KR100865759B1

KR100865759B1 - 사람의 골형성단백질-2를 암호화하는 유전자를 이용한 재조합된 사람의 골형성단백질-2의 제조방법

Info

Publication number: KR100865759B1
Application number: KR1020070044322A
Authority: KR
Inventors: 조성우; 허재완; 최명민; 김은아; 임효진; 김태우
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2007-05-07
Filing date: 2007-05-07
Publication date: 2008-10-29

Abstract

본 발명은 사람의 골형성단백질-2(hBMP-2)를 암호화하는 새로운 염기서열을 갖는 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터를 이용하여 재조합된 사람의 골형성단백질-2를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 사람의 BMP-2를 암호화하는 신규한 유전자를 사용할 경우, 재조합 대장균에서 봉입체가 아닌 가용화된 형태의 BMP-2를 제조할 수 있으므로, 활성이 우수한 사람의 BMP-2의 대량생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

사람의 골형성단백질-2, 가용화된 형태, 대장균

Description

사람의 골형성단백질-2를 암호화하는 유전자를 이용한 재조합된 사람의 골형성단백질-2의 제조방법{Process for Preparing Recombinant Human BMP-2 Employing Gene Coding for Human BMP-2}

도 1은 본 발명의 사람의 골형성단백질-2를 암호화하는 신규한 유전자 HBMP-2를 합성하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 본 발명의 발현벡터 pHBMP-2의 유전자 지도이다.

도 3은 본 발명의 형질전환체로부터 발현된 단백질의 전기영동사진이다.

도 4는 rhBMP-2 단량체 및 이량체의 처리농도에 따른, 알칼라인 포스파타제 활성도의 변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 사람의 골형성단백질-2를 암호화하는 신규한 유전자 및 이를 이용한 재조합된 사람의 골형성단백질-2의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 사람의 골형성단백질-2(hBMP-2)를 암호화하는 새로운 염기서열을 갖 는 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터를 이용하여 재조합된 사람의 골형성단백질-2를 제조하는 방법에 관한 것이다.

골형성단백질-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)는 비근골격계 조직에서 이소성 골 형성(heterotopic ossification)을 촉진시킬 수 있는 일련의 골 기질 단백질의 일종으로, 114개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드의 이량체이다(참조: Wozney et al., Science, 242:1528-1534, 1988; Celeste et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:9843-9847, 1990). 상기 BMP-2는 섬유아세포 성장인자와 상호작용하여 연골세포와 골모세포 전구체의 형성을 유도할 뿐만 아니라, 표피조직의 발생을 유도하며, 신경세포의 분화를 유도할 수도 있는 것으로 알려져 있다(참조: Niswander and Martin, Development, 119:287-294, 1993; Wall and Hogan, Curr. Opin. Genet. Dev., 4:517-522, 1994).

이러한, BMP-2는 다양한 포유동물에서 장골의 결손을 치료할 수 있고(참조: Murakami et al., J. Biomed. Mater. Res., 62:169-174, 2002), BMP-2 유전자가 이식된 골수의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)와 생물학적으로 재흡수가능한 고분자를 이용하여 골결손을 치료할 수 있다는 연구결과에 따라(참조: Chang et al., Gene Ther., 10:2013-2019, 2003), BMP-2의 골다공증을 비롯한 다양한 골결손의 치료효과에 대하여 주목하게 되었다.

최근에는, 재조합된 사람의 BMP-2(이하, 'rhBMP-2'라 함)를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 인산칼슘 담체 또는 리포좀 담체를 이용하여 투여한 rhBMP-2가 척골을 절골시킨 토끼와 대퇴골을 결손시킨 쥐의 골결손의 치유를 촉진시키고(참조: Li et al., J. Orthop. Res., 21:997-1004, 2003; Matsuo et al., J. Biomed. Mater. Res., 66A:747-754, 2003). 척추 융합 수술시에 rhBMP-2를 투여하면, 종래의 골 이식물을 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 환자 자신의 골 이식물 보다도 융합 성공율이 향상된 다는 보고가 있었다(참조: Sandhu, Spine, 28:S64-S73, 2003).

한편, rhBMP-2는 두 가지 방법으로 제조되는데, 하나는 hBMP-2 유전자로 형질전환된 CHO 세포에서 rhBMP-2를 발현시키는 방법이고, 다른 하나는 hBMP-2 유전자로 형질전환된 대장균 세포에서 rhBMP-2를 발현시키는 방법이다. 형질전환된 CHO 세포에서 발현시킨 rhBMP-2는 높은 생물학적 활성을 갖는 반면, rhBMP-2의 발현량이 적어 제조단가가 높다는 단점이 있었다. 한편, 형질전환된 대장균 세포에서 발현시킨 rhBMP-2는 대부분 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현되어, 이를 재접힘(refolding)하여 가용화시키는 공정에 의하여 재활성화되기 때문에, 상대적으로 생물학적 활성이 낮아서, 형질전환된 CHO 세포에서 생산된 rhBMP-2와 동등한 수준의 치료효과를 나타내기 위하여는 상대적으로 많은 량의 rhBMP-2를 사용하여야만 하였다. 따라서, 골 관련 질환의 치료에 형질전환된 대장균에서 생산된 rhBMP-2를 사용하거나 또는 형질전환된 CHO 세포에서 생산된 rhBMP-2를 사용할 경우, 사용되는 rhBMP-2의 전체 비용은 상호 동등한 수준으로 높았는 바, rhBMP-2를 보다 경제적으로 생산할 수 있는 기술의 개발이 요청되었다.

상술한 바와 같이, rhBMP-2는 모든 골 관련 질환의 치료에 활용될 수 있으므 로, 생물학적 활성이 저하되지 않은 rhBMP-2를 대량으로 제조할 수 있다면, 보다 많은 골 관련 질환의 환자에게 혜택을 줄 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 아직까지는 활성이 우수한 rhBMP-2를 경제적으로 제조하는 방법이 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 경제적으로 rhBMP-2를 생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 대장균에서의 발현율을 향상시킨 새로운 염기서열을 갖는 사람의 BMP-2를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 작제하고, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양할 경우, 생물학적 활성이 우수한 재조합된 rhBMP-2를 대량으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 대장균에서의 발현율을 향상시킨 새로운 염기서열을 갖는 사람의 BMP-2를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 상기 형질전환된 대장균을 배양하고, 이로부터 rhBMP-2를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 생물학적 활성이 저하된 rhBMP-2가 제조되는 종래기술의 문제점을 극복하여, 재조합 대장균에서 rhBMP-2를 정상적인 형태로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자, 대장균의 발현빈도가 높은 코돈세트를 이용하여, 종래의 rhBMP-2를 암호화하는 유전자 대신에, 동일한 rhBMP-2의 아미노산 서열(서열번호 1)을 암호화하면서도, 염기서열이 종래의 유전자와 상이한 유전자(서열번호 2)를 설계하였다.

구체적으로, rhBMP-2 아미노산 서열에 근거하여, 제한효소 인식부위를 중간에 삽입하고 대장균에서 사용빈도가 높은 코돈을 사용하며, 리보솜 결합부위를 부가하여 어떠한 벡터를 사용하더라도 발현이 가능하도록 하고, 시작부위와 끝 부위에 정지코돈을 포함하도록 유전자의 염기서열을 설계하였다. 이렇게 설계한 유전자를 6조각으로 나누어 합성하고, 2개씩 결합시켜서 3개의 큰 조각을 형성한 다음, 이들 3개의 유전자를 pUC18에 클로닝하고 염기서열을 분석하여, rhBMP-2를 암호화할 수 있는 유전자임을 확인하고, 상기 새로이 합성된 유전자를 "HBMP-2"라 명명하였다.

rhBMP-2의 아미노산 서열(서열번호 1):

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

rhBMP-2를 암호화하는 신규한 유전자 HBMP-2의 염기서열(서열번호 2):

5'-atgcaggctaaacacaaacagcgcaaacgccttaagagcagctgcaaacgccacccgctgtacgtagacttcagcgacgttggttggaacgactggatcgttgctccgccgggttaccacgctttctactgccacggtgaatgcccgttcccgctggctgaccacctgaacagcaccaaccacgctatcgtgcagaccctggttaacagcgtaaacagcaaaatcccgaaagcatgctgcgttccgaccgagctgagcgcaatctctatgctgtacctggacgaaaacgaaaaagttgttctgaaaaactaccaggacatggttgttgaaggttgcggttgccgc-3'

상기 합성된 HBMP-2 유전자를 pCold 벡터에 클로닝하여 발현벡터 pHBMP-2를 작제하고(참조: 도 2), 이황화결합의 형성을 허용하는 대장균주인 Origami B(DE3)에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. BMP-2는 단량체로 발현되지만, 이량체를 형성한 후에 생물학적인 활성을 나타내며, 상기 이량체는 이황화결합에 의하여 형성되므로, 이황화결합의 형성을 허용하는 대장균주를 사용하는 것이 필수적이다. 상기 형질전환체를 배양하여 rhBMP-2를 발현시켰으며, 배양된 형질전환체를 파쇄하 여 단백질 분획을 수득하고, 이를 순차적인 컬럼크로마토그래피에 적용하여 rhBMP-2를 정제하였다. 상기 정제한 rhBMP-2는 약 24kDa의 분자량을 나타내었으나, 이를 SDS-PAGE에 적용한 결과, 약 12kDa의 분자량을 나타내었으므로, 상기 정제한 rhBMP-2는 이량체로 존재함을 알 수 있었다.

아울러, 상기 정제한 rhBMP-2의 생물학적 활성을 측정하기 위하여, 단량체 및 이량체 rhBMP-2가 처리된 C2C12 세포에서의 알칼라인 포스파타제의 활성증가 정도를 측정한 결과(참조: Katagiri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 172:295-299, 1990), 단량체 rhBMP-2의 처리양을 증가시킬 경우 알칼라인 포스파타제의 활성이 변화되지 않은 반면, 이량체 rhBMP-2의 처리양을 증가시킬 경우 알칼라인 포스파타제의 활성이 이에 비례하여 증대되었으므로, 상기 정제한 rhBMP-2가 가용화된 형태임을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업게에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합된 사람의 골형성단백질-2(rhBMP-2)를 암호화하는 유전자의 합성

대장균에서 가용화 형태의 rhBMP-2를 발현시킬 수 있는 유전자를 다음과 같이 설계하였다:

우선, 클로닝의 용이성을 확보하기 위하여, 추후에 사용하는 클로닝 벡터인 pUC18에는 존재하지 않는 제한효소에 의하여 절단될 수 있는 제한효소 인식부위를 유전자 전체에 걸쳐 평균 30bp마다 포함하도록 하고, 양말단에는 EcoRI과 HindIII에 의하여 인식될 수 있는 부위를 포함하도록 하였다.

다음으로, rhBMP-2를 암호화하는 유전자의 사용코돈은, 상기 제한효소 인식부위를 유지하면서도, 대장균에서 용이하게 발현될 수 있도록, 대장균에서 높은 빈도로 사용되는 코돈을 사용하도록 변형시켜서, rhBMP-2와 아미노산 서열은 100% 일치하면서도 DNA 서열에서는 차이가 나도록 하였다.

또한, 리보솜 결합부위를 코딩부위의 10bp 상류에 부가하여 어떠한 종류의 대장균 벡터를 사용하여도 독립적으로 발현이 가능하도록 하고, 그 뒷부분 (-1 에서 -9)에 다량의 AT염기를 포함하는 개재부위(AT rich spacer region)를 부가하여, 전사시작부위에서 발생할 수 있는 mRNA의 2차 구조의 발생을 방지하도록 고안하였다.

마지막으로, 발현된 rhBMP-2의 N-말단과 C-말단 어느 쪽에도 추가적인 아미노산이 포함되지 않도록 정지코돈을 양쪽 시작과 끝 부분에 포함시켰다.

상기 설계된 유전자를 평균 60bp의 크기를 갖는 6조각으로 나누어 화학적으로 합성하고, 이를 2개씩 연결하여 3개의 절편으로 합성하였다. 합성된 3개의 절 편은 각각, 5'말단에 EcoRI 인식부위가 존재하고, 3'말단에 XbaI 인식부위가 존재하는 절편; 5'말단에 XbaI 인식부위가 존재하고, 3'말단에 SacI 인식부위가 존재하는 절편; 및, 5'말단에 SacI 인식부위가 존재하고, 3'말단에 HindIII 인식부위가 존재하는 절편이다. 상기 각각의 절편을 클로닝 벡터인 pUC18에 순차적으로 삽입하여 372bp의 유전자 HBMP-2를 합성하였다(참조: 도 1). 도 1은 본 발명의 사람의 골형성단백질-2를 암호화하는 신규한 유전자 HBMP-2를 합성하는 과정을 나타내는 모식도로서, R은 EcoRI을, S는 SacI을, B는 XbaI을, H는 HindIII 제한효소 인식부위를 각각 의미하고, 하단의 염기서열은 합성된 HBMP-2의 염기서열이며, 아미노산 서열은 상기 염기서열에 의하여 발현되는 사람의 골형성단백질-2의 아미노산 서열이고, 각 제한효소 부위는 해당하는 제한효소에 의하여 절단되는 부위를 나타낸다.

상기 합성된 유전자의 염기서열을 결정하고, 이에 의하여 발현될 수 있는 아미노산 서열을 추론한 결과, 합성된 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖고, 이에 의하여 발현될 수 있는 아미노산 서열은 종래의 rhBMP-2의 아미노산 서열(서열번호 1)과 동일함을 알 수 있었는 바, 상기 합성된 유전자를 "HBMP-2"라 명명하였다.

실시예 2: pCold 벡터를 이용한 발현시스템의 확립

실시예 2-1: 발현벡터의 작제

pCold 벡터(Takara Bio Ltd., 일본)는 대장균 콜드샥(cold shock) 유전자의 cspA 프로모터를 포함하는 단백질 발현벡터로서, 당업계에서 통상적으로 이용해 온 T7 발현계에서 발현되지 않았던 단백질이나 발현되어도 가용화가 어려운 단백질을 발현시킬 수 있는 것으로 알려져 있으므로, 상기 실시예 1에서 합성한 유전자를 pCold 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 작제하였다.

상기 실시예 1의 pUC18에 EcoRI과 HindIII로 처리하여 클로닝된 HBMP-2 유전자를 수득하고, EcoRI과 HindIII으로 처리한 pCold 벡터에 클로닝하여 발현벡터 pHBMP-2를 작제하였다(참조: 도 2). 도 2는 본 발명의 발현벡터 pHBMP-2의 유전자 지도이다.

실시예 2-2: 형질전환체의 수득

rhBMP-2는 단량체로 발현되지만, 이량체를 형성한 후에 생물학적인 활성을 나타내며, 상기 이량체는 이황화결합에 의하여 형성되므로, 이황화결합의 형성을 허용하는 대장균주를 사용하는 것이 필수적이다. 따라서, 이황화결합의 형성을 허용하는 대장균주인 Origami B(DE3)(Novagen. USA)에 상기 실시예 2-1에서 작제한 발현벡터 pHBMP-2를 도입하여 형질전환체를 수득하였다. 이때, 형질전환 방법은 통상적으로 사용되고 있는 문헌에 개시된 방법을 그대로 사용하여 수행하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1989).

실시예 2-3: rhBMP-2의 제조

실시예 2-2에서 수득한 형질전환체를 100ug/mL의 앰피실린을 포함하는 LB 배지에서 OD₆₀₀가 0.4 내지 0.5 정도가 되도록 배양하고, 상기 배양액을 15℃에서 30분간 방치한 후, 배양액에 1mM IPTG를 첨가하여 다시 15℃에서 24시간동안 진탕 배양하였다. 상기 배양된 상기 배양물을 5000rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 수득하고, 이를 용균용 완충용액(100mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 5mM dithiothreitol, pH 7.4)에 넣고, 초음파 분쇄하여, 세포를 파쇄하고 이를 15,000rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 단백질 분획을 수득하였다.

상기 수득한 단백질 분획을 헤파린 세파로스(heparin-Sepharose)(Pharmacia Co. Ltd., USA) 컬럼 크로마토그래피(완충용액: 20mM Tris/HCl, pH 8.0, 용출액: 0.1 내지 1.0M NaCl 농도구배 완충용액)에 적용하여, 0.5M NaCl 완충용액에서 용출된 rhBMP-2를 포함하는 활성분획을 수득하였다.

상기 수득한 활성분획에 완충용액(20mM Tris/HCl, pH 8.0)을 가하여, NaCl의 농도를 50mM로 적정한 다음, 이를 리소스-Q(Resource-Q)(Pharmacia Co. Ltd., USA) 컬럼 크로마토그래피(완충용액: 20mM Tris/HCl, pH 8.0, 용출액: 0.1 내지 1.0M NaCl 농도구배 완충용액)에 적용하여, 0.3M NaCl 완충용액에서 용출된 rhBMP-2를 포함하는 활성분획을 수득하였다.

상기 수득한 활성분획을 HPLC 겔여과(HPLC gel filtration) 크로마토그래피(컬럼: Protein-Pak SW300, 완충용액: 20mM Tris/HCl, 50mM NaCl, pH 8.0)에 적용하여, rhBMP-2를 정제하였다.

정제한 rhBMP-2의 분자량을 확인하기 위하여, 저분자량 겔여과용 표지단백질 키트(Pharmacia Co. Ltd., USA)를 상기 HPLC 겔여과 크로마토그래피에 적용하여 검량곡선을 만들고, 이에 근거하여 상기 정제한 rhBMP-2의 분자량을 산출한 결과, 약 24kDa의 분자량을 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기 수득한 rhBMP-2를 15% SDS-PAGE로 전기영동한 결과, 12kDa의 크기를 나타내었으므로, 상기 수득한 rhBMP-2는 이량체임을 알 수 있었다.

아울러, 최초 수득한 단백질 분획을 SDS 전기영동하고, 전기영동한 젤에서 rhBMP-2의 상대적 함량을 측정한 결과, rhBMP-2가 형질전환된 대장균으로부터 발현되는 전체 단백질 양의 대략 13% 정도임을 알 수 있었다(참조: 도 3). 도 3은 본 발명의 형질전환체로부터 발현된 단백질의 전기영동사진으로, 1번 레인은 실시예 2-2에서 수득한 본 발명의 형질전환체로부터 발현된 단백질을 나타내고, 2번 레인은 HBMP-2 유전자가 클로닝되지 않은 pCold 벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 발현된 단백질을 나타내며, 화살표는 발현된 rhBMP-2를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 본 발명의 형질전환체는 전체 생산하는 단백질 중에서 BMP-2 단백질을 높은 함량으로 발현시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 정제된 rhBMP-2의 생물학적 활성

인간의 근모세포인 C2C12 세포(ATCC-1772)에 BMP-2를 처리하면, C2C12 세포가 골모세포로 분화되고, 분화된 골모세포에서 알칼라인 포스파타제의 발현량이 증가하므로(참조: Katagiri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 172:295-299, 1990), 상기 실시예 2-3에서 정제된 rhBMP-2가 처리된 C2C12 세포에서의 알칼라인 포스파타제의 활성증가 정도를 측정하였다.

즉, C2C12 세포를 다양한 농도의 단량체 또는 이량체 rhBMP-2와 함께 2%(v/v) 우태아혈청(FBS, Sigma Chemical Co., USA), 100IU/mL 페니실린 및 100ug/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 1mL에서 2일 동안 배양하고, 1% NP-40를 포함하는 반응용 완충용액(0.1M 글리신, pH 9.6, 1mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) 200ul를 가하여 1시간 동안 용균시켰다. 그런 다음, 상기 용균액 100ul를 1mg/ml p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 50ul의 반응용 완충용액과 37℃에서 15분간 반응시키고, 1N NaOH 50ul를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다(참조: 도 4).

도 4는 rhBMP-2 단량체 및 이량체의 처리농도에 따른, 알칼라인 포스파타제 활성도의 변화를 나타내는 그래프로서, (○)는 단량체 rhBMP-2를 처리한 경우를 나타내고, (■)는 이량체 rhBMP-2를 처리한 경우를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 단량체 rhBMP-2의 처리농도가 증가하더라도 알칼라인 포스파타제의 활성도가 변화되지 않았으나, 이량체 rhBMP-2의 처리농도가 증가하면 이에 비례하여 알칼라인 포스파타제의 활성도가 증가함을 알 수 있었다.

상기 알칼라인 포스파타제의 활성도가 증가되었다 함은 C2C12 세포가 골모세포로 분화되고, 분화된 골모세포에서 알칼라인 포스파타제의 발현량이 증가되었음을 의미하므로, 결국, 이량체 rhBMP-2가 처리되었을 때, 처리농도에 비례하여 알칼라인 포스파타제 활성도가 증가됨을 나타내는 상기 도 4의 결과는, 본 발명의 방법으로 제조된 rhBMP-2가 정상적인 생물학적 활성을 갖는 가용화된 형태라는 점을 의미하는 것으로 해석되었다.

따라서, 상기 실시예 2-3에서 제조된 rhBMP-2는 대장균에서 제조되었음에도 불구하고, 종래기술과는 달리 정상적인 생물학적 활성을 나타내는 가용화된 형태임을 알 수 있었다.

이상에서 상세하게 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 사람의 골형성단백질-2(hBMP-2)를 암호화하는 새로운 염기서열을 갖는 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터를 이용하여 재조합된 사람의 골형성단백질-2를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 사람의 BMP-2를 암호화하는 신규한 유전자를 사용할 경우, 재조합 대장균에서 봉입체가 아닌 가용화된 형태의 BMP-2를 제조할 수 있으므로, 활성이 우수한 사람의 BMP-2의 대량생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

<110> Ulsan University <120> Novel Gene Coding for Human BMP-2 and Process for Preparing Recombinant Human BMP-2 Employing the Same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn 85 90 95 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 Gly Cys Arg 115 <210> 2 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2 <400> 2 atgcaggcta aacacaaaca gcgcaaacgc cttaagagca gctgcaaacg ccacccgctg 60 tacgtagact tcagcgacgt tggttggaac gactggatcg ttgctccgcc gggttaccac 120 gctttctact gccacggtga atgcccgttc ccgctggctg accacctgaa cagcaccaac 180 cacgctatcg tgcagaccct ggttaacagc gtaaacagca aaatcccgaa agcatgctgc 240 gttccgaccg agctgagcgc aatctctatg ctgtacctgg acgaaaacga aaaagttgtt 300 ctgaaaaact accaggacat ggttgttgaa ggttgcggtt gccgc 345

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사람의 골형성단백질-2(human bone morphogenetic protein-2, hBMP-2)를 암호화하는 유전자 HBMP-2(서열번호 2)를 포함하고, 도 2의 유전자 지도로 나타내는 발현벡터 pHBMP-2를 이황화 결합 형성을 허용하는 대장균(Origami B(DE3))에 도입하여 형질전환시킨 대장균을 배양하고, 이로부터 사람의 골형성단백질-2(서열번호 1)를 수득하는 공정을 포함하는, 재조합된 사람의 골형성단백질-2(rhBMP-2)의 제조방법.
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