JPH05178896A - 新規なタンパク質、それをコードする遺伝子及びその産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 牛胎児軟骨から精製された、分子量が約２
６，０００ダルトンで１２０個または１２１個のアミノ
酸から成るコンドロモデュリンタンパク質（ＣｈＭ）及
びそのｃＤＮＡを分離取得し、該遺伝子を発現ベクター
に組込み、異種細胞によりＣｈＭを生産させた。 【効果】 ＣｈＭは軟骨細胞増殖作用かつ血管内皮細胞
増殖抑制作用を有するため、骨折及び各種軟骨疾患の治
療薬として、また癌等の腫瘍に対する治療薬として有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なタンパク質、それ
をコードする遺伝子、形質転換体、その産生方法ならび
にその用途に関する。詳しくは、軟骨細胞の増殖及び分
化機能の誘導を促す作用を有するタンパク質コンドロモ
デュリン−Ｉ及びそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
と、少なくともタンパク質発現に必要なプロモーター配
列、シグナルペプチド様配列、コンドロモデュリン−Ｉ
がコードされたＤＮＡ配列及びターミネーター配列を有
する発現ベクターにより形質転換された形質転換体、さ
らにその形質転換体を培養することによりかかるコンド
ロモデュリン−Ｉを発現させる方法、ならびにタンパク
質コンドロモデュリン−Ｉを有効成分とする骨折、各種
軟骨疾患に対する治療効果を有する薬剤、癌等の腫瘍に
対する治療効果を有する薬剤としてのコンドロモデュリ
ン−Ｉタンパク質の用途に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】哺乳
類の大部分の骨（頭蓋骨等の平板な骨は除く）は胎児期
にまず軟骨原基が出現した後、軟骨細胞の増殖と分化、
プロテオグリカンや２型、９型、１０型コラーゲン等の
軟骨原基の産生を経て、毛細血管の侵入と共に軟骨基質
が分解して、基質小胞を中心とする石灰化が始まり、最
後は骨に置換する、いわゆる“内軟骨性骨化”という仕
組みによって作られる。従って軟骨代謝は骨の形成、特
に長軸方向への伸長において非常に重要な役割を演じて
いる。

【０００３】この一連の過程において種々のホルモンや
成長因子が関与している。この中にはインスリン様増殖
因子（ＩＧＦ１，ＩＧＦ２）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、成長ホルモン、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ−β）
などが含まれる。これらの他に軟骨細胞の増殖、分化機
能の促進作用を有する因子が軟骨中に存在することが知
られていた。しかし、これまでこの因子の単一バンドま
での精製はなされておらず、その生理活性を明確に示す
ことはなされていなかった。Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｎｅａｍ
ら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２６５．Ｎｏ．１
７、９６２８−９６３３，１９９０）は牛軟骨より、軟
骨内に存在する構成タンパク質を同定する目的でコンド
ロモデュリンと極めて類似したアミノ酸配列を持つ糖タ
ンパク質を分離した。しかし彼らはこのタンパク質の生
物学的機能の解明には至っていない。一方、かかるタン
パク質の実用的な利用のためには大量の軟骨由来のタン
パク質を必要とするが、これを軟骨組織から調製するこ
とは工業的に必ずしも容易ではない。

【０００４】また骨折の治癒、各種軟骨疾患の治癒過程
においては、軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要で
ある。骨折治癒過程においては、骨折部位における炎症
反応、骨膜由来細胞の増殖に続き、軟骨細胞が出現、増
殖し、軟骨細胞外基質を合成した後に、石灰化し、骨組
織に置換されて骨折治癒が完成する。すなわち骨折部位
での軟骨組織の形成は骨折修復時の骨組織の基礎であ
る。また軟骨破壊、損傷を伴う軟骨疾患からの回復過程
においては軟骨細胞の増殖が重要なことは明白である。

【０００５】さらには癌組織の増殖、転移においてはエ
ネルギー獲得のために組織内への血管侵入が必須であ
る。この増殖、転移の抑制には血管浸潤を抑制すること
が重要である。しかしこれら疾患に対する軟骨細胞増
殖、血管浸潤抑制能を有する有効な薬剤は現在まで存在
しない。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】そこで本発明者らは、
このコンドロモデュリンタンパク質を組換えＤＮＡ技術
により大量に生産すべく鋭意検討を重ね、かかる目的に
有用な新規タンパク質及びそれをコードする遺伝子をは
じめて分離取得し、この遺伝子を発現ベクターに組み込
み、異種細胞によりコンドロモデュリンタンパク質を生
産させるに至った。さらに骨折、各種軟骨疾患、癌等に
対する有効な治療薬を得る目的で、それに有用なタンパ
ク質コンドロモデュリンの生理活性を解明するに至り、
本発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的
性質を有することを特徴とする新規なタンパク質コンド
ロモデュリン−Ｉ、それをコードする遺伝子、形質転換
体、その産生方法及びその用途に存する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量
が約２６，０００ドルトンである。 軟骨細胞を単独または繊維芽細胞増殖因子共存下で
増殖させる活性を有する。 軟骨細胞を分化機能を促進する活性を有する。

【０００８】以下本発明をさらに詳細に説明するに、本
発明の新規なタンパク質コンドロモデュリン−Ｉ（以
下、「コンドロモデュリンタンパク質」と略す）は、例
えば後述の実施例に詳述するように牛胎児軟骨を破砕
し、それを遠心分離した上清を限外濾過膜により分画、
濃縮したものを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム
等による分子ふるいクロマトグラフィーによりさらに分
画したのち、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラムクロマトグ
ラフィー等により溶出条件を変えて繰り返し精製するこ
とによって得られる。精製された本発明の蛋白質はＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約２
６，０００ドルトンであり、軟骨細胞を単独または繊維
芽細胞増殖因子共存下で増殖させる活性及び軟骨細胞の
分化機能を促進する活性を有する。

【０００９】また、本発明のコンドロモデュリンタンパ
ク質は、配列番号：１に示すような１２０個または１２
１個のアミノ酸からなるタンパク質であり、軟骨細胞の
増殖及び分化機能促進活性を損なわない範囲で一部のア
ミノ酸を除去、置換、修飾または追加するなどの改変を
行ったものも、本発明のタンパク質に含まれる。上記の
タンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、
例えば、配列番号：２に示すような塩基配列を有するも
のが挙げられる。

【００１０】本発明のコンドロモデュリンタンパク質を
コードする遺伝子ＤＮＡ断片は例えば、次のような方法
によって得られる。本発明のタンパク質をコードする遺
伝子を含有するｃＤＮＡライブラリーとしては、牛胎児
軟骨ｃＤＮＡライブラリーから利用でき、これは公知の
常法によって作製される。このｃＤＮＡライブラリーか
らλファージを富沢らの方法（「バクテリオファージの
実験」、岩波書店、９９〜１７４、１９７０年）により
大腸菌に感染させ培養する。形成されたプラークを部分
ｃＤＮＡ断片あるいは決定した本発明のタンパク質の部
分アミノ酸配列に対応する塩基配列を持つＤＮＡ断片を
プローブとしてプラークハイブリダイゼーション法
（「モレキュラークローニング」、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー、３２０〜３２８、１９８２年）
によって選択し、目的とするｃＤＮＡを得ることができ
る。

【００１１】このプラークハイブリダイゼーション法に
使用するプローブには、ポリメラーゼチェイン反応（以
下、「ＰＣＲ」と略す）法によって得られるコンドロモ
デュリンタンパク質をコードする遺伝子の部分ｃＤＮＡ
断片が用いられる（サイエンス〔Ｓｃｉｅｎｃｅ〕、２
３９、４８７〜４９１、１９８８年）。例えば配列番
号：１のアミノ酸配列の１〜７番目に対応する＋鎖ＤＮ
Ａプライマー５’ＧＡＡ／ＧＴＴＡ／ＧＧＴＡ／Ｃ／Ｇ
／ＴＡＧＡ／ＧＡＡＡ／ＧＡＴＡ／Ｃ／ＴＡ／ＧＴ３’
（２０ヌクレオチド）及び５’ＧＡＡ／ＧＣＴＡ／Ｃ／
Ｇ／ＴＧＴＡ／Ｃ／Ｇ／ＴＡＧＡ／ＧＡＡＡ／ＧＡＴＡ
／Ｃ／ＴＡ／ＧＴ３’（２０ヌクレオチド）と、アミノ
酸配列の９３〜９８番目に対応する−鎖ＤＮＡプライマ
ー５’ＴＧＡ／ＧＴＡＡ／ＧＴＴＡ／ＧＴＡＡ／Ｃ／Ｇ
／ＴＧＧＣＣＡ３’（１７ヌクレオチド）を用いてＰＣ
Ｒを行い、配列番号：３に示した２９０ｂｐＤＮＡ断片
を作製し、プローブとして用いる。またコンドロモデュ
リンタンパク質のアミノ酸配列より推定されるＤＮＡ配
列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て用いてもよい。

【００１２】さらに上記のスクリーニング陽性のプラー
クから富沢らの方法によりファージを増殖させ、そのも
のからＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー
・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、８５、１９８２年）によりＤＮＡを調製
し、適切な制限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後、ｐ
ＵＣ１８等のプラスミドにクローンし、Ｓａｎｇｅｒら
のジデオキシ法（プロシーディングス オブ ナショナ
ル アカデミー サイエンス ユー エス エー〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ〕、７４、
５４６３、１９７７年）によって目的ｃＤＮＡセグメン
トの塩基配列が決定できる。

【００１３】このようにして決定されるｃＤＮＡ断片の
塩基配列（配列番号：２）は、配列番号：１に示す精製
したコンドロモデュリンタンパク質の部分アミノ酸配列
（１〜７番目及び９３〜９８番目）に対応する塩基配列
を含む１２０個または１２１個のアミノ酸からなるタン
パク質をコードしている全長３６０または３６３ヌクレ
オチド長からなる断片であり、成熟コンドロモデュリン
タンパク質の全長構造遺伝子を含んでいる。この本発明
によるｃＤＮＡ断片は配列番号：１に示すアミノ酸配列
をコードする限り、その塩基配列を改変したものも含ま
れる。

【００１４】上記のようにして得られるｃＤＮＡ断片は
その５’末端を修飾して、あるいは前駆体遺伝子を付加
して公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモ
ーターの下流に挿入され、次いで上記のｃＤＮＡが挿入
された発現ベクターは、大腸菌、酵母、動物細胞宿主
等、公知の細胞中にそれ自体公知の方法で導入される。
本発明のコンドロモデュリンタンパク質の産生方法につ
き詳細に説明すると、発現ベクターとしては上記のよう
にして得られたコンドロモデュリンタンパク質をコード
するＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが使用される。例えば大腸菌、枯草菌等の微生
物を宿主とするときは、発現ベクターはプロモーター、
リボゾーム結合（ＳＤ）配列、コンドロモデュリンタン
パク質遺伝子、転写終結因子、及びプロモーターを制御
する遺伝子より成ることが好ましい。

【００１５】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
Ｐ_L 、Ｐ_R 、Ｔ₅ 初期遺伝子Ｐ₂₅、Ｐ₂₆プロモーター等
が挙げられる。また、これらは例えばｐａｃプロモータ
ー（アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケ
ミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）５２
巻９８３−９８８頁（１９８８））のように独自に改
変、設計された配列でもよい。

【００１６】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでもよいが、合成により作成した１
６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列を
４塩基以上連続して持つコンセンサス配列を持ったもの
でもよい。転写終結因子は必ずしも必要ではないが、ρ
非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネータ
ー、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している方が
好ましい。

【００１７】さらにこれらの発現に必要な因子の発現プ
ラスミド上での配列順序は、５’上流からプロモータ
ー、ＳＤ配列、コンドロモデュリンタンパク質遺伝子、
転写終結因子の順に並ぶことが望ましい。発現ベクター
として使用できるものとしては、市販のｐＫＫ２３３−
２（ファルマシア社製）等がある。また、融合蛋白とし
て発現させる発現ベクターｐＧＥＸシリーズ（ファルマ
シア社製）等も同様にして使用できる。

【００１８】宿主の形質転換法としては、常法に従い行
うことができる。形質転換体の培養は、モレキュラー
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
１９８２）に記載の方法を参考にして行うことができ
る。培養温度としては、２８℃から４２℃が適当であ
る。また真核生物、例えば昆虫細胞、動物（哺乳類）細
胞等においても発現ベクターを構成する基本的な単位は
前述（微生物）のものと変わらないが、以下のようなも
のが好ましい。

【００１９】昆虫細胞としては、例えばインビトロジェ
ン社のバキュロウイルス発現マニュアルであるマックス
バック（ＭＡＸＢＡＣ^TM、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ Ｅ
ＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＭＡＮＵＡＬ Ｖ
ＥＲＳＩＯＮ １．４）に従い、このキットを使用す
る。この時、発現量を上げるためにポリヘドリンのプロ
モーターから開始コドンまでの距離を変えることが好ま
しい。

【００２０】動物細胞としては、プロモーターがＳＶ４
０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、アポ
リポプロテインＥ遺伝子プロモーター等が利用される。
具体的には、発現ベクターｐＫＣＲ（プロシーディング
ス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
ユー エス エー、７８、１５２８、（１９８１））
あるいはｐＢＰＶ ＭＴｌ（プロシーディングス オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユー
エス エー、８０、３９８、（１９８３））等を基本的
な最低限の機能を失わない程度に改変、設計し（例えば
Ｎａｔｕｒｅ，３０７巻６０４頁（１９８４）に記載さ
れているようにクローニングサイトを導入する、等）、
使用することができる。

【００２１】発現ベクターで形質転換される動物細胞と
しては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウ
スＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等が挙げられる。
大腸菌等の微生物、昆虫細胞、および動物細胞で発現さ
せて得られる該組換えポリペプチドは、例えばコンドロ
モデュリンタンパク質の一部配列を含む合成ペプチドに
対するウサギ抗血清との免疫学的反応性により、コンド
ロモデュリンタンパク質であることが確認される。かか
る方法としては、常法であるウェスタンブロッティング
法が利用できる。

【００２２】上記宿主中で上記ｃＤＮＡが発現して得ら
れるコンドロモデュリンタンパク質は、公知の方法で宿
主から単離、精製される。コンドロモデュリンの生理活
性は例えば次のようにして測定される。軟骨細胞増殖活
性の評価のための細胞取得、培養、及び評価方法は鈴木
らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４６，３１３−３２０，１９８７）に従って行
う。すなわちウサギより肋骨成長軟骨を分離し、初代軟
骨細胞を９６穴プレートを用いて培養した。細胞がコン
フルエントに達した後、０．６から２００ｎｇ／ｍｌの
コンドロモデュリン及び０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞
増殖因子を加え、〔 ³Ｈ〕チミジンの取り込みを測定し
た。図２にその結果を示す。２００ｎｇ／ｍｌのコンド
ロモデュリンを加えたときに、増殖因子非添加時の約２
８倍、０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子のみ添加
時の約２．２倍の放射性チミジンの取り込みが見られ、
コンドロモデュリンが強力な軟骨細胞の増殖促進効果を
有していることが明らかとなった。

【００２３】血管浸潤抑制の指標となる血管内皮細胞の
増殖抑制は大動脈内皮細胞の〔 ³Ｈ〕チミジンの取り込
みの抑制として測定される。牛大動脈内皮細胞にコンド
ロモデュリンを添加して、細胞内に取り込まれる
〔 ³Ｈ〕チミジンの量を測定したところ、以下に示す通
り、コンドロモデュリンは内皮細胞への放射能の取り込
みを明らかに抑制し、血管内皮細胞の増殖を抑える活性
を有していることが明らかとなった。

【００２４】このコンドロモデュリンは１ｎｇから１０
０μｇを骨折部位、軟骨疾患部位にコラーゲン、アテロ
コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリエチレング
リコール、ポリ乳酸、骨セメント、ハイドロキシアパタ
イト、セラミックス、炭素繊維、フィブリン糊等の外科
手術用生体接着剤等の生体適合性担体に混合、含浸、塗
布することにより局所的に外科手術によって投与する、
または局所的に注入する、または静脈中、皮下へ投与す
ることにより骨折、各種軟骨疾患の治療薬として有用で
ある。

【００２５】さらに、得られるコンドロモデュリンタン
パク質、コンドロモデュリン様タンパク質、またはこれ
を含むタンパク質は１ｎｇから５０ｍｇを癌組織に注
入、または静脈中、皮下へ投与することにより癌の治療
薬として有効である。

【００２６】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り以
下の実施例によって限定されるものではない。

【００２７】実施例１ コンドロモデュリンタンパク質
の精製及び部分アミノ酸配列決定 牛胎児軟骨５ｋｇを原料に用いた。数ｍｍ角に破砕した
軟骨を１０倍量（体積／重量）の緩衝液Ａ（１Ｍグアニ
ジン塩酸、０．１Ｍ６−アミノ−ｎ−カプロン酸、０．
０２Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ｐＨ
６．０）にポリトロンを用いてホモゲナイズした。この
ホモゲネートを４℃で４８時間撹拌して抽出を行ったの
ち、１０，０００ｇ、２０分間遠心分離して上清を回収
した。この上清に冷アセトンを終濃度４５％になるよう
にゆっくりと加え、生じた沈殿を４，０００ｒｐｍ、３
０分間の遠心分離で除去した。この上清に終濃度６５％
になるように冷アセトンをゆっくりと加え、生じた沈殿
を４，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離により回収し
た。このアセトン４５〜６５％画分のペレットを６リッ
トルの緩衝液Ｂ（４Ｍグアニジン塩酸、０．１Ｍ ６−
アミノ−ｎ−カプロン酸、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ
トリス塩酸ｐＨ８．０）に４℃で溶解した。１０，００
０ｒｐｍ、３０分間の遠心により不溶物を沈殿させて除
去し、上清をアミコンＸＭ３００限外ろ過膜により分画
した。限外ろ過膜通過画分を次にアミコンＸＭ５０限外
ろ過膜にて分画し、通過画分をさらにアミコンＹＭ１０
限外ろ過膜にて５００ｍｌまで濃縮した。

【００２８】この濃縮液３０ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ２００カラム（直径２．６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）
を使い、溶出液に緩衝液Ｂを用いて分子篩クロマトグラ
フィーを行い分画した。溶出液２３０ｍｌから３１０ｍ
ｌの間を集め、蒸留水に対して４℃で２日間透析した。
透析終了した液を緩衝液Ｃ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０３％ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）、０．０２５Ｍリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化したヘパリン−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにて分画した。すなわち緩衝
液Ｃにてカラムを十分洗浄した後、０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む緩衝液Ｃで溶出し、ついで１．２Ｍ ＮａＣｌを
含む緩衝液Ｃで溶出した。この１．２Ｍ溶出画分を０．
１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％アセトニ
トリル／イソプロピルアルコール（３／７、体積／体
積）で平衡化したＹＭＣｐａｃｋ Ｃ４カラム（ＡＰ−
８０２ Ｓ−５ ３００Ａ Ｃ４、０．４６×１５ｃ
ｍ）に添加し、同有機溶媒濃度２０％から７０％までの
４０分間の濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。
蛍光分光測定（励起：２８０ｎｍ、最大吸収：３４５ｎ
ｍ）による溶出パターンを図１に示す。このうち１４分
に溶出した画分を真空状態で乾燥後、５０％ＴＦＡ６０
μｌに溶解しポリブレン処理したグラスフィルターに添
加し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７
０Ａ型シークエンサーでエドマン分解し、シークエンス
を決定した。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミ
ノ酸の同定は三菱化成社製“ＭＣＩｇｅｌ ＯＤＳ １
Ｈｕ”（０．４６×１５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝
液（１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．７、０．０１％ＳＤ
Ｓ、３８％アセトニトリル）による単一溶媒溶出法を流
速１．２ｍｌ／分、温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸
の検出は２６９ｎｍの吸光度で行った。また精製したコ
ンドロモデュリンタンパク質を５Ｍ尿素を含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解し、リジルエンドペ
プチダーゼ（和光純薬製）により酵素：基質＝１：２０
０で、３７℃６時間作用させペプチド断片を得、同様に
シークエンサーによりエドマン分解した。この結果、こ
のタンパク質のアミノ酸配列は下記の通りであることが
明らかとなった。

【００２９】Ｎ末端 Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖ
ａｌ／Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ （上記式中、Ｘａａは不明であることを示す。）

【００３０】リジルエンドペプチダーゼ断片 Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ またこの精製したコンドロモデュリンタンパク質を１
２．５％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により解析
したところ、分子量は約２６，０００ドルトンであるこ
とが明らかとなった。

【００３１】実施例２ コンドロモデュリン蛋白質の活
性の評価 評価のための細胞の取得、培養、及び評価方法は鈴木ら
の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４６，３１３−３２０、１９８７年）に従って行
った。すなわち４００〜６００ｇの若いニュージーラン
ド兎より肋骨成長軟骨を分離し、分離した細胞をＨａ
ｍ’ｓ Ｆ−１２培地とダルベッコ修飾培地の１：１混
合培養液（以下「ＦＡＤ培養液」と称す）に、１０％牛
胎児血清を加えたものに対し、１０⁵ 細胞／ｍｌとなる
よう懸濁した。この細胞懸濁物０．１ｍｌを、タイプＩ
コラーゲン溶液（５０μｇ／ｍｌ）で一夜コートし、Ｆ
ＡＤ培養液で一度洗浄した９６穴培養プレートに蒔き、
５％二酸化炭素を含む空気存在下に３７℃で培養した。
培地は一日置きに交換した。

【００３２】ＤＮＡ合成のアッセイは以下のごとく行っ
た。すなわち上記細胞が９６穴プレート中でコンフルエ
ントに達した後、細胞を０．３％牛胎児血清を含むＦＡ
Ｄ培養液で２４時間培養した。次に培養液を０．０６〜
２０ｎｇコンドロモデュリンタンパク質、０．０４ｎｇ
ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、０．３％牛胎児血清
を含むＦＡＤ培養液０．１ｍｌを加え２２時間培養し
た。さらに１０μｌの〔 ³Ｈ〕チミジン（１３０μＣｉ
／ｍｌ）を加え、４時間培養した後、細胞を氷冷した燐
酸緩衝食塩水（２０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．０、０．１
５Ｍ塩化ナトリウム）で３回洗った。これを５％トリク
ロロ酢酸で抽出し、さらにエタノール：エーテル＝３：
１（体積比）で抽出した。抽出後の沈殿を０．３Ｍ水酸
化ナトリウムに溶解し、これを１／２０容の６Ｍ塩酸で
中和したものをシンチレーションカウンターで放射活性
を測定した。

【００３３】図２にその結果を示す。２００ｎｇ／ｍｌ
のコンドロモデュリンタンパク質を加えたときに、ＦＧ
Ｆ非添加時の約２８倍、０．４ｎｇ ＦＧＦ添加時の約
２．２倍の放射性チミジンの取り込みが見られ、コンド
ロモデュリンタンパク質が強力な軟骨細胞の増殖促進効
果を有していることが明らかとなった。

【００３４】実施例３ コンドロモデュリンの血管内皮
細胞増殖抑制 コンドロモデュリン蛋白質の血管内皮細胞に対する効果
は、ウシ大動脈内皮細胞を用いて行われた。ウシ大動脈
内皮細胞２×１０³ ／ウェルになるように９６穴プレー
トに０．１ｍｌの２０％ウシ新生児血清を含むαＭＥＭ
培地と共に播種した。ＣＯ₂ インキュベーター中で３７
℃で４８時間、培養した後、培地を新しいものに換える
と同時に０から３μｇ／ｍｌのコンドロモデュリン蛋白
質を加えた。さらに３７℃で１２時間培養を続けた後、
〔 ³Ｈ〕チミジンを１μＣｉ／ウェルになるように加
え、３７℃で４時間、放射能の取り込みを行わせた。セ
ルハーベスターで細胞を回収しＬＫＢβプレートを用い
て、放射能を測定した。その結果を以下に示す。結果よ
り明らかなようにコンドロモデュリンは血管内皮細胞の
増殖を抑制する効果を有している。

【００３５】

【表１】 コンドロモジュリン 濃度（μｇ／ｍｌ） 3 1 0.45 0.15 0.068 0.023 0.001 ─────────────────────────────────── ［ ³Ｈ］チミジン取 り込みのコントロー 24.2 36.4 40.4 74.5 59.2 71.6 60.1 ルに対する量（％）

【００３６】実施例４ ＰＣＲ法によるコンドロモデュ
リン蛋白質の部分ｃＤＮＡ断片の調製 基質となる牛胎児軟骨ｃＤＮＡは常法に従って作製され
る。すなわち１０ｇの牛成長軟骨よりグアニジン塩酸法
（ＰｒｏＮＡＳ，７４，３３９９−３４０３，１９７
７）に従い、ポリＡを有するＲＮＡを以下のごとく調製
した。

【００３７】牛胎児成長軟骨１０ｇを８Ｍグアニジン塩
酸、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、０．５ｍ
Ｍ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）からなる溶液６０ｍ
ｌ中で破砕し、遠心分離後、上清に５０％体積相当のエ
タノールを加え−２０℃に３０分間放置後、遠心分離し
てＲＮＡを含む画分を沈殿として回収した。このＲＮＡ
の沈殿を７Ｍグアニジン塩酸、１０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ
からなる溶液３０ｍｌに溶解し５０％体積相当のエタノ
ールを加えて−２０℃に３０分間放置後、遠心分離して
ＲＮＡ画分を沈殿として回収した。さらにもう一度同様
の操作を行い、得られたＲＮＡ沈殿を２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ１２．５ｍｌに溶解した。ブタノール：クロロホルム
＝１：４で抽出し、水層に３７．５ｍｌに４Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．５）を加え、−１５℃に一晩置いた
後、遠心操作によりＲＮＡ画分を沈殿として回収した。

【００３８】この操作を３回繰り返して得られたＲＮＡ
６ｍｇを、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡからなる溶液２．２５ｍｌに溶解し、６５
℃、５分間インキュベートした後、氷中で急冷した。こ
れに０．２５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、オリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラム（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ社製）クロマトグラフィー（カラム体積０．５ｍｌ）
にかけた。カラムに吸着したポリＡを有するｍＲＮＡを
オートクレーブ滅菌した蒸留水で溶出し、ポリＡを有す
るｍＲＮＡ１０４μｇを得た。ｃＤＮＡ合成はアマーシ
ャム社のｃＤＮＡ合成システムプラスを用いて行った。
すなわち１０μｌポリＡ ＲＮＡ（１０μｇ）、１０μ
ｌファーストストランド合成反応用バッファー、２．５
μｌピロリン酸ナトリウム溶液、２．５μｌヒト胎盤リ
ボヌクレアーゼインヒビター、５μｌデオキシリボヌク
レオチド三リン酸混液、２．５μｌオリゴ（ｄＴ）プラ
イマー、２．５μｌ滅菌蒸留水を加え４５μｌとした。
静かに混和後、５μｌ逆転写酵素（１００ユニット）を
加え、混和し５０μｌとした。４２℃で４５分間反応さ
せた後氷上に置いた。

【００３９】上記の反応液に９３．５μｌセカンドスト
ランド合成反応用バッファー、５μｌ大腸菌リボヌクレ
アーゼＨ、３２．８μｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、
４３．７μｌ滅菌蒸留水を加え計２２５μｌの系とし、
１２℃６０分間、２２℃６０分間、７０℃１０分間反応
させた。さらに２．５μｌ Ｔ４ポリメラーゼ（１０ユ
ニット）を加え３７℃１０分間反応させた。得られた２
本鎖ＤＮＡ２μｇをエタノール沈殿として回収した。

【００４０】この様にして得られたｃＤＮＡ２μｇを２
００μｌの滅菌蒸留水に溶解しこれを基質ｃＤＮＡとし
た。ＰＣＲはパーキン・エルマー・シータス・ＤＮＡ・
サーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ・Ｃ
ｅｔｕｓ・ＤＮＡ・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を
使用して、使用説明書に基づき、ジーンアンプキット
（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ、宝酒造製）を使って行っ
た。すなわち基質ｃＤＮＡ２μｌ（２０ｎｇ相当量）、
１０倍濃度の反応緩衝液〔５００ｍＭ塩化カリウム、１
００ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、１５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン〕１０μｌ、１．２
５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μｌ、４０μＭプライマー＃
１として配列番号：１のアミノ酸配列の１−７番目に対
応する＋鎖ＤＮＡプライマー５’ＧＡＡ／ＧＴＴＡ／Ｇ
ＧＴＡ／Ｃ／Ｇ／ＴＡＧＡ／ＧＡＡＡ／ＧＡＴＡ／Ｃ／
ＴＡ／ＧＴ ３’（２０ヌクレオチド）及びプライマー
＃２として５’ＧＡＡ／ＧＣＴＡ／Ｃ／Ｇ／ＴＧＴＡ／
Ｃ／Ｇ／ＴＡＧＡ／ＧＡＡＡ／ＧＡＴＡ／Ｃ／ＴＡ／Ｇ
Ｔ ３’（２０ヌクレオチド）各５μｌ、配列番号：１
のアミノ酸配列の９３−９８番目に対応する−鎖ＤＮＡ
プライマーを＃３プライマーとして（４０μＭ）５’Ｔ
ＧＡ／ＧＴＡＡ／ＧＴＴＡ／ＧＴＡＡ／Ｃ／Ｇ／ＴＧＧ
ＣＣＡ ３’（１７ヌクレオチド）５．５μｌ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加え１００μｌの系と
する。反応は９４℃、１０分間の前処理後、９４℃１分
（変性ステップ）、４４℃１．５分間（アニーリングス
テップ）、７２℃２分間（伸長ステップ）のインキュベ
ーションを３５サイクル行った。得られた反応液をフェ
ノール：クロロホルム＝１：１で抽出し、エタノール沈
殿を行った。この沈殿を２０μｌの滅菌蒸留水に溶解
し、５％アクリルアミド電気泳動を行い、２９０ｂｐの
バンドを常法に従って切り出しＤＮＡフラグメントを回
収し、エタノール沈殿を行った。ＤＮＡ沈殿を１６μｌ
滅菌蒸留水に溶解し、１０倍濃度のＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（０．３３Ｍトリス−酢酸ｐＨ７．９、０．
６６Ｍ酢酸カリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、５ｍ
Ｍ ＤＴＴ）２μｌ、１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰ １μ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（６ユニット）を加
え２０μｌの系とし３７℃で３０分間反応させ、２本鎖
の平滑末端を得た。このＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１
８ベクターのＳｍａＩ部位に挿入してデュポン社の蛍光
ＤＮＡシーケンサーを用いてその塩基配列を決定した。
その結果核ＰＣＲフラグメントの塩基配列は配列番号：
３に示す通りであり、２９０ｂｐＤＮＡフラグメントが
コードするアミノ酸配列のうち５’側から２８アミノ酸
が配列番号：１の１〜２８番目のアミノ酸に、また３’
側から１５アミノ酸が配列番号：１の８３〜９５番目の
アミノ酸に相当し、精製コンドロモデュリンタンパク質
から決定したアミノ酸配列に一致した。

【００４１】実施例５ 牛コンドロモデュリンタンパク
質の完全長ｃＤＮＡのスクリーニング スクリーニングを行うλファージｃＤＮＡライブラリー
としては牛胎児軟骨ｃＤＮＡ−λｇｔ１０ライブラリー
を用いた。このｃＤＮＡライブラリーは実施例１で作製
したｃＤＮＡをアマーシャム社ｃＤＮＡクローニングシ
ステムを用いてλｇｔ１０ファージに組み込んで構築し
た。すなわち二本鎖牛胎児軟骨ｃＤＮＡ２μｇを蒸留水
１３．５μｌに溶解し、２μｌのＬ／Ｋバッファー、
２．５μｌのＥｃｏＲＩアダプター、２μｌのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（５ユニット）を加えてよく混和後１５℃で
一夜インキュベートした。このライゲートされたＤＮＡ
をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で平衡化したキット付属のカラムで未反応
アダプターを除去して、アダプターがライゲートされた
ｃＤＮＡのみを回収した。回収したｃＤＮＡ溶液７７０
μｌに８６μｌのＬ／Ｋ緩衝液、１０μｌのＴ４カイネ
ース（８０ユニット）を加えて３７℃で３０分間反応さ
せた。反応後フェノール：クロロホルム＝１：１で２
回、クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１で
２回抽出した後、ブタノールで２２０μｌまで濃縮して
２０μｌの４Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、５，５００
μｌのエタノールを加えてエタノール沈殿としてＤＮＡ
を回収した。

【００４２】回収したＤＮＡを４０μｌの蒸留水に溶解
した。このＤＮＡ溶液４μｌに２μｌのλｇｔ１０アー
ム、１μｌのＬ／Ｋ緩衝液、２μｌの蒸留水、１μｌの
ライゲースを加えて１５℃で一夜インキュベートした。
アダプターが結合したｃＤＮＡはストラタジーン社のギ
ガパックゴールドパッケージングキットを用いてλファ
ージ粒子中にパッケージングした。すなわち４μｌのｃ
ＤＮＡ溶液（８０ｎｇ相当）を使い、キット付属の説明
書にしたがって反応を行った。反応液５０μｌのファー
ジ希釈溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ塩化マグネ
シウム、５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、０．０１％ゼ
ラチン）と２０μｌのクロロホルムを加えファージのス
トックとした。完成したバンクのタイターはＮＭ５１４
菌を用いたときに２．４×１０⁶ プラーク形成単位／ｍ
ｌであった。コンドロモデュリンタンパク質ｃＤＮＡの
スクリーニングはこのバンクを増幅させたものを用いて
行った。得られた増幅バンクのタイターはＮＭ５１４菌
を用いたときに２×１０¹¹プラーク形成単位／ｍｌであ
った。

【００４３】バンクのスクリーニングはクローニングシ
ステムの説明書に従い、直径１５ｃｍのプレートを用い
て行った。５．４×１０⁵ クローンのファージを大腸菌
ＮＭ５１４株に感染させ直径１５ｃｍのシャーレ中のＬ
Ｂ軟寒天培地（ＬＢ軟寒天培地；１％酵母抽出物、０．
５％バクトトリプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．
７％アガロースをオートクレーブしたもの）中で１枚当
り２．０×１０⁴ クローンの割合で２７枚分を３７℃で
７．５時間培養した。次に培地中のλファージクローン
を市販のニトロセルロース膜であるＢＡ８５（Ｓ＆Ｓ
社）上に移し取り、以下に説明するプラークハイブリダ
イゼーションを行った。すなわち、１枚のシャーレあた
りニトロセルロース膜２枚の割合でファージ粒子を移し
取り、そのようにしてできたニトロセルロース膜を０．
１Ｍ水酸化ナトリウム−１．５Ｍ塩化ナトリウムが染み
込んだ濾紙上に２分間静置し、続いて１．５Ｍ塩化ナト
リウム、０．５Ｍトリス−塩酸ｐＨ７．４が染み込んだ
濾紙上で５分間静置した。次に、２×ＳＳＣ（２倍ＳＳ
Ｃ溶液）でこのニトロセルロース膜を洗浄し、乾いた濾
紙上で風乾した後、８０℃で２時間静置した。

【００４４】こうして処理したニトロセルロース膜は、
２×ＳＳＣで一度洗浄し、次にニトロセルロース膜１枚
当り、１．５ｍｌのハイブリダイゼーション液〔６×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ（５０倍
濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ；１％牛血清アルブミン、１％
ポリビニルピロリドン、１％フィコール４００）、１０
μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ〕に６２℃で２時間浸した。次
に、実施例４で作製した２９０ｂｐＤＮＡ断片をアマー
シャム社ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットを
用いて、キット付属の説明書に従って³²Ｐ標識した。こ
うしてできあがった³²Ｐ標識ＤＮＡ断片を含むハイブリ
ダイゼーション液（１μＣｉ／ｍｌ）中で、上述のフィ
ルターを６２℃で２０時間保温した。その後ニトロセル
ロース膜を取り出し６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中
で室温で１５分間洗浄し、さらに２×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ溶液中で６２℃で３０分間、２回洗浄してオート
ラジオグラフィーをとった。

【００４５】２枚１組のニトロセルロース膜のオートラ
ジオグラフィー上のポジティブなシグナルが一致したプ
ラークは約１３００個あった。これらのポジティブプラ
ークのシングルプラークアイソレーションを上述と同様
なプラークハイブリダイゼーションにより行い、１０個
のポジティブなファージを得た。これらファージはプラ
ークをガラス管で打ち抜きＳＭＧ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−塩酸ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０
ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ゼラチン）５００μ
ｌに懸濁し、１０μｌのクロロホルムを加えて冷蔵保存
した。

【００４６】実施例６ ｃＤＮＡ断片のサブクローニン
グ及び塩基配列の決定 これらのλファージクローンから以下のように、ＤＮＡ
を抽出しプラスミドベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９に
サブクローニングを行った。すなわち、ＳＭＧ緩衝液に
懸濁してあるλファージクローン２×１０⁵ プラーク形
成単位と大腸菌ＮＭ５１４株３×１０⁷ を３７℃で１５
分間置くことにより感染させた。これを実施例２で述べ
た方法により１５ｃｍのＬＢプレートにまき、３７℃で
８時間培養した。このプレートを４℃に１時間置いたの
ち、８ｍｌのＳＭＧ緩衝液を加え、４℃で２．５時間振
とうした。このライゼートに２滴のクロロホルムを加え
かくはんし２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。
この上清に１μｌ／ｍｌになるように牛すい臓のＤＮａ
ｓｅＩを加え室温に３０分間置いて、大腸菌ゲノムのＤ
ＮＡを消化した。これに１Ｍになるように塩化ナトリウ
ムを加え氷上に３０分間置いた後、９，３００ｒｐｍで
１０分間遠心分離し上清を回収した。この上清３ｍｌに
３ｇのポリエチレングリコール８０００を溶解し氷上に
１時間置いた後、９，３００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
してファージ粒子を回収した。回収したファージを３ｍ
ｌのＳＭＧ緩衝液に懸濁し、等量のクロロホルムを加え
てかくはんし２２００ｒｐｍで１５分間遠心した。この
上清に２．２５ｇの塩化セシウムを溶解し、日立ＳＷ５
５Ｔｉローターで３８，０００ｒｐｍ、１５℃で１９時
間遠心したファージ粒子のバンドをチューブ側面より２
１Ｇ注射針を差し込むことにより回収した。このファー
ジ懸濁液を１リットルの１０ｍＭ塩化ナトリウム、５０
ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０、１０ｍＭ塩化マグネシウム
に対して、２回、１時間ずつ透析した後、ＥＤＴＡを２
０ｍＭになるように加え、さらにプロテナーゼＫを５０
μｇ／ｍｌになるようにＳＤＳを０．５％になるように
加えて５６℃に１時間置いてファージタンパク質を消化
した。これを等量のフェノールで１回、等量のフェノー
ル：クロロホルム＝１：１で１回、同じく等量のクロロ
ホルムで１回抽出し、１５，０００ｒｐｍ、１分間遠心
操作を行い、水層を回収した。

【００４７】ファージＤＮＡをエタノール沈殿により回
収し、２５μｌの滅菌蒸留水に溶解した。このＤＮＡ溶
液から１．５μｌを採り、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し
てアガロース電気泳動で挿入ｃＤＮＡ断片の長さを解析
した。最も挿入断片の長かったクローンのＤＮＡ２０μ
ｌをＢａｍＨＩで切断し挿入ｃＤＮＡ断片をクローニン
グベクターｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにクローニン
グした（ペラスミドｐＵＣＨＭ２６）。クローニングさ
れたＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで切断し、約０．
５ｋｂおよび約０．９ｋｂのｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１８
のＢａｍＨＩサイトに再度クローニングして、デュポン
社蛍光ＤＮＡシーケンサーを使って塩基配列を決定した
ところ、配列番号：２に示すような塩基配列が得られ
た。すなわちコンドロモデュリンタンパク質のＮ末端ア
ミノ酸配列を含む１２１または１２０アミノ酸をコード
している全長３６３または３６０塩基対からなるコンド
ロモデュリンタンパク質をコードするｃＤＮＡが得られ
た。

【００４８】実施例７ コンドロモデュリン−Ｉタンパ
ク質発現プラスミドの構築 実施例６で得たコンドロモデュリン−ＩｃＤＮＡ（バイ
オケミカルバイオフィジカルリサーチコミニュケーショ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｕｎ．）１７５巻９１頁（１９９１））を含むプラスミ
ドｐＵＣＨＭ２６を常法（「モレキュラークローニン
グ」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、８６
−９６頁（１９８２））により調製した。次に該プラス
ミドＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＳｃａＩで消化し、得ら
れたＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルム抽出を行
い、エタノール沈殿により該ＤＮＡ断片を精製し１０μ
ｌの水に溶解した。次にこのＤＮＡ断片のＳｃａＩ切断
点に８塩基よりなるＥｃｏＲＩリンカー（^5'ＧＧＡＡＴ
ＴＣＣ^3'）をＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラ
ークローニング」、３９６頁（１９８２）に従い導入し
プラスミドｐＵＣＨＭ２６１を得た。

【００４９】次にプラスミドｐＵＣＨＭ２６１ＤＮＡ１
０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、コンドロモデュ
リン−Ｉ前駆体のコーディング領域を含む約１．２５ｋ
ｂＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルに電気泳動する
ことにより他のＤＮＡ断片と分離し、該ＤＮＡ断片をＭ
ａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニン
グ」、１６４頁（１９８２））に従いアガロースゲルか
ら精製した。一方、０．０５μｇの発現ベクターｐＫＣ
Ｒ Ｈ２（Ｎａｔｕｒｅ，３０７巻，６０４頁（１９８
４））ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで部分消化し、フェ
ノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により精
製した。これをバクテリアルアルカリホスファターゼに
より脱燐酸化処理し、フェノール／クロロホルム抽出と
エタノール沈殿により精製し１０μｌの水に溶解した。

【００５０】以上のようにして調製されたｐＫＣＲ Ｈ
２ベクター０．０１μｇとコンドロモデュリン−ＩｃＤ
ＮＡＥｃｏＲＩ断片０．１μｇをＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造６０２１）を用いて結合させた。この反
応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニング」、
３６５−３８１頁（１９８２））に従い解析することに
よりコンドロモデュリン−ＩｃＤＮＡが順方向に連結し
たプラスミドｐＫＣＲＣＨＭ１（図３）と該ｐＫＣＲＣ
ＨＭ１とは、ウシコンドロモデュリンＩ遺伝子（図中ｂ
−ＣｈＭ−Ｉで示す）の挿入が逆向きであるｐＫＣＲＣ
ＨＭ３を得た。

【００５１】実施例８ コンドロモデュリン−Ｉタンパ
ク質の産生と精製 実施例７により構築されたコンドロモデュリン−Ｉ発現
用プラスミドｐＫＣＲＣＨＭ１および３を用いてＡｕｓ
ｕｂｅｌらの方法（カレント・プロトコール・イン・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）、グリーンパブリッシングアソシエイツアンドウイ
リーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）９・１・１章〜９・１・４
章（１９８７））を基にＣＯＳ細胞をトランスフェクシ
ョンした。

【００５２】すなわちまず直径９ｃｍのシャーレの中で
ＦＣＳ（牛胎児血清）が１０％入ったＥＲＤＦ培地（極
東製薬社製）中でＣＯＳ細胞をセミコンフルエントな状
態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそ
こにＤＮＡ溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は予め次に示
す手順に従って調製した。まず直径９ｃｍのシャーレ１
枚につき３００μｌの２×ＨＥＢＳ溶液（２×ＨＥＢＳ
溶液；１．６％塩化ナトリウム、０．０７４％塩化カリ
ウム、０．０５％燐酸水素二ナトリウム１２水塩、０．
２％デキストロース、１％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０
５））と１０μｇのプラスミドＤＮＡを加え滅菌された
水で５７０μｌに合わせた溶液をエッペンドルフ遠心管
中に準備する。次に該ＤＮＡ溶液に３０μｌの２．５Ｍ
の塩化カルシウム溶液を滴加しながらボルテックスミキ
サーを用い数秒間激しく混和する。これを室温で３０分
間放置するが、その間およそ１０分おきにボルテックス
ミキサーで混和する。この様にしてできたＤＮＡ溶液を
前述の細胞にかけて室温で３０分間静置した。

【００５３】その後ＦＣＳが１０％入ったＥＲＤＦ培地
９ｍｌをシャーレに入れて３７℃、５％ＣＯ₂ 存在下で
４〜５時間培養した。次にシャーレから培地を除き５ｍ
ｌの１×ＴＢＳ＋＋溶液（１×ＴＢＳ＋＋溶液；２５ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）１４０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭ塩化カリウム、０．６ｍＭ燐酸水素二ナトリ
ウム、０．０８ｍＭ塩化カルシウム、０．０８ｍＭ塩化
マグネシウム）で細胞を洗浄し、１×ＴＢＳ＋＋溶液を
除去した後グリセロールを２０％含む１×ＴＢＳ＋＋溶
液を５ｍｌ細胞にかけて室温で１〜２分間静置した後上
清を除去した。その後５ｍｌの１×ＴＢＳ＋＋溶液で細
胞を再び洗浄しＦＣＳが１０％入ったＥＲＤＦ培地１０
ｍｌをシャーレに入れて３７℃、５％ＣＯ₂ 存在下で培
養し、４８時間が経過した時点で培地を回収した。この
培地を１５００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、その上清を
緩衝液Ｃ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０３％ＣＨＡＰ
Ｓ（界面活性剤）、０．０２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したヘパリン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
カラムにて分画した。すなわち緩衝液Ｃにてカラムを十
分洗浄した後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶
出し、ついで１．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出
した。この１．２Ｍ溶出画分をセントリコン−１０（ア
ミコン社製）で濃縮した。

【００５４】この様にして得られた試料１０μｌ（培養
液１ｍｌ相当）を０．１％ＳＤＳ−１２．５％ポリアク
リルアミドゲル（７０×８５×１ｍｍ）に添加した。そ
の際、マーカー蛋白質としてＢｉｏＲａｄ社製“ＰＲＥ
ＳＴＡＩＮＥＤ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＴＡＮＤＡＲＤ
Ｓ”（低分子量用）を添加した。電極液としてトリス緩
衝液（２５ｍＭトリス塩酸 ｐＨ８．３、１９２ｍＭグ
リシン、０．１％ＳＤＳ）を用い、３０ｍＡの定電流で
４５分間泳動後、常法により該ゲルをＳ＆Ｓ社製ニトロ
セルロースフィルター（商品名、ＢＡ−８５、ポアサイ
ズ０．４５μｍ）と重ね、ゲル側を陰極、ニトロセルロ
ースフィルター側を陽極として１４５ｍＡの定電流を４
５分間印加して転写した。次にこのフィルターを５％
（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（２０
ｍＭトリス塩酸 ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に１時間浸した。これをＴ
ＮＴ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．４，２ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０）で２回軽く洗浄後、１００μｌのウサギ抗ペ
プチド抗体（成熟型コンドロモデュリン−Ｉの８番目の
Ｔｈｒから３４番目のＰｒｏにＣｙｓを付加した合成ペ
プチドに対する抗体）を含む１０ｍｌのＴＢＳＴ緩衝液
に浸し、４℃で１夜静置した。これをＴＮＴ緩衝液で１
５分間ずつ３回洗浄後、ＴＢＳＴ緩衝液で２０００倍に
希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｉ
ｏＲａｄ社製）と３７℃で１時間反応させた。

【００５５】次にこのフィルターＴＮＴ緩衝液で１５分
間ずつ４回洗浄後蒸留水で軽く洗浄し、５０ｍｌのパー
オキシダーゼ発色液（４０ｍｌ Ｈ₂ Ｏ、３０ｍｇ４−
クロ−１−ナフトール、１０ｍｌメタノール、２０μｌ
過酸化水素水）に浸して発色させた。その結果、プラス
ミドｐＫＣＲＣＨＭ１および３で形質転換したＣＯＳ細
胞の上清より得られたいずれの画分も精製したコンドロ
モデュリンタンパク質の電気泳動パターンと一致し、組
換えコンドロモデュリンタンパク質は精製コンドロモデ
ュリンタンパク質であることが同定された。

【００５６】実施例９ 組換えコンドロモデュリンタン
パク質の活性の評価 実施例８で得られた組換えコンドロモデュリンタンパク
質の活性を実施例２に記載の方法と同様に行った。図４
にその結果を示す。０．３％（培養上清約１００μｌ）
のコンドロモデュリンタンパク質を加えたときに、ＦＧ
Ｆ非添加時の約２０倍、０．４ｎｇＦＧＦ添加時の約
３．０倍の放射性チミジンの取り込みが見られ、組換え
コンドロモデュリンタンパク質が強力な軟骨細胞の増殖
促進効果を有していることが明らかとなった。

【００５７】

【発明の効果】本発明のコンドロモデュリンタンパク質
は、骨折や各種の軟骨疾患等の治療薬として、また癌等
の腫瘍に対する治療薬として有用であり、遺伝子組換え
の手法を用いることにより、効率良く生産することがで
きる。

【００５８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１２０−１２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−ＡＡＡ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− １ ＢＢＢ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ− １０ Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− １９ Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ− ２８ Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ− ３７ Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−ＣＣＣ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ− ４６ Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ− ５５ Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ− ６４ Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ− ７３ Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−ＤＤＤ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ− ８２ Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ− ９１ Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ− １００ Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ− １０９ Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ １１８ （上記式中ＡＡＡはＭｅｔまたはＶａｌ、ＢＢＢはＧｌ
ｕまたはＴｈｒ、ＣＣＣは欠失またはＧｌｎ、ＤＤＤは
ＣｙｓまたはＶａｌ）

【００５９】

【配列表】配列番号：２ 配列の長さ：３６３−３６６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＴＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＯＴＧ ＡＣＣ ２４ ＡＣＡ １２Ｇ ＡＣＣ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＴＡ ＣＧＣ ４８ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＣＣ ＣＣＡ ＧＣＣ ７２ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＣＡ ＡＡＣ ＡＡＣ ＧＧＡ ＡＣＣ ９６ ＡＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＣＡ １２０ ＧＡＧ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＣＣＴ １４４ ＴＡＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ３４５ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＣ １６８ ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＴＣ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＴＧ ＧＡＴ １９２ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＧＡＡ ２１６ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＣＡＣ ＴＧＣ ２４０ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＣ ６７８ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＧＧ ２６４ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＡＣ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＡＣ ２８８ ＴＡＣ ＣＡＧ ＧＧＣ ＴＧＣ ＣＧＴ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＣ ３１２ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ３３６ ＴＧＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ３６０ ＧＴＧ ＴＧＡ ３６６ （上記中０はＧまたはＡを、１はＡまたはＧを、２はＣ
またはＡを、３は欠失またはＧを、４は欠失またはＣ
を、４は欠失またはＡを、５は欠失またはＧを、６はＴ
またはＧを、７はＧまたはＴを、８はＴ，Ｇ，Ａまたは
Ｃを表す）

【００６０】

【配列表】配列番号：３ 配列の長さ：２９０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ウシ 組織の種類：胎児軟骨 配列 ＧＡＧＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣ ３２ ＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡ ６４ ＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣ ９６ ＡＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＴ １２８ ＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧ １６０ ＡＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＴＣＧＡＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴ １９２ ＧＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧ ２２４ ＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣ ２５６ ＴＧＧＧＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣ ２８８ ＣＡ ２９０

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のコンドロモデュリンタンパク質の精製
過程における、ＹＭＣｐａｃｋＣ４カラムによる分画パ
ターンを表す図面である。

【図２】本発明のコンドロモデュリンタンパク質のＤＮ
Ａ合成活性を測定した結果を表す図面である。

【図３】本発明のコンドロモデュリンタンパク質を発現
するベクターｐＫＣＲＣＨＭ１の構築を表す図面であ
る。

【図４】組換えコンドロモデュリンタンパク質の培養上
清の活性評価結果を表す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/06 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 上園 昭人 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 近藤 淳 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 寺西 豊 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
   とする新規なタンパク質コンドロモデュリン−Ｉ。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量
   が約２６，０００ドルトンである。 軟骨細胞を単独または繊維芽細胞増殖因子共存下で
   増殖させる活性を有する。 軟骨細胞を分化機能を促進する活性を有する。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載のアミノ酸配列で表さ
   れることを特徴とする請求項１記載のタンパク質コンド
   ロモデュリン−Ｉ。
3. 【請求項３】 請求項２記載のタンパク質コンドロモデ
   ュリン−Ｉをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号２に記載の塩基配列で表される
   ことを特徴とする請求項３記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項３または請求項４記載の遺伝子に
   よりコードされるポリペプチドを発現し得る組換え発現
   ベクターで、宿主細胞を形質転換させて得られた形質転
   換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養してタ
   ンパク質コンドロモデュリン−Ｉを産生させる方法。
7. 【請求項７】 請求項１または２に記載のタンパク質コ
   ンドロモデュリン−Ｉを有効成分とする軟骨細胞増殖
   剤。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載のタンパク質コ
   ンドロモデュリン−Ｉを有効成分とする抗腫瘍剤。