CN100587073C - 人成纤维细胞生长因子-21的重组表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人成纤维细胞生长因子-21的重组表达方法，本发明方法将FGF-21基因与分子伴侣Sumo序列融合，构建了一种新型原核表达载体，转化大肠杆菌，从而建立了一种工程菌，通过培养该工程菌并诱导表达即可获得FGF-21。本发明方法可促进蛋白的可溶性表达，有利于重组蛋白的正确折叠，便于蛋白的分离纯化。经活性检测证实，获得的重组蛋白具有较高的生物学活性，其生物活性与FGF-21标准品活性相当。

Description

人成纤维细胞生长因子-21的重组表达

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人成纤维细胞生长因子-21的重组表达。

背景技术

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)是一类由FGF基因家族成员编码的结构相关的蛋白质，目前已经发现23个成员，其中心区域都含有同源性为30％-70％的一段氨基酸序列。庞大的FGF家族成员作为细胞间的多功能信号分子调节着生物体的多种生理功能。

FGF-21是FGF家族的一个新成员，是一种可分泌蛋白，最早从老鼠胚胎中分离出。人的FGF-21cDNA编码209个氨基酸，与老鼠的FGF-21的氨基酸具有大约75％的同源性。人类的FGF-21氨基酸序列与FGF-19和FGF-23同源性分别为35％和24％。FGF-21、FGF-19和FGF-23与脂肪代谢有着密切的关系，近年来成为国际上肥胖和糖尿病研究的热点基因。如美国科学家最新研究发现，食用高脂肪低碳水化合物的食物能否达到减肥效果，取决于身体能否产生FGF-21来帮助脂肪代谢。这些研究显示，FGF-21分子对于脂肪的代谢和体重的控制非常重要，对这种分子进行研究，有助于找到治疗肥胖症的新方法。

FGF-21在糖尿病治疗方面的作用也有较好的研究前景。FGF-21对β细胞的功能和活性具有保护作用，它可以通过激活ERK1/2和Akt信号通路来提高胰β细胞的活性，而胰β细胞发生机能障碍正是糖尿病发病的主要原因。研究表明：FGF-21对胰β细胞的作用时发现，在小鼠胰岛和胰岛-1E细胞中，FGF-21激活细胞外信号调节激酶ERK1/2和Akt信号通路。FGF-21可以提高正常小鼠胰岛素mRNA水平和蛋白水平，但无葡萄糖诱导胰岛素分泌功能。FGF-21处理的糖尿病啮鼠动物，可以提高胰岛素量和葡萄糖诱导胰岛素分泌。正常或db/db小鼠进行FGF-21短期治疗降低了胰岛素水平，改善了葡萄糖清除率。持续处理8周的db/db小鼠餐后血糖正常，血浆胰岛素水平升高，但不影响胰岛细胞增殖。另外，FGF-21对糖脂毒性和细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡有局部保护作用。FGF-21可以在肝脏中优先表达。肝脏中的FGF-21在PPARalpha调节下可以作为肝脏中油脂保持稳定的调节剂，因此FGF-21作为肝脏油脂稳定的调节剂可以避免脂肪肝的发生。

许多疾病的发生特别是癌症都与FGF信号的异常有关。FGF-21作用于BalB/c3T3，NIH 3T3，HMECS细胞等，都没有促有丝分裂活性，这给FGF-21在肿瘤药物开发方面提供了非常好的信息。FGF-21是FGFs家族成员中第一个被报道在肝脏中优先表达的基因。研究发现，大量表达FGF-21可以抑制二乙基亚硝胺(DEN)导致的肝癌的发生。然而肿瘤发生以后，FGF-21对肿瘤的抑制作用便又消失。目前的研究已经证实，FGF-21可以通过与FGFR4结合来抑制肝细胞肿瘤的发展；而通过与FGFR1相互作用，加速肝癌的进程。利用转基因小鼠进行的实验研究表明，肿瘤发生以后，FGFR1的异常表达能加速细胞周期和新生血管生成从而促进DEN诱导的肝癌进程。可见在肝癌细胞分化过程中，FGF-21通过不同FGFR表现出两种截然不同的功能，但不会对肝癌发生率有影响。(Nishimura T，et al.Biochim Biophys Acta，2000，1492(1)：203-6；Yamashita T，Yoshioka M，Biochem Biophys Res Common，2000，277(2)：494-8；AlexeiKharitonenkov，et al.J Clin Invest.2005，115(6)：1627-1635；WolfWente，Alexander M，Efanov，et al..American Diabetes Association，2006，5：2470-2478；Inagaki T，Dutchak P，Zhao G，et al.Cell Metab，2007，5(6)：415-25；Hajime Yamauchi，YuheiHotta，Morichika Konishi，et al.EMBOreport，2006，7：649-654.)

因此，FGF-21的发现对于治疗糖尿病和一些新陈代谢疾病以及肝癌的早期治疗有着重要意义。FGF-21的研究以及在临床上的应用前景日益受到人们的关注。

迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质的宿主细胞，大肠杆菌的主要优点是：易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养可获得高产率的表达产物；细胞易于培养，从而可降低生产成本。然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓包涵体，即无生物学活性的不溶性聚合体。必须对包涵体进行变性--溶解--复性处理。这一过程获得的产物回收率很低，也影响了蛋白质活性。目前，国外研究显示，FGF-21的表达主要以包涵体形式存在，这给医学研究和药物开发带来了困难。

为了克服原核表达容易形成包涵体的缺点，人们采用分子伴侣技术，使目的基因与具有协助蛋白质跨膜运输、参与维持蛋白质高级结构、调节细胞的生长与分化等功能的分子伴侣基因共表达，以期在细胞所固有的分泌信号肽帮助下，实现前体分子的跨膜分泌和正确切割，并维持成熟的分泌蛋白的正确构象，在原核系统中高效表达外源蛋白。为此，我们采用Sumo分子伴侣与FGF-21基因融合，以提高FGF-21的可溶性表达。

本发明中，FGF-21基因通过与Sumo融合后，蛋白表达量明显提高。可溶性蛋白含量大大增加，通过DEAE-Sepharose FF阴离子交换、Ni-NTA亲和层析以及Sephadex G-25脱盐，最终获得蛋白纯度超过95％的具有较高生物学活性的FGF-21重组蛋白，为今后开展产业化生产奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供FGF-21的重组表达方法，为FGF-21的产业化提供可能。

本发明的方法是将FGF-21与Sumo融合表达。因而，本发明的另一个目的是提供编码Sumo-FGF-21融合蛋白的融合基因以及含有所述的融合基因的表达载体和转化所述表达载体的宿主细胞。

本发明再一个目的在于提供一种生产FGF-21的方法。

FGF-21的重组表达包括步骤：合成编码Sumo-FGF-21融合蛋白的融合基因；将所述融合基因连接到表达载体中；将所述表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达。

本发明所述的融合基因是通过将编码FGF-21的核苷酸序列与编码Sumo的核苷酸序列相连接，或者直接合成Sumo-FGF-21融合基因。具体地说，可以采用如下方法合成：

1.合成编码FGF-21的核苷酸序列：根据FGF-21基因去除信号肽的氨基酸序列，设计引物，通过PCR引物延伸的方法获得去除信号肽的FGF-21基因。

2.合成编码Sumo-FGF-21的融合基因：将编码FGF-21的核苷酸序列通过PCR引物延伸的方法连接到编码分子伴侣Sumo的核苷酸序列上。

应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，并转化相应的宿主。例如合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，克隆到pET-20b表达载体，转化BL21(DE3)感受态细胞。

本发明还提供了一种生产FGF-21的方法，其是通过培养上述转化的宿主细胞，诱导表达Sumo-FGF-21，分离纯化Sumo-FGF-21，切除Sumo部分，再经纯化获得FGF-21。

以SEQ ID NO.1为融合基因、pET-20b为表达载体，BL21(DE3)作为宿主为例，以下是生产人成纤维细胞生长因子FGF-21的方法，包括如下步骤：

1、培养转化后的宿主细胞，诱导表达Sumo-FGF-21：将转化后的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子，将筛选的阳性重组菌BL21(DE3)/pET-20b-Sumo-FGF21单菌落，接种到LB培养基中，37℃振荡培养16h。然后按5％比例转接到新鲜LB培养基中，进行温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化，经研究证实，OD值为0.6时，1mM IPTG在37℃诱导3h，超声波(100w，超声2s，间隔2s)破菌，适于蛋白FGF-21的可溶性表达。其中可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的90％以上。

2、分离纯化Sumo-FGF-21：收集菌体，破碎后离心，取上清液进行纯化、碱性洗脱，收集洗脱液，进行树脂亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得含Sumo-FGF-21的可溶性融合蛋白。

3、切除Sumo部分：利用Sumo蛋白酶切除分子伴侣部分：取分离纯化后的可溶性融合蛋白，加入Sumo蛋白酶，在适当的条件下进行酶切反应，反应终止后，进行SDS-PAGE检测。

4、纯化FGF-21重组蛋白：酶切后的融合蛋白进行树脂亲和层析，经洗涤、洗脱、脱盐，即得纯化后的FGF-21重组蛋白，再经SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析，证实蛋白纯度。

本发明中所述载体、宿主菌等可由商业途径得到，如pET-20b和BL21(DE3)购自Novagen公司。

本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，DNA序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作，可按照本领域已知的技术进行(参见Sambrook ct al.，Molecular Cloning：A LaboratoryMannual，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cola Spring Harbor，NY，1989)。

本发明FGF-21的重组表达方法，以分子伴侣Sumo作为融合标签，具有以下几方面优势：

1.抗蛋白酶解：在细胞内，蛋白酶解受到严密调控，通过降解空闲或错误折叠的蛋白维持细胞的稳定性。宿主表达的重组蛋白很容易被当成空闲蛋白被酶解从而降低表达水平。Sumo融合表达时，可能促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。

2.增加重组蛋白表达量：蛋白表达是一个很复杂的过程，通常依赖于mRNA的稳定性、转录效率、转录调控等。而重组蛋白的高效表达依赖于mRNA的拷贝数和稳定性、有效的转录起始延伸(强有效的启动子)、翻译的增强(密码子偏好性)。Sumo与蛋白融合表达时表达量明显增加，但确切的机理尚不清楚。

3.促进蛋白正确折叠：虽然E.coli是重组蛋白表达的首选，但由于缺乏蛋白折叠机制，表达很多真核蛋白，尤其是含有二硫键的蛋白时，很难形成正确结构。一旦蛋白大量表达，来不及正确折叠导致了蛋白形成非活性的包涵体(inclusion bodies)。因此，为了防止这种情况的出现，分子伴侣和折叠酶共表达，分泌表达，融合表达等策略相继出现。Sumo融合标签可以增强可溶性，部分原因可能是由于Sumo独特的结构。Sumo有一个亲水表面和一个高度疏水的内核，这对于在其它情况下不可溶的蛋白可能起到一个类似于洗涤剂的效果，从而增强所融合目的蛋白的可溶性。

4.能准确无误地切除融合标签：由于融合标签会影响重组蛋白的结构和功能，所以融合蛋白必须切除融合标签，通常采用化学或酶学方法，如Xa因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多问题，产率低、蛋白沉淀、酶切条件复杂、蛋白酶昂贵等，此外还经常产生非意愿的N-端。和其他蛋白酶不同，Sumo酶识别Sumo标签的三级结构，因而能准确地切除，不会产生延伸的N-端，而且酶切效率高，酶切条件(pH、温度和离子强度等)很宽松。

原核生物在自然状态下不存在Sumo蛋白，也不存在Sumo蛋白酶，因而，在基因工程中构建Sumo融合标签表达时不用担心胞内Sumo蛋白酶将融合蛋白的Sumo标签切除。其表达系统的构建也比较简单：可以直接在成熟Sumo的N-末端和C-末端-Gly-Gly的DNA序列上分别连上亲和层析纯化标签(6xHis)与目的蛋白的DNA序列，然后克隆到表达载体上，再导入宿主菌，进行SUMO融合蛋白的高效表达；在纯化目的蛋白时，使用高效的带有相同纯化标签(6x His)的Sumo蛋白酶将融合标签与目的蛋白水解切开，然后通过亲和层析柱(Ni-NTA Resin)，便很方便地分离到所需要的目的蛋白。

附图说明

图1：为Sumo-FGF-21的SDS-PAGE图，其中：1、诱导前；2、Marker；3、4分别是诱导3h和4h；

图2：为FGF-21重组蛋白的Western检测图，其中：1，2，3均为重组FGF-21；

图3：为FGF-21重组蛋白的细胞活性检测图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 FGF-21基因的PCR合成

根据FGF-21基因去除信号肽的氨基酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除信号肽的FGF-21基因。按照密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，利用在线软件Primer Finder及DNA STAR设计FGF-21引物，共14条(其核苷酸序列见序列表)，每两条之间含有20bp的互补序列，其中N端引物含有跟Sumo分子伴侣互补的序列。FGF-21基因通过桥式PCR合成。

FGF-21基因合成

PCR体系一：

10×pfu buffer     10μl

dNTP(2.5mM)        8μl

引物F1(10μmol)    2μl

引物R1(10μmol)    2μl

pfu DNA聚合酶      0.5μl

ddH2O              77.5μl

Total              100μl

PCR体系二：

10×pfu buffer     10μl

dNTP(2.5mM)        8μl

引物F2(10μmol)    2μl

引物R2(10μmol)    2μl

pfu DNA聚合酶      0.5μl

ddH2O              77.5μl

Total              100μl

反应程序：94℃变性5min；55℃退火5min；72℃延伸5min。经2％琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物分别命名为E1和E2。

PCR体系三：

10×pfu buffer     10μl

dNTP(2.5mM)        8μl

E1(10μmol)        2μl

E2(10μmol)        2μl

pfuDNA聚合酶       0.5μl

ddH2O            77.5μl

Total            100μl

反应条件同上。其它片段合成方法条件同上，最终得到全长的FGF-21基因。

实施例2 pET-20b-Sumo-FGF-21表达载体的构建

为了将合成的FGF-21基因同Sumo分子伴侣融合，根据Sumo序列N端设计合成引物P1，根据FGF-21基因c端设计引物P2，在含有FGF-21基因和Sumo分子伴侣的反应体系中，以P1，P2为引物，通过PCR扩增获得含有Sumo-FGF-21的融合基因。然后将该片段用NdeI和Xho I双酶切，与同样用两种酶双酶切的pET-20b质粒连接。

引物P1、P2的核苷酸序列：

P1：5’GGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCACG 3’

P2：5’CCGCTCGAG TCAGGAAGCGTAGCTGGGGCT 3’

PCR反应体系：

10×pfu buffer       2μl

dNTP(2.5mM)          2μl

引物P1(10μmol)      1μl

引物P2(10μmol)      1μl

FGF21 sequence：     0.5μl

含Sumo质粒           0.5μl

pfu DNA聚合酶        0.5μl

ddH2O                12.5μl

Total                20μl

反应程序：94℃变性5min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收。

实施例3：重组FGF-21蛋白的获得

1.诱导表达

将测序正确的pET-20b-Sumo-FGF21转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子。将筛选的阳性重组菌BL21(DE3)/pET-20b-Sumo-FGF-21单菌落，接种到LB培养基中，37℃振荡培养16h。然后按5％比例转接到新鲜LB培养基中，进行温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化。经研究证实，OD值为0.6时，1mM IPTG在37℃诱导3h，超声波(100w，超声2s，间隔2s)破菌，可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的90％以上。

2.蛋白质纯化

按照上述的融合蛋白表达的最优条件，扩大培养体积，诱导表达后收集菌体，破碎后离心收集上清，先进行DEAE-Sepharose FF纯化，用25mmol/L Tris-HCl+0.25mol/LNacl pH8.0进行洗脱。收集吸脱峰组分，进行Ni-NTA树脂亲和层析，用缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，10m mol/L咪唑平衡Ni-NTA树脂，将裂解液引流到平衡好的树脂柱中，上样完毕后用缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，40m mol/L咪唑进行洗涤。最后，以缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，250m mol/L咪唑进行目的蛋白SUMO的洗脱。收集各洗脱峰，并进行SDS-PAGE检测(见附图1)。

3.重组蛋白的Sumo蛋白酶切

参考Invitrogen(USA)公司SUMO蛋白酶(Cat.No.12588-018)的酶切条件，取两个1.5ml的Eppendorf管，分别加入49.9μgSumo-FGF21，并往此管中加入50μl SUMO蛋白酶，反应在酶切缓冲液(50m mol/L Tris-HCl，pH 8.0，150m mol/L NaCl，1m mol/L DTT)中进行，反应体系的终体积是150μl。置此溶液于4℃下，反应24h后，以6x SDS小分子上样缓冲液终止酶切反应，并进行12％SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色，分析酶切效果。

4.FGF-21重组蛋白的纯化

将酶切样品上样Ni-NTA树脂亲和层析，用缓冲液50m mol/LTris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，10m mol/L咪唑平衡Ni-NTA树脂，将裂解液引流到平衡好的树脂柱中，上样完毕后用缓冲液50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，40m mol/L咪唑进行洗涤。最后，以缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，250mmol/L咪唑进行目的蛋白SUMO的洗脱。洗脱后的蛋白进行SephadexG25脱盐，脱去咪唑和多余的NaCl，保存于-20℃中。纯化后的蛋白经SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析，证实蛋白纯度达95％以上。

实施例4：重组FGF-21蛋白的鉴定

Western检测

按照Biorade电转仪操作方法进行，首先剪PVDF膜适当大小，泡甲醇20min，然后同滤纸及海绵垫一起泡在转移缓冲液中。按照黑板-海绵垫-3层滤纸-PAGE胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵垫-白板的顺序，将胶固定好，黑板对着转移槽的黑板，黑板一边放置冰盒，将转移槽放在冰浴中300mA，转膜100min后，将PVDF膜取出，用1×丽春红染色，观察转膜效果。用0.01M PBS漂洗PVDF膜10min×2次，加封闭液(3％脱脂奶粉)封闭90min。然后将1∶100封闭液稀释的羊抗人的FGF-21多抗(Santa cruz)点到PVDF膜上，4℃湿盒中孵育过夜。第二日，取出PVDF膜用PBS洗膜10min×2次。室温下与结合有HRP的兔抗羊的二抗(1∶200)孵育90min。用含0.05％Tween 20的PBST洗膜10min×2次，再用PBS洗膜10min。将PVDF膜在DAB显色液中显色，至特异性杂交带出现后，用H2O终止显色。

细胞活性检测

表达FGFR的BaF₃细胞以3×104个/ml浓度接种于96孔板中，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5％CO2浓度及饱和湿度恒温培养箱中培养，选用对数生长期的细胞作为受试对象，换成无血清培养液刺激过夜，换成2.5％小牛血清的RPMI1640培养液，并加不同浓度的重组FGF-21蛋白，以不加FGF-21的细胞组为对照，分别培养48hr后，每孔加入MTT 10μl(5mg/ml)，37℃，5％CO₂浓度及饱和湿度恒温培养箱中培养4hr后，小心弃掉上清，加入DMSO 110μl，室温放置30min后，用酶标仪测570nm的吸光值，以630nm为参考波长。结果显示，在一定蛋白浓度下，重组FGF-21蛋白对BaF₃具有显著的促增殖作用(P＜0.01)；与FGF-21标准品蛋白的活性相当。

图中矩形标准的线条为不加FGF-21蛋白的对照，圆标注的曲线为FGF-21标准品蛋白，三角形标注的曲线为本发明表达的重组FGF-21蛋白。

序列表说明：SEQ ID NO.1为Sumo-FGF-21的核苷酸序列，SEQID NO.2为Sumo-FGF-21重组蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO.3～16是合成FGF-21的引物序列，SEQ ID NO.17&18为引物P1&P2。

<110>吉林农大生物反应器工程有限公司

<120>人成纤维细胞生长因子-21的重组表达方法

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>864

<212>DNA

<213>Sumo-FGF-21

<400>1

atgcatcatc atcatcatca cggcatgtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca     60

gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct    120

tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc    180

gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt    240

caagctgatc agacccctga agatttggac atggaggata acgatatcat tgaggctcac    300

agagaacaga ttggtggtca ccccatccct gactccagtc ctctcctgca attcgggggc    360

caagtccggc agcggtacct ctacacagat gatgcccagc agacagaagc ccacctggag    420

atcagggagg atgggacggt ggggggcgct gctgaccaga gccccgaaag tctcctgcag    480

ctgaaagcct tgaagccggg agttattcaa atcttgggag tcaagacatc caggttcctg    540

tgccagcggc cagatggggc cctgtatgga tcgctccact ttgaccctga ggcctgcagc    600

ttccgggagc tgcttcttga ggacggatac aatgtttacc agtccgaagc ccacggcctc    660

ccgctgcacc tgccagggaa caagtcccca caccgggacc ctgcaccccg aggaccagct    720

cgcttcctgc cactaccagg cctgcccccc gcactcccgg agccacccgg aatcctggcc    780

ccccagcccc ccgatgtggg ctcctcggac cctctgagca tggtgggacc ttcccagggc    840

cgaagcccca gctacgcttc ctga                                           864

<210>2

<211>287

<212>PRT

<213>Sumo-FGF-21

<400>2

Met His His His His His His Gly Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1               5                   10                  15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

            20                  25                  30

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

        35                  40                  45

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

    50                  55                  60

Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

65                  70                  75                  80

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

                85                  90                  95

Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly His Pro Ile Pro Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr

        115                 120                 125

Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp

    130                 135                 140

Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln

145                 150                 155                 160

Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr

                165                 170                 175

Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu

            180                 185                 190

His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp

        195                 200                 205

Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu

    210                 215                 220

Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala

225                 230                 235                 240

Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro

                245                 250                 255

Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu

            260                 265                 270

Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

        275                 280                 285

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagt           47

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctgtctgctg ggcatcatct gtgtagaggt accgctgccg gacttggccc ccgaattgc    59

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gatgatgccc agcagacaga agcccacctg gagatcaggg aggatgggac ggtgggggg    59

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tttcagctgc aggagacttt cggggctctg gtcagcagcg ccccccaccg tcccatcct    59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aagtctcctg cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt caaatcttgg gagtcaaga    59

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tacagggccc catctggccg ctggcacagg aacctggatg tcttgactcc caagatttg    59

<210>9

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ggccagatgg ggccctgtat ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc agcttccgg    59

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cggactggta aacattgtat ccgtcctcaa gaagcagctc ccggaagctg caggcctca    59

<210>11

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tacaatgttt accagtccga agcccacggc ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtc    59

<210>12

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gaagcgagct ggtcctcggg gtgcagggtc ccggtgtggg gacttgttcc ctggcaggt    59

<210>13

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

ccgaggacca gctcgcttcc tgccactacc aggcctgccc cccgcactcc cggagccac    59

<210>14

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gaggagccca catcgggggg ctggggggcc aggattccgg gtggctccgg gagtgcggg    59

<210>15

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

cccccgatgt gggctcctcg gaccctctga gcatggtggg accttcccag ggccgaagc    59

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ccgctcgagt caggaagcgt agctggggct tcggccctgg gaaggt    46

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ggaattccat atgcatcatc atcatcatca cg                   32

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ccgctcgagt caggaagcgt agctggggct                      30

Claims (4)

1、一种融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、含有权利要求1所述融合基因的表达载体，其通过以下方法制备：以P1、P2为引物，通过PCR扩增获得含有权利要求1所述基因的片段，然后将该片段用NdeI和XhoI双酶切，与同样用这两种酶双酶切的pET-20b质粒连接，其中P1核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，P2核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

3、含有权利要求2所述表达载体的大肠杆菌BL21。

4、一种生产人成纤维细胞生长因子的方法，包括步骤：培养权利要求3所述的大肠杆菌BL21，诱导表达由SEQ ID NO.1所编码的融合蛋白，分离纯化由SEQ ID NO.1所编码的融合蛋白，切除Sumo部分，纯化FGF-21重组蛋白。

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