CN107108709B - Fgf21衍生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在与成熟人FGF21的位置167、169、170、171、172、173、174、175，特别是位置180或位置181相对应的位置处具有半胱氨酸残基的FGF21蛋白的衍生物，以及具有附接至该半胱氨酸的侧链的其衍生物。本发明的FGF21衍生物表现出对FGF受体有高效力。本发明还涉及包含这类FGF21衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，以及该FGF21衍生物的医学用途。

Description

FGF21衍生物及其用途
技术领域
本发明涉及FGF21的类似物的衍生物，更具体地涉及在位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181处具有侧链的FGF21类似物，以及它们的医药用途。
序列表的援引并入
名称为“序列表(SEQUENCE LISTING)”的序列表为33kb，创建于2015年12月21日，并且通过引用并入本文。
背景
FGF21属于具有代谢作用而非促有丝分裂作用的非典型成纤维细胞生长因子(FGF)的FGF19亚族。FGF21结合并激活FGF受体(FGFR1c、FGFR2c和FGFR3c)，但仅在非信号传导共受体β-klotho(BKL)的存在下发生。BKL的组织特异性表达决定了FGF21的代谢活性。FGF21转基因小鼠对饮食诱发的肥胖症有抗性，并且寿命延长。FGF21是能量消耗、葡萄糖和脂质代谢的代谢调节物，其具有在患有糖尿病和血脂异常的肥胖患者中逆转体重、高血糖和血脂异常的巨大潜力。
FGF21由于蛋白水解而面临体内不稳定性的问题，并且多达一半的内源性循环人FGF21是无活性的。活性的丧失是由于C-末端的降解，这些代谢物中的大多数终止于P171而非S181。因此，对于治疗性FGF21分子来说，针对C-末端区的代谢分解的保护是需要的。C-末端区的工程改造可使其免受降解，然而迄今为止，这种工程改造的代价是工程化FGF21化合物的效力降低或丧失。FGF21的N-末端区与FGFR结合，而FGF21的C-末端区与BKL结合。C-末端氨基酸的截短导致效力显著丧失。
在[180C]FGF21的位置180处的PEG化导致体外活性大幅下降(J.Xu等人,Bioconjugate Chemistry(2013),24,915-925)。通过将Fc附接至FGF21的C-末端而产生的Fc融合蛋白比天然FGF21和FGF21的N-末端Fc融合体的效力低得多(Hecht等人,PLoS One2012,7(11),e49345)。
概述
本发明涉及相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)在与位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181之一相对应的位置具有侧链的FGF21衍生物。本发明涉及相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)在与位置180或181之一相对应的位置具有侧链的FGF21衍生物。更具体地，所述侧链共价附接至与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180相对应的FGF21类似物位置，或共价附接至与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置181相对应的FGF21类似物位置。
更具体地，所述侧链共价附接至与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置170、174或175相对应的FGF21类似物位置，或共价附接至与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、171、172或173相对应的FGF21类似物位置。
半胱氨酸存在于FGF21类似物中的侧链附接位置。该侧链共价附接至其所附接的半胱氨酸残基的硫原子。该侧链包含连接体和延长体(protractor)。该延长体可为脂防二酸。
所述连接体可包含若干个连接体元件，如一个或多个gGlu残基，和/或一个或多个Ado残基(Ado为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸)，以及/或者一个或多个具有*-NH基团和*-CO基团的其他二价基团(di-radical)。所述延长体和所述连接体经由酰胺键连接。所述连接体经由硫醚键连接至FGF21蛋白的180Cys或181Cys的硫原子。
所述连接体可包含若干个连接体元件，如一个或多个gGlu残基，和/或一个或多个Ado残基(Ado为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸)，和/或一个或多个Trx元件(Trx为氨甲环酸)，和/或一个或多个*-NH-S(＝O)2-(CH2)3-CO-*，以及/或者一个或多个具有*-NH基团和*-CO基团的其他二价基团。所述延长体和所述连接体经由酰胺键连接，而所述连接体经由在位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181的半胱氨酸的硫原子通过硫醚键连接至FGF21蛋白。
并入本发明FGF21衍生物中的FGF21蛋白为成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的类似物，该类似物在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置之一处包含半胱氨酸残基。
相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)，本发明衍生物的FGF21类似物可具有总计至多30个氨基酸改变，其中在位置180或181之一处的半胱氨酸算作一个氨基酸改变。最多29个其他改变可独立地为一个或多个延伸、一个或多个插入、一个或多个缺失，和/或一个或多个置换。
特别地，在第一方面，本发明涉及FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中所述蛋白在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相对应的位置处包含Cys残基，其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；其中该延长体选自：
化学式1A：HOOC-(CH2)X-CO-*，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*
化学式1C：HO-S(＝O)2-(CH2)x-CO-*
其中x为8-18范围内的整数；并且其中所述连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个；
其中化学式2选自：
化学式2A：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式2B：*-NH-S(＝O)2-(CH2)3-CO-*以及
化学式2C：*-NH-CH2-环己烷-CO-*，
其中化学式3为*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，并且
其中化学式4选自
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*和
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
其中m为1-5范围内的整数，并且
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
更特别地，在第一方面，本发明涉及FGF21蛋白的衍生物，其中所述蛋白包含在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基，以及与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)相比的最多30个氨基酸修饰；其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；其中该延长体为化学式1：HOOC-(CH2)x-CO-*，其中x为10-18范围内的整数，并且其中所述连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数。化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
被指定为化合物13至化合物24的本发明优选的FGF21衍生物在实验部分中公开。
被指定为化合物13至化合物18的本发明进一步优选的FGF21衍生物在实验部分中公开。
被指定为化合物35至化合物41的本发明进一步优选的FGF21衍生物在实验部分中公开。
被指定为化合物43至化合物56的本发明进一步优选的FGF21衍生物在实验部分中公开。
在进一步的方面，本发明涉及在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181相对应的位置处包含Cys残基的FGF21类似物。优选地，该类似物与人FGF21(SEQ ID NO:1)具有高度的同一性。可通过与人FGF21(SEQ ID NO:1)相比的氨基酸置换或修饰的数目来描述同一性的程度。
在进一步的方面，本发明涉及包含在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基，以及与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)相比的最多30个氨基酸修饰的FGF21类似物。
在第三方面，本发明涉及本发明的FGF21衍生物和类似物的医药用途，例如，用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病及相关疾病，如饮食失调、心血管疾病、糖尿病并发症；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能；和/或用于延缓或预防糖尿病进展；以及/或者用于治疗和/或预防肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
本发明的FGF21衍生物是生物活性的。例如，它们非常有效，另外或可替代地，它们与FGF受体非常好地结合。另外或可替代地，它们具有延长的药代动力学谱。例如，它们在静脉内施用至小鼠和/或小型猪时具有非常长的终末半衰期。良好效力与长半衰期的特别组合可能是非常理想的。
令人感兴趣的是，在与成熟人FGF21的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一相对应的位置处包含侧链的FGF21衍生物全部保留效力。
另外或可替代地，注意到，在与成熟人FGF21的位置180和181之一，特别是位置180相对应的位置处包含侧链的FGF21衍生物保留了高效力。
描述
在下文中，希腊字母可用其符号或相应的书面名称表示，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。此外，希腊字母μ也可用“u”表示，例如在μl＝ul或μM＝uM中。
化学式中的星号(*)表示附接点。
在第一方面，本发明涉及FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中所述蛋白在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相对应的位置处包含Cys残基，其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；其中该延长体选自：
化学式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*
化学式1C：HO-S(＝O)2-(CH2)x-CO-*
其中x为8-18范围内的整数；并且其中所述连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个；
其中化学式2选自：
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*，
*-NH-S(＝O)2-(CH2)m-CO-*以及
*-NH-(CH2)m-环己烷-CO-*，
其中m单独选自1-5范围内的整数，
其中化学式3为*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，并且
其中化学式4选自
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*和
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
其中m为1-5范围内的整数。
在进一步的实施方案中，化学式2选自：
*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
*-NH-S(＝O)2-(CH2)3-CO-*以及
*-NH-CH2-环己烷-CO-*。
在进一步的实施方案中，化学式2为*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*。
在进一步的实施方案中，化学式2为*-NH-S(＝O)2-(CH2)3-CO-*。
在进一步的实施方案中，化学式2为*-NH-CH2-环己烷-CO-*。
如上文提到的，所述衍生物包含经由酰胺键相互连接的化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个。此外，所述连接体元件按所示顺序连接。化学式2在其*-NH端连接至延长体的CO-*端，而化学式4在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
在进一步的方面，本发明涉及FGF21蛋白的衍生物，其中所述蛋白包含在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基，以及与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)相比的最多30个氨基酸修饰；其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；其中该延长体为化学式1：HOOC-(CH2)x-CO-*，其中x为10-18范围内的整数，并且其中所述连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数。化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的巯基基团。
FGF21蛋白和类似物
实际上，合成的天然FGF21蛋白具有28个氨基酸的信号肽以供分泌。由其余181个氨基酸组成的成熟FGF21多肽作为SEQ ID NO:1包含在序列表中。
本发明衍生物的FGF21蛋白有时可被称为该衍生物的“骨架”或“蛋白骨架”，或“FGF21类似物”。
如本文所用的，术语“FGF21蛋白”是指人FGF21(FGF21(1-181))的类似物或变体，人FGF21(FGF21(1-181))的序列作为SEQ ID NO:1包含在序列表中。具有SEQ ID NO:1序列的蛋白还可被称为“天然”FGF21、“成熟”FGF21和/或“成熟人”FGF21。
在序列表中，SEQ ID NO:1的成熟人FGF21的第一个氨基酸残基(组氨酸)被指定为第1号。
FGF21类似物的一个实例为具有N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:1的蛋白，其也被称为MetFGF21(SEQ ID NO:2)。当成熟人FGF21在大肠杆菌中表达时，N-末端Met被添加，参见例如WO 2006/050247，表6。在成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)位置1的组氨酸之前的另一个N-末端氨基酸残基被指定为第-1号位置。SEQ ID NO:2的MetFGF21的合适命名法的非限制性实例为MetFGF21、[Met]FGF21或[-1M]FGF21。
MetFGF21显示出与SEQ ID NO:1的成熟人FGF21相当的生物活性，并且出于实际原因，其常常代替SEQ ID NO:1的成熟人FGF21用作参考化合物。MetFGF21的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2包含在序列表中。
本文中，可参考i)成熟FGF21(1-181)中与改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即，成熟人FGF21中的相应位置)以及参考ii)实际改变，来描述本发明的FGF21蛋白。
本发明的一个方面涉及包含氨基酸置换的FGF21蛋白(FGF21类似物)，其中野生型氨基酸残基被半胱氨酸残基置换。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174和175之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置167、170、171、172、173、174、175和180之一相对应的位置处包含Cys残基。
在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置169、170、173、174、175、180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173、174、175和180之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173、174、175、180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173、174、175和180之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173、174和175之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173、174、180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173、174和180之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置170、173和174之一相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。
例如，本发明的FGF21蛋白被定义为在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置180相对应的位置处或在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置181相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置180或181相对应的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ IDNO:1)的位置180相对应的位置处包含Cys残基。
本发明FGF21蛋白的这些Cys残基可分别被指定为Cys180和Cys181。例如，在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置181相对应的位置处具有Cys残基的本发明FGF21蛋白可被称为Cys181 FGF21和/或181C FGF21，或者[Cys181]FGF21和/或[181C]FGF21。
以下是合适的类似物命名法的非限制性实例。
Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21表示成熟人FGF21的类似物，其中丙氨酸已添加至N-末端(即，在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置-1相对应的位置处的Ala)，位置121的天然存在的天冬酰胺已被谷氨酰胺置换，位置168的天然存在的甲硫氨酸已被亮氨酸置换，并且位置180的天然存在的丙氨酸已被半胱氨酸置换。
以下是FGF21类似物的衍生物的合适命名法的非限制性实例。S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21表示成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的类似物的衍生物，其中Ala[Gln121,Leu168,Cys180]表示相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的氨基酸改变，其中数字指代成熟FGF21的相应位置，并且其中取代基[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙基氨基]-2-氧代乙基]-共价附接至与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180相对应的位置处的半胱氨酸的硫原子。
本发明的FGF21蛋白可具有相比于FGF21(SEQ ID NO:1)的其他氨基酸改变，但仅限于最多30个氨基酸改变。这些改变也是相比于成熟人FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的，并且其可独立地代表一个或多个氨基酸置换、插入、延伸和/或缺失。
在特定实施方案中，该氨基酸改变在与FGF21(SEQ ID NO:1)的位置-1、121和168中的一个或多个相对应的一个或多个位置处。
在一个实施方案中，本发明的FGF21蛋白除半胱氨酸氨基酸置换外还包含-1Ala、121Gln和168Leu。
在实施方案中，本发明的FGF21蛋白除167Cys、170Cys、171Cys、172Cys、173Cys、174Cys、175Cys、180Cys和181Cys中的任一个外还包含-1Ala、121Gln和168Leu。也并入在实验部分中公开的本发明特定衍生物中的本发明特定FGF21蛋白为序列表中的SEQ ID NO:8、10、12、14、15、16、17、18、19和20。
在另一特定实施方案中，本发明的FGF21蛋白除180Cys或181Cys中的任一个外还包含-1Ala、121Gln和168Leu。
也并入在实验部分中公开的本发明特定衍生物中的本发明特定FGF21蛋白为序列表中的SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10。
与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)相比，“包含”某些指定改变的蛋白可包含另外的改变。
从以上实例可以明显看出，氨基酸残基可通过其全称、其单字母代码和/或其三字母代码来确定。这三种方式完全等效。
表述“等同于...的位置”或“相应位置”可用来参照成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)表征变异FGF21序列中的改变的位点。等同或相应位置，以及改变的编号，例如通过简单的书写和目测来容易地推断；以及/或者可使用标准蛋白质或肽比对程序，如基于Needleman-Wunsch算法的“align”。该算法在Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),Journal ofMolecular Biology,48:443-453中描述，而align程序由Myers和W.Miller在"OptimalAlignments in Linear Space"CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988)4:11-17中描述。为了比对，可以使用默认的打分矩阵BLOSUM62和默认的单位矩阵(identity matrix)，并可将空位中的第一残基的罚分设置为-12，或优选-10，而将空位中的其他残基的罚分设置为-2，或优选-0.5。
在下文插入了这类比对的一个例子，其中第1号序列为成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)，而第2号序列为类似物Ala[121Q,168L,181C]FGF21(SEQ ID NO:10)。所计算的同一性因此为97.8％。
#1：FGF21
#2：Ala[121Q,168L,181C]FGF21
#矩阵：EBLOSUM62
#空位罚分：10.0
#延伸罚分：0.5
#长度：182
#同一性：178/182(97.8％)
#相似性：179/182(98.4％)
#空位：1/182(0.5％)
#得分：952.0
Figure BDA0001325351030000111
Figure BDA0001325351030000121
在进一步的实施方案中，FGF衍生物的FGF21蛋白或类似物或FGF21骨架与人FGF21(SEQ ID NO:1)有至少80％的同一性，如至少85％的同一性，如至少90％的同一性，如与人FGF21(SEQ ID NO:1)至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
术语“蛋白”是指包含一系列通过酰胺(或肽)键相互连接的氨基酸的化合物。
本发明的蛋白包含至少151个通过肽键连接的组成氨基酸。在特定实施方案中，该蛋白包含至少160个，优选至少170个，更优选至少180个，甚至更优选至少181个，或最优选至少182个氨基酸。在其他特定实施方案中，该蛋白a)包含181或182个氨基酸，或b)由181或182个氨基酸组成。
在更进一步的特定实施方案中，所述蛋白由通过肽键相互连接的氨基酸组成。
可将氨基酸定义为包含胺基团和羧酸基团并任选地包含一个或多个通常被称为侧链的额外基团的化合物。例如，该胺基团可以为伯氨基或仲氨基基团。
氨基酸残基是并入肽或蛋白中的氨基酸的基团。
在特定的实施方案中，本发明的蛋白的氨基酸是α-氨基酸，在α-氨基酸中，伯氨基或仲氨基基团的氮原子与α-碳原子键合。
在另一个特定的实施方案中，本发明的蛋白的氨基酸选自编码氨基酸和非编码氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的蛋白的所有氨基酸都为编码氨基酸。
编码氨基酸可以如IUPAC(国际理论与应用化学联合会；参见http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/)推荐规范的3AA-1部分中的表1中所定义，其中给出了20种编码氨基酸的结构、俗称、学名、单字母符号和三字母符号。
术语“非编码氨基酸”是指所有其他氨基酸。非编码氨基酸的非限制性实例为编码氨基酸的D-异构体，如D-丙氨酸和D-亮氨酸。
在下文中，未说明光学异构体的所有具体氨基酸都应被理解为是指L-异构体(除非另外说明)，例如，除非另有说明，当提及具体氨基酸谷氨酰胺时，这是意在指L-谷氨酰胺。在另一方面，当通过更多通式如brutto式或结构式描述氨基酸并且未示出立体化学时，这些通式旨在涵盖所有的立体异构体。
根据本领域的一般做法，本发明的FGF21蛋白的N-末端在左侧示出，而C-末端在右侧示出。
FGF21衍生物
如本文在FGF21蛋白或类似物的情境中所用的，术语“衍生物”意指化学修饰的FGF21蛋白或类似物，其中数目明确的取代基已经与该蛋白的一个或多个具体氨基酸残基共价附接。该取代基可被称为侧链。
在特定实施方案中，所述侧链能够与白蛋白形成非共价缔合，由此促进衍生物随血流的循环，并且由于FGF21衍生物与白蛋白的缔合仅缓慢地分解以释放活性药物成分，因此还有延长该衍生物的作用时间的效果。
所述侧链包含本文中被称为延长体的部分。
相对于侧链与蛋白的附接点，所述延长体可以在侧链的远端处或远端附近。
在更进一步的特定实施方案中，所述侧链包含在延长体与肽附接点之间的部分，该部分可被称为连接体。该连接体可由一个或多个连接体元件组成。
在特定实施方案中，所述侧链和/或延长体是亲脂性的，和/或在生理pH(7.4)下带负电荷。
所述侧链可以通过烷基化与FGF21蛋白的半胱氨酸残基共价附接。
在优选的实施方案中，所述侧链以卤代乙酰胺基团的形式合成，并且通过卤代乙酰胺基团激活，该卤代乙酰胺基团在形成也被称为硫醚键的共价巯基-碳键(该过程被称为Cys烷基化)的条件下与半胱氨酸残基的巯基基团反应。因此，衍生物中不存在巯基基团，并且侧链通过硫原子连接。在与衍生物相关地提及巯基基团的情况下，其必须被理解为在Cys烷基化之前是半胱氨酸的巯基基团的一部分的硫原子。
在另一实施方案中，通过马来酰亚胺基团激活侧链，该马来酰亚胺基团在形成共价巯基-碳键的条件下与半胱氨酸残基的巯基基团反应。
对于本文的目的，术语延长体和连接体可包括这些分子的未反应的形式以及反应的形式。从使用该术语的语境中可以清楚地看出指的是某一种形式还是另一种形式。
在一个方面，每个延长体包含化学式1的延长体或由化学式1的延长体组成：
化学式1：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数。
在备选实施方案中，延长体化学式1选自由化学式1A、化学式1B和化学式1C限定的延长体：
化学式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为8-18范围内的整数，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*
其中x为8-18范围内的整数，以及
化学式1C：HO-S(＝O)2-(CH2)x-CO-*
其中x为8-18范围内的整数。
对于每一个不同的化学式1结构，由x限定的碳链的长度可在8-18之间不等，而如下所述，不同类型的延长体元件可偏好更短或更长的形式。
在1A的特定实施方案中，*-(CH2)x-*指直链亚烷基，其中x为10-18范围内的整数，如14-18或如14-16。
在1A的另一特定实施方案中，*-(CH2)x-*指其中x为16的直链亚烷基。该延长体可被简称为C18二酸，即具有18个碳原子的脂肪二羧酸。当x＝16时，该连接体元件的结构对应于化学式1a：
化学式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*。
在一个实施方案中，该延长体为化学式1B。在1B的实施方案中，*-(CH2)x-*指直链亚烷基，其中x为8-14范围内的整数。在特定实施方案中，当x＝9时，该连接体元件的结构对应于化学式1b。
化学式1b：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO*
在一个实施方案中，该延长体为化学式1C。在1C的实施方案中，*-(CH2)x-*指直链亚烷基，其中x为10-18范围内的整数，如12-18或14-18。在1C的特定实施方案中，当x＝15时，该连接体元件的结构对应于化学式1c。
化学式1c：HO-S(＝O)2-(CH2)15-CO-*
命名法与本领域常用的命名法一样，例如在上式中，*-CO-*指羰基(*-C(＝O)-*)。例如，在本文的任何通式(R-CO-*)(其中R是如每个通式所定义的)中，R-CO-*指R-C(＝O)-*。苯是指化学式1B中在C1和C4处分别被O-(CH2)x-*和–COOH取代的环结构。HO-S(＝O)2表示磺酸。
本发明衍生物的连接体包含以下连接体元件化学式2、化学式3和化学式4中的至少一个。元件化学式2和化学式3都带有–NH-和CO-端，从而允许它们通过酰胺键彼此相连，以及与延长体或化学式4的-CO-或-NH-连接。
化学式4具有–NH-端(能够与化学式2或化学式3形成酰胺键)和-NH-CO-CH2-端，其在未反应形式下是能够与FGF21类似物的半胱氨酸的巯基基团反应的卤代乙酰胺。
本发明衍生物的连接体包含以下连接体元件化学式2、化学式3和化学式4中的至少一个，
其中化学式2选自：
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*，
*-NH-S(＝O)2-(CH2)m-CO-*，
*-NH-(CH2)m-环己烷-CO-*，并且
其中m单独选自1-5范围内的整数。
其中化学式3为：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，并且
其中化学式4选自：
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*和
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
其中m单独选自1-5范围内的整数。
在一个实施方案中，化学式2为*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*，其中m为1、2或3。在一个实施方案中，m为2或3。
在m为2的实施方案中，连接体元件化学式2可被称为化学式2a，即*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*。连接体元件*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*可被简称为gGlu、gamma Glu或γ-Glu。在gGlu中，氨基酸谷氨酸的γ羧基基团用于与另一个连接体元件连接。在一个特定实施方案中，(每一个)gGlu连接体元件均为L型。
在一个实施方案中，化学式2为*-NH-S(＝O)2-(CH2)m-CO-*，其中m为1、2或3。在一个实施方案中，m为2或3。连接体元件*-NH-S(＝O)2-(CH2)m-CO-*为磺酸衍生物，其中羧基基团用于与另一个连接体元件连接。在一个实施方案中，m为3，因而连接体元件化学式2可被称为化学式2b：*-NH-S(＝O)2-(CH2)3-CO-*。
在一个实施方案中，化学式2为*-NH-(CH2)m-环己烷-CO-*，其中m为1、2或3。在一个实施方案中，m为2或3。因此，在化学式2结构中，环己烷环在C1和C4处分别被NH-CH2和CO取代。
在一个实施方案中，m为1，因而连接体元件化学式2可被称为化学式2c：*-NH-CH2-环己烷-CO-*。该连接体元件还可被称为Trx。
在化学式3的连接体元件中，“k”和“n”都可在1至5之间不等。当k＝n＝1时，该连接体元件的结构对应于化学式3a：
在一个实施方案中，化学式3为化学式3a：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。化学式3a的连接体元件可被简称为Ado(8-氨基-3,6-二氧杂辛酸)，因为它是Ado的二价基团。
在化学式4的连接体元件中，“m”可在1至5之间不等。在一个实施方案中，化学式4为*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，其中m为1、2、3或4。在一个实施方案中，m为2或3。
在一个实施方案中，当化学式4为*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*并且m＝2时，该连接体元件的结构对应于化学式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*。
在一个实施方案中，化学式4为*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，其中m为1、2、3或4。在一个实施方案中，m为2或3。在一个实施方案中，m为4或5。
当化学式4为*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*并且m＝4时，该连接体元件的结构对应于化学式4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
本发明衍生物的连接体可包含这三种不同类型的连接体元件中的一种或多种，并且其还可包含每一种单独连接体元件的一个或多个。在一个实施方案中，该连接体仅包含一个化学式4元件。在一个实施方案中，该连接体包含化学式2和化学式3中每一种的一个或多个，以及仅一个化学式4元件。
作为非限制性实例，所述连接体可由经由酰胺键并按所示顺序相互连接的一个化学式2元件、两个化学式3a元件和一个化学式4元件组成，在该连接体的*-NH端连接至延长体的CO-*，并且在其CO-*端连接至FGF21蛋白的位置180或181处的Cys残基的硫原子。因此，化学式4元件将化学式2/化学式3元件的-CO-*端与FGF21半胱氨酸类似物的硫原子连接。
在进一步的实例中，所述连接体可由经由酰胺键并按所示顺序相互连接的两个化学式2元件(如两个化学式2a元件)、两个化学式3a元件和一个化学式4元件组成。化学式2元件在其*-NH端连接至延长体的CO-*端，而化学式4在其CH2-*端连接至FGF21蛋白的Cys残基的硫原子。
在一个实施方案中，所述连接体与FGF21蛋白的位置167、169、170、171、172、173、173、174、175、180或181处的Cys的巯基基团相连接。在进一步的实施方案中，该连接体与位置180或181处的Cys的硫原子相连接。
自不必说，仅为了良好的顺序：短语“按所示顺序”是指，首先提到的连接体元件(在此为化学式2)的*-NH端与延长体的CO-*端相连接，而最后提到的连接体元件(在此为化学式4)的CO-*端与FGF21蛋白的所述Cys残基的巯基基团相连接。
在一个实施方案中，本发明的衍生物选自：
a.化合物13-24
b.化合物35-41和/或
c.化合物43-56。
在进一步的实施方案中，该衍生物选自化合物13-24。
在一个实施方案中，该衍生物选自化合物13-18。在一个实施方案中，该衍生物选自化合物20-24。
在一个实施方案中，该衍生物选自化合物35-41。
在一个实施方案中，该衍生物选自化合物43-56。在一个实施方案中，该衍生物选自化合物43-44和46-54。在一个实施方案中，该衍生物选自化合物44、47和50-54。
可使用马来酰亚胺衍生的连接体元件来代替化学式4，其中p和q可在1至5之间不等：
Figure BDA0001325351030000181
当p＝q＝2时，该连接体元件的结构对应于N-(2-氨基乙基)-3-(-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)丙酰胺：
Figure BDA0001325351030000191
本发明的衍生物可以以具有相同的分子式和键合原子顺序但仅其原子在空间中的三维朝向不同的不同立体异构形式存在。在实验部分中使用标准的命名法，以名称以及结构的方式说明了本发明的示例衍生物的立体异构现象。除非另外说明，否则本发明涉及所请求保护的衍生物的所有立体异构形式。
功能性质
本发明的FGF21衍生物是生物活性的。例如，它们是非常有效，另外或可替代地，它们与FGF受体非常好地结合。另外或可替代地，它们具有延长的药代动力学谱。例如，它们在静脉内施用至小鼠和/或小型猪时具有非常长的终末半衰期。良好效力与长半衰期的特别组合可能是非常理想的。
另外或可替代地，在与成熟人FGF21的位置167、169、170、171、172、173、173、174、175、180和181之一相对应的位置处包含本发明侧链的FGF21衍生物出人意料地具有高效力。
根据第一方面，所述FGF21衍生物具有FGF21活性。例如，本发明的FGF21衍生物对人FGF受体有出人意料的良好效力。
在第一特定实施方案中，效力和/或活性是指体外效力，即在功能性FGF受体试验中的表现，更具体地是指激活人FGF受体的能力。
例如，可在采用表达人FGF受体(FGFR1c、FGFR2c或FGFR3c)和BKL的全细胞的试验中确定体外效力。例如，可采用超表达人β-klotho(BKL)的HEK(人胚肾细胞)测量人FGF受体的响应。HEK293细胞内源性地表达若干种FGF受体，包括FGFR1c和FGFR3c。在用共受体BKL转染之前，这些细胞对FGF21是不响应的。FGF受体/BKL复合体的激活导致MAPK/ERK信号途径的激活和ERK的磷酸化。在给定时间点的磷酸化ERK(pERK)的水平随FGF21浓度的升高而升高。这种试验的一个非限制性实例在实施例6中描述。
还可在采用小鼠3T3-L1脂肪细胞的试验中测定体外效力。例如，可测试FGF21类似物和衍生物增加葡萄糖向脂肪细胞中的摄入的能力。分化的3T3-L1脂肪细胞内源性地表达FGFR1c和BKL。在分化前，3T3-L1细胞对FGF21是不响应的，因为分化导致共受体BKL的表达。FGFR1c受体/BKL复合体的激活增加了葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达，因此FGF21激动剂将以剂量响应的方式导致吸收进脂肪细胞中的葡萄糖的量增加。
通常使用EC50值作为药物效力的量度。EC50值是指通过参考剂量-响应曲线，诱导在基线与最大值之间的一半响应的所讨论化合物的浓度。通俗地说，EC50表示观察到最大效果的50％时的浓度。本发明衍生物的体外效力可以如上所述确定，并且确定所讨论的衍生物的EC50。EC50值越低，效力越好。
作为非限制性实例，采用表达人β-klotho的HEK293细胞测量的本发明FGF21衍生物的效力对应于在0％HSA下低于60nM，优选低于20nM，或更优选低于10nM的EC50(例如，如实施例6所述确定的)。
作为非限制性实例，采用3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入测量的本发明FGF21衍生物的效力对应于低于60nM，优选低于20nM，或更优选低于10nM的EC50(例如，如实施例7所述确定的)。
作为非限制性实例，采用3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入测量的本发明FGF21衍生物的功效Emax为至少50％，优选至少80％，或更优选至少90％(例如，如实施例7所述确定的)。
作为非限制性实例，采用3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入测量的本发明FGF21衍生物的效力对应于低于60nM，优选低于20nM，或更优选低于10nM的EC50(例如，如实施例7所述确定的)，并且采用3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入测量的功效Emax为至少80％，或更优选至少90％(例如，如实施例7所述确定的)。
在第二个特定的实施方案中，效力和/或活性是指体内效力。本发明的蛋白和衍生物在体内是有效的，其可以如本领域所知在任何合适的动物模型以及临床试验中确定。
之前已经表明，瘦型小鼠中由FGF21诱导的体重减轻对在肥胖小鼠中的效果有预示性，因此，瘦型小鼠被认为是良好的筛选模型。瘦型C57BL小鼠是合适的动物模型的一个实例，因此可在这类小鼠中体内确定体重减轻效果(例如，如实施例9所述确定的)。
根据第二方面，本发明的衍生物是效果延长的(protracted)。可以在体外估计和/或从体内药代动力学研究确定延长性。在存在血清白蛋白的情况下的体外效力(EC50值)的增加指示对血清白蛋白的亲和性，并且代表了用于预测测试物质在动物模型中延长的药代动力学谱的方法。可将延长性确定为例如在向例如小鼠或小型猪静脉内施用后的终末半衰期(t1/2)。
作为一个非限制性实例，本发明的衍生物在静脉内施用于小鼠后具有至少1小时、更优选至少3小时或最优选至少10小时的终末半衰期(例如，如实施例8所述确定的)。
作为另一个非限制性实例，本发明的衍生物在静脉内施用于小型猪后具有至少2小时、更优选至少10小时、甚至更优选至少20小时或最优选至少50小时的终末半衰期(例如，如实施例8所述确定的)。
根据第三方面，本发明的衍生物是效果延长的，并且同时具有非常好的效力。优良的效力/结合与长半衰期的特别组合可能是非常理想的。
根据第四方面，本发明的衍生物具有良好的生物物理学性质。这些性质包括但不限于物理稳定性和/或溶解度。这些和其他生物物理学性质可使用蛋白化学领域已知的标准方法来测量。在特定实施方案中，这些性质与成熟人FGF21相比得到改善。
本发明衍生物的其他特定实施方案在实验部分之前的标题为“特定实施方案”的部分中进行了描述。
FGF21化合物的生产和纯化
蛋白例如FGF21的生产是本领域公知的。可通过这样的方法生产FGF21类似物，该方法包括在允许表达FGF21类似物的条件下在合适的营养培养基中培养含有编码该分子的DNA序列并且能够表达FGF21类似物的宿主细胞。若干重组方法可用于FGF21及其类似物的生产。可用于在例如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等微生物中生产FGF21的方法的实例在WO12010553中公开。
实验部分中包括制备本发明的一些衍生物的方法的具体实例。简而言之，通过烷基化在半胱氨酸残基处衍生出FGF21类似物。因此，巯基反应性侧链，如用卤代乙酰胺制备的侧链，可与该FGF21类似物反应。可在用胱胺保护半胱氨酸的巯基基团的情况下制备FGF类似物。若如此，则在将该类似物与巯基反应性侧链反应之前，用例如还原剂如磷化氢还原该类似物。
本发明的FGF21类似物和衍生物可通过多种本领域已知的程序来纯化，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水性色谱法、色谱聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦(IEF))、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)或萃取(参见例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编著,VCH Publishers,New York,1989)。
给药方式
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“治疗”意在包括预防和最小化所提及的疾病、病症或病状(即，“治疗”是指预防性和治疗性施用本发明FGF21衍生物或包含本发明FGF21衍生物的组合物)。
给药途径可以是有效地将本发明化合物输送至身体中的所需或适当位置的任何途径，诸如肠胃外，例如皮下、肌肉内或静脉内给药。或者，可口服、经肺、经直肠、经皮、经颊、舌下或经鼻施用本发明化合物。
药物组合物
包含本发明化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯和药学上可接受的赋形剂的药物组合物可以如本领域已知的那样制备。
术语“赋形剂”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。赋形剂可以是惰性物质、无活性物质和/或非医药活性物质。
赋形剂可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。
药学活性成分与各种赋形剂的配制是本领域已知的，参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何后续版本)。
包含本发明FGF21化合物的可注射组合物可采用制药产业的常规技术来制备，该常规技术包括将成分适当溶解并混合以得到所需的终产物。因此，根据一种程序，将本发明FGF21化合物溶解在适当pH的合适的缓冲液中，从而最小化或避免沉淀。例如通过过滤除菌，将可注射组合物制成无菌的。还可向该组合物中添加抗微生物剂。
组合物可以是稳定化的制剂。术语“稳定化的制剂”是指具有提高的物理和/或化学稳定性(优选兼具)的制剂。通常，直到到达失效时间之前，制剂在使用和储存期间(符合推荐的使用和储存条件)必须是稳定的。
术语“物理稳定性”是指不改变共价键的物理状态及其改变，因而指蛋白质由于暴露于热-机械应力和/或与去稳定界面和表面(诸如疏水性表面)相互作用而形成无生物活性和/或不溶的聚集物和/或形成原纤维(fibrillate)的趋势。可在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅动)不同的时间段之后，借助于目测和/或通过浊度测量和/或通过浓度测量来评估水性蛋白质制剂的物理稳定性。或者，可使用蛋白质的构象状态的光谱剂或探针例如硫代黄素T或“疏水贴片”探针来评估物理稳定性。
术语“化学稳定性”是指蛋白质结构中共价键的化学(特别是共价的)变化，其导致形成相比于完整蛋白质可能具有降低的生物效能和/或提高的免疫原性效应的化学降解产物。可通过在暴露于不同环境条件之后的多个时间点测量化学降解产物的量，例如通过SEC-HPLC、RP-HPLC、LCMS和/或肽作图，来评估化学稳定性。
在一个方面，本发明提供具有改善的物理稳定性的FGF21衍生物。在一个方面，本发明提供具有改善的化学稳定性的FGF21衍生物。
联合治疗
采用本发明FGF21衍生物进行的治疗还可以联合一种或多种额外的药理学活性物质，例如选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防由糖尿病导致或与糖尿病相关的并发症的药剂，以及用于治疗和/或预防由肥胖症导致或与肥胖症相关的并发症和病症的药剂。
这些药理学活性物质的实例为：GLP-1受体激动剂、胰岛素、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、胰淀素(amylin)激动剂和瘦蛋白受体激动剂。
药物适应症
本发明还涉及用作药物的本发明衍生物。
在特定实施方案中，本发明的衍生物可用于以下医学治疗：
(i)预防和/或治疗所有形式的糖尿病，如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、MODY(青年成熟发作型糖尿病)、妊娠糖尿病，和/或减少HbA1C
(ii)延缓或预防糖尿病进展，如2型糖尿病的进展，延缓糖耐量减低(IGT)进展成需要胰岛素的2型糖尿病，延缓或预防胰岛素抵抗，和/或延缓无需胰岛素的2型糖尿病进展成需要胰岛素的2型糖尿病；
(iii)改善β-细胞功能，如减少β-细胞凋亡、提高β-细胞功能和/或β-细胞质量，和/或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性；
(iv)例如通过减少食物摄入、增加能量消耗、减轻体重、抑制食欲、诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症；治疗或预防暴食症、神经性贪食症和/或由抗精神病药或类固醇给药诱发的肥胖症；和/或预防和/或治疗肥胖症的共病，如骨关节炎和/或尿失禁；
(v)预防和/或治疗糖尿病并发症，如肾病；
(vi)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常、降低总血清脂质；增加HDL；降低小而密的LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低人的脂蛋白a(Lp(a))血浆水平；在体外和/或体内抑制载脂蛋白a(apo(a))的生成；
(vii)预防和/或治疗心血管疾病，如综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；
(viii)预防和/或治疗肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；以及/或者
(ix)预防和/或治疗危重病，如治疗危重患者、危重病多发性肾病(CIPNP)患者和/或潜在的CIPNP患者；预防危重病或CIPNP的进展；预防、治疗和/或治愈患者的全身性炎症反应综合征(SIRS)；预防或降低患者在住院期间罹患菌血症、败血症和/或脓毒性休克的可能性。
在特定实施方案中，该适应症选自(i)-(vii)。在另一特定实施方案中，该适应症选自(i)、(iv)、(vi)和/或(vii)。以下适应症是特别优选的：2型糖尿病和/或肥胖症。在一个实施方案中，本发明的化合物用于治疗2型糖尿病。在一个实施方案中，本发明的化合物用于治疗肥胖症。
特定实施方案
以下是本发明的特定实施方案：
1.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，
其中所述蛋白在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相对应的位置处包含Cys残基
其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；
其中该延长体选自
化学式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*以及
化学式1C：HO-S(＝O)2-(CH2)x-CO-*
其中x为8-18范围内的整数；并且
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
其中化学式2选自：
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*，
*-NH-S(＝O)2-(CH2)m-CO-*以及
*-NH-(CH2)m-环己烷-CO-*，
其中m为1-5范围内的整数，
其中化学式3为*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k为1-5范围内的整数，并且n为1-5范围内的整数，并且
其中化学式4选自
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*和
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
其中m为1-5范围内的整数；并且
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
2.根据实施方案1的衍生物，其中所述蛋白在位置170、171、172、173、174、175、180或位置181处包含Cys残基。
3.根据实施方案1的衍生物，其中所述蛋白在位置170、173、174、175、180或位置181处包含Cys残基。
4.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式2选自：
化学式2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式2b：*-NH-S(＝O)2-(CH2)3-CO-*以及
化学式2c：*-NH-CH2-环己烷-CO-*。
5.根据实施方案1的衍生物，其中化学式4选自：
化学式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*。
化学式4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
6.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中所述蛋白包含在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基，以及与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)相比的最多30个氨基酸修饰；
其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；
其中该延长体选自
化学式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x
其中x为8-18范围内的整数，
以及
化学式1C：HO-S(＝O)2-(CH2)x
其中x为10-18范围内的整数，
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数；
并且
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其-CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
7.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式1选自：
化学式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*，
化学式1b：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO-*以及
化学式1c：HO-S(＝O)2-(CH2)15-CO-*
8.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，
其中所述蛋白在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处包含Cys残基，其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；
其中该延长体为
化学式1：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数；并且
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数；
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
9.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，
其中所述蛋白包含在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基，以及与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)相比的最多30个氨基酸修饰；
其中所述衍生物包含经由连接体附接至所述Cys残基的延长体；
其中该延长体为
化学式1：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数；并且
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数；
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的巯基基团。
10.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述蛋白在与成熟人FGF21(SEQID NO:1)的位置180相对应的位置处包含Cys残基。
11.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)，所述蛋白具有最多30个氨基酸修饰，如25个氨基酸修饰，如20个氨基酸修饰，如15个氨基酸修饰，如10个氨基酸修饰，如8个氨基酸修饰，如最多5个氨基酸修饰。
12.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)，所述蛋白具有4或5个氨基酸修饰。
13.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)，所述蛋白具有4个氨基酸修饰。
14.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述FGF蛋白与成熟人FGF21(SEQID NO:1)具有至少80％，如85％，如90％，如95％的同一性。
15.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述FGF蛋白与成熟人FGF21(SEQID NO:1)具有至少96％，如97％，如98％，如99％的同一性。
16.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述氨基酸改变在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的位置121、168、180或181中的一个或多个相对应的一个或多个位置处。
17.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述氨基酸改变之一是在与成熟人FGF21(SEQ ID NO:1)的N-末端相对应的位置处的Ala残基添加。
18.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述蛋白在所述蛋白的N-末端包含Ala。
19.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含121Q。
20.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含168L。
21.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含SEQ ID NO:8或10的氨基酸序列。
22.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述蛋白具有SEQ ID NO:8、10、12、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列。
23.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式1为1A或1C并且x为12-18范围内的整数。
24.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式1为1A或1C并且x为14-16范围内的整数。
25.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式1为1B并且x为8-12范围内的整数。
26.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中x为16。
27.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中k为1-2范围内的整数。
28.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中k为1。
29.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中n为1-2范围内的整数。
30.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中n为1。
31.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式4的m为1-5范围内的整数。
32.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中化学式4的m为2。
33.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述延长体包含化学式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*。
34.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述延长体由化学式1a：HOOC-(CH2)14-CO-*组成。
35.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述连接体包含化学式3a：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。
36.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述连接体包含化学式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*。
37.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述连接体由至少一个化学式2元件、两个化学式3元件和一个化学式4元件组成。
38.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述连接体由一个化学式2元件、两个化学式3元件和一个化学式4元件组成。
39.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述连接体由两个化学式2元件、两个化学式3元件和一个化学式4元件组成。
40.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述连接体由一个化学式2元件、两个化学式3a元件和一个化学式4a元件组成。
41.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为以下之一：
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物13)
Figure BDA0001325351030000321
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物14)
Figure BDA0001325351030000322
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物15)
Figure BDA0001325351030000331
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物16)
Figure BDA0001325351030000332
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物17)
Figure BDA0001325351030000341
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21(化合物18)
Figure BDA0001325351030000342
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物19)
Figure BDA0001325351030000351
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物20)
Figure BDA0001325351030000352
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物21)
Figure BDA0001325351030000361
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物22)
Figure BDA0001325351030000362
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(化合物23)
Figure BDA0001325351030000371
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Met[Cys181]FGF21(化合物24)
Figure BDA0001325351030000372
42.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为以下之一：
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物13)
Figure BDA0001325351030000381
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物14)
Figure BDA0001325351030000382
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物15)
Figure BDA0001325351030000391
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物16)
Figure BDA0001325351030000392
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21(化合物17)
Figure BDA0001325351030000401
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21(化合物18)
Figure BDA0001325351030000402
43.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物选自化合物13-24和化合物43至56。
44.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物选自化合物35-41。
45.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物选自化合物13-24、35-41和43至56。
46.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物13。
47.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物14。
48.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物15。根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物16。
49.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物17。
50.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物18。
51.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物19。
52.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物20。
53.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物21。
54.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物22。
55.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物23。
56.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物24。
57.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物35。
58.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物36。
59.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物37。
60.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物38。
61.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物39。
62.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物40。
63.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物41。
64.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物43。
65.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物44。
66.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物45。
67.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物46。
68.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物47。
69.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物48。
70.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物49。
71.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物50。
72.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物51。
73.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物53。
74.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物54。
75.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物55。
76.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物为化合物56。
77.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物具有FGF21活性。
78.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中所述衍生物能够激活FGF受体。
79.根据前述实施方案中任一项的衍生物，其中静脉内施用至小型猪后的终末半衰期(t1/2)至少为成熟人FGF21的终末半衰期(t1/2)的20倍。
80.根据实施方案1-79中任一项的衍生物，其用作药物。
81.根据实施方案1-79中任一项的衍生物，其用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病及相关疾病如肥胖症、饮食失调、心血管疾病、糖尿病并发症中的任一种；和/或改善脂质参数、改善β-细胞功能；和/或延缓或预防糖尿病进展；以及/或者治疗和/或预防肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法。
82.根据实施方案1-79中任一项的衍生物在制备药物中的用途，该药物用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病及相关疾病，如肥胖症、饮食失调、心血管疾病、糖尿病并发症；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能；和/或用于延缓或预防糖尿病进展；以及/或者用于治疗和/或预防肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
83.通过施用药物活性量的根据实施方案1-79中任一项的衍生物来治疗或预防所有形式的糖尿病及相关疾病，如肥胖症、饮食失调、心血管疾病、糖尿病并发症；和/或改善脂质参数、改善β-细胞功能；和/或延缓或预防糖尿病进展；以及/或者治疗和/或预防肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法。
84.FGF21蛋白，其在与FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一相对应的位置处包含野生型氨基酸被半胱氨酸残基的氨基酸置换。
85.根据实施方案83的FGF21蛋白，其中所述FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ IDNO:1)的位置170、173、174、180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。
86.根据实施方案83的FGF21蛋白，其中所述FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ IDNO:1)的位置170、173和174之一相对应的位置处包含Cys残基。
87.根据实施方案83的FGF21蛋白，其中所述FGF21蛋白在与FGF21(1-181)(SEQ IDNO:1)的位置180和181之一相对应的位置处包含Cys残基。
88.根据实施方案83的FGF21蛋白，其中除了变异Cys残基之外，所述FGF21蛋白还包含-1Ala、121Gln和/或168Leu。
89.根据实施方案83的FGF21蛋白，其中除了在FGF21(1-181)(SEQ ID NO:1)的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180和181之一处的Cys残基之外，所述FGF21蛋白还包含-1Ala、121Gln和/或168Leu。
实施例
缩写列表
AcOD：氘代丙酮
Ado：8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
BSPP：双(对磺酸基苯基)苯基膦二钾盐二水合物
DCM：二氯甲烷
DMSO：二甲基亚砜
DPBS：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
EDAC：(3-二甲基氨基丙基)乙基碳二亚胺
ELSD：蒸发光散射检测器
Fmoc：9H-芴-9-基甲氧羰基
Fc：可结晶片段
GLP-1：胰高血糖素样肽-1
gGlu：γ谷氨酸
GLUT1：葡萄糖转运蛋白1
HATU：2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HEPES：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HPLC：高效液相色谱法
IgG4：免疫球蛋白G4
IBMX：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
IPTG：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷
LCMS：液相色谱质谱法
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMR：核磁共振
OtBu：叔丁酯
PBS：磷酸缓冲盐水
RF：阻滞因数
Rt：保留时间
RT：室温
tBu：叔丁基
TCTU：O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TFA：三氟乙酸
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇
Trx：氨甲环酸
UPLC：超高效液相色谱法
ZOSu：N-(苄氧羰基氧基)琥珀酰亚胺
材料与方法
通用检测和表征方法
LCMS方法1
将样品稀释至约0.2mg/ml并注射至LCMS系统，例如3-5μL。LCMS仪器由UPLC系统和质谱仪组成。将类似物脱盐，并且可将其在反相柱(例如，C4、C8、C18柱或前置柱)上分离，并采用乙腈在0.02-0.05％TFA(三氟乙酸)中的线性梯度进行分析。应该将仪器校准，并且若可能，通过使用锁定质量喷雾(lock mass spray)进行校准。生成主色谱峰上的MS谱，并使用去卷积算法重建完整质量。
LCMS仪器设置(Synapt)的实例：
正离子模式
3000V毛细管电位，
30V锥电压
110℃源温度，
250℃去溶剂化温度
25L/h的锥孔气流。
m/z范围200-3000
得到去卷积的质量。
LCMS方法2
系统：Agilent 1290 infinity系列UPLC柱：Aeris WIDEPORE 3.6μXB-C182.1x50mm检测器：Agilent TechnologiesLC/MSD TOF 6230(G6230A)检测器设置
电离方法：Agilent Jet Stream源扫描范围：m/z最小值100，m/z最大值3200线性反射器模式正模式
条件：线性梯度：5％至95％B梯度运行时间：10分钟0-8min5-95％B、8-9min95％B、9-9.5min95-5％B9.5-10min5％B流速：0.40ml/min固定柱温：40℃
洗脱液溶剂A：99.90％H2O，0.02％TFA溶剂B：99.90％CH3CN，0.02％TFA溶剂C：NA
结果说明和验证：实测质量是对于m<4000的化合物而言的化合物的m/z((m+z)/z)，或者是使用Masshunter Workstation软件版本B.05.00Build 5.0.519.13 SP1(Agilent)去卷积所得到的质量(平均)。所计算的质量是所需化合物的平均分子量。所计算的m/z是所需化合物的分子量(m+z)/z。
LCMS方法3
系统：Agilent 1290 infinity系列UPLC柱：Phenomenex Aeris widepore 3,6μC450x2.1mm检测器：Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230(G6230A)
检测器设置：电离方法：Agilent Jet Stream源扫描范围：m/z最小值100，m/z最大值3200线性反射器模式正模式
条件：分级梯度：5％至90％B梯度运行时间：10分钟：0-1min5-20％B、1-7min20-90％B、7-8min90％B8-8.5min90-5％B8.5-10min5％B流速：0.40ml/min固定柱温：40℃
洗脱液溶剂A：99.90％H2O，0.02％TFA溶剂B：99.90％CH3CN，0.02％TFA溶剂C：NA
结果说明和验证：实测质量是对于m<4000的化合物而言的化合物的m/z((m+z)/z)，或者是使用Masshunter Workstation软件版本B.05.00Build5.0.519.13SP1(Agilent)去卷积所得到的质量(平均)。所计算的质量是所需化合物的平均分子量。所计算的m/z是所需化合物的分子量(m+z)/z。
LCMS方法4
系统：Waters自动纯化系统
柱：Kinetex C18 4.6mmx50mm
检测器：UV：PDA，ELSD，MS Micromass Quatro micro
检测器设置：电离方法：ES+，扫描范围100-1000，锥电压30V，毛细管电压300kV，扫描时间1.3s；PDA：210-400nm；ELSD：雾化加热器-冷却器70％，漂移管57.0℃
条件：线性梯度乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA，梯度运行时间：4.0min，总运行时间：6.0min，流速：1.1ml/min，柱温：23℃
本发明化合物的制备
实施例1：人成熟FGF21的克隆和表达
人FGF21的DNA和氨基酸序列已被例如Nishimura等人,Biochim.Biophys.Acta1492(1):203-206(2000)公开。这些序列还可从公共数据库分别通过登录号EMBL:AB021975和UNIPROT:Q9NSA1获得。
对成熟人FGF21蛋白进行克隆并在大肠杆菌中表达为细胞内蛋白，其没有信号肽，但添加有N-末端甲硫氨酸。更具体地，将编码成熟人FGF21(在N末端添加了Met)的基因序列针对大肠杆菌表达进行密码子优化，并克隆到载体pET11c的NdeI与BamHI位点之间。这使得FGF21基因处于噬菌体T7启动子的控制下。将表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取单个菌落，并使其在LB+Amp100μg/mL中生长至OD450为0.5。在37℃下用0.3mM IPTG诱导表达4小时。通过超声处理制备细胞的粗提取物以供分析FGF21表达。考马斯蓝染色的SDS-PAGE显示出FGF21的成功表达，主要在沉淀物级分中鉴别到该FGF21。尽管这样表达的MetFGF21的计算分子量为19.5kD，但其作为25kD蛋白在凝胶上迁移，这可能是由于脯氨酸含量高而延缓了该蛋白的移动。
在本申请中，MetFGF21用作参考化合物。当通过使用大肠杆菌表达系统生产FGF21时，在FGF21的N-末端引入了甲硫氨酸。然而，不认为这会影响生物活性，因此通常将FGF21和MetFGF21二者用作参考化合物。
实施例2：FGF21类似物的克隆和表达
通过对实施例1所述的FGF21成熟表达构建体进行诱变来制备用于表1(实施例3)中的类似物的表达构建体。使用Stratagene多位点诱变试剂盒。也应用与实施例1中所述相同的表达条件。考马斯蓝染色的SDS-PAGE显示出类似物的成功表达。表达的类似物在FGF21序列的N-末端包含二肽Met-Ala，这允许由于Met被大肠杆菌酶切割而表达出以Ala作为N-末端氨基酸残基的FGF21类似物。
实施例3：成熟FGF21和FGF21类似物的纯化
为纯化实施例1-2中所述的成熟FGF21和FGF21类似物，使用以下过程或类似技术：
将大肠杆菌细胞沉淀物重悬在pH6.0的10mM磷酸钾中，并通过匀浆器在800巴下破坏两次。通过离心(10,000×g，30分钟)使包涵体沉淀，重溶解在pH8.0的50mM Tris中，并任选地添加2M尿素和/或5mM半胱胺，并将浆液在4℃下搅拌过夜。在上柱之前，再次在10,000×g下将浆液离心30分钟。将上清液加至阴离子交换色谱柱(Q Sepharose Fast Flow树脂，GE Healthcare)，并用50-250mM NaCl洗脱。将0.4M硫酸铵添加至洗脱合并物中，随后将该洗脱合并物加至在pH 8.0的20mM Tris、0.4M硫酸铵中平衡的苯基FF柱(GE Healthcare)上。用pH 8.0的20mM Tris、1.5M氯化钠洗涤该柱，之后用10％Tris-氯化物缓冲液(pH8.0的20mM Tris，1.5M氯化钠)洗脱。可将30Q柱用于进一步的纯度精制。通过SDS-PAGE或其他相关技术分析终产物。对于化合物3和5-10，在药效学试验期间保留所引入的半胱氨酸的半胱胺保护。
如上所述制备FGF21类似物。对于所述化合物给出了通过LCMS(采用LCMS方法1)测得的完整质量。
表1A.FGF21类似物1到10。
Figure BDA0001325351030000491
Figure BDA0001325351030000501
表1B.FGF21类似物25到32。
Figure BDA0001325351030000502
Figure BDA0001325351030000511
实施例4：用于衍生FGF21类似物的试剂的制备
实施例4.1给出了用于衍生的代表性试剂的制备。实施例4.2-4.4的试剂通过实施例4.1提供的方法制备。实施例4.5-4.17的试剂通过与如下所述类似的方法制备。
实施例4.1：15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十五酸的制备
Figure BDA0001325351030000512
固相合成方案：
经2小时将N-(苄氧羰基氧基)琥珀酰亚胺(ZOSu，100g，401mmol)在二氯甲烷(500mL)中的溶液逐滴添加至乙二胺(1，189mL，2.81mol)在二氯甲烷(750mL)中的溶液中。30分钟后，过滤悬浮液并用二氯甲烷洗涤固体。将滤液蒸发至干，并用甲苯(1.00L)和水(0.50L)稀释残余物。过滤所得混合物，并分离滤液以得到两个相。水相含有产物；因此将其用二氯甲烷(2×250mL)萃取。合并所有有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物用甲苯(750mL)稀释并用2M盐酸水溶液(500mL)和1M盐酸水溶液(100mL)萃取。合并酸性水相并用氢氧化钠(60.0g，1.50mol)的水(90mL)溶液碱化。用二氯甲烷(4x200mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，并用己烷(200mL)稀释。向该溶液中加入在醚中的4M氯化氢溶液(100mL，400mmol)，真空浓缩所得悬浮液，并用己烷(1.00L)稀释。将沉淀的固体过滤，用己烷洗涤，并真空干燥，以得到呈白色粉末的(2-氨基-乙基)-氨基甲酸苄酯盐酸盐。
产率：62.62g(68％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇4:1)：0.25(游离碱)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH):7.42-7.26(m,5H)；5.16(s,2H)；3.60(t,J＝5.7Hz,2H)；3.32(t,J＝5.7Hz,2H)。
使2-氯三苯甲基树脂100-200目1.7mmol/g(3，40.1g，68.1mmol)在无水二氯甲烷(250mL)中溶胀20分钟。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，17.5g，45.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(30.1mL，173mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的溶液，并将该混合物振摇5小时。将树脂过滤并用N,N-二异丙基乙胺(15.8mL，90.8mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，250mL，2x5min)中的溶液处理。然后用N,N-二甲基甲酰胺(2×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×250mL)洗涤树脂。通过用含20％哌啶的二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×250mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×250mL)、2-丙醇(2×250mL)和二氯甲烷(300mL，2×250mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，26.3g，68.1mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，24.2g，68.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(21.4mL，123mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(140mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)和N,N-二甲基甲酰胺(250mL)洗涤。通过用含20％哌啶的二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×250mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×250mL)、2-丙醇(2×250mL)和二氯甲烷(300mL，2×250mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-Glu-OtBu，29.0g，68.1mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，24.2g，68.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(21.4mL，123mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(140mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)和N,N-二甲基甲酰胺(250mL)洗涤。通过用含20％哌啶的二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×250mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×250mL)、2-丙醇(2×250mL)和二氯甲烷(300mL，2×250mL)洗涤树脂。向树脂中加入16-(叔丁氧基)-16-氧代十六酸(23.3g，68.1mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，24.2g，68.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(21.4mL，123mmol)在N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷混合物(4:1，200mL)中的溶液。将树脂振摇1小时，过滤，并用N,N-二甲基甲酰胺(3×250mL)、二氯甲烷(2×250mL)、甲醇(2×250mL)和二氯甲烷(350，6×250mL)洗涤。通过用2,2,2-三氟乙醇(250mL)处理18小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用二氯甲烷(2×250mL)、2-丙醇/二氯甲烷混合物(1:1，2×250mL)、2-丙醇(250mL)和二氯甲烷(3×250mL)洗涤。合并溶液；蒸发溶剂，并通过急骤柱色谱法(Silicagel 60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)纯化粗产物。纯(S)-22-(叔丁氧羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四氧代-3,6,12,15,40-五氧杂-9,18,23-三氮杂四十二烷酸在真空中干燥，并获得淡黄色粘稠黄色油。
产率：30.88g(83％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇4:1)：0.30。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.36(t,J＝5.7Hz,1H)；7.02(t,J＝5.4Hz,1H)；6.55(d,J＝7.7Hz,1H)；4.46(m,1H)；4.18(s,2H)；4.02(s,2H)；3.83-3.36(m,16H)；2.44-2.12(m,7H)；2.02-1.86(m,1H)；1.60(m,4H)；1.47(s,9H)；1.45(s,9H)；1.36-1.21(m,20H)。
LC-MS方法4：
纯度：100％
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：3.60min。
实测m/z,z＝1:818.7(M+H)+
随后将2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU，11.4g，30.1mmol)和三乙胺(8.77mL，62.9mmol)添加至(S)-22-(叔丁氧羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四氧代-3,6,12,15,40-五氧杂-9,18,23-三氮杂四十二烷酸(22.4g，27.4mmol)在无水二氯甲烷(110mL)中的溶液中。向(2-氨基-乙基)-氨基甲酸苄酯盐酸盐(6.94g，30.1mmol)在无水二氯甲烷(165mL)中的悬浮液中加入三乙胺(5.72mL，41.0mmol)，并将所得混合物加入上述溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，然后将其蒸发至干。将残余物再溶解于乙酸乙酯(500mL)中；用1M盐酸水溶液(2×200mL)、5％碳酸钠水溶液(2×200mL，极慢的相分离)、1M盐酸水溶液(8×200mL)和盐水洗涤；经无水硫酸钠干燥，并真空蒸发至干。残余物通过急骤柱色谱法纯化(Silicagel 60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5)，得到呈淡黄色粘稠油的15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-苄氧羰基氨基-乙基氨基甲酰基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基氨基甲酰基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基氨基甲酰基)-1-叔丁氧羰基-丙基氨基甲酰基]-十五酸叔丁酯。
产率：23.84g(88％)
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.35
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.39-7.26(m,6H)；7.19(t,J＝6.3Hz,1H)；6.91(t,J＝5.7Hz,1H)；6.52(d,J＝7.5Hz,1H)；5.83(t,J＝5.5Hz,1H)；5.09(s,2H)；4.41(ddd,J＝12.3,4.6和4.3Hz,1H)；3.99(s,2H)；3.97(s,2H)；3.71-3.30(m,20H)；2.33-2.08(m,7H)；1.97-1.83(m,1H)；1.67-1.51(m,4H)；1.45(s,9H)；1.44(s,9H)；1.35-1.20(m,20H)。
LCMS方法4
纯度：100％
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：4.18min
实测m/z,z＝1:994.9(M+H)+
将碳载钯(10％，1.27g，1.20mmol)添加至上述化合物(23.8g，24.0mmol)在甲醇(350mL)中的溶液中，并将所得混合物在正常压力下氢化4小时。滤出催化剂并将滤液蒸发至干。将残余物从二氯甲烷中蒸发数次以除去甲醇残余物，并真空干燥，以产生呈粘稠无色油的(S)-1-氨基-25-(叔丁氧羰基)-4,13,22,27-四氧代-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21,26-四氮杂四十二烷-42-酸叔丁酯。
产率：20.50g(99％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.05。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.54(t,J＝5.7Hz,1H)；7.41(t,J＝5.6Hz,1H)；7.14(t,J＝5.5Hz,1H)；6.68(d,J＝7.5Hz,1H)；5.25(bs,2H)；4.39(td,J＝8.3和4.2Hz,1H)；4.01(s,4H)；3.74-3.39(m,18H)；2.96(t,J＝5.7Hz,2H)；2.34-2.06(m,7H)；1.97-1.83(m,1H)；1.68-1.50(m,4H)；1.45(s,9H)；1.43(s,9H)；1.37-1.19(m,20H)。
LCMS方法4
纯度：100％
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：1.43min
实测m/z,z＝1:860.8(M+H)+
在-30℃和氩气下，将N,N-二异丙基乙胺(4.98mL，28.6mmol)添加至上述胺(6，20.5g，23.8mmol)在无水二氯甲烷(290mL)中的溶液中。逐滴加入溴乙酰溴(2.48mL，28.6mmol)，并将所得溶液在-30℃下搅拌另外3小时。移除冷却浴，将混合物在室温下搅拌1小时，然后真空除去溶剂。将残余物再溶解于乙酸乙酯(450mL)中，并用5％柠檬酸水溶液(300mL)洗涤。在1小时内分离各相。用水(300mL)洗涤有机层，使所得乳液分离过夜以得到3个相。除去澄清水层，并振摇其余2个相，加入溴化钾饱和水溶液(100mL)。使相分离过夜，然后除去水相，将有机相经无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂，并将残余物通过急骤柱色谱法纯化(Silicagel 60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5)，得到呈无色固体的(S)-1-溴-28-(叔丁氧羰基)-2,7,16,25,30-五氧代-9,12,18,21-四氧杂-3,6,15,24,29-五氮杂四十五烷-45-酸叔丁酯。
产率：19.46g(83％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.25
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.46(m,1H)；7.33(t,J＝5.9Hz,1H)；7.21(t,J＝5.1Hz,1H)；6.92(t,J＝5.2Hz,1H)；6.50(d,J＝7.5Hz,1H)；4.41(ddd,J＝12.2,4.5和4.2Hz,1H)；4.01(s,4H),3.85(s,2H)；3.75-3.40(m,20H),2.36-2.08(m,7H)；1.99-1.84(m,1H)；1.68-1.51(m,4H),1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.38-1.19(m,20H)
LCMS方法4
纯度：100％
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：3.51min。
实测：m/z,z＝1:980.9,982.9(M+H)+
将上述化合物(19.5g，19.8mmol)溶解在三氟乙酸(120mL)中，并将所得溶液在室温下搅拌1.5小时。真空除去三氟乙酸，并将残余物从二氯甲烷(6×200mL)中蒸发。向油状残余物中加入二乙醚(200mL)，并将混合物搅拌过夜以得到悬浮液。将固体产物过滤，用二乙醚和己烷洗涤，并真空干燥，得到呈白色粉末的标题产物15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十五酸。
产率：16.74g(97％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.61(dd,J＝8.8和4.8Hz,1H)；4.12(s,2H),4.10(s,2H)；3.96(s,2H)；3.77-3.39(m,20H),2.49-2.18(m,7H)；2.16-1.04(m,1H)；1.71-1.56(m,4H),1.30(bs,20H)
LCMS方法4：
纯度：100％
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：3.51min
理论m/z,z＝1:869.8,实测：m/z,z＝1:868.7,870.7
实施例4.2：11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十一酸的制备
Figure BDA0001325351030000571
11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十一酸通过与实施例4.1所述相同的方法制备，得到粘稠橙色油。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.61(dd,J＝8.9和4.9Hz,1H)；4.13(s,2H)；4.10(s,2H)；3.96(s,2H)；3.79-3.38(m,20H)；2.50-2.16(m,7H)；2.16-2.00(m,1H)；1.72-1.56(m,4H)；1.42-1.24(m,12H)
LCMS方法4:
纯度：100％(ELSD)
Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：2.74min
理论，m/z,z＝1:813.8,实测m/z,z＝1:812.0,814.0
实施例4.3：13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十三酸的制备
Figure BDA0001325351030000581
13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十三酸通过与实施例4.1所述相同的方法制备，得到粘稠黄色油。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.61(dd,J＝8.9和4.9Hz,1H)；4.13(s,2H)；4.11(s,2H)；3.96(s,2H)；3.77-3.40(m,20H)；2.49-2.18(m,7H)；2.16-2.07(m,1H)；1.70-1.56(m,4H)；1.31(bs,16H)。
LCMS方法4：
纯度：100％(ELSD)
Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：2.94min
理论m/z,z＝1:841.9,实测：m/z,z＝1:841.7,843.7
实施例4.4：19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基-氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九酸的制备
Figure BDA0001325351030000591
19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九酸通过与实施例4.1所述相同的方法制备，得到米色粉末。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.65-4.57(m,1H)；4.13(s,2H)；4.10(s,2H)；3.96(s,2H)；3.77-3.43(m,20H)；2.49-2.40(t,J＝7.3Hz,2H)；2.39-2.23(m,5H)；2.17-2.07(m,1H)；1.68-1.57(m,4H)；1.30(bs,28H)
LCMS方法4:
纯度：100％(ELSD)
Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：2.17min
理论质量：926.0,实测m/z:926(M+H)+
实施例4.5：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸的制备
Figure BDA0001325351030000601
溶液相合成方案：
步骤1：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-苄氧羰基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸苄酯
经75min向0℃的乙二胺(8.5ml)在DCM(80ml)和三乙胺(5.2ml)中的溶液中逐滴加入如WO10029159所述制备的18-[[(1S)-1-苄氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸苄酯(26g)在DCM(320mL)中的溶液。搅拌2h后滤出沉淀物。向滤液中加水(200ml)和异丙醇(50ml)。萃取该混合物，用MgSO4将有机层干燥。通过过滤除去MgSO4，并将滤液真空干燥以得到标题化合物20.07g(81％)LCMS：理论质量：956.2；实测m/z,z＝1:957.0
步骤2：18-[[(1S)-1-苄氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸苄酯
将氯乙酸(0.19g)溶解在DCM(15ml)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.22g)和EDACHCl(0.42g)。搅拌2.5h后，加入在DCM(5ml)中的18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-苄氧羰基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸苄酯(1.5g)。在室温下搅拌过夜后，用1M HCl(2×20ml)和水/盐水2:1(30ml)萃取该混合物。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，并真空浓缩，以得到澄清的油，1.37g(84％)
LCMS：理论质量：1032.7；实测m/z,z＝1:1033.1
步骤3:18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸
在通氮气后向18-[[(1S)-1-苄氧羰基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸苄酯(10.5g)在丙酮(140ml)中的溶液中加入10％PD/C(1.0g)。在氢化6h后，将混合物加热至40-50℃，然后过滤。分离在冷滤液中的沉淀物，并用丙酮洗涤并干燥，以得到标题化合物，7.42g(85％)。
步骤4:8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸。
向18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-氯乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸在丙酮(60ml)中的悬浮液中加入溴化钠(5当量，1.21g)。将混合物在室温下避光搅拌。2h后再加入溴化钠(10当量，2.41g)。2天后再加入溴化钠(5当量，1.21g)。5天后浓缩该混合物。向残余物的一半中添加DCM(30ml)、10％抗坏血酸(20ml)和水30ml。向乳液中加入异丙醇(50ml)和水(30ml)。分离有机相，并用10％抗坏血酸(20ml)和异丙醇(10ml)的混合物洗涤两次。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，并浓缩，以得到固体油，将其在丙酮中结晶并通过过滤分离，以得到掺杂有起始材料的标题化合物，0.80g(72％)。
LCMS：理论质量：896.9。实测m/z,z＝1:898.9(M+1)
实施例4.6：12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸的制备
Figure BDA0001325351030000621
固相合成方案：
使2-氯三苯甲基树脂100-200目1.8mmol/g(1，11.9g，21.4mmol)在无水二氯甲烷(80mL)中溶胀20分钟。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，5.50g，14.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.44mL，54.2mmol)在无水二氯甲烷(70mL)中的溶液，并将该混合物振摇4小时。将树脂过滤并用N,N-二异丙基乙胺(4.97mL，28.5mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2×5min，2×57mL)中的溶液处理。然后用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)洗涤树脂。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，11.0g，28.5mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，10.1g，28.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.93mL，57.0mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，9.11g，21.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，7.60g，21.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.71mL，38.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入4-[(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)甲基]环己烷羧酸(Fmoc-Trx-OH，9.11g，21.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，7.60g，21.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.71mL，38.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入十二烷二酸单叔丁酯(C12(OtBu)-OH，6.13g，21.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，7.61g，21.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.71mL，38.5mmol)在二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合物(4:1，80mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(6×80mL)、二氯甲烷(4×80mL)、甲醇(4×80mL)和二氯甲烷(7×80mL)洗涤。通过用2,2,2-三氟乙醇(80mL)处理18小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用二氯甲烷(4×80mL)、二氯甲烷/2-丙醇混合物(1:1，4×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(6×80mL)洗涤。合并溶液；蒸发溶剂，并通过柱色谱法(Silicagel 60，0.040-0-063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)纯化粗产物。将纯产物(2)真空干燥并获得油状物。
产率：5.40g(42％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.30。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.45-7.31(m,1H)；7.10-6.97(m,1H)；6.71-6.60(m,1H)；5.70-5.58(m,1H)；4.43-4.31(m,1H)；4.15(s,2H)；4.01(s,2H)；3.79-3.31(m,16H)；3.13-3.08(m,2H)；2.28-1.79(m,11H)；1.71-1.51(m,4H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.25(bs,12H)；1.05-0.88(m,2H)。
LC-MS纯度：100％。
LC-MS Rt(Sunfire4.6mm×100mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：2.16min。
LC-MS m/z:903.0(M+H)+。
随后将2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU，2.46g，6.48mmol)和三乙胺(1.89mL，13.6mmol)添加至来自以上的油(2，5.31g，5.89mmol)在无水二氯甲烷(23mL)中的溶液中。将三乙胺(1.36mL，9.72mmol)添加至(2-氨基-乙基)-氨基甲酸苄酯盐酸盐(3，1.49g，6.48mmol)在无水二氯甲烷(35mL)中的悬浮液中，并将所得混合物添加至上述溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，然后将其蒸发至干。将残余物再溶解于乙酸乙酯(70mL)中；用1M盐酸水溶液(1×70mL)、5％碳酸钠水溶液(2×70mL)、1M盐酸水溶液(4×70mL)和盐水(70mL)洗涤；经无水硫酸钠干燥并蒸发。残余物通过急骤柱色谱法纯化(Silicagel 60，0.040-0-063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5至92:8)，得到粘稠黄色油。
产率：2.81g(44％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.25。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.41-7.29(m,6H)；7.22-7.13(m,1H)；6.93-6.81(m,1H)；6.62-6.58(m,1H)；5.90-5.81(m,1H)；5.68-5.55(m,1H)；5.09(s,2H)；4.42-4.33(m,1H)；4.01-3.95(m,4H)；3.75-3.30(m,20H)；3.14-3.06(m,2H)；2.31-2.01(m,11H)；1.97-1.76(m,1H)；1.65-1.52(m,4H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.27(bs,12H)；1.04-0.87(m,2H)。
将碳载钯(10％，0.15g，0.13mmol)添加至上述化合物(2.81g，2.60mmol)在甲醇(43mL)中的溶液中，并将所得混合物在正常压力下氢化2.5小时。滤出催化剂并将滤液蒸发至干。残余物与甲苯共蒸发四次并真空干燥，产生化合物5。
产率：2.01g(81％)。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.51-7.36(m,2H)；7.04-6.96(m,1H)；6.76-6.66(m,1H)；5.93-5.85(m,1H)；4.41-4.29(m,1H)；4.03-3.99(m,4H)；3.73-3.25(m,18H)；3.13-2.97(m,4H)；2.34-1.78(m,11H)；1.67-1.51(m,4H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.30(m,12H)；1.04-0.88(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水70:30至100:0+0.1％TFA)：0.67min。
LC-MS m/z:945.0(M+H)+。
在-30℃和氩气下，将N,N-二异丙基乙胺(0.40mL，2.28mmol)添加至上述胺(5，1.79g，1.90mmol)在无水二氯甲烷(30mL)中的溶液中。逐滴加入溴乙酰溴(0.20mL，2.28mmol)，并将所得溶液在-30℃下搅拌3小时。移除冷却浴，并将混合物在室温下搅拌另外1小时，然后使其蒸发至干。将残余物再溶解于乙酸乙酯(50mL)中，用5％柠檬酸水溶液(3×50mL，极慢的相分离)、1M盐酸水溶液(4×50mL)和盐水(50mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物通过急骤柱色谱法纯化(Silicagel 60，0.040-0-063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5至93:7)，得到黄色油。
产率：1.63g(80％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇95:5)：0.25。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.56-7.48(m,1H)；7.43-7.34(m,1H)；7.04-6.95(m,1H)；6.62(d,J＝7.9Hz,1H)；5.74-5.63(m,1H)；4.43-4.33(m,1H)；4.02(s,4H)；3.85(s,2H)；3.73-3.40(m,20H)；3.14-3.09(m,2H)；2.34-2.04(m,9H)；1.97-1.76(m,4H)；1.68-1.51(m,7H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.27(m,12H)；1.07-0.90(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：2.16min。
LC-MS m/z:1066.0(M+H)+。
将上述化合物(1.53g，1.44mmol)溶解在三氟乙酸(25mL)中并放置1.5小时。真空除去三氟乙酸，残余物与甲苯共蒸发三次并与二氯甲烷共蒸发十次，得到黄色油状固体。
产率：810mg(59％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.64-4.54(m,1H)；4.13(s,2H)；4.11(s,2H)；3.96(s,2H)；3.78-3.40(m,20H)；3.13-3.10(d,J＝6.6Hz,2H)；2.51-2.19(m,9H)；1.94-1.77(m,4H)；1.68-1.41(m,7H)；1.31(bs,12H)；1.10-0.92(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：2.82min。
LC-MS m/z:952.0(M+H)+。
实施例4.7：16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸的制备
Figure BDA0001325351030000671
固相合成方案：
使2-氯三苯甲基树脂100-200目1.8mmol/g(1，11.9g，21.4mmol)在无水二氯甲烷(80mL)中溶胀20分钟。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，5.50g，14.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.44mL，54.2mmol)在无水二氯甲烷(70mL)中的溶液，并将该混合物振摇4小时。将树脂过滤并用N,N-二异丙基乙胺(4.97mL，28.5mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2×5min，2×57mL)中的溶液处理。然后用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)洗涤树脂。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，11.0g，28.5mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，10.1g，28.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.93mL，57.0mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，9.11g，21.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，7.60g，21.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.71mL，38.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入Fmoc-氨甲环酸(Fmoc-Trx-OH，9.11g，21.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，7.60g，21.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.71mL，38.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)、二氯甲烷(2×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×80mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(100mL，2×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入十六烷二酸单叔丁酯(C16(OtBu)-OH，7.33g，21.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，7.61g，21.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.71mL，38.5mmol)在二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合物(4:1，80mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(6×80mL)、二氯甲烷(4×80mL),甲醇(4×80mL)和二氯甲烷(7×80mL)洗涤。通过用2,2,2-三氟乙醇(80mL)处理18小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用二氯甲烷(4×80mL)、二氯甲烷/2-丙醇混合物(1:1，4×80mL)、2-丙醇(2×80mL)和二氯甲烷(6×80mL)洗涤。合并溶液；蒸发溶剂，并通过柱色谱法(Silicagel 60，0.040-0-063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)纯化粗产物。将中间体(2)真空干燥并获得油状物。
产率：8.20g(80％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.20。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.44-7.33(m,1H)；7.07-6.97(m,1H)；6.72-6.63(m,1H)；5.70-5.59(m,1H)；4.44-4.33(m,1H)；4.15(s,2H)；4.01(s,2H)；3.76-3.32(m,16H)；3.14-3.07(m,2H)；2.38-1.77(m,11H)；1.71-1.50(m,4H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.25(bs,20H)；1.05-0.87(m,2H)。
LC-MS纯度：100％。
LC-MS Rt(Sunfire4.6mm×100mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：3.56min。
LC-MS m/z:959.0(M+H)+。
随后将2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU，3.55g，9.34mmol)和三乙胺(2.72mL，19.5mmol)添加至中间体2(8.13g，8.49mmol)在无水二氯甲烷(34mL)中的溶液中。将三乙胺(1.78mL，12.7mmol)添加至(2-氨基-乙基)-氨基甲酸苄酯盐酸盐(2.15g，9.34mmol)在无水二氯甲烷(51mL)中的悬浮液中，并将所得混合物添加至上述溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，然后将其蒸发至干。将残余物再溶解于乙酸乙酯(150mL)；用1M盐酸水溶液(1×100mL)、5％碳酸钠水溶液(2×100mL)、1M盐酸水溶液(4×100mL)和盐水洗涤；经无水硫酸钠干燥并蒸发。残余物通过急骤柱色谱法纯化(Silicagel60，0.040-0-063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5至92:8)，得到呈粘稠黄色油的化合物4。
产率：5.59g(58％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9:1)：0.20。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.41-7.31(m,6H)；7.21-7.12(m,1H)；6.92-6.83(m,1H)；6.58-6.52(m,1H)；5.89-5.79(m,1H)；5.62-5.51(m,1H)；5.10(s,2H)；4.43-4.32(m,1H)；4.05-3.92(m,4H)；3.75-3.30(m,20H)；3.15-3.07(m,2H)；2.33-2.03(m,11H)；1.97-1.68(m,1H)；1.67-1.51(m,4H)；1.45(s,9H)；1.44(s,9H)；1.26(bs,20H)；1.05-0.87(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水70:30至100:0+0.1％TFA)：1.41min。
LC-MS m/z:1136.0(M+H)+。
将碳载钯(10％，0.27g，0.24mmol)添加至上述化合物(4，5.59g，4.93mmol)在甲醇(85mL)中的溶液中，并将所得混合物在正常压力下氢化2.5小时。滤出催化剂并将滤液蒸发至干。残余物与甲苯共蒸发四次并真空干燥，产生化合物5。
产率：3.45g(70％)。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.43-7.33(m,2H)；7.05-6.94(m,1H)；6.72-6.65(m,1H)；5.69-5.59(m,1H)；4.44-4.33(m,1H)；4.03-3.98(m,4H)；3.72-3.39(m,18H)；3.15-3.07(m,2H)；2.96-2.90(m,2H)；2.34-1.78(m,13H)；1.71-1.51(m,7H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.25(m,20H)；1.07-0.93(m,1H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水70:30至100:0+0.1％TFA)：0.76min。
LC-MS m/z:1001.0(M+H)+。
在-30℃和氩气下，将N,N-二异丙基乙胺(0.73mL，4.14mmol)添加至上述胺(5，3.45g，3.45mmol)在无水二氯甲烷(55mL)中的溶液中。逐滴加入溴乙酰溴(0.36mL，4.14mmol)，并将所得溶液在-30℃下搅拌3小时。移除冷却浴，并将混合物在室温下搅拌另外1小时，然后使其蒸发至干。将残余物再溶解于乙酸乙酯(100mL)，用5％柠檬酸水溶液(3×100mL，极慢的相分离)、1M盐酸水溶液(4×100mL)和盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物通过急骤柱色谱法纯化(Silicagel 60，0.040-0-063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5至93:7)，得到呈黄色油的化合物6。
产率：1.63g(44％)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇95:5)：0.15。
1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.55-7.46(m,1H)；7.43-7.33(m,1H)；6.99-6.89(m,1H)；6.58(d,J＝7.5Hz,1H)；5.72-5.59(m,1H)；4.44-4.32(m,1H)；4.02(s,4H)；3.85(s,2H)；3.74-3.40(m,20H)；3.14-3.09(m,2H)；2.33-2.05(m,9H)；2.01-1.76(m,4H)；1.67-1.53(m,7H)；1.46(s,9H)；1.44(s,9H)；1.25(m,20H)；1.07-0.89(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水50:50至100:0+0.1％FA)：3.47min。
LC-MS m/z:1122.0(M+H)+。
将上述化合物(6，1.63g，1.53mmol)溶解在三氟乙酸(25mL)中并放置1.5小时。真空除去三氟乙酸，残余物与甲苯共蒸发三次。将二乙醚(120mL)添加至油状残余物中，并搅拌该混合物1小时。然后滤出沉淀物，并将残余物真空干燥以得到白色粉末。
产率：1.55g(90％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.65-4.56(m,1H)；4.14(s,2H)；4.12(s,2H)；3.98(s,2H)；3.78-3.44(m,20H)；3.14-3.10(d,J＝6.8Hz,2H)；2.48-2.21(m,8H)；2.18-2.10(m,1H)；1.97-1.79(m,4H)；1.70-1.46(m,7H)；1.32(bs,20H)；1.11-0.93(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex，4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：3.32min。
LC-MS m/z:1008.0(M+H)+。
实施例4.8：18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸的制备
Figure BDA0001325351030000721
合成方案：
使WangFmoc-Lys(Mtt)树脂0.26mmol/g(1，11.7g，3.05mmol)在二氯甲烷(100mL)中溶胀45分钟。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，2.35g，6.09mmol)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，2.17g，6.09mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.12mL，12.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3x90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，2.35g，6.09mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，2.17g，6.09mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.12mL，12.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤以获得中间体1。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，1.94g，4.57mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.62g，4.57mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.43mL，8.23mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×90mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入4-[(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)甲基]环己烷羧酸(Fmoc-Trx-OH，1.73g，4.57mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.62g，4.57mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.43mL，8.23mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤以获得中间体2。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×50mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×50mL),2-丙醇(3×50mL)和二氯甲烷(3×30mL)洗涤树脂。向树脂中加入十八烷二酸单叔丁酯(C18(OtBu)-OH，0.85g，2.28mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，0.81g，2.28mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.72mL，4.11mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(50mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×50mL)、二氯甲烷(3×50mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×50mL)洗涤。通过用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷处理(2×10min，2×30min，4×50mL)除去Mtt基团。用二氯甲烷(6×50mL)洗涤树脂。向树脂中加入溴乙酸(4.24g，30.5mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC，4.01mL，25.9mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(50mL)中的溶液，并将该混合物振摇45分钟。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(5×50mL)和二氯甲烷(10×50mL)洗涤。通过用三氟乙酸(50mL)处理1小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用三氟乙酸(1×25mL)和二氯甲烷(2×30mL)洗涤。合并溶液并将溶剂蒸发至干，从而得到呈粘稠淡褐色油的化合物。
产率：2.18mg(64％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH):4.72-4.55(m,2H)；4.16(s,2H)；4.12(s,2H)；3.80-3.62(m,12H)；3.58-3.44(m,4H)；3.32(t,J＝6.8Hz,2H)；3.15(d,J＝6.8Hz,2H)；2.51-2.07(m,8H)；2.01-1.77(m,6H)；1.72-1.44(m,11H)；1.33(bs,24H)；1.13-0.95(m,2H)。
LC-MS纯度：96％。
LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：3.68min。
LC-MS m/z:1124.1(M+H)+。
实施例4.9：16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸的制备
Figure BDA0001325351030000751
合成程序类似于实施例4.8，不同之处在于在中间体2后的合成步骤中，使用十六烷二酸单叔丁酯(C16(OtBu)-OH)代替十八烷二酸单叔丁酯(C18(OtBu)-OH)。获得呈粘稠淡褐色油的产物。
产率：2.05mg(62％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH):4.71-4.55(m,2H)；4.16(s,2H)；4.12(s,2H)；3.79-3.62(m,12H)；3.58-3.44(m,4H)；3.32(t,J＝6.7Hz,2H)；3.15(d,J＝6.6Hz,2H)；2.49-2.07(m,8H)；2.01-1.77(m,6H)；1.72-1.44(m,11H)；1.33(bs,20H)；1.13-0.97(m,2H)。
LC-MS纯度：92％。
LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：3.38min。
LC-MS m/z:1096.0(M+H)+。
实施例4.10：4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸的制备
Figure BDA0001325351030000752
合成程序类似于实施例4.8，不同之处在于在中间体1后的合成步骤中，使用标准Fmoc保护/脱保护合成程序，先将3-羧基丙烷磺酰胺、后将10-(4-叔丁氧羰基苯氧基)癸酸偶联至树脂。如实施例4.8所例示的后续合成步骤、切割和后处理得到白色固体。
LC-MS m/z:998.54(M1+)。
UPLC5：方法09_B4_1，Rt＝8.3004min(pH2.3)；98％纯度。
实施例4.11：4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸的制备
Figure BDA0001325351030000761
合成程序类似于实施例4.8，不同之处在于在中间体1后的合成步骤中，使用标准Fmoc保护/脱保护合成程序，先将(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu)、后将10-(4-叔丁氧羰基苯氧基)癸酸偶联至树脂。如实施例4.8所例示的后续合成步骤、切割和后处理得到白色固体。
LC-MS m/z:978,55(M1+)。
UPLC5：方法09_B4_1，Rt＝7.573min(pH2.3)；99％纯度。
实施例4.12：20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸的制备
Figure BDA0001325351030000771
合成程序类似于实施例4.8，不同之处在于在中间体1后的合成步骤中，使用标准Fmoc保护/脱保护合成程序，先将(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu)偶联至树脂两次，随后将20-叔丁氧基-20-氧代-二十酸(C20(OtBu)-OH)偶联至树脂。如实施例4.8所例示的后续合成步骤、切割和后处理得到白色固体。
LC-MS m/z:1141.2(M+H)+。
实施例4.13：20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸的制备
Figure BDA0001325351030000772
合成程序类似于实施例4.8，不同之处在于在中间体1后的合成步骤中，使用标准Fmoc保护/脱保护合成程序，先将(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu)偶联至树脂，随后将20-叔丁氧基-20-氧代-二十酸(C20(OtBu)-OH)偶联至树脂。如实施例4.8所例示的后续合成步骤、切割和后处理得到白色固体。
LC-MS m/z:1012.0(M+H)+。
实施例4.14：(2S,25S)-2-(4-(2-溴乙酰胺基)丁基)-4,13,22-三氧代-25-(15-磺基十五烷酰胺基)-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21-三氮杂二十六烷二酸的制备
Figure BDA0001325351030000773
合成方案：
使WangFmoc-Lys(Mtt)树脂0.26mmol/g(1，36.7g，9.55mmol)在二氯甲烷(200mL)中溶胀45分钟。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，7.36g，19.1mmol)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，6.79g，19.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.66mL，38.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，7.36g，19.1mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，6.79g，19.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.66mL，38.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(150mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，6.10g，14.3mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，5.09g，14.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.49mL，25.8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(150mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。将树脂分离成三份，向上述树脂的一份中加入16-磺基-十六酸钠(3，2.28g，6.37mmol)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP，3.31g，6.37mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.22mL，12.8mmol)在二甲基亚砜(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺:水混合物(3:1，3×80mL)、N,N-二甲基甲酰胺(3×80mL)、二氯甲烷(3×80mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×80mL)洗涤。通过用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷处理(3×10min，2×30min，5×80mL)除去Mtt基团。用二氯甲烷(6×80mL)洗涤树脂。向树脂中加入溴乙酸(6.64g，47.8mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC，5.26mL，34.0mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(80mL)中的溶液，并将该混合物振摇45分钟。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(4×80mL)和二氯甲烷(10×80mL)洗涤。通过用三氟乙酸(100mL)处理1小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用三氟乙酸(1×40mL)和二氯甲烷(3×50mL)洗涤。合并溶液并将溶剂蒸发至干，得到粘稠淡褐色油。将该油溶解在水:乙腈混合物(4:1，25mL)中，并使溶液通过H+型Dowex50WX4柱(7×10cm)(50-100目；洗脱液：水)。合并具有酸性pH的级分，并冷冻干燥以得到白色粉末。
产率：2.17g(68％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH):4.74-4.56(m,2H)；4.16(d,J＝5.3Hz,4H)；3.95(s,2H)；3.82-3.64(m,12H)；3.61-3.47(m,4H)；3.33(t,J＝6.9Hz,2H)；3.17-3.07(m,2H)；2.54(t,J＝7.3Hz,2H)；2.38(t,J＝7.5Hz,2H)；2.34-2.09(m,2H)；2.01-1.93(m,1H)；1.93-1.78(m,3H)；1.74-1.57(m,4H)；1.57-1.29(m,24H)。
LC-MS纯度：100％。
LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：2.86min。
LC-MS m/z:1003.9(M+H)+。
实施例4.15：12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸的制备
Figure BDA0001325351030000801
合成方案：
使Wang Fmoc-Lys(Mtt)树脂0.26mmol/g(1，36.7g，9.55mmol)在二氯甲烷(200mL)中溶胀45分钟。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，7.36g，19.1mmol)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，6.79g，19.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.66mL，38.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，7.36g，19.1mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，6.79g，19.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.66mL，38.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(150mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，6.10g，14.3mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，5.09g，14.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.49mL，25.8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(150mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×30min，2×150mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤树脂。将树脂分离成三份，向上述树脂的一份(2)中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，2.03g，4.78mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.70g，4.78mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.50mL，8.60mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(70mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×70mL)、二氯甲烷(2×70mL)和N,N-二甲基甲酰胺(70mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1××5min，1x30min，2×70mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×70mL)、2-丙醇(2×70mL)和二氯甲烷(2×70mL)洗涤树脂。向树脂中加入十二烷二酸单叔丁酯(C12(OtBu)-OH，1.37g，4.78mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.70g，4.78mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.50mL，8.60mmol)在二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合物(4:1，70mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5hr。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、二氯甲烷(3×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)洗涤。通过用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷处理(3×10min，2×30min，4×70mL)除去Mtt基团。用二氯甲烷(6×70mL)洗涤树脂。向树脂中加入溴乙酸(6.60g，47.8mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC，5.30mL，34.0mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(90mL)中的溶液，并将该混合物振摇30分钟。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(4×70mL)和二氯甲烷(10×70mL)洗涤。通过用三氟乙酸(100mL)处理1小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用三氟乙酸(1×40mL)和二氯甲烷(2×40mL)洗涤。合并溶液并将溶剂蒸发至干，得到粘稠淡褐色油。
产率：2.94mg(90％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.74-4.53(m,3H)；4.17(s,2H)；4.12(s,2H)；3.96(s,2H)；3.81-3.40(m,16H)；3.31(t,J＝6.8Hz,2H)；2.57-2.20(m,10H)；2.16-2.04(m,3H)；1.89-1.75(m,1H)；1.72-1.54(m,6H)；1.52-1.41(m,2H)；1.32(bs,12H)。
LC-MS纯度：100％。
LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：2.64min。
LC-MS m/z:1028.0(M+H)+。
实施例4.16：12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸的制备
Figure BDA0001325351030000831
合成程序与实施例4.8相似，不同之处在于在中间体1后的合成步骤中，使用标准Fmoc保护/脱保护合成程序，先将(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu)、后将12-叔丁氧基-12-氧代-十二酸偶联至树脂。如实施例4.8所例示的后续合成步骤、切割和后处理得到呈粘稠淡褐色油的化合物。
产率：97％
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.73-4.55(m,2H)；4.17(s,2H)；4.12(s,2H)；3.96(s,2H)；3.80-3.42(m,16H)；3.31(t,J＝6.78Hz,2H)；2.49-2.17(m,7H)；2.01-1.92(m,2H)；1.87-1.76(m,1H)；1.70-1.54(m,6H)；1.52-1.41(m,2H)；1.32(bs,12H)。
LC-MS纯度：100％。
LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：2.72min。
LC-MS m/z:900.0(M+H)+。
实施例4.17：20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸的制备
Figure BDA0001325351030000841
合成方案：
使Wang Fmoc-Lys(Mtt)树脂0.26mmol/g(1，11.2g，2.90mmol)在二氯甲烷(100mL)中溶胀45分钟。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，2.23g，5.80mmol)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，2.06g，5.80mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.02mL，11.6mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，2.23g，5.80mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，2.06g，5.80mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.02mL，11.6mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，1.85g，4.35mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.55g，4.35mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.36mL，7.82mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇1.5小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入4-[(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)甲基]环己烷羧酸(Fmoc-Trx-OH，1.65g，4.35mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.55g，4.35mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.36mL，7.82mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤。通过用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺处理(1×5min，1×10min，1×30min，3×100mL)除去Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、2-丙醇(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入二十烷二酸单叔丁酯(C20(OtBu)-OH，1.73g，4.35mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，1.55g，4.35mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.36mL，7.82mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)、二氯甲烷(3×90mL)、N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)和二氯甲烷(3×90mL)洗涤。通过用含80％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的二氯甲烷处理(2×10min，2×30min，4×100mL)除去Mtt基团。用二氯甲烷(6×90mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×90mL)洗涤树脂。向树脂中加入溴乙酸(8.06g，58.0mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC,7.60mL，49.3mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液，并将该混合物振摇40分钟。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(5×90mL)和二氯甲烷(12×90mL)洗涤。通过用三氟乙酸(100mL)处理1小时从树脂上切下产物。滤出树脂并用三氟乙酸(1×50mL)和二氯甲烷(7×70mL)洗涤。合并溶液并将溶剂蒸发至干，得到粘稠淡褐色油。
产率：3.28g(98％)。
1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH):4.68(dd,J＝8.0和5.4Hz,1H)；4.60(dd,J＝7.9和5.3Hz,1H)；4.16(s,2H)；4.12(s,2H)；3.94(s,2H)；3.81-3.61(m,12H)；3.59-3.44(m,4H)；3.32(t,J＝6.8Hz,2H)；3.14(d,J＝6.8Hz,2H)；2.49-1.79(m,15H)；1.73-1.43(m,11H)；1.33(s,28H)；1.11-0.96(m,2H)。
LC-MS纯度：100％(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:80至100:0+0.1％FA)：4.04min。
LC-MS m/z:1151.3(M+H)+。
实施例5：FGF21衍生物的制备
代表性FGF21衍生物的制备在实施例5.1(化合物21)中给出。实施例5.2-5.14的FGF21衍生物(化合物11-20和22-14)通过实施例5.1提供的方法制备。实施例5.15-5.37的FGF21衍生物通过实施例5.1提供的方法制备或如下文所述制备。
实施例5.1：化合物21
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030000871
该化合物是SEQ ID NO:10的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
化合物21如下制备：
按实施例1-3中一般性描述所制备的SEQ NO:10的S{β-181}-2-氨基乙基硫基-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21类似物位置181的Cys残基在位置181C的Cys残基的巯基处用实施例4.1制备的试剂修饰：
Figure BDA0001325351030000872
向Tris和NaCl-缓冲液(1.35mg/ml)中的半胱胺保护的Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21(70mg，0.0036mmol)中加入Tris水溶液以将pH调节至8.0。加入溶解在水中的BSPP(双(对磺酸基苯基)苯基膦二钾盐二水合物，12mg)，并在室温下轻轻搅拌4小时。加入在乙醇(0.5ml)中的15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十五酸(19mg，0.022mmol)。轻轻搅拌过夜后，加入MiliQ水(150ml)以使电导率降低至2.5mS/cm。在MonoQ 10/100GL柱上利用阴离子交换纯化该混合物，其中使用A-缓冲液：20mMTris，pH8.0；B-缓冲液：20mM Tris，500mM NaCl，pH8.0，流量为6ml，梯度为0-80％B，经60个CV。产率：37mg，51％。
LCMS方法2：
理论质量：20279.9；实测：20280.4
实施例5.2：化合物11
S{β-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21
Figure BDA0001325351030000881
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:6的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2
理论质量：20279.9；实测：20280.2
实施例5.3：化合物12
S{β-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21
Figure BDA0001325351030000891
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:7的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20203.8；实测：20204.2
实施例5.4：化合物13
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030000901
该化合物是使用实施例4.2的试剂11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十一酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2
理论质量：20239.8；实测：20240.1
实施例5.5：化合物14
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030000911
该化合物是使用实施例4.3的试剂13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十三酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3：
理论质量：20267.8；实测：20268.1
实施例5.6：化合物15
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030000921
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2：
理论质量：20295.9；实测：20296.2
实施例5.7：化合物16
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030000931
该化合物是使用实施例4.5的试剂17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20323.9；实测：20324.5
实施例5.8：化合物17
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030000941
该化合物是使用实施例4.4的试剂19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十九酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20352.0；实测：20352.0
实施例5.9：化合物18
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21
Figure BDA0001325351030000951
该化合物是使用实施例4.5的试剂17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十七酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:9的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2：
理论质量：20236.8；实测：20237.0
实施例5.10：化合物19
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030000961
该化合物是使用实施例4.2的试剂11-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十一酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:1的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2：
理论质量：20223.8；实测：20224.4。
实施例5.11：化合物20
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030000971
该化合物是使用实施例4.3的试剂13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基-氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十三酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:10的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2：
理论质量：20251.8；实测：20252.2
实施例5.12：化合物22
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030000981
该化合物是使用实施例4.5的试剂17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}-乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:10的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2：
理论质量：20307.9；实测：20308.6。
实施例5.13：化合物23
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030000991
该化合物是使用实施例4.4的试剂19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基-氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十九酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:10的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法2：
理论质量：20336.0；实测：20336.2
实施例5.14：化合物24
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Met[Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030001001
该化合物是使用实施例4.5的试剂17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十七酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:11的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3：
理论质量：20372.2；实测：20372.2。
实施例5.15：化合物34
S{β-168}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Cys168]FGF21
Figure BDA0001325351030001011
该化合物是使用实施例4.3的试剂13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十三酸，通过实施例5.1所述的方法制备的SEQ ID NO:13的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法1
理论质量：20225.；实测：20226.7
实施例5.16：化合物35
S{β-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21
Figure BDA0001325351030001021
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:14的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20267.8；实测：20268.2
实施例5.17：化合物36
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21
Figure BDA0001325351030001031
该化合物是使用实施例4.5的试剂18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:15的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.18：化合物37
S{β-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21
Figure BDA0001325351030001032
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:18的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20238.8；实测：20239.3
实施例5.19：化合物38
S{β-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure BDA0001325351030001041
该化合物是使用实施例4.3的试剂13-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十三酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:19的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法1
理论质量：20281.9；实测：20281.9
实施例5.20：化合物39
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure BDA0001325351030001051
该化合物是使用实施例4.5的试剂18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:19的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.21：化合物40
16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-16-氧代-十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure BDA0001325351030001061
该化合物是使用实施例4.1的试剂16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-16-氧代-十六酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:19的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.22：化合物41
S{β-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21
Figure BDA0001325351030001071
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:20的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20210.8；实测：20211.4
实施例5.23：化合物42
S{β-176}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys176]FGF21
Figure BDA0001325351030001081
该化合物是使用实施例4.1的试剂15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}十五酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:4的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
LCMS方法3
理论质量：20279.9；实测：20280.4
实施例5.24：化合物43
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001091
该化合物是使用实施例4.11的试剂4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.25：化合物44
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001101
该化合物是使用实施例4.10的试剂4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.26：化合物45
20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001111
该化合物是使用实施例4.12的试剂20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.27：化合物46
20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001121
该化合物是使用实施例4.13的试剂20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.28：化合物47
(2S)-6-乙酰胺基-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001131
该化合物是使用实施例4.14的试剂(2S)-6-[(2-溴乙酰基)氨基]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.29：化合物48
12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001141
该化合物是使用实施例4.16的试剂12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.30：化合物49
12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001151
该化合物是使用实施例4.15的试剂12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.31：化合物50
20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001161
该化合物是使用实施例4.17的试剂20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.32：化合物51
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001171
该化合物是使用实施例4.7的试剂16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.33：化合物52
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001181
该化合物是使用实施例4.9的试剂16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.34：化合物53
18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001191
该化合物是使用实施例4.8的试剂18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.35：化合物54
12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure BDA0001325351030001201
该化合物是使用实施例4.6的试剂12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:8的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.36：化合物55
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030001211
该化合物是使用实施例4.11的试剂4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:10的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
实施例5.37：化合物56
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure BDA0001325351030001221
该化合物是使用实施例4.10的试剂4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-溴乙酰基)氨基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸，通过实施例5.1所述方法制备的SEQ ID NO:10的FGF21类似物(参见实施例3)的衍生物。
药理学方法
本发明的FGF21类似物或其衍生物作为药学活性剂在减少哺乳动物(如人)的体重增加和治疗肥胖症和糖尿病中的应用可通过在常规试验中以及在以下所述的体外和体内试验中通过FGF21激动剂的活性来证明。
此类试验还提供了一种方法，凭借该方法可将本发明的FGF21化合物的活性与已知化合物的活性进行比较。
实施例6：在超表达人BKL的HEK293中的Erk磷酸化试验中的FGF受体效力
本实施例的目的是测试FGF21衍生物在体外的活性或效力。体外效力是全细胞试验中FGF受体激活的量度。
实施例5的FGF21衍生物的效力在超表达人β-klotho(BKL)的HEK(人胚肾细胞)中进行测定，如以下进一步描述。
为了测试FGF21衍生物与白蛋白的结合，该试验在不存在血清白蛋白以及存在人血清白蛋白(HSA)(0.1％最终测定浓度)的情况下进行。在血清白蛋白的存在下，FGF21衍生物的EC50值的增加(效力的降低)将指示与血清白蛋白的结合，并代表用来预测测试物质在动物模型中延长的药代动力学谱的方法。
FGF21类似物的结果示于表2中，而FGF21衍生物的结果示于表3中。包含MetFGF21(SEQ ID NO:2)以供参考。
试验原理
HEK293细胞内源性地表达数种FGF受体，包括FGFR1c、FGFR3c和FGFR4。在用共受体β-klotho(BKL)转染之前，这些细胞对FGF21是不响应的。FGF受体/BKL复合体的激活导致MAPK/ERK信号途径的激活和ERK的磷酸化。在给定时间点的磷酸化ERK(pERK)的水平随FGF21浓度的升高而升高。如下所述，在用一系列的FGF21类似物浓度刺激12分钟之后测定pERK的水平。
试验描述
将HEK293/β-klotho细胞以30,000个细胞/孔接种在96孔板中的补充有10％FCS(Gibco#16140-071)、1％青霉素/链霉素(Gibco#15140)、100μg/ml潮霉素B(Calbiochem,#400052)的DMEM(BioWhittaker#BE12-604F/U1)中。两天后且在加入化合物之前2小时，将细胞培养基更换为100μl基础培养基(DMEM(BioWhittaker#BE12-604F/U1))。将FGF21类似物在测定培养基(补充有0.02％吐温20的DMEM(BioWhittaker#BE12-604F/U1))中稀释，加温至37℃，加入细胞(100μl)，并在37℃下温育12分钟。FGF21衍生物还在0.1％HSA(Sigma–A1887)的存在下进行测试。快速移出所有培养基，并且每孔加入50μl裂解缓冲液。将该培养板摇动5分钟，并准备好裂解物以供pERK的测定。用AlphaScreen SureFire试剂盒(PerkinElmer#TGRES10K)在384孔板中测定pERK。该试剂盒基于与供体和受体珠子偶联的ERK和pERK特异性抗体。pERK的存在将使受体和供体珠子紧密接近，并生成信号，在EnVision上读取该信号。使用GraphPad Prism分析数据，并将FGF21蛋白的效力描述为绝对EC50值。
表2A.FGF21类似物在HEK293/BKL细胞中的效力
Figure BDA0001325351030001241
从表2中的结果可以看出，在位置176、177、178或179处引入半胱氨酸使效力与MetFGF21相比急剧降低。然而，出乎意料地，在位置180或在位置181处引入半胱氨酸导致与MetFGF21相比没有(180C)或仅有适度(181C)的效力降低。在位置180处具有半胱氨酸的化合物7显示出与MetFGF21和除了位置180处的半胱氨酸外与化合物8具有相同氨基酸改变的化合物2两者类似的效力。
与MetFGF21以及除了位置181的半胱氨酸外与化合物9具有相同氨基酸改变的化合物2相比，在位置181处具有半胱氨酸的化合物9的效力仅稍微降低。
表2B.其他FGF21类似物在HEK293/BKL细胞中的效力
Figure BDA0001325351030001251
可以看出，具有C168氨基酸置换的化合物#26效力降低，而在位置167、169、170、171、172、173、174和175处具有半胱氨酸的类似物意外地具有类似于MetFGF21的效力。
表3A.在不存在或存在0.1％HSA的情况下，FGF21衍生物在HEK293/BKL细胞中的效 力。
Figure BDA0001325351030001261
从表3A中的结果可以看出，意外地发现与不具有侧链的化合物(参见表2)相比，本发明的侧链附接至位置178-181中任一处的半胱氨酸没有导致效力的降低。化合物11、12、15和21都包含相同的侧链，其中延长体元件为C16二酸(化学式1a)(连接体元件为一个化学式2元件、两个化学式3a元件和一个化学式4a元件)。当与相应的FGF21类似物(化合物5、6、7和9，参见表2)的效力比较时，可以看出这些FGF21衍生物的效力类似于相应的FGF类似物(即不具有侧链)。
还探究了不同脂肪链长度对具有延长体元件的化合物的效力的影响。在不存在HSA的情况下，在位置180处具有半胱氨酸的FGF衍生物的效力类似于具有C12二酸、C14二酸、C16二酸或C18二酸作为延长体元件的FGF21衍生物。在不存在HSA的情况下，在位置181处具有半胱氨酸的FGF衍生物的效力类似于具有C14二酸、C16二酸、C18二酸或C20二酸作为延长体元件的FGF21衍生物。
提高HSA浓度对包含C12、C14或C16侧链的衍生物的效力没有影响或具有适度影响，而在存在0.1％HAS的情况下，具有C18或C20侧链的化合物的效力降低。
从表3A可以看出，与不存在血清白蛋白时的EC50值相比，FGF21衍生物在存在0.1％血清白蛋白时的EC50值增加与延长体长度的增加相符合。这良好地符合这些FGF21衍生物的半衰期延长(参见实施例8)。
表3B.在不存在或存在0.1％HSA的情况下，其他FGF21衍生物在HEK293/BKL细胞中 的效力。
Figure BDA0001325351030001271
进一步测试了如上所述具有不同FGF21骨架的FGF21衍生物的效力，并且发现当用脂肪酸延长体衍生化时，在位置169、170、171、172、173、174和175处具有半胱氨酸的衍生物都保持效力。注意到，在Cys 169处的衍生化稍微降低了效力。
表3C.在不存在或存在0.1％HSA的情况下，其他FGF21衍生物在HEK293/BKL细胞中 的效力。
Figure BDA0001325351030001272
Figure BDA0001325351030001281
为了比较其他延伸元件，测试了延长体和连接体的不同组合。全部与Cys 180或Cys 181缀合，并且观察到所获得的FGF21衍生物具有十分类似的功能，这表明当与FGF21Cys如Cys 180或Cys 181缀合时可以使用各种延长体元件。
实施例7：3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入
对C-末端修饰的类似物增加3T3-L1小鼠脂肪细胞中的葡萄糖摄入的能力进行了测试。以下试验用于测定本发明的FGF21类似物和衍生物的生物活性或效力。
试验原理
还可以通过测试FGF21类似物和衍生物增加葡萄糖向脂肪细胞中的摄入的能力，在采用小鼠3T3-L1脂肪细胞的试验中测定体外效力。分化的3T3-L1脂肪细胞内源性地表达FGFR1c和BKL。在分化前，3T3-L1细胞对FGF21是不响应的，因为分化导致共受体BKL的表达。FGFR1受体/BKL复合体的激活增加了葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达，因此FGF21激动剂将以剂量反应的方式导致吸收进脂肪细胞中的葡萄糖的量增加。
试验描述
将小鼠3T3-L1成纤维细胞(例如可获自ATCC，目录号CL-173)保持在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的基础培养基(DMEM(4500mg/l葡萄糖))中。不允许细胞达到汇合，并应该在达到约60％汇合度(通过目测)之前传代(转移至新的小瓶)。
对于葡萄糖摄入试验，细胞在96孔板(BIOCOAT)中为15,000个细胞/孔，并且当它们达到汇合(高密度，意在制备分化的脂肪细胞)时，将培养基由基础培养基更换为含曲格列酮、IBMX、地塞米松(例如可商购自Sigma)和人胰岛素(例如可商购自Novo Nordisk A/S)的基础培养基。在开始分化后7-9天使用细胞。在基础培养基中用浓度逐渐增加(0-300nM)的本发明FGF21类似物或衍生物刺激细胞20小时。在加入3H-脱氧-葡萄糖(在下文中：示踪剂)之前，在温的(约37℃)测定缓冲液(含有1mMMgCl2和2mMCaCl2的PBS、HEPES和0.1％人血清白蛋白)中洗涤细胞，并将细胞与示踪剂一起温育1小时。通过在冰冷的测定缓冲液中洗涤两次结束该温育。将细胞用Triton X-100裂解，并将裂解物转移到96孔板中，加入microscint-40(例如可商购自Perkin Elmer)，并在TOP计数器(例如，来自Perkin Elmer的Packard top-counter)中对示踪剂的量进行计数。计算所讨论的FGF21化合物的EC50和Emax。以下表4-表5中显示的结果分别指示了FGF21类似物和衍生物的EC50(效力)和Emax(功效)。
表4：FGF21类似物在3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入
Figure BDA0001325351030001291
Figure BDA0001325351030001301
表5.FGF21衍生物在3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄入
Figure BDA0001325351030001302
Figure BDA0001325351030001311
因为基础测定培养基中血清、因而白蛋白的存在，由于FGF21衍生物的侧链与白蛋白的结合，FGF21衍生物(表5)具有比相应的FGF21类似物(表4)更低的效力。效力的降低与延长体元件的长度相关。
实施例8：在小型猪和小鼠中的药代动力学研究
本研究的目的在于确定FGF21衍生物在静脉内施用于小型猪和小鼠后的体内延长性，即FGF21衍生物在体内的时间的延长以及由此导致的其作用时间的延长。这在药代动力学(PK)研究中完成，其中测定了所讨论的类似物的终末半衰期。终末半衰期是指在终末消除阶段使某个血浆浓度减半所花的时间。
在小型猪中的研究
在本研究中使用从Ellegaard
Figure BDA0001325351030001312
Minipigs(Dalmose,Denmark)获得的约7-14个月龄且重约16-35kg的雌性
Figure BDA0001325351030001313
小型猪。将小型猪单独地(具有永久导管的猪)或成组地圈养，并限制性地每日一次或两次饲以SDS小型猪饮食(Special DietsServices,Essex,UK)。
在至少2周的适应后，将两个永久中心静脉导管植入每只动物的尾侧或颅侧腔静脉中。使动物在手术后恢复1周，然后用于重复的药代动力学研究，其中在连续给药之间具有适当的洗脱期。
所述化合物的静脉注射液(体积对应于例如0.050-0.125ml/kg)通过一个导管或通过venflon给予，并在预定的时间点采集血样，直到给药后11天(优选通过另一个导管或通过静脉穿刺)。
将血液样品(例如0.8ml)收集在EDTA(8mM)包被的试管中，随后在4℃和1942G下离心10分钟。收集血液样品以充分覆盖API的完全血浆浓度-时间曲线。在实例中，在t＝给药前、给药后0.0833、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、30、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264小时收集血液样品。
将血浆移取至干冰上的Micronic管中，并在-20℃下保存，直到使用ELISA来分析相应FGF-1类似物的血浆浓度。通过Phoenix v.6.3(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)或用于PK分析的其他相关软件中的非房室药代动力学方法分析单独的血浆浓度-时间曲线，并确定所得到的终末半衰期(调和平均值)。如上所述，FGF21衍生物的终末半衰期是采用不同剂量的两个测定的算数平均值。
在小鼠中的研究
在正常的瘦型C57bl小鼠n＝2-3(约30克)中测试FGF21类似物的药代动力学谱。FGF21化合物以单一静脉内剂量20mg/kg(约5ml/kg)给药。
使用成纤维细胞生长因子-21人ELISA(可获自BioVendor，目录号RD191108200R)测定FGF21化合物的血浆水平。使用基于PC的软件——来自Pharsight Corportion,CaryN.C.的WinNonLin第6.3版进行药代动力学计算。结果在表6中给出。
表6：FGF21类似物的药代动力学谱。
Figure BDA0001325351030001321
从表6中可以看出，在小型猪和小鼠中血浆半衰期随着延长体元件的脂肪酸链的长度而增加。
实施例9：瘦型小鼠中的体重减轻
为了测定FGF21衍生物的体内效力，在瘦型C57BL小鼠中研究了皮下(s.c.)给药后对体重的影响。之前已经表明，瘦型小鼠中由FGF21诱导的体重减轻对在肥胖小鼠中的效果有预示性，因此认为瘦型小鼠是良好的筛选模型。
每日一次(QD)或两次(BID)皮下施用在10mM磷酸盐、2％(w/vol)甘油、500ppm(＝0.05％)聚山梨酯80，pH＝8.15(2ml/kg)中的所述化合物1mg/kg，持续7天(n＝7-8)。相应的媒介物处理组(对照)用10mM磷酸盐、2％(w/vol)甘油、500ppm(＝0.05％)聚山梨酯80，pH＝8.15(2ml/kg)每日皮下处理两次，持续7天(n＝6-8)。在给药前以及在处理7天后再次测量体重。结果见表7。
表7：第1天至第7天相对于基线的体重变化(百分比)
Figure BDA0001325351030001331
Figure BDA0001325351030001341
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001单因素ANOVA事后Dunnet检验比较化合物与相应的媒介物，n＝6-8
以体重减轻的形式测得的在位置180处具有侧链的FGF21衍生物的体内效力高于在位置181处具有相同侧链的衍生物。因此，体内效力与体外效力相关。对体重减轻的影响依赖于血浆半衰期。如果血浆半衰期短，则每日给药两次增加效力。
尽管己在本文中说明和描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现将会想到许多修改、替代、改变和等同物。因此，应当理解，所附权利要求意欲涵盖落入本发明的真实精神内的所有这类修改和改变。
序列表
<110> 诺和诺德股份有限公司
<120> FGF21衍生物及其用途
<130> 140109CN01
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
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Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
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Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
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Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
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Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
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Pro Ser Tyr Ala Ser
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<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 2
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
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<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
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<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
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65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Cys
180
<210> 12
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 12
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Cys Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 13
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 13
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Cys Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 14
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 14
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
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50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
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100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
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Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Cys Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 15
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 15
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
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65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Cys Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 16
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 16
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
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50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Cys Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 17
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 17
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
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Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Cys Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 18
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 18
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Cys Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 19
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 19
Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
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Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
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Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Cys Arg
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180
<210> 20
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基于成熟人FGF21的人工蛋白质
<400> 20
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
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115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Cys
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180

Claims (85)

1.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，
其中所述FGF21蛋白与如SEQ ID NO:1所示的成熟人FGF21具有至少95%的同一性，
其中所述衍生物包含经由连接体附接至1个Cys残基的延长体，该Cys残基位于与成熟人FGF21的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相对应的位置处，并且所述衍生物具有FGF21活性，
其中，该延长体选自
化学式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*以及
化学式1C：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
其中x为8-18范围内的整数；并且
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
其中化学式2选自：
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*，
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*以及
*-NH-(CH2)m-环己烷-CO-*，
其中m为1-5范围内的整数，
其中化学式3为*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，其中k为1-5范围内的整数，并且n为1-5范围内的整数，并且
其中化学式4选自
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*和
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
其中m为1-5范围内的整数；并且
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21的位置167、169、170、171、172、173、174、175、180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
2.根据权利要求1的衍生物，其中所述Cys残基位于与成熟人FGF21的位置167、170、171、172、173、174、175、180或181相对应的位置处。
3.根据权利要求1的衍生物，其中所述Cys残基位于与成熟人FGF21的位置180相对应的位置处。
4.根据权利要求1的衍生物，其中所述Cys残基位于位置170、171、172、173、174、175、180或位置181处。
5.根据权利要求1的衍生物，其中所述Cys残基位于位置170、173、174、175、180或位置181处。
6.根据权利要求1-5中任一项的衍生物，其中化学式2选自：
化学式2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式2b：*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*以及
化学式2c：*-NH-CH2-环己烷-CO-*。
7.根据权利要求1的衍生物，其中化学式4选自：
化学式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*，和
化学式4b：*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*。
8.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，
其中所述FGF21蛋白与如SEQ ID NO:1所示的成熟人FGF21具有至少95%的同一性，
其中所述衍生物包含经由连接体附接至1个Cys残基的延长体，该Cys残基位于与成熟人FGF21的位置180或位置181相对应的位置处；并且所述衍生物具有FGF21活性，
其中该延长体选自
化学式1A：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数，
化学式1B：HOOC-苯-O-(CH2)x-CO-*，
其中x为8-18范围内的整数，
以及
化学式1C：HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数，
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数；
并且
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其-CH2-*端连接至在与成熟人FGF21的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
9.根据权利要求1或8的衍生物，其中化学式1选自：
化学式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*，
化学式1b：HOOC-苯-O-(CH2)9-CO-*以及
化学式1c：HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*。
10.FGF21蛋白的衍生物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，
其中所述FGF21蛋白与如SEQ ID NO:1所示的成熟人FGF21具有至少95%的同一性，
其中所述衍生物包含经由连接体附接至1个Cys残基的延长体，该Cys残基位于与成熟人FGF21的位置180或位置181相对应的位置处；并且所述衍生物具有FGF21活性，
其中该延长体为
化学式1：HOOC-(CH2)x-CO-*，
其中x为10-18范围内的整数；并且
其中该连接体包含化学式2、化学式3和化学式4中每一种的至少一个：
化学式2：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3：*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*，以及
化学式4：*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*，
其中k为1-5范围内的整数，n为1-5范围内的整数，且m为1-5范围内的整数；
其中化学式2、化学式3和化学式4经由酰胺键并按所示顺序相互连接，在其*-NH端连接至所述延长体的CO-*端，并在其CH2-*端连接至在与成熟人FGF21的位置180或位置181相对应的位置处的Cys残基的硫原子。
11.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述Cys残基位于与成熟人FGF21的位置180相对应的位置处。
12.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21，所述蛋白具有最多8个氨基酸修饰。
13.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21，所述蛋白具有最多5个氨基酸修饰。
14.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21，所述蛋白具有4或5个氨基酸修饰。
15.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中相比于成熟人FGF21，所述蛋白具有4个氨基酸修饰。
16.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述FGF21蛋白与成熟人FGF21具有至少96%的同一性。
17.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述FGF21蛋白与成熟人FGF21具有至少97%的同一性。
18.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述FGF21蛋白与成熟人FGF21具有至少98%的同一性。
19.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述FGF21蛋白与成熟人FGF21具有至少99%的同一性。
20.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述FGF21蛋白在与成熟人FGF21的位置121、168、180或181中的一个或多个相对应的一个或多个位置处包含氨基酸改变。
21.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述FGF21蛋白包含在与成熟人FGF21的N-末端相对应的位置处的Ala残基添加。
22.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述蛋白在与成熟人FGF21的位置121或168中的一个或多个相对应的一个或多个位置处包含氨基酸改变。
23.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含121Q，或168L，或二者。
24.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含121Q。
25.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含168L。
26.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述蛋白包含SEQ ID NO:8或10的氨基酸序列。
27.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述蛋白具有SEQ ID NO: 8、10、12、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列。
28.根据权利要求1或8的衍生物，其中所述延长体为化学式1A或化学式1C并且x为12-18范围内的整数。
29.根据权利要求1或8的衍生物，其中所述延长体为化学式1A或化学式1C并且x为14-16范围内的整数。
30.根据权利要求1或8的衍生物，其中所述延长体为化学式1B并且x为8-12范围内的整数。
31.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中x为16。
32.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中k为1-2范围内的整数。
33.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中k为1。
34.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中n为1-2范围内的整数。
35.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中n为1。
36.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中化学式4的m为2。
37.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述延长体包含化学式1a：HOOC-(CH2)16-CO-*。
38.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述延长体由化学式1a：HOOC-(CH2)14-CO-*组成。
39.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体包含以下的一种、两种或三种：
化学式2a：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，
化学式3a：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*以及
化学式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*。
40.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体包含化学式3a：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。
41.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体包含化学式4a：*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*。
42.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体由至少一个化学式2元件、两个化学式3元件和一个化学式4元件组成。
43.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体由一个化学式2元件、两个化学式3元件和一个化学式4元件组成。
44.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体由两个化学式2元件、两个化学式3元件和一个化学式4元件组成。
45.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述连接体由一个化学式2元件、两个化学式3a元件和一个化学式4a元件组成。
46.根据权利要求1的衍生物，其中所述衍生物为以下之一：
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物13）
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物14）
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物15）
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物16）
Figure DEST_PATH_IMAGE008
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物17）
Figure DEST_PATH_IMAGE010
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21（化合物18）
Figure DEST_PATH_IMAGE012
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物19）
Figure DEST_PATH_IMAGE014
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物20）
Figure DEST_PATH_IMAGE016
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物21）
Figure DEST_PATH_IMAGE018
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物22）
Figure DEST_PATH_IMAGE020
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物23）
Figure DEST_PATH_IMAGE022
；
S{β-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Met[Cys181]FGF21（化合物24）
Figure DEST_PATH_IMAGE024
；
S{β-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21（化合物35）
Figure DEST_PATH_IMAGE026
；
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21（化合物36）
Figure DEST_PATH_IMAGE028
；
S{β-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21（化合物37）
Figure DEST_PATH_IMAGE030
；
S{β-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21（化合物38）
Figure DEST_PATH_IMAGE032
；
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21（化合物39）
Figure DEST_PATH_IMAGE034
；
16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-16-氧代-十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21（化合物40）
Figure DEST_PATH_IMAGE036
；
S{β-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21（化合物41）
Figure DEST_PATH_IMAGE038
；
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物43）
Figure DEST_PATH_IMAGE040
；
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物44）
Figure DEST_PATH_IMAGE042
；
20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物45）
Figure DEST_PATH_IMAGE044
；
20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-20-氧代-二十酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物46）
Figure DEST_PATH_IMAGE046
；
(2S)-6-乙酰胺基-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物47）
Figure DEST_PATH_IMAGE048
；
12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物48）
Figure DEST_PATH_IMAGE050
；
12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-12-氧代-十二酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物49）
Figure DEST_PATH_IMAGE052
；
20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-20-氧代-二十酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物50）
Figure DEST_PATH_IMAGE054
；
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物51）
Figure DEST_PATH_IMAGE056
；
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-16-氧代-十六酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物52）
Figure DEST_PATH_IMAGE058
；
18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-乙酰胺基]-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-18-氧代-十八酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物53）
Figure DEST_PATH_IMAGE060
；
12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰胺基乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基甲酰基]环己基]甲基氨基]-12-氧代-十二酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物54）
Figure DEST_PATH_IMAGE062
；
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物55）
Figure DEST_PATH_IMAGE064
；
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-乙酰胺基-1-羧基-戊基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]磺酰基氨基]-10-氧代-癸氧基]苯甲酸-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21（化合物56）
Figure DEST_PATH_IMAGE066
。
47.根据权利要求1的衍生物，其中所述衍生物为以下之一：
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(11-羧基十一酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物13）
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物14）
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物15）
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物16）
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21（化合物17）
Figure DEST_PATH_IMAGE010A
；
S{β-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基-氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-乙基氨基]-2-氧代乙基]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21（化合物18）
Figure DEST_PATH_IMAGE012A
。
48.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物选自化合物13-24和化合物43至56。
49.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物选自化合物35-41。
50.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物13。
51.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物14。
52.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物15。
53.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物16。
54.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物17。
55.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物18。
56.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物19。
57.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物20。
58.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物21。
59.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物22。
60.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物23。
61.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物24。
62.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物35。
63.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物36。
64.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物37。
65.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物38。
66.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物39。
67.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物40。
68.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物41。
69.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物43。
70.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物44。
71.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物45。
72.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物46。
73.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物47。
74.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物48。
75.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物49。
76.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物50。
77.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物51。
78.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物53。
79.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物54。
80.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物55。
81.根据权利要求46的衍生物，其中所述衍生物为化合物56。
82.根据权利要求1、8和10中任一项的衍生物，其中所述衍生物能够激活FGF受体。
83.根据权利要求1-82中任一项的衍生物在制备药物中的用途，该药物用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病及相关疾病，其中所述相关疾病选自肥胖症、饮食失调、心血管疾病和糖尿病并发症；和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能；和/或用于延缓或预防糖尿病进展；以及/或者用于治疗和/或预防肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。
84.FGF21蛋白，其在与如SEQ ID NO:1所示的FGF21(1-181)的位置180相对应的位置处包含野生型氨基酸被半胱氨酸残基的氨基酸置换，并且其与所述FGF21(1-181)具有至少95%的同一性。
85.根据权利要求84的FGF21蛋白，其中除了在FGF21(1-181)的位置180处的Cys残基之外，所述FGF21蛋白还包含-1Ala、121Gln和/或168Leu。
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