CN111269916B - 一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人骨形成蛋白2编码序列，所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)或(b)结构的核苷酸序列；其中所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2。本发明根据大肠杆菌表达系统设计了适合该表达系统的优化的人骨形成蛋白2编码序列，通过优化密码子获得更高的目的蛋白的表达量。本发明还提供一种大肠杆菌表达系统表达的人骨形成蛋白2纯化方法，通过该纯化方法可得到纯度达到95％以上的本发明的人骨形成蛋白2。

Description

一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因
技术领域
本发明属于蛋白质或多肽技术领域，具体涉及一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因。
背景技术
人骨形成蛋白2(rhBMP2)的基因工程制备，最先是美日研究机构利用人骨形成蛋白2天然编码基因用真核细胞系统来做的，表达水平低，成本比较高，规模化生产所需投资和软硬件要求高，国内的研究者往往直接用人骨形成蛋白2转基因的可向骨细胞分化的干细胞和材料复合用于成骨研究。另一人骨形成蛋白2的基因工程的技术路线是利用大肠杆菌来进行，利用天然编码序列就能得到高水平表达，国内外都有相应的研究报道，从成本和、软硬件要求和投资需求方面都有比较优势。由于人骨形成蛋白2天然基因的终止密码子终止能力较弱，我们和德国的研究机构都发现该天然编码基因在大肠杆菌中不能有效地的终止，会产生1/3强比例的比天然人骨形成蛋白2大3kDa左右的产物，且在纯化过程中难于去掉。德国同行的办法是用特殊的表达系统，且在研究中发现人骨形成蛋白2成熟肽的N段是一个肝素结合位点，去掉这个肝素结合位点不影响生物学活性，且因不会被细胞外基质非特异吸附截留，体现出更高的生物活性。也有对人骨形成蛋白2天然基因进行部分优化进行大肠杆菌表达的研究，还有加入胶原结合序列等功能位点进行局部受控缓释的人骨形成蛋白2大肠杆菌基因工程研究。
发明内容
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
第一个目的，本发明提供了一种人骨形成蛋白2基因，所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)或(b)结构的核苷酸序列；其中所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2。
本发明人发现了氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的人骨形成蛋白2，为了研究其在大肠杆菌中的表达机理，本发明针对大肠杆菌的表达系统密码子的偏好性对人骨形成蛋白2的核苷酸序列进行了优化，使其更适用于大肠杆菌表达系统，设计优化后的人骨形成蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，将该序列与质粒连接转入大肠杆菌表达系统，结果获得更高的表达量，因此，本发明设计的编码人骨形成蛋白2的核苷酸序列适用于大肠杆菌表达载体，能提高人骨形成蛋白2在该载体系统中的蛋白表达量。
进一步地，所述人骨形成蛋白2基因具有(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。
为了质粒与目的基因连接时限制性内切酶能更精准的进行酶切，而不破坏目的基因序列，在截短型人骨形成蛋白2编码序列前加上了限制性内切酶EcoRI的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，在截短型人骨形成蛋白2编码序列后加上了限制性内切酶HindIII的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，其核苷酸如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二个目的在于提供了一种人骨形成蛋白2的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列与质粒载体连接；
(2)将步骤(1)制备的质粒转入原核细胞表达载体；
(3)将步骤(2)的原核细胞培养于含有抗生素的平板中筛选阳性克隆细胞；
(4)抽提阳性克隆细胞的质粒，进行测序判定质粒载体中的目的基因是否正确；
(5)将正确表达的阳性细胞扩大培养，收集菌体，分离纯化细胞破碎的上清液，获得人骨形成蛋白2；
其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQID NO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。
优选地，所述原核细胞表达载体为大肠杆菌BL21(DE3)；所述质粒为pEVT质粒；所述抗生素为氨苄。
优选地，所述步骤(4)中的分离纯化采用以下方法：将收集的细胞上清液采用反向层析纯化，再进行阴离子层析，在收集的纯化溶液中加入复性液，复性24h，然后进行阴离子交换层析，最后用分子排阻层析纯化，获得人骨形成蛋白2。
优选地，所述反向层析的条件为：分离介质：SOURCE30RPC，洗脱液：pH8.5，6mol/L尿素中含有0～40％异丙醇；所述复性液为：2mol/L尿素溶液中包含0.1％(V/V)TritonX100，1mM还原型谷胱苷肽，1g/L聚乙二醇4000，5％(V/V)甘油，pH8.5；所述阴离子交换层析的条件为：分离介质：SOURCE 30Q，洗脱液：pH8.5，1.5mol/L尿素中含有0～1mol/L氯化钠；所述分子排阻层析的条件为：分离介质：Sephacryl s100，洗脱液：pH7.5，0.15mol/L氯化钠。
通过本发明的蛋白纯化方法可得到纯度达到95％以上的本发明的rhBMP2，经蛋白含量的测定各批次产量为359～378mg/L。
本发明的第三个目的在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的第四个目的在于提供一种质粒，所述质粒包含具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。
优选地，所述质粒为pEVT。
本发明的第五个目的在于提供如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列在制备促骨细胞分化钙化的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明根据大肠杆菌表达系统设计了适合该表达系统的优化的人骨形成蛋白2编码序列，通过优化密码子获得较高水平的目的蛋白的表达量，没有出现天然基因在大肠杆菌中表达产物不均一的现象。
附图说明
图1为人骨形成蛋白2重组表达载体的构建过程示意图。
图2为人骨形成蛋白2重组蛋白SDS电泳图(1：未诱导表达工程菌；2：诱导表达工程菌；3：分子量Marker：116000,66000,45000,35000,25000,18000,14000,单位：道尔顿；4：纯化复性后的半成品；5：半成品的western-blot)。
图3为本发明的人骨形成蛋白2的第三方检测报告。
图4为本发明的人骨形成蛋白2的第三方检测报告。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1人骨形成蛋白2(rhBMP2)的编码序列的合成
本发明人发现了氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的人骨形成蛋白2，为了使其能在大肠杆菌中更好的表达，本实施例所选大肠杆菌表达系统为BL21(DE3)。发明人针对大肠杆菌BL21(DE3)表达系统密码子的偏好性对人骨形成蛋白2的核苷酸序列进行了优化，使其更适用于大肠杆菌表达系统，设计优化后的人骨形成蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，将该序列与质粒连接转入大肠杆菌表达系统，结果获得更高的蛋白表达量。
将优化过的人骨形成蛋白2的核苷酸序列与质粒载体进行连接，以便进一步转入宿主细胞进行蛋白表达，本实施例所选质粒为pEVT。为了质粒与目的基因连接时限制性内切酶能更精准的进行酶切，而不破坏目的基因序列，因此发明人设计了在截短型人骨形成蛋白2编码序列前加上了限制性内切酶EcoRI的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，在截短型人骨形成蛋白2编码序列后加上了限制性内切酶HindIII的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，其核苷酸如SEQ ID NO:2所示。
实施例2人骨形成蛋白2(rhBMP2)的表达以及纯化
本发明委托上海捷瑞生物技术有限公司人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因片段，然后将其连接入pEVT载体(New England Biolabs公司)的EcoR I和Hind III的酶切位点之间，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，于含氨苄青霉素50mg/L的LB平板上筛选，筛选阳性的菌中包含的表达载体被命名为pEVT-hBMP2，抽提质粒，测序鉴定正确。
取阳性菌接种于5mL LB培养基中，以30℃、200r/min培养12h，然后以按2％(V/V)接种量接种于400mL LB培养基中，以30℃、200r/min培养8h。然后进行发酵，将上述培养的400mL发酵种子菌接种入8L发酵培养基(每升含：蛋白胨5g，甘油5mL，十二水磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵1.5g，氯化铵1g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钙0.02g，硫酸亚铁0.04g，甘氨酸0.5g，pH7.0)中，利用NBS Bioflo IV20L发酵罐进行发酵，发酵全过程共20h，期间pH始终控制在7.0～7.2；溶解氧控制在40％(空气流量设定为12L/min，搅拌速度为200r/mim～1000r/min)；当细菌密度OD600达到20时，加入0.35mM的IPTG进行诱导表达；在未加入IPTG前，当以最低搅拌速度搅拌，溶解氧仍旧在在3min内持续达到60％或以上，则补加补料培养基(每升含：甘油120mL，蛋白胨50g，酵母抽提物50g，七水合硫酸镁2g，pH7.0)直至溶解氧恢复到40％；在加入IPTG后，当以最低搅拌速度搅拌，溶解氧仍旧在在3min内持续达到50％或以上，则补加上述补料培养基直至溶解氧恢复到40％。取样溶菌后用15％SDS-PAGE检测，在14kDa有大量表达。
离心收集菌体后，每10g湿重菌体加入8摩尔/升的尿素150mL变性溶解，在冰浴下，搅拌裂解8小时，取上清液，采用反相层析纯化(分离介质：SOURCE30RPC，在pH8.5，6M尿素条件下，以0～40％异丙醇梯度洗脱纯化)；再用阴离子柱离子层析纯化(分离介质：SOURCE30Q，在pH8.5，8M尿素条件下，以0～1mol/L氯化钠梯度洗脱纯化)；以SDS-PAGE检测收集纯化所得的相应峰，然后加入复性液(含：2摩尔/升尿素，0.1％(V/V)TritonX100，1mM还原型谷胱苷肽，1克/升聚乙二醇4000，和5％(V/V)甘油，pH8.5)中复性24h；再用阴离子交换层析纯化(分离介质：SOURCE 30Q，在pH8.5，1.5M尿素条件下，以0～1mol/L氯化钠梯度洗脱)；再用分子排阻层析纯化(分离介质：Sephacryl s100，在pH7.5，0.15mol/L氯化钠的条件下洗脱纯化)；采用SDS-PAGE检测收集纯化所得的相应峰，通过本发明的蛋白纯化方法可得到纯度达到95％以上的本发明的rhBMP2，经蛋白含量的测定各批次产量为359～378mg/L(图2、3)。
实施例3人骨形成蛋白2(rhBMP2)的活性测定(甲基百里香酚蓝比色法)
1.材料：
血清钙试剂盒(南京建成生物工程研究所)，试剂盒组成：试剂一(40ml/瓶)、试剂二(80ml/瓶)、钙标准液(0.1mg/ml)；其他试剂为化学纯。
测活样品的制备和样品植入实验用器材均应经过消毒处理。
2.方法：
(1)测活样品的制备：市售的体内医用胶原膜，在超净台中用剪刀切开密封袋，用特制打孔器把胶原膜裁成圆片，放入48孔细胞培养板的孔内，每孔放一片。将原液用无菌水配成合适的浓度，按每片胶原膜1微克本发明的rhBMP-2的复合量用移液器加入到48孔板有胶原膜片的孔中，注意：在复合rhBMP-2之前，要先在每片胶原膜上加入rhBMP-2复合体积的1/50的1M磷酸氢二钠，以使rhBMP-2充分析出，增强缓释效果。盖好盖子，冻干后即可用于半成品的活性测定。
本步骤设置了实验组和对照组，以及对比例组：实验组1中的rhBMP-2为核苷酸序列SEQ ID NO:1编码的人骨形成蛋白2；实验组2中的rhBMP-2为核苷酸序列SEQ ID NO:2编码的人骨形成蛋白2；对照组中以生理盐水作为对照；对比例1中的rhBMP-2为未优化过的基因编码的人骨形成蛋白2；对比例2为中国专利201410310953中的人骨形成蛋白2；对比例3为中国专利201510731405.7中的人骨形成蛋白2；对比例4为中国专利200910045832中的人骨形成蛋白2。
(2)样品植入：昆明种雄性小白鼠10只，体重18～22g。样品包埋组用乙醚吸如法麻醉，后肢股部皮肤消毒，切开皮肤，分离肌间隙，把吸附rhBMP-2的胶原膜片植入肌间隙。缝合皮肤，正常饲养。
(3)植入区组织取材及测定样品的制备：样品植入后14天，取植入区组织，(残留少量的肌肉组织不会影响钙测定)，把植入区组织剪碎成2～3mm的小块，放入试管，每管加1ml0.6ml/L HCl，加盖，密封，在室温放置24h以上。离心，取上清，用于测定钙含量。
(4)钙测定工作液配制：将血清钙试剂盒中的试剂一和试剂二按1：2比例混合，此混合液即为工作液。临用时新鲜配制，室温放置不超过12h。
(5)标准钙曲线制作及钙测定：标准钙原液浓度为0.1mg/ml，比色测定在96孔板中进行，标准曲线制作及样品测定为：
Figure BDA0002414652270000071
Figure BDA0002414652270000081
每孔做两个复孔，各加工作液300μl，混匀，静置5分钟。用酶联测定仪610nm测定光吸收，制作标准曲线。标准曲线以OD610值为Y轴，钙含量为X轴。根据标准曲线的截距(b)和斜率(a)及未知样品的OD值，可利用标准曲线的直线公式(Y＝aX+b)，求出未知样品的钙量，并计算出新生骨钙量。样品组10个数据舍去最高与最低值，取其余8个值的平均值。
(6)rhBMP-2生物学活性单位定义为：rhBMP-2植入小鼠股部肌间隙14天时，植入区钙生成1μg为一个生物学活性单位，其英文简写为BU。
rhBMP-2的比活性定义为rhBMP-2的生物学活性单位(BU)与植入的rhBMP-2量(mg)之比，单位为：BU/mg。备注：预实验证明小鼠肌肉组织及未复合rhBMP-2的胶原不会对结果造成影响。
3、实验结果：结果如表1所示：
表1：各组人骨形成蛋白2的比活性结果
分组 比活性(BU/mg)
实验例1 8.8×104
实验例2 11.2×104
对照组 0.5×104
对比例1 4.72×104
对比例2 5.31×104
对比例3 5.72×104
对比例4 6.14×104
上述结果可知，试验例中的rhBMP2的比活性均高于对比例，这说明通过密码子优化的核苷酸序列更适用于大肠杆菌表达系统。试验例2的比活性高于实验例1的比活性，这说明经过在截短型人骨形成蛋白2编码序列后加上了限制性内切酶HindIII的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，质粒与目的基因连接时限制性内切酶能更精准的进行酶切，提高了rhBMP2的比活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海深泓鑫生物科技有限公司
<120> 一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因
<130> 11.18
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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ggttggaatg attggattgt tgcaccacct ggttatcatg cattctactg tcatggtgaa 120
tgtccatttc cactagcaga tcatctgaac agtacaaatc atgcaattgt acaaacactt 180
gtaaacagtg tgaacagcaa gataccaaaa gcatgttgtg taccaactga actgagtgca 240
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gttgttgaag gatgtggatg tcgttaataa 330
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<400> 3
Met Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp
1 5 10 15
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr
20 25 30
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
35 40 45
Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
50 55 60
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
65 70 75 80
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
85 90 95
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
100 105

Claims (9)

1.一种人骨形成蛋白2基因，其特征在于：
所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)结构的核苷酸序列，所述(a)的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2. 如权利要求1所述的人骨形成蛋白2基因，其特征在于：所述人骨形成蛋白2的基因具有(c)结构的核苷酸序列，所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
(1)将具有(a)或(c)结构的核苷酸序列与质粒载体连接；
(2)将步骤(1)制备的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)；
(3)将步骤(2)的大肠杆菌BL21(DE3)培养于含有抗生素的平板中筛选阳性克隆细胞；
(4)抽提阳性克隆细胞的质粒，进行测序判定质粒载体中的目的基因是否正确；
(5)将正确表达的阳性细胞扩大培养，收集菌体，分离纯化细胞破碎的上清液，获得人骨形成蛋白2；
其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求3所述的人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于：所述质粒为pEVT质粒；所述抗生素为氨苄。
5.如权利要求3所述的人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的分离纯化采用以下方法：
将收集的细胞上清液采用反向层析纯化，再进行阴离子层析，在收集的纯化溶液中加入复性液，复性24h，然后进行阴离子交换层析，最后用分子排阻层析纯化，获得人骨形成蛋白2。
6.如权利要求5所述的人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于：所述反向层析的条件为：分离介质：SOURCE30RPC，洗脱液：pH8.5，6mol/L尿素中含有0～40％异丙醇；所述复性液为：2mol/L尿素溶液中包含0.1％(V/V)TritonX100，1mM还原型谷胱苷肽，1g/L聚乙二醇4000，5％(V/V)甘油，pH8.5；所述阴离子交换层析的条件为：分离介质：SOURCE 30Q，洗脱液：pH8.5，1.5mol/L尿素中含有0～1mol/L氯化钠；所述分子排阻层析的条件为：分离介质：Sephacryls100，洗脱液：pH7.5，0.15mol/L氯化钠。
7.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含具有(a)或(c)结构的核苷酸序列；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
8. 一种质粒，其特征在于：所述质粒包含具有(a)或(c)结构的核苷酸序列；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(c)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9. 如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列在制备促骨细胞分化钙化的药物中的应用。
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