KR102427527B1 - Fgf21 유도체 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

발명은 성숙한 인간 FGF21의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 특히 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기를 가지는 FGF21 단백질의 유도체 및 이 시스테인에 부착된 측쇄를 가지는 그것의 유도체에 관한 것이다. 발명의 FGF21 유도체는 FGF 수용체를 향해 고도의 효능을 나타낸다. 발명은 또한 그런 FGF21 유도체 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물, 뿐만 아니라 FGF21 유도체의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

FGF21 유도체 및 그것의 용도{FGF21 DERIVATIVES AND USES THEREOF}
본 발명은 FGF21의 유사체의 유도체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 181에 측쇄를 가지는 FGF21의 유사체 및 그것들의 제약학적 용도에 관한 것이다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
"서열 목록"을 제목으로 하는 서열 목록은 33 kb이고, 2015년 12월 21일에 작성되었으며 본원에 참조로 포함된다.
FGF21은 유사분열촉진 효과보다는 대사 효과를 가지는 비정형적인 섬유아세포 성장 인자 (FGF)의 FGF19 서브패밀리에 속한다. FGF21은 FGF 수용체 (FGFR1c, FGFR2c 및 FGFR3c)에 결합하여 그것들을 활성화시키지만 단지 비-신호화 공-수용체 베타-클로토(klotho) (BKL)의 존재하에서만 그렇다. BKL의 조직 특이적 발현은 FGF21의 대사적 활성을 측정한다. FGF21 형질전환 마우스는 다이어트-유도 비만에 대해 내성이고 증가된 수명을 갖는다. FGF21은 당뇨병 및 이상지질혈증이 있는 비만 환자에서 체중 반전, 과혈당증 및 이상지질혈증의 가능성이 큰 에너지 소비, 글루코오스 및 지질 대사의 대사 조절제이다.
FGF21은 단백질 가수분해로 인하여 생체 내 불안정성을 겪고, 내인성 순환 인간 FGF21의 절반 정도로 많이 비활성이다. 활성의 손실은 C-말단의 분해로 인한 것이고, 이들 대사물의 대부분은 S181보다는 P171에서 종결된다. 그러므로 C-말단 영역에서 대사적 파괴에 대한 보호는 치료용 FGF21 분자에 대해 바람직하다.C-말단 영역의 엔지니어링은 분해에 대해 보호할 수 있지만, 지금까지 그런 엔지니어링은 엔지니어링된 FGF21 화합물의 저하된 또는 손실된 효능을 댓가로 치뤄왔다. FGF21의 N-말단 영역은 FGFR에 결합하는 한편 FGF21의 C-말단 영역은 BKL에 결합한다. C-말단 아미노산의 절단은 효능의 유의미한 손실을 유발한다.
[180C]FGF21의 위치 180에서 페길화 (PEGylation)는 시험관 내 활성의 극적인 감소를 초래한다 (J. Xu et al, Bioconjugate Chemistry (2013), 24, 915-925). Fc를 FGF21의 C-말단에 부착시킴으로써 유발되는 Fc 융합 단백질은 천연 FGF21 및 FGF21의 N-말단 Fc 융합보다 훨씬 효능이 적다 (Hecht et al, PLoS One 2012, 7(11), e49345).
본 발명은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에 비교하여 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 181 중 하나에 상응하는 위치에 측쇄를 가지는 FGF21 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에 비교하여 위치 180 또는 181 중 하나에 상응하는 위치에 측쇄를 가지는 FGF21 유도체에 관한 것이다. 보다 구체적으로 측쇄는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180에 상응하는 FGF21 유사체의 위치에 공유적으로 부착되거나, 또는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 181에 상응하는 FGF21 유사체의 위치에 공유적으로 부착된다.
보다 구체적으로 측쇄는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 174 또는 175에 상응하는 FGF21 유사체의 위치에 공유적으로 부착되거나, 또는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 171, 172 또는 173에 상응하는 FGF21 유사체의 위치에 공유적으로 부착된다.
시스테인은 FGF21 유사체에서 측쇄의 부착 위치에 존재한다. 측쇄는 그 측쇄가 부착되는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 부착된다. 측쇄는 링커 및 프로트랙터 (protractor)를 포함한다. 프로트랙터는 지방 2-산일 수 있다.
링커는 여러 링커 엘레먼트, 예컨대 하나 이상의 gGlu 잔기 및/또는 하나 이상의 Ado 잔기 (Ado는 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산임) 및/또는 *-NH 기 및 *-CO 기를 통합시키는 하나 이상의 다른 2-라디칼을 포함할 수 있다. 프로트랙터와 링커는 아미드 결합을 통해 연결된다. 링커는 FGF21 단백질의 180Cys 또는 181Cys의 황 원자에 티오에테르 결합을 통해 연결된다.
링커는 여러 링커 엘레먼트, 예컨대 하나 이상의 gGlu 잔기 및/또는 하나 이상의 Ado 잔기 (Ado는 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산임) 및/또는 하나 이상의 Trx 엘레먼트 (Trx는 트라넥사민산임) 및/또는 하나 이상의 *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및/또는 *-NH 기 및 *-CO 기를 통합시키는 하나 이상의 다른 2-라디칼을 포함할 수 있다. 프로트랙터와 링커는 아미드 결합을 통해 연결되는 한편, 링커는 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 181의 시스테인의 황 원자를 통한 티오에테르 결합을 통해 FGF21 단백질에 연결된다.
발명의 FGF21 유도체에 통합된 FGF21 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 유사체이고, 그 유사체는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치들 중 하나에서 시스테인 잔기를 포함한다.
발명의 유도체의 FGF21 유사체는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)와 비교하여 총 최대 30개의 아미노산 변화를 가질 수 있고, 그중 위치 180 또는 181 중 하나의 시스테인 잔기가 하나의 아미노산 변화로 간주된다. 최대 29개의 추가의 변화는, 독립적으로, 하나 이상의 연장, 하나 이상의 삽입, 하나 이상의 결실 및/또는 하나 이상의 치환일 수 있다.
특히 발명은 제1 측면으로, FGF21 단백질의 유도체, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련되는데, 상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하며, 상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하고; 프로트랙터는 다음:
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HOOC-벤젠-O-(CH2)x-CO-*
Chem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*의 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 8 내지 18의 범위의 정수이고;
링커는 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함하는데;
Chem. 2는
Chem. 2A: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 2B: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
Chem. 2C: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로부터 선택되며,
Chem. 3은 *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*이고, 여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이며, n은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
Chem. 4는
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* 및
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*로부터 선택되며, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되며 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결된다.
보다 구체적으로, 발명은 제1 측면으로, FGF21 단백질의 유도체에 관련되는데, 상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기와, 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 최대 30개의 아미노산 변형을 포함하며; 상기 유도체는 상기 Cys 잔기에 링커를 통하여 부착된 프로트랙터를 포함하고; 프로트랙터는 Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*이며, 여기서 x는 10 내지 18의 범위의 정수이고; 링커는 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함하며:
Chem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-* 및
Chem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이고, n은 1 내지 5의 범위의 정수이며, m은 1 내지 5의 범위의 정수이다. Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되며 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결된다.
화합물 13 내지 화합물 24로 표시된 발명의 바람직한 FGF21 유도체는 실험 단원에서 개시된다.
화합물 13 내지 화합물 18로 표시된 발명의 추가의 바람직한 FGF21 유도체는 실험 단원에서 개시된다.
화합물 35 내지 화합물 41로 표시된 발명의 추가의 바람직한 FGF21 유도체는 실험 단원에서 개시된다.
화합물 43 내지 화합물 56으로 표시된 발명의 추가의 바람직한 FGF21 유도체는 실험 단원에서 개시된다.
추가의 측면으로, 발명은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는 FGF21 유사체에 관련된다. 유사체는 바람직하게 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에 대해 높은 정도의 동일성을 가진다. 동일성 정도는 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 아미노산 치환 또는 변형의 수에 의해 기술될 수 있다.
추가의 측면으로, 발명은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하고, 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 최대 30개의 아미노산 변형을 포함하는 FGF21 유사체와 관련된다.
제3 측면으로, 발명은 발명의 FGF21 유도체 및 유사체의 제약학적 용도, 예를 들면 당뇨병 및 관련 질환의 모든 형태, 예컨대 섭식 장애, 심혈관 질환, 당뇨 합병증의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한; 및/또는 지질 변수를 개선하기 위한, β-세포 기능을 개선하기 위한; 및/또는 당뇨병 질환 진행을 지연시키거나 방지하기 위한; 및/또는 간 지방증 및 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 치료 및/또는 예방을 위한 용도에 관련된다.
발명의 FGF21 유도체는 생물학적으로 활성이다. 예를 들어, 그것들은 매우 효능이 있고, 또한 또는 다르게는, 그것들은 FGF 수용체에 매우 잘 결합한다. 또한, 또는 다르게는, 그것들은 장기적인 약물동역학적 프로파일을 가진다. 예를 들어 그것들은 마우스 및/또는 미니피그에게 i.v. 투여될 때 매우 긴 말단 반감기를 가진다. 양호한 효능 및 긴 반감기의 특정 조합은 매우 바람직할 수 있다.
성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 및 181에 상응하는 위치에서 측쇄를 포함하는 FGF21 유도체는 모두 효능을 보유한다는 것을 흥미롭다.
또한, 또는 다르게는, 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 및 181 중 하나, 특히 위치 180에 상응하는 위치에서 측쇄를 포함하는 FGF21 유도체가 높은 효능을 나타낸다.
이하에서, 그리스 문자는 그것들의 기호 또는 상응하는 서명, 예를 들면 α=알파; β=베타; ε=엡실론; γ=감마; ω=오메가 등에 의해 표시될 수 있다. 또한, 그리스 문자 μ는 "u"에 의해, 예컨대 νl=ul로, 또는 νM=uM으로 표시될 수 있다.
화학식에서 별표 (*)는 부착점을 나타낸다.
발명은 제1 측면으로 FGF21 단백질의 유도체에 관련되는데, 상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하고, 상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하며; 프로트랙터는 다음:
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HOOC-벤젠-O-(CH2)x-CO-*
Chem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*의 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 8 내지 18의 범위의 정수이고;
링커는 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함하는데;
Chem. 2는
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-* 및
*-NH-(CH2)m-사이클로헥산-CO-*로부터 선택되며, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
Chem. 3은 *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*이며, 여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이고, n은 1 내지 5의 범위의 정수이며,
Chem. 4는
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* 및
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*로부터 선택되고, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이다.
추가의 구체예에서, Chem. 2는:
*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
*-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로부터 선택된다.
추가의 구체예에서, Chem. 2는 *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*이다.
추가의 구체예에서, Chem. 2는 *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*이다.
추가의 구체예에서, Chem. 2는 *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*이다.
상기에서 언급된 것과 같이 유도체는 아미드 결합을 통해 상호연결된 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함한다. 나아가 링커 엘레먼트는 표시된 서열에서 연결된다. Chem. 2는 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-*에 연결되고, Chem.4는 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1), 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결된다.
추가의 측면으로, 발명은 FGF21 단백질의 유도체에 관련되는데, 상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기와, 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 최대 30개의 아미노산 변형을 포함하며; 상기 유도체는 상기 Cys 잔기에 링커를 통하여 부착된 프로트랙터를 포함하고; 프로트랙터는 Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*이며, 여기서 x는 10 내지 18의 범위의 정수이고; 링커는 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함하며:
Chem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-* 및
Chem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이고, n은 1 내지 5의 범위의 정수이며, m은 1 내지 5의 범위의 정수이다. Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되며 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 티올기에 연결된다.
FGF21 단백질 및 유사체
사실상 천연 FGF21 단백질은 분비를 위해 28개의 아미노산의 신호 펩티드를 사용하여 합성된다. 남아있는 181개의 아미노산으로 구성되는 성숙한 FGF21 폴리펩티드는 서열 목록에 SEQ ID NO:1로서 포함된다.
발명의 유도체의 FGF21 단백질은 종종 유도체의 "골격" 또는 "골격 단백질"로서 또는 "FGF21 유사체"로서 언급될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "FGF21 단백질"은 인간 FGF21 (FGF21(1-181))의 유사체 또는 변이체를 나타내고, 그것의 서열은 SEQ ID NO:1로서 서열 목록에 포함된다. SEQ ID NO:1의 서열을 가지는 단백질은 또한 "천연" FGF21", "성숙한" FGF21 및/또는 "성숙한 인간" FGF21로서 표시될 수 있다.
서열 목록에서, SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21의 제1 아미노산 잔기 (히스티딘)는 번호 1이 부여된다.
FGF21 유사체의 실례는 N-말단 메티오닌을 가지는 SEQ ID NO:1의 단백질이고, MetFGF21 (SEQ ID NO:2)로도 표시된다. N-말단 Met는 성숙한 인간 FGF21이 대장균에서 발현될 때 첨가된다, 예컨대 WO 2006/050247, 표 6 참조. 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 1에서 히스티딘에 선행하는 추가의 N-말단 아미노산 잔기는 위치 번호 -1이 부여된다. SEQ ID NO:2의 MetFGF21에 대한 적합한 명명법의 비-제한적 실례는 MetFGF21, [Met]FGF21 또는 [-1M]FGF21이다.
MetFGF21은 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21에 대한 비교할만한 생물학적 활성을 보이고, 실제적인 이유로 자주 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21 대신 참조 화합물로서 사용된다. MetFGF21의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로서 서열 목록에 포함된다.
본원에서, 발명의 FGF21 단백질은 i) 변화되는 아미노산 잔기에 상응하는 성숙한 인간 FGF21(1-181)의 아미노산 잔기의 번호 (즉 성숙한 인간 FGF21의 상응하는 위치) 및 ii) 실제 변화를 참조로 기술될 수 있다.
발명의 한 측면은 야생형 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 치환된 아미노산 치환을 포함하는 FGF21 단백질 (FGF21 유사체)에 관련된다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 및 175 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175 및 180 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다.
한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 169, 170, 173, 174, 175, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174, 175 및 180 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174, 175, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174, 175 및 180 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174 및 175 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174 및 180 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173 및 174 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함한다.
예를 들어, 발명의 FGF21 단백질은 FGF21(1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 189에 상응하는 위치에서 또는 FGF21(1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 181에 상응하는 위치에 Cys 잔기를 포함한다. 한 구체예에서 FGF21 단백질은 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 180에 상응하는 위치에 Cys 잔기를 포함한다.
발명의 FGF21 단백질의 이들 Cys 잔기는 각각 Cys180 및 Cys181로 표시될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 181에 상응하는 위치에 Cys 잔기를 가지는 발명의 FGF21 단백질은 Cys181 FGF21로서 및/또는 181C FGF21로서, 다르게는 [Cys181]FGF21로서 및/또는 [181C]FGF21로서 언급될 수 있다.
다음은 적합한 유사체 명명법의 비-제한적인 실례이다.
Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21은 성숙한 인간 FGF21의 유사체를 나타내는데, 여기서 알라닌은 N-말단에 첨가되었고 (즉 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 -1에 상응하는 위치에 Ala이 있음), 위치 121에서 자연적으로 발생하는 아스파라긴은 글루타민으로 치환되었으며, 위치 168에서 자연적으로 발생하는 메티오닌은 류신으로 치환되었고, 위치 180에서 자연적으로 발생하는 알라닌은 시스테인으로 치환되었다.
다음은 FGF21 유사체의 유도체에 적합한 명명법의 비-제한적인 실례이다. S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 유사체의 유도체를 나타내는데, 여기서 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]은 성숙한 FGF21의 상응하는 위치를 언급하는 번호를 가진 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교한 아미노산 변화를 나타내고, 치환체 [2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에틸]-은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에서 위치 180에 상응하는 위치에서 시스테인의 황 원자에 공유적으로 부착된다.
발명의 FGF21 단백질은 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 추가의 아미노산 변화를 가질 수 있지만, 최대 30개의 아미노산 변화로 한정된다. 이들 변화는 또한 성숙한 인간 FGF21(1-181) (SEQ ID NO:1)과도 비교되는데, 그것들은 독립적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 연장 및/또는 결실을 나타낼 수 있다.
특정 구체예에서 아미노산 변화는 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 -1, 121 및 168 중 하나 이상의 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 일어난다.
한 구체예에서 발명의 FGF21 단백질은 시스테인 아미노산 치환에 더불어 -1Ala, 121Gln 및 168Leu를 포함한다.
한 구체예에서 발명의 FGF21 단백질은 167Cys, 170Cys, 171Cys, 172Cys, 173Cys, 174Cys, 175Cys, 180Cys 및 181Cys 중 어느 하나에 더불어 -1Ala, 121Gln 및 168Leu를 포함한다. 또한 실시예 단원에서 개시된 발명의 특정 유도체에 포함된 발명의 특정 FGF21 단백질은 서열 목록의 SEQ ID NO:8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20이다.
다른 특정 구체예에서 발명의 FGF21 단백질은 180Cys 또는 181Cys 중 어느 하나에 더불어 -1Ala, 121Gln 및 168Leu를 포함한다.
또한 실시예 단원에서 개시된 발명의 특정 유도체에 포함된 발명의 특정 FGF21 단백질은 서열 목록의 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:10이다.
특정한 명시된 변화를 "포함하는" 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교할 때, 추가의 변화를 포함할 수 있다.
상기 실례들로부터 명백한 바, 아미노산 잔기는 그것들의 전체 명칭, 그것들의 한-문자 코드 및/또는 그것들의 3-문자 코드에 의해 확인될 수 있다. 이들 세 가지 방법은 완전히 동등하다.
표현 "~과 동등한 위치" 또는 "상응하는 위치"는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)을 참조하여 변이체 FGF21 서열에서 변화의 부위를 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 변화의 수뿐만 아니라 동등한 또는 상응하는 위치는, 예컨대 간단한 수기 (handwriting) 및 눈대중; 및/또는 사용될 수 있는 표준 단백질 또는 펩티드 일렬배열, 예컨대 Needleman-W운sch 알고리즘을 기반으로 하는 "얼라인 (align)"에 의해 쉽게 추론된다. 이 알고리즘은 Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453에 기술되어 있고, 얼라인 프로그램은 Myers and W. Miller in "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17에서 기술된다. 일렬배열을 위해, 디폴트 스코어링 매트릭스 BLOSUM62 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용될 수 있고, 갭에서 제1 잔기에 대한 페널티는 -12에서, 또는 바람직하게는 -10에서 설정될 수 있으며, 갭에서 추가의 잔기들에 대한 페널티는 -2에서, 또는 바람직하게는 -0.5에서 설정될 수 있다.
그런 일렬배열의 한 실례가 아래에 삽입되는데, 여기서 서열 번호 1은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)이고, 서열 번호 2는 유사체 Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21 (SEQ ID NO:10)이다. 그러므로 계산된 동일성은 97.8%이다.
# 1: FGF21
# 2: Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21
# 매트릭스: EBLOSUM62
# 갭_페널티: 10.0
# 연장된_페널티: 0.5
# 길이: 182
# 동일성: 178/182 (97.8%)
# 유사성: 179/182 (98.4%)
# 갭: 1/182 ( 0.5%)
# 스코어: 952.0
Figure 112017061495692-pct00001
추가의 구체예에서, FGF21 단백질 또는 FGF 유도체의 유사체 또는 FGF21 골격은 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 적어도 80%의 동일성, 예컨대 적어도 85%의 동일성, 예컨대 90%의 동일성, 예컨대 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에 대해 적어도 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 %의 동일성을 가진다.
용어 "단백질"은 아미드 (또는 펩티드) 결합에 의해 상호연결된 일련의 아미노산을 포함하는 화합물을 나타낸다.
발명의 단백질은 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 151개의 구성 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서 단백질은 적어도 160, 바람직하게는 적어도 170, 더 바람직하게는 적어도 180, 보다 더 바람직하게는 적어도 181, 또는 가장 바람직하게는 적어도 182개를 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 단백질은 181 또는 182개의 아미노산 a) 을 포함하거나 또는 b) 으로 구성된다.
또 추가의 특정 구체예에서, 단백질은 펩티드 결합에 의해 상호연결된 아미노산들로 구성된다.
아미노산은 아민기 및 카르복실산기를 포함하고, 선택적으로 자주 측쇄로서 언급되는 하나 이상의 추가의 기를 포함하는 화합물로서 정의될 수 있다. 아민기는 예컨대 일차 또는 이차 아미노기일 수 있다.
아미노산 잔기는 펩티드 또는 단백질로 통합되는 아미노산의 라디칼이다.
특정 구체예에서 발명의 단백질의 아미노산은 일차 또는 이차 아미노기의 질소 원자가 알파-탄소 원자에 결합되어 있는 알파-아미노산이다.
다른 특정 구체예에서 발명의 단백질의 아미노산은 코딩된 아미노산 및 비-코딩된 아미노산으로부터 선택된다.
한 구체예에서 발명의 단백질의 모든 아미노산은 코딩된 아미노산이다.
코딩된 아미노산은 IUPAC (INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY; see http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/)에 의한 권장사항의 단원 3AA-1의 표 1에서 정의된 것과 같을 수 있는데, 그 표에는 20개의 코딩된 아미노산에 대한 구조, 실용 명칭, 합성 명칭, 1- 및 3-문자 기호가 제시되어 있다.
용어 "비-코딩된 아미노산"은 모든 다른 아미노산을 나타낸다. 비-코딩된 아미노산의 비-제한적인 실례는 D-알라닌 및 D-류신과 같은 코딩된 아미노산의 D-이성질체이다.
이하에, 그것들에 대한 광학 이성질체가 서술되지 않은 모든 특이적 아미노산은 L-이성질체 (다르게 명시되지 않는 한)를 의미하는 것으로 인지되어야 하는데, 예컨대 글루타민의 특정 아미노산을 언급할 때, 이것은 다른 것이 서술되지 않는 한 L-글루타민을 언급하는 것으로 의도된다. 다른 한편으로, 아미노산이 브루토 (brutto) 식 또는 구조식과 같은 보다 일반적인 식에 의해 기술되는 경우 및 입체 화학이 제시되지 않을 때, 이들 식은 모든 입체 이성질체를 포함하는 것으로 의도된다.
기술분야의 일반적인 실시에 따라, 발명의 FGF21 단백질의 N-말단은 좌측에 제시되고 우측에는 C-말단이 제시된다.
FGF21 유도체
FGF21 단백질 또는 유사체의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 화학적으로 변형된 FGF21 단백질 또는 유사체를 의미하고, 이때 잘-규정된 수의 치환체는 단백질의 하나 이상의 특정 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되어 있다. 치환체(들)은 측쇄(들)로서도 언급될 수 있다.
특정 구체예에서, 측쇄는 알부민과의 비-공유 회합을 형성할 수 있고, 그로써 혈류와 함께 유도체의 순환을 촉진하며, 또한 유도체의 작용시, FGF21 유도체와 알부민의 회합이 단지 서서히 분해되어 활성 제약학적 성분을 방출한다는 사실로 인해 지속적인 효과를 나타낸다.
측쇄는 본원에서 프로트랙터로서 언급되는 부분을 포함한다.
프로트랙터는 단백질에 대한 부착점과 관련하여, 측쇄의 원위 단부 (distant end)에, 또는 가까이에 있을 수 있다.
또 추가의 특정 구체예에서, 측쇄는 프로트랙터와 단백질에 대한 부착점 사이에서 링커로 언급될 수 있는 부분을 포함한다. 링커는 하나 이상의 링커 엘레먼트들로 구성될 수 있다.
특정 구체예에서, 측쇄 및/또는 프로트랙터는 친유성이거나 및/또는 생리적 pH (7.4)에서 음전하를 가진다.
측쇄는 알킬화에 의해 FGF21 단백질의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 측쇄는 할로아세트아미드기로서 합성되고 할로아세트아미드기로 활성화되며, 티오-에테르 결합으로서도 언급되는 공유 티올-탄소 결합 (이 과정은 Cys-알킬화로서도 언급됨)의 형성 하에서 시스테인 잔기의 티올기와 반응한다. 그로써 티올기는 유도체에 존재하지 않으며, 측쇄는 황 원자를 통해 연결된다. 티올기가 유도체와 관련하여 언급되는 경우에 그것은 Cys-알킬화 전에 시스테인의 티올기의 부분인 황 원자로서 인지되어야 한다.
다른 구체예에서, 측쇄는 말레이미드기로 활성화되고, 공유 티올-탄소 결합의 형성 하에서, 시스테인 잔기의 티올기와 반응한다.
본 목적에 대해, 용어 프로트랙터 및 링커는 이들 분자의 반응된 형태뿐 아니라 미반응 형태도 포함할 수 있다. 의미하는 것이 한 가지 형태이거나 다른 형태이거나 하는 것은 그 용어가 사용되는 맥락으로부터 명백하다.
한 측면으로, 각각의 프로트랙터는 식 Chem. 1의 프로트랙터를 포함하거나, 그것으로 구성된다:
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,
상기 식에서 x는 10 내지 18의 범위의 정수이다.
대체 구체예에서, 프로트랙터 Chem. 1은 Chem. 1A, Chem. 1B 및 Chem. 1C에 의해 정의된 프로트랙터 군으로부터 선택된다:
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-* (식에서 x는 8 내지 18의 범위의 정수임),
Chem. 1B: HOOC-벤젠-O-(CH2)x-CO-* (식에서 x는 8 내지 18의 범위의 정수임) 및
Chem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-* (식에서 x는 8 내지 18의 범위의 정수임).
x에 의해 정의된 탄소 사슬의 길이는 상이한 Chem. 1 구조의 각각에 대해 8 내지 18로 달라질 수 있는 한편, 아래에서 기술되는 것과 같이 더 짧거나 더 긴 버전이 상이한 유형의 프로트랙터 엘레먼트들에 대해 선호될 수 있다.
1A의 특정 구체예에서, *-(CH2)x-*는 x가 10 내지 18, 예컨대 14 내지 18 또는 14 내지 16의 범위의 정수인 직쇄 알킬렌을 나타낸다.
1A의 다른 특정 구체예에서, *-(CH2)x-*는 x가 16인 직쇄 알킬렌을 나타낸다. 이 프로트랙터는 간단하게 C18 2산, 즉 18개의 탄소 원자를 가지는 지방 다이-카르복실산으로서 언급될 수 있다. x=16일 때 이 링커 엘레먼트의 구조는 Chem. 1a에 상응한다:
Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*.
한 구체예에서 프로트랙터는 Chem. 1B이다. 1B의 구체예에서 *-(CH2)x-*는 x가 8 내지 14의 범위의 정수인 직쇄 알킬렌을 나타낸다. 특정 구체예에서 x=9일때 이 링커 엘레먼트의 구조는 Chem. 1b에 상응한다:
Chem. 1b: HOOC-벤젠-O-(CH2)9-CO*.
한 구체예에서 프로트랙터는 Chem. 1C이다. 1C의 구체예에서, *-(CH2)x-*는 x가 10 내지 18, 예컨대 12 내지 18 또는 14 내지 18의 범위의 정수인 직쇄 알킬렌을 나타낸다. 1C의 특정 구체예에서, x=15일때 이 링커 엘레먼트의 구조는 Chem. 1c에 상응한다:
Chem. 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*.
명명법은 기술분야에서 통상적인 것과 같다, 예를 들면 상기 식에서 *-CO-*는 카르보닐 (*-C(=O)-*)을 나타낸다. 예를 들어, 본원의 임의의 식 (R-CO-*)에서 (R은 각 식에 의해 정의된 것과 같음), R-CO-*는 R-C(=O)-*를 나타낸다. 벤젠은 Chem. 1B에서 C1 및 C4에서 각각 O-(CH2)x-* 및 -COOH에 의해 치환된 고리 구조를 나타낸다. HO-S(=O)2는 설폰산을 나타낸다.
발명의 유도체의 링커는 다음의 링커 엘레먼트 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함한다. 엘레먼트 Chem. 2 및 Chem. 3은 둘 다 그것들이 아미드 결합에 의해 서로에 및 프로트랙터의 -CO- 또는 -NH- 중 어느 하나 또는 Chem. 4에 결합하는 것을 허용하는 -NH- 및 CO- 단부를 가지고 있다.
Chem. 4는 Chem. 2 또는 Chem. 3과 아미드 결합을 형성할 수 있는 -NH- 단부 및 -NH-CO-CH2- 단부를 가지며, 미반응 형태에서는 FGF21 유사체의 시스테인의 티올기와 반응할 수 있는 할로아세트아미드이다.
발명의 유도체의 링커는 다음의 링커 엘레먼트 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4 중 적어도 하나를 포함하며,
여기서 Chem. 2 는
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*,
*-NH-(CH2)m-사이클로헥산-CO-*로부터 선택되고,
여기서 m은 개별적으로 1 내지 5의 범위의 정수로서 선택되며,
Chem. 3은 이고, 여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이며, n은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
Chem. 4는
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* 및
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*로부터 선택되며, 여기서 m은 개별적으로 1 내지 5의 범위의 정수로서 선택된다.
한 구체예에서 Chem. 2는 *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*이고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이다. 한 구체예에서 m은 2 또는 3이다.
구체예에서 m은 2이고, 링커 엘레먼트 Chem. 2는 *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*인 Chem. 2a로서 언급될 수 있다. 링커 엘레먼트 *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*는 간단하게 gGlu, 감마 Glu 또는 γ-Glu로서 언급될 수 있다. gGlu에서 다른 링커 엘레먼트에 연결되기 위해 사용되는 것은 바로 아미노산 글루탐산의 감마 카르복시기이다. 한 특정 구체예에서 (각각의) gGlu 링커 엘레먼트는 L-형태로 존재한다.
한 구체예에서 Chem. 2는 *-NH-S(=O)2-(CH2)m -CO-*이고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이다. 한 구체예에서 m은 2 또는 3이다. 링커 엘레먼트 *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*는, 카르복시기가 다른 링커 엘레먼트에 연결되기 위해 사용되는 설폰산 유도체이다. 한 구체예에서 m은 3이고 링커 엘레먼트 Chem. 2는 Chem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*로서 언급될 수 있다.
한 구체예에서 Chem. 2는 *-NH-(CH2)m-사이클로헥산-CO-*이고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이다. 한 구체예에서 m은 2 또는 3이다. Chem. 2 구조에서, 사이클로헥산 고리는 그로써 C1 및 C4에서 각각 NH-CH2 및 CO로 치환된다.
한 구체예에서 m은 1이고 링커 엘레먼트 Chem2는 Chem. 2c: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로서 언급될 수 있다. 이 링커 엘레먼트는 추가로 Trx로도 언급될 수 있다.
Chem. 3의 링커 엘레먼트에서, "k" 및 "n"은 둘 다 1과 5 사이에서 달라질 수 있다. k=n=1일 때 이 링커 엘레먼트의 구조는 Chem. 3a에 상응한다.
한 구체예에서 Chem. 3은 Chem. 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*이다. Chem. 3a의 링커 엘레먼트는 간단하게 Ado (8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산)으로서 언급되는데, 그것의 2-라디칼이기 때문이다.
Chem. 4의 링커 엘레먼트에서, "m"은 1과 5 사이에서 달라질 수 있다. 한 구체예에서 Chem. 4는 *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*이고, 여기서 m은 1, 2, 3 또는 4이다. 한 구체예에서 m은 2 또는 3이다.
Chem. 4는 *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*이고 m=2인 한 구체예에서, 이 링커 엘레먼트의 구조는 Chem. 4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*에 상응한다.
한 구체예에서 Chem. 4는 *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*이고, 여기서 m은 1, 2, 3 또는 4이다. 한 구체예에서 m은 2 또는 3이다. 한 구체예에서 m은 4 또는 5이다.
Chem. 4가 *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*이고 m=4일 때 이 링커 엘레먼트의 구조는 Chem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*에 상응한다.
발명의 유도체의 링커는 하나 이상의 이들 3가지 상이한 유형의 링커 엘레먼트를 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 각각의 개별적인 링커 엘레먼트를 포함할 수 있다. 한 구체예에서 링커는 단지 하나의 Chem. 4 엘레먼트만을 포함한다. 한 구체예에서 링커는 Chem2 및 Chem. 3의 각각의 하나 이상 및 단지 하나의 Chem. 4 엘레먼트를 포함한다.
비-제한적인 실례로서, 링커는 아미드 결합을 통해 상호연결된 하나의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3a 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4 엘레먼트로 구성될 수 있고, 표시된 순서로 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CO-* 단부에서 FGF21 단백질의 위치 180 또는 181 중 어느 하나의 Cys 잔기의 황 원자에 연결된다. 그러므로 Chem. 4 엘레먼트들은 Chem.2/Chem.3 엘레먼트의 -CO-*를 FGF21 시스테인 유사체의 황 원자에 연결시킨다.
추가의 실례에서, 링커는 아미드 결합을 통해 상호연결되고 표시된 순서로 2개의 Chem. 2 엘레먼트, 예컨대 2개의 Chem. 2a 엘레먼트, 2개의 Chem. 3a 엘레먼트 및 한 개의 Chem. 4 엘레먼트로 구성될 수 있다. Chem. 2 엘레먼트는 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, Chem4는 그것의 에서 FGF21 단백질의 Cys 잔기의 황 원자에 연결된다.
한 구체예에서 링커는 FGF21 단백질의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 173, 174, 175, 180 또는 181에서 Cys의 티올기에 연결된다. 추가의 구체예에서 링커는 위치 180 또는 181에서 Cys의 황 원자에 연결된다.
말할 필요 없이, 바로 질서정연함을 위해: 구절 "표시된 순서로"는 먼저 언급된 링커 엘레먼트 (여기서는 Chem. 2)의 *-NH 단부가 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 마지막으로 언급된 링커 엘레먼트 (여기서 Chem. 4)의 CO-* 단부가 FGF21 단백질의 의문의 Cys 잔기의 티올기에 연결되는 것을 의미한다.
한 구체예에서 발명의 유도체는
a. 화합물 13 내지 24
b. 화합물 35 내지 41 및/또는
c. 화합물 43 내지 56으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가의 구체예에서 유도체는 화합물 13 내지 24로부터 선택된다.
한 구체예에서 유도체는 화합물 13 내지 18로부터 선택된다. 한 구체예에서 유도체는 화합물 20 내지 24로부터 선택된다.
한 구체예에서 유도체는 화합물 35 내지 41로부터 선택된다.
한 구체예에서 유도체는 화합물 43 내지 44 및 46 내지 54로부터 선택된다. 한 구체예에서 유도체는 화합물 44, 47 및 50 내지 54로부터 선택된다.
Chem. 4 대신, p와 q가 1과 5 사이에서 달라질 수 있는 말레이미드 유도된 링커 엘레먼트가 사용될 수 있다:
Figure 112017061495692-pct00002
.
p=q=2일 때 이 링커 엘레먼트의 구조는 N-(2-아미노에틸)-3-(-2,5-다이옥소-피롤리딘-1-일)프로판아미드에 상응한다:
Figure 112017061495692-pct00003
.
발명의 유도체는 동일한 분자식 및 결합된 원자의 순서를 갖지만, 단지 그것들의 원자의 공간에서 삼차원 배향이 다른 상이한 입체-이성질체 형태로 존재할 수 있다. 발명의 예시된 유도체의 입체이성질체는 구조뿐 아니라 명칭에서 표준 명명법을 사용하여 실시예 단원에서 표시된다. 다르게 표시되지 않는 한, 발명은 청구된 유도체의 모든 입체이성질체 형태에 관련된다.
기능성 특성
발명의 FGF21 유도체는 생물학적으로 활성이다. 예를 들어 그것들은 매우 효능적이고, 또한 또는 다르게는, 그것들은 FGF 수용체에 매우 잘 결합한다. 또한, 또는 다르게는, 그것들은 오래 지속되는 약물동역학적 프로파일을 가진다. 예를 들어 그것들은 마우스 및/또는 미니 피그에 i.v. 투여될 때 매우 긴 말단 반감기를 가진다. 양호한 효능 및 긴 반감기의 특정 조합이 매우 바람직할 수 있다.
또한, 또는 다르게는, 성숙한 인간 FGF21의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 173, 174, 175, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 발명의 측쇄를 포함하는 FGF21 유도체가 고도의 효능을 가지는 것은 놀랍다.
제1 측면에 따르면, FGF21 유도체는 FGF21 활성을 가진다. 예를 들어, 발명의 FGF21 유도체는 인간 FGF 수용체를 향한 놀라울 정도로 양호한 효능을 가진다.
제1 특정 구체예에서, 효능 및/또는 활성은 시험관 내 효능, 즉 기능성 FGF 수용체 분석에서의 성능, 보다 구체적으로는 인간 FGF 수용체를 활성화시키는 능력을 나타낸다.
시험관 내 효능은, 예컨대 인간 FGF 수용체 (FGFR1c, FGFR2c 또는 FGFR3c) 및 BK을 발현하는 전체 세포를 사용하는 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 인간 FGF 수용체의 반응은 인간 베타-클로토 (BKL)를 과잉발현하는 HEK (인간 배아 신장 세포)를 사용하여 측정될 수 있다. HEK293 세포는 FGFR1c 및 FGFR3c를 포함하여 여러 FGF 수용체들을 내생적으로 발현한다. 이들 세포는 공-수용체 BKL로 트랜스펙션될 때까지 FGF21에 대해 반응하지 않는다. FGF 수용체/BKL 복합체의 활성화는 MAPK/ERK 신호화 경로의 활성화 및 ERK의 인산화를 유도한다. 주어진 시점에서 인산화된 ERK (pERK)의 수준은 FGF21의 농도가 증가함에 따라 증가한다. 그런 분석의 한 가지 비-제한적 실례는 실시예 6에서 기술된다.
시험관 내 효능은 또한 마우스 3T3-L1 지방세포를 사용한 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, FGF21 유사체 및 유도체는 지방세포 안으로 글루코오스 흡수를 증가시키는 능력에 대헤 시험될 수 있다. 분화된 3T3-L1 지방세포는 FGFR1c 및 BKL을 내생적으로 발현한다. 3T3-L1 세포는 분화가 공-수용체 BKL의 발현을 유도하기 때문에 분화된 후까지는 FGF21에 대해 반응하지 않는다. FGFR1c 수용체/BKL 복합체의 활성화는 글루코오스 트랜스포터 1 (GLUT1)의 발현을 증가시키고 그러므로 FGF21 유사체는 지방세포 안으로 흡수되는 글루코오스의 양의 증가를 용량 반응 방식으로 유도할 것이다.
EC50 값은 통상적으로 약물의 효능의 척도로서 사용된다. 그것은 용량-반응 곡선을 참조로, 기준선과 최대치 사이의 중간 반응을 유도하는 의문의 화합물의 농도를 나타낸다. 일반적으로 말하자면, EC50은 최대 효과의 50%가 관찰되는 농도를 나타낸다. 발명의 유도체의 시험관 내 효능은 상기 기술된 대로 측정될 수 있고, 의문의 유도체의 EC50도 측정될 수 있다. EC50 값이 낮을수록 효능은 더 좋다.
비-제한적 실례로서, 발명의 FGF21 유도체는 60 nM 아래, 바람직하게는 20 nM 아래, 더 바람직하게는 10 nM 아래 (예컨대 실시예 6에서 기술되는 대로 측정됨)의 0% HSA에서의 EC50에 상응하는 인간 베타-클로토를 과잉발현하는 HEK293 세포를 사용하여 측정된 효능을 가진다.
비-제한적 실례로서, 발명의 FGF21 유도체는 60 nM 아래, 바람직하게는 20 nM 아래, 더 바람직하게는 10 nM 아래 (예컨대 실시예 7에서 기술되는 대로 측정됨)의 EC50에 상응하는 3T3-L1 지방세포에서의 글루코오스 흡수를 사용하여 측정된 효능을 가진다.
비-제한적 실례로서, 발명의 FGF21 유도체는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90% (예컨대 실시예 7에서 기술되는 대로 측정됨)의 3T3-L1 지방세포에서의 글루코오스 흡수를 사용하여 측정된 효능 Emax를 가진다.
비-제한적 실례로서, 발명의 FGF21 유도체는 60 nM 아래, 바람직하게는 20 nM 아래, 더 바람직하게는 10 nM 아래 (예컨대 실시예 7에서 기술되는 대로 측정됨)의 EC50에 상응하는 3T3-L1 지방세포에서의 글루코오스 흡수를 사용하여 측정된 효능 및 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90% (예컨대 실시예 7에서 기술되는 대로 측정됨)의 3T3-L1 지방세포에서의 글루코오스 흡수를 사용하여 측정된 효능 Emax를 가진다.
제2 특정 구체예에서, 효능 및/또는 활성은 생체 내 효능을 나타낸다. 발명의 단백질 및 유도체는 생체 내에서 효능이 있고, 그것은 기술분야에서 알려져 있는 것과 같이 임의의 적합한 동물 모델에서뿐 아니라 임상 실험에서 측정될 수 있다.
앞서 린 (lean) 마우스에서 FGF21에 의해 유도된 중량 손실로 비만 마우스에서의 효과를 예측할 수 있고 그러므로 양호한 스크리닝 모델인 것으로 밝혀졌다. 린 C57BL 마우스는 적합한 동물 모델의 한 실례이고, 체중 감량 효과는 그런 마우스에서 생체 내에서 측정되었다 (예컨대 실시예 9에서 기술된 대로 측정됨).
제2 측면에 따르면, 발명의 유도체는 오래 지속된다.
지속성 (protraction)은 시험관 내에서 평가될 수 있고 및/또는 생체 내 연구에서 약물동역학으로부터 측정될 수 있다. 혈청 알부민의 존재하에 시험관 내 효능, EC50 값의 증가는 혈청 알부민에 대한 친화성을 가리키고 시험 물질의 동물 모델에서의 오래 지속되는 약물동역학적 프로파일을 예측하는 방법을 나타낸다. 지속성은 예컨대 마우스 또는 미니 피그에 정맥 내 투여 후 말단 반감기 (t½)로서 측정될 수 있다.
비-제한적 실례로서, 발명의 유도체는 마우스에 정맥 내 투여 후, 적어도 1시간, 더 바람직하게는 적어도 3시간, 가장 바람직하게는 적어도 10시간 (예컨대 실시예 8에 기술된 대로 측정됨)의 말단 반감기를 가진다.
다른 비-제한적 실례로서, 발명의 유도체는 미니 피그에 정맥 내 투여 후, 적어도 2시간, 더 바람직하게는 적어도 10시간, 보다 더 바람직하게는 적어도 20시간 또는 가장 바람직하게는 적어도 50시간 (예컨대 실시예 8에 기술된 대로 측정됨)의 말단 반감기를 가진다.
제3 측면에 따르면, 발명의 유도체는 오래 지속되고 동시에 매우 양호한 효능을 가진다. 양호한 효능/결합 및 장기간 반감기의 특정 조합이 고도로 바람직할 수 있다.
제4 측면에 따르면, 발명의 유도체는 양호한 생물물리학적 특성을 가진다. 이들 특성은 제한하는 것은 아니지만, 물리적 안정성 및/또는 용해도를 포함한다. 이들 및 다른 생물물리학적 특성은 단백질 화학의 기술분야에 공지되어 있는 표준 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 이들 특성은 성숙한 인간 FGF21과 비교하여 개선된다.
발명의 유도체의 추가의 특정 구체예들은 실시예 단원 전에 "특정 구체예들"이란 제목의 단원에서 기술된다.
FGF21 화합물의 제조 및 정제
단백질, 예컨대 FGF21의 제조는 기술분야에 잘 알려져 있다. FGF21 유사체는 분자를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고 FGF21 유사체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 적합한 영양 배지에서 FGF21 유사체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 여러 재조합 방법이 FGF21 및 그것의 유사체들의 제조에 사용될 수 있다. 미생물, 예컨대 대장균 및 맥주효모균에서 FGF21의 제조에 사용될 수 있는 방법의 실례는, 예컨대 WO12010553에서 개시된다.
발명의 많은 유도체를 제조하는 방법의 구체적인 실례는 실시예 부분에 포함된다. 간단히 설명하면, FGF21 유사체는 알킬화에 의해 시스테인 잔기에서 유도체화된다. 그러므로 티올 반응성 측쇄, 예컨대 할로아세트아미드로 제조된 측쇄가 FGF21 유사체와 반응할 수 있다. FGF 유사체는 시스테인의 티올기를 보호하는 시스타민으로 제조될 수 있다. 만약 그렇다면 유사체는 티올 반응성 측쇄를 가지는 유사체를 반응시키기 전에 예컨대 포스핀과 같은 환원제로 환원된다.
본 발명의 FGF21 유사체 및 유도체는 한정하는 것은 아니지만, 크로마토그래피 (예컨대 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 축출), 전기영동적 과정 (예컨대 제조용 등전점 포커싱 (IEF)), 차등 용해도 (예컨대 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출 (예컨대 Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함한 다양한 과정에 의해 정제될 수 있다.
투여 방식
용어 "치료"는 다르게 표시되거나 맥락에 의해 명백하게 반대되지 않는 한 참조된 질환, 장애 또는 상태의 예방 및 최소화 둘 다를 포함하는 것을 의미한다 (즉 "치료"는 발명의 FGF21 유도체 또는 발명의 FGF21 유도체를 포함하는 조성물의 예방적 및 치료적 투여 둘 다를 나타낸다).
투여의 경로는 본 발명의 화합물을 신체의 원하는 또는 적절한 장소로 효과적으로 전달하는 임의의 경로, 예컨대 비경구, 예를 들면 피하, 근육 내 또는 정맥 내일 수 있다. 다르게는, 본 발명의 화합물은 경구로, 폐로, 직장으로, 경피적으로, 볼로, 혀 밑으로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
제약학적 조성물
발명의 유도체 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물은 기술분야에 공지되어 있는 것과 같이 제조될 수 있다.
용어 "부형제"는 활성 치료 성분(들) 이외의 임의의 성분을 광범위하게 나타낸다. 부형제는 불활성 물질, 비활성 물질 및/또는 의학적으로 활성이 아닌 물질일 수 있다.
부형제는 다양한 목적, 예컨대 담체, 비히클, 희석제, 정제 보조제로서 및/또는 활성 물질의 투여 및/또는 흡수를 개선하기 위하여 작용할 수 있다.
제약학적 활성 성분들과 다양한 부형제와의 제형은 기술분야에 알려져 있고, 예컨대 Re분gton: The Science and Practice of Pharmacy (예컨대 19판본 (1995) 및 임의의 후판본들)를 참조한다.
본 발명의 FGF21 화합물을 포함하는 주사 가능한 조성물은 원하는 최종 제품을 얻기 위하여 적절하게 성분들을 용해하고 혼합하는 것을 포함하는 제약산업의 종래 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 그러므로, 한 과정에 따르면, 본 발명의 FGF21 화합물은 적합한 완충액에 적합한 pH에서 용해되어 침전이 최소화되거나 피해진다. 주사 가능한 조성물은 예를 들면 멸균 여과에 의해 멸균성으로 만들어진다. 항미생물제가 또한 조성물에 첨가될 수 있다.
조성물은 안정화된 제형일 수 있다. 용어 "안정화된 제형"은 증가된 물리적 및/또는 화학적 안정성, 바람직하게는 둘 다를 가지는 제형을 나타낸다. 일반적으로, 제형은 유효 기한이 도달하기까지는 사용 및 보관 중에 안정해야 한다 (권장된 사용 및 보관 조건에 적응하여).
용어 "물리적 안정성"은 공유 결합을 변경시키지 않고 따라서 열-기계적 응력에 대한 노출의 결과로서 생물학적으로 비활성 및/또는 불용성 응집체 및/또는 소섬유를 형성하거나 및/또는 계면과 표면 (예컨대 소수성 표면)을 탈안정화시키는 상호작용하려는 경향성이 없는 물리적 상태 및 그것의 변화를 나타낸다. 수성 단백질 제형의 물리적 안정성은 시각적 검사에 의해 및/또는 다양한 시간 동안 상이한 온도에서 기계적/물리적 응력 (예컨대 교반)에 대한 노출 후에 혼탁도 측정에 의해 및/또는 농도 측정에 의해 평가될 수 있다. 다르게는, 물리적 안정성은 분광학적 제제 또는 단백질의 형태적 상황의 프로브, 예컨대 티오플라빈 T 또는 "소수성 패치" 프로브를 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "화학적 안정성"은 무상 단백질과 비교하여 감소된 생물학적 효능 및/또는 증가된 면역원성 효과를 잠재적으로 가지는 화학적 분해 생성물의 형성을 유도하는 단백질 구조의 공유 결합의 화학적 (특히 공유) 변화를 나타낸다. 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 대한 노출 후 다양한 시점에서 화학적 분해 생성물의 양을, 예컨대 SEC-HPLC, RP-HPLC, LCMS 및/또는 펩티드 지도화에 의해 측정함으로써 평가될 수 있다.
한 측면으로, 발명은 물리적 안정성이 개선된 FGF21 유도체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 화학적 안정성이 개선된 FGF21 유도체를 제공한다.
조합 치료
본 발명에 따르는 FGF21 유도체를 사용한 치료는 또한, 예컨대 항-당뇨제, 항-비만제, 식욕 조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로부터 유발된 또는 당뇨병과 결합된 합병증의 치료 및/또는 예방을 위한 제제 및 비만으로부터 유발된 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 제제로부터 선택된, 하나 이상의 약물학적 활성 물질과 조합될 수 있다.
이들 약물학적 활성 물질의 실례는: GLP-1 수용체 아고니스트, 인슐린, DPP-IV (다이펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, 아밀린 아고니스트 및 렙틴 수용체 아고니스트이다.
제약학적 징후
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 발명의 유도체에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 발명의 유도체는 다음의 의학적 치료를 위해 사용될 수 있다:
(i) 모든 형태의 당뇨병, 예컨대 고혈당증, 제2 형 당뇨병, 손상된 글루코오스 내성, 제1 형 당뇨병, 비-인슐린 의존성 당뇨병, MODY (청년의 성인기 발병 당뇨병), 임신성 당뇨병의 예방 및/또는 치료 및/또는 HbA1C의 감소를 위해;
(ii) 당뇨병성 질환 진행, 예컨대 제2 형 당뇨병의 진행의 지연 또는 예방, 손상된 글루코오스 내성 (IGT)의 인슐린 요구성 제2 형 당뇨병으로의 진행의 지연, 인슐린 저항성의 지연 또는 예방 및/또는 비-인슐린 요구성 제2 형 당뇨병의 인슐린 요구성 제2 형 당뇨병으로의 진행의 지연;
(iii) β-세포 기능의 개선, 예컨대 β-세포 아폽토시스의 감소, β-세포 기능 및/또는 β-세포 질량의 증가 및/또는 β-세포에 대한 글루코오스 민감성의 복원을 위해;
(iv) 섭식 장애, 예컨대 비만을, 예컨대 음식물 섭취를 감소시키고, 에너지 소비를 증가시키고, 체중을 감량시키고, 식용을 억제시키고, 포만감을 유도함으로써 예방 및/또는 치료함; 폭식 섭식 장애, 신경성 식욕 항진 및/또는 항정신병약 또는 스테로이드의 투여에 의해 유도된 비만의 치료 또는 예방; 및/또는 비만으로의 동반이환, 예컨대 골관절염 및/또는 요실금의 예방 및/또는 치료;
(v) 당뇨병 합병증, 예컨대 신장병의 예방 및/또는 치료;
(vi) 지질 매개변수의 개선, 예컨대 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료, 총 혈청 리피드의 강하; HDL의 증가; 작고, 조밀한 LDL의 강하; VLDL의 강하; 트라이글리세리드의 강하; 콜레스테롤의 강하; 인간에서 리포단백질 a (Lp(a))의 혈장 수준의 강하; 시험관 내 및/또는 생체 내에서 아포리포단백질 a (apo(a))의 생성의 억제;
(vii) 심혈관 질환, 예컨대 증후군 X, 아테롬성 동맥경화증, 심근 경색, 관상 동맥성 심장 질환, 재관류 손상, 발작, 뇌 허혈, 조기 심장 또는 조기 심혈관 질환, 좌심실 비대, 관상 동맥 질환, 고혈압, 본태성 고혈압, 급성 고혈압성 응급, 심근증, 심장 부전, 운동 불내성, 급성 및/또는 만성 심부전, 부정맥증, 심장 부정맥, 신카피 (syncopy), 협심증, 심장 바이패스 및/또는 스텐트 재폐색, 간헐성 파행 (폐쇄성 동맥경화증), 심장확장성 기능장애 및/또는 심장수축성 기능장애; 및/또는 혈압의 감소, 예컨대 수축기 혈압의 감소;
(viii) 간 지방증 및 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 예방 및/또는 치료; 및/또는
(ix) 중대 질병의 예방 및/또는 치료, 예컨대 중대하게 아픈 환자, 중대 질병 다중-신장 병증 (CIPNP) 환자 및/또는 잠재적인 CIPNP 환자의 치료; 중대 질병 또는 CIPNP의 발달의 예방, 환자의 전신성 염증성 반응 증후군 (SIRS)의 치료 및/또는 치유; 입원 중 환자의 균혈증, 패혈증 및/또는 패혈성 쇼크로 고생할 가능성의 예방 또는 감소.
특정 구체예에서 징후는 (i) 내지 (vii)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 특정 구체예에서, 징후는 (i), (iv), (vi) 및/또는 (vii)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다음의 징후가 특히 바람직하다: 제2 형 당뇨병 및/또는 비만. 한 구체예에서 발명의 화합물은 제2 형 당뇨병의 치료를 위한 것이다. 한 구체예에서 발명의 화합물은 비만의 치료를 위한 것이다.
특정 구체예들
다음은 발명의 특정 구체예들이다:
1. FGF21 단백질의 유도체, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르로서,
상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기를 포함하며,
상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하고;
프로트랙터는 다음:
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Chem. 1B: HOOC-벤젠-O-(CH2)x-CO-*
Chem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*의 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 8 내지 18의 범위의 정수이고;
링커는 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함하는데;
Chem. 2는
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
*-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*로부터 선택되며, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
Chem. 3은 *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*이며, 여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이고, n은 1 내지 5의 범위의 정수이며,
Chem. 4는
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* 및
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*로부터 선택되고, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이며; 그리고
Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되며 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결되는 유도체.
2. 상기 단백질이 위치 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에서 Cys 잔기를 포함하는, 구체예 1에 따르는 유도체.
3. 상기 단백질이 위치 170, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에서 Cys 잔기를 포함하는, 구체예 1에 따르는 유도체.
4. Chem. 2가
Chem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
Chem. 2c: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*의 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
5. Chem. 4가
Chem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* 및
Chem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*로부터 선택되는, 구체예 1에 따르는 유도체.
6. FGF21 단백질의 유도체, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르로서, 상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기, 및 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 최대 30개의 아미노산 변형을 포함하며,
상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하고;
프로트랙터는 다음:
Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-* (여기서 x는 10 내지 18의 범위의 정수임),
Chem. 1B: HOOC-벤젠-O-(CH2)x (여기서 x는 8 내지 18의 범위의 정수임) 및
Chem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x (여기서 x는 10 내지 18의 범위의 정수임)
의 군으로부터 선택되며,
링커는 다음의 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4:
Chem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-* 및
Chem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
의 각각의 적어도 하나를 포함하고, 여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이며, n은 1 내지 5의 범위의 정수이고, m은 1 내지 5의 범위의 정수이며; 그리고
Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되며 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결되는 유도체.
7. Chem. 1이 다음:
Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
Chem. 1b: HOOC-벤젠-O-(CH2)9-CO-* 및
Chem. 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*의 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
8. FGF21 단백질의 유도체, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르로서,
상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하고, 상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하며;
프로트랙터는
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*이고, 여기서 x는 10 내지 18의 범위의 정수이며;
링커는 다음 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4:
Chem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-* 및
Chem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
의 각각의 적어도 하나를 포함하고,
여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이며, n은 1 내지 5의 범위의 정수이고, m은 1 내지 5의 범위의 정수이며;
Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되고 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결되는 유도체.
9. FGF21 단백질의 유도체, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르로서,
상기 단백질은 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기, 및 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 최대 30개의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하며;
프로트랙터는
Chem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*이고, 여기서 x는 10 내지 18의 범위의 정수이며;
링커는 다음 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4:
Chem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Chem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-* 및
Chem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
의 각각의 적어도 하나를 포함하고,
여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이며, n은 1 내지 5의 범위의 정수이고, m은 1 내지 5의 범위의 정수이며;
Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되고 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결되는 유도체.
10. 상기 단백질이 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 180에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
11. 상기 단백질이 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 최대 30, 예컨대 25, 예컨대 20, 예컨대 15, 예컨대 10, 예컨대 8, 예컨대 최대 5개의 아미노산 변형을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
12. 상기 단백질이 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 4 또는 5개의 아미노산 변형을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
13. 상기 단백질이 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 4개의 아미노산 변형을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
14. 상기 FGF 단백질이 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에 대해 적어도 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%, 예컨대 95%의 동일성을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
15. 상기 FGF 단백질이 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)에 대해 적어도 96%, 예컨대 97%, 예컨대 98%, 예컨대 99%의 동일성을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
16. 아미노산 변화는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 위치 121, 168, 180 또는 181 중 하나 이상에 상응하는 하나 이상의 위치에서 일어나는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
17. 아미노산 변화는 성숙한 인간 FGF21 (SEQ ID NO:1)의 N-말단에 상응하는 위치에서 Ala 잔기의 첨가인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
18. 단백질은 상기 단백질의 N-말단에 Ala를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
19. 단백질은 121Q를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
20. 단백질은 168L을 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
21. 단백질은 SEQ ID NO:8 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
22. 단백질은 SEQ ID NO:8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
23. Chem. 1은 1A 또는 1C이고 x는 12 내지 18의 범위의 정수인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
24. Chem. 1은 1A 또는 1C이고 x는 14 내지 16의 범위의 정수인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
25. Chem. 1은 1B이고 x는 8 내지 12의 범위의 정수인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
26. x는 16인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
27. k는 1 내지 2의 범위의 정수인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
28. k는 1인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
29. n은 1 내지 2의 범위의 정수인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
30. n은 1인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
31. Chem. 4의 m은 1 내지 5의 범위의 정수인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
32. Chem4의 m은 2인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
33. 프로트랙터는 Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
34. 프로트랙터는 Chem. 1a: HOOC-(CH2)14-CO-*로 구성되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
35. 링커는 Chem. 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
36. 링커는 Chem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
37. 링커는 적어도 하나의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4 엘레먼트로 구성되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
38. 링커는 하나의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4 엘레먼트로 구성되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
39. 링커는 2개의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4 엘레먼트로 구성되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
40. 링커는 하나의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3a 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4a 엘레먼트로 구성되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
41. 유도체가 다음 중 하나인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체:
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 13)
Figure 112017061495692-pct00004
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 14)
Figure 112017061495692-pct00005
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 15)
Figure 112017061495692-pct00006
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 16)
Figure 112017061495692-pct00007
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 17)
Figure 112017061495692-pct00008
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (화합물 18)
Figure 112017061495692-pct00009
;
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 19)
Figure 112017061495692-pct00010
;
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 20)
Figure 112017061495692-pct00011
;
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 21)
Figure 112017061495692-pct00012
;
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 22)
Figure 112017061495692-pct00013
;
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 23)
Figure 112017061495692-pct00014
;
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Met[Cys181]FGF21 (화합물 24)
Figure 112017061495692-pct00015
.
42. 유도체가 다음 중 하나인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체:
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 13)
Figure 112017061495692-pct00016
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 14)
Figure 112017061495692-pct00017
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 15)
Figure 112017061495692-pct00018
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 16)
Figure 112017061495692-pct00019
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 17)
Figure 112017061495692-pct00020
;
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (화합물 18)
Figure 112017061495692-pct00021
.
43. 유도체가 화합물 13 내지 24 및 43 내지 56의 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
44. 유도체가 화합물 35 내지 41의 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
45. 유도체가 화합물 13 내지 24, 35 내지 41 및 43 내지 56의 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
46. 유도체가 화합물 13인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
47. 유도체가 화합물 14인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
48. 유도체가 화합물 15인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체. 유도체가 화합물 16인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
49. 유도체가 화합물 17인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
50. 유도체가 화합물 18인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
51. 유도체가 화합물 19인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
52. 유도체가 화합물 20인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
53. 유도체가 화합물 21인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
54. 유도체가 화합물 22인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
55. 유도체가 화합물 23인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
56. 유도체가 화합물 24인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
57. 유도체가 화합물 35인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
58. 유도체가 화합물 36인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
59. 유도체가 화합물 37인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
60. 유도체가 화합물 38인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
61. 유도체가 화합물 39인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
62. 유도체가 화합물 40인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
63. 유도체가 화합물 41인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
64. 유도체가 화합물 43인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
65. 유도체가 화합물 44인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
66. 유도체가 화합물 45인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
67. 유도체가 화합물 46인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
68. 유도체가 화합물 47인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
69. 유도체가 화합물 48인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
70. 유도체가 화합물 49인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
71. 유도체가 화합물 50인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
72. 유도체가 화합물 51인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
73. 유도체가 화합물 53인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
74. 유도체가 화합물 54인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
75. 유도체가 화합물 55인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
76. 유도체가 화합물 56인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
77. 유도체가 FGF21 활성을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
78. 유도체가 FGF 수용체를 활성화시킬 수 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
79. 미니 피그에 정맥 내 투여 후 말단 반감기 (t/½)가 성숙한 인간 FGF21의 말단 반감기 (t/½)보다 적어도 20배 높은, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
80. 의약으로서 사용하기 위한, 구체예 1 내지 79 중 어느 하나에 따르는 유도체.
81. 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환, 예컨대 비만, 섭식 장애, 심혈관 질환, 당뇨 합병증 중 어느 하나의 치료 및/또는 예방을 위한; 및/또는 지질 매개변수들을 개선하고, β-세포 기능을 개선하기 위한; 및/또는 당뇨병 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한; 및/또는 간 지방증 및 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한, 구체예 1 내지 79 중 어느 하나에 따르는 유도체.
82. 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환, 예컨대 비만, 섭식 장애, 심혈관 질환, 당뇨 합병증 중 어느 하나의 치료 및/또는 예방을 위한; 및/또는 지질 매개변수들을 개선하고, β-세포 기능을 개선하기 위한; 및/또는 당뇨병 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한; 및/또는 간 지방증 및 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용되는, 구체예 1 내지 79 중 어느 하나에 따르는 유도체의 용도.
83. 구체예 1 내지 79 중 어느 하나에 따르는 유도체의 제약학적 활성량을 투여함으로써 모든 형태의 당뇨병 및 관련 질환, 예컨대 비만, 섭식 장애, 심혈관 질환, 당뇨 합병증 중 어느 하나를 치료 및/또는 예방하고; 및/또는 지질 매개변수들을 개선하고, β-세포 기능을 개선하며; 및/또는 당뇨병 질환 진행을 지연 또는 예방하고; 및/또는 간 지방증 및 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)의 치료 및/또는 예방하는 방법.
84. FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 시스테인 잔기에 의한 야생형 아미노산의 아미노산 치환을 포함하는 FGF21 단백질.
85. FGF21 단백질이 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173, 174, 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는, 구체예 83에 따르는 FGF21 단백질.
86. FGF21 단백질이 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 170, 173 및 174 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는, 구체예 83에 따르는 FGF21 단백질.
87. FGF21 단백질이 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 180 및 181 중 하나에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는, 구체예 83에 따르는 FGF21 단백질.
88. FGF21 단백질이 변이체 Cys 잔기에 더불어 -1Ala, 121Gln 및/또는 168Leu를 포함하는, 구체예 83에 따르는 FGF21 단백질.
89. FGF21 단백질이 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1)의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 및 181 중 하나에서의 변이체 Cys 잔기에 더불어 -1Ala, 121Gln 및/또는 168Leu를 포함하는, 구체예 83에 따르는 FGF21 단백질.
실시예
약어 목록
AcOD: 중수소화된 아세톤
Ado: 8-아미노-3,6-다이-옥사-옥탄산
BSPP: 비스(p-설폰아토페닐)페닐포스핀 2수화물 2칼륨 염
DCM: 다이-클로로-메탄
DMSO: 다이메틸설폭사이드
DPBS: 둘베코 포스페이트-완충 식염수
EDAC: (3-다이-메틸-아미노-프로필) 에틸 카르보다이이미드
ELSD: 증발 광산란 검출기
Fmoc: 9H-플루오렌-9-일메톡시-카르보닐
Fc: 단편, 결정화 가능함
GLP-1: 글루카곤-유사 펩티드-1
gGlu: 감마 글루탐산
GLUT1: 글루코오스 트랜스포터 1
HATU: 2-(7-아자-1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HEPES: 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄-설폰산
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
IgG4: 면역글로불린 G4
IBMX: 3-아이소-부틸-1-메틸크산틴
IPTG: 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드
LCMS: 액체 크로마토그래피 질량 분광학
Mtt: 4-메틸트리틸
NMR: 핵자기공명
OtBu: 삼차-부틸 에스테르
PBS: 포스페이트 완충 식염수
RF: 지연 인자
Rt: 보유 시간
RT: 실온
tBu: t-부틸
TCTU: O-(6-클로로-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
TFA: 트라이플루오로아세트산
Tris: 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄 또는 2-아미노-2-하이드록시메틸프로판-1,3-다이올
Trx: 트라넥사민산
UPLC: 초고성능 액체 크로마토그래피
ZOSu: N-(벤질옥시카르보닐옥시)석신이미드
물질 및 방법
검출 및 특성화의 일반적 방법
LCMS 방법 1
샘플을 대략 0.2 mg/ml로 희석하고 LCMS 시스템에, 예컨대 3 내지 5 uL로 주입하였다. LCMS 기기는 UPLC 시스템과 질량 분광계로 구성된다. 유사체를 탈염하고고 아마도 역상 칼럼 (예컨대 C4, C8, C18 또는 프리칼럼 (precolumn))에서 분리되고 0.02 내지 0.05% TFA (트라이플루오로아세트산) 중의 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 분석한다. 기기는 보정되어야 하고 가능하면 록 매스 스프레이 (lock mass spray)에 의해 보정되어야 한다. 주요 크로마토그래프 피크 위의 MS 스펙트럼을 생성하고 무상 질량을 디콘볼루션 알고리즘 (deconvolution algorithm)을 사용하여 복원한다.
LCMS 기기 세팅 (Synapt)의 실례:
양이온 방식
3000 V 모세관 포텐셜 (capillary potential)
30 V 콘 (cone) 전압
110℃ 열원
250℃ 탈용매화 온도
25 L/h의 콘 가스 흐름
m/z 범위 200 내지 3000
디콘볼루션된 질량이 제시된다.
LCMS 방법 2
시스템: Agilent 1290 인피니트 시리즈 UPLC 칼럼: Aeris WIDEPORE 3.6μ XB-C18 2.1 x 50 mm 검출기: Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A) 검출기 구성.
이온화 방법: Agilent 제트 스트림 공급원 스캐닝 범위: m/z 최소 100, m/z 최대 3200 선형 리플렉터 모드 포지티브 모드.
조건: 선형 구배: 5% 내지 95% B. 구배 실행 시간: 10분 0 내지 8분 5 내지 95% B, 8 내지 9분 95% B, 9 내지 9.5분 95 내지 5% B, 9.5 내지 10분 5% B. 유량: 0.40 ml/분. 고정된 칼럼 온도: 40℃
용출 용매 A: 99.90% H2O, 0.02% TFA 용매 B: 99.90% CH3CN, 0.02% TFA 용매 C: NA.
결과 명세 및 확인: 실측된 질량은 m<4000인 화합물에 대한 화합물의 m/z ((m+z)/z) 또는 Masshunter Workstation 소프트웨어 버전 B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1 (Agilent)을 사용한 디콘볼루션의 결과로서의 질량 (평균) 중 어느 하나이다. 계산된 질량은 원하는 화합물의 평균 분자량이고 계산된 m/z는 원하는 화합물의 분자량 (m+z)/z이다.
LCMS 방법 3
시스템: Agilent 1290 인피니티 시리즈 UPLC 칼럼: Phenomenex Aeris widepore 3.6μ C4 50x2.1 mm 검출기: Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A).
검출기 구성 이온화 방법: Agilent 제트 스트림 공급원 스캐닝 범위: m/z 최소 100, m/z 최대 3200 선형 리플렉터 모드 포지티브 모드.
조건: 단계 구배: 5% 내지 90% B, 구배 실행시간: 10분: 0 내지 1분 5 내지 20% B, 1 내지 7분 20 내지 90% B, 7 내지 8분 90% B, 8 내지 8.5분 90 내지 5% B, 8.5 내지 10분 5% B. 유량: 0.40 ml/분. 고정된 칼럼 온도: 40℃.
용출 용매 A: 99.90% H2O, 0.02% TFA 용매 B: 99.90% CH3CN, 0.02% TFA 용매 C: NA.
결과 명세 및 확인: 실측된 질량은 m<4000인 화합물에 대한 화합물의 m/z ((m+z)/z) 또는 Masshunter Workstation 소프트웨어 버전 B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1 (Agilent)을 사용한 디콘볼루션의 결과로서의 질량 (평균) 중 어느 하나이다. 계산된 질량은 원하는 화합물의 평균 분자량이고 계산된 m/z는 원하는 화합물의 분자량 (m+z)/z이다.
LCMS 방법 4
시스템: 물s 자동정제 시스템
칼럼: Kinetex C18 4.6 mm x 50 mm
검출기: UV: PDA, ELSD, MS Micromass Quatro 마이크로
검출기 구성: 이온화 방법: ES+, 스캐닝 범위 100 내지 1000, 콘 30 V, 모세관 300 kV, 스캔 시간 1.3 s; PDA: 210-400 nm; ELSD: Nebulizer 히터-쿨러 70 %, 드리프트 튜브 57.0℃.
조건: 선형 구배 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA, 구배 실행시간: 4.0분, 총 실행시간: 6.0분, 유량: 1.1 ml/분, 칼럼 온도: 23℃.
발명의 화합물의 제조
실시예 1: 인간 성숙 FGF21의 클로닝 및 발현
인간 FGF21에 대한 DNA 및 아미노산 서열은 예컨대 Nishimura et al. in Biochim. Biophys . Acta 1492(1):203-206 (2000)에 의해 개시되었다. 서열은 또한 각각 승인 번호 EMBL:AB021975 및 unIPROT:Q9NSA1을 가진 공용 데이터베이스로부터 입수 가능하다.
성숙한 인간 FGF21 단백질을 대장균에서 신호 펩티드 없이, 그러나 첨가된 N-말단 메티오닌과 함께, 세포내 단백질로서 클로닝하고 발현시켰다. 보다 구체적으로, 성숙한 인간 FGF21 (N-말단에 첨가된 Met를 가짐)을 코딩하는 유전자 서열을 대장균 발현에 대해 코돈-최적화시켰고 벡터 pET11c의 NdeI과 BamHI 부위 사이에 클로닝하였다. 이것은 FGF21 유전자를 파지 T7 프로모터의 제어하에 놓이게 하였다. 발현 구성물을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 단일 콜로니를 선택하고 LB + Amp 100 ug/mL에서 0.5의 OD450으로 성장시켰다. 발현을 0.3 mM IPTG를 사용하여 4시간 동안 37℃에서 유도하였다. FGF21 발현의 분석을 위해 세포의 미정제 추출물을 음파처리에 의해 만들었다. 쿠마찌 염색된 SDS-PAGE는 펠릿 부분에서 주로 확인된 FGF21의 성공적인 발현을 보였다. 비록 그렇게 발현된 MetFGF21의 계산된 MW가 19.5 kD이지만, 겔 상에서는 25 kD 단백질로서 이동하였는데, 그것은 단백질의 이동을 지연시키는 프롤린의 고함량으로 인한 것으로 보인다.
본 출원에서, MetFGF21은 참조 화합물로서 사용된다. FGF21이 대장균 발현 시스템을 사용하여 제조될 때, 메티오닌은 FGF21의 N-말단에 도입된다. 그러나, 이것은 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로 여겨지지 않으며, 따라서 FGF21과 MetFGF21은 둘 다 통상적으로 참조 화합물로서 사용된다.
실시예 2: FGF21 유사체의 클로닝 및 발현
표 1의 유사체들에 대한 발현 구성물 (실시예 3)을 실시예 1에서 기술한 FGF21 성숙 발현 구성물에 대한 돌연변이생성에 의해 만들었다. Stratagene 다중-부위 돌연변이생성 키트를 사용하였다. 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 발현 조건을 또한 적용하였다. 쿠마찌 블루 염색된 SDS-PAGE는 유사체들의 성공적인 발현을 보였다. FGF21 서열에 대해 N-말단으로 2-펩티드 Met-Ala를 포함하는 유사체들이 발현되었고, 그것은 대장균 효소들에 의한 Met의 절단으로 인해 N-말단 아미노산 잔기로서 Ala를 가진 FGF21 유사체의 발현을 허용한다.
실시예 3: 성숙한 FGF21 및 FGF21 유사체들의 정제
실시예 1 및 2에 기술된 성숙한 FGF21 및 FGF21 유사체들을 정제하기 위하여, 다음의 과정 또는 유사한 기법들을 사용하였다:
대장균 세포 펠릿을 10 mM 인산 칼륨 pH 6.0에 재현탁하고, 균등화기에 의해 800 바 아래에서 2회 파괴하였다. 봉입체를 원심분리 (10,000 x g, 30분)에 의해 펠릿화하고, 50 mM Tris pH 8.0에 재-용해함 후, 2 M 우레아 및/또는 5 mM 시스테아민을 선택적으로 첨가하고, 슬러리를 밤새 4℃에서 교반하였다. 칼럼에 적용하기 전에, 슬러리를 다시 10,000 x g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 음이온 교환 크로마토그래피 (Q 세파로오스 고속 흐름 수지, GE Healthcare) 위에 적용하고, 50 내지 250 mM NaCl로 용출하였다. 용출액 모음에 0.4 M 암모늄 설페이트를 첨가한 후, 20 mM 트리스 pH 8.0, 0.4 M 암모늄 설페이트로 평형화한 페닐 FF 칼럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. 칼럼을 20 mM 트리스 pH 8.0, 1.5 M 염화나트륨으로 세척한 후, 10% 트리스-클로라이드 완충액 (20 mM 트리스 pH 8.0, 1.5 M 염화나트륨)으로 용출하였다. 30Q 칼럼을 추가의 순도 연마에 대해 사용할 수 있다. 최종 생성물을 SDS-PAGE 또는 다른 관련 기법에 의해 분석하였다. 화합물 3 및 5 내지 10에 대해, 도입된 시스테인의 시스테아민 보호는 약물학적 실험 동안 유지되었다.
FGF21 유사체를 상기 기술한 대로 제조하였다. LCMS에 의해 측정된 (LCMS 방법 1을 사용함)무상 질량을 화합물들에 대해 제시한다.
Figure 112017061495692-pct00022
실시예 4: FGF21 유사체의 유도체화에 대한 시약의 제조
유도체와에 대한 대표적인 시약의 제조를 실시예 4.1에 제공한다. 실시예 4.2 내지 4.4의 시약들은 실시예 4.1에 제공된 방법에 의해 제조한다. 실시예 4.5 내지 4.17의 시약들은 아래에서 기술되는 유사한 방법에 의해 제조하였다.
실시예 4.1:
실시예 4.1: 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}펜타데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00023
고상 합성 프로토콜:
다이클로로메탄 (500 mL) 중의 N-(벤질옥시카르보닐옥시)석신이미드 (ZOSu, 100 g, 401 mmol) 용액을 다이클로로메탄 (750 mL) 중의 에틸렌다이아민 (1, 189 mL, 2.81 mol) 용액에 2시간에 걸쳐 적상 방식으로 첨가하였다. 30분 후에 현탁액을 여과하고 고체를 다이클로로메탄으로 세척하였다. 여과액을 건고상태로 증발시키고 그 잔류물을 톨루엔 (1.00 L) 및 물 (0.50 L)로 희석하였다. 그 결과의 혼합물을 여과하고 여과액을 두 개의 상 (phase)을 얻기 위하여 분리하였다. 수성 상은 생성물을 함유하였고; 따라서 그것을 다이클로로메탄으로 추출하였다 (2 x 250 mL). 모든 유기상을 조합하고, 무수 황상 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 진공 농축하였다. 잔류물을 톨루엔 (750 mL)으로 희석하고 2 M 수성 염산 (500 mL) 및 1 M 수성 염산 (100 mL)으로 추출하였다. 산성 수성 상을 조합하고 물 (90 mL) 중의 수산화나트륨 (60.0 g, 1.50 mol) 용액으로 염기화하였다. 그 결과의 혼합물을 다이클로로메탄으로 추출하고 (4 x 200 mL), 무수 황산 나트륨 상에서 건조시킨 후, 여과하고, 진공 농축하고 헥산 (200 mL)으로 희석하였다. 그 용액에 에테르 (100 mL, 400 mmol) 중의 염화 수소의 4 M 용액을 첨가하고, 그 결과의 현탁액을 진공 농축한 후 헥산 (1.00 L)으로 희석하였다. 침전된 고체를 여과하고, 헥산으로 세척하고 진공 건조시켜서 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염를 백색 분말로서 얻었다.
수율: 62.62 g (68%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 4:1): 0.25 (유리 염기).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, dH): 7.42-7.26 (m, 5 H); 5.16 (s, 2 H); 3.60 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 3.32 (t, J=5.7 Hz, 2 H).
2-클로로트리틸 수지 100 내지 200 메쉬 1.7 mmol/g (3, 40.1 g, 68.1 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (250 mL) 중에 팽창되도록 20분 동안 놓아두었다. 그 수지에 건조 다이클로로메탄 (50 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-Ado-OH, 17.5 g, 45.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (30.1 mL, 173 mmol)의 용액을 첨가하고 그 혼합물을 5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고, 메탄올/다이클로로메탄 혼합물 (4:1, 250 mL, 2 x 5 분) 중의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (15.8 mL, 90.8 mmol) 용액으로 처리하였다. 그런 다음 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 250 mL), 다이클로로메탄 (2 x 250 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 250 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 250 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 250 mL), 2-프로판올 (2 x 250 mL) 및 다이클로로메탄 (300 mL, 2 x 250 mL)으로 세척하였다. 그 수지에 N,N-다이메틸포름아미드 (140 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-Ado-OH, 26.3 g, 68.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 24.2 g, 68.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (21.4 mL, 123 mmol)의 용액을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 250 mL), 다이클로로메탄 (2 x 250 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (250 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 250 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 250 mL), 2-프로판올 (2 x 250 mL) 및 다이클로로메탄 (300 mL, 2 x 250 mL)으로 세척하였다. 수지에 N,N-다이메틸포름아미드 (140 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-Glu-OtBu, 29.0 g, 68.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 24.2 g, 68.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (21.4 mL, 123 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 250 mL), 다이클로로메탄 (2 x 250 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (250 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 250 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 250 mL), 2-프로판올 (2 x 250 mL) 및 다이클로로메탄 (300 mL, 2 x 250 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드/다이클로로메탄 혼합물 (4:1, 200 mL) 중의 16-(삼차-부톡시)-16-옥소헥사데칸산 (23.3 g, 68.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 24.2 g, 68.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (21.4 mL, 123 mmol)의 용액을 수지에 첨가하였다. 수지를 1시간 동안 흔들고, 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 250 mL), 다이클로로메탄 (2 x 250 mL), 메탄올 (2 x 250 mL) 및 다이클로로메탄 (350, 6 x 250 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트라이플루오에탄올 (250 mL)로 18시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 다이클로로메탄 (2 x 250 mL), 2-프로판올/다이클로로메탄 혼합물 (1:1, 2 x 250 mL), 2-프로판올 (250 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 250 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하고; 용매를 증발시키고 미정제 생성물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0.060 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 1:0-9:1)에 의해 정제하였다. 순수한 (S)-22-(삼차-부톡시카르보닐)-41,41-다이메틸-10,19,24,39-테트라옥소-3,6,12,15,40-펜타옥사-9,18,23-트라이아자도테트라콘탄산을 진공 중에서 건조시켜서 담황색 진황색 오일로서 얻었다.
수율: 30.88 g (83%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 4:1): 0.30.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.36 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7.02 (t, J=5.4 Hz, 1 H); 6.55 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 4.46 (m, 1 H); 4.18 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3.83-3.36 (m, 16 H); 2.44-2.12 (m, 7 H); 2.02-1.86 (m, 1 H); 1.60 (m, 4 H); 1.47 (s, 9 H); 1.45 (s, 9 H); 1.36-1.21 (m, 20 H).
LC-MS 방법 4:
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.60 분.
실측된 m/z, z=1: 818.7 (M+H)+
2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 11.4 g, 30.1 mmol) 및 트라이에틸아민 (8.77 mL, 62.9 mmol)을 계속해서 건조 다이클로로메탄 (110 mL) 중의 (S)-22-(삼차-부톡시카르보닐)-41,41-다이메틸-10,19,24,39-테트라옥소-3,6,12,15,40-펜타옥사-9,18,23-트라이아자도테트라콘탄산 (22.4 g, 27.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 건조 다이클로로메탄 (165 mL) 중의 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염 (6.94 g, 30.1 mmol)의 현탁액에 트라이에틸아민 (5.72 mL, 41.0 mmol)을 첨가하고 그 결과의 혼합물을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 건고 상태로 증발시켰다. 그 잔류물을 에틸 아세테이트 (500 mL)에 재-용해하고; 1 M 수성 염산 (2 x 200 mL), 5% 수용액의 탄산 나트륨 (2 x 200 mL, 매우 느린 상의 분리), 1 M 수성 염산 (8 x 200 mL) 및 식염수로 세척하고; 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고 진공 중에서 건고 상태로 증발시켰다. 그 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0.060 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 95:5)에 의해 정제하여 15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-벤질옥시카르보닐아미노-에틸카바모일)-메톡시]-에톡시}-에틸카바모일)-메톡시]-에톡시}-에틸카바모일)-1-삼차-부톡시카르보닐-프로필카바모일]-펜타데칸산 삼차-부틸 에스테르를 담황색 걸쭉한 오일로 얻었다.
수율: 23.84 g (88%)
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.35
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.39-7.26 (m, 6 H); 7.19 (t, J=6.3 Hz, 1 H); 6.91 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 6.52 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.83 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 5.09 (s, 2 H); 4.41 (ddd, J=12.3, 4.6 및 4.3 Hz, 1 H); 3.99 (s, 2 H); 3.97 (s, 2 H); 3.71-3.30 (m, 20 H); 2.33-2.08 (m, 7 H); 1.97-1.83 (m, 1 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.35-1.20 (m, 20 H).
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 4.18 분
실측된 m/z, z=1: 994.9 (M+H)+
메탄올 (350 mL) 중의 상기 화합물 (23.8 g, 24.0 mmol)의 용액에 탄소 상의 팔라듐 (10%, 1.27 g, 1.20 mmol)을 첨가하고 그 결과의 혼합물을 정상 압력에서 4시간 동안 수소화하였다. 결정을 여과하고 여과물을 건고 상태로 증발시켰다. 그 잔류물을 여러 번 다이클로로메탄으로부터 증발시켜서 메탄올의 잔류물을 제거하고 진공 중에서 건조시켜서 삼차-부틸 (S)-1-아미노-25-(삼차-부톡시카르보닐)-4,13,22,27-테트라옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21,26-테트라아자도테트라콘탄-42-오에이트를 걸쭉한 무색 오일로서 얻었다.
수율: 20.50 g (99%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.05.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.54 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7.41 (t, J=5.6 Hz, 1 H); 7.14 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 6.68 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.25 (bs, 2 H); 4.39 (td, J=8.3 및 4.2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H); 3.74-3.39 (m, 18 H); 2.96 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 2.34-2.06 (m, 7 H); 1.97-1.83 (m, 1 H); 1.68-1.50 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.43 (s, 9 H); 1.37-1.19 (m, 20 H).
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 1.43 분
실측된 m/z, z=1: 860.8 (M+H)+
건조 다이클로로메탄 (290 mL) 중의 상기 아민 (6, 20.5 g, 23.8 mmol)의 용액에 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (4.98 mL, 28.6 mmol)을 -30℃에서 아르곤 하에서 첨가하였다. 거기에 브로모아세틸 브로마이드 (2.48 mL, 28.6 mmol)를 적상 방식으로 첨가하고 그 결과의 용액을 -30℃에서 추가로 3시간 동안 교반하였다. 냉각 배스를 제거하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 제거하였다. 그 잔류물을 에틸 아세테이트 (450 mL)에 재-용해하고 시트르산의 5% 수용액 (300 mL)으로 세척하였다. 상들은 1시간 내에 분리되었다. 유기층을 물 (300 mL)로 세척하고 그 결과의 에멀젼을 3개의 상을 얻기 위해 밤새 분리하도록 놓아두었다. 투명한 수성 층을 제거하고 나머지 2개의 상을 첨가한 브롬화 칼륨의 포화 수용액 (100 mL)과 함께 흔들었다. 상들을 분리하도록 밤새 놓아둔 후, 수성 상을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 제거하고 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0.060 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 95:5)에 의해 정제하여 삼차-부틸 (S)-1-브로모-28-(삼차-부톡시카르보닐)-2,7,16,25,30-펜타옥소-9,12,18,21-테트라옥사-3,6,15,24,29-펜타아자펜타테트라콘탄-45-오에이트를 무색 고체로서 얻었다.
수율: 19.46 g (83%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.25
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.46 (m, 1 H); 7.33 (t, J=5.9 Hz, 1 H); 7.21 (t, J=5.1 Hz, 1 H); 6.92 (t, J=5.2 Hz, 1 H); 6.50 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.41 (ddd, J=12.2, 4.5 및 4.2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H), 3.85 (s, 2 H); 3.75-3.40 (m, 20 H), 2.36-2.08 (m, 7 H); 1.99-1.84 (m, 1 H); 1.68-1.51 (m, 4 H), 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.38-1.19 (m, 20 H)
LCMS 방법 4
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.51 분.
실측된: m/z, z=1: 980.9, 982.9 (M+H)+
상기 화합물 (19.5 g, 19.8 mmol)을 트라이플루오로아세트산 (120 mL)에 녹이고 그 결과의 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 트라이플루오로아세트산을 진공 제거하고 잔류물을 다이클로로메탄 (6 x 200 mL)으로부터 증발시켰다. 유상 잔류물에 다이에틸 에테르 (200 mL)를 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하여 현탁액을 얻었다. 고체 생성물을 여과하고, 다이에틸 에테르 및 헥산으로 세척하고, 진공 건조하여 표제 생성물 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}펜타데칸산을 백색 분말로서 얻었다.
수율: 16.74 g (97%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.8 및 4.8 Hz, 1 H); 4.12 (s, 2 H), 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77 -3.39 (m, 20 H), 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-1.04 (m, 1 H); 1.71-1.56 (m, 4 H), 1.30 (bs, 20 H)
LCMS 방법 4:
순도: 100%
Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.51 분
이론적 m/z, z=1: 869,8, 실측된: m/z, z=1: 868.7, 870.7
실시예 4.2: 11-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}운데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00024
11-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}운데칸산을 실시예 4.1에서 기술된 것과 같은 방법에 의해 제조하여 걸쭉한 오렌지색 오일을 얻었다.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.9 및 4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.79-3.38 (m, 20 H); 2.50-2.16 (m, 7 H); 2.16-2.00 (m, 1 H); 1.72-1.56 (m, 4 H); 1.42-1.24 (m, 12 H)
LCMS 방법 4:
순도: 100% (ELSD)
Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.74 분
이론적, m/z, z=1:813,8, 실측된 m/z, z=1: 812.0, 814.0
실시예 4.3: 13-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}트라이데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00025
13-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}트라이데칸산을 실시예 4.1에서 기술된 것과 같은 방법에 의해 제조하여 걸쭉한 황색 오일을 얻었다.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.9 및 4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.11 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77-3.40 (m, 20 H); 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-2.07 (m, 1 H); 1.70-1.56 (m, 4 H); 1.31 (bs, 16 H).
LCMS 방법 4:
순도: 100% (ELSD)
Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.94 분
이론적 m/z, z=1: 841.9, 실측된: m/z, z=1: 841.7, 843.7
실시예 4.4: 19-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸-아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]프로필카바모일}노나데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00026
19-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}노나데칸산을 실시예 4.1에서 기술한 것과 같은 방법에 의해 제조하여 베이지색 분말을 얻었다.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.65-4.57 (m, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77-3.43 (m, 20 H); 2.49-2.40 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.39-2.23 (m, 5 H); 2.17-2.07 (m, 1 H); 1.68-1.57 (m, 4 H); 1.30 (bs, 28 H)
LCMS 방법 4:
순도: 100% (ELSD)
Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.17 분
이론적 질량: 926.0, 실측된 m/z: 926 (M+H)+
실시예 4.5: 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00027
용액상 합성 프로토콜:
단계 1: 벤질 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-벤질옥시카르보닐-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데카노에이트. 0℃에서 DCM (80 ml) 및 트라이에틸아민 (5.2 ml) 중의 에틸렌다이아민 (8.5 ml ml)의 용액에 DCM (320 ml) 중의, WO10029159에 기술된 대로 제조한, 벤질 18-[[(1S)-1-벤질옥시카르보닐-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-di옥소피롤리딘-1-일)옥시-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데카노에이트 (26 g)의 용액을 75분에 걸쳐 적상 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후 침전물을 여과하였다. 그 여과물에 물 (200 ml) 및 아이소프로판올 (50 ml)을 첨가하였다. 혼합물을 추출하였다. 유기층을 MgSO4를 사용하여 건조시켰다. MgSO4를 여과에 의해 제거하고 여과물을 진공 중에서 건조시켜서 표제 화합물 20.07 g (81%)을 얻었다. LCMS: 이론적 질량: 956.2; 실측된 m/z, z=1: 957.0
단계 2: 벤질 18-[[(1S)-1-벤질옥시카르보닐-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데카노에이트
클로로아세트산 (0.19 g)을 DCM (15 ml)에 녹였다. N-하이드록시석신이미드 (0.22 g) 및 EDAC HCl (0.42 g)을 첨가하였다. 2.5시간 동안 교반한 후 DCM (15 ml) 중의 벤질 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-벤질옥시카르보닐-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데카노에이트 (1.5 g)를 첨가하였다. 밤새 RT에서 교반한 후 혼합물을 1M HCl (2x20 ml) 및 물/식염수 2:1 (30 ml)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고 (MgSO4), 여과하고 진공 농축하여 투명한 오일, 1.37 g (84%)을 얻었다.
LCMS: 이론적 질량: 1032.7; 실측된 m/z, z=1: 1033.1
단계 3: 18-[[(1S)-1-카르복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산
아세톤 (140 ml) 중의 벤질 18-[[(1S)-1-벤질옥시카르보닐-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데카노에이트 (10.5 g)의 용액에 질소 탈기 후 10% PD/C (1.0 g)를 첨가하였다. 6시간 동안 수소화한 후, 혼합물을 40 내지 50℃로 가열한 후 여과하였다. 저온 여과물 중의 침전을 분리하고 아세톤으로 세척한 후 건조시켜서 표제 화합물, 7.42 g (85%)을 얻었다.
단계 4: 8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산.
아세톤 (60 ml) 중의 18-[[(1S)-1-카르복시-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-클로로아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산의 현탁액에 브롬화 나트륨 (5 eq, 1.21 g)을 첨가하였다. 그 혼합물을 RT에서 암실에서 교반하였다. 2시간 후 더 많은 브롬화 나트륨 (10 eq, 2.41 g)을 첨가하였다. 2일 후에 더 많은 브롬화 나트륨 (5 eq, 2.41 g)을 첨가하였다. 5일 후에 혼합물을 농축하였다. 그 절반의 잔류물에 DCM (30 ml), 10% 아스코르브산 (20 ml) 및 물 30 ml을 첨가하였다. 그 에멀젼에 아이소프로판올 (50 ml) 및 물 (30 ml)을 첨가하였다. 유기상을 분리하고 10% 아스코르브산 (20 ml) 및 아이소프로판올 (10 ml)의 혼합물로 2회 세척하였다. 유기층을 건조시키고 (MgSO4), 여과하고 농축하여 고체 오일을 얻었고, 그것은 아세톤에서 결정화되었으며 여과에 의해 분리하여 출발 물질로 오염된 표제 화합물, 0.80 g (72%)을 얻었다.
LCMS: 이론적 질량: 896.9. 실측된 m/z, z=1: 898.9 (M+1)
실시예 4.6: 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-12-옥소-도데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00028
고상 합성 프로토콜:
2-클로로트리틸 수지 100-200 메쉬 1.8 mmol/g (1, 11.9 g, 21.4 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (80 mL)에 팽창되도록 20분 동안 놓아두었다. 건조 다이클로로메탄 (70 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 5.50 g, 14.3 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (9.44 mL, 54.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 4시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 메탄올/다이클로로메탄 혼합물 (4:1, 2 x 5 분, 2 x 57 mL) 중의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (4.97 mL, 28.5 mmol)의 용액으로 처리하였다. 그런 다음 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 11.0 g, 28.5 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 10.1 g, 28.5 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (9.93 mL, 57.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 9.11 g, 21.4 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 7.60 g, 21.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.71 mL, 38.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 4-[(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)메틸]사이클로헥산카르복실산 (Fmoc-Trx-OH, 9.11 g, 21.4 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 7.60 g, 21.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.71 mL, 38.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. 다이클로로메탄/N,N-다이메틸포름아미드 혼합물 (4:1, 80 mL) 중의 도데칸디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C12(OtBu)-OH, 6.13 g, 21.4 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 7.61 g, 21.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.71 mL, 38.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (6 x 80 mL), 다이클로로메탄 (4 x 80 mL), 메탄올 (4 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (7 x 80 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트라이플루오로에탄올 (80 mL)으로 18시간 동안 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 다이클로로메탄 (4 x 80 mL), 다이클로로메탄/2-프로판올 혼합물 (1:1, 4 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (6 x 80 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하였다: 용매를 증발시키고 미정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0-063 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 1:0-9:1)에 의해 정제하였다. 순수한 생성물 (2)을 진공 중에서 건조시켰고 오일로서 얻었다.
수율: 5.40 g (42%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.30.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.45-7.31 (m, 1 H); 7.10-6.97 (m, 1 H); 6.71-6.60 (m, 1 H); 5.70-5.58 (m, 1 H); 4.43-4.31 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.01 (s, 2 H); 3.79-3.31 (m, 16 H); 3.13-3.08 (m, 2 H); 2.28-1.79 (m, 11 H); 1.71-1.51 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (bs, 12 H); 1.05-0.88 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt (Sunfire 4.6 mm x 100 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.16 분.
LC-MS m/z: 903.0 (M+H)+.
2-(7-아자-1H-벤조트리아졸e-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 2.46 g, 6.48 mmol) 및 트라이에틸아민 (1.89 mL, 13.6 mmol)을 계속해서 건조 다이클로로메탄 (23 mL) 중의 상기로부터의 오일 (2, 5.31 g, 5.89 mmol)의 용액에 첨가하였다. 트라이에틸아민 (1.36 mL, 9.72 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (35 mL) 중의 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 염산염 (3, 1.49 g, 6.48 mmol)의 현탁액에 첨가하고 그 결과의 혼합물을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 후, 건고 상태로 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (70 mL)에 재용해하고; 1 M 수성 염산 (1 x 70 mL), 5% 탄산 나트륨 ㅅ수용액 (2 x 70 mL), 1 M 수성 염산 (4 x 70 mL) 및 식염수 (70 mL)로 세척하고; 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0-063 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 95:5 내지 92:8)에 의해 정제하여 걸쭉한 황색 오일을 얻었다.
수율: 2.81 g (44%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.25.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.41-7.29 (m, 6 H); 7.22-7.13 (m, 1 H); 6.93-6.81 (m, 1 H); 6.62-6.58 (m, 1 H); 5.90-5.81 (m, 1 H); 5.68-5.55 (m, 1 H); 5.09 (s, 2 H); 4.42-4.33 (m, 1 H); 4.01-3.95 (m, 4 H); 3.75-3.30 (m, 20 H); 3.14-3.06 (m, 2 H); 2.31-2.01 (m, 11 H); 1.97-1.76 (m, 1 H); 1.65-1.52 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.27 (bs, 12 H); 1.04-0.87 (m, 2 H).
탄소 상의 팔라듐 (10%, 0.15 g, 0.13 mmol)을 메탄올 (43 mL) 중의 상기 화합물 (2.81 g, 2.60 mmol)의 용액에 첨가하고 그 결과의 혼합물을 정상 기압에서 2.5시간 동안 수소화하였다. 결정을 여과해내고 여과물을 건고 상태로 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔으로 4회 공-증발시키고 진공 중에서 건조시켜서 화합물 5를 얻었다.
수율: 2.01 g (81%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.51-7.36 (m, 2 H); 7.04-6.96 (m, 1 H); 6.76-6.66 (m, 1 H); 5.93-5.85 (m, 1 H); 4.41-4.29 (m, 1 H); 4.03-3.99 (m, 4 H); 3.73-3.25 (m, 18 H); 3.13-2.97 (m, 4 H); 2.34-1.78 (m, 11 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.30 (m, 12 H); 1.04-0.88 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 70:30 내지 100:0 + 0.1% TFA): 0.67 분.
LC-MS m/z: 945.0 (M+H)+.
N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.40 mL, 2.28 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (30 mL) 중의 상기 아민 (5, 1.79 g, 1.90 mmol)의 용액에 -30℃에서 아르곤 하에 첨가하였다. 브로모아세틸 브로마이드 (0.20 mL, 2.28 mmol)를 적상 첨가하고 그 결과의 용액을 -30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 냉각 배스를 제거하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반한 후 건고상태로 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (50 mL)에 재용해하고, 시트르산의 5% 수용액 (3 x 50 mL, 매우 느린 상들의 분리), 1 M 수성 염산 (4 x 50 mL) 및 식염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0-063 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 95:5 내지 93:7)에 의해 정제하여 황색 오일을 얻었다.
수율: 1.63 g (80%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 95:5): 0.25.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.56-7.48 (m, 1 H); 7.43-7.34 (m, 1 H); 7.04-6.95 (m, 1 H); 6.62 (d, J=7.9 Hz, 1 H); 5.74-5.63 (m, 1 H); 4.43-4.33 (m, 1 H); 4.02 (s, 4 H); 3.85 (s, 2 H); 3.73-3.40 (m, 20 H); 3.14-3.09 (m, 2 H); 2.34-2.04 (m, 9 H); 1.97-1.76 (m, 4 H); 1.68-1.51 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.27 (m, 12 H); 1.07-0.90 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.16 분.
LC-MS m/z: 1066.0 (M+H)+.
상기 화합물 (1.53 g, 1.44 mmol)을 트라이플루오로아세트산 (25 mL)에 녹이고 1.5시간 동안 놓아두었다. 트라이플루오로아세트산을 진공 중에서 제거하고 그 잔류물을 톨루엔으로 3회 및 다이클로로메탄으로 10회 공-증발시켜서 황색 유상 고체를 얻었다.
수율: 810 mg (59%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.64-4.54 (m, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.11 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.78-3.40 (m, 20 H); 3.13-3.10 (d, J=6.6 Hz, 2 H); 2.51-2.19 (m, 9 H); 1.94-1.77 (m, 4 H); 1.68-1.41 (m, 7 H); 1.31 (bs, 12 H); 1.10-0.92 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.82 분.
LC-MS m/z: 952.0 (M+H)+.
실시예 4.7: 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00029
고상 합성 프로토콜:
2-클로로트리틸 수지 100-200 메쉬 1.8 mmol/g (1, 11.9 g, 21.4 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (80 mL) 중에 팽창하도록 20분 동안 놓아두었다. 건조 다이클로로메탄 (70 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 5.50 g, 14.3 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (9.44 mL, 54.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 그 혼합물을 4시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 메탄올/다이클로로메탄 혼합물 (4:1, 2 x 5 분, 2 x 57 mL) 중의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (4.97 mL, 28.5 mmol)의 용액으로 처리하였다. 그런 다음 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 11.0 g, 28.5 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 10.1 g, 28.5 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (9.93 mL, 57.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 9.11 g, 21.4 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 7.60 g, 21.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.71 mL, 38.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 Fmoc-트라넥사민산 (Fmoc-Trx-OH, 9.11 g, 21.4 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 7.60 g, 21.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.71 mL, 38.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL), 다이클로로메탄 (2 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 80 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (100 mL, 2 x 80 mL)으로 세척하였다. 다이클로로메탄/N,N-다이메틸포름아미드 혼합물 (4:1, 80 mL) 중의 헥사데칸디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C16(OtBu)-OH, 7.33 g, 21.4 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 7.61 g, 21.4 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.71 mL, 38.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (6 x 80 mL), 다이클로로메탄 (4 x 80 mL), 메탄올 (4 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (7 x 80 mL)으로 세척하였다. 생성물을 2,2,2-트라이플루오로에탄올 (80 mL)로 18시간 동안 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과해내고 다이클로로메탄 (4 x 80 mL), 다이클로로메탄/2-프로판올 혼합물 (1:1, 4 x 80 mL), 2-프로판올 (2 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (6 x 80 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하였다: 용매를 증발시키고 미정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0-063 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 1:0-9:1)에 의하여 정제하였다. 중간체 (2)를 진공 중에서 건조시켰고 오일로서 얻었다.
수율: 8.20 g (80%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.20.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.44-7.33 (m, 1 H); 7.07-6.97 (m, 1 H); 6.72-6.63 (m, 1 H); 5.70-5.59 (m, 1 H); 4.44-4.33 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.01 (s, 2 H); 3.76-3.32 (m, 16 H); 3.14-3.07 (m, 2 H); 2.38-1.77 (m, 11 H); 1.71-1.50 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (bs, 20 H); 1.05-0.87 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt (Sunfire 4.6 mm x 100 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.56 분.
LC-MS m/z: 959.0 (M+H)+.
2-(7-아자-1H-벤조트리아졸e-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 3.55 g, 9.34 mmol) 및 트라이에틸아민 (2.72 mL, 19.5 mmol)을 계속해서 건조 다이클로로메탄 (34 mL) 중의 중간체 2 (8.13 g, 8.49 mmol)의 용액에 첨가하였다. 트라이에틸아민 (1.78 mL, 12.7 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (51 mL) 중의 (2-아미노-에틸)-카르밤산 벤질 에스테르 hydrochloride (2.15 g, 9.34 mmol)의 현탁액에 첨가하고 그 결과의 혼합물을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 후 건고 상태로 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (150 mL)에 재용해하고; 1 M 수성 염산 (1 x 100 mL), 5% 탄산 나트륨 수용액 (2 x 100 mL), 1 M 수성 염산 (4 x 100 mL) 및 식염수로 세척하고; 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60, 0.040-0-063 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 95:5 내지 92:8)에 의하여 정제하여 화합물 4를 걸쭉한 황색 오일로서 얻었다.
수율: 5.59 g (58%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 9:1): 0.20.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.41-7.31 (m, 6 H); 7.21-7.12 (m, 1 H); 6.92-6.83 (m, 1 H); 6.58-6.52 (m, 1 H); 5.89-5.79 (m, 1 H); 5.62-5.51 (m, 1 H); 5.10 (s, 2 H); 4.43-4.32 (m, 1 H); 4.05-3.92 (m, 4 H); 3.75-3.30 (m, 20 H); 3.15-3.07 (m, 2 H); 2.33-2.03 (m, 11 H); 1.97-1.68 (m, 1 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.26 (bs, 20 H); 1.05-0.87 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 70:30 내지 100:0 + 0.1% TFA): 1.41 분.
LC-MS m/z: 1136.0 (M+H)+.
탄소 상의 팔라듐 (10%, 0.27 g, 0.24 mmol)을 메탄올 (85 mL) 중의 상기 화합물 (4, 5.59 g, 4.93 mmol)의 용액에 첨가하고 그 결과의 혼합물을 정상 압력에서 2.5시간 동안 수소화하였다. 결정을 여과해내고 여과물을 건고상태로 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔으로 4회 공-증발시키고 진공 중에서 건조시켜 화합물 5를 얻었다.
수율: 3.45 g (70%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.43-7.33 (m, 2 H); 7.05-6.94 (m, 1 H); 6.72-6.65 (m, 1 H); 5.69-5.59 (m, 1 H); 4.44-4.33 (m, 1 H); 4.03-3.98 (m, 4 H); 3.72-3.39 (m, 18 H); 3.15-3.07 (m, 2 H); 2.96-2.90 (m, 2 H); 2.34-1.78 (m, 13 H); 1.71-1.51 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (m, 20 H); 1.07-0.93 (m, 1 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 70:30 내지 100:0 + 0.1% TFA): 0.76 분.
LC-MS m/z: 1001.0 (M+H)+.
N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.73 mL, 4.14 mmol)을 건조 다이클로로메탄 (55 mL) 중의 상기 아민 (5, 3.45 g, 3.45 mmol)의 용액에 -30℃에서 아르곤 하에 첨가하였다. 브로모아세틸 브로마이드 (0.36 mL, 4.14 mmol)를 적상 첨가하고 그 결과의 용액을 -30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 냉각 배스를 제거하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반한 후, 건고 상태로 증발시켰다. 그 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 mL)에 재용해하고, 5% 시트르산의 수용액 (3 x 100 mL, 매우 느린 상의 분리), 1 M 수성 염산 (4 x 100 mL) 및 식염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 실리카겔 60, 0.040-0-063 mm; 용출액: 다이클로로메탄/메탄올 95:5 내지 93:7)에 의해 정제하여 화합물 6을 황색 오일로서 얻었다.
수율: 1.63 g (44%).
RF (SiO2, 다이클로로메탄/메탄올 95:5): 0.15.
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3, dH): 7.55-7.46 (m, 1 H); 7.43-7.33 (m, 1 H); 6.99-6.89 (m, 1 H); 6.58 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.72-5.59 (m, 1 H); 4.44-4.32 (m, 1 H); 4.02 (s, 4 H); 3.85 (s, 2 H); 3.74-3.40 (m, 20 H); 3.14-3.09 (m, 2 H); 2.33-2.05 (m, 9 H); 2.01-1.76 (m, 4 H); 1.67-1.53 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (m, 20 H); 1.07-0.89 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 50:50 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.47 분.
LC-MS m/z: 1122.0 (M+H)+.
상기 화합물 (6, 1.63 g, 1.53 mmol)을 트라이플루오로아세트산 (25 mL)에 녹이고 1.5시간 동안 놓아두었다. 트라이플루오로아세트산을 진공 중에서 제거하고 그 잔류물을 톨루엔으로 3회 공-증발시켰다. 다이에틸 에테르 (120 mL)를 유상 잔류물에 첨가하고 그 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 침전물을 여과해 내고 그 잔류물을 진공 중에서 건조시켜서 백색 분말을 얻었다.
수율: 1.55 g (90%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.65-4.56 (m, 1 H); 4.14 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.98 (s, 2 H); 3.78-3.44 (m, 20 H); 3.14-3.10 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 2.48-2.21 (m, 8 H); 2.18-2.10 (m, 1 H); 1.97-1.79 (m, 4 H); 1.70-1.46 (m, 7 H); 1.32 (bs, 20 H); 1.11-0.93 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.32 분.
LC-MS m/z: 1008.0 (M+H)+.
실시예 4.8: 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-18-옥소-옥타데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00030
합성 프로토콜:
Wang Fmoc-Lys(Mtt) 수지 0.26 mmol/g (1, 11.7 g, 3.05 mmol)를 다이클로로메탄 (100 mL)에 팽창하도록 45분 동안 놓아두었다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 90 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 2.35 g, 6.09 mmol), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 2.17 g, 6.09 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (2.12 mL, 12.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 90 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 2.35 g, 6.09 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 2.17 g, 6.09 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (2.12 mL, 12.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하여 중간체 1 을 얻었다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 90 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 1.94 g, 4.57 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.62 g, 4.57 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.43 mL, 8.23 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 90 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 4-[(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)메틸]사이클로헥산카르복실산 (Fmoc-Trx-OH, 1.73 g, 4.57 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.62 g, 4.57 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.43 mL, 8.23 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하여 중간체 2 를 얻었다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 90 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 50 mL), 2-프로판올 (3 x 50 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 30 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (50 mL) 중의 옥타데칸디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C18(OtBu)-OH, 0.85 g, 2.28 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 0.81 g, 2.28 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.72 mL, 4.11 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 50 mL), 다이클로로메탄 (3 x 50 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 50 mL)로 세척하였다. Mtt 기를 다이클로로메탄 중의 80% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올로의 처리 (2 x 10 분, 2 x 30 분, 4 x 50 mL)에 의하여 제거하였다. 수지를 다이클로로메탄 (6 x 50 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (50 mL) 중의 브로모아세트산 (4.24 g, 30.5 mmol) 및 N,N'-다이아이소프로필카르보다이이미드 (DIC, 4.01 mL, 25.9 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 45분 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (5 x 50 mL) 및 다이클로로메탄 (10 x 50 mL)으로 세척하였다. 생성물을 트라이플루오로아세트산 (50 mL)으로 1시간 동안 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 트라이플루오로아세트산 (1 x 25 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 30 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하고 용매를 건고 상태로 증발시켜서 화합물을 걸쭉한 갈색을 띠는 오일로서 얻었다.
수율: 2.18 mg (64%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, dH): 4.72-4.55 (m, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.80-3.62 (m, 12 H); 3.58-3.44 (m, 4 H); 3.32 (t, J=6.8 Hz, 2 H); 3.15 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 2.51-2.07 (m, 8 H); 2.01-1.77 (m, 6 H); 1.72-1.44 (m, 11 H); 1.33 (bs, 24 H); 1.13-0.95 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 96%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.68 분.
LC-MS m/z: 1124.1 (M+H)+.
실시예 4.9: 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00031
합성 과정은 실시예 4.8과 유사하였고, 단 중간체 2 다음의 합성 단계에서 옥타데칸디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C18(OtBu)-OH) 대신 헥사데칸디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C16(OtBu)-OH)를 사용하였다. 생성물을 걸쭉한 갈색을 띠는 오일로서 얻었다.
수율: 2.05 mg (62%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, dH): 4.71-4.55 (m, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.79-3.62 (m, 12 H); 3.58-3.44 (m, 4 H); 3.32 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 3.15 (d, J=6.6 Hz, 2 H); 2.49-2.07 (m, 8 H); 2.01-1.77 (m, 6 H); 1.72-1.44 (m, 11 H); 1.33 (bs, 20 H); 1.13-0.97 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 92%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 3.38 분.
LC-MS m/z: 1096.0 (M+H)+.
실시예 4.10: 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산의 제조
Figure 112017061495692-pct00032
합성 과정은 실시예 4.8과 유사하였고, 단 중간체 1 다음의 합성 단계들에서 먼저 3-카르복시프로판설폰아미드 및 계속해서 10-(4-삼차-부톡시카르보닐페녹시)데칸산을 표준 Fmoc 보호/탈보호 합성 과정을 사용하여 수지에 커플링시켰다. 실시예 4.8에서 예시된 것과 같은 후속되는 합성 단계, 절단 및 워크-업 (work-up)으로 백색 고체를 얻었다.
LC-MS m/z:998.54 (M1+).
UPLC5: 방법 09_B4_1, Rt=8.3004 분 (pH 2.3); 98% 순도.
실시예 4.11: 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산의 제조
Figure 112017061495692-pct00033
합성 과정은 실시예 4.8과 유사하였고, 단 중간체 1 다음의 합성 단계들에서 먼저 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu) 및 계속해서 10-(4-삼차-부톡시카르보닐페녹시)데칸산을 표준 Fmoc 보호/탈보호 합성 과정을 사용하여 수지에 커플링시켰다. 실시예 4.8에서 예시된 것과 같은 후속되는 합성 단계, 절단 및 워크-업으로 백색 고체를 얻었다.
LC-MS m/z: 978,55(M1+) .
UPLC5: 방법 09_B4_1, Rt=7.573 분 (pH 2.3); 99% 순도.
실시예 4.12: 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산의 제조
Figure 112017061495692-pct00034
합성 과정은 실시예 4.8과 유사하였고, 단 중간체 1 다음의 합성 단계들에서 먼저 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu)를 수지에 2회 커플링하였고, 그런 다음 표준 Fmoc 보호/탈보호 합성 과정을 사용하여 20-삼차-부톡시-20-옥소-이코산산 (C20(OtBu)-OH)을 수지에 커플링시켰다. 실시예 4.8에서 예시된 것과 같은 후속되는 합성 단계, 절단 및 워크-업으로 백색 고체를 얻었다.
LC-MS m/z: 1141.2 (M+H)+.
실시예 4.13: 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산의 제조
Figure 112017061495692-pct00035
합성 과정은 실시예 4.8과 유사하였고, 단 중간체 1 다음의 합성 단계들에서 먼저 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu)를 수지에 커플링하였고, 그런 다음 표준 Fmoc 보호/탈보호 합성 과정을 사용하여 20-삼차-부톡시-20-옥소-이코산산 (C20(OtBu)-OH)을 수지에 커플링시켰다. 실시예 4.8에서 예시된 것과 같은 후속되는 합성 단계, 절단 및 워크-업으로 백색 고체를 얻었다.
LC-MS m/z: 1012.0 (M+H)+.
실시예 4.14: (2S,25S)-2-(4-(2-브로모아세트아미도)부틸)-4,13,22-트라이옥소-25-(15-설포펜타데칸아미도)-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21-트라이아자헥사코산디오산의 제조
Figure 112017061495692-pct00036
합성 프로토콜:
Wang Fmoc-Lys(Mtt) 수지 0.26 mmol/g (1, 36.7 g, 9.55 mmol)를 다이클로로메탄 (200 mL) 중에 팽창하도록 45분 동안 놓아두었다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 7.36 g, 19.1 mmol), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 6.79 g, 19.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.66 mL, 38.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 다이클로로메탄 (2 x 150 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 7.36 g, 19.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 6.79 g, 19.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.66 mL, 38.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 다이클로로메탄 (2 x 150mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 6.10 g, 14.3 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 5.09 g, 14.3 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (4.49 mL, 25.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 다이클로로메탄 (2 x 150mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. 수지를 3개의 부분으로 분리하고, 다이메틸 설폭사이드 (80 mL) 중의 나트륨 16-설포-헥사데칸산 (3, 2.28 g, 6.37 mmol), 벤조트리아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP, 3.31 g, 6.37 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (2.22 mL, 12.8 mmol)의 용액을 상기 수지의 한 부분에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드:물 혼합물 (3:1, 3 x 80 mL), N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 80 mL), 다이클로로메탄 (3 x 80 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 80 mL)로 세척하였다. Mtt 기를 다이클로로메탄 중의 80% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올로의 처리 (3 x 10 분, 2 x 30 분, 5 x 80 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 다이클로로메탄 (6 x 80 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (80 mL) 중의 브로모아세트산 (6.64 g, 47.8 mmol) 및 N,N'-다이아이소프로필카르보다이이미드 (DIC, 5.26 mL, 34.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 45분 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (4 x 80 mL) 및 다이클로로메탄 (10 x 80 mL)으로 세척하였다. 생성물을 트라이플루오로아세트산 (100 mL)으로 1시간 동안 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 트라이플루오로아세트산 (1 x 40 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하고 용매를 건고 상태로 증발시켜서 걸쭉한 갈색을 띤 오일을 얻었다. 오일을 물:아세토니트릴 혼합물 (4:1, 25 mL)에 녹이고 용액을 H+ 형태 (50-100 메쉬; 용출액: 물)의 Dowex 50WX4의 칼럼 (7 x 10 cm)을 통해 통과시켰다. 산성 pH의 부분들을 조합하고 냉동-건조시켜서 백색 분말을 얻었다.
수율: 2.17 g (68%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, dH): 4.74-4.56 (m, 2 H); 4.16 (d, J=5.3 Hz, 4 H); 3.95 (s, 2 H); 3.82-3.64 (m, 12 H); 3.61-3.47 (m, 4 H); 3.33 (t, J=6.9 Hz, 2 H); 3.17-3.07 (m, 2 H); 2.54 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.38 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.34-2.09 (m, 2 H); 2.01-1.93 (m, 1 H); 1.93-1.78 (m, 3 H); 1.74-1.57 (m, 4 H); 1.57-1.29 (m, 24 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.86 분.
LC-MS m/z: 1003.9 (M+H)+.
실시예 4.15: 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00037
합성 프로토콜:
Wang Fmoc-Lys(Mtt) 수지 0.26 mmol/g (1, 36.7 g, 9.55 mmol)을 다이클로로메탄 (200 mL) 중에 팽창하도록 45분 동안 놓아두었다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 7.36 g, 19.1 mmol), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 6.79 g, 19.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.66 mL, 38.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 다이클로로메탄 (2 x 150 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 7.36 g, 19.1 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 6.79 g, 19.1 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (6.66 mL, 38.2 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 다이클로로메탄 (2 x 150mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 6.10 g, 14.3 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 5.09 g, 14.3 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (4.49 mL, 25.8 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 150 mL), 다이클로로메탄 (2 x 150mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (150 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 150 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 2-프로판올 (2 x 150 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 150 mL)으로 세척하였다. 수지를 3개의 부분으로 분리하고, N,N-다이메틸포름아미드 (70 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 2.03 g, 4.78 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.70 g, 4.78 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.50 mL, 8.60 mmol)의 용액을 상기 수지 (2)에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하로 N,N-다이메틸포름아미드 (2 x 70 mL), 다이클로로메탄 (2 x 70mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (70 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 30 분, 2 x 70 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 70 mL), 2-프로판올 (2 x 70 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 70 mL)으로 세척하였다. 다이클로로메탄/N,N-다이메틸포름아미드 혼합물 (4:1, 70 mL) 중의 도데칸디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C12(OtBu)-OH, 1.37 g, 4.78 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.70 g, 4.78 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.50 mL, 8.60 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL), 다이클로로메탄 (3 x 150 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 150 mL)로 세척하였다. Mtt 기를 다이클로로메탄 중의 80% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올로의 처리 (3 x 10 분, 2 x 30 분, 4 x 70 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 다이클로로메탄 (6 x 70 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (90 mL) 중의 브로모아세트산 (6.60 g, 47.8 mmol) 및 N,N'-다이아이소프로필카르보다이이미드 (DIC, 5.30 mL, 34.0 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 30분 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (4 x 70 mL) 및 다이클로로메탄 (10 x 70 mL)으로 세척하였다. 생성물을 트라이플루오로아세트산 (100 mL)으로 1시간 동안 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 트라이플루오로아세트산 (1 x 40 mL) 및 다이클로로메탄 (2 x 40 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하고 용매를 건고 상태로 증발시켜서 걸쭉한 갈색을 띤 오일을 얻었다.
수율: 2.94 mg (90%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.74-4.53 (m, 3 H); 4.17 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.81-3.40 (m, 16 H); 3.31 (t, J=6.8 Hz, 2 H); 2.57-2.20 (m, 10 H); 2.16-2.04 (m, 3 H); 1.89-1.75 (m, 1 H); 1.72-1.54 (m, 6 H); 1.52-1.41 (m, 2 H); 1.32 (bs, 12 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 2.64 분.
LC-MS m/z: 1028.0 (M+H)+.
실시예 4.16: 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산의 제조
Figure 112017061495692-pct00038
합성 과정은 실시예 4.8에 대한 것과 유사하였고, 단 중간체 1 다음의 합성 단계들에서 먼저 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu) 및 계속해서 12-삼차-부톡시-12-옥소-도데칸산을 표준 Fmoc 보호/탈보호 합성 과정을 사용하여 수지에 커플링시켰다. 실시예 4.8에서 예시된 것과 같은 후속 합성 단계들, 절단 및 워크-업으로 화합물을 걸쭉한 갈색을 띤 오일로서 얻었다.
수율: 97%
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.73-4.55 (m, 2 H); 4.17 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.80-3.42 (m, 16 H); 3.31 (t, J=6.78 Hz, 2 H); 2.49-2.17 (m, 7 H); 2.01-1.92 (m, 2 H); 1.87-1.76 (m, 1 H); 1.70-1.54 (m, 6 H); 1.52-1.41 (m, 2 H); 1.32 (bs, 12 H).
LC-MS 순도: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 to 100:0 + 0.1% FA): 2.72 분.
LC-MS m/z: 900.0 (M+H)+.
실시예 4.17: 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-20-옥소-이코산산의 제조
Figure 112017061495692-pct00039
합성 프로토콜:
Wang Fmoc-Lys(Mtt) 수지 0.26 mmol/g (1, 11.2 g, 2.90 mmol)를 다이클로로메탄 (100 mL) 중에 팽창하도록 45분 동안 놓아두었다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 100 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 2.23 g, 5.80 mmol), O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 2.06 g, 5.80 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (2.02 mL, 11.6 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 100 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 {2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-에톡시]-에톡시}-아세트산 (Fmoc-OEG-OH, 2.23 g, 5.80 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 2.06 g, 5.80 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (2.02 mL, 11.6 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 100 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-펜탄디오산 1-삼차-부틸 에스테르 (Fmoc-LGlu-OtBu, 1.85 g, 4.35 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.55 g, 4.35 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.36 mL, 7.82 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 1.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 100 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 4-[(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)메틸]사이클로헥산카르복실산 (Fmoc-Trx-OH, 1.65 g, 4.35 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.55 g, 4.35 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.36 mL, 7.82 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. Fmoc 기를 N,N-다이메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘으로의 처리 (1 x 5 분, 1 x 10 분, 1 x 30 분, 3 x 100 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 2-프로판올 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 이코산디오산 모노-삼차-부틸 에스테르 (C20(OtBu)-OH, 1.73 g, 4.35 mmol), O-(6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TCTU, 1.55 g, 4.35 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (1.36 mL, 7.82 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL), 다이클로로메탄 (3 x 90 mL), N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (3 x 90 mL)으로 세척하였다. Mtt 기를 다이클로로메탄 중의 80% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올로의 처리 (2 x 10 분, 2 x 30 분, 4 x 100 mL)에 의해 제거하였다. 수지를 다이클로로메탄 (6 x 90 mL) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (3 x 90 mL)로 세척하였다. N,N-다이메틸포름아미드 (100 mL) 중의 브로모아세트산 (8.06 g, 58.0 mmol) 및 N,N'-다이아이소프로필카르보다이이미드 (DIC, 7.60 mL, 49.3 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 40분 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 N,N-다이메틸포름아미드 (5 x 90 mL) 및 다이클로로메탄 (12 x 90 mL)으로 세척하였다. 생성물을 트라이플루오로아세트산 (100 mL)으로 1시간 동안 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 트라이플루오로아세트산 (1 x 50 mL) 및 다이클로로메탄 (7 x 70 mL)으로 세척하였다. 용액을 조합하고 용매를 건고 상태로 증발시켜서 걸쭉한 갈색을 띤 오일을 얻었다.
수율: 3.28 g (98%).
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, dH): 4.68 (dd, J=8.0 및 5.4 Hz, 1 H); 4.60 (dd, J=7.9 및 5.3 Hz, 1 H); 4.16 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.94 (s, 2 H); 3.81-3.61 (m, 12 H); 3.59-3.44 (m, 4 H); 3.32 (t, J=6.8 Hz, 2 H); 3.14 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 2.49-1.79 (m, 15 H); 1.73-1.43 (m, 11 H); 1.33 (s, 28 H); 1.11-0.96 (m, 2 H).
LC-MS 순도: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, 아세토니트릴/물 20:80 내지 100:0 + 0.1% FA): 4.04 분.
LC-MS m/z: 1151.3 (M+H)+.
실시예 5: FGF21 유도체의 제조
대표적인 FGF21 유도체의 제조를 실시예 5.1 (화합물 21)에 제시한다. 실시예 5.2 내지 5.14 (화합물 11 내지 20 및 22 내지 14)의 FGF21 유도체들을 실시예 5.1에 제시한 방법에 의해 제조한다. 실시예 5.15 내지 5.37의 FGF21 유도체는 실시예 5.1에 제시한 또는 아래에서 기술된 것과 같은 방법에 의해 제조한다.
실시예 5.1: 화합물 21
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00040
이 화합물은 SEQ ID NO:10의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
화합물 21을 다음과 같이 제조하였다:
실시예 1 내지 3에서 일반적으로 기술한 것과 같이 제조한, SEQ ID NO:10의 S{베타-181}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 유사체의 위치 181에 있는 Cys 잔기를 실시예 4.1에서 제조된 시약으로 위치 181C에 있는 Cys 잔기의 티올 잔기에서 변형시켰다:
Figure 112017061495692-pct00041
Tris 및 NaCl-완충액 (1.35 mg/ml) 중의 시스테아민 보호된 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (70 mg, 0.0036 mmol)에 물 중의 트리스를 첨가하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 물에 녹인 BSPP (Bis(p-설포네이토페닐)페닐포스핀 2수화물 2칼륨 염, 12 mg)를 첨가하고 4시간 동안 실온에서 부드럽게 교반하였다. 에탄올 (0.5 ml) 중의 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸-카바모일]-메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}펜타데칸산 (19 mg, 0.022 mmol)을 첨가하였다. 그것을 부드럽게 밤새 교반한 후, MiliQ 물 (150 ml)을 첨가하여 전도성을 2.5 mS/cm로 낮추었다. 혼합물을 MonoQ 10/100 GL 칼럼 상에서 음이온 교환을 사용하여 A-완충액: 20 mM Tris, pH 8.0; B-완충액: 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0, 흐름 6 ml 및 60 CV 상에서의 0 내지 80% B의 구배를 사용하여 정제하였다. 수율: 37 mg, 51%.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20279.9: 실측치: 20280.4
실시예 5.2: 화합물 11
S{베타-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21
Figure 112017061495692-pct00042
이 화합물은 실시예 4.1의 시약 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}펜타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:6의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2
이론적 질량: 20279.9; 실측치: 20280.2
실시예 5.3: 화합물 12
S{베타-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21
Figure 112017061495692-pct00043
이 화합물은 실시예 4.1의 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}펜타데칸산의 시약을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:6의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20203.8; 실측치: 20204.2
실시예 5.4: 화합물 13
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00044
이 화합물은 실시예 4.2의 시약 11-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)-에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}운데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2
이론적 질량: 20239.8; 실측치: 20240.1
실시예 5.5: 화합물 14
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00045
이 화합물은 실시예 4.3의 시약 13-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}트라이데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3:
이론적 질량: 20267.8; 실측치: 20268.1
실시예 5.6: 화합물 15
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00046
이 화합물은 실시예 4.1의 시약 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}펜타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20295.9; 실측치: 20296.2
실시예 5.7: 화합물 16
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00047
이 화합물은 실시예 4.5의 시약 17-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}헵타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20323.9; 실측치: 20324.5
실시예 5.8: 화합물 17
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00048
이 화합물은 실시예 4.4의 시약 19-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)-에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}노나데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20352.0; 실측치: 20352.0
실시예 5.9: 화합물 18
S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00049
이 화합물은 실시예 4.5의 시약 17-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}헵타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:9의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20236.8; 실측치: 20237.0
실시예 5.10: 화합물 19
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00050
이 화합물은 실시예 4.2의 시약 11-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}운데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:1의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20223.8; 실측치: 20224.4.
실시예 5.11: 화합물 20
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00051
이 화합물은 실시예 4.3의 시약 13-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸-카바모일]메톡시}-에톡시)에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}트라이데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:10의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20251.8; 실측치: 20252.2
실시예 5.12: 화합물 22
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00052
이 화합물은 실시예 4.5의 시약 17-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}-에톡시)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]프로필카바모일}헵타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:10의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20307.9; 실측치: 20308.6.
실시예 5.13: 화합물 23
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00053
이 화합물은 실시예 4.4의 시약 19-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸-카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}노나데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:10의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 2:
이론적 질량: 20336.0; 실측치: 20336.2
실시예 5.14 : 화합물 24
S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Met[Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00054
이 화합물은 실시예 4.5의 시약 17-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}헵타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:11의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3:
이론적 질량: 20372.2; 실측치: 20372.2.
실시예 5.15: 화합물 34
S{베타-168}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Cys168]FGF21
Figure 112017061495692-pct00055
이 화합물은 실시예 4.3의 시약 13-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}트라이데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:13의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 1
이론적 질량: 20225.; 실측치: 20226.7
실시예 5.16: 화합물 35
S{베타-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21
Figure 112017061495692-pct00056
이 화합물은 실시예 4.1의 시약 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}펜타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:14의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20267.8; 실측치: 20268.2
실시예 5.17: 화합물 36
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21
Figure 112017061495692-pct00057
이 화합물은 실시예 4.5의 시약 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:15의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.18: 화합물 37
S{베타-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21
Figure 112017061495692-pct00058
이 화합물은 실시예 4.1의 시약 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}펜타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:18의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20238.8; 실측치: 20239.3
실시예 5.19: 화합물 38
S{베타-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure 112017061495692-pct00059
이 화합물은 실시예 4.3의 시약 13-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}트리타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:19의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 1
이론적 질량: 20281.9; 실측치: 20281.9
실시예 5.20: 화합물 39
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure 112017061495692-pct00060
이 화합물은 실시예 4.5의 시약 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:19의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.21: 화합물 40
16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-16-옥소-헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure 112017061495692-pct00061
이 화합물은 실시예 4.1의 시약 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-16-옥소-헥사데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:19의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.22: 화합물 41
S{베타-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21
Figure 112017061495692-pct00062
이 화합물은 실시예 4.1의 시약 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}펜타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:20의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20210.8; 실측치: 20211.4
실시예 5.23: 화합물 42
S{베타-176}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys176]FGF21
Figure 112017061495692-pct00063
이 화합물은 실시에 4.1의 시약 15-{(S)-1-카르복시-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-브로모아세틸아미노)에틸카바모일]메톡시}에톡시)-에틸카바모일]메톡시}에톡시)에틸카바모일]-프로필카바모일}펜타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:4의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
LCMS 방법 3
이론적 질량: 20279.9; 실측치: 20280.4
실시예 5.24: 화합물 43
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00064
이 화합물은 실시예 4.11의 시약 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.25 : 화합물 44
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00065
이 화합물은 실시예 4.10의 시약 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.26 : 화합물 45
20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00066
이 화합물은 실시예 4.12의 시약 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.27 : 화합물 46
20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00067
이 화합물은 실시예 4.13의 시약 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.28: 화합물 47
(2S)-6-아세트아미도-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(16-설포헥사데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00068
이 화합물은 실시예 4.14의 시약 (2S)-6-[(2-브로모아세틸)아미노]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(16-설포헥사데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥산산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.29: 화합물 48
12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00069
이 화합물은 실시예 4.16의 시약 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.30: 화합물 49
12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00070
이 화합물은 실시예 4.15의 시약 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.31: 화합물 50
20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-아세트아미도]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-20-옥소-이코산산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00071
이 화합물은 실시예 4.17의 시약 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-20-옥소-이코산산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.32: 화합물 51
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00072
이 화합물은 실시예 4.7의 시약 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.33: 화합물 52
16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-아세트아미도]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00073
이 화합물은 실시예 4.9의 시약 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.34: 화합물 53
18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-아세트아미도]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-18-옥소-옥타데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00074
이 화합물은 실시예 4.8의 시약 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-18-옥소-옥타데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.35: 화합물 54
12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-12-옥소-도데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure 112017061495692-pct00075
이 화합물은 실시예 4.6의 시약 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-브로모아세틸)아미노]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-12-옥소-도데칸산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:8의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.36: 화합물 55
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00076
이 화합물은 실시예 4.11의 시약 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:10의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
실시예 5.37: 화합물 56
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure 112017061495692-pct00077
이 화합물은 실시예 4.10의 시약 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-브로모아세틸)아미노]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산을 사용하여 실시예 5.1에서 기술된 방법에 의해 제조된 SEQ ID NO:10의 FGF21 유사체 (실시예 3 참조)의 유도체이다.
약물학적 방법들
포유류 (예컨대 인간)에서 체중 증가의 감소 및 비만과 당뇨병의 치료에서 본 발명의 FGF21 유사체 또는 그것의 유도체의 제약학적 활성 성분들로서의 활용성은 종래의 분석 및 아래에서 기술되는 시험관 내 및 생체내 분석에서 FGF21 아고니스트의 활성에 의해 측정될 수 있다.
그런 분석들은 또한 그로 인해 본 발명의 FGF21 화합물들의 활성이 공지된 화합물들의 활성과 비교될 수 있는 수단을 제공한다.
실시예 6: 인간 BKL을 과잉발현하는 HEK293에서 Erk 인산화 분석에서 FGF 수용체 효능
이 실시예의 목적은 시험관 내에서 FGF21 유도체의 활성 또는 효능을 시험하는 것이다. 시험관 내 효능은 전체 세포 분석에서 FGF 수용체 활성화의 척도이다.
실시예 5의 FGF21 유도체의 효능을 아래에서 한층 더 기술하는 것과 같이 인간 베타-클로토 (BKL)를 과잉발현하는 HEK (인간 배아 신장 세포)에서 측정하였다.
FGF21 유도체의 알부민에 대한 결합을 시험하기 위하여, 분석을 인간 혈청 알부민 (HSA)의 존재하에서 (0.1% 최종 분석 농도)뿐 아니라 혈청 알부민의 부재하에서도 수행하였다. FGF21 유도체에 대한 혈청 알부민의 존재하에서의 EC50 값의 증가 (효능의 감소)는 혈청 알부민에 대한 결합을 나타낼 것이고 동물 모델에서 시험 물질의 장기화된 약물동역학적 프로파일을 예측하는 방법을 나타낼 것이다.
FGF21 유사체에 대한 결과는 표 2에 나타내며 FGF21 유도체에 대한 결과는 표 3에 나타낸다. MetFGF21 (SEQ ID NO:2)는 참조로 포함된다.
분석 원리
HEK293 세포는 FGFR1c, FGFR3c 및 FGFR4를 포함하여 여러 FGF 수용체를 내생적으로 발현한다. 이들 세포는 공-수용체 베타-클로토 (BKL)로 트랜스펙션될 때까지는 FGF21에 반응하지 않는다. FGF 수용체/BKL 복합체의 활성화는 MAPK/ERK 신호화 경로의 활성화 및 ERK의 인산화를 유도한다. 주어진 시점에서 인산화된 ERK (pERK)의 수준은 FGF21의 농도 증가와 함께 증가한다. 아래에서 기술되는 것과 같이 pERK의 수준은 일정 농도 범위의 FGF21 유사체로 자극되고 12분 후에 측정된다.
분석 설명
HEK293/베타-클로토 세포를 10% FCS (Gibco #16140-071), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco #15140), 100 μg/ml 하이그로마이신 B (Calbiochem, #400052)가 첨가된 DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1) 중의 96 웰 플레이트에 30,000 세포/웰로 시딩한다. 2일 후 화합물을 첨가하기 2시간 전에 세포 배지를 100 μl의 기준 배지 (DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1))로 교환한다. FGF21 유사체를 분석 배지 (0.02% Tween20이 첨가된 DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1)로 희석하고, 37℃로 가온하고, 세포에 첨가한 후 (100 μl) 37℃에서 12분 동안 인큐베이션한다. FGF21 유도체를 또한 0.1% HSA (Sigma - A1887)의 존재하에 시험하였다. 모든 배지를 빠르게 제거하고 웰당 50 μl의 용해 완충액을 첨가한다. 플레이트를 5분 동안 흔들면 용해물은 pERKDML 측정에 대해 준비가 된다. pERK를 384 웰 플레이트에서 AlphaScreen SureFire 키트 (PMerkinElmer #TGRES10K)로 측정한다. 이 키트는 도너 및 수령체 비드에 커플링된 ERK 및 pERK 특이적 항체를 기반으로 한다. pERK의 존재는 수령체와 도너 비드가 밀접하게 매우 가까워지도록 할 것이고 EnVision 상에서 판독되는 신호가 생성된다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 분석하고 FGF21 단백질의 효능은 절대 EC50 값으로서 기술한다.
Figure 112017061495692-pct00078
표 2에서 알 수 있는 것과 같이, 위치 176, 177, 178 또는 179에서 시스테인의 도입은 MetFGF21과 비교하여 효능을 극적으로 감소시킨다. 그러나, 놀랍게도 위치 180 또는 위치 181에서의 시스테인의 도입은 MetFGF21과 비교하여 없거나 (180C) 또는 중간 정도 (181C)의 효능 감소를 유발한다. 위치 180에 시스테인이 있는 화합물 7은 MetFGF21 및 위치 180에서의 시스테인을 제외하면 화합물 8과 동일한 아미노산 변화를 가진 화합물 2 둘 다와 유사한 효능을 나타낸다.
위치 181에 시스테인을 가진 화합물 9의 효능은 MetFGF21 및 또한 위치 181에서의 시스테인을 제외하면 화합물 9와 동일한 아미노산 변화를 가진 화합물 2와 비교하여 단지 약간 감소된다.
Figure 112017061495692-pct00079
Figure 112017061495692-pct00080
C168 아미노산 치환을 가진 화합물 #26은 감소된 효능을 나타낸 한편, 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 및 175에 시스테인을 가진 유사체들은 놀랍게도 MetFGF21에 유사한 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
Figure 112022041241785-pct00142
표 3A의 결과로부터 알 수 있는 것과 같이, 놀랍게도 위치 17 내지 181의 어느 곳에서 시스테인에 대한 본 발명의 측쇄의 부착은 측쇄가 없는 화합물 (표 2 참조)과 비교하여 효능의 감소를 유도하지 않는 것이 발견되었다. 화합물 11, 12, 15 및 21은 모두 프로트랙터 엘레먼트가 C16 2산 (Chem. 1a)인 동일한 측쇄를 포함한다 (링커 엘레먼트는 하나의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3a 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4a 엘레먼트이다). 상응하는 FGF21 유사체들 (화합물 5, 6, 7 및 9, 표 2 참조)의 효능과 비교할 때, 이들 FGF21 유도체들의 효능은 상응하는 FGF 유사체들 (즉 측쇄가 없는 것들)과 유사한 것을 알 수 있다.
다양한 지방산 사슬 길이의 프로트랙터 엘레먼트를 가지는 화합물들의 효능에 대한 효과를 또한 탐색하였다. 위치 180에 시스테인을 가진 FGF 유도체들의 효능은 HSA가 없을 때 프로트랙터 엘레먼트로서 C12 2산, C14 2산, C16 2산 또는 C18 2산을 가지는 FGF21 유도체와 유사하였다. 위치 181에 시스테인을 가진 FGF 유도체들의 효능은 HSA가 없을 때 프로트랙터 엘레먼트로서 C14 2산, C16 2산, C18 2산 또는 C20 2산을 가지는 FGF21 유도체와 유사하였다.
HSA 농도를 증가시키는 것은 C12, C14 또는 C16 측쇄를 포함하는 유도체들의 효능에 영향을 미치지 않거나 중간 정도로 영향을 미친 한편, C18 또는 C20 측쇄를 가진 화합물들의 효능은 0.1% HSA의 존재하에 감소된 효능을 나타낸다.
표 3A로부터 알 수 있는 것과 같이, 0.1% 혈청 알부민의 존재하에 EC50 값의 증가는 FGF21 유도체에 대한 혈청 알부민이 없을 때의 EC50 값과 비교하여 프로트랙터의 증가하는 길이와 상응한다. 이것은 이들 FGF21 유도체에 대한 증가된 반감기와 잘 부합한다 (실시예 8 참조).
Figure 112017061495692-pct00082
Figure 112017061495692-pct00083
상기에서 기술한 것과 같이 상이한 FGF21 골격을 가지는 FGF21 유도체들의 효능을 추가로 시험하였고 위치 169, 170, 171, 172, 173, 174 및 175에 시스테인을 가진 유도체들은 모두 지방산 프로트랙터로 유도체화될 때 효능을 유지하는 것이 발견되었다. Cys 169에서의 유도체화는 효능이 약간 감소하는 것이 주지된다.
Figure 112017061495692-pct00084
추가의 장기간 엘레먼트를 비교하기 위하여, 프로트랙터와 링커의 상이한 조합을 시험하였다. 모두 Cys 180 또는 Cys 181에 컨쥬게이트되었고 얻어진 FGF21 유도체들의 꽤 유사한 기능성이 관찰되었는데 그것은 FGF21 Cys, 예컨대 Cys 180 또는 Cys 181에 컨쥬게이트되었을 때 다양한 프로트랙터 엘레먼트가 사용될 수 있는 것을 증명한다.
실시예 7: 3T3 -L1 지방세포에서 글루코오스 흡수
C-말단 변형된 유사체들을 3T3-L1 마우스 지방세포에서의 글루코오스 흡수를 증가시키는 능력에 대해 시험하였다. 다음의 분석을 본 발명의 FGF21 유사체 및 유도체들의 생물학적 활성 또는 효능을 측정하기 위해 사용하였다.
분석 원리
시험관 내 효능을 또한 3T3-L1 지방세포를 사용한 분석으로 지방세포로 글루코오스 흡수를 증가시키는 능력에 대해 FGF21 유사체들을 시험함으로써 측정하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포들은 FGFR1c 및 BKL을 내생적으로 발현한다. 3T3-L1 세포는 분화된 후까지는 FGF21에 반응하지 않는데 분화가 공-수용체 BKL의 발현을 유도하기 때문이다. FGFR1 수용체/BKL 복합체의 활성화는 글루코오스 트랜스포터 1 (GLUT1)의 발현을 증가시키고 따라서 FGF21 아고니스트는 용량 반응 방식으로 지방세포 안으로 흡수되는 글루코오스의 양의 증가를 유도할 것이다.
분석 설명
마우스 3T3-L1 섬유아세포 (예컨대 ATCC로부터 카탈로그 번호 CL-173으로 입수 가능함)를 기준 배지 (10% 우태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (4500 mg/l 글루코오스))에서 유지시켰다. 세포는 집밀도에 이르도록 허용하지 않았고 대략 60%의 집밀도 (육안 검사에 의함)에 도달하기 전에 통과되어야 한다 (새로운 바이알로 옮김).
글루코오스 흡수 분석을 위해, 세포를 96 웰 플레이트 (BIOCOAT)에 15,000 세포/웰로 두고, 세포가 집밀도 (고밀도, 만들어진 분화된 지방세포를 가지는 것으로 보임)에 도달했을 때, 배지를 기준 배지로부터 트로글리타존, IBMX, 덱사메타손 (예컨대 Sigma로부터 상업적으로 입수 가능함) 및 인간 인슐린 (예컨대 Novo Nordisk A/S로부터 상업적으로 입수 가능한 형태)을 함유한 기준 배지로 바꿨다. 세포를 분화 개시 후 7 내지 9일에 사용하였다. 세포를 증가하는 농도 (0 내지 300 nM)의 본 발명의 FGF21 유사체 또는 유도체로 20시간 동안 기준 배지에서 자극하였다. 3H-데옥시-글루코오스 (이하: 트레이서)를 첨가하기 전에 세포를 따뜻한 (대략 37℃) 분석 완충액 (1 mM MgCl2 및 2 mM CaCl2가 첨가된 PBS), HEPES 및 0.1% 인간 혈청 알부민)으로 세척하고 세포를 트레이서와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션을 빙냉 분석 완충액으로 2회 세척함으로써 종결시켰다. 세포를 트리톤 X-100으로 용해시키고 용해물을 96 웰 플레이트에 옮기고, microscint-40 (예컨대 Perkin Elmer로부터 상업적으로 입수 가능함)을 첨가하고 트레이서의 양을 TOP-카운터 (예컨대 Perkin Elmer로부터의 Packard 탑-카운터)에서 카운팅하였다. 의문의 FGF21 화합물의 EC50 및 Emax를 계산하였다. 아래의 표 4 내지 5에 나타낸 결과들은 각각 FGF21 유사체 및 유도체들의 EC50 (효능) 및 Emax (효능)을 나타낸다.
FGF21 유사체의 3T3-L1 지방세포에서의 글루코오스 흡수
화합물 화합물 명칭 글루코오스 흡수 EC50 (nM) 글루코오스 흡수 Emax (%)
1 MetFGF21 1.2 100
2 Ala[Gln121,Leu168]FGF21 3.1 85
3 S{베타-176}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys176]FGF21 73 84
4 Ala[Gln121,Leu168,Cys177]FGF21 ND ND
5 S{베타-178}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21 50 69
6 S{베타-179}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21 25 77
7 S{베타-180}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 2.6 102
8 S{베타-180}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys180, des181]FGF21 73 72
9 S{베타-181}-2-아미노에틸설파닐-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 5.0 74
FGF21 유도체의 3T3-L1 지방세포에서의 글루코오스 흡수
화합물 단백질 골격 프로트랙터 엘레먼트 글루코오스 흡수 EC50 (nM) 글루코오스 흡수 Emax ( % )
11 Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21 C16 2산 186 59
12 Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21 C16 2산 107 54
13 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C12 2산 2.7 87
14 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C14 2산 6.7 106
15 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C16 2산 9.1 98
16 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C18 2산 32 109
17 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C20 2산 24 53
18 Ala[Gln121,Leu168,Cys180, des181]FGF21 C18 2산 8 71
19 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C12 2산 ND ND
20 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C14 2산 7.2 55
21 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C16 2산 31 61
22 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C18 2산 56 73
23 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C20 2산 410 57
24 Met[Cys181]FGF21 C18 2산 37 -
알부민에 대한 FGF21 유도체의 측쇄의 결합으로 인해, FGF21 유도체 (표 5)는 기준 분석 배지에서 혈청의 존재 및 그로써 알부민의 존재로 인해 상응하는 FGF21 유사체 (표 4)보다 낮은 효능을 가진다. 효능의 감소는 프로트랙터 엘레먼트의 길이와 상관된다.
실시예 8: 미니 피그 및 마우스에서의 약물동역학적 연구
이 연구의 목적은 미니 피그 및 마우스에 정맥 내 투여 후, 즉 신체에서의 거주 시간의 연장 및 그로써 작용 시간의 연장 후 FGF21 유도체의 생체 내 프로트랙션을 측정하는 것이었다. 이것을 약물동역학적 (PK) 연구로 수행하였는데, 이 연구에서 의문의 유사체의 말단 반감기를 측정하였다. 말단 반감기는 말단 제거 상에서 특정 혈장 농도를 절반으로 하는 데 걸리는 시간을 의미한다.
미니 피그에서의 연구
암컷 괴팅겐 미니 피그를 Ellegaard Gottingen 분ipigs (Dalmose, Denmark)로부터 얻었는데, 대략 7 내지 14개월의 체중이 대략 16 내지 35 kg인 미니 피그를 연구에 사용하였다. 미니 피그를 개별적으로 (영구 카테테르가 삽입된 피그들) 또는 그룹으로 하우징하였고 하루에 1회 또는 2회 SDS 미니 피그 다이어트식 (Special Diets Services, Essex, UK)으로 사료를 제한하여 공급하였다.
적응 후 적어도 2주 후에 각 동물에 2개의 영구적인 중추 정맥 카테테르를 후대 정맥에 또는 상대 정맥에 이식하였다. 동물들을 수술 후 1주 동안 회복되도록 허용한 후, 연속적인 투약 사이에 적당한 세척 (wash-out) 주기를 넣은 반복적인 약물동역학적 연구에 사용하였다.
화합물의 정맥 내 주사 (실시예에 상응하는 부피 0.050 내지 0.125 ml/kg)를 한 카테테르를 통해 또는 벤플론을 통해 제공하고, 혈액을 투약 후 11일이 될 때까지 정해진 시점에 샘플로 채혈하였다 (바람직하게는 다른 카테테르를 통해 또는 정맥 천자에 의해). 혈액 샘플 (실시예에 대해 0.8 ml)을 EDTA (8 mM) 코팅된 튜브에 수집한 후 4℃에서 1942G에서 10분 동안 원심분리하였다. 혈액 샘플을 수집하여 API의 전체 혈장 농도-시간 프로파일을 적절하게 커버하였다. 실시예에서 혈액 샘플을 t = 투여 전, 투여 후 0.0833, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 시간에 수집하였다.
혈장을 드라이아이스 상의 Micronic 튜브에 피펫팅하여 넣고, ELISA를 사용하여 각각의 FGF-1 유사체의 혈장 농도에 대해 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 개별적인 혈장 농도-시간 프로파일을 비-구획 약물동역학적 방법에 의해 Phoenix v. 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)에서, 또는 PK 분석에 대한 다른 관련 소프트웨어로 분석하고, 그 결과의 말단 반감기 (조화 평균)를 측정하였다. FGF21 유도체의 말단 반감기는 상기에서 설명된 것과 같이, 상이한 단위용량을 사용한 2회 측정의 산술 평균이다.
마우스에서의 연구
FGF21 유사체의 약물동역학적 프로파일을 정상 린 C57b1 마우스, n = 2 내지 3 (대략 30 그램)에서 시험하였다. FGF21 화합물을 20 mg/kg (대략 5 ml/kg)의 단일 정맥 내 용량으로서 투여하였다.
FGF21 화합물의 혈장 수준을 섬유아세포 성장 인자-21 인간 ELISA (BioVendor로부터 입수 가능함, 카탈로그 번호 RD191108200R)를 사용하여 측정하였다. Pharsight Corportion, Cary N.C.로부터의 PC 기반 소프트웨어, WinNonKin 버전 6.3을 약물동역학적 계산에 사용하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
FGF21 유사체의 약물동역학적 프로파일
화합물 단백질 골격 프로트랙터 엘레먼트 반감기
마우스 (시간) 		반감기
미니 피그 (시간)
1 MetFGF21 - 1 2
13 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C12 2산 1 ND
14 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C14 2산 1 3
15 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C16 2산 3 23
16 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C18 2산 12 70
17 Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 C20 2산 ND ND
18 Ala[Gln121,Leu168,Cys180, des181]FGF21 C18 2산 ND ND
19 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C12 2산 1
20 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C14 2산 3 2
21 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C16 2산 4 25
22 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C18 2산 14 85
23 Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 C20 2산 19 ND
24 Met[Cys181]FGF21 C18 2산 12 ND
표 6으로부터 알 수 있는 것과 같이, 미니 피그 및 마우스 둘 다에서 프로트랙터 엘레먼트의 지방산 사슬의 길이에 따라 혈장 반감기가 증가한다.
실시예 9: 린 마우스에서 체중 감소
FGF21 유도체의 생체 내 효능을 측정하기 위하여, 체중에 미치는 효과를 피라 (s.c.) 투여 후 린 C57BL 마우스에서 연구하였다. 린 마우스에서 FGF21에 의한 중량 손실은 비만 마우스에서의 효과를 예견하고 따라서 린 마우스는 양호한 스크리닝 모델로 여겨지는 것으로 앞서 드러났다.
화합물을 10mM 포스페이트, 2% (w/vol) 글리세롤, 500ppm (=0.05%) 폴리소르베이트 80, pH=8.15에 넣어 (2 ml/kg) 7일 동안 하루에 1회 (QD) 또는 2회 (BID) 1 mg/kg으로 s.c. 투여하였다 (n=7 내지 8). 각각의 비히클 처리된 군 (대조표준)을 10mM 포스페이트, 2% (w/vol) glycerol, 500ppm (=0.05%) polysorbate 80, pH=8.15, (2 ml/kg)로, 7일 동안 하루에 2회 s.c. 처리하였다 (n=6내지 8). 체중을 투약 전 및 처리 후 7일에 다시 측정하였다. 그 결과를 표 7에서 볼 수 있다.
1일 내지 7일까지 기준선으로부터 체중의 변화 (백분율)
화합물 투약 n/군 평균
△ 체중 (%)		 SD
△ 체중 (%)
비히클 BID 8 2.84 2.65
1 BID 8 -1,88** 2.52
2 BID 8 -1,98** 3.33
14 QD 8 1.85 3.33
15 QD 8 -4,48*** 2.41
16 QD 8 -10,59*** 3.39
21 QD 8 0.18 2.12
비히클 BID 6 0.44 3.27
13 BID 8 -2.04 1.30
14 BID 8 -3.09* 1.61
19 BID 7 0.04 1.11
20 BID 8 -0.94 2.94
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 화합물 대 각각의 비히클을 비교하는 일원 변량 분석 hoc Dunnet 시험, n=6 내지 8.
위치 180에서 측쇄를 가지는 FGF21 유도체의 체중의 손실로서 측정된 생체 내 효능은 위치 181에서 동일한 측쇄를 가지는 유도체보다 높다. 그러므로 생체 내 효능은 시험관 내 효능과 상관된다. 체중 감소에 미치는 효과는 혈장 반감기에 의존적이다. 만약 혈장 반감기가 짧다면 하루에 2회 투약이 효능을 증가시킨다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에서 예시되고 기술된 한편으로, 많은 변형, 치환, 변화 및 동등물이 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 일어날 것이다. 그러므로, 첨부된 청구범위는 그런 모든 변형 및 변화를 발명의 진정한 사상에 속하는 것으로서 포함하는 것으로 의도된 것이 인지되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> FGF21 derivatives and uses thereof <130> 140109WO01 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 1 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 2 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 2 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 3 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 3 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 4 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 4 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Cys Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 5 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 5 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Cys Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 6 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 6 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Cys Tyr Ala Ser 180 <210> 7 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 7 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Cys Ala Ser 180 <210> 8 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 8 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Cys Ser 180 <210> 9 <211> 181 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 9 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Cys 180 <210> 10 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 10 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Cys 180 <210> 11 <211> 182 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 11 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Cys 180 <210> 12 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 12 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Cys Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 13 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 13 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Cys Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 14 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 14 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Cys Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 15 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 15 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Cys Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 16 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 16 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Cys Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 17 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 17 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Cys Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 18 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 18 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Cys Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 19 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 19 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Cys Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 20 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial protein based on mature human FGF21 <400> 20 Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Gln Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Leu Val Gly Pro Ser Gln Gly Cys 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180

Claims (18)

  1. FGF21 단백질의 유도체, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염, 또는 아미드로써,
    상기 단백질은 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하며,
    상기 유도체는 링커를 통해 상기 Cys 잔기에 부착된 프로트랙터를 포함하고;
    프로트랙터는 다음:
    Chem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
    Chem. 1B: HOOC-벤젠-O-(CH2)x-CO-* 및
    Chem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*의 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 8 내지 18의 범위의 정수이고;
    링커는 Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4의 각각의 적어도 하나를 포함하며:
    Chem. 2는
    *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
    *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-* 및
    *-NH-(CH2)m-사이클로헥산-CO-*로부터 선택되고, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이며,
    Chem. 3은 *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*이고, 여기서 k는 1 내지 5의 범위의 정수이며, n은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
    Chem. 4는
    *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* 및
    *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*로부터 선택되며, 여기서 m은 1 내지 5의 범위의 정수이고,
    Chem. 2, Chem. 3 및 Chem. 4는 아미드 결합을 통해 상호연결되며 표시된 순서대로, 그것의 *-NH 단부에서 프로트랙터의 CO-* 단부에 연결되고, 그것의 CH2-* 단부에서 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간의 위치 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 위치 181에 상응하는 위치에 있는 Cys 잔기의 황 원자에 연결되고,
    상기 단백질은 121Q 및 168L 중 어느 하나 이상을 포함하는 유도체.
  2. 제1 항에 있어서, Chem. 1은
    Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
    Chem. 1b: HOOC-벤젠-O-(CH2)9-CO-* 및
    Chem. 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유도체.
  3. 제1 항에 있어서, Chem. 2는
    Chem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
    Chem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* 및
    Chem. 2c: *-NH-CH2-사이클로헥산-CO-*의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유도체.
  4. 제1 항에 있어서, Chem. 4는
    Chem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* 및
    Chem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유도체.
  5. 제1 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21의 위치 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 또는 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21의 위치 180 또는 181에 상응하는 위치에서 Cys 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  7. 제1 항에 있어서, 단백질은 SEQ ID NO:1의 성숙한 인간 FGF21의 N-말단에 상응하는 위치에서 Ala 잔기의 첨가를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  8. 제1 항에 있어서, 단백질은 121Q 또는 168L 또는 둘 다를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  9. 제1 항에 있어서, 단백질은 SEQ ID NO: 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유도체.
  10. 제1 항에 있어서, 단백질은 SEQ D NO: 8 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  11. 제1 항에 있어서, 프로트랙터는 Chem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  12. 제1 항에 있어서, 링커는
    Chem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
    Chem. 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-* 및
    Chem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
  13. 제1 항에 있어서, 링커는 하나의 Chem. 2 엘레먼트, 2개의 Chem. 3 엘레먼트 및 하나의 Chem. 4 엘레먼트로 구성되는 것을 특징으로 하는 유도체.
  14. 제1 항에 있어서, 유도체는 다음 중 하나인 것을 특징으로 하는 유도체:
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 13)
    Figure 112022041241785-pct00097
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 14)
    Figure 112022041241785-pct00098
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 15)
    Figure 112022041241785-pct00099
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 16)
    Figure 112022041241785-pct00100
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 17)
    Figure 112022041241785-pct00101
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (화합물 18)
    Figure 112022041241785-pct00102
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 19)
    Figure 112022041241785-pct00103
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 20)
    Figure 112022041241785-pct00104
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 21)
    Figure 112022041241785-pct00105
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 22)
    Figure 112022041241785-pct00106
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 23)
    Figure 112022041241785-pct00107
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Met[Cys181]FGF21 (화합물 24)
    Figure 112022041241785-pct00108
    ;
    S{베타-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21 (화합물 35)
    Figure 112022041241785-pct00109
    ;
    18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21 (화합물 36)
    Figure 112022041241785-pct00110
    ;
    S{베타-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21 (화합물 37)
    Figure 112022041241785-pct00111
    ;
    S{베타-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (화합물 38)
    Figure 112022041241785-pct00112
    ;
    18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-18-옥소-옥타데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (화합물 39)
    Figure 112022041241785-pct00113
    ;
    16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-16-옥소-헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (화합물 40)
    Figure 112022041241785-pct00114
    ;
    S{베타-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21 (화합물 41)
    Figure 112022041241785-pct00115
    ;
    4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 43)
    Figure 112022041241785-pct00116
    ;
    4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 44)
    Figure 112022041241785-pct00117
    ;
    20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 45)
    Figure 112022041241785-pct00118
    ;
    20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코산산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 46)
    Figure 112022041241785-pct00119
    ;
    (2S)-6-아세트아미도-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(16-설포헥사데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 47)
    Figure 112022041241785-pct00120
    ;
    12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 48)
    Figure 112022041241785-pct00121
    ;
    12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-12-옥소-도데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 49)
    Figure 112022041241785-pct00122
    ;
    20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-아세트아미도]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-20-옥소-이코산산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 50)
    Figure 112022041241785-pct00123
    ;
    16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 51)
    Figure 112022041241785-pct00124
    ;
    16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-아세트아미도]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-16-옥소-헥사데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 52)
    Figure 112022041241785-pct00125
    ;
    18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-아세트아미도]-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-18-옥소-옥타데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 53)
    Figure 112022041241785-pct00126
    ;
    12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세트아미도에틸아미노)-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]카바모일]사이클로헥실]메틸아미노]-12-옥소-도데칸산-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 54)
    Figure 112022041241785-pct00127
    ;
    4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-카르복시-4-옥소-부틸]아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 55)
    Figure 112022041241785-pct00128
    ;
    4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-아세트아미도-1-카르복시-펜틸]아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부틸]설포닐아미노]-10-옥소-데콕시]벤조산-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 56)
    Figure 112022041241785-pct00129
    .
  15. 제1 항에 있어서, 상기 FGF21 단백질의 유도체는 다음 중 하나인 유도체:
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 13)
    Figure 112022041241785-pct00130
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 14)
    Figure 112022041241785-pct00131
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 15)
    Figure 112022041241785-pct00132
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 16)
    Figure 112022041241785-pct00133
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 17)
    Figure 112022041241785-pct00134
    ;
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (화합물 18)
    Figure 112022041241785-pct00135
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(11-카르복시운데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 19)
    Figure 112022041241785-pct00136
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(13-카르복시트라이데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 20)
    Figure 112022041241785-pct00137
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 21)
    Figure 112022041241785-pct00138
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 22)
    Figure 112022041241785-pct00139
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (화합물 23)
    Figure 112022041241785-pct00140
    ;
    S{베타-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Met[Cys181]FGF21 (화합물 24)
    Figure 112022041241785-pct00141
    .
  16. 제1 항에 있어서, 상기 FGF21 단백질의 유도체는:
    S{베타-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일-아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-에틸아미노]-2-옥소에틸]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (화합물 16)
    Figure 112022041241785-pct00143

    인 것을 특징으로 하는 유도체.
  17. 의약으로서 사용하기 위한, 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 따르는 유도체.
  18. 당뇨병, 비만, 섭식 장애, 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 위한; 당뇨병 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한; 또는 간 지방증 및 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한, 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 따르는 유도체를 포함하는 약학적 조성물.
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