ES2742503T3 - Derivados de FGF21 y sus usos - Google Patents

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Kristian Sass-Ørum
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Abstract

Un derivado de una proteína FGF21, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1) en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador se selecciona del grupo de Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*, Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x-CO-* y Químico 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-* en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18; y en donde el enlazador comprende al menos uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4: en donde el Químico 2 se selecciona de: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*, *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-* y *-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO-*, en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5, en donde el Químico 3 es *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5, y en donde el Químico 4 se selecciona de: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* y *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-* en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5; y en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de FGF21 y sus usos
Campo técnico
La presente invención se refiere a derivados de análogos de FGF21, más en particular a análogos de FGF21 que tienen una cadena lateral en la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181, y su uso farmacéutico.
Antecedentes de la invención
FGF21 pertenece a la subfamilia FGF19 de los factores de crecimiento de fibroblastos atípicos (FGF) con efectos metabólicos en lugar de mitogénicos. FGF21 se une y activa a los receptores de FGF (FGFR1c, FGFR2c y FGFR3c) pero solo en presencia del correceptor beta-kloto que no señaliza (BKL). La expresión específica tisular de BKL determina la actividad metabólica de FGF21. Los ratones transgénicos FGF21 son resistentes a la obesidad inducida por la dieta y tienen mayor longevidad. FGF21 es un regulador metabólico del gasto de energía, metabolismo de glucosa y lípidos, con un gran potencial para invertir el peso corporal, hiperglicemia y dislipidemia en pacientes obesos con diabetes y dislipidemia.
FGF21 sufre de inestabilidad in vivo debido a la proteólisis, y tanto como la mitad del FGF21 humano circulante endógeno es inactivo. La pérdida de actividad se debe a la degradación del C-terminal, la mayoría de estos metabolitos terminan en P171 en lugar de S181. Por lo tanto la protección contra la ruptura metabólica en la región C-terminal es conveniente para una molécula FGF21 terapéutica. La modificación genética de la región C-terminal puede protegerse contra la degradación, sin embargo hasta el momento tal modificación genética ha llegado al costo de disminución o pérdida de potencia del compuesto FGF21 modificado genéticamente. La región N-terminal de FGF21 se une a los FGFR mientras que la región C-terminal de FGF21 se une a BKL. Los truncamientos de aminoácidos C-terminales conducen a una pérdida significativa de la potencia.
La PEGilación en la posición 180 de [180C]FGF21 resulta en una reducción drástica en la actividad in vitro (J. Xu y otros, Bioconjugate Chemistry (2013), 24, 915-925). La proteína de fusión Fc que resulta de unir Fc al C-terminal de FGF21 es mucho menos potente que el FGF21 nativo y la fusión Fc N-terminal de FGF21 (Hecht y otros, PLOs One 2012, 7(11), e49345).
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a derivados de FGF21 que tienen una cadena lateral en una posición correspondiente a una de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181 en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1). La presente invención se refiere a derivados de FGF21 que tienen una cadena lateral en una posición correspondiente a una de las posiciones 180 o 181 en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1). Más en particular, la cadena lateral se une covalentemente a la posición de un análogo de FGF21 que corresponde a la posición 180 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o se une covalentemente a la posición de un análogo de FGF21 que corresponde a la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
Más en particular, la cadena lateral se une covalentemente a la posición de un análogo de FGF21 que corresponde a la posición 170, 174 o 175 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o se une covalentemente a la posición de un análogo de FGF21 que corresponde a la posición 167, 171, 172 o 173 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
Una cisteína está presente en el análogo de FGF21 en la posición de la unión de la cadena lateral. La cadena lateral se une covalentemente al átomo de azufre del residuo de cisteína al cual se une la cadena lateral. La cadena lateral comprende un enlazador y un prolongador. El prolongador puede ser un diácido graso.
El enlazador puede comprender varios elementos enlazadores, tales como uno o más residuos de gGlu, y/o uno o más residuos Ado (Ado es ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico) y/o uno o más de otros dirradicales que incorporan un grupo *-NH y un grupo *-CO. El prolongador y el enlazador se conectan mediante un enlace amida. El enlazador se conecta al átomo de azufre de 180Cys o 181Cys de la proteína FGF21, a través de un enlace tioéter.
El enlazador puede comprender varios elementos enlazadores, tales como uno o más residuos de gGlu, y/o uno o más residuos Ado (Ado es ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico) y/o uno o más elementos Trx (Trx es ácido tranexámico) , y/o uno o más *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* y/o uno o más de otros dirradicales que incorporan un grupo *-NH y un grupo *-CO. El prolongador y el enlazador se conectan mediante un enlace amida, mientras que el enlazador se conecta a la proteína FGF21 a través de un enlace tioéter a través del átomo de azufre de la cisteína en la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181.
La proteína FGF21 incorporada en el derivado de FGF21 de la invención es un análogo de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), el análogo que comprende un residuo de cisteína en una de las posiciones correspondientes a la posición 180 o posición 181 del FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
El análogo de FGF21 del derivado de la invención puede tener hasta 30 cambios de aminoácidos en total en comparación con el FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), de los cuales el residuo de cisteína en una de las posiciones 180 o 181 cuenta como un cambio de aminoácidos. Los 29 cambios adicionales pueden ser, independientemente, una o más extensiones, una o más inserciones, una o más deleciones, y/o una o más sustituciones.
En particular la invención se refiere, en un primer aspecto, a un derivado de una proteína FGF21, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador se selecciona del grupo de
Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x-CO-*
Químico 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18; y en donde el enlazador comprende al menos uno de cada uno del Químico. 2, Químico 3 y Químico 4;
en donde el Químico 2 se selecciona de:
Químico 2A: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 2B: * -NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*
y
Químico 2C: -NH-CH2-ciclohexano-CO-*,
en donde el Químico 3 es *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, n es un número entero en el intervalo de 1-5, y
en donde el Químico 4 se selecciona de
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
y
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5 y
en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
Más en particular la invención se refiere, en un primer aspecto, a un derivado de una proteína FGF21, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1); y un máximo de 30 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1); en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador es el Químico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*, en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18; y en donde el enlazador comprende al menos uno de cada uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
Químico 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, y
Químico 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, n es un número entero en el intervalo de 1-5, y m es un número entero en el intervalo de 1-5. Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
Los derivados de FGF21 preferidos de la invención designados del Compuesto 13 al Compuesto 24 se describen en la sección experimental.
Los derivados de FGF21 preferidos adicionales de la invención designados del Compuesto 13 al Compuesto 18 se describen en la sección experimental.
Los derivados de FGF21 preferidos adicionales de la invención designados del Compuesto 35 al Compuesto 41 se describen en la sección experimental.
Los derivados de FGF21 preferidos adicionales de la invención designados del Compuesto 43 al Compuesto 56 se describen en la sección experimental.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un análogo de FGF21 que comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1). Los análogos tienen preferentemente un alto grado de identidad con el FGF21 humano (SEQ ID NO:1). El grado de identidad puede describirse por la cantidad de sustituciones o modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano (SEQ ID NO:1).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un análogo de FGF21 que comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), y un máximo de 30 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
En un tercer aspecto, la invención se refiere al uso farmacéutico de los derivados y análogos de FGF21 de la invención, por ejemplo, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como trastornos alimenticios, enfermedades cardiovasculares, complicaciones diabéticas; y/o para mejorar los parámetro lipídicos, mejorar la función de las células p; y/o para retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad diabética; y/o para el tratamiento y/o prevención de la esteatosis hepática y la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHLD).
Los derivados de FGF21 de la invención son biológicamente activos. Por ejemplo son muy potentes, y, también o alternativamente, se unen muy bien a los receptores de FGF. Además, o alternativamente, tienen un perfil farmacocinético prolongado. Por ejemplo tienen una vida media terminal muy larga cuando se administran por vía i.v. a ratones y/o minicerdos. La combinación particular de buena potencia y larga vida media puede ser muy conveniente.
Es de interés que los derivados de FGF21 que comprenden una cadena lateral en una posición correspondiente a una de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 y 181 de FGF21 humano maduro conserven la potencia.
Además, o alternativamente, se observa que los derivados de FGF21 que comprenden una cadena lateral en una posición correspondiente a una de las posiciones 180 y 181, y en particular la posición 180, de FGF21 humano maduro tienen alta potencia conservada.
Descripción
En lo siguiente, las letras del alfabeto griego pueden representarse por su símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; o = omega; etcétera. Además, la letra griega de p puede representarse por "u", por ejemplo en pl=ul, o en pM=uM.
Un asterisco (*) en una fórmula química designa un punto de unión.
La invención se refiere, en un primer aspecto, a un derivado de una proteína FGF21, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1); en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador se selecciona del grupo de
Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x-CO-*
Químico 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18; y en donde el enlazador comprende al menos uno de cada uno del Químico. 2, Químico 3 y Químico 4;
en donde el Químico 2 se selecciona de:
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*
y
*-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO-*,
en donde m se selecciona individualmente como un número entero en el intervalo de 1-5,
en donde el Químico 3 es *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, n es un número entero en el intervalo de 1-5, y
en donde el Químico 4 se selecciona de
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
y
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5.
En otras modalidades el Químico 2 se selecciona de
*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*
y
*-NH-CH2-ciclohexano-CO-*.
En una modalidad adicional, el Químico 2 es *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*.
En una modalidad adicional el Químico 2 es *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*.
En una modalidad adicional, el Químico 2 es *-NH-CH2-ciclohexano-CO-*.
Como se mencionó anteriormente, el derivado incluye al menos uno de cada uno del Químico 2, Químico 3, y Químico 4 interconectadas por medio de enlaces amida. Además, se unen los elementos enlazadores en la secuencia indicada. El Químico 2 se conecta en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y el Químico 4 está en su extremo CH2-* enlazado al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un derivado de una proteína FGF21, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1); y un máximo de 30 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1); en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador es el Químico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*, en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18; y en donde el enlazador comprende al menos uno de cada uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
Químico 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*,
y
Químico 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, n es un número entero en el intervalo de 1-5, y m es un número entero en el intervalo de 1-5. Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al grupo tiol del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
Proteínas FGF21 y análogos
En la naturaleza la proteína FGF21 nativa se sintetiza con un péptido señal de 28 aminoácidos para la secreción. El polipéptido maduro FGF21 que consiste en los restantes 181 aminoácidos se incluye en la secuencia que se enumera como la SEQ ID NO:1.
La proteína FGF21 del derivado de la invención puede ahora y después referirse como la “cadena principal” o la “cadena principal de la proteína” del derivado o como un “análogo de FGF21”.
El término “proteína FGF21” como se usa en la presente descripción se refiere a un análogo o variante del FGF21 humano (FGF21(1-181)), la secuencia del cual se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO:1. La proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO:1 puede denominarse también FGF21 "nativo", FGF21 "maduro", y/o FGF21 "humano maduro".
En el listado de secuencias, el primer residuo de aminoácido del FGF21 humano maduro de la SEQ ID NO:1 (histidina) se asigna el núm. 1.
Un ejemplo de un análogo de FGF21 es la proteína de la SEQ ID NO:1, que tiene una metionina N-terminal, también designada como MetFGF21 (SEQ ID NO:2). Cuando FGF21 humano maduro se expresa en E. coli se añade una Met N-terminal, ver, por ejemplo, el documento núm. WO 2006/050247, Tabla 6. Un residuo adicional de aminoácido N-terminal, que antecede la histidina en la posición 1 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1) se asigna la posición núm. -1. Los ejemplos no limitantes de la nomenclatura adecuada para MetFGF21 de la SEQ ID NO:2 son MetFGF21, [Met]FGF21 o [-1M]FGF21.
MetFGF21 muestra actividad biológica comparable al FGF21 humano maduro de la SEQ ID NO:1, y por razones prácticas se usa frecuentemente como compuesto de referencia en lugar del FGF21 humano maduro de la SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos de MetFGF21 se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO:2.
En la presente descripción, las proteínas FGF21 de la invención puede describirse mediante referencia a i) el número del residuo de aminoácido en el FGF21(1-181) humano maduro que corresponde al residuo de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el FGF21humano maduro), y ii) al cambio real.
Un aspecto de la invención se refiere a una proteína FGF21 (análogo FGF21) que comprende una sustitución de aminoácidos donde un residuo de aminoácido de tipo silvestre se sustituye por un residuo de cisteína. En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 y 175 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175 y 180 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1).
En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 169, 170, 173, 174, 175, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174, 175 y 180 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174, 175, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174, 175 y 180 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174 y 175 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174 y 180 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173 y 174 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1).
Por ejemplo, la proteína FGF21 de la invención se define de manera que comprende un residuo de Cys ya sea en la posición correspondiente a la posición 180 de FGF21(1-181) (SEQ ID NO:1) o en la posición correspondiente a la posición 181 de FGF21(1-181) (SEQ ID NO:1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). En una modalidad la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1).
Estos residuos de Cys de la proteína FGF21 de la invención pueden denominarse Cys180 y Cys181, respectivamente. Por ejemplo, una proteína FGF21 de la invención que tiene un residuo de Cys en la posición correspondiente a la posición 181 de f Gf21 humano maduro (SEQ ID n O:1) puede referirse como Cys181 FGF21 y/o como 181C FGF21, alternativamente [Cys181]FGF21 y/o como [181C]FGF21.
Lo siguiente es un ejemplo no limitante de la nomenclatura apropiada de los análogos.
Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 designa un análogo de FGF21 humano maduro, en donde una alanina se ha añadido al N-terminal (es decir Ala en la posición correspondiente a la posición -1 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1)), la asparagina presente de manera natural en la posición 121 se ha sustituido con glutamina, la metionina presente de manera natural en la posición 168 se ha sustituido con leucina, y la alanina presente de manera natural en la posición 180 se ha sustituido con cisteína.
Lo que sigue es un ejemplo no limitante de la nomenclatura adecuada para un derivado de un análogo de FGF21. S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 designa un derivado de un análogo de FGF21 maduro humano (SEQ ID NO:1), en donde Ala[Gln121,Leu168,Cys180] designa los cambios de aminoácidos en comparación con FGF21 maduro humano (SEQ ID NO:1) con los números que se refieren a las posiciones de FGF21 maduro, y en donde el sustituyente [2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etilamino]-2-oxoetil]- se une covalentemente al átomo de azufre de la cisteína en la posición correspondiente a la posición 180 en FGF21 maduro humano (SEQ ID NO:1).
La proteína FGF21 de la invención puede tener cambios de aminoácidos adicionales en comparación con FGF21 (SEQ ID NO:1), sin embargo se limita a un máximo de 30 cambios de aminoácidos. Estos cambios también son en comparación con FGF21(1-181) maduro humano (SEQ ID NO:1), y pueden también representar, independientemente, una o más sustituciones, inserciones, extensiones, y/o deleciones de aminoácidos.
En una modalidad particular los cambios de aminoácidos están en una o más posiciones correspondientes a una o más de las posiciones -1, 121, y 168 de FGF21 (SEQ ID NO:1).
En una modalidad la proteína FGF21 de la invención comprende -1Ala, 121Gln y 168Leu en adición a la sustitución del aminoácido de cisteína.
En una modalidad la proteína FGF21 de la invención comprende -1Ala, 121Gln, y 168Leu en adición a cualquiera de 167Cys, 170Cys, 171Cys, 172Cys, 173Cys, 174Cys, 175Cys, 180Cys y 181Cys. Las proteínas FGF21 particulares de la invención, que también se incorporan en los derivados particulares de la invención que se describen en la sección experimental, son SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 del listado de secuencias.
En otra modalidad particular la proteína FGF21 de la invención comprende -1Ala, 121 Gln, y 168Leu en adición a cualquiera de 180Cys o 181Cys.
Las proteínas FGF21 particulares de la invención, que también se incorporan en los derivados particulares de la invención que se describen en la sección experimental, son SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO:10 del listado de secuencias.
Una proteína “que comprenden” determinados cambios especificados pueden comprender otros cambios, cuando se comparan con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, los residuos de aminoácidos pueden identificarse mediante su nombre completo, su código de una letra, y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes.
Las expresiones “una posición equivalente a” o "posición correspondiente" puede usarse para caracterizar el sitio de cambio en una variante de secuencia de FGF21 como referencia a FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1). Las posiciones equivalentes o correspondientes, así como la cantidad de cambios, se deducen fácilmente, por ejemplo mediante simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align" que se basa en un algoritmo de Needleman-Wunsch. Este algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa de alineamiento de Myers y W. Miller en "Alignments Optimum in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 o preferentemente en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2 o preferentemente en -0,5.
Un ejemplo de tal alineación se inserta en la presente descripción más abajo, en el cual la secuencia núm. 1 es FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), y la secuencia núm. 2 es el análogo Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21 (SEQ ID NO:10). La identidad calculada es por lo tanto 97,8 %.
# 1: FGF21
# 2: Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21
# Matriz: EBLOSUM62
# Penalización_interrupción: 10,0
# Penalización_extendida: 0,5
# Longitud: 182
# Identidad: 178/182 (97,8 %)
# Similitud: 179/182 (98,4 %)
# Interrupciones: 1/182 ( 0,5 %)
# Puntuación: 952,0
1 1 -HPIFDSSFUiQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSP 49
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
2 1 AHPIEDSSP1LQFGGQVRQRYLYTDD AQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSP 50
1 50 ESLLQLKALKPGV1QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELL 59
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
2 51 ESLLQLKALKPGV1CILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELL 100
1 100 LEDGYWVYQSEAHGLPLHLPGKKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEP 149
1 11 11 11 1 11 11 1 11 11 1 11 1 - 111 1 11 11 1 11 11 1 11 11 1 11 11 1 11 11
2 10 ] LE DGYNVYQSEAHGLPLHL PGQKSPHRD PAPRGPARFLPLPG LFFAL PE F 150 1 150 FGILAPQFPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS 161
I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I I I I I I I I I I .
2 151 PGILAPQPPDVGSSDPLSLVGPEQGREPSYAC 182
En modalidades adicionales la proteína FGF21 o el análogo o la cadena principal FGF21 de los derivados de FGF tiene al menos 80 % de identidad con FGF21 humano (SEQ ID NO:1), tal como al menos 85 % de identidad, tal como al menos 90 % de identidad, tal como al menos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con FGF21 humano (SEQ ID NO:1).
El término “proteína” se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoácidos interconectados por enlaces amida (o peptídicos).
Las proteínas de la invención comprenden al menos 151 aminoácidos constituyentes conectados mediante enlaces peptídicos. En modalidades particulares la proteína comprende al menos 160, preferentemente al menos 170, con mayor preferencia al menos 180, incluso con mayor preferencia al menos 181, o con la máxima preferencia al menos 182 aminoácidos. En modalidades particulares adicionales, la proteína a) está compuesta de, o b) consiste en, 181 o 182 aminoácidos.
En aún una modalidad particular adicional, la proteína consiste en aminoácidos interconectados mediante enlaces peptídicos.
Los aminoácidos pueden definirse como un compuesto que comprende un grupo amina y un grupo ácido carboxílico y, opcionalmente, uno o más grupos adicionales, frecuentemente referidos como una cadena lateral. El grupo amina puede, por ejemplo, ser un grupo amino primario o secundario.
Un residuo de aminoácido es un radical de un aminoácido cuando se incorpora en un péptido o proteína.
En una modalidad particular los aminoácidos de la proteína de la invención son alfa aminoácidos donde el átomo de nitrógeno del grupo amino primario o secundario se une al átomo de alfa carbono.
En otra modalidad particular los aminoácidos de la proteína de la invención se seleccionan de aminoácidos codificados y aminoácidos no codificados.
En una modalidad todos los aminoácidos de la proteína de la invención son aminoácidos codificados.
Los aminoácidos codificados pueden definirse como en la Tabla 1 en la sección 3AA-1 de las recomendaciones por IUPAC (INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY; véase http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/), donde se proporcionan estructura, nombre común, nombre sistemático, símbolos de una y tres letras para los 20 aminoácidos codificados.
El término “aminoácidos no codificados” se refiere a todos los otros aminoácidos. Los ejemplos no limitantes de aminoácidos no codificados son los isómeros D de los aminoácidos codificados tales como D-alanina y D-leucina. En lo que sigue, se pretende que todos los aminoácidos específicos para los cuales no se indica el isómero óptico signifiquen el L-isómero (a menos que se especifique de otra manera), por ejemplo cuando se hace referencia al aminoácido específico de glutamina, esto se refiere a que se refiere a L-glutamina, a menos que se indique de cualquier otra manera. Por otro lado, cuando los aminoácidos se describen por fórmulas más generales tales como fórmulas brutas o fórmulas estructurales y cuando no se muestra ningún compuesto estereoquímico, estas fórmulas están destinadas a cubrir todos los estereoisómeros.
De acuerdo con la práctica general en la técnica el N-terminal de las proteínas FGF21 de la invención se muestra hacia la izquierda y el C-terminal hacia la derecha.
Derivados de FGF21
El término “derivado” como se usa en la presente descripción en el contexto de una proteína FGF21 o análogo significa una proteína FGF21 o análogo modificado químicamente, en el cual un número bien definido de sustituyentes se han unido covalentemente a uno o más residuos de aminoácidos específicos de la proteína. El(Los) sustituyente(s) puede(n) referirse, además, una cadena lateral o cadenas laterales.
En una modalidad particular, la cadena lateral es capaz de formar asociaciones no covalentes con albúmina, lo que promueve de esta manera la circulación del derivado con la corriente sanguínea y tienen además el efecto de proteger el tiempo de acción del derivado, debido al hecho de que la asociación del derivado de FGF21 y la albúmina se desintegra sólo lentamente para liberar el ingrediente farmacéutico activo.
La cadena lateral comprende una porción que se denomina en la presente descripción como un prolongador.
El prolongador puede estar en, o cerca del extremo distante de la cadena lateral, con relación a su punto de unión a la proteína.
Aún en una modalidad particular adicional la cadena lateral comprende una porción entre el prolongador y el punto de unión a la proteína, cuya porción puede referirse como un enlazador. El enlazador puede consistir en uno o más elementos enlazadores.
En modalidades particulares, la cadena lateral y/o el prolongador es lipofílico, y/o cargado negativamente a pH fisiológico (7,4).
La cadena lateral puede unirse covalentemente a un residuo de cisteína de la proteína FGF21 mediante alquilación. En una modalidad preferida, la cadena lateral se sintetiza y se activa con un grupo de haloacetamida, que reacciona con el grupo tiol de un residuo de cisteína, bajo la formación de un enlace tiol-carbono covalente (este proceso se denomina como Cys-alquilación) que también se denomina como enlace tio-éter. Por lo tanto, el grupo tiol no está presente en los derivados, y la cadena lateral está enlazada a través del átomo de azufre. En los casos en los que el grupo tiol se menciona en relación con un derivado, debe entenderse como el átomo de azufre que es parte del grupo tiol de la cisteína antes de la Cys-alquilación.
En otra modalidad, la cadena lateral se activa con un grupo maleimida, que reacciona con el grupo tiol de un residuo de cisteína, bajo la formación de un enlace covalente tiol-carbono.
Para los propósitos presentes, los términos prolongador y enlazador pueden incluir las formas sin reaccionar, así como también las formas que reaccionaron de estas moléculas. Si se quiere decir o no una forma u otra es claro a partir del contexto en el que se usa el término.
En un aspecto, cada prolongador comprende, o consiste en, un prolongador de la fórmula del Químico 1:
Químico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,
en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18.
En modalidades alternativas el prolongador Químico 1 se selecciona del grupo de prolongadores definidos por el Químico 1A, Químico 1B y Químico 1C
Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18,
Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x-CO-*
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18, y
Químico 1C; HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18.
La longitud de la cadena de carbono definida por x puede variar de 8-18 para cada una de las diferentes estructuras del Químico 1, mientras que como se describe a continuación la versión más corta o más larga puede favorecer diferentes tipos de elementos prolongadores.
En una modalidad particular de 1A, *-(CH2)x-* se refiere a alquileno lineal en el que x es un número entero en el intervalo de 10-18, tal como 14-18 o tal como 14-16.
En otra modalidad particular de 1A, *-(CH2)x-* se refiere a alquileno lineal en el que x es 16. Este prolongador puede denominarse brevemente diácido C18, es decir un ácido dicarboxílico graso con 18 átomos de carbono. Cuando x=16 la estructura de este elemento enlazador corresponde al Químico 1a:
Químico 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*.
En una modalidad el prolongador es el Químico 1B. En una modalidad de 1B *-(CH2)x-* se refiere a alquileno lineal en el que x es un número entero en el intervalo de 8-14. En la modalidad particular cuando x=9 la estructura de este elemento enlazador corresponde al Químico 1b.
Químico 1b: HOOC-benceno-O-(CH2)9-CO*
En una modalidad el prolongador es el Químico 1C. En una modalidad de 1C, *-(CH2)x-* se refiere a un alquileno lineal en el que x es un número entero en el intervalo de 10-18, tal como 12-18 o 14-18. En una modalidad particular de 1C, cuando x=15 la estructura de este elemento enlazador corresponde al Químico 1c
Químico 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
La nomenclatura es como es común en la técnica, por ejemplo en las fórmulas anteriores *-CO-* se refiere a carbonil (*-C(=O)-*). Por ejemplo, en cualquier fórmula (R-CO-*) en la presente descripción (donde R es tal como se define por cada fórmula), R-CO-* se refiere a R-C(=O)-*. El benceno se refiere a la estructura de anillo que en el Químico 1B se sustituye en C1 y C4 por O-(CH2)x-* y -COOH, respectivamente. HO-S(=O)2 describe ácido sulfónico.
El enlazador del derivado de la invención comprende al menos uno de los siguientes elementos enlazadores Químico 2, Químico 3 y Químico 4. Los elementos Químico 2 y Químico 3 ambos sostienen un extremo -NH- y CO- que les permite unirse mediante enlaces entre sí y a -CO- o -NH- del prolongador o Químico 4.
El Químico 4 tiene un extremo -NH-(capaz de formar un enlace amida con el Químico 2 o Químico 3, y un extremo -NH-CO-CH2-, que en la forma sin reaccionar es una haloacetamida capaz de reaccionar con el grupo tiol de la cisteína del análogo de FGF21.
El enlazador del derivado de la invención comprende al menos uno de los siguientes elementos enlazadores Químico 2, Químico 3 y Químico 4,
en donde el Químico 2 se selecciona de:
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*,
*-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO-*,
y en donde m se selecciona individualmente como un número entero en el intervalo de 1-5.
en donde el Químico 3 es: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5, n es un número entero en el intervalo de 1-5, y
en donde el Químico 4 se selecciona de:
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
y
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
en donde m se selecciona individualmente como un número entero en el intervalo de 1-5.
En una modalidad el Químico 2 es *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*, en donde m es 1, 2 o 3. En una modalidad m es 2 o 3.
En la modalidad donde m es 2, el elemento enlazador Químico 2 puede denominarse como Químico 2a que es*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*. El elemento enlazador *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-* puede denominarse brevemente gGlu, gamma Glu, o y-GIu. En gGlu es el grupo carboxi gamma del aminoácido ácido glutámico que se usa para la conexión a otro elemento enlazador. En una modalidad particular, el (cada) elemento enlazador de gGlu está en la forma L.
En una modalidad el Químico 2 es *-NH-S(=O)2-(CH2)m -CO-*,en donde m es 1, 2 o 3. En una modalidad m es 2 o 3. El elemento enlazador *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*, es un derivado de ácido sulfónico, donde el grupo carboxi se usa para la conexión a otro elemento enlazador. En una modalidad m es 3 y el elemento enlazador Químico 2 puede denominarse como Químico 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*.
En una modalidad el Químico 2 es *-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO-*, en donde m es 1,2 o 3. En una modalidad m es 2 o 3. En la estructura del Químico 2, el anillo de ciclohexano se sustituye por lo tanto en C1 y C4 con NH-CH2 y CO respectivamente.
En una modalidad m es 1 y el elemento enlazador Químico 2 puede denominarse como Químico 2c: *-NH-CH2-ciclohexano-CO-*. Este elemento enlazador puede denominarse además Trx.
En el elemento enlazador del Químico 3, “k” y “n” pueden variar entre 1 y 5. Cuando k=n=1 la estructura de este elemento enlazador corresponde al Químico 3a:
En una modalidad el Químico 3 es Químico 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*. El elemento enlazador del Químico 3a puede denominarse brevemente como Ado (ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico) ya que es un dirradical de este.
En el elemento enlazador del Químico 4, “m” puede variar entre 1 y 5. En una modalidad el Químico 4 es *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, en donde m es 1, 2, 3 o 4. En una modalidad m es 2 o 3.
En una modalidad cuando el Químico 4 es *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* y m=2 la estructura de este elemento enlazador corresponde al Químico 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.
En una modalidad del Químico 4 es *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-* en donde m es 1, 2, 3 o 4. En una modalidad m es 2 o 3. En una modalidad m es 4 o 5.
Cuando el Químico 4 es *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-* y m=4 la estructura de este elemento enlazador corresponde al Químico 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*.
El enlazador del derivado de la invención puede comprender uno o más de estos tres tipos diferentes de elementos enlazadores, y puede comprender además uno o más de cada elemento enlazador individual. En una modalidad el enlazador comprende solamente un elemento del Químico 4. En una modalidad el enlazador comprende uno o más de cada uno de Químico 2 y Químico 3 y sólo un elemento del Químico 4.
Como un ejemplo no limitante, el enlazador puede consistir en un elemento del Químico 2, dos elementos del Químico 3a, y un elemento del Químico 4, interconectados a través de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CO-* al átomo de azufre del residuo de Cys en la posición 180 o 181 de la proteína FGF21. Los elementos del Químico 4 se enlazan por lo tanto al extremo -CO-* de los elementos del químico2/químico3 al átomo de azufre del análogo de cisteína de FGF21.
En un ejemplo adicional, el enlazador puede consistir en dos elementos del Químico 2, tales como dos elementos del Químico 2a, dos elementos del Químico 3a, y un elemento del Químico 4, interconectados a través de enlaces amida y en la secuencia indicada. El elemento del Químico 2 se conecta en el extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y el Químico 4 en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys de la proteína FGF21.
En una modalidad el enlazador se conecta al grupo tiol de la Cys en la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 173, 174, 175, 180 o 181 de la proteína FGF21. En modalidades adicionales, el enlazador se conecta al átomo de azufre de las Cys en la posición 180 o 181.
De más está decir, solo para el buen orden: La frase "en la secuencia indicada" significa que el extremo *-NH del primer elemento enlazador mencionado (aquí el Químico 2) está conectado al extremo *-CO del prolongador, y el extremo *-CO del último elemento enlazador mencionado (aquí el Químico 4) está conectado al grupo tiol amino del residuo de Cys en cuestión de la proteína FGF21.
En una modalidad el derivado de la invención se selecciona de los grupos que consiste en:
a. Compuesto 13-24
b. Compuesto 35-41 y/o
c. Compuesto 43-56.
En una modalidad adicional el derivado se selecciona del compuesto 13-24.
En una modalidad el derivado se selecciona del compuesto 13-18. En una modalidad el derivado se selecciona del compuesto 20-24.
En una modalidad el derivado se selecciona del compuesto 35-41.
En una modalidad el derivado se selecciona del compuesto 43-56. En una modalidad el derivado se selecciona del compuesto 43-44 y 46-54. En una modalidad el derivado se selecciona del compuesto 44, 47 y 50-54.
En lugar del Químico 4, puede usarse un elemento enlazador derivado de maleimida donde p y q pueden variar entre 1 y 5:
Figure imgf000012_0001
Cuando p=q=2 la estructura de este elemento enlazador corresponde a N-(2-aminoetil)-3-(-2,5-dioxo-pirrolidin-1-il)propanamida:
Figure imgf000012_0002
Los derivados de la invención pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas que tienen la misma fórmula molecular y la secuencia de átomos unidos, pero que difieren solo en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados de la invención se indica en la sección experimental, en los nombres así como también en las estructuras, con el uso de la nomenclatura estándar. A menos que se establezca de cualquier otra manera la invención se refiere a todas las formas estereoisoméricas del derivado reivindicado.
Propiedades funcionales
Los derivados de FGF21 de la invención son biológicamente activos. Por ejemplo son muy potentes, y, también o alternativamente, se unen muy bien a los receptores de FGF. Además, o alternativamente, tienen un perfil farmacocinético prolongado. Por ejemplo tienen una vida media terminal muy larga cuando se administran por vía i.v. a ratones y/o minicerdos. La combinación particular de buena potencia y larga vida media puede ser muy conveniente. Además, o alternativamente, es sorprendente que los derivados de FGF21 que comprenden una cadena lateral de la invención en una posición correspondiente a una de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 173, 174, 175, 180 y 181 del FGF21 humano maduro tienen alta potencia.
De acuerdo con un primer aspecto, los derivados de FGF21 tienen actividad de FGF21. Por ejemplo, los derivados de FGF21 de la invención tienen una potencia sorprendentemente buena hacia los receptores de FGF humanos.
En una primera modalidad particular, la potencia y/o actividad se refiere a la potencia in vitro, es decir, el rendimiento en un ensayo funcional del receptor de FGF, más en particular a la capacidad de activar al receptor de FGF humano.
La potencia in vitro puede determinarse, por ejemplo, en un ensayo con células completas que expresan receptores de FGF humanos (FGFR1c, FGFR2c o FGFR3c) y BKL. Por ejemplo, la respuesta de los receptores de FGF humanos puede medirse mediante el uso de HEK (células Renales Embrionarias Humanas) que sobreexpresan beta-kloto humano (BKL). Las células HEK293 expresan endógenamente varios receptores de FGF, que incluyen FGFR1c y FGFR3c. Estas células no responden a FGF21 hasta ser transfectadas con el correceptor BKL. La activación del complejo receptor de FGF/BKL conduce a la activación de la vía de señalización MAPK/e Rk y la fosforilación de ERK. El nivel de ERK fosforilado (pERK) en un punto de tiempo dado aumenta con concentraciones crecientes de FGF21. Un ejemplo no limitante de tal ensayo se describe en el Ejemplo 6.
La potencia in vitro también puede determinarse en un ensayo con adipocitos de ratón 3T3-L1. Por ejemplo, los análogos y derivados de FGF21 pueden analizarse por su capacidad de aumentar la captación de glucosa en los adipocitos. Los adipocitos 3T3-L1 diferenciados expresan endógenamente FGFR1c y b Kl . Las células 3T3-L1 no responden al FGF21 hasta después de diferenciarse, la diferenciación conduce la expresión del correceptor BKL. La activación del complejo receptor FGFR1c/BKL aumenta la expresión del transportador de glucosa 1 (GLUt 1) y por lo tanto los análogos del FGF21 conducirán a una mayor cantidad de glucosa captada por los adipocitos de manera sensible a la dosis.
El valor de EC50 se usa comúnmente como una medida de la potencia de un fármaco. Se refiere a la concentración del compuesto en cuestión que induce una respuesta a mitad entre el valor basal y el máximo, con referencia a la curva de dosis-respuesta. De manera popular el EC50 representa la concentración donde se observa el 50 % del efecto máximo. La potencia in vitro de los derivados de la invención puede determinarse como se describió anteriormente y determinarse la EC50 del derivado en cuestión. A menor valor de EC50, mejor será la potencia.
A modo de ejemplo no limitante, el derivado de FGF21 de la invención tiene una potencia medida mediante el uso de las células HEK293 que sobreexpresan beta-kloto humano correspondiente a una EC50 al 0 % de HSA inferior a 60 nM, preferentemente inferior a 20 nM, o con mayor preferencia inferior a 10 nM (por ejemplo determinado como se describe en el Ejemplo 6).
A modo de ejemplo no limitante, el derivado de FGF21 de la invención tiene una potencia medida mediante el uso de la captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 que corresponde a una EC50 inferior a 60 nM, preferentemente inferior a 20 nM, o con mayor preferencia inferior a 10 nM (por ejemplo determinado como se describe en el Ejemplo 7).
A modo de ejemplo no limitante, el derivado de FGF21 de la invención tiene una eficacia Emáx medida mediante el uso de la captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 de al menos 50 %, preferentemente al menos 80 %, o con mayor preferencia al menos 90 % (por ejemplo determinado como se describe en el Ejemplo 7).
A modo de ejemplo no limitante, el derivado de FGF21 de la invención tiene una potencia medida mediante el uso de la captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 que corresponde a una EC50 inferior a 60 nM, preferentemente inferior a 20 nM, o con mayor preferencia inferior a 10 nM (por ejemplo determinado como se describe en el Ejemplo 7) y una eficacia de Emáx medida mediante el uso de la captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 de al menos 80 %, o más preferentemente al menos 90 % (por ejemplo determinado como se describe en el Ejemplo 7).
En una segunda modalidad particular, la potencia y/o la actividad se refieren a la potencia in vivo. Las proteínas y derivados de la invención son potentes in vivo, lo que puede determinarse como se conoce en la técnica en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos.
Se ha demostrado anteriormente que la pérdida de peso inducida por FGF21 en ratones delgados predice el efecto en ratones obesos y, por lo tanto, los ratones delgados se consideran un modelo de selección bueno. Los ratones delgados C57BL son un ejemplo de un modelo animal adecuado, y el efecto de disminución del peso corporal puede determinarse en tales ratones in vivo (determinados, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 9).
De acuerdo con un segundo aspecto, los derivados de la invención se prolongan. La prolongación puede estimarse in vitro, y/o determinarse a partir de estudios farmacocinéticos in vivo. Un aumento de la potencia in vitro, valor de EC50, en presencia de albúmina sérica indica una afinidad a la albúmina sérica y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales. La prolongación puede determinarse, por ejemplo, como vida media terminal (t1^ ) después de la administración i.v. a, por ejemplo, ratones o minicerdos.
Como un ejemplo no limitante, el derivado de la invención tiene una vida media terminal después de la administración i.v. a ratones de al menos 1 hora, con mayor preferencia al menos 3 horas, o con la máxima preferencia al menos 10 horas (determinada, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 8).
Como otro ejemplo no limitante, el derivado de la invención tiene una vida media terminal después de la administración i.v. a los minicerdos de al menos 2 horas, con mayor preferencia al menos 10 horas, incluso con mayor preferencia al menos 20 horas o con la máxima preferencia al menos 50 horas (determinada, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 8).
De acuerdo con un tercer aspecto, los derivados de la invención se prolongan y al mismo tiempo tienen una potencia muy buena. La combinación particular de buena potencia/unión y vida media larga puede ser muy conveniente.
De acuerdo con un cuarto aspecto, los derivados de la invención tienen buenas propiedades biofísicas. Estas propiedades incluyen pero no se limitan a estabilidad física y/o solubilidad. Estas y otras propiedades biofísicas pueden medirse mediante el uso de métodos estándar conocidos en la técnica de la química de proteínas. En una modalidad particular, estas propiedades se mejoran en comparación con el FGF21 humano maduro.
En la sección titulada "MODALIDADES PARTICULARES", antes de la sección experimental, se describen modalidades particulares adicionales de los derivados de la invención.
Producción y purificación del compuesto FGF21
La producción de proteínas, por ejemplo, FGF21, es bien conocida en la técnica. Los análogos de FGF21 pueden producirse mediante un método que comprende cultivar una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica la molécula y es capaz de expresar análogos de FGF21 en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del análogo de FGF21. Se pueden usar varios métodos recombinantes en la producción de FGF21 y sus análogos. Ejemplos de métodos que pueden usarse en la producción de FGF21 en microorganismos tales como, por ejemplo, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae se describen, por ejemplo, en el documento núm. WO12010553.
Los ejemplos específicos de métodos para preparar varios derivados de la invención se incluyen en la parte experimental. En resumen, los análogos de FGF21 se derivan en el residuo de cisteína por alquilación. Las cadenas laterales reactivas de tiol, tales como las cadenas laterales preparadas con una haloacetamida, pueden por lo tanto hacerse reaccionar con el análogo de FGF21. El análogo de f Gf puede prepararse con una cisteamina que protege el grupo tiol de la cisteína. Si es así, el análogo se reduce con, por ejemplo, un agente reductor tal como una fosfina antes de reaccionar el análogo con la cadena lateral reactiva de tiol.
Los análogos y derivados de FGF21 de la presente invención pueden purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromato enfoque, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativa (IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio) o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
Modo de administración
El término "tratamiento" pretende incluir tanto la prevención como la minimización de la enfermedad, trastorno o afección a los que se hace referencia (es decir, "tratamiento" se refiere tanto a la administración profiláctica como terapéutica de los derivados de FGF21 de la invención o de una composición que comprende los derivados de FGF21 de la invención) a menos que se indique de cualquier otra manera o se contradiga claramente por el contexto.
La vía de administración puede ser cualquier vía que transporte eficazmente un compuesto de esta invención al lugar deseado o adecuado en el cuerpo, tal como parenteral, por ejemplo, subcutánea, intramuscular o intravenosa. Alternativamente, un compuesto de esta invención puede administrarse por vía oral, pulmonar, rectal, transdérmica, bucal, sublingual, o nasal.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de la invención o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptables de este y un excipiente farmacéuticamente aceptable puede prepararse como se conoce en la técnica.
El término "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del/de los ingrediente/s terapéutico/s activo/s. El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.
El excipiente puede servir para diversos fines, por ejemplo como portador, vehículo, diluyente, auxiliar para tabletas, y/o para mejorar la administración, y/o la ingesta de la sustancia activa.
En la técnica se conoce la formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con diversos excipientes, véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).
Las composiciones inyectables que comprenden compuestos de FGF21 de la presente invención pueden prepararse con el uso de técnicas convencionales de la industria farmacéutica que implican disolver y mezclar los ingredientes según convenga para proporcionar el producto final deseado. Por lo tanto, de acuerdo con un procedimiento, un compuesto de FGF21 de esta invención se disuelve en un tampón adecuado a un pH adecuado de modo que la precipitación sea mínima o se evite. La composición inyectable se esteriliza, por ejemplo, mediante filtración estéril. También se pueden agregar agentes antimicrobianos a la composición.
Una composición puede ser una formulación estabilizada. El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física y/o química aumentada, preferentemente ambas. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de acuerdo con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.
El término “estabilidad física” se refiere al estado físico y los cambios del mismo sin alterar los enlaces covalentes y, por lo tanto, a la tendencia de la proteína a formar agregados y/o fibrillas biológicamente inactivas y/o insolubles como un resultado de exponer a estrés termo-mecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies estabilizantes (tales como superficies hidrófobas). La estabilidad física de una formulación acuosa de proteína se evaluó por medio de inspección visual y/o mediciones de la turbidez y/o mediciones de concentración después de exponer a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos períodos de tiempo. Alternativamente, la estabilidad física puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional de la proteína tal como por ejemplo Tioflavina T o sondas de “parche hidrófobo”.
El término “estabilidad química” se refiere a cambios químicos (en particular covalentes) de enlaces covalentes en la estructura de la proteína que conduce a la formación de productos de degradación química que tienen potencialmente una potencia biológica reducida, y/o efecto inmunogénico aumentado en comparación con la proteína intacta. La estabilidad química puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos de tiempo después de la exposición a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo mediante SEC-HPLC, RP-HPLC, LCMS y/o mapeo peptídico.
En un aspecto, la invención proporciona derivados de FGF21 con estabilidad física mejorada. En un aspecto, la invención proporciona derivados de FGF21 con estabilidad química mejorada.
Tratamiento de combinación
El tratamiento con un derivado de FGF21 de acuerdo con la presente invención puede combinarse, además, con una más sustancias activas farmacológicamente adicionales, por ejemplo, seleccionadas de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad.
Ejemplos de estas sustancias activas farmacológicamente son: agonistas del receptor de GLP-1, insulina, inhibidores de DPP-IV (peptidasa-IV), agonistas de amilina y agonistas del receptor de leptinas.
Indicaciones farmacéuticas
La presente invención se refiere, además, a un derivado de la invención para el uso como un medicamento.
En modalidades particulares, el derivado de la invención puede usarse para los siguientes tratamientos médicos:
(i) prevención y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o reducción de HbA1C;
(ii) retardo o prevención de la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retardo de la progresión de la tolerancia a la glucosa alterada (IGT) a diabetes tipo 2 que requiere insulina, retardo o prevención de la resistencia a la insulina, y/o retardo de la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;
(iii) mejorar la función de las células p, tal como disminuir la apoptosis de las células p, aumentar la función de las células p y/o la masa de células p, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa de las células p;
(iv) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como la obesidad, por ejemplo, mediante la disminución de la ingesta de alimentos, aumento del gasto energético, reducción del peso corporal, supresión del apetito, inducción de saciedad; tratamiento o prevención del trastorno por atracón, bulimia nerviosa, y/u obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; y/o prevención y/o tratamiento de comorbilidades de la obesidad, tales como osteoartritis y/o incontinencia urinaria;
(v) prevención y/o tratamiento de complicaciones diabéticas, como nefropatía;
(vi) mejorar los parámetros lipídicos, tales como la prevención y/o tratamiento de la dislipidemia, reducción de los lípidos séricos totales; aumento de HDL; reducción de LDL densa y pequeña; reducción de VLDL; reducción de triglicéridos; reducción del colesterol; reducción de los niveles plasmáticos de lipoproteína a (Lp(a)) en un ser humano; inhibición de la generación de apolipoproteína a (apo(a)) in vitro y/o in vivo;
(vii) la prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, como el síndrome X, ateroesclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria, daño por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, una enfermedad cardiaca temprana o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, hipertensión esencial, emergencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca, intolerancia al ejercicio, fallo cardiaco agudo y/o crónico, arritmia, disritmia cardiaca, síncope, angina de pecho, derivación cardiaca y/o reoclusión con stent, claudicación intermitente (ateroesclerosis obliterante), disfunción diastólica, y/o disfunción sistólica; y/o reducción de la presión sanguínea, tal como reducción de la presión sanguínea sistólica;
(viii) prevención y/o tratamiento de la esteatosis hepática y enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD); y/o (ix) prevención y/o tratamiento de enfermedades críticas, tales como el tratamiento de un paciente crítico, un paciente de polinefropatía por enfermedad crítica (CIPNP), y/o un paciente con CIPNP potencial; prevención del desarrollo de enfermedades críticas o CIPNP; prevención, tratamiento y/o curación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) en un paciente; prevención o reducción de la posibilidad de que un paciente sufra de bacteriemia, septicemia y/o choque séptico durante la hospitalización.
En una modalidad particular la indicación se selecciona del grupo que consiste en (i)-(vii). En otra modalidad particular, la indicación se selecciona del grupo que consiste en (i), (iv), (vi) y/o (vii). Se prefieren particularmente las siguientes indicaciones: Diabetes tipo 2 y/u obesidad. En una modalidad los compuestos de la invención son para el tratamiento de la diabetes tipo 2. En una modalidad los compuestos de la invención son para el tratamiento de la obesidad. Modalidades particulares
Las siguientes son modalidades particulares de la invención:
1. Un derivado de una proteína FGF21,
en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1)
en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador se selecciona del grupo de
Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*
Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x-CO-*
y
Químico 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18; y
en donde el enlazador comprende al menos uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
en donde el Químico 2 se selecciona de:
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*
*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*
y
*-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO-*
en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5,
en donde el Químico 3 es *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5, y
en donde el Químico 4 se selecciona de:
*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
y
*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5; y
en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
2. El derivado de acuerdo con la modalidad 1, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en la posición 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o la posición 181.
3. El derivado de acuerdo con la modalidad 1, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en la posición 170, 173, 174, 175, 180 o la posición 181.
4. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Químico 2 se selecciona del grupo de:
Químico 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 2b: * -NH-S(=O)2-(CH2)a-CO-*
y
Químico 2c: *-NH-CH2-ciclohexano-CO-*.
5. El derivado de acuerdo con la modalidad 1, en donde el Químico 4 se selecciona de:
Químico 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.
Químico 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*.
6. Un derivado de una proteína FGF21, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), y un máximo de 30 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1);
en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador se selecciona del grupo de
Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18,
Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x
en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18,
y
Químico 1C; HO-S(=O)2-(CH2)x
en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18,
en donde el enlazador comprende al menos uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
Químico 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*,
y
Químico 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5; y m es un número entero en el intervalo de 1-5;
y
en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo -CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
7. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Químico 1 se selecciona del grupo de:
Químico 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
Químico 1b: HOOC-benceno-O-(CH2)9-CO-*
y
Químico 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
8. Un derivado de una proteína FGF21,
en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador;
en donde el prolongador es el
Químico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,
en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18; y
en donde el enlazador comprende al menos uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
Químico 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*,
y
Químico 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5; y m es un número entero en el intervalo de 1-5;
en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
9. Un derivado de una proteína FGF21,
en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), y un máximo de 30 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1);
en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador es el
Químico 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,
en donde x es un número entero en el intervalo de 10-18; y
en donde el enlazador comprende al menos uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
Químico 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
Químico 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*
y
Químico 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,
en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5; y m es un número entero en el intervalo de 1-5;
en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al grupo tiol del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
10. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en la posición correspondiente a la posición 180 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
11. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicha proteína tiene un máximo de 30, tal como 25, tal como 20, tal como 15, tal como 10, tal como 8, tal como un máximo de 5 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
12. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicha proteína tiene 4 o 5 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
13. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicha proteína tiene 4 modificaciones de aminoácidos en comparación con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
14. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicha proteína FGF tiene al menos 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 % de identidad con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
15. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicha proteína FGF tiene al menos 96 %, tal como 97 %, tal como 98 %, tal como 99 % de identidad con FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
16. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los cambios de aminoácidos están en una o más posiciones correspondientes a una o más de las posiciones 121, 168, 180, o 181 de FGF21 humano madura (Se Q ID NO:1).
17. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde uno de los cambios de aminoácidos es la adición de un residuo de Ala en una posición correspondiente al N-terminal del FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
18. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la proteína comprende un Ala en el extremo N-terminal de dicha proteína.
19. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la proteína comprende 121Q.
20. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la proteína comprende 168L.
21. El derivado, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 o 10.
22. El derivado, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la proteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
23. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Químico 1 es 1A o 1C y x es un número entero en el intervalo de 12-18.
24. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Químico 1 es 1A o 1C y x es un número entero en el intervalo de 14-16.
25. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el Químico 1 es 1B y x es un número entero en el intervalo de 8-12.
26. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde x es 16.
27. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-2.
28. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde k es 1.
29. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde n es un número entero en el intervalo de 1-2.
30. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde n es 1.
31. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde m del Químico 4 es un número entero en el intervalo de 1-5.
32. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde m del Químico 4 es 2.
33. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el prolongador comprende el Químico 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*.
34. El derivado de acuerdo con cualquier modalidad anterior, en donde el prolongador consiste en el Químico 1a: HOOC-(CH2)14-CO-*.
35. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador comprende el Químico 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*.
36. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador comprende el Químico 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.
37. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en al menos un elemento del Químico 2, dos elementos del Químico 3, y un elemento del Químico 4.
38 El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en un elemento del Químico 2, dos elementos del Químico 3, y un elemento del Químico 4.
39 El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en dos elementos del Químico 2, dos elementos del Químico 3, y un elemento del Químico 4.
40. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el enlazador consiste en un elemento del Químico 2, dos elementos del Químico 3a, y un elemento del Químico 4a.
41. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es uno de los siguientes:
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 13)
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0003
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 15)
Figure imgf000021_0002
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 16)
Figure imgf000022_0001
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 17)
Figure imgf000022_0002
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-ca rboxi-4-( 17-ca rboxi h e ptad eca no i I-am¡no)butano¡l]am¡no]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]etoxi]etox¡]acet¡l]am¡no]-et¡lam¡no]-2-oxoet¡l]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Compuesto 18)
Figure imgf000023_0001
S{Beta-181 }-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11 -carboxiundecanoil-am¡no)butano¡l]am¡no]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]-et¡lam¡no]-2-oxoet¡l]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 19)
Figure imgf000023_0002
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 20)
Figure imgf000024_0001
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 21)
Figure imgf000024_0002
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 22)
Figure imgf000024_0003
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 23)
Figure imgf000025_0001
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Met[Cys181]FGF21 (Compuesto 24)
Figure imgf000025_0002
42. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es uno de los siguientes:
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 13)
Figure imgf000026_0001
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 14)
Figure imgf000026_0002
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 15)
Figure imgf000027_0001
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 17)
Figure imgf000028_0001
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Compuesto 18)
Figure imgf000028_0002
43. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado se selecciona del grupo del compuesto 13-24 y 43 a 56.
44. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado se selecciona del grupo del compuesto 35-41.
45. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado se selecciona del grupo del compuesto 13-24, 35-41 y 43 a 56.
46. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 13.
47. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 14.
48. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 15. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 16.
49. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 17.
73. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 53.
74. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 54.
75. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 55.
76. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es el Compuesto 56.
77. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado tiene actividad de FGF21
78. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el derivado es capaz de activar receptores de FGF.
79. El derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la vida media terminal (t1^ ) después de la administración i.v. a los minicerdos es al menos 20 veces mayor que la vida media terminal (t1^ ) del FGF21 humano maduro.
80. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-79 para usar como un medicamento.
81. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-79, para usar en un método para el tratamiento y/o la prevención de cualquiera de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como obesidad, trastornos alimentarios, enfermedades cardiovasculares complicaciones diabéticas, y/o para mejorar los parámetros lipídicos, mejorar la función de las células p; y/o para retardar o prevenir la progresión de una enfermedad diabética; y/o para el tratamiento y/o la prevención de esteatosis hepática y enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD).
82. Uso de un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-79, en la fabricación de en un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como obesidad, trastornos alimentarios, enfermedades cardiovasculares complicaciones diabéticas, y/o para mejorar los parámetros lipídicos, mejorar la función de las células p; y/o para retardar o prevenir la progresión de una enfermedad diabética; y/o para el tratamiento y/o la prevención de esteatosis hepática y enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD).
83. Un método para el tratar o prevenir todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como obesidad, trastornos alimentarios, enfermedades cardiovasculares complicaciones diabéticas, y/o para mejorar los parámetros lipídicos, mejorar la función de las células p; y/o para retardar o prevenir la progresión de una enfermedad diabética; y/o para el tratamiento y/o la prevención de esteatosis hepática y enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) mediante la administración de una cantidad activa farmacéuticamente de un derivado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-79.
84. Una proteína FGF21 que comprende una sustitución de aminoácidos de un aminoácido de tipo silvestre por un residuo de cisteína en una posición correspondiente a uno de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1).
85. La proteína FGF21 de acuerdo con la modalidad 83, en donde la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a una de las posiciones 170, 173, 174, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1).
86. La proteína FGF21 de acuerdo con la modalidad 83, en donde la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a uno de las posiciones 170, 173 y 174 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1). 87. La proteína FGF21 de acuerdo con la modalidad 83, en donde la proteína FGF21 comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a uno de las posiciones 180 y 181 de FGF21 (1-181) (Se Q ID NO:1).
88. La proteína FGF21 de acuerdo con la modalidad 83 en donde la proteína FGF21 comprende -1Ala, 121 Gln y/o 168Leu en adición a un residuo variante de Cys.
89. La proteína FGF21 de acuerdo con la modalidad 83 en donde la proteína FGF21 comprende -1Ala, 121 Gln y/o 168Leu en adición a una cisteína en una de las posiciones 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 y 181 de FGF21 (1-181) (SEQ ID NO:1).
EJEMPLOS
Lista de abreviaturas
AcOD: acetona deuterada
Ado: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctánico
BSPP: Bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina dihidrato de sal de dipotasio
DCM: diclorometano
DMSO: Dimetilsulfóxido
DPBS: Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
EDAC: (3-dimetilaminopropil) etil carbodiimida
ELSD: Detector de Dispersión de Luz de Evaporación
Fmoc: 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo
Fc: Fragmento, cristalizable
GLP-1: péptido similar al glucagón tipo 1
gGlu: ácido gamma glutámico
GLUT1: transportador de glucosa 1
HATU: hexafluorofosfato de 2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento
IgG4: Inmunoglobulina G4
IBMX: 3-isobutil-1-metilxantina
IPTG: isopropil p-D-1-tiogalactopirananósido
LCMS: Cromatografía líquida Espectroscopía de masas
Mtt: 4-metiltritilo
NMR: Resonancia Magnética Nuclear
OtBu: éster terc butílico
PBS: solución salina tamponada con fosfato
RF: factor de retardo
Rt = tiempo de retención
RT: temperatura ambiente
tBu: t-butil
TCTU: tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio TFA: ácido trifluoroacético
Tris: tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol Trx: ácido tranexámico
UPLC: Cromatografía líquida de ultra rendimiento
ZOSu: N-(benciloxicarboniloxi)succinimida
Materiales y Métodos
Métodos generales de detección y caracterización
Método de LCMS 1
La muestra se diluye a aproximadamente 0,2 mg/ml y se inyecta en un sistema LCMS, por ejemplo, 3-5 ul. El instrumento LCMS consiste en un sistema UPLC y un espectrómetro de masas. Los análogos se desalan y pueden separarse en una columna de fase inversa (por ejemplo, una columna o precolumna C4, C8, C18) y se analizan mediante el uso de un gradiente lineal de acetonitrilo en TFA al 0,02-0,05 % (ácido trifluoroacético). El instrumento debe calibrarse y, si es posible, mediante el uso de pulverización con masa de estándar. El espectro de MS sobre el pico cromatográfico principal se genera y la masa intacta se reconstruye mediante el uso de un algoritmo de deconvolución.
Ejemplo de los ajustes del instrumento LCMS (Synapt):
modo de ion positivo
potencial capilar de 3000 V,
voltaje de cono 30V
temperatura de la fuente 110 °C,
temperatura de desolvatación 250 °C
flujo de gas del cono (N2) de 25L/h.
intervalo m/z 200-3000
Se proporciona la masa deconvolucionada
Método de LCMS 2
Sistema: Columna UPLC serie infinity Agilent 1290 Aeris WISPORE 3,6|j XB-C18 2,1 x 50 mm Detector: Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A) Configuración del detectordel método de ionización: Fuente Agilent Jet Stream Intervalo de barrido: m/z min. 100, m/z máx. 3200 modo reflector lineal modo positivo
Condiciones: Gradiente lineal: 5 % a 95 % de B tiempo de corrida del gradiente: 10 minutos 0-8 min 5-95 % de B, 8-9 min 95 % de B , 9-9,5 min 95-5 % de B 9,5-10 min 5 % de B velocidad de flujo: 0,40 ml/min temperatura de la columna fija: 40 °C
Eluyentes Solvente A: 99,90 % de H2O, 0,02 % de Solvente B de TFA: 99,90 % de CH3CN, 0,02 % Solvente C de TFA: NA
Descripción y validación de los resultados: La masa encontrada es ya sea m/z ((m+z)/z) del compuesto para los compuestos con m<4000 o masa (promedio) como el resultado de una deconvolución mediante el uso del programa informático Masshunter Workstation versión B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1 (Agilent). La masa calculada es el peso molecular promedio del compuesto deseado. M / z calculado es el peso molecular (m z) / z del compuesto deseado. Método de LCMS 3
Sistema: Columna UPLC serie infinity Agilent 1290 Phenomenex Aeris ancho del poro 3,6 p C4 50x2,1 mm Detector: Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A)
Método de ionización de la configuración del detector: Fuente Agilent Jet Stream Intervalo de barrido: m/z min. 100, m/z máx. 3200 modo reflector lineal modo positivo
Condiciones: Gradiente de etapa: 5 % a 90 % de B tiempo de corrida del gradiente: 10 minutos: 0-1 min 5-20 % de B, 1-7 min 20-90 % de B , 7-8 min 90 % de B 8-8,5 min 90-5 % de B 8,5-10 min 5 % de B velocidad de flujo: 0,40 ml/min temperatura de la columna fija: 40 °C
Eluyentes Solvente A: 99,90 % de H2O, 0,02 % de Solvente B de TFA: 99,90 % de CH3CN, 0,02 % Solvente C de TFA: NA
Descripción y validación de los resultados: La masa encontrada es ya sea m/z ((m+z)/z) del compuesto para los compuestos con m<4000 o masa (promedio) como el resultado de una deconvolución mediante el uso del programa informático Masshunter Workstation versión B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1 (Agilent). La masa calculada es el peso molecular promedio del compuesto deseado. M / z calculado es el peso molecular (m z) / z del compuesto deseado. Método de LCMS 4
Sistema: Sistema de autopurificación Waters
Columna: Kinetex C184,6 mm x 50 mm
Detector: UV: PDA, ELSD, MS Micromass Quatro micro
Configuración del detector: Método de ionización: ES+ , intervalo de barrido 100-1000, Cono 30 V, Capilar 300 kV, tiempo de barrido 1,3 s; PDA: 210-400 nm; ELSD: Nebulizador calentador-enfriador 70 %, tubo de empuje 57,0 °C Condiciones: Gradiente lineal de acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 0,1 % de FA, tiempo de corrida del gradiente: 4,0 min, tiempo de corrida total: 6,0 min, velocidad de flujo: 1,1 ml/min, temperatura de la columna: 23 °C Preparación de los compuestos de la invención
Ejemplo 1: Clonación y expresión de FGF21 humano maduro
El ADN y las secuencias de aminoácidos para el FGF21 humano se ha descrito, por ejemplo, por Nishimura y otros en Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000). Las secuencias están disponibles, además, desde las bases de datos públicas con núms. de acceso EMBL:AB021975 y UNIPROT:Q9NSA1, respectivamente.
La proteína humana madura FGF21 se clonó y se expresó como una proteína intracelular en E. coli, sin el péptido señal, pero con una metionina añadida en el N-terminal. Más en particular, la secuencia génica que codifica para el FGF21 humano maduro (con una Met añadida en el N terminal) se optimizó con codones para la expresión en E.coli y se clonó entre el sitio NdeI y BamHI del vector pET11c. Esto pone el gen de FGF21 bajo el control del promotor T7 de fago. El constructo de expresión se transformó en E. coli BL21(DE3). Se recogió una sola colonia y se cultivó en LB Amp 100 ug/ml a OD450 de 0,5. La expresión se indujo con IPTG 0,3 mM durante 4 horas a 37° C. Los extractos crudos de las células se realizaron mediante sonicación para el análisis de la expresión de FGF21. Un SDS-PAGE teñido con Coomassie demostró la expresión exitosa del FGF21 que se identificó principalmente en la fracción del sobrenadante. Aunque la MW calculada del Met-FGF21 así expresado es 19,5 kD, este migra en el gel como una proteína de 25 kD, lo que se debe, probablemente, al alto contenido en prolinas, que retardan el movimiento de la proteína.
En la presente solicitud, MetFGF21 se usa como el compuesto de referencia. Cuando FGF21 se produce mediante el uso de sistemas de expresión en E. Coli, se introduce una metionina en el N-terminal del FGF21. Sin embargo, esto no se considera que afecta la actividad biológica, y tanto FGF21 como MetFGF21 se usan comúnmente por lo tanto como compuestos de referencia.
Ejemplo 2: Clonación y expresión de los análogos del FGF21
Los constructos de expresión para los análogos en la tabla 1 (ejemplo 3) se realizaron por mutagénesis sobre el constructo de expresión de FGF21 maduro descrito en el ejemplo 1. Se usó un kit de mutagénesis en múltiples sitios de Stratagene. Se aplicó además la misma condición de expresión como se describió en el ejemplo 1. Un SDS-PAGE teñida con azul coomassie mostró la expresión exitosa de los análogos. Los análogos se expresaron incluyendo el dipéptido Met-Ala N-terminal a las secuencias FGF21 lo que permite la expresión de un análogo de FGF21 con Ala como el residuo de amino ácido N-terminal debido a la escisión de la Met por las enzimas de E. coli.
Ejemplo 3: Purificación de FGF21 maduro y los análogos de FGF21
Para purificar los análogos de FGF21 y FGF21 maduros descritos en los Ejemplos 1-2, se usó el siguiente proceso o técnicas similares:
El sedimento celular de E. coli se resuspendió en 10 mM de fosfato de potasio pH 6,0, y se desintegró por un homogeneizador a 800 bar dos veces. Los cuerpos de inclusión se sedimentaron por centrifugación (10 000 x g, durante 30 minutos), se resolubilizaron en Tris 50 mM a pH 8,0, y se añadieron opcionalmente urea 2M y/o cisteína 5 mM, y la suspensión se agitó durante la noche a 4°C. Antes de la aplicación en la columna, la suspensión se centrifugó nuevamente a 10000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se aplicó a una cromatografía de intercambio aniónico (resina Q Sepharose Fast Flow, GE Healthcare) y se eluyó con 50-250 mM de NaCl. Se añadió sulfato de amonio 0,4 M al grupo de elución, que luego se aplicó a una columna de Phenil FF (GE Healthcare) equilibrada en Tris 20 mM pH 8,0, sulfato de amonio 0,4 M. La columna se lavó con Tris 20 mM pH 8,0, cloruro de sodio 1,5 M antes de la elución con tampón Tris-cloruro al 10 % (Tris 20 mM pH 8,0, cloruro de sodio 1,5 M). Una columna 30Q puede usarse para pulido de pureza adicional. El producto final se analizó mediante SDS-PAGE u otras técnicas relevantes. Para los compuestos 3 y 5-10, la protección de cisteamina de las cisteínas introducidas se conservó durante la prueba farmacológica.
Los análogos de FGF21 se prepararon como se describió anteriormente. La masa intacta determinada por LCMS (mediante el uso del método de LCMS 1) se proporcionan para los compuestos.
Tabla 1A. Análogos de FGF21 del 1 al 10.
Figure imgf000034_0001
Tabla 1B. Análogos de FGF21 del 25 al 32
Figure imgf000034_0002
Ejemplo 4: Preparación de reactivos para la derivatización de los análogos de FGF21
La preparación de un reactivo representativo para la derivatización se proporciona en el Ejemplo 4.1. Los reactivos de los Ejemplos 4.2-4.4 se preparan mediante el método proporcionado en el Ejemplo 4.1. Los reactivos de los ejemplos 4.5-4.17 se prepararon mediante métodos similares como se describe a continuación.
Ejemplo 4.1: Preparación del ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico
Figure imgf000035_0001
Protocolo Sintético en Fase Sólida:
Una solución de N-(benciloxicarboniloxi)succinimida (ZOSu, 100 g, 401 mmol) en diclorometano (500 ml) se añadió en forma de gotas durante 2 horas a una solución de etilendiamina (1, 189 ml, 2,81 mol) en diclorometano (750 ml). Después de 30 minutos la suspensión se filtró y los sólidos se lavaron con diclorometano. El filtrado se evaporó hasta la sequedad y el residuo se diluyó con tolueno (1,00 L) y agua (0,50 L). La mezcla resultante se filtró y el filtrado se separó para proporcionar dos fases. La fase acuosa contenía el producto; por lo tanto se extrajo con diclorometano (2 x 250 ml). Todas las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se diluyó con tolueno (750 ml) y se extrajo con ácido clorhídrico acuoso 2 M (500 ml) y ácido clorhídrico acuoso 1 M (100 ml). Las fases acuosas ácidas se combinaron y se basificaron con una solución de hidróxido de sodio (60,0 g, 1,50 mol) en agua (90 ml). La mezcla resultante se extrajo con diclorometano (4 x 200 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, se concentró al vacío y se diluyó con hexanos (200 ml). Se añadió 4 M de solución de cloruro de hidrógeno en éter (100 ml, 400 mmol) a la solución, la suspensión resultante se concentró al vacío y se diluyó con hexanos (1,00 L). El sólido precipitado se filtró, se lavó con hexanos y se secó al vacío para dar hidrocloruro ácido (2-amino-etil)-carbámico bencil éster como polvo blanco.
Rendimiento: 62,62 g (68 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 4:1): 0,25 (sin base).
Espectro de 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 7,42-7,26 (m, 5 H); 5,16 (s, 2 H); 3,60 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 3,32 (t, J=5,7 Hz, 2 H).
La resina de 2-clorotritilo malla de 100-200 1,7 mmol/g (3, 40,1 g, 68,1 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (250 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-Ado-OH, 17,5 g, 45,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (30,1 ml, 173 mmol) en diclorometano seco (50 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 5 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (15,8 ml, 90,8 mmol) en mezcla de metanol/diclorometano (4:1,250 ml, 2 x 5 min). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 250 ml), diclorometano (2 x 250 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 250 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 250 ml), 2-propanol (2 x 250 ml) y diclorometano (300 ml, 2 x 250 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-Ado-OH, 26,3 g, 68,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (21,4 ml, 123 mmol) en N,N-dimetilformamida (140 ml) a resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 250 ml), diclorometano (2 x 250 ml) y N,N-dimetilformamida (250 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 250 ml), 2-propanol (2 x 250 ml) y diclorometano (300 ml, 2 x 250 ml). Se añadió solución de éster 1-terc-butílico del ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-entanodioico (Fmoc-Glu-OtBu, 29,0 g, 68,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (21,4 mL, 123 mmol) en N,N-dimetilformamida (140 mL) a resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 250 ml), diclorometano (2 x 250 ml) y N,N-dimetilformamida (250 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 250 ml), 2-propanol (2 x 250 ml) y diclorometano (300 ml, 2 x 250 ml). Se añadió una solución de ácido 16-(terc-butoxi)-16-oxohexadecanoico (23,3 g, 68,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (21,4 ml, 123 mmol) en mezcla de N,N-dimetilformamida/diclorometano (4:1,200 ml) a resina. La resina se agitó durante 1 hora, se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 250 ml), diclorometano (2 x 250 ml), metanol (2 x 250 ml) y diclorometano (350, 6 x 250 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con 2,2,2-trifluoetanol (250 ml) durante 18 horas. La resina se filtró y se lavó con diclorometano (2 x 250 ml), mezcla de 2-propanol/diclorometano (1:1, 2 x 250 ml), 2-propanol (250 ml) y diclorometano (3 x 250 ml). Las soluciones se combinaron; el disolvente se evaporó y el producto crudo se purificó mediante cromatografía rápida en columna (Silicagel 60, 0,040-0,060 mm; eluyente: diclorometano/metanol 1:0-9:1). El ácido puro de (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-41,41-dimetil-10,19,24,39-tetraoxo-3,6,12,15,40-pentaoxa-9,18,23-triazadotetracontanoico se secó al vacío y se obtuvo como aceite amarillo espeso amarillo pálido.
Rendimiento: 30,88 g (83 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 4:1): 0,30.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,36 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 7,02 (t, J=5,4 Hz, 1 H); 6,55 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 4,46 (m, 1 H); 4,18 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3,83-3,36 (m, 16 H); 2,44-2,12 (m, 7 H); 2,02-1,86 (m, 1 H); 1,60 (m, 4 H); 1,47 (s, 9 H); 1,45 (s, 9 H); 1,36-1,21 (m, 20 H).
Método de LC-MS 4:
Pureza: 100 %
Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,60 min.
Encontrado m/z, z=1: 818,7 (M+H)+
Se añadieron posteriormente hexafluorofosfato de 2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU, 11,4 g, 30,1 mmol) y trietilamina (8,77 ml, 62,9 mmol) a una solución de ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-41,41-dimetil-10,19,24,39-tetraoxo-3,6,12,15,40-pentaoxa-9,18,23-triazadotetracontanoico (22,4 g, 27,4 mmol) en diclorometano seco (110 ml). Se añadió trietilamina (5,72 ml, 41,0 mmol) a una suspensión de hidrocloruro de ácido (2-amino-etil)-carbámico bencil éster (6,94 g, 30,1 mmol) en diclorometano seco (165 ml) y la mezcla resultante se añadió a la solución anterior. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche, y luego se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (500 ml); se lavó con ácido clorhídrico acuoso 1 M (2 x 200 ml), 5 % de solución acuosa de carbonato de sodio (2 x 200 ml, separación de fases muy lenta), ácido clorhídrico acuoso 1 M (8 x 200 ml) y salmuera; se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó hasta la sequedad al vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna rápida (Silicagel 60, 0,040-0,060 mm; eluyente: diclorometano/metanol 95:5) para proporcionar ácido 15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-benciloxicarbonilamino-etilcarbamoil)-metoxi]-etoxi}-etilcarbamoil)-metoxi]-etoxi}-etilcarbamoil)-1-tert-butoxicarbonil-propilcarbamoil]-pentadecanoico terc-butil éster como aceite espeso amarillo pálido.
Rendimiento: 23,84 g (88 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,35
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,39-7,26 (m, 6 H); 7,19 (t, J=6,3 Hz, 1 H); 6,91 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 6,52 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 5,83 (t, J=5,5 Hz, 1 H); 5,09 (s, 2 H); 4,41 (ddd, J=12,3, 4,6 y 4,3 Hz, 1 H); 3,99 (s, 2 H); 3,97 (s, 2 H); 3,71-3,30 (m, 20 H); 2,33-2,08 (m, 7 H); 1,97-1,83 (m, 1 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,35-1,20 (m, 20 H).
Método de LCMS 4
Pureza: 100 %
Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 4,18 min
Encontrado m/z, z=1: 994,9 (M+H)+
Se añadió paladio sobre carbono (10 %, 1,27 g, 1,20 mmol) a una solución del compuesto anterior (23,8 g, 24,0 mmol) en metanol (350 ml) y la mezcla resultante se hidrogenó a presión normal durante 4 horas. El catalizador se filtró y el filtrado se evaporó hasta la sequedad. El residuo se evaporó varias veces a partir de diclorometano para eliminar residuos de metanol y se secó al vacío para proporcionar terc-butil (S)-1-amino-25-(terc-butoxicarbonil)-4,13,22,27-tetraoxo-6,9,15,18-tetraoxa-3,12,21,26-tetraazadotetracontan-42-oato como aceite sin color espeso.
Rendimiento: 20,50 g (99 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,05.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,54 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 7,41 (t, J=5,6 Hz, 1 H); 7,14 (t, J=5,5 Hz, 1 H); 6,68 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 5,25 (bs, 2 H); 4,39 (td, J=8,3 y 4,2 Hz, 1 H); 4,01 (s, 4 H); 3,74-3,39 (m, 18 H); 2,96 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 2,34-2,06 (m, 7 H); 1,97-1,83 (m, 1 H); 1,68-1,50 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,37-1,19 (m, 20 H).
Método de LCMS 4
Pureza: 100 %
Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 1,43 min
Encontrado m/z, z=1: 860,8 (M+H)+
Se añadió N,N-Diisopropiletilamina (4,98 ml, 28,6 mmol) a una solución de la amina anterior (6, 20,5 g, 23,8 mmol) en diclorometano seco (290 ml) a -30 °C bajo argón. Se añadió Bromuro de bromoacetilo (2,48 ml, 28,6 mmol) en forma de gotas y la solución resultante se agitó a -30 °C durante 3 horas adicionales. El baño de enfriamiento se eliminó, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego el solvente se eliminó al vacío. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (450 ml) y se lavó con solución acuosa al 5 % de ácido cítrico (300 ml). Las fases se separaron dentro de 1 hora. La capa orgánica se lavó con agua (300 ml) y la emulsión resultante se dejó separar durante la noche para dar 3 fases. La capa acuosa transparente se retiró y las 2 fases residuales se agitaron con solución acuosa saturada de bromuro de potasio (100 ml). Las fases se dejaron separar durante toda la noche, la acuosa se retiró después y la orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna rápida (Silicagel 60, 0,040-0,060 mm; eluyente: diclorometano/metanol 95:5) para proporcionar terc-butil (S)-1-bromo-28-(terc-butoxicarbonil)-2,7,16,25,30-pentaoxo-9,12,18,21-tetraoxa-3,6,15,24,29-pentaazapentatetracontan-45-oato como un sólido incoloro.
Rendimiento: 19,46 g (83 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,25
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,46 (m, 1 H); 7,33 (t, J=5,9 Hz, 1 H); 7,21 (t, J=5,1 Hz, 1 H); 6,92 (t, J=5,2 Hz, 1 H); 6,50 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 4,41 (ddd, J=12,2, 4,5 y 4,2 Hz, 1 H); 4.01 (s, 4 H), 3,85 (s, 2 H); 3,75-3,40 (m, 20 H), 2,36-2,08 (m, 7 H); 1,99-1,84 (m, 1 H); 1,68-1,51 (m, 4 H), 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,38-1,19 (m, 20 H) Método de LCMS 4
Pureza: 100 %
Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,51 min.
Encontrado: m/z, z=1: 980,9, 982,9 (M+H)+
El compuesto anterior (19,5 g, 19,8 mmol) se disolvió en ácido trifluoroacético (120 ml) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El ácido trifluoroacético se eliminó al vacío y el residuo se evaporó del diclorometano (6 x 200 ml). Se añadió éter de dietilo (200 ml) al residuo oleoso y la mezcla se agitó durante toda la noche para dar una suspensión. El producto sólido se filtró, se lavó con éter de dietilo y hexanos y se secó al vacío para proporcionar el producto del título ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico como un polvo blanco.
Rendimiento: 16,74 g (97 %).
Espectro de 1H NMR 300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,61 (dd, J=8,8 y 4,8 Hz, 1 H); 4,12 (s, 2 H), 4,10 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,77 -3,39 (m, 20 H), 2,49-2,18 (m, 7 H); 2,16-1,04 (m, 1 H); 1,71-1,56 (m, 4 H), 1,30 (bs, 20 H)
Método de LCMS 4:
Pureza: 100 %
Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,51 min
m/z teórico, z=1: 869,8, encontrado: m/z, z=1: 868,7, 870,7
Ejemplo 4.2: Preparación del ácido 11-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}undecanoico
Figure imgf000038_0001
Se preparó ácido 11-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}undecanoico mediante el mismo método como se describió en el Ejemplo 4.1 que resulta en un aceite naranja espeso.
Espectro de 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,61 (dd, J=8,9 y 4,9 Hz, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,10 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,79-3,38 (m, 20 H); 2,50-2,16 (m, 7 H); 2,16-2,00 (m, 1 H); 1,72-1,56 (m, 4 H); 1,42-1,24 (m, 12 H) Método de LCMS 4:
Pureza: 100 % (ELSD)
Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,74 min.
Teórico, m/z, z=1:813,8, Encontrado m/z, z=1: 812,0, 814,0
Ejemplo 4.3: Preparación del ácido 13-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}tridecanoico
Figure imgf000038_0002
Se preparó ácido 13-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}tridecanoico mediante el mismo método como se describió en el Ejemplo 4.1 que resulta en un aceite amarillo espeso.
Espectro de 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,61 (dd, J=8,9 y 4,9 Hz, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,11 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,77-3,40 (m, 20 H); 2,49-2,18 (m, 7 H); 2,16-2,07 (m, 1 H); 1,70-1,56 (m, 4 H); 1,31 (bs, 16 H).
Método de LCMS 4:
Pureza: 100 % (ELSD)
Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,94 min.
m/z teórico, z=1: 841,9, encontrado: m/z, z=1: 841,7, 843,7
Ejemplo 4.4: Preparación del ácido 19-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}nonadecanoico
Figure imgf000039_0001
Se preparó ácido 19-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}nonadecanoico mediante el mismo método como se describió en el Ejemplo 4.1 que resulta en un polvo beis.
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,65-4,57 (m, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,10 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,77-3,43 (m, 20 H); 2,49-2,40 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 2,39-2,23 (m, 5 H); 2,17-2,07 (m, 1 H); 1,68-1,57 (m, 4 H); 1,30 (bs, 28 H) Método de LCMS 4:
Pureza: 100 % (ELSD)
Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,17 min.
Masa teórica: 926,0, Encontrado m/z: 926 (M+H)+
Ejemplo 4.5: Preparación de
ácido 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico
Figure imgf000039_0002
Protocolo sintético de la fase de solución:
Etapa 1: bencilo 18-[[(1 S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-benciloxicarbonil-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoato. A una solución de etilendiamina (8,5 ml) en DCM (80 ml) y trietilamina (5,2 ml) a 0 °C se añadió una solución de bencil 18-[[(1S)-1-benciloxicarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoato (26 g), preparado como se describe en el documento núm. WO10029159, en forma de gotas en DCM (320 ml) en forma de gotas, durante 75 min. Después de la agitación durante 2 h, el precipitado se filtró. Al filtrado se añadió agua (200 ml) e isopropanol (50 ml). La mezcla se extrajo. La capa orgánica se secó mediante el uso de MgSO4. El MgSO4 se eliminó mediante filtración y el filtrado se secó al vacío para dar el compuesto del título 20,07 g ( 81 %) LCMS: Masa teórica: 956,2; Encontrado m/z, z=1: 957,0
Etapa 2: bencilo 18-[[(1S)-1-benziloxicarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoato
Se disolvió ácido cloroacético (0,19 g) en DCM (15 ml). Se añadió N-hidroxisuccinimida (0,22 g) y EDAC HCl (0,42 g). Luego de agitarse durante 2,5 h bencilo 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-benciloxicarbonil-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoato (1,5 g) en DCM (5 ml). Después de agitar durante la noche a RT la mezcla se extrajo con HCl 1M (2x20 ml) y agua/salmuera 2:1 (30 ml). La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío para proporcionar un aceite transparente, 1,37 g (84 %)
LCMS: Masa teórica: 1032,7; Encontrado m/z, z=1: 1033,1
Etapa 3: Ácido 18-[[(1S)-1-Carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico
se añadió a una solución de 18-[[(1S)-1-benziloxicarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]-18-oxo-octadecanoato (10,5 g) en acetona (140 ml) al 10 % p D/C (1,0 g) luego de la aireación con nitrógeno. Después de la hidrogenación durante 6h, la mezcla se calentó a 40-50 °C antes de la filtración. El precipitado en el filtrado frío se aisló y se lavó con acetona y se secó para dar el compuesto del título, 7,42 g (85 %).
Etapa 4: ácido 8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-Bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico.
A una suspensión de acetona de ácido 18-[[(1S)-1-Carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-cloroacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico (60 ml) se añadió bromuro de sodio (5 eq, 1,21 g). La mezcla se agitó a RT en la oscuridad. Después de 2h se añadió más bromuro de sodio (10 eq, 2,41 g). Después de 2 días se añadió bromuro de sodio (5 eq, 1,21 g). Después de 5 días la mezcla se concentró. A la mitad del residuo se añadió DCM (30 ml), 10 % de ácido ascórbico (20 ml) y agua 30 ml. A la emulsión se añadió isopropanol (50 ml) y agua (30 ml). La fase orgánica se separó y se lavó dos veces con una mezcla de ácido ascórbico al 10 % (20 ml) e isopropanol (10 ml). La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para dar un aceite sólido, que se cristalizó en acetona y se aisló por filtración para dar al compuesto del título contaminado con el material de partida, 0,80 g (72 %).
LCMS: Masa teórica: 896,9. Encontrado m/z, z=1: 898,9 (M+1)
Ejemplo 4.6: Preparación de ácido 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-12-oxododecanoico
Figure imgf000040_0001
Protocolo Sintético en Fase Sólida:
La resina de 2-clorotritilo malla de 100-200 1,8 mmol/g (1, 11,9 g, 21,4 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (80 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 5,50 g, 14,3 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (9,44 ml, 54,2 mmol) en diclorometano seco (70 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 4 horas. La resina se filtró y se trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (4,97 ml, 28,5 mmol) en mezcla de metanol/diclorometano (4:1, 2 x 5 min, 2 x 57 ml). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 11,0 g, 28,5 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (Tc Tu , 10,1 g, 28,5 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (9,93 ml, 57,0 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 9,11 g, 21,4 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (t Ct U, 7,60 g, 21,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió la solución de ácido 4-[(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)metil]ciclohexanacarboxílico (Fmoc-Trx-OH, 9,11 g, 21,4 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 7,60 g, 21,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió la solución de ácido dodecanodioico mono-terc-butil éster (C12(OtBu)-OH, 6,13 g, 21,4 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 7,61 g, 21,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) en mezcla de diclorometano/N,N-dimetilformamida (4:1, 80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 horas. La resina se filtró y lavó con N,N-dimetilformamida (6 x 80 ml), diclorometano (4 x 80 ml), metanol (4 x 80 ml) y diclorometano (7 x 80 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con 2,2,2-trifluoroetanol (80 ml) durante 18 horas. La resina se filtró y se lavó con diclorometano (4 x 80 ml), mezcla diclorometano/2-propanol (1:1, 4 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (6 x 80 ml). Las soluciones se combinaron; el solvente evaporado y el producto crudo se purificó por cromatografía en columna (Silicagel 60, 0,040-0-063 mm; eluyente: diclorometano/metanol 1:0-9:1). El producto puro (2) se secó al vacío y se obtuvo como aceite.
Rendimiento: 5,40 g (42 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,30.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,45-7,31 (m, 1 H); 7,10-6,97 (m, 1 H); 6,71-6,60 (m, 1 H); 5,70-5,58 (m, 1 H); 4,43-4,31 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,79-3,31 (m, 16 H); 3,13-3,08 (m, 2 H); 2,28-1,79 (m, 11 H); 1,71­ 1,51 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,25 (bs, 12 H); 1,05-0,88 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,16 min.
LC-MS m/z: 903,0 (M+H)+.
Se añadieron posteriormente hexafluorofosfato de 2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU, 2,46 g, 6,48 mmol) y trietilamina (1,89 ml, 13,6 mmol) a una solución del aceite anterior (2, 5,31 g, 5,89 mmol) en diclorometano seco (23 ml). Se añadió trietilamina (1,36 ml, 9,72 mmol) a una suspensión de hidrocloruro de ácido (2-amino-etil)-carbámico bencil éster (3, 1,49 g, 6,48 mmol) en diclorometano seco (35 ml) y la mezcla resultante se añadió a la solución anterior. La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y luego se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (70 ml); se lavó con ácido clorhídrico acuoso 1 M (1 x 70 ml), solución acuosa al 5 % de carbonato de sodio (2 x 70 ml), ácido clorhídrico acuoso 1 M (4 x 70 ml) y salmuera (70 ml); se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna rápida (Silicagel 60, 0,040-0-063 mm; eluyente: diclorometano/metanol 95:5 a 92:8) para proporcionar un aceite amarillo espeso.
Rendimiento: 2,81 g (44 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,25.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,41-7,29 (m, 6 H); 7,22-7,13 (m, 1 H); 6,93-6,81 (m, 1 H); 6,62-6,58 (m, 1 H); 5,90-5,81 (m, 1 H); 5,68-5,55 (m, 1 H); 5,09 (s, 2 H); 4,42-4,33 (m, 1 H); 4,01-3,95 (m, 4 H); 3,75-3,30 (m, 20 H); 3,14-3,06 (m, 2 H); 2,31-2,01 (m, 11 H); 1,97-1,76 (m, 1 H); 1,65-1,52 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.27 (bs, 12 H); 1.04-0,87 (m, 2 H).
Se añadió paladio sobre carbono (10 %, 0,15 g, 0,13 mmol) a una solución del compuesto anterior (2,81 g, 2,60 mmol) en metanol (43 ml) y la mezcla resultante se hidrogenó a presión normal durante 2,5 horas. El catalizador se filtró y el filtrado se evaporó hasta la sequedad. El residuo se coevaporó cuatro veces con tolueno y se secó al vacío para producir el compuesto 5.
Rendimiento: 2,01 g (81 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCI3, dH): 7,51-7,36 (m, 2 H); 7,04-6,96 (m, 1 H); 6,76-6,66 (m, 1 H); 5,93-5,85 (m, 1 H); 4,41-4,29 (m, 1 H); 4,03-3,99 (m, 4 H); 3,73-3,25 (m, 18 H); 3,13-2,97 (m, 4 H); 2,34-1.78 (m, 11 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.30 (m, 12 H); 1.04-0,88 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 70:30 a 100:0 TFA al 0,1 %): 0,67 min.
LC-MS m/z: 945,0 (M+H)+.
Se añadió N,N-Diisopropiletilamina (0,40 ml, 2,28 mmol) a una solución de la amina anterior (5 , 1,79 g, 1,90 mmol) en diclorometano seco (30 ml) a -30 °C bajo argón. Se añadió bromuro de bromoacetilo (0,20 ml, 2,28 mmol) en forma de gotas y la solución resultante se agitó a -30 °C durante 3 horas. El baño de enfriamiento se eliminó, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora adicional y luego se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (50 ml), se lavó con solución acuosa al 5 % de ácido cítrico (3 x 50 ml, separación de fases muy lenta), ácido clorhídrico acuoso 1 M (4 x 50 ml) y salmuera (50 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna rápida (Silicagel 60, 0,040-0-063 mm; eluyente: diclorometano/metanol 95:5 a 93:7) para proporcionar un aceite amarillo.
Rendimiento: 1,63 g (80 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 95:5): 0,25.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,56-7,48 (m, 1 H); 7,43-7,34 (m, 1 H); 7,04-6,95 (m, 1 H); 6,62 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 5,74-5,63 (m, 1 H); 4,43-4,33 (m, 1 H); 4,02 (s, 4 H); 3,85 (s, 2 H); 3,73-3,40 (m, 20 H); 3,14-3,09 (m, 2 H); 2,34-2,04 (m, 9 H); 1.97-1.76 (m, 4 H); 1.68-1.51 (m, 7 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.27 (m, 12 H); 1.07-0,90 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,16 min.
LC-MS m/z: 1066,0 (M+H)+.
El compuesto anterior (1,53 g, 1,44 mmol) se disolvió en ácido trifluoroacético (25 ml) y se dejó en reposo durante 1,5 horas. El ácido trifluoroacético se eliminó al vacío y el residuo se coevaporó con tolueno tres veces y diclorometano diez veces para proporcionar un sólido aceitoso amarillo.
Rendimiento 810 mg (59 %)
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,64-4,54 (m, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,11 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,78-3,40 (m, 20 H); 3,13-3,10 (d, J=6,6 Hz, 2 H); 2,51-2,19 (m, 9 H); 1.94-1.77 (m, 4 H); 1.68-1.41 (m, 7 H); 1.31 (bs, 12 H); 1.10-0,92 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,82 min.
LC-MS m/z: 952,0 (M+H)+.
Ejemplo 4.7: Preparación de ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxohexadecanoico
Figure imgf000043_0001
Protocolo sintético en fase sólida:
La resina de 2-clorotritilo malla de 100-200 1,8 mmol/g (1, 11,9 g, 21,4 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (80 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 5,50 g, 14,3 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (9,44 ml, 54,2 mmol) en diclorometano seco (70 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 4 horas. La resina se filtró y se trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (4,97 ml, 28,5 mmol) en mezcla de metanol/diclorometano (4:1, 2 x 5 min, 2 x 57 ml). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 11,0 g, 28,5 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (Tc Tu , 10,1 g, 28,5 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (9,93 ml, 57,0 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 9,11 g, 21,4 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (t Ct U, 7,60 g, 21,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). La solución de ácido Fmoc-tranexámico (Fmoc-Trx-OH, 9,11 g, 21,4 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 7,60 g, 21,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) se añadió a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml), diclorometano (2 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (100 ml, 2 x 80 ml). Se añadió la solución de ácido hexadecanodioico mono-terc-butil éster (C16(OtBu)-OH, 7,33 g, 21,4 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (Tc Tu , 7,61 g, 21,4 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) en mezcla de diclorometano/N,N-dimetilformamida (4:1, 80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 horas. La resina se filtró y lavó con N,N-dimetilformamida (6 x 80 ml), diclorometano (4 x 80 ml), metanol (4 x 80 ml) y diclorometano (7 x 80 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con 2,2,2-trifluoroetanol (80 ml) durante 18 horas. La resina se filtró y se lavó con diclorometano (4 x 80 ml), mezcla diclorometano/2-propanol (1:1, 4 x 80 ml), 2-propanol (2 x 80 ml) y diclorometano (6 x 80 ml). Las soluciones se combinaron; el solvente evaporado y el producto crudo se purificó por cromatografía en columna (Silicagel 60, 0,040­ 0-063 mm; eluyente: diclorometano/metanol 1:0-9:1). El intermedio (2) se secó al vacío y se obtuvo como aceite.
Rendimiento: 8,20 g (80 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,20.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCI3, dH): 7,44-7,33 (m, 1 H); 7,07-6,97 (m, 1 H); 6,72-6,63 (m, 1 H); 5,70-5,59 (m, 1 H); 4,44-4,33 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,76-3,32 (m, 16 H); 3,14-3,07 (m, 2 H); 2,38-1.77 (m, 11 H); 1.71­ 1.50 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.25 (bs, 20 H); 1.05-0,87 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,56 min.
LC-MS m/z: 959,0 (M+H)+.
Se añadieron posteriormente hexafluorofosfato de 2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU, 3,55 g, 9,34 mmol) y trietilamina (2,72 ml, 19,5 mmol) a una solución de intermedio 2 (8,13 g, 8,49 mmol) en diclorometano seco (34 ml). Se añadió trietilamina (1,78 ml, 12,7 mmol) a una suspensión de hidrocloruro de ácido (2-amino-etil)-carbámico bencil éster (2,15 g, 9,34 mmol) en diclorometano seco (51 ml) y la mezcla resultante se añadió a la solución anterior. La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y luego se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (150 ml); se lavó con ácido clorhídrico acuoso 1 M (1 x 100 ml), solución acuosa al 5 % de carbonato de sodio (2 x 100 ml), ácido clorhídrico acuoso 1 M (4 x 100 ml) y salmuera; se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna rápida (Silicagel 60, 0,040­ 0-063 mm; eluyente: diclorometano/metanol 95:5 a 92:8) para proporcionar el compuesto 4 como aceite amarillo espeso.
Rendimiento: 5,59 g (58 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 9:1): 0,20.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,41-7,31 (m, 6 H); 7,21-7,12 (m, 1 H); 6,92-6,83 (m, 1 H); 6,58-6,52 (m, 1 H); 5,89-5,79 (m, 1 H); 5,62-5,51 (m, 1 H); 5,10 (s, 2 H); 4,43-4,32 (m, 1 H); 4,05-3,92 (m, 4 H); 3,75-3,30 (m, 20 H); 3,15-3,07 (m, 2 H); 2,33-2,03 (m, 11 H); 1.97-1.68 (m, 1 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,26 (bs, 20 H); 1,05-0,87 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 70:30 a 100:0 TFA al 0,1 %): 1,41 min.
LC-MS m/z: 1136,0 (M+H)+.
Se añadió paladio sobre carbono (10 %, 0,27 g, 0,24 mmol) a una solución del compuesto anterior (4, 5,59 g, 4,93 mmol) en metanol (85 ml) y la mezcla resultante se hidrogenó a presión normal durante 2,5 horas. El catalizador se filtró y el filtrado se evaporó hasta la sequedad. El residuo se coevaporó cuatro veces con tolueno y se secó al vacío para producir el compuesto 5.
Rendimiento: 3,45 g (70 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCl3, dH): 7,43-7,33 (m, 2 H); 7,05-6,94 (m, 1 H); 6,72-6,65 (m, 1 H); 5,69-5,59 (m, 1 H); 4,44-4,33 (m, 1 H); 4,03-3,98 (m, 4 H); 3,72-3,39 (m, 18 H); 3,15-3,07 (m, 2 H); 2,96-2,90 (m, 2 H); 2,34-1,78 (m, 13 H); 1,71-1,51 (m, 7 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,25 (m, 20 H); 1,07-0,93 (m, 1 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 70:30 a 100:0 TFA al 0,1 %): 0,76 min.
LC-MS m/z: 1001,0 (M+H)+.
Se añadió N,N-Diisopropiletilamina (0,73 ml, 4,14 mmol) a una solución de la amina anterior (5 , 3,45 g, 3,45 mmol) en diclorometano seco (55 ml) a -30 °C bajo argón. Se añadió bromuro de bromoacetilo (0,36 ml, 4,14 mmol) en forma de gotas y la solución resultante se agitó a -30 °C durante 3 horas. El baño de enfriamiento se eliminó, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora adicional y luego se evaporó hasta la sequedad. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (100 ml), se lavó con solución acuosa al 5 % de ácido cítrico (3 x 100 ml, separación de fases muy lenta), ácido clorhídrico acuoso 1 M (4 x 100 ml) y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna rápida (Silicagel 60, 0,040-0-063 mm; eluyente: diclorometano/metanol 95:5 a 93:7) para proporcionar el compuesto 6 como aceite amarillo.
Rendimiento: 1,63 g (44 %).
RF (SiO2, diclorometano/metanol 95:5): 0,15.
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCI3, dH): 7,55-7,46 (m, 1 H); 7,43-7,33 (m, 1 H); 6,99-6,89 (m, 1 H); 6,58 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 5,72-5,59 (m, 1 H); 4,44-4,32 (m, 1 H); 4,02 (s, 4 H); 3,85 (s, 2 H); 3,74-3,40 (m, 20 H); 3,14-3,09 (m, 2 H); 2,33-2,05 (m, 9 H); 2,01-1,76 (m, 4 H); 1,67-1,53 (m, 7 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,25 (m, 20 H); 1,07-0,89 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,47 min.
LC-MS m/z: 1122,0 (M+H)+.
El compuesto anterior (6 , 1,63 g, 1,53 mmol) se disolvió en ácido trifluoroacético (25 ml) y se dejó reposar durante 1,5 horas. El ácido trifluoroacético se eliminó al vacío y el residuo se coevaporó con tolueno tres veces. Se añadió éter de dietilo (120 ml) al residuo oleoso y la mezcla se agitó durante 1 hora. Luego, el precipitado se filtró y el residuo se secó al vacío para proporcionar un polvo blanco.
Rendimiento: 1,55 g (90 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,65-4,56 (m, 1 H); 4,14 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,98 (s, 2 H); 3,78-3,44 (m, 20 H); 3,14-3,10 (d, J=6,8 Hz, 2 H); 2,48-2,21 (m, 8 H); 2,18-2,10 (m, 1 H); 1,97-1,79 (m, 4 H); 1,70-1,46 (m, 7 H); 1,32 (bs, 20 H); 1,11-0,93 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,32 min.
LC-MS m/z: 1008,0 (M+H)+.
Ejemplo 4.8: Preparación de ácido 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-18-oxo-octadecanoico
Figure imgf000045_0001
Protocolo sintético:
Se dejó hinchar la resina Wang Fmoc-Lys(Mtt) 0,26 mmol/g (1, 11,7 g, 3,05 mmol) en diclorometano (100 ml) durante 45 minutos. El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 2,35 g, 6,09 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 2,17 g, 6,09 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,12 ml, 12,2 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 2,35 g, 6,09 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 2,17 g, 6,09 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,12 ml, 12,2 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml) para obtener el intermedio 1. El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 1,94 g, 4,57 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N' tetrametiluronio (TCTU, 1,62 g, 4,57 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,43 ml, 8,23 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido 4-[(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)metil]ciclohexanacarboxílico (Fmoc-Trx-OH, 1,73 g, 4,57 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 1,62 g, 4,57 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,43 ml, 8,23 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml) para obtener el intermedio 2. El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 50 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 50 ml), 2-propanol (3 x 50 ml) y diclorometano (3 x 30 ml). Se añadió solución de ácido octadecanodioico mono-terc-butil éster (C18(OtBu)-OH, 0,85 g, 2,28 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (Tc Tu , 0,81 g, 2,28 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,72 ml, 4,11 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 horas. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 50 ml), diclorometano (3 x 50 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 50 ml). El grupo Mtt se eliminó mediante tratamiento con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol en diclorometano al 80 % (2 x 10 min, 2 x 30 min, 4 x 50 ml). La resina se lavó con diclorometano (6 x 50 ml). Se añadió solución de ácido bromoacético (4,24 g, 30,5 mmol) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 4,01 ml, 25,9 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 45 minutos. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (5 x 50 ml) y diclorometano (10 x 50 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (50 ml) durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con ácido trifluoroacético (1 x 25 ml) y diclorometano (2 x 30 ml). Las soluciones se combinaron y los solventes se evaporaron hasta la sequedad dando el compuesto como aceite pardusco espeso.
Rendimiento 2,18 mg (64 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, 80°C, dH): 4,72-4,55 (m, 2 H); 4,16 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,80-3,62 (m, 12 H); 3,58-3,44 (m, 4 H); 3,32 (t, J=6,8 Hz, 2 H); 3,15 (d, J=6,8 Hz, 2 H); 2,51-2,07 (m, 8 H); 2,01-1,77 (m, 6 H); 1,72­ 1,44 (m, 11 H); 1,33 (bs, 24 H); 1,13-0,95 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 96 %.
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,68 min.
LC-MS m/z: 1124,1 (M+H)+.
Ejemplo 4.9: Preparación de ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxo-hexadecanoico
Figure imgf000046_0001
El procedimiento sintético fue similar al ejemplo 4.8, excepto porque en las etapas sintéticas luego del intermedio 2 se usó ácido hexadecanodioico mono-terc-butil éster (C16(OtBu)-OH) en lugar de ácido octadecanodioico mono-terc-butil éster (C18(OtBu)-OH). El producto se obtuvo como un aceite pardusco espeso.
Rendimiento 2,05 mg (62 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, 80°C, dH): 4,71-4,55 (m, 2 H); 4,16 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,79-3,62 (m, 12 H); 3,58-3,44 (m, 4 H); 3,32 (t, J=6,7 Hz, 2 H); 3,15 (d, J=6,6 Hz, 2 H); 2,49-2,07 (m, 8 H); 2.01-1,77 (m, 6 H); 1,72­ 1,44 (m, 11 H); 1,33 (bs, 20 H); 1,13-0,97 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 92 %.
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,38 min.
LC-MS m/z: 1096,0 (M+H)+.
Ejemplo 4.10: Preparación de ácido 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]sulfonilamino]-10-oxo-decoxi]benzoico
Figure imgf000047_0001
El procedimiento sintético fue similar al ejemplo 4.8, excepto porque en las etapas sintéticas luego del intermedio 1 primero 3-carboxipropanosulfonamida y posteriormente el ácido 10-(4-terc-butoxicarbonilfenoxi)decanoico se acoplaron a la resina mediante el uso de procedimientos sintéticos estándar de protección/desprotección de Fmoc. Las etapas sintéticas posteriores, escisión y metodología como se ejemplifica en el ejemplo 4.8 proporcionaron un sólido blanco.
LC-MS m/z:998,54 (M1+).
UPLC5: método 09_B4_1, Rt=8,3004 min (pH 2,3); 98 % de pureza.
Ejemplo 4.11: Preparación de ácido 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-10-oxodecoxi]benzoico
Figure imgf000047_0002
El procedimiento sintético fue similar al ejemplo 4.8, excepto porque en las etapas sintéticas luego del intermedio 1 primero el ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1 -terc-util-éster (Fmoc-LGlu-OtBu) y posteriormente el ácido 10-(4-terc-butoxicarbonilfenoxi)decanoico se acoplaron a la resina mediante el uso de procedimientos sintéticos estándar de protección/desprotección de Fmoc. Las etapas sintéticas posteriores, escisión y metodología como se ejemplifica en el ejemplo 4.8 proporcionaron un sólido blanco.
LC-MS m/z: 978,55(M1+).
UPLC5: método 09_B4_1, Rt=7,573 min (pH 2,3); 99 % de pureza.
Ejemplo 4.12: Preparación de ácido 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icosanoico
Figure imgf000047_0003
El procedimiento sintético fue similar al ejemplo 4.8, excepto porque en las etapas sintéticas luego del intermedio 1 primero el ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu) se acopló a la resina dos veces, después de lo cual se acopló el ácido 20-terc-butoxi-20-oxo-icosanoico (C20(OtBu)-OH) a la resina mediante el uso de procedimientos sintéticos estándar de protección/desprotección de Fmoc. Las etapas sintéticas posteriores, escisión y metodología como se ejemplifica en el ejemplo 4.8 proporcionaron un sólido blanco.
LC-MS m/z: 1141,2 (M+H)+.
Ejemplo 4.13: Preparación de ácido 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icoasnoico
Figure imgf000047_0004
El procedimiento sintético fue similar al ejemplo 4.8, excepto porque en las etapas sintéticas luego del intermedio 1 primero el ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu) se acopló a la resina, después de lo cual se acopló el ácido 20-terc-butoxi-20-oxo-icosanoico (C20(OtBu)-OH) a la resina mediante el uso de procedimientos sintéticos estándar de protección/desprotección de Fmoc. Las etapas sintéticas posteriores, escisión y metodología como se ejemplifica en el ejemplo 4.8 proporcionaron un sólido blanco.
LC-MS m/z: 1012,0 (M+H)+.
Ejemplo 4.14: Preparación de ácido (2S,25S)-2-(4-(2-Bromoacetamido)butil)-4,13,22-trioxo-25-(15-sulfopentadecanamido)-6,9,15,18-tetraoxa-3,12,21-triazahexacosanedioico
Figure imgf000048_0001
45 minutos. El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,66 ml, 38,2 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,66 ml, 38,2 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (150 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 6,10 g, 14,3 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (t Ct U, 5,09 g, 14,3 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (4,49 ml, 25,8 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (150 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). La resina se separó en tres porciones, se añadió una solución de ácido sódico 16-sulfo-hexadecanoico (3, 2,28 g, 6,37 mmol, hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP, 3,31 g, 6,37 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,22 ml, 12,8 mmol) en sulfóxido de dimetilo (80 ml) a un tipo de resina anterior y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con mezcla de N,N-dimetilformamida:agua (3:1, 3 x 80 ml), N,N-dimetilformamida (3 x 80 ml), diclorometano (3 x 80 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 80 ml). El grupo Mtt se eliminó mediante tratamiento con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol en diclorometano al 80 % (3 x 10 min, 2 x 30 min, 5 x 80 ml). La resina se lavó con diclorometano (6 x 80 ml). Se añadió solución de ácido bromoacético (6,64 g, 47,8 mmol) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 5,26 ml, 34,0 mmol) en N,N-dimetilformamida (80 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 45 minutos. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (4 x 80 ml) y diclorometano (10 x 80 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (100 ml) durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con ácido trifluoroacético (1 x 40 ml) y diclorometano (3 x 50 ml). Las soluciones se combinaron y los solventes se evaporaron hasta la sequedad dando un aceite pardusco espeso. El aceite se disolvió en mezcla de agua:acetonitrilo (4:1,25 ml) y la solución se pasó a través de una columna (7 x 10 cm) de Dowex 50WX4 en la forma H+ (malla de 50-100; eluyente: agua). Las fracciones con pH ácido se combinaron y se liofilizaron para dar un polvo blanco.
Rendimiento: 2,17 g (68 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 4,74-4,56 (m, 2 H); 4,16 (d, J=5,3 Hz, 4 H); 3,95 (s, 2 H); 3,82­ 3,64 (m, 12 H); 3,61-3,47 (m, 4 H); 3,33 (t, J=6,9 Hz, 2 H); 3,17-3,07 (m, 2 H); 2,54 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 2,38 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 2,34-2,09 (m, 2 H); 2,01-1,93 (m, 1 H); 1,93-1,78 (m, 3 H); 1,74-1,57 (m, 4 H); 1,57-1,29 (m, 24 H).
Pureza por LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,86 min.
LC-MS m/z: 1003,9 (M+H)+.
Ejemplo 4.15: Preparación de: ácido 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-12-oxo-dodecanoico
Figure imgf000049_0001
Protocolo sintético:
Se dejó hinchar la resina Wang Fmoc-Lys(Mtt) 0,26 mmol/g (1, 36,7 g, 9,55 mmol) en diclorometano (200 ml) durante 45 minutos. ). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,66 ml, 38,2 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (6,66 ml, 38,2 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (150 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 6,10 g, 14,3 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (t Ct U, 5,09 g, 14,3 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (4,49 ml, 25,8 mmol) en N,N-dimetilformamida (150 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (150 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml) y diclorometano (2 x 150 ml). La resina se separó en tres porciones, se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 2,03 g, 4,78 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 1,70 g, 4,78 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,50 ml, 8,60 mmol) en N,N-dimetilformamida (70 ml) a un grupo de resinas anteriores (2) y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 70 ml), diclorometano (2 x 70 ml) y N,N-dimetilformamida (70 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 70 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 70 ml), 2-propanol (2 x 70 ml) y diclorometano (2 x 70 ml). Se añadió la solución de ácido dodecanodioico mono-terc-butil éster (C12(OtBu)-OH, 1,37 g, 4,78 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 1,70 g, 4,78 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,50 ml, 8,60 mmol) en mezcla de diclorometano/N,N-dimetilformamida (4:1, 70 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 horas. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml), diclorometano (3 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 150 ml). El grupo Mtt se eliminó mediante tratamiento con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol en diclorometano al 80 % (3 x 10 min, 2 x 30 min, 4 x 70 ml). La resina se lavó con diclorometano (6 x 70 ml). Se añadió solución de ácido bromoacético (6,60 g, 47,8 mmol) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 5,30 ml, 34,0 mmol) en N,N-dimetilformamida (90 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (4 x 70 ml) y diclorometano (10 x 70 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (100 ml) durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con ácido trifluoroacético (1 x 40 ml) y diclorometano (2 x 40 ml). Las soluciones se combinaron y los solventes se evaporaron hasta la sequedad dando un aceite pardusco espeso.
Rendimiento 2,94 mg (90 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,74-4,53 (m, 3 H); 4,17 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,81-3,40 (m, 16 H); 3,31 (t, J=6,8 Hz, 2 H); 2,57-2,20 (m, 10 H); 2,16-2,04 (m, 3 H); 1,89-1,75 (m, 1 H); 1,72-1,54 (m, 6 H); 1,52­ 1,41 (m, 2 H); 1,32 (bs, 12 H).
Pureza por LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,64 min.
LC-MS m/z: 1028,0 (M+H)+.
Ejemplo 4.16: Preparación de ácido 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-12-oxododecanoico
Figure imgf000050_0001
El procedimiento sintético fue el mismo que para el ejemplo 4.8, excepto que en las etapas sintéticas luego del intermedio 1 primero el ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1 -terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu) y posteriormente ácido 12-terc-butoxi-12-oxo-dodecanoico se acoplaron a la resina mediante el uso de procedimientos sintéticos estándar protección/desprotección de Fmoc. Las etapas sintéticas posteriores, escisión y metodología como se ejemplifica en el ejemplo 4.8 proporcionaron el compuesto como un aceite pardusco espeso. Rendimiento: 97 %
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,73-4,55 (m, 2 H); 4,17 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,80-3,42 (m, 16 H); 3,31 (t, J=6,78 Hz, 2 H); 2,49-2,17 (m, 7 H); 2,01-1,92 (m, 2 H); 1,87-1,76 (m, 1 H); 1,70-1,54 (m, 6 H); 1,52­ 1,41 (m, 2 H); 1,32 (bs, 12 H).
Pureza por LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 2,72 min.
LC-MS m/z: 900,0 (M+H)+.
Ejemplo 4.17: Preparación de ácido 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxipentil]pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-20-oxo-icosanoico
Figure imgf000051_0001
Protocolo sintético:
Se dejó hinchar la resina Wang Fmoc-Lys(Mtt) 0,26 mmol/g (1, 11,2 g, 2,90 mmol) en diclorometano (100 ml) durante 45 minutos. El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 2,23 g, 5,80 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 2,06 g, 5,80 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,02 ml, 11,6 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-etoxi]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 2,23 g, 5,80 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 2,06 g, 5,80 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,02 ml, 11,6 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentanodioico 1-terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 1,85 g, 4,35 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 1,55 g, 4,35 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,36 ml, 7,82 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1,5 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido 4-[(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)metil]ciclohexanecarboxílico
(Fmoc-Trx-OH, 1,65 g, 4,35 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 1,55 g, 4,35 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,36 ml, 7,82 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) se añadió a la resina y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), 2-propanol (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido icosanodioico mono-terc-butil éster (C20(OtBu)-OH, 1,73 g, 4,35 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 1,55 g, 4,35 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,36 ml, 7,82 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a resina y la mezcla se agitó durante 2 horas. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml), diclorometano (3 x 90 ml), N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml) y diclorometano (3 x 90 ml). El grupo Mtt se eliminó mediante tratamiento con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol en diclorometano al 80 % (2 x 10 min, 2 x 30 min, 4 x 100 ml). La resina se lavó con diclorometano (6 x 90 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 90 ml). Se añadió solución de ácido bromoacético (8,06 g, 58,0 mmol) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 7,60 ml, 49,3 mmol) en N,N-dimetilformamida (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 40 minutos. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (5 x 90 ml) y diclorometano (12 x 90 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (100 ml) durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con ácido trifluoroacético (1 x 50 ml) y diclorometano (7 x 70 ml). Las soluciones se combinaron y los solventes se evaporaron hasta la sequedad dando un aceite pardusco espeso.
Rendimiento: 3,28 g (98 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 4,68 (dd, J=8,0 y 5,4 Hz, 1 H); 4,60 (dd, J=7,9 y 5,3 Hz, 1 H); 4,16 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,94 (s, 2 H); 3,81-3,61 (m, 12 H); 3,59-3,44 (m, 4 H); 3,32 (t, J=6,8 Hz, 2 H); 3,14 (d, J=6,8 Hz, 2 H); 2,49-1,79 (m, 15 H); 1,73-1,43 (m, 11 H); 1,33 (s, 28 H); 1,11-0,96 (m, 2 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitrilo/agua 20:80 a 100:0 FA al 0,1 %): 4,04 min.
LC-MS m/z: 1151,3 (M+H)+.
Ejemplo 5: Preparación de derivados de FGF21
La preparación de un derivado de FGF21 representativo se proporciona en el Ejemplo 5.1 (Compuesto 21). Los derivados de FGF21 de los Ejemplos 5.2-5.14 (Compuestos 11-20 y 22-14) se preparan mediante el método proporcionado en el Ejemplo 5.1. El derivado de FGF21 de los ejemplos 5.15-5.37 se prepara mediante el método proporcionado en el Ejemplo 5.1 o como se describe a continuación.
Ejemplo 5.1: Compuesto 21
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure imgf000052_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:10 (ver el ejemplo 3).
El compuesto 21 se preparó de la siguiente manera:
El residuo de Cys en la posición 181 en el análogo S{Beta-181}-2-aminoetilsulfanil-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 de la SEQ NO:10, preparado como se describe generalmente en los Ejemplos 1-3, se modificó en el grupo tiol del residuo de Cys en la posición 181C con el reactivo preparado en el ejemplo 4.1:
Figure imgf000052_0002
Al Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 protegido por cisteamina (70 mg, 0,0036 mmol), en Tris y tampón de NaCl (1,35 mg/ml) se añadió Tris en agua para ajustar el pH a 8,0. Se añadió BSPP (Bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina dihidrato de sal dipotásica, 12 mg) disuelta en agua y se agitó suavemente durante 4 horas a temperatura ambiente. Se añadió ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etil-carbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}} pentadecanoico (19 mg, 0,022 mmol) en etanol (0,5 ml). Después de agitarse suavemente durante toda la noche, se añadió agua MiliQ (150 ml) para disminuir la conductividad a 2,5 mS/cm. La mezcla se purificó mediante el uso de intercambio aniónico en una columna MonoQ 10/100 GL con el uso de tampón A: Tris 20 mM, pH 8,0; tampón B: Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0, flujo 6 ml y un gradiente de 0-80 % de B en 60 CV. Rendimiento: 37 mg 51 %.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20279,9: Encontrado: 20280,4
Ejemplo 5.2: Compuesto 11
S{Beta-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21
Figure imgf000053_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:6 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 2
Masa teórica: 20279,9; Encontrado: 20280,2
Ejemplo 5.3: Compuesto 12
S{Beta-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21
Figure imgf000054_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:7 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido de 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)-etilcarbamoil]metoxi}etoxi)-etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20203,8; Encontrado: 20204,2
Ejemplo 5.4: Compuesto 13
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000054_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 11-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)-etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-propilcarbamoil}undecanoico del Ejemplo 4.2.
Método de LCMS 2
Masa teórica: 20239,8; Encontrado: 20240,1
Ejemplo 5.5: Compuesto 14
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000055_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 13-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}tridecanoico del Ejemplo 4.3.
Método de LCMS 3:
Masa teórica: 20267,8; Encontrado: 20268,1
Ejemplo 5.6: Compuesto 15
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000055_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20295,9; Encontrado: 20296,2
Ejemplo 5.7: Compuesto 16
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000056_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 17-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}heptadecanoico del Ejemplo 4.5.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20323,9 Encontrado: 20324,5
Ejemplo 5.8: Compuesto 17
Figure imgf000056_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 19-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}nonadecanoico del Ejemplo 4.4.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20352,0 Encontrado: 20352,0
Ejemplo 5.9: Compuesto 18
S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21
Figure imgf000057_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:9 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 17-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)-etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}heptadecanoico del Ejemplo 4.5.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20236,8; Encontrado: 20237,0
Ejemplo 5.10: Compuesto 19
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure imgf000058_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:1 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 11-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}undecanoico del Ejemplo 4.2.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20223,8; Encontrado: 20224,4.
Ejemplo 5.11: Compuesto 20
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure imgf000058_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:10 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 13-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etil-carbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-propilcarbamoil}tridecanoico del Ejemplo 4.3.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20251,8; Encontrado: 20252,2
Ejemplo 5.12: Compuesto 22
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure imgf000059_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:10 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 17-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}-etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}heptadecanoico del Ejemplo 4.5.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20307,9 Encontrado: 20308,6.
Ejemplo 5.13: Compuesto 23
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure imgf000059_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:10 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 19-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2 bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}nonadecanoico del Ejemplo 4.4.
Método de LCMS 2:
Masa teórica: 20336,0 Encontrado: 20336,2
Ejemplo 5.14: Compuesto 24
S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Met[Cys181]FGF21
Figure imgf000060_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:11 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 17-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)-etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}heptadecanoico del Ejemplo 4.5.
Método de LCMS 3:
Masa teórica: 20372,2 Encontrado: 20372,2.
Ejemplo 5.15: Compuesto 34
S{Beta-168}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Cys168]FGF21
Figure imgf000061_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:13 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 13-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)-etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}tridecanoico del Ejemplo 4.3.
Método de LCMS 1
Masa teórica: 20225.; Encontrado: 20226,7
Ejemplo 5.16: Compuesto 35
S{Beta-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21
Figure imgf000061_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:14 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20267,8; Encontrado: 20268,2
Ejemplo 5.17: Compuesto 36
Ácido 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21
Figure imgf000062_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:15 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico del ejemplo 4.5.
Ejemplo 5.18: Compuesto 37
S{Beta-173H2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21
Figure imgf000062_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:18 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20238,8; Encontrado: 20239,3
Ejemplo 5.19: Compuesto 38
S{Beta-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoil-amino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure imgf000063_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:19 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 13-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)-etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}tritadecanoico del Ejemplo 4.3.
Método de LCMS 1
Masa teórica: 20281,9 Encontrado: 20281,9
Ejemplo 5.20: Compuesto 39
Ácido 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure imgf000064_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO: 19 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 usando el reactivo ácido 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico del ejemplo 4.5
Ejemplo 5.21: Compuesto 40
Ácido 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-16-oxo-hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21
Figure imgf000064_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO: 19 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 usando el reactivo ácido 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-16-oxo-hexadecanoico del ejemplo 4.1
Ejemplo 5.22: Compuesto 41
S{Beta-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21
Figure imgf000065_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:20 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20210,8; Encontrado: 20211,4
Ejemplo 5.23: Compuesto 42
S{Beta-176}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gl
Figure imgf000065_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:4 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 15-{(S)-1-carboxi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilcarbamoil]metoxi}etoxi)etilcarbamoil]-metoxi}etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}pentadecanoico del Ejemplo 4.1.
Método de LCMS 3
Masa teórica: 20279,9; Encontrado: 20280,4
Ejemplo 5.24: Compuesto 43
Ácido 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000066_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 4-[10-[[(1s )-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]amino]-10-oxo-decoxi]benzoico del Ejemplo 4.11.
Ejemplo 5.25: Compuesto 44
Ácido 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]sulfonilamino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000067_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]sulfonilamino]-10-oxodecoxi]benzoico del Ejemplo 4.10.
Ejemplo 5.26: Compuesto 45
Ácido 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icosanoico
Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000068_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icosanoico del ejemplo 4.12.
Ejemplo 5.27: Compuesto 46
Ácido 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icosanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000069_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]amino]-20-oxo-icosanoico del ejemplo 4.13.
Ejemplo 5.28: Compuesto 47
Ácido (2S)-6-acetamido-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(16-sulfohexadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000069_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido (2S)-6-[(2-bromoacetil)amino]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carbox¡-4-(16-sulfohexadecano¡lam¡no)butano¡l]am¡no]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡nojhexano¡co del ejemplo 4.14.
Ejemplo 5.29: Compuesto 48
Ácido 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-12-oxo-dodecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000070_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]amino]-12-oxo-dodecanoico del ejemplo 4.16.
Ejemplo 5.30: Compuesto 49
Ácido 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-12-oxo-dodecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000071_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-12-oxo-dodecanoico del ejemplo 4.15.
Ejemplo 5.31: Compuesto 50
Ácido 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-20-oxo-icosanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000071_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-20-oxo-icosanoico del ejemplo 4.17.
Ejemplo 5.32: Compuesto 51
Ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxo-hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000072_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxo-hexadecanoico del ejemplo 4.7.
Ejemplo 5.33: Compuesto 52
Ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxo-hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000073_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxo-hexadecanoico del ejemplo 4.9.
Ejemplo 5.34: Compuesto 53
Ácido 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-18-oxo-octadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000074_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-18-oxo-octadecanoico del ejemplo 4.8.
Ejemplo 5.35: Compuesto 54
Ácido 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-12-oxo-dodecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21
Figure imgf000075_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:8 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-12-oxo-dodecanoico del ejemplo 4.6.
Ejemplo 5.36: Compuesto 55
4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico]-Ala[Gln121,Leii168,Cys181]FGF21 Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:10 (ver ejemplo 3) preparado mediante el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxobutil]amino]-10-oxo-decoxi]benzoico del Ejemplo 4.11.
Ejemplo 5.37: Compuesto 56
4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]sulfonilamino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21
Figure imgf000076_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de FGF21 de la SEQ ID NO:10 (ver el ejemplo 3) preparado por el método descrito en el Ejemplo 5.1 mediante el uso del reactivo ácido 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]sulfonilamino]-10-oxodecoxi]benzoico del Ejemplo 4.10.
Métodos farmacológicos
La utilidad de los análogos de FGF21 o sus derivados de la presente invención como agentes farmacéuticamente activos en la reducción de la ganancia de peso y el tratamiento de la obesidad y la diabetes en mamíferos (tales como seres humanos) puede demostrarse mediante la actividad de los agonistas de FGF21 en ensayos convencionales y en los ensayos in vitro e in vivo que se describen a continuación.
Tales ensayos proporcionan además un medio por el cual las actividades de los compuestos de FGF21 de esta invención pueden compararse con las actividades de compuestos conocidos.
Ejemplo 6: Potencia del receptor de FGF en un ensayo de fosforilación de Erk en HEK293 que sobreexpresan el BKL humano
El propósito de este ejemplo es probar la actividad, o potencia, de los derivados de FGF21 in vitro. La potencia in vitro es la medida de la activación del receptor de FGF en un ensayo de células completas.
Las potencias de los derivados de FGF21 del Ejemplo 5 se determinaron en HEK (células renales embrionarias humanas) que sobreexpresan beta-kloto humano (BKL) como se describe adicionalmente a continuación.
Para probar la unión de los derivados de FGF21 a la albúmina, el ensayo se realizó en ausencia de albúmina de suero así como también en presencia de albúmina de suero humano (HSA) (concentración de ensayo final de 0,1 %). Un aumento en el valor de EC50 (disminución de la potencia) en presencia de albúmina de suero para los derivados de FGF21 indicaría la unión a la albúmina de suero y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales.
Los resultados para los análogos de FGF21 se muestran en la Tabla 2 y los resultados para los derivados de FGF21 se muestran en la Tabla 3. MetFGF21 (SEQ ID NO:2) se incluye como referencia.
Principio del ensayo
Las células HEK293 expresan endógenamente varios receptores de FGF, que incluyen FGFR1c, FGFR3c y FGFR4. Estas células no responden a FGF21 hasta transfectadas con el correceptor beta-kloto (BKL). La activación del complejo receptor de FGF/BKL conduce a la activación de la vía de señalización MAPK/ERK y la fosforilación de ERK. El nivel de ERK fosforilado (pERK) en un punto de tiempo dado aumenta con concentraciones crecientes de FGF21. Como se describe a continuación el nivel de pERK se mide después de 12 minutos de estimulación con un intervalo de concentraciones de análogos de FGF21.
Descripción del ensayo
Las células HEK293/beta-kloto se siembran con 30000 células/pocillo en placas de 96 pocillos en DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1), suplementado con FCS al 10 % (Gibco #16140-071), 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco #15140), 100 pg/ml de Higromicina B, (Calbiochem, # 400052). Dos días más tarde y 2 horas antes de la adición del compuesto, el medio celular se cambia con 100 pl de medio basal (DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1)). Los análogos de FGF21 se diluyen en medio de ensayo (DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1) suplementado con 0,02 % de Tween20), se calientan a 37 °C, se añaden a las células (100 pl) y se incubaron a 37 °C durante 12 minutos. Los derivados de FGF21 también se probaron en presencia de 0,1 % de HSA (Sigma - A1887). Todos los medios se extraen rápidamente y se añade un tampón de lisis 50 pl por pocillo. La placa se agita durante 5 minutos y el lisado está listo para la medición de pERK. pERK se mide en placas de 384 pocillos con el kit AlphAscreen SureFire (PerkinElmer #TGRES10K). Este kit se basa en anticuerpos específicos ERK y pERK acoplados a perlas donantes y aceptoras. La presencia de pERK traerá perlas aceptoras y donantes en estrecha proximidad y se genera una señal que se lee en EnVision. Los datos se analizan mediante el uso de GraphPad Prism y la potencia de las proteínas FGF21 se describe como el valor de EC50 absoluto.
Tabla 2A. Potencia de análogos de FGF21 en células HEK293/BKL
Figure imgf000077_0001
Como puede observarse a partir de los resultados en la T abla 2, la introducción de una cisteína en las posiciones 176, 177, 178 o 179 disminuye dramáticamente la potencia en comparación con MetFGF21. Sorprendentemente, sin embargo, la introducción de una cisteína en la posición 180 o en la posición 181 no conduce a una reducción de la potencia (180C) o reducción modesta (181C) en comparación con MetFGF21. El Compuesto 7, con una cisteína en la posición 180, muestra una potencia similar a MetFGF21 y el Compuesto 2 que tiene los mismos cambios de aminoácidos que el Compuesto 8, excepto por la cisteína en la posición 180.
La potencia del Compuesto 9 con una cisteína en la posición 181 solo disminuye ligeramente en comparación con MetFGF21 y también con el Compuesto 2 que tiene los mismos cambios de aminoácidos que el Compuesto 9, excepto por la cisteína en la posición 181.
Tabla 2B. Potencia de análogos de FGF21 adicionales en células HEK293/BKL
Figure imgf000078_0002
Puede observarse que el compuesto #26 con una sustitución de aminoácidos C168 tiene potencia reducida, mientras que los análogos con una cisteína en la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 y 175 sorprendentemente tienen potencias similares a MetFGF21.
Tabla 3A. Potencia de derivados de FGF21 en células HEK293/BKL en ausencia o presencia de HSA al 0,1 %.
Figure imgf000078_0001
Como puede observarse a partir de los resultados en la Tabla 3A, se encontró sorprendentemente que la unión de una cadena lateral de la presente invención a la cisteína en cualquiera de las posiciones 178-181 no conduce a una disminución de la potencia en comparación con los compuestos sin una cadena lateral (ver Tabla 2). Los compuestos 11, 12, 15 y 21 todos comprenden una cadena lateral idéntica en donde el elemento prolongador es el diácido C16 (Químico 1a) (los elementos enlazadores son un elemento del Químico 2, dos elementos del Químico 3a, y un elemento de Químico 4a). Cuando se comparan con las potencias de los análogos de FGF21 correspondientes (Compuestos 5, 6, 7 y 9, ver tabla 2), puede observarse que las potencias de estos derivados de FGF21 son similares a los análogos de FGF correspondientes (es decir que no tienen cadena lateral).
También se exploró el efecto sobre la potencia de los compuestos que tienen elementos prolongadores de longitud variable de la cadena de ácido graso. Las potencias de los derivados de FGF con una cisteína en la posición 180 fueron similares para los derivados de FGF21 que tienen un diácido C12, un diácido C14, un diácido C16 o un diácido C18 como elemento prolongador en ausencia de HSA. Las potencias de los derivados de FGF con una cisteína en la posición 181 fueron similares para los derivados de FGF21 que tienen un diácido C14, un diácido C16, un diácido C18 o un diácido C20 como elemento prolongador en ausencia de HSA.
El aumento de la concentración de HSA no tiene efecto o tiene un efecto modesto sobre la potencia de los derivados que comprenden una cadena lateral C12, C14 o C16, mientras que la potencia de los compuestos con una cadena lateral C18 o C20 tiene una potencia reducida en presencia de hAs al 0,1 %.
Como puede observarse en la Tabla 3A, el aumento del valor EC50 en presencia de albúmina de suero al 0,1 % en comparación con el valor de EC50 sin albúmina de suero para los derivados de FGF21 corresponde con la longitud creciente del prolongador. Esto se corresponde bien con un aumento de la vida media para estos derivados de FGF21 (ver el Ejemplo 8).
Tabla 3B. Potencia de derivados de FGF21 adicionales en células HEK293/BKL en ausencia o presencia de HSA al
0,1 %.
Figure imgf000079_0002
La potencia de los derivados de FGF21 con diferentes cadenas principales FGF21 como se describió anteriormente se probó adicionalmente y se encontró que los derivados con la cisteína en la posición 169, 170, 171, 172, 173, 174 y 175 mantuvieron la potencia cuando se derivaron con un prolongador de ácido graso. Se observa que la derivatización en la Cys 169 reduce ligeramente la potencia.
Tabla 3C. Potencia de derivados de FGF21 adicionales en células HEK293/BKL en ausencia o presencia de HSA al
0,1 %.
Figure imgf000079_0001
Para comparar más elementos prolongadores, se probaron diferentes combinaciones de prolongadores y enlazadores. Todas se conjugaron a la Cys 180 o Cys 181 y se observaron funcionalidades bastante similares de los derivados de FGF21 obtenidos lo que demuestra que se puede usar una variedad de elementos prolongadores cuando se conjuga a una Cys de FGF21, tal como la Cys 180 o Cys 181.
Ejemplo 7: Ensayo de captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1
Los análogos modificados en el C-terminal se probaron para determinar su capacidad de aumentar la captación de glucosa en los adipocitos de ratón 3T3-L1. El siguiente ensayo se usó para determinar la actividad biológica, o la potencia, de los análogos y derivados de FGF21 de la invención.
Principio del ensayo
La potencia in vitro puede determinarse, además, en un ensayo con adipocitos de ratón 3T3-L1 mediante la prueba de los análogos y derivados de FGF21 para determinar su capacidad de aumentar la captación de glucosa en los adipocitos. Los adipocitos 3T3-L1 diferenciados expresan endógenamente FGFR1c y b Kl . Las células 3T3-L1 no responden al FGF21 hasta después de diferenciarse, la diferenciación conduce la expresión del correceptor BKL. La activación del complejo receptor de FGFR1/BKL aumenta la expresión del transportador de glucosa 1 (GLUT1) y por lo tanto los agonistas del FGF21 conducirán a una mayor cantidad de glucosa captada por los adipocitos de manera sensible a la dosis.
Descripción del ensayo
Los fibroblastos de ratón 3T3-L1 (por ejemplo, disponibles de ATCC, núm. de catálogo CL-173) se mantuvieron en medio basal (DMEM (4500 mg/L de Glucosa) con Suero Fetal Bovino (FBS) al 10 % y Penicilina/Estreptomicina al 1 %). No se permite que las células alcancen la confluencia y deben pasarse (transferirse a nuevos viales) antes de alcanzar aproximadamente el 60 % de confluencia (por inspección visual).
Para el ensayo de captación de la glucosa, las células fueron 15 000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (BIOCAT), y cuando alcanzaron la confluencia (alta densidad, con una visión para diferenciar las células adiposas), se realizó un cambio de medio, de medio basal a medio basal que contiene Troglitazona, IBMX, Dexametasona (comercializado por, por ejemplo, Sigma) e insulina humana (comercializado por, por ejemplo, Novo Nordisk A/S).
Las células se usaron de 7-9 días, después de iniciar la diferenciación. Las células se estimularon con concentraciones crecientes (0-300 nM) de los análogos o derivados del FGF21 de la invención durante 20 horas en medio basal. Antes de la adición de 3H-deoxi-glucosa (en lo adelante: el trazador) las células se lavaron en tampón de ensayo cálido (aproximadamente 37 C) (PBS con MgCl2 1 mM y CaCl2 2 mM), HEPES y albúmina de suero humano 0,1 %) y las células se incubaron con el trazador durante 1 hora. Esta incubación se terminó mediante el lavado, dos veces, en tampón de ensayo enfriado en hielo. Las células se lisaron con Tritón X-100 y los lisados se transfieren a una placa de 96 pocillos, se adicionó microscint-40 (comercializado por, por ejemplo, Perkin Elmer) y se contabiliza la cantidad de trazador en un contador TOP (por ejemplo, un contador superior Packard de Perkin Elmer). Se calcularon la EC50 y la Emáx del compuesto de FGF21 en cuestión. Los resultados que se muestran en las tablas 4-5 a continuación indican la EC50 (potencia) y la Emáx (eficacia) de los análogos y derivados de FGF21, respectivamente.
Tabla 4: Captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 de los análogos de FGF21
Figure imgf000080_0002
Tabla 5. Captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 de los derivados de FGF21
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Debido a la unión de las cadenas laterales de los derivados de FGF21 a la albúmina, los derivados de FGF21 (tabla 5) tienen menores potencias que los análogos de FGF21 correspondientes (tabla 4) debido a la presencia de suero y de esta manera albúmina en el medio de ensayo basal. La disminución de la potencia se correlaciona con la longitud del elemento prolongador.
Ejemplo 8: Estudio farmacocinético en minicerdos y ratones
El propósito de este estudio fue determinar la prolongación in vivo de los derivados de FGF21 después de la administración i.v. a minicerdos y ratones, es decir, la prolongación de su tiempo en el cuerpo y de esta manera su tiempo de acción. Esto se hizo en un estudio farmacocinético (PK), donde se determinó la vida media terminal del análogo en cuestión. Por tiempo de vida media terminal se entiende el tiempo necesario para alcanzar la mitad de una determinada concentración plasmática en la fase de eliminación terminal.
Estudio en minicerdos
En los estudios se usaron minicerdos hembras Gottingen obtenidos de Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca) de aproximadamente 7-14 meses de edad y con peso de aproximadamente 16-35 kg. Los minicerdos se alojaron individualmente (minicerdos con catéteres permanentes) o en un grupo y se alimentaron de forma restringida una o dos veces al día con dieta SDS para minicerdos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido).
Después de al menos 2 semanas de aclimatación, se implantaron dos catéteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudalis o cranial en cada animal. A los animales se les permitió una recuperación de 1 semana después de la cirugía y después se usaron para estudios farmacocinéticos repetidos con un período de lavado adecuado entre las dosificaciones sucesivas.
Se administraron inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente, a por ejemplo 0,050-0,125 ml/kg) de los compuestos a través de un catéter o a través de una cánula, y se tomaron muestras de sangre en puntos de tiempo predefinidos hasta 11 días después de la dosificación (preferentemente a través del otro catéter o por venopunción).
Las muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) se recolectaron en tubos recubiertos con EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 1942 G durante 10 minutos. Las muestras de sangre se recolectaron para cubrir adecuadamente el perfil completo de concentración plasmática-tiempo del API. En las muestras de sangre de los ejemplos se recolectaron en t= predosis, 0,0833, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 horas después de la dosis.
El plasma se pipeteó en tubos Micronic en hielo seco y se mantuvo a -20 °C hasta analizarse para determinar la concentración en plasma del análogo de FGF-1 respectivo mediante el uso de ELISA. Los perfiles de concentración plasmática-tiempo individuales se analizaron mediante un método farmacocinético no compartimental en Phoenix v.
6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos), u otro programa informático relevante para el análisis PK, y las vidas medias resultantes (media armónica) determinadas. La vida media terminal de los derivados de FGF21 es la media aritmética de dos determinaciones con dosificaciones diferentes, como se explicó anteriormente.
Estudio en ratones
El perfil farmacocinético de los análogos de FGF21 se probó en ratones C57bl delgados normales, n = 2-3 (aproximadamente 30 gramos). Los compuestos de FGF21 se dosificaron como una dosis intravenosa única de 20 mg/kg (aproximadamente 5 ml/kg).
Los niveles plasmáticos de los compuestos del FGF21 se determinaron mediante el uso del ELISA específico para el Factor de Crecimiento de Fibroblastos-21 Humano (comercializado por BioVendor, núm. de catálogo RD191108200R). El software basado en PC, WinNonLin versión 6.3 de Pharsight Corportion, Cary N.C., se usó para el cálculo farmacocinético. Los resultados se proporcionan en la tabla 6.
Tabla 6: Perfiles farmacocinéticos de los análogos de FGF21.
Figure imgf000082_0001
Como puede observarse en la tabla 6, la vida media en plasma aumenta con la longitud de la cadena de ácido graso del elemento prolongador en los minicerdos y ratones.
Ejemplo 9: Reducción del peso corporal en ratones delgados
Para determinar la potencia in vivo de los derivados de FGF21, se estudió el efecto sobre el peso corporal en ratones C57BL delgados después de la administración subcutánea (s.c.). Se ha demostrado anteriormente que la pérdida de peso inducida por FGF21 en ratones delgados predice el efecto en ratones obesos y, por lo tanto, los ratones delgados se consideran un modelo de selección bueno.
Los compuestos se administraron por vía s.c. 1 mg/kg, ya sea una vez (QD) o dos veces (BID) diariamente en fosfato 10 mM, glicerol al 2 % (p/vol), polisorbato 80500 ppm (=0,05 %), pH=8,15, (2 ml/kg) durante 7 días (n=7-8). Los grupos respectivos tratados con vehículo (control) se trataron con fosfato 10 mM, glicerol al 2 % (p/vol), polisorbato 80 500 ppm (=0,05 %), pH=8,15, (2 ml/kg) s.c. dos veces al día durante 7 días (n=6-8). El peso corporal se midió antes de la dosificación y nuevamente después de 7 días de tratamiento. Los resultados pueden observarse en la Tabla 7.
Tabla 7: Cambio en el peso corporal desde el valor inicial (porcentaje) del día 1 a 7 Compuesto Dosificaci n/grupo Media SD
ón
A peso corporal (%) A peso corporal (%) Vehículo BID 8 2,84 2,65
1 BID 8 -1,88** 2,52
2 BID 8 -1,98** 3,33
14 QD 8 1,85 3,33
15 QD 8 -4 48*** 2,41
16 QD 8 -10,59*** 3,39
21 QD 8 0,18 2,12
Vehículo BID 6 0,44 3,27
13 BID 8 -2,04 1,30
14 BID 8 -3,09* 1,61
19 BID 7 0,04 1,11
20 BID 8 -0,94 2,94

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un derivado de una proteína FGF21,
    en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1)
    en donde dicho derivado comprende un prolongador unido a dicho residuo de Cys por medio de un enlazador; en donde el prolongador se selecciona del grupo de
    Químico 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,
    Químico 1B: HOOC-benceno-O-(CH2)x-CO-*
    y
    Químico 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
    en donde x es un número entero en el intervalo de 8-18; y
    en donde el enlazador comprende al menos uno del Químico 2, Químico 3 y Químico 4:
    en donde el Químico 2 se selecciona de:
    *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,
    *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*
    y
    *-NH-(CH2)m-ciclohexano-CO-*,
    en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5,
    en donde el Químico 3 es *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, en donde k es un número entero en el intervalo de 1-5 y n es un número entero en el intervalo de 1-5, y
    en donde el Químico 4 se selecciona de:
    *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
    y
    *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*
    en donde m es un número entero en el intervalo de 1-5; y
    en donde el Químico 2, Químico 3, y Químico 4 están interconectados por medio de enlaces amida y en la secuencia indicada, conectados en su extremo *-NH al extremo CO-* del prolongador, y en su extremo CH2-* al átomo de azufre del residuo de Cys en una posición correspondiente a la posición 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 o la posición 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    El derivado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el Químico 1 se selecciona del grupo de:
    Químico 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,
    Químico 1b: HOOC-benceno-O-(CH2)9-CO-*
    y
    Químico 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
    El derivado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el Químico 2 se selecciona del grupo de:
    Químico 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
    Químico 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*
    y
    Químico 2c: *-NH-CH2-ciclohexano-CO-*.
    4. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el Químico 4 se selecciona de:
    Químico 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*
    y
    Químico 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*.
    5. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en la posición correspondiente a la posición 167, 170. 171, 172, 173, 174, 175, 180 o 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1), tal como 180 de FGF21 humano maduro.
    6. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína comprende un residuo de Cys en la posición correspondiente a la posición 180 o 181 de FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
    7. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína comprende cambios de aminoácidos en una o más posiciones, correspondientes a una o más de las posiciones 121 o 168 del FGF21 humano maduro (SEQ ID n O:1).
    8. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína comprende una adición de un residuo de Ala en una posición correspondiente al N-terminal del FGF21 humano maduro (SEQ ID NO:1).
    9. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína comprende uno o más de 121Q y 168L, tal como 121Q o 168L o ambas.
    10. El derivado, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la proteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
    11. El derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 o 10.
    12. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el prolongador comprende el Químico 1a: HOOC-(CH2)16-c O-*.
    13. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador comprende uno, dos o tres del:
    Químico 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,
    Químico 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
    y
    Químico 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.
    14. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador consiste en un elemento del Químico 2, dos elementos del Químico 3, y un elemento del Químico 4.
    15. El derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el derivado es uno de los siguientes:
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 13)
    Figure imgf000106_0001
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 16)
    Figure imgf000107_0001
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 17)
    Figure imgf000107_0002
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Compuesto 18)
    C 113
    Figure imgf000108_0001
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 19)
    Figure imgf000108_0002
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 20)
    CHa
    H,Nvi> l l l ) l PDSSPL l QF GGQVRQR Yl Y TDDAQQT I A ................
    Figure imgf000109_0001
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 21);
    Figure imgf000109_0002
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 22)
    Figure imgf000110_0001
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Met[Cys181]FGF21 (Compuesto 24)
    Figure imgf000111_0001
    S{Beta-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21 (Compuesto 35)
    Figure imgf000111_0002
    Ácido 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-18-oxo-octadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21 (Compuesto 36)
    Figure imgf000112_0001
    S{Beta-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21 (Compuesto 37)
    Figure imgf000112_0002
    S{Beta-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (Compuesto 38)
    Figure imgf000112_0003
    Á c id o 18 -[[(1 S )-4 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -(2 -a c e ta m id o e tila m in o )-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-1 -c a rb o x i-4 -o x o -b u til]a m in o ]-18 -o x o -o c ta d e c a n o ic o -A la [G ln 121 ,L e u 168 ,C y s 174 ]F G F 21 (C o m p u e s to 39)
    Figure imgf000113_0001
    Ácido 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-16-oxo-hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (Compuesto 40)
    Figure imgf000113_0002
    S{Beta-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21 (Compuesto 41)
    Figure imgf000114_0001
    4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 43)
    Figure imgf000114_0002
    4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxo-butil]sulfonilamino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 44)
    Figure imgf000115_0001
    Acido 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icosanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 45)
    Figure imgf000116_0001
    Ácido 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-20-oxo-icosanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 46)
    Figure imgf000117_0001
    Acido (2S)-6-acetamido-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(16-sulfohexadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 47)
    Á c id o 12 -[[(1 S )-4 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -[[(1 S )-5 -a c e ta m id o -1 -c a rb o x i-p e n til]a m in o ]-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-1 -c a rb o x i-4 -o x o -b u til]a m in o ]-12 -o x o -d o d e c a n o ic o -A la [G ln 121 ,L e u 168 ,C y s 180 ]F G F 21 (C o m p u e s to 48 )
    Figure imgf000118_0001
    Ácido 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-20-oxoicosanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 50)
    Figure imgf000119_0001
    Ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxo-hexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 51)
    Figure imgf000119_0002
    Ácido 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-16-oxohexadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 52)
    Figure imgf000120_0001
    Acido 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]carbamoil]ciclohexil]metilamino]-18-oxooctadecanoico-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 53)
    Figure imgf000120_0002
    Á c id o 12 -[[4 -[[(1 S )-4 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -(2 -a c e ta m id o e tila m in o )-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-1 -c a rb o x i-4 -o x o -b u til]c a rb a m o il]c ic lo h e x il]m e tila m in o ]-12 -o x o -d o d e c a n o ic o -A la [G ln 121 ,L e u 168 ,C y s 180 ]F G F 21 (C o m p u e s to 54)
    Figure imgf000121_0001
    4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-carboxi-pentil]amino]-2-oxo-etoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-1-carboxi-4-oxo-butil]amino]-10-oxo-decoxi]ácido benzoico]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 55)
    Figure imgf000121_0002
    4 -[10 -[[4 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -[2 -[[(1 S )-5 -a c e ta m id o -1 -c a rb o x i-p e n til]a m in o ]-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-2 -o x o -e to x i]e to x i]e tila m in o ]-4 -o x o -b u til]s u lfo n ila m in o ]-10 -o x o -d e c o x i]á c id o b e n zo ico -A la [G ln 121 ,L e u 168 ,C y s 181 ]F G F 21 (C o m p u e s to 56)
    Figure imgf000122_0001
    16. Un derivado de una proteína FGF21, en donde dicho derivado es uno de los siguientes:
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(11-carboxiundecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 13)
    Figure imgf000122_0002
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 14);
    Figure imgf000123_0001
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 15)
    Figure imgf000123_0002
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 16)
    Figure imgf000124_0001
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Compuesto 17)
    Figure imgf000124_0002
    S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Compuesto 18)
    Figure imgf000125_0001
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 21);
    Figure imgf000126_0001
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 22)
    Figure imgf000126_0002
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Compuesto 23)
    Figure imgf000127_0001
    S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etilamino]-2-oxoetil]-Met[Cys181]FGF21 (Compuesto 24)
    Figure imgf000127_0002
    18. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para usar en un método de tratamiento y/o prevención de cualquiera de todas las formas de diabetes y enfermedades relacionadas, tales como obesidad, trastornos alimentarios, enfermedades cardiovasculares complicaciones diabéticas, y/o para mejorar los parámetros lipídicos, mejorar la función de las células p; y/o para retardar o prevenir la progresión de una enfermedad diabética; y/o para el tratamiento y/o la prevención de esteatosis hepática y enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD).
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