩衝液連續稀釋，得到1μM至1pM範圍內之最終分析濃度。將盤密封且在+22℃下於設定為350rpm之盤振盪器中培育2小時，且此後以1500rpm離心10分鐘，之乎讀取SPA珠粒光發射。放射配位體之位移量測為自SPA珠粒之光發射之減小，且IC50值藉由S形劑量反應曲線之非線性回歸分析計算。
如表20可見，與無脂肪酸之MIC-1多肽相比，具有脂肪酸之MIC-1化合物具有類似試管內效力。但若Cys突變接近MIC-1多肽之N端，諸如 Cys突變S(-3)C，則試管內效力將降低。
具有脂肪酸之MIC-1化合物具有與無脂肪酸之MIC-1多肽類似之效力的研究結果出人意料。一般而言，將脂肪酸添加至醫藥生物學化合物中以用於延長導致效力降低，且此降低一般藉由量測白蛋白存在下之效力進一步增強。因此，具有脂肪酸延長子之MIC-1化合物之效力不減小之研究結果出人意料。
實施例14：瘦弱史泊格多利大鼠中MIC-1化合物對食物攝入及體重之影響
在9至11週齡之瘦弱雄性史泊格多利大鼠中量測本發明之MIC-1化合物之活體內功效。動物每日在黑暗階段開始之前以體重8奈莫耳/公斤之劑量注射1-2小時。在適當緩衝溶液中皮下投予化合物(1-4ml/kg)。食物攝入之變化使用自動食物監測系統(對於大鼠為BioDAQ系統及HM2系統)量測7天。在BioDAQ系統中，動物單個圈養；且在HM2系統中，動物在每個籠3隻動物下以群組圈養。在第8天，在投與化合物之後2至3小時收集尾部血液樣本，且使用此樣品量測投予之化合物之血漿濃度。在n=4-8個動物中測試各化合物。在實驗之前使動物適應至少7天。所收集之食物攝入資料表示為自開始各每日12小時黑暗階段至次日黑暗階段量測之每日食物攝入(24小時食物攝入)。藉由自治療組之平均每日食物攝入減去媒劑組之平均每日食物攝入來計算回應於所投予化合物之食物攝入之每日變化。若使用雙尾史都登氏t測試(two-tailed student's t-test)p<0.1，則變化視為顯著的。結果表示為研究時段期間記錄之與媒劑(緩衝溶液，百分比)相比之食物攝入的「最大減小」。資料亦表示為食物攝入之「積累減少」，其呈研究時段期間食物攝入之顯著(p<0.1)每日降低(百分比)之總和的形式。在研究終止當天使用校準標度量測動物之體重。處理對體重之影響計算為研究終止時化合物處理之動物相比於媒劑處理之動物之間的體重百分數差。
表21之實驗性資料展示，與野生型MIC-1化合物相比時，具有或不具有延長子之MIC-1化合物在大鼠中具有等效或較佳活體內功效。資料亦展示此等延長子對MIC-1化合物之活體內功效不具有消極影響。
實施例15：豬中之藥效動力學(Pharmacodynamic；PD)研究
此實驗之目的為研究MIC-1化合物對豬之食物攝入及體重之影響。此舉在如下所述之藥效動力學(PD)研究中實現，其中與經媒劑處理之對照組相比，在投予單次劑量之MIC-1化合物之後1至21天量測食物攝入。
使用大致3月齡、稱重大致30-35kg之雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)豬(n=4-6隻/組)。在適應動物設施期間將動物以組形式圈養持續大致1週。在最後一部分適應時段期間，(在給藥之前2週)及在量測個別食物攝入之完整實驗期間將動物置放於個別圍欄中。在給藥之前最後三天量測食物攝入充當基線。
在適應與實驗時段期間始終用豬飼料(Svinefoder Danish Top SI 611+3’，Danish Agro)任意餵養動物。藉由連續使用HMview系統記錄飼料重量線上監測食物攝入(Ellegaard Systems,Faaborg,Denmark)。收集任何顯著溢出物且稱重，且針對此量校正自動量測之食物攝入。
在研究期間每週一次或兩次量測體重。
將MIC-1化合物溶解於濃度為大致25或100nmol/ml之適當緩衝液中，與1或9nmol/kg之劑量對應。緩衝溶液亦充當媒劑。
在第1天上午，動物給藥單次皮下劑量之MIC-1化合物或媒劑，且在給藥之後21天量測食物攝入。在研究結束時，經由耳靜脈導管靜脈內投予過度劑量之Euthasol使動物安樂死。
以24小時間隔計算食物攝入(0-24小時、24-48小時、48-72小時、72-96小時至20-21天)。在以下表22中，結果意謂食物攝入呈現為相同時間間隔之媒劑組之平均食物攝入之百分比。
資料展示，在注射9nmol/kg劑量及化合物01之後，豬中單次皮 下注射測試化合物使食物攝入減少持續多達及甚至大於21天。
在研究期間量測體重且在用MIC-1化合物處理之群組中豬重量增加較少(表23，圖6)。
實施例16：瘦弱SD大鼠中之藥物動力學研究
此研究之目的為確定MIC-1化合物在向瘦弱史泊格多利大鼠靜脈內及皮下投予後之活體內終半衰期(T½)、平均滯留時間(mean residence time；MRT)、最大血漿含量之時間(Tmax)及生物可用性(F)時間。此舉在藥物動力學(PK)研究中實現，其中確定所討論之MIC-1化合物之PK參數。T½一般意謂在靜脈內給藥下在初始分配階段之後量測之使某一血漿濃度減半所花費的時間。MRT一般意謂所討論之化合物保持於體內之平均時間量。Tmax一般意謂皮下投予所討論之化合物之後所討論之化合物在期間在血漿中達到最高濃度時之時間點。F一般意謂血漿中出現之皮下投予之化合物之分數。
在300g-500g瘦弱SD大鼠中藉由將化合物注入至尾部靜脈或頸之皮下組織中，之後在暴露分析之各個時間點收集血漿樣品來量測前述PK參數。靜脈內投予(1ml/kg)於適當緩衝溶液中之化合物(4-5奈莫耳/公斤體重)。靜脈內基團之基團尺寸典型地為4且皮下基團之基團尺寸典型地為5。在整個實驗期間大鼠清醒且獲取食物及水。
對於T½小於12小時之化合物，典型地在給藥之後5min、15 min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、14h、22h、30h、48h時間或在給藥之後0min、15min、30min、60min、90min、2h、2½h、3h、4h、5h、6h、8h、24h、30h、48h時間自舌頭收集血液樣品。用於T½大於24小時之化合物，典型地在給藥之後5min、15min、30min、60min、120min、360min、720min、24h、30h、48h、54h、72h、96h、168h、216h、264h、336h時間自舌頭收集血液樣品，將200μl血液收集至EDTA管中且儲存於冰上長達20分鐘。藉由在4℃下以10000G離心血液樣品5分鐘產生血漿樣品。將樣品隨後吸移至乾冰上之微管中，且保持在-20℃下，直至使用LOCI或類似基於抗體之分析(諸如ELISA)分析對應MIC-1化合物之血漿濃度。藉由非室體模型在Phoenix v.6.4軟體(Pharsight公司，Mountain View，CA，USA)中分析個別血漿濃度-時間曲線，且確定所得T½、MRT、Tmax及F(表24)。
可見與其具有N延伸部分之非延長MIC-1多肽相比，具有延長子之MIC-1化合物具有更長之T½、MRT及Tmax。具有可比脂肪酸延長子之醫藥生物學化合物之延長一般導致大鼠中終半衰期很少超過12小時。令人吃驚且出人意料的是終半衰期之研究結果大於48小時。
實施例17：小型豬之藥物動力學研究
此研究之目的為確定MIC-1化合物在向小型豬靜脈內投予後之活體內延長，亦即其於體內之時間且由此其作用時間之延長。此舉在藥物動力學(PK)研究中實現，其中確定所討論之化合物之終半衰期。終半衰期意謂使終末消除階段中之某一血漿濃度減半花費之時間。
將大致8月齡且稱重為大致23-25kg的獲自Ellegaard Göttingen小型豬(Dalmose,Denmark)之雄性Göttingen小型豬用於研究。將小型豬單獨圈養(具有永久導管之豬)於具有草稈作為鋪墊之圍欄中，且每日一次限制性地餵養Altromin 9030小型豬膳食(Altromin Spezialfutter GmbH & Co.KG)。
在適應三週之後，將兩個永久性中心靜脈導管植入各動物中之尾側腔靜脈中。在手術之後允許動物恢復1週，且接著用於連續給藥之間具有適合間歇期的重複藥物動力學研究。
經由一個導管靜脈內注射化合物(與0.17ml/kg對應之體積)， 且在預定時間點取樣血液直至給藥後12天(較佳來自其他導管)。
在EDTA(8mM)塗佈之管道中收集血液樣品(例如0.8ml)且接著在4℃及1942g下離心10分鐘。在預定時間點下收集血液樣品。在實施例中，在t=給藥前、在給藥之後0.0833、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、30、48、72、96、120、168、192、216、240、264及288小時收集血液樣品。
將血漿吸取至乾冰上之細微管中，且保持於-20℃下直至使用LOCI分析MIC-1化合物之血漿濃度。藉由非室體藥物動力學方法在Phoenix v.6.4軟體(Pharsight公司，Mountain View，CA，USA)中分析個別血漿濃度-時間曲線，且確定所得終半衰期(調和平均值)。
結果
獲得以下結果(表25)。
具有可比脂肪酸延長子之醫藥生物學化合物之延長一般導致小型豬中終半衰期很少超過100小時。令人吃驚且出人意料的是終半衰期之研究結果大於300小時。
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> N端延伸部分
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<220>
<223> N端延伸部分
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<223> N端延伸部分
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> N端延伸部分
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<220>
<223> N端延伸部分
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<220>
<223> N端延伸部分
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 148 
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 149 
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 150 
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 151 
<210> 152
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 152 
<210> 153
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 153 
<210> 154
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 154 
<210> 155
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 155 
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 156 
<210> 157
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 157 
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 158 
<210> 159
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 159 
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<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 160 
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 161 
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 162 
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
<400> 163 
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<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 164 
<210> 165
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 166 
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 167 
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 168 
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 169 
<210> 170
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 170 
<210> 171
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 171 
<210> 172
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 172 
<210> 173
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 173 
<210> 174
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N外延伸部分
<400> 174 
<210> 175
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 175 
<210> 176
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 176 
<210> 177
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 177 
<210> 178
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 178 
<210> 179
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 179 
<210> 180
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 180 
<210> 181
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 181 
<210> 182
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
<400> 182 
<210> 183
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 183 
<210> 184
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 184 
<210> 185
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 185 
<210> 186
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 186 
<210> 187
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 187 
<210> 188
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 188 
<210> 189
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 189 
<210> 190
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 190 
<210> 191
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 191 
<210> 192
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 192 
<210> 193
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 193 
<210> 194
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 194 
<210> 195
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 195 
<210> 196
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 196 
<210> 197
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 197 
<210> 198
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 198 
<210> 199
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 199 
<210> 200
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 200 
<210> 201
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 201 
<210> 202
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 202 
<210> 203
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 203 
<210> 204
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 204 
<210> 205
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 205 
<210> 206
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 206 
<210> 207
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 207 
<210> 208
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 208 
<210> 209
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 209 
<210> 210
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 210 
<210> 211
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 211 
<210> 212
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 212 
<210> 213
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 213 
<210> 214
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 214 
<210> 215
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 215 
<210> 216
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 216 
<210> 217
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 217 
<210> 218
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 218 
<210> 219
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 219 
<210> 220
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 220 
<210> 221
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 221 
<210> 222
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 222 
<210> 223
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 223 
<210> 224
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 224 
<210> 225
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 225 
<210> 226
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 226 
<210> 227
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 227 
<210> 228
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 228 
<210> 229
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 229 
<210> 230
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 230 
<210> 231
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 231 
<210> 232
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 232 
<210> 233
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 233 
<210> 234
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 234 
<210> 235
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 235 
<210> 236
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 236 
<210> 237
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 237 
<210> 238
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 238 
<210> 239
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 239 
<210> 240
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 240 
<210> 241
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 241 
<210> 242
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 242 
<210> 243
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 243 
<210> 244
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 244 
<210> 245
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 245 
<210> 246
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 246 
<210> 247
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 247 
<210> 248
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 248 
<210> 249
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 249 
<210> 250
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 250 
<210> 251
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 251 
<210> 252
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 252 
<210> 253
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 253 
<210> 254
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 254 
<210> 255
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 255 
<210> 256
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 256 
<210> 257
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 257 
<210> 258
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 260 
<210> 261
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 262 
<210> 263
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 263 
<210> 264
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 264 
<210> 265
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 265 
<210> 266
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 266 
<210> 267
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 267 
<210> 268
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 268 
<210> 269
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 269 
<210> 270
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 270 
<210> 271
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 271 
<210> 272
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 272 
<210> 273
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 273 
<210> 274
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 274 
<210> 275
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 275 
<210> 276
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 276 
<210> 277
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 277 
<210> 278
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 278 
<210> 279
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 279 
<210> 280
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 280 
<210> 281
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 281 
<210> 282
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 282 
<210> 283
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 283 
<210> 284
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 284 
<210> 285
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 285 
<210> 286
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 286 
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<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 287 
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
<400> 289 
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<212> PRT
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<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<212> PRT
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<223> 具有N端延伸部分之MIC-1多肽
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<223> N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽
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<223> MIC-1多肽
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<223> N端延伸部分
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Claims (11)
- 一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽、胺基酸延伸部分、及延長子；其中該胺基酸延伸部分為連接於該MIC-1多肽之N端的N端胺基酸延伸部分；其中該延長子連接於該胺基酸延伸部分；其中該胺基酸延伸部分由3至36個胺基酸殘基組成；其中該胺基酸延伸部分由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成：A、C、E、G、P、S及T；其中該胺基酸延伸部分具有一個半胱胺酸殘基；其中該胺基酸延伸部分之半胱胺酸殘基與該MIC-1多肽之N端胺基酸之間的距離為至少3個胺基酸；其中該MIC-1多肽加上該胺基酸延伸部分一起具有小於6.5之計算pI；其中該延長子連接於該胺基酸延伸部分之半胱胺酸殘基；其中該延長子包含化學式1、化學式2、化學式3及化學式4；其中化學式1選自以下之群：化學式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*、化學式1B：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、化學式1C：HOOC-苯-O-(CH2)y-CO-*、及化學式1D：(1H-四唑-5-基)-(CH2)x-CO-*，其中x為12至20範圍內之整數，其中y為5至15範圍內之整數；其中化學式2選自：化學式2A：*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*、及化學式2B：*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*， 其中化學式2之m為1至5範圍內之整數，且其中化學式2之k為0至4範圍內之整數；其中化學式3為化學式3：*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)l，其中化學式3之k為1至10範圍內之整數，其中n為1至5範圍內之整數，且其中l為0至5範圍內之整數；其中化學式4選自化學式4A：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、及化學式4B：*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，其中化學式4之m為1至5範圍內之整數；且其中化學式1、化學式2、化學式3及化學式4經由醯胺鍵互連，使一化學式之*-NH端連接至另一化學式之CO-*端，且其中化學式4在其CH2-*端連接至該胺基酸延伸部分之半胱胺酸殘基之硫原子。
- 如請求項1所述之化合物，其中化學式1選自以下之群：化學式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*、化學式1b：HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*及化學式1c：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO-*。
- 如請求項1或2所述之化合物，其中化學式2選自以下之群：化學式2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、及化學式2b：*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*。
- 如請求項1或2所述之化合物，其中化學式4為以下中之一者：化學式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*及化學式4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
- 如請求項1所述之化合物，其中該延長子為以下式IX、X、XI、XII及XIII中之一者：
- 如請求項1或2所述之化合物，其中該延伸部分之半胱胺酸殘基與該MIC-1多肽之N端胺基酸之間的距離為至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32個胺基酸。
- 如請求項1或2所述之化合物，其中該N端胺基酸延伸部分包含以下序列中之一或多者：SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：223)、SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：224)、SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：225)、SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：226)、SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：227)、SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：229)、SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：230)、SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：231)、SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：232)、SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：233)、SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：234)、SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：235)、SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：236)、及 SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：237)。
- 如請求項1或2所述之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含M57L、M86L或兩者，及/或與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含前三個殘基之缺失(MIC-1-△1-3)或N3之缺失(des-N3)。
- 如請求項1或2所述之化合物，其中該MIC-1多肽加上該胺基酸延伸部分一起包含根據以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117、164、288、289、290、291及292。
- 如請求項1所述之化合物，其中該化合物為下式中之任一者：
- 根據請求項1或2所述之化合物，其係用於預防及/或治療代謝病症，其中該代謝病症為肥胖症、糖尿病、心血管樣血脂異常(cardiovascular like dyslipidaemia)、動脈硬化、脂肪肝炎(steatohepatitis)或糖尿病性腎病。
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