JPH10146189A - 新規な遺伝子およびそれを用いた組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents
新規な遺伝子およびそれを用いた組換えタンパク質の製造方法Info
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- JPH10146189A JPH10146189A JP8304942A JP30494296A JPH10146189A JP H10146189 A JPH10146189 A JP H10146189A JP 8304942 A JP8304942 A JP 8304942A JP 30494296 A JP30494296 A JP 30494296A JP H10146189 A JPH10146189 A JP H10146189A
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- dna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 様々な骨、軟骨疾患に対し効果が期待される
コンドロモジュリン−ＩＩタンパク質をコードするＤＮ
Ａを提供する。 【解決手段】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするコンドロモジュリン−ＩＩタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。
コンドロモジュリン−ＩＩタンパク質をコードするＤＮ
Ａを提供する。 【解決手段】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするコンドロモジュリン−ＩＩタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、軟骨細胞増殖活性
を有するタンパク質（以下、該タンパク質を「ＣｈＭ−
ＩＩタンパク質」または「コンドロモジュリン−ＩＩタ
ンパク質」あるいは単に「ＣｈＭ−ＩＩ」または「コン
ドロモジュリン−ＩＩ」と略記することがある。またコ
ンドロモジュリンを単に「ＣｈＭ」と略記することがあ
る）をコードするＤＮＡ（以下、「ＣｈＭ−ＩＩ遺伝
子」と略記することがある）、該遺伝子を含有してなる
発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転
換体、および、該形質転換体を用いたコンドロモジュリ
ン−ＩＩの産生方法に関する。
を有するタンパク質（以下、該タンパク質を「ＣｈＭ−
ＩＩタンパク質」または「コンドロモジュリン−ＩＩタ
ンパク質」あるいは単に「ＣｈＭ−ＩＩ」または「コン
ドロモジュリン−ＩＩ」と略記することがある。またコ
ンドロモジュリンを単に「ＣｈＭ」と略記することがあ
る）をコードするＤＮＡ（以下、「ＣｈＭ−ＩＩ遺伝
子」と略記することがある）、該遺伝子を含有してなる
発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転
換体、および、該形質転換体を用いたコンドロモジュリ
ン−ＩＩの産生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】哺乳
類の大部分の骨（頭蓋骨等の平板な骨は除く）は胎児期
にまず軟骨原基が出現した後、軟骨細胞の増殖と分化、
プロテオグリカンや２型、９型、１０型コラーゲン等の
軟骨原基の産生を経て、毛細血管の侵入と共に軟骨原基
が分解して、基質小胞を中心とする石灰化が始まり、最
後は骨に置換する、いわゆる「内軟骨性骨化」という仕
組みによって作られる。従って軟骨代謝は骨の形成、特
に長軸方向への伸長において非常に重要な役割を演じて
いる。
類の大部分の骨（頭蓋骨等の平板な骨は除く）は胎児期
にまず軟骨原基が出現した後、軟骨細胞の増殖と分化、
プロテオグリカンや２型、９型、１０型コラーゲン等の
軟骨原基の産生を経て、毛細血管の侵入と共に軟骨原基
が分解して、基質小胞を中心とする石灰化が始まり、最
後は骨に置換する、いわゆる「内軟骨性骨化」という仕
組みによって作られる。従って軟骨代謝は骨の形成、特
に長軸方向への伸長において非常に重要な役割を演じて
いる。
【０００３】この一連の過程において種々のホルモンや
成長因子が関与している。この中にはインスリン様増殖
因子（ＩＧＦ１、ＩＧＦ２）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ）、成長ホルモンなど
が含まれる。これらの他に軟骨細胞の増殖、分化機能の
促進作用を有する因子が軟骨中に存在する事が知られて
いた。例えば、コンドロモジュリン−Ｉ（ＣｈＭ−Ｉ）
は、軟骨細胞のプロテオグリカン合成を促進し、ＤＮＡ
合成能を高める作用を有していることが知られている。
成長因子が関与している。この中にはインスリン様増殖
因子（ＩＧＦ１、ＩＧＦ２）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ）、成長ホルモンなど
が含まれる。これらの他に軟骨細胞の増殖、分化機能の
促進作用を有する因子が軟骨中に存在する事が知られて
いた。例えば、コンドロモジュリン−Ｉ（ＣｈＭ−Ｉ）
は、軟骨細胞のプロテオグリカン合成を促進し、ＤＮＡ
合成能を高める作用を有していることが知られている。
【０００４】骨折の治癒、各種軟骨疾患の治癒過程にお
いては軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要である。
骨折治癒過程においては、骨折部位における炎症反応、
骨膜由来細胞の増殖に続き、軟骨細胞が出現、増殖し、
軟骨細胞外基質を合成した後に、石灰化し、骨組織に置
換されて骨折治癒が完成する。すなわち軟骨破壊、損傷
を伴う軟骨疾患からの回復過程においては軟骨細胞の増
殖が重要である事は明白である。
いては軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要である。
骨折治癒過程においては、骨折部位における炎症反応、
骨膜由来細胞の増殖に続き、軟骨細胞が出現、増殖し、
軟骨細胞外基質を合成した後に、石灰化し、骨組織に置
換されて骨折治癒が完成する。すなわち軟骨破壊、損傷
を伴う軟骨疾患からの回復過程においては軟骨細胞の増
殖が重要である事は明白である。
【０００５】Peter J. Neameら［The Journal of Biolo
gical Chemistry, Vol.265, No.17,9628-9633(1990)］
は、牛軟骨より軟骨中に存在する構成タンパク質を同定
する目的でＣｈＭ−Ｉと極めて類似したアミノ酸配列を
持つ糖タンパク質を分離した。しかし彼らはこのタンパ
ク質の生物学的機能の解明には至っていない。
gical Chemistry, Vol.265, No.17,9628-9633(1990)］
は、牛軟骨より軟骨中に存在する構成タンパク質を同定
する目的でＣｈＭ−Ｉと極めて類似したアミノ酸配列を
持つ糖タンパク質を分離した。しかし彼らはこのタンパ
ク質の生物学的機能の解明には至っていない。
【０００６】本発明者らは先に、牛軟骨より作成したｃ
ＤＮＡライブラリーより牛ＣｈＭ−Ｉ遺伝子をクローニ
ングし、動物細胞で発現させた。発現された組換え牛Ｃ
ｈＭ−Ｉは、精製された牛ＣｈＭ−Ｉと同等の活性があ
る事が報告されている（欧州公開特許第473080号公
報）。
ＤＮＡライブラリーより牛ＣｈＭ−Ｉ遺伝子をクローニ
ングし、動物細胞で発現させた。発現された組換え牛Ｃ
ｈＭ−Ｉは、精製された牛ＣｈＭ−Ｉと同等の活性があ
る事が報告されている（欧州公開特許第473080号公
報）。
【０００７】さらに本発明者らは、牛ＣｈＭ−Ｉを、よ
り抗原性の低いものに作り換え、適用するためにヒトＣ
ｈＭ−Ｉ遺伝子を単離し、組み換えタンパク質を取得す
ることにも成功した（特開平7-138295）。
り抗原性の低いものに作り換え、適用するためにヒトＣ
ｈＭ−Ｉ遺伝子を単離し、組み換えタンパク質を取得す
ることにも成功した（特開平7-138295）。
【０００８】一方、本発明者らは、牛軟骨よりＣｈＭ−
Ｉを単離する際に、逆相ＨＰＬＣで分画する前段階の試
料に、ＣｈＭ−Ｉと同様な活性を有する別の因子の存在
を確認し、これを別に単離同定した。そしてこの因子を
ＣｈＭ−ＩＩと命名し、そのアミノ酸配列の全構造を決
定した（特開平5-255398）。その活性は、軟骨細胞のプ
ロテオグリカン合成を促進させること、ＤＮＡ合成能を
高めることに関してはＣｈＭ−Ｉと変わらなかった。し
かし、ＣｈＭ−ＩＩは血管内皮細胞の増殖阻害活性を有
していない点でＣｈＭ−Ｉと異なっていた。またＣｈＭ
−ＩＩは破骨細胞に対する増殖活性をも有することが判
明した。これらＣｈＭ−ＩＩタンパク質の性質は様々な
骨、軟骨疾患に対し効果が期待されるところであるが、
ＣｈＭ−ＩＩタンパク質を軟骨から商業的に単離精製す
る事は困難を伴い、大量かつ安価な生産手段の確立が望
まれた。
Ｉを単離する際に、逆相ＨＰＬＣで分画する前段階の試
料に、ＣｈＭ−Ｉと同様な活性を有する別の因子の存在
を確認し、これを別に単離同定した。そしてこの因子を
ＣｈＭ−ＩＩと命名し、そのアミノ酸配列の全構造を決
定した（特開平5-255398）。その活性は、軟骨細胞のプ
ロテオグリカン合成を促進させること、ＤＮＡ合成能を
高めることに関してはＣｈＭ−Ｉと変わらなかった。し
かし、ＣｈＭ−ＩＩは血管内皮細胞の増殖阻害活性を有
していない点でＣｈＭ−Ｉと異なっていた。またＣｈＭ
−ＩＩは破骨細胞に対する増殖活性をも有することが判
明した。これらＣｈＭ−ＩＩタンパク質の性質は様々な
骨、軟骨疾患に対し効果が期待されるところであるが、
ＣｈＭ−ＩＩタンパク質を軟骨から商業的に単離精製す
る事は困難を伴い、大量かつ安価な生産手段の確立が望
まれた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、Ｃ
ｈＭ−ＩＩを組換えＤＮＡ技術により大量に生産させる
べく鋭意検討を重ね、かかる目的に有用な新規なＣｈＭ
−ＩＩをコードする遺伝子を初めて分離取得し、さらに
この遺伝子を発現ベクターに組み込み形質転換体を得
て、その形質転換体により軟骨細胞増殖因子タンパク質
を大量に生産させることに成功し、本発明を完成するに
至った。
ｈＭ−ＩＩを組換えＤＮＡ技術により大量に生産させる
べく鋭意検討を重ね、かかる目的に有用な新規なＣｈＭ
−ＩＩをコードする遺伝子を初めて分離取得し、さらに
この遺伝子を発現ベクターに組み込み形質転換体を得
て、その形質転換体により軟骨細胞増殖因子タンパク質
を大量に生産させることに成功し、本発明を完成するに
至った。
【００１０】すなわち、本発明の要旨は、下記の理化学
的性質を有することを特徴とするコンドロモジュリン−
ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡに存する。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。
的性質を有することを特徴とするコンドロモジュリン−
ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡに存する。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。
【００１１】上記ＤＮＡとして具体的には、前記コンド
ロモジュリン−ＩＩタンパク質が、下記（Ａ）又は
（Ｂ）に示すタンパク質であるＤＮＡが挙げられる。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ
酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記
（１）〜（４）に記載の性質を有するタンパク質。
ロモジュリン−ＩＩタンパク質が、下記（Ａ）又は
（Ｂ）に示すタンパク質であるＤＮＡが挙げられる。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ
酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記
（１）〜（４）に記載の性質を有するタンパク質。
【００１２】上記ＤＮＡとしてさらに具体的には、下記
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配列を有
するＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配列を有
するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡ。
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配列を有
するＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配列を有
するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡ。
【００１３】また本発明は、上記ＤＮＡを含有する組換
えベクター、上記ＤＮＡを含み、かつ、コンドロモジュ
リン−ＩＩタンパク質の一部又は全部を発現し得る形質
転換体、上記形質転換体を培地で培養し、その培養物か
らコンドロモジュリン−ＩＩタンパク質の一部または全
部を採取することを特徴とする、コンドロモジュリン−
ＩＩタンパク質の一部または全部を製造する方法、及び
上記ＤＮＡによりコードされるコンドロモジュリン−Ｉ
Ｉタンパク質の一部または全部を有効成分とする医薬組
成物を提供する。
えベクター、上記ＤＮＡを含み、かつ、コンドロモジュ
リン−ＩＩタンパク質の一部又は全部を発現し得る形質
転換体、上記形質転換体を培地で培養し、その培養物か
らコンドロモジュリン−ＩＩタンパク質の一部または全
部を採取することを特徴とする、コンドロモジュリン−
ＩＩタンパク質の一部または全部を製造する方法、及び
上記ＤＮＡによりコードされるコンドロモジュリン−Ｉ
Ｉタンパク質の一部または全部を有効成分とする医薬組
成物を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下本発明につき詳細に説明す
る。本発明のＤＮＡがコードするタンパク質ＣｈＭ−Ｉ
Ｉは、特開平５−２５５３９８号公報に記載されている
ように、以下のような理化学的性質を有するものであ
る。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分子量
が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。
る。本発明のＤＮＡがコードするタンパク質ＣｈＭ−Ｉ
Ｉは、特開平５−２５５３９８号公報に記載されている
ように、以下のような理化学的性質を有するものであ
る。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分子量
が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。
【００１５】ＣｈＭ−ＩＩタンパク質は、配列表の配列
番号２においてアミノ酸番号１〜１３３で表されるアミ
ノ酸配列を有する。本発明のＤＮＡによってコードされ
るＣｈＭ−ＩＩには、上記アミノ酸配列において、軟骨
細胞を増殖させる活性および軟骨細胞の分化機能を促進
する活性、さらに破骨細胞の増殖を促進する活性を損な
わない範囲で、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものも含まれ
る。
番号２においてアミノ酸番号１〜１３３で表されるアミ
ノ酸配列を有する。本発明のＤＮＡによってコードされ
るＣｈＭ−ＩＩには、上記アミノ酸配列において、軟骨
細胞を増殖させる活性および軟骨細胞の分化機能を促進
する活性、さらに破骨細胞の増殖を促進する活性を損な
わない範囲で、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものも含まれ
る。
【００１６】本発明のＤＮＡは、上記（１）〜（４）に
示す理化学的性質を有するＣｈＭ−ＩＩタンパク質をコ
ードするものであり、具体的には、配列番号２において
アミノ酸番号１〜１３３で表されるアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡが挙げられる。本発明のＤＮＡは、この配
列を有するものに限られず、配列番号２に示すアミノ酸
配列をコードするものは全て含まれる。さらに具体的に
は、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、塩基番号１８７〜５８５で表される塩基配列を有す
るものが挙げられる。なお、配列表の配列番号１に示す
塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略して一本鎖のみ
を記載した。
示す理化学的性質を有するＣｈＭ−ＩＩタンパク質をコ
ードするものであり、具体的には、配列番号２において
アミノ酸番号１〜１３３で表されるアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡが挙げられる。本発明のＤＮＡは、この配
列を有するものに限られず、配列番号２に示すアミノ酸
配列をコードするものは全て含まれる。さらに具体的に
は、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、塩基番号１８７〜５８５で表される塩基配列を有す
るものが挙げられる。なお、配列表の配列番号１に示す
塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略して一本鎖のみ
を記載した。
【００１７】また、コードするＣｈＭ−ＩＩの活性を損
なわない範囲で、配列番号２に示すアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ
酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
も、本発明に含まれる。このようなＤＮＡの一態様とし
て、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、少なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡであって、かつ、上記（１）〜
（４）に示す理化学的性質を有するＣｈＭ−ＩＩタンパ
ク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
なわない範囲で、配列番号２に示すアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ
酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
も、本発明に含まれる。このようなＤＮＡの一態様とし
て、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、少なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡであって、かつ、上記（１）〜
（４）に示す理化学的性質を有するＣｈＭ−ＩＩタンパ
ク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１８】本発明のＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術
を利用して例えば配列表の配列番号２に示すアミノ酸配
列を有するＣｈＭ−ＩＩタンパク質を発現することがで
きる。尚、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質は、生体内ではシグ
ナル配列を含む前駆体として合成され、細胞から分泌さ
れる際にはシグナル配列が切断されて、成熟タンパク質
が産生される。配列番号２に示すアミノ酸配列は、前駆
体のアミノ酸配列であり、アミノ酸番号−１５〜−１が
シグナル配列に相当し、１〜１３３が成熟タンパク質に
相当する。
を利用して例えば配列表の配列番号２に示すアミノ酸配
列を有するＣｈＭ−ＩＩタンパク質を発現することがで
きる。尚、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質は、生体内ではシグ
ナル配列を含む前駆体として合成され、細胞から分泌さ
れる際にはシグナル配列が切断されて、成熟タンパク質
が産生される。配列番号２に示すアミノ酸配列は、前駆
体のアミノ酸配列であり、アミノ酸番号−１５〜−１が
シグナル配列に相当し、１〜１３３が成熟タンパク質に
相当する。
【００１９】本発明のＤＮＡを利用してＣｈＭ−ＩＩタ
ンパク質を発現させる場合には、成熟タンパク質を直接
発現させてもよく、シグナル配列を含む前駆体として発
現させてもよい。その際、シグナル配列としてＣｈＭ−
ＩＩタンパク質固有のシグナル配列を用いてもよく、ま
た、他のタンパク質のシグナル配列を利用してＣｈＭ−
ＩＩタンパク質を産生させることも可能であり、この１
例が配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列である。す
なわち本発明のＣｈＭ−ＩＩをコードするＤＮＡは、例
えば、配列表の配列番号１の他に、発現効率を向上させ
るアミノ酸配列、例えば、いわゆるシグナル配列に置き
換えた物あるいは発現を確認するために他のタンパク質
と読み枠が変わらないようにつなげた、いわゆるフュー
ジョンタンパク質として設計された物をコードするＤＮ
Ａも含まれる。
ンパク質を発現させる場合には、成熟タンパク質を直接
発現させてもよく、シグナル配列を含む前駆体として発
現させてもよい。その際、シグナル配列としてＣｈＭ−
ＩＩタンパク質固有のシグナル配列を用いてもよく、ま
た、他のタンパク質のシグナル配列を利用してＣｈＭ−
ＩＩタンパク質を産生させることも可能であり、この１
例が配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列である。す
なわち本発明のＣｈＭ−ＩＩをコードするＤＮＡは、例
えば、配列表の配列番号１の他に、発現効率を向上させ
るアミノ酸配列、例えば、いわゆるシグナル配列に置き
換えた物あるいは発現を確認するために他のタンパク質
と読み枠が変わらないようにつなげた、いわゆるフュー
ジョンタンパク質として設計された物をコードするＤＮ
Ａも含まれる。
【００２０】本発明においては、以下に示すような方法
で、上記ＤＮＡ又はその一部を含有してなる発現ベクタ
ーを作製し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換さ
せ、該形質転換体を培地で培養し、その培養物からＣｈ
Ｍ−ＩＩタンパク質の一部または全部を採取することに
より、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質の一部または全部（以
下、単に「組換えＣｈＭ−ＩＩということがある」）を
得ることができる。
で、上記ＤＮＡ又はその一部を含有してなる発現ベクタ
ーを作製し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換さ
せ、該形質転換体を培地で培養し、その培養物からＣｈ
Ｍ−ＩＩタンパク質の一部または全部を採取することに
より、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質の一部または全部（以
下、単に「組換えＣｈＭ−ＩＩということがある」）を
得ることができる。
【００２１】本発明のＣｈＭ−ＩＩをコードするＤＮＡ
は、例えば、次のような方法によって得られる。まず本
発明のＣｈＭ−ＩＩをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａライブラリーとしては、正常牛軟骨あるいは牛胎児全
体から調製してきたＲＮＡを用いて公知の常法により作
成したプラスミドｃＤＮＡライブラリーもしくはファー
ジｃＤＮＡライブラリーもしくはファージゲノミックラ
イブラリーが利用できる。
は、例えば、次のような方法によって得られる。まず本
発明のＣｈＭ−ＩＩをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａライブラリーとしては、正常牛軟骨あるいは牛胎児全
体から調製してきたＲＮＡを用いて公知の常法により作
成したプラスミドｃＤＮＡライブラリーもしくはファー
ジｃＤＮＡライブラリーもしくはファージゲノミックラ
イブラリーが利用できる。
【００２２】例えば、ファージｃＤＮＡライブラリーの
場合、まず牛軟骨などの組織、あるいは牛胎児全組織を
液体窒素中で粉砕しグアニジンイソチオシアネート水溶
液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方法［Biochemi
stry Vol.18, 5294-5299(1979)］に従って塩化セシウム
平衡密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを沈澱として分離
する。ＲＮＡの分離には市販のＲＮＡｚｏｌ（TelTest
社）などの抽出試薬を使用することもできる。分離後、
フェノール抽出、エタノール沈澱により全ＲＮＡを精製
し、これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグ
ラフィーにかけて精製して目的の牛ＣｈＭ−ＩＩタンパ
ク質のｍＲＮＡを含むポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ（ｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ｍＲＮＡ）を単離しｍＲＮＡ群を得ることが
できる。
場合、まず牛軟骨などの組織、あるいは牛胎児全組織を
液体窒素中で粉砕しグアニジンイソチオシアネート水溶
液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方法［Biochemi
stry Vol.18, 5294-5299(1979)］に従って塩化セシウム
平衡密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを沈澱として分離
する。ＲＮＡの分離には市販のＲＮＡｚｏｌ（TelTest
社）などの抽出試薬を使用することもできる。分離後、
フェノール抽出、エタノール沈澱により全ＲＮＡを精製
し、これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグ
ラフィーにかけて精製して目的の牛ＣｈＭ−ＩＩタンパ
ク質のｍＲＮＡを含むポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ（ｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ｍＲＮＡ）を単離しｍＲＮＡ群を得ることが
できる。
【００２３】次に、上記で調製したｍＲＮＡ群と、例え
ば、デオキシチミジンが１２個から１８個つながったい
わゆるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）配列そのもの、あるいは［Na
tureVol.329, 836-838(1987)］に記載されているような
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）配列を含有するような合成ＤＮＡに
より構成されるプライマーＤＮＡをハイブリダイズさ
せ、逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成する。市販
のｃＤＮＡの合成キットにもこれに類する配列が利用さ
れている。例えばClontech社のMarathonTM cDNA Amplif
ication kitの例では配列番号８で表されるＤＮＡによ
り構成されるプライマーＤＮＡを利用しており、これを
用いてｃＤＮＡの合成を行うこともできる。その際、後
述するＰＣＲ反応にはその市販のプライマーに対するＰ
ＣＲ反応用の合成ＤＮＡが添付されているのでそれを用
いてＰＣＲ反応を行えば良い。また、前述の［Nature V
ol.329, 836-838(1987)］に記載されているようなプラ
イマーＤＮＡを用いる場合にはその配列に相補的な配列
を設計し、ＰＣＲ反応用のプライマーとしてあらかじめ
用意しておくと良い。次に大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨを用い常法
に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼによりｃＤＮＡの末端を平滑化した後、い
わゆるＥｃｏＲＩアダプター等の、制限酵素により切断
された形をなすＤＮＡの小断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
よりｃＤＮＡ鎖の両末端に付加する。
ば、デオキシチミジンが１２個から１８個つながったい
わゆるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）配列そのもの、あるいは［Na
tureVol.329, 836-838(1987)］に記載されているような
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）配列を含有するような合成ＤＮＡに
より構成されるプライマーＤＮＡをハイブリダイズさ
せ、逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成する。市販
のｃＤＮＡの合成キットにもこれに類する配列が利用さ
れている。例えばClontech社のMarathonTM cDNA Amplif
ication kitの例では配列番号８で表されるＤＮＡによ
り構成されるプライマーＤＮＡを利用しており、これを
用いてｃＤＮＡの合成を行うこともできる。その際、後
述するＰＣＲ反応にはその市販のプライマーに対するＰ
ＣＲ反応用の合成ＤＮＡが添付されているのでそれを用
いてＰＣＲ反応を行えば良い。また、前述の［Nature V
ol.329, 836-838(1987)］に記載されているようなプラ
イマーＤＮＡを用いる場合にはその配列に相補的な配列
を設計し、ＰＣＲ反応用のプライマーとしてあらかじめ
用意しておくと良い。次に大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨを用い常法
に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼによりｃＤＮＡの末端を平滑化した後、い
わゆるＥｃｏＲＩアダプター等の、制限酵素により切断
された形をなすＤＮＡの小断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
よりｃＤＮＡ鎖の両末端に付加する。
【００２４】この際、例えばＥｃｏＲＩメチレース等の
ＤＮＡメチレースでｃＤＮＡ中の制限酵素切断点を、具
体的にはＥｃｏＲＩメチレースの場合はＥｃｏＲＩ切断
点をメチル化し、制限酵素ＥｃｏＲＩの切断からｃＤＮ
Ａを保護しておき、次にｃＤＮＡの末端に、いわゆるＥ
ｃｏＲＩリンカー等をＴ４ＤＮＡリガーゼにより付加し
た後、制限酵素ＥｃｏＲＩでリンカーＤＮＡ部分のみを
切断しても同様な結果が得られる。ベクターのクローニ
ングサイトを例えばＢａｍＨＩなどの他の制限酵素の切
断点を選択する場合は前述の一連の末端処理の操作を、
例えばＢａｍＨＩアダプターの結合もしくはＢａｍＨＩ
メチレース、ＢａｍＨＩリンカー、ＢａｍＨＩ等の組み
合わせによる処理にする事により同様な結果を得ること
ができる。
ＤＮＡメチレースでｃＤＮＡ中の制限酵素切断点を、具
体的にはＥｃｏＲＩメチレースの場合はＥｃｏＲＩ切断
点をメチル化し、制限酵素ＥｃｏＲＩの切断からｃＤＮ
Ａを保護しておき、次にｃＤＮＡの末端に、いわゆるＥ
ｃｏＲＩリンカー等をＴ４ＤＮＡリガーゼにより付加し
た後、制限酵素ＥｃｏＲＩでリンカーＤＮＡ部分のみを
切断しても同様な結果が得られる。ベクターのクローニ
ングサイトを例えばＢａｍＨＩなどの他の制限酵素の切
断点を選択する場合は前述の一連の末端処理の操作を、
例えばＢａｍＨＩアダプターの結合もしくはＢａｍＨＩ
メチレース、ＢａｍＨＩリンカー、ＢａｍＨＩ等の組み
合わせによる処理にする事により同様な結果を得ること
ができる。
【００２５】また、前述のMarathonTM cDNA Amplificat
ion kitの場合ｃＤＮＡ末端にベクターの配列と相補的
な配列を導入したり、ＰＣＲ反応を行えるように工夫さ
れたできるアンカーＤＮＡを添付してあるのでそれを用
いて、適切なベクターにｃＤＮＡを挿入したり、ＰＣＲ
反応で増幅したりすることもできる。
ion kitの場合ｃＤＮＡ末端にベクターの配列と相補的
な配列を導入したり、ＰＣＲ反応を行えるように工夫さ
れたできるアンカーＤＮＡを添付してあるのでそれを用
いて、適切なベクターにｃＤＮＡを挿入したり、ＰＣＲ
反応で増幅したりすることもできる。
【００２６】上記の様に末端処理されたｃＤＮＡ鎖を市
販のλファージベクター、例えばλＺＡＰ（PromegaBio
tech社）等のλファージベクターまたはｐＧＥＭ２（Pr
omegaBiotech社）等のプラスミドベクターのＥｃｏＲＩ
切断部位に常法に従い挿入して組換えλファージＤＮＡ
群または組換えプラスミドＤＮＡ群を得る。あるいはMa
rathonTM cDNA Amplification kitの場合はメーカーが
推賞するベクターとつなぐことにより効率よく組み換え
体を得ることができる。あるいはＰＣＲ反応で断片を取
得する場合はＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡの断片
がその末端に特異的にＡが付加されるために、それに相
補的にＴを付加したベクター、例えばｐＣＲＩＩ（Invi
trogen社）やｐＴ７（Novagen社）などのベクターを用
いることによりできる。
販のλファージベクター、例えばλＺＡＰ（PromegaBio
tech社）等のλファージベクターまたはｐＧＥＭ２（Pr
omegaBiotech社）等のプラスミドベクターのＥｃｏＲＩ
切断部位に常法に従い挿入して組換えλファージＤＮＡ
群または組換えプラスミドＤＮＡ群を得る。あるいはMa
rathonTM cDNA Amplification kitの場合はメーカーが
推賞するベクターとつなぐことにより効率よく組み換え
体を得ることができる。あるいはＰＣＲ反応で断片を取
得する場合はＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡの断片
がその末端に特異的にＡが付加されるために、それに相
補的にＴを付加したベクター、例えばｐＣＲＩＩ（Invi
trogen社）やｐＴ７（Novagen社）などのベクターを用
いることによりできる。
【００２７】このようにして得られた組換えλファージ
ＤＮＡ群を材料とし、市販の例えばギガパック・ゴール
ド（プロメガ・バイオテック社）などのイン・ビトロ・
パッケージング・キットを説明書に従い使用し、いわゆ
るイン・ビトロ・パッケージングを行い、組換えλファ
ージＤＮＡを有するλファージ粒子を得ることが出来
る。得られたλファージ粒子を常法、例えばT. Maniati
sらの方法（「MolecularCloning」 Cold Spring Harbor L
aboratories刊 1982年）に従い、宿主、例えば、大腸菌
に形質導入し、増殖させることによりファージｃＤＮＡ
ライブラリーを作ることが出来る。また、組換えプラス
ミドＤＮＡ群では常法に従い、宿主、例えば、大腸菌を
形質転換し、増殖させる。これにより、プラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを得ることができる。
ＤＮＡ群を材料とし、市販の例えばギガパック・ゴール
ド（プロメガ・バイオテック社）などのイン・ビトロ・
パッケージング・キットを説明書に従い使用し、いわゆ
るイン・ビトロ・パッケージングを行い、組換えλファ
ージＤＮＡを有するλファージ粒子を得ることが出来
る。得られたλファージ粒子を常法、例えばT. Maniati
sらの方法（「MolecularCloning」 Cold Spring Harbor L
aboratories刊 1982年）に従い、宿主、例えば、大腸菌
に形質導入し、増殖させることによりファージｃＤＮＡ
ライブラリーを作ることが出来る。また、組換えプラス
ミドＤＮＡ群では常法に従い、宿主、例えば、大腸菌を
形質転換し、増殖させる。これにより、プラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを得ることができる。
【００２８】牛ＣｈＭ−ＩＩタンパク質の配列（特開平
５−２５５３９８号公報参照）を基にＰＣＲプライマー
を設計し、いわゆるＰＣＲ法にて牛ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子
の一部を取得することもできる。その場合ＰＣＲ法に用
いる鋳型には前述のファージｃＤＮＡライブラリー、プ
ラスミドｃＤＮＡライブラリーの他に牛軟骨細胞より抽
出したＲＮＡを基に常法に従い合成したｃＤＮＡを直接
用いることもできる。ＰＣＲ反応の反応後、反応液をア
ガロースやポリアクリルアミドゲルで解析し、二種類の
プライマーにより増幅されるＤＮＡ断片の中から、予想
される大きさの断片を回収、精製し、市販の、例えばｐ
ＣＲＩＩの様なＰＣＲ断片を直接組み込むことが出来る
ベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換することにより塩
基配列の解析に供することができる。さらに、得られた
ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子の部分配列を基に新たにＰＣＲプラ
イマーを設計、合成し、これと、牛ＣｈＭ−ＩＩの配列
を基に設計したＰＣＲプライマー、あるいはｃＤＮＡを
合成する際に用いるプライマーに対して相補的な配列の
プライマー、またはｃＤＮＡの両端に付加したアンカー
配列に対応するＰＣＲ用プライマー、ｃＤＮＡが組み込
まれたベクターに対するプライマーとの間でＤＮＡの増
幅を繰り返し行うことによりＣｈＭ−ＩＩの全長をコー
ドする遺伝子を取得することもできる。
５−２５５３９８号公報参照）を基にＰＣＲプライマー
を設計し、いわゆるＰＣＲ法にて牛ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子
の一部を取得することもできる。その場合ＰＣＲ法に用
いる鋳型には前述のファージｃＤＮＡライブラリー、プ
ラスミドｃＤＮＡライブラリーの他に牛軟骨細胞より抽
出したＲＮＡを基に常法に従い合成したｃＤＮＡを直接
用いることもできる。ＰＣＲ反応の反応後、反応液をア
ガロースやポリアクリルアミドゲルで解析し、二種類の
プライマーにより増幅されるＤＮＡ断片の中から、予想
される大きさの断片を回収、精製し、市販の、例えばｐ
ＣＲＩＩの様なＰＣＲ断片を直接組み込むことが出来る
ベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換することにより塩
基配列の解析に供することができる。さらに、得られた
ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子の部分配列を基に新たにＰＣＲプラ
イマーを設計、合成し、これと、牛ＣｈＭ−ＩＩの配列
を基に設計したＰＣＲプライマー、あるいはｃＤＮＡを
合成する際に用いるプライマーに対して相補的な配列の
プライマー、またはｃＤＮＡの両端に付加したアンカー
配列に対応するＰＣＲ用プライマー、ｃＤＮＡが組み込
まれたベクターに対するプライマーとの間でＤＮＡの増
幅を繰り返し行うことによりＣｈＭ−ＩＩの全長をコー
ドする遺伝子を取得することもできる。
【００２９】また、ファージｃＤＮＡライブラリー、プ
ラスミドｃＤＮＡライブラリーを常法に従い、適当な宿
主、例えば、大腸菌を形質転換し、増殖させる。次に、
これらファージあるいは大腸菌を、例えばジーンスクリ
ーニングプラス（Dupon社）などのナイロン膜あるいは
ニトロセルロース膜上に移し取り、アルカリ存在下で蛋
白を除き、λファージＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡ
にしたものに対して、前述の方法で増幅されたＣｈＭ遺
伝子の部分断片から常法に従い、あるいは市販のキット
等により作製した［32Ｐ］標識プローブとこれらｃＤＮ
ＡクローンのＤＮＡ群とをハイブリダイズさせプラーク
ハイブリダイゼーション法によって選択し、目的とする
牛ＣｈＭ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンをの全部
または一部得ることもできる。
ラスミドｃＤＮＡライブラリーを常法に従い、適当な宿
主、例えば、大腸菌を形質転換し、増殖させる。次に、
これらファージあるいは大腸菌を、例えばジーンスクリ
ーニングプラス（Dupon社）などのナイロン膜あるいは
ニトロセルロース膜上に移し取り、アルカリ存在下で蛋
白を除き、λファージＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡ
にしたものに対して、前述の方法で増幅されたＣｈＭ遺
伝子の部分断片から常法に従い、あるいは市販のキット
等により作製した［32Ｐ］標識プローブとこれらｃＤＮ
ＡクローンのＤＮＡ群とをハイブリダイズさせプラーク
ハイブリダイゼーション法によって選択し、目的とする
牛ＣｈＭ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンをの全部
または一部得ることもできる。
【００３０】ＰＣＲ反応の反応後、ＤＮＡの断片はアガ
ロースやポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によ
り解析、回収、精製し、前述の例えばｐＣＲ−ＩＩの様
なＰＣＲ断片を直接組み込むことが出来るベクターに挿
入後に大腸菌を形質転換し、常法に従いＤＮＡを調製
し、Sangerらのジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol.74, 5463(1977)］によって目的ＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できる。配列の決定はＡＢＩ３７３Ａ
（アプライド・バイオ・システムズ社）の様な自動シー
クエンサーによって行うこともできる。
ロースやポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によ
り解析、回収、精製し、前述の例えばｐＣＲ−ＩＩの様
なＰＣＲ断片を直接組み込むことが出来るベクターに挿
入後に大腸菌を形質転換し、常法に従いＤＮＡを調製
し、Sangerらのジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol.74, 5463(1977)］によって目的ＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できる。配列の決定はＡＢＩ３７３Ａ
（アプライド・バイオ・システムズ社）の様な自動シー
クエンサーによって行うこともできる。
【００３１】また、ファージライブラリーやプラスミド
ライブラリーから得られたクローンの場合、自動シーク
エンサーが塩基配列を決定できる長さには限界があるた
め、ベクターに挿入されたｃＤＮＡの全領域を一度に解
析することは難しい。そこで、断片を適当な制限酵素で
切断し、ゲル電気泳動で分離、回収し、回収された断片
を然るべきベクターに挿入し直すことにより解析を容易
にすることができる。このような操作をサブクローニン
グと呼ぶが、サブクローニング以外にも、自動シークエ
ンサーが決定した塩基配列の中から適当な配列を選び、
新たなプライマーを設計し、そこから先を継続して解析
する事ができる。このようにして決定されるＤＮＡ断片
の配列を互いに重なるように、かつ、コード領域の全長
をカバーするようにつなぎ合わせることにより、１５１
個のアミノ酸からなるＣｈＭ−ＩＩ前駆体タンパク質を
コードするＤＮＡが得られる。前述したように、本発明
のＤＮＡを利用してＣｈＭ−ＩＩタンパク質を発現させ
る場合には、この前駆体タンパク質を発現させてもよ
く、１３３アミノ酸からなる成熟タンパク質を直接発現
させてもよい。
ライブラリーから得られたクローンの場合、自動シーク
エンサーが塩基配列を決定できる長さには限界があるた
め、ベクターに挿入されたｃＤＮＡの全領域を一度に解
析することは難しい。そこで、断片を適当な制限酵素で
切断し、ゲル電気泳動で分離、回収し、回収された断片
を然るべきベクターに挿入し直すことにより解析を容易
にすることができる。このような操作をサブクローニン
グと呼ぶが、サブクローニング以外にも、自動シークエ
ンサーが決定した塩基配列の中から適当な配列を選び、
新たなプライマーを設計し、そこから先を継続して解析
する事ができる。このようにして決定されるＤＮＡ断片
の配列を互いに重なるように、かつ、コード領域の全長
をカバーするようにつなぎ合わせることにより、１５１
個のアミノ酸からなるＣｈＭ−ＩＩ前駆体タンパク質を
コードするＤＮＡが得られる。前述したように、本発明
のＤＮＡを利用してＣｈＭ−ＩＩタンパク質を発現させ
る場合には、この前駆体タンパク質を発現させてもよ
く、１３３アミノ酸からなる成熟タンパク質を直接発現
させてもよい。
【００３２】さらに、本発明によるＤＮＡ断片は配列表
の配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするものに限
らず、軟骨細胞を増殖させる活性および軟骨細胞の分化
機能を促進する活性、さらに破骨細胞の増殖を促進する
活性を持つ限りは、そのアミノ酸配列を改変したものも
含まれる。そのような改変されたＤＮＡは、例えば部位
特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配
列を改変することによって得られる。
の配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするものに限
らず、軟骨細胞を増殖させる活性および軟骨細胞の分化
機能を促進する活性、さらに破骨細胞の増殖を促進する
活性を持つ限りは、そのアミノ酸配列を改変したものも
含まれる。そのような改変されたＤＮＡは、例えば部位
特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配
列を改変することによって得られる。
【００３３】また、本発明のＤＮＡ又はこれを有する細
胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞又は
自然突然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列
番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１
８７〜５８５からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択
することによっても、改変されたＤＮＡを得ることがで
きる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、い
わゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハ
イブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確
に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同
性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞又は
自然突然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列
番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１
８７〜５８５からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択
することによっても、改変されたＤＮＡを得ることがで
きる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、い
わゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハ
イブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確
に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同
性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有する
ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００３４】上記のようにして得られる、特定の部位又
は未知の部位が変異した改変ＤＮＡ断片を、適当な細胞
で発現させ、その発現産物について、軟骨細胞を増殖さ
せる活性、軟骨細胞の分化機能を促進する活性、及び破
骨細胞の増殖を促進する活性を調べ、これらの活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを選択することによ
り、目的のＤＮＡを取得することができる。
は未知の部位が変異した改変ＤＮＡ断片を、適当な細胞
で発現させ、その発現産物について、軟骨細胞を増殖さ
せる活性、軟骨細胞の分化機能を促進する活性、及び破
骨細胞の増殖を促進する活性を調べ、これらの活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを選択することによ
り、目的のＤＮＡを取得することができる。
【００３５】上記のようにして得られる、ＣｈＭ−ＩＩ
蛋白の一部または全部をコードするＤＮＡ断片は、その
両端あるいはどちらかの末端を改変し、またはそのま
ま、公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモ
ーターの下流に挿入され、次いで上記のＤＮＡが挿入さ
れた発現ベクターは、大腸菌、酵母、動物細胞宿主等、
公知の宿主細胞中にそれ自体公知の方法により導入され
る。
蛋白の一部または全部をコードするＤＮＡ断片は、その
両端あるいはどちらかの末端を改変し、またはそのま
ま、公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモ
ーターの下流に挿入され、次いで上記のＤＮＡが挿入さ
れた発現ベクターは、大腸菌、酵母、動物細胞宿主等、
公知の宿主細胞中にそれ自体公知の方法により導入され
る。
【００３６】本発明のＣｈＭ−ＩＩタンパク質の産生方
法につき詳細に説明すると、発現ベクターとしては上記
のようにして得られたＣｈＭ−ＩＩタンパク質をコード
するＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが使用される。
法につき詳細に説明すると、発現ベクターとしては上記
のようにして得られたＣｈＭ−ＩＩタンパク質をコード
するＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが使用される。
【００３７】ＣｈＭ−ＩＩの工業生産のためには、安定
した宿主−ベクター系を構築すること、さらに生物学的
に活性の有するＣｈＭ−ＩＩを発現しうる系を用いる必
要がある。ＣｈＭ−ＩＩは多くのシステインを含み、そ
のリフォールディングが生理活性の獲得に重要である。
一般的にはリフォールディングを考慮した場合、宿主と
しては動物細胞を用いることが多い。しかし、天然のＣ
ｈＭ−ＩＩは糖蛋白質ではないこと、また生産量の優位
性から、生理活性を確保できるのであれば大腸菌での生
産も可能である。大腸菌での生産については、後述の実
施例で具体的に説明する。
した宿主−ベクター系を構築すること、さらに生物学的
に活性の有するＣｈＭ−ＩＩを発現しうる系を用いる必
要がある。ＣｈＭ−ＩＩは多くのシステインを含み、そ
のリフォールディングが生理活性の獲得に重要である。
一般的にはリフォールディングを考慮した場合、宿主と
しては動物細胞を用いることが多い。しかし、天然のＣ
ｈＭ−ＩＩは糖蛋白質ではないこと、また生産量の優位
性から、生理活性を確保できるのであれば大腸菌での生
産も可能である。大腸菌での生産については、後述の実
施例で具体的に説明する。
【００３８】動物細胞としては、例えばＣＨＯ細胞、Ｃ
ＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス
ＦＭ３Ａ細胞等が挙げられる。またこれらの細胞を宿主
とするとする場合は、前駆体タンパク質の形でＣｈＭ−
ＩＩ遺伝子を導入することにより、成熟型になったＣｈ
Ｍ−ＩＩが分泌生産されるという利点が期待される。
ＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス
ＦＭ３Ａ細胞等が挙げられる。またこれらの細胞を宿主
とするとする場合は、前駆体タンパク質の形でＣｈＭ−
ＩＩ遺伝子を導入することにより、成熟型になったＣｈ
Ｍ−ＩＩが分泌生産されるという利点が期待される。
【００３９】これらの細胞を宿主とした発現用プラスミ
ドは、プロモーターとしてはＳＶ４０プロモーターまた
はメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい。
この下流にシグナル配列を含むＣｈＭ−ＩＩ遺伝子を
５’側から挿入する。またＣｈＭ−ＩＩの生産量を上げ
るためＣｈＭ−ＩＩ遺伝子を５’側から２〜３個つなげ
たものを挿入してもよいし、各ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子の
５’側にＳＶ４０などのプロモーターを挿入したものを
２〜３個つなげてもよい。このＣｈＭ−ＩＩ遺伝子の下
流にはポリアデニル化部位が含まれる。例えばＳＶ４０
ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺
伝子由来のものが上げられる。
ドは、プロモーターとしてはＳＶ４０プロモーターまた
はメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい。
この下流にシグナル配列を含むＣｈＭ−ＩＩ遺伝子を
５’側から挿入する。またＣｈＭ−ＩＩの生産量を上げ
るためＣｈＭ−ＩＩ遺伝子を５’側から２〜３個つなげ
たものを挿入してもよいし、各ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子の
５’側にＳＶ４０などのプロモーターを挿入したものを
２〜３個つなげてもよい。このＣｈＭ−ＩＩ遺伝子の下
流にはポリアデニル化部位が含まれる。例えばＳＶ４０
ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺
伝子由来のものが上げられる。
【００４０】この発現ベクターには動物細胞、例えばＣ
ＨＯ細胞に形質転換した際の選択マーカーを有している
場合とそうでない場合の両者があげられる。選択マーカ
ーとしては、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺
伝子、３’−デオキシストレプタミン抗生物質Ｇ−４１
８などが挙げられ、各耐性遺伝子の５’側には例えばＳ
Ｖ４０由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺
伝子の３’側には、ポリアデニル化部位が含まれる。Ｃ
ｈＭ−ＩＩの発現ベクターにこれらの耐性遺伝子を挿入
する場合、ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子のポリアデニル化部位下
流に挿入すればよい。かかる発現ベクターは、形質転換
体の選択マーカーがなくてもよい。この場合、ＣｈＭ−
ＩＩの発現ベクターと共に形質転換体の選択のマーカー
を有するベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｇ
ｐｔ、ｐＭＴＶｄｈｆｒなどを二重形質転換してやれば
よい。
ＨＯ細胞に形質転換した際の選択マーカーを有している
場合とそうでない場合の両者があげられる。選択マーカ
ーとしては、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺
伝子、３’−デオキシストレプタミン抗生物質Ｇ−４１
８などが挙げられ、各耐性遺伝子の５’側には例えばＳ
Ｖ４０由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺
伝子の３’側には、ポリアデニル化部位が含まれる。Ｃ
ｈＭ−ＩＩの発現ベクターにこれらの耐性遺伝子を挿入
する場合、ＣｈＭ−ＩＩ遺伝子のポリアデニル化部位下
流に挿入すればよい。かかる発現ベクターは、形質転換
体の選択マーカーがなくてもよい。この場合、ＣｈＭ−
ＩＩの発現ベクターと共に形質転換体の選択のマーカー
を有するベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｇ
ｐｔ、ｐＭＴＶｄｈｆｒなどを二重形質転換してやれば
よい。
【００４１】この二重形質転換法によってＣｈＭ−ＩＩ
発現ベクターで形質転換した動物細胞を選択するために
は、上記した選択マーカーの発現による表現形質によ
り、ＣｈＭ−ＩＩ形質転換細胞を選択することが可能で
ある。さらにＣｈＭ−ＩＩの発現量の上昇を目的とし
て、二重形質転換法にてＣｈＭ−ＩＩの発現が確認され
た細胞に対し、選択マーカーを変更し二重形質転換を繰
り返してもよい。発現ベクターに使用されるプラスミド
ベクターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス
配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポリア
デニ化部位、ＳＶ４０初期領域からのポリアデニル化部
位、並びにｐＢＲ３２２由来の複製開始点およびアンピ
シリン耐性遺伝子を含有するｐＫＣＲ（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, Vol.78, 1528(1981)）などが挙げられ
る。
発現ベクターで形質転換した動物細胞を選択するために
は、上記した選択マーカーの発現による表現形質によ
り、ＣｈＭ−ＩＩ形質転換細胞を選択することが可能で
ある。さらにＣｈＭ−ＩＩの発現量の上昇を目的とし
て、二重形質転換法にてＣｈＭ−ＩＩの発現が確認され
た細胞に対し、選択マーカーを変更し二重形質転換を繰
り返してもよい。発現ベクターに使用されるプラスミド
ベクターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス
配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポリア
デニ化部位、ＳＶ４０初期領域からのポリアデニル化部
位、並びにｐＢＲ３２２由来の複製開始点およびアンピ
シリン耐性遺伝子を含有するｐＫＣＲ（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, Vol.78, 1528(1981)）などが挙げられ
る。
【００４２】発現ベクターの動物細胞への移入はリン酸
カルシウムによるトランスフェクション法が一般的であ
る。形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊
培養または付着培養で行うことができる。培地として
は、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜１０％
血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメサ
ゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下に
て培養する。ＣｈＭ−ＩＩを発現している動物細胞はそ
の培養上清中にＣｈＭ−ＩＩを分泌するものと考えら
れ、かかる組換え体の培養上清を用いＣｈＭ−ＩＩの分
離精製を行うことが可能である。生産されたＣｈＭ−Ｉ
Ｉを含む培養上清は各種クロマトグラフィー例えば、ヘ
パリンセファロースもしくはブルーセファロース等を用
いたクロマトグラフィーにより精製可能である。
カルシウムによるトランスフェクション法が一般的であ
る。形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊
培養または付着培養で行うことができる。培地として
は、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜１０％
血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメサ
ゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下に
て培養する。ＣｈＭ−ＩＩを発現している動物細胞はそ
の培養上清中にＣｈＭ−ＩＩを分泌するものと考えら
れ、かかる組換え体の培養上清を用いＣｈＭ−ＩＩの分
離精製を行うことが可能である。生産されたＣｈＭ−Ｉ
Ｉを含む培養上清は各種クロマトグラフィー例えば、ヘ
パリンセファロースもしくはブルーセファロース等を用
いたクロマトグラフィーにより精製可能である。
【００４３】また大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とす
るときには、発現ベクターはプロモーター、リボゾーム
結合（ＳＤ）配列、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質遺伝子、転
写終結配列、およびプロモーターを制御する遺伝子より
成ることが好ましい。
るときには、発現ベクターはプロモーター、リボゾーム
結合（ＳＤ）配列、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質遺伝子、転
写終結配列、およびプロモーターを制御する遺伝子より
成ることが好ましい。
【００４４】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
ＰＬ、ＰＲ 、Ｔ５ ファージの初期遺伝子のプロモー
ターであるＰ２５、Ｐ２６プロモーター等が挙げられ
る。また、これらのプロモーターは、例えばｐａｃプロ
モーター［Agric. Biol. Chem., Vol.52, 983-988(198
8)］のように独自に改変、設計された配列でも良い。
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
ＰＬ、ＰＲ 、Ｔ５ ファージの初期遺伝子のプロモー
ターであるＰ２５、Ｐ２６プロモーター等が挙げられ
る。また、これらのプロモーターは、例えばｐａｃプロ
モーター［Agric. Biol. Chem., Vol.52, 983-988(198
8)］のように独自に改変、設計された配列でも良い。
【００４５】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリボプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリボプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。
【００４６】更にこれらの発現に必要な因子の発現プラ
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質遺伝子、転写終
結因子の順に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上の
ＳＤ配列とＣｈＭ−ＩＩタンパク質遺伝子とのユニット
を複数個同方向に挿入することにより、ベクター上の転
写単位のコピー数を増加させる方法（特開平１−９５７
９８号公報）を用いることもできる。
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質遺伝子、転写終
結因子の順に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上の
ＳＤ配列とＣｈＭ−ＩＩタンパク質遺伝子とのユニット
を複数個同方向に挿入することにより、ベクター上の転
写単位のコピー数を増加させる方法（特開平１−９５７
９８号公報）を用いることもできる。
【００４７】組換え蛋白の大腸菌からの回収、精製を容
易にするために種々のアフィニティーカラムを利用する
こともできる。例えばヒスチジンが６個以上並んだアミ
ノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグを有する蛋白質がキ
レートカラムに結合する性質を利用し、プロモーターの
下流にこのヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列を
置き、その下流にＣｈＭ−ＩＩをつなぐことにより蛋白
の発現後キレートカラムにより容易に精製が可能とな
る。さらにヒスチジン配列とＣｈＭ−ＩＩの配列の間
に、例えばＴＥＶプロテアーゼや第１０因子により特異
的に切断される配列を組み込むことによりキレートカラ
ム精製後に蛋白質を天然型と同じ配列に戻し回収するこ
とができる。プロテアーゼによる切断後はＨＰＬＣ等に
より分離、精製することができる。
易にするために種々のアフィニティーカラムを利用する
こともできる。例えばヒスチジンが６個以上並んだアミ
ノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグを有する蛋白質がキ
レートカラムに結合する性質を利用し、プロモーターの
下流にこのヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列を
置き、その下流にＣｈＭ−ＩＩをつなぐことにより蛋白
の発現後キレートカラムにより容易に精製が可能とな
る。さらにヒスチジン配列とＣｈＭ−ＩＩの配列の間
に、例えばＴＥＶプロテアーゼや第１０因子により特異
的に切断される配列を組み込むことによりキレートカラ
ム精製後に蛋白質を天然型と同じ配列に戻し回収するこ
とができる。プロテアーゼによる切断後はＨＰＬＣ等に
より分離、精製することができる。
【００４８】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社）等がある。また、
融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシリー
ズ（Pharmacia社）、ヒスチジン配列を利用した精製が
可能なベクターとしてはｐＰＲＯＥＸ−Ｉが同様にして
使用できる。宿主の形質転換法としては、常法に従い行
うことができる。
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社）等がある。また、
融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシリー
ズ（Pharmacia社）、ヒスチジン配列を利用した精製が
可能なベクターとしてはｐＰＲＯＥＸ−Ｉが同様にして
使用できる。宿主の形質転換法としては、常法に従い行
うことができる。
【００４９】形質転換体の培養は、公知の常法に従って
行うことができる。培養温度としては、２８℃〜４２℃
が適当である。ラクトースオペロン（ｌａｃ）のプロモ
ーターを利用する場合は、菌体培養液の６００ｎｍの波
長における吸光度がおよそ０．５になったところで、終
濃度が１ｍＭ程度になるようにＩＰＴＧを加え発現誘導
を行うことが必要である。
行うことができる。培養温度としては、２８℃〜４２℃
が適当である。ラクトースオペロン（ｌａｃ）のプロモ
ーターを利用する場合は、菌体培養液の６００ｎｍの波
長における吸光度がおよそ０．５になったところで、終
濃度が１ｍＭ程度になるようにＩＰＴＧを加え発現誘導
を行うことが必要である。
【００５０】昆虫細胞としては、例えばInvitrogen社の
バキュロウイルス発現マニュアルであるマックスバック
（MAXBACTM； BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM MANUAL
VERSION 1.4）に従い、このキットを使用する。この
時、発現量を上げるためにポリヘドリンのプロモーター
から開始コドンまでの距離を変えることが好ましい。
バキュロウイルス発現マニュアルであるマックスバック
（MAXBACTM； BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM MANUAL
VERSION 1.4）に従い、このキットを使用する。この
時、発現量を上げるためにポリヘドリンのプロモーター
から開始コドンまでの距離を変えることが好ましい。
【００５１】上記形質転換体を培養して得られるＣｈＭ
−ＩＩタンパク質は、公知の方法で宿主から単離・精製
される。
−ＩＩタンパク質は、公知の方法で宿主から単離・精製
される。
【００５２】大腸菌等の微生物、昆虫細胞、および動物
細胞で発現させて得られる該組換えポリペプチドは、例
えばＣｈＭ−ＩＩの一部配列を含む合成ペプチドに対す
るウサギ抗血清との免疫学的反応性によりＣｈＭ−ＩＩ
であることが確認される。かかる方法としては、常法で
あるウェスタンブロッティング法が利用できる。
細胞で発現させて得られる該組換えポリペプチドは、例
えばＣｈＭ−ＩＩの一部配列を含む合成ペプチドに対す
るウサギ抗血清との免疫学的反応性によりＣｈＭ−ＩＩ
であることが確認される。かかる方法としては、常法で
あるウェスタンブロッティング法が利用できる。
【００５３】本発明のＣｈＭ−ＩＩは、医薬組成物とし
て、具体的には、軟骨細胞の増殖、軟骨細胞の分化機能
の促進、さらに破骨細胞の増殖の促進等の作用により、
骨折、各種軟骨疾患の予防または治療薬として有効であ
る。
て、具体的には、軟骨細胞の増殖、軟骨細胞の分化機能
の促進、さらに破骨細胞の増殖の促進等の作用により、
骨折、各種軟骨疾患の予防または治療薬として有効であ
る。
【００５４】ＣｈＭ−ＩＩの生理活性は例えば次のよう
にして測定される。軟骨細胞増殖活性の評価のための細
胞取得、培養、および評価方法は鈴木らの方法［Method
s inEnzymology, Vol.146, 313-320(1987)］に従って行
う。すなわちウサギより成長肋軟骨を分離し、初代軟骨
細胞を９６穴プレートを用いて培養する。細胞がコンフ
ルエントに達した後、約０．６から約２００ｎｇ／ｍｌ
のＣｈＭ−ＩＩおよび０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増
殖因子を加え、［3Ｈ］チミジンの取り込みを測定す
る。０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子のみ添加時
に比べＣｈＭ−ＩＩを同時に加えた時の方が多量の放射
性チミジンの取り込みがみられ、これはＣｈＭ−ＩＩが
強力な軟骨細胞の増殖促進効果を有することを示してい
る。
にして測定される。軟骨細胞増殖活性の評価のための細
胞取得、培養、および評価方法は鈴木らの方法［Method
s inEnzymology, Vol.146, 313-320(1987)］に従って行
う。すなわちウサギより成長肋軟骨を分離し、初代軟骨
細胞を９６穴プレートを用いて培養する。細胞がコンフ
ルエントに達した後、約０．６から約２００ｎｇ／ｍｌ
のＣｈＭ−ＩＩおよび０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増
殖因子を加え、［3Ｈ］チミジンの取り込みを測定す
る。０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子のみ添加時
に比べＣｈＭ−ＩＩを同時に加えた時の方が多量の放射
性チミジンの取り込みがみられ、これはＣｈＭ−ＩＩが
強力な軟骨細胞の増殖促進効果を有することを示してい
る。
【００５５】破骨細胞の増殖促進は破骨細胞の象牙質へ
の浸潤孔を指標に測定することができる。
の浸潤孔を指標に測定することができる。
【００５６】本発明においては、軟骨細胞を増殖させる
活性および軟骨細胞の分化機能を促進する活性さらに破
骨細胞の増殖を促進する活性を生体に適用させるには、
上記で得られたＣｈＭ−ＩＩタンパク質の他に形質転換
体の培養液、分離形質転換体、形質転換体処理物、固定
化形質転換体、粗酵素液、酵素処理物等が用いられる。
活性および軟骨細胞の分化機能を促進する活性さらに破
骨細胞の増殖を促進する活性を生体に適用させるには、
上記で得られたＣｈＭ−ＩＩタンパク質の他に形質転換
体の培養液、分離形質転換体、形質転換体処理物、固定
化形質転換体、粗酵素液、酵素処理物等が用いられる。
【００５７】このＣｈＭ−ＩＩは特開平５−２５５３９
８号公報にも記載されているように１ｎｇ〜１００μｇ
程度を骨折部位、軟骨疾患部位に、例えば外科手術用生
体接着剤等の生体適合性担体に混合、含浸、塗布するこ
とによって投与する、または局所的に注入する、または
静脈中、皮下等へ投与することにより、骨折、各種軟骨
疾患の治療薬として用いることができる。生体適合性担
体への混合、含浸、塗布、または注入用製剤等の調製は
それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができ
る。
８号公報にも記載されているように１ｎｇ〜１００μｇ
程度を骨折部位、軟骨疾患部位に、例えば外科手術用生
体接着剤等の生体適合性担体に混合、含浸、塗布するこ
とによって投与する、または局所的に注入する、または
静脈中、皮下等へ投与することにより、骨折、各種軟骨
疾患の治療薬として用いることができる。生体適合性担
体への混合、含浸、塗布、または注入用製剤等の調製は
それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができ
る。
【００５８】
【実施例】以下の実施例により、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例によって限定されるものではない。
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例によって限定されるものではない。
【００５９】＜１＞ＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡの部分断片
のクローニング （１）ウシ胎仔四肢骨端軟骨由来ｃＤＮＡライブラリー
の調製
のクローニング （１）ウシ胎仔四肢骨端軟骨由来ｃＤＮＡライブラリー
の調製
【００６０】ＰＣＲ反応の鋳型に用いるｃＤＮＡを合成
するために、ウシ胎仔四肢骨端軟骨ＲＮＡを調製した。
ＲＮＡの調製は、Chirgwinらの方法を若干変更して行っ
た。すなわち、ウシ胎仔四肢骨端軟骨１００ｇを液体窒
素中で粉砕し、グアニジンイソチオシアネート溶液［６
Ｍ グアニジンイソチオシアネート（和光純薬）、５ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウム（和光純薬）、０．１Ｍ ２−
メルカプトエタノール、０．５％ザルコシン酸ナトリウ
ム（和光純薬）、 ｐＨ７．０］中でホモジナイズし
た。ホモジネート２．５ｍｌあたり１ｇの塩化セシウム
（和光純薬）を加え、溶解した。あらかじめ、ホモジネ
ート２５ｍｌに対して１５ｍｌの塩化セシウム溶液
（５．７Ｍ塩化セシウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を遠沈
管に用意した。これに、ホモジネートを積層した。これ
を５５，０００×ｇで遠心分離してトータルＲＮＡを沈
澱として回収した。
するために、ウシ胎仔四肢骨端軟骨ＲＮＡを調製した。
ＲＮＡの調製は、Chirgwinらの方法を若干変更して行っ
た。すなわち、ウシ胎仔四肢骨端軟骨１００ｇを液体窒
素中で粉砕し、グアニジンイソチオシアネート溶液［６
Ｍ グアニジンイソチオシアネート（和光純薬）、５ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウム（和光純薬）、０．１Ｍ ２−
メルカプトエタノール、０．５％ザルコシン酸ナトリウ
ム（和光純薬）、 ｐＨ７．０］中でホモジナイズし
た。ホモジネート２．５ｍｌあたり１ｇの塩化セシウム
（和光純薬）を加え、溶解した。あらかじめ、ホモジネ
ート２５ｍｌに対して１５ｍｌの塩化セシウム溶液
（５．７Ｍ塩化セシウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を遠沈
管に用意した。これに、ホモジネートを積層した。これ
を５５，０００×ｇで遠心分離してトータルＲＮＡを沈
澱として回収した。
【００６１】回収したトータルＲＮＡを滅菌脱塩水に溶
解し、フェノール／クロロホルム抽出を行った。すなわ
ち、トータルＲＮＡ溶液と等容量のフェノール（和光純
薬）／クロロホルム（和光純薬）／イソアミルアルコー
ル（和光純薬）混液（２４対２５対１、体積比）を混和
し、１５，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上
清の水層を回収した。回収した水層と１／１０容量の３
Ｍ酢酸ナトリウム（和光純薬）溶液を混和後、２倍容量
のエタノールを添加して１５，０００×ｇ、１０分間の
遠心分離を行い、エタノール沈澱によるトータルＲＮＡ
の回収を行った。回収したトータルＲＮＡを乾燥させた
後、１０ｍｌの滅菌脱塩水に溶解した。
解し、フェノール／クロロホルム抽出を行った。すなわ
ち、トータルＲＮＡ溶液と等容量のフェノール（和光純
薬）／クロロホルム（和光純薬）／イソアミルアルコー
ル（和光純薬）混液（２４対２５対１、体積比）を混和
し、１５，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上
清の水層を回収した。回収した水層と１／１０容量の３
Ｍ酢酸ナトリウム（和光純薬）溶液を混和後、２倍容量
のエタノールを添加して１５，０００×ｇ、１０分間の
遠心分離を行い、エタノール沈澱によるトータルＲＮＡ
の回収を行った。回収したトータルＲＮＡを乾燥させた
後、１０ｍｌの滅菌脱塩水に溶解した。
【００６２】ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの精製は、以下の
ように行った。すなわち、１０ｍｇのトータルＲＮＡを
終濃度が１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５）になるように調製し、７０℃、５分間の熱処理
後、氷上で急冷した。これに、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を、
終濃度が０．５Ｍになるように加えて、Ｏｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）セルロースカラム（ｔｙｐｅ７、１×１ｃｍ、Phar
macia社）に展開し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）でカラムを洗浄後、滅菌脱塩水にて結合分画を溶出
して約１００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得た。
ように行った。すなわち、１０ｍｇのトータルＲＮＡを
終濃度が１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５）になるように調製し、７０℃、５分間の熱処理
後、氷上で急冷した。これに、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を、
終濃度が０．５Ｍになるように加えて、Ｏｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）セルロースカラム（ｔｙｐｅ７、１×１ｃｍ、Phar
macia社）に展開し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）でカラムを洗浄後、滅菌脱塩水にて結合分画を溶出
して約１００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得た。
【００６３】ｃＤＮＡの合成は、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮ
Ａ １０μｇを鋳型に用いた。反応は、ｃＤＮＡ synthe
sis module（Amersham社）に添付された逆転写酵素、リ
ボヌクリアーゼＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにて、説
明書に記載の方法で、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次
に、同じくｃＤＮＡ synthesis module（Amersham社）
に添付されたＴ４ＤＮＡポリメラーゼにてｃＤＮＡ末端
の平滑化を行った。反応後、フェノール／クロロホルム
抽出を行い、上清の水層を回収した。回収した水層と等
容量の５Ｍ酢酸アンモニウム溶液を添加後、２倍容量の
エタノールを混和した。次に、１５，０００×ｇ、１０
分間の遠心分離を行い、エタノール沈澱によるｃＤＮＡ
の回収を行った。回収したｃＤＮＡを乾燥した後、２０
μｌの滅菌脱塩水に溶解した。
Ａ １０μｇを鋳型に用いた。反応は、ｃＤＮＡ synthe
sis module（Amersham社）に添付された逆転写酵素、リ
ボヌクリアーゼＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにて、説
明書に記載の方法で、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次
に、同じくｃＤＮＡ synthesis module（Amersham社）
に添付されたＴ４ＤＮＡポリメラーゼにてｃＤＮＡ末端
の平滑化を行った。反応後、フェノール／クロロホルム
抽出を行い、上清の水層を回収した。回収した水層と等
容量の５Ｍ酢酸アンモニウム溶液を添加後、２倍容量の
エタノールを混和した。次に、１５，０００×ｇ、１０
分間の遠心分離を行い、エタノール沈澱によるｃＤＮＡ
の回収を行った。回収したｃＤＮＡを乾燥した後、２０
μｌの滅菌脱塩水に溶解した。
【００６４】次に、１０μｌのｃＤＮＡ（約２μｇ）を
分取して、その末端にＥｃｏＲＩアダプター（宝酒造）
を付加した。すなわち、２０μｌのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ反応液「６６ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2（和光純薬）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ、和光純薬）、６６μＭ
アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ、ＳＩＧＭＡ社）」
中に３５０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加
え、１６℃、２時間インキュベーションして、２００ｐ
ｍｏｌのＥｃｏＲＩアダプターをｃＤＮＡの末端に結合
した。
分取して、その末端にＥｃｏＲＩアダプター（宝酒造）
を付加した。すなわち、２０μｌのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ反応液「６６ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2（和光純薬）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ、和光純薬）、６６μＭ
アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ、ＳＩＧＭＡ社）」
中に３５０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加
え、１６℃、２時間インキュベーションして、２００ｐ
ｍｏｌのＥｃｏＲＩアダプターをｃＤＮＡの末端に結合
した。
【００６５】反応物を常法に従いＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ
−２００カラム（１×４ｃｍ）に展開し、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡと０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）にて、末端にＥｃｏＲＩアダプタ
ーを付加したｃＤＮＡを溶出した。溶出したｃＤＮＡを
エタノール沈澱で回収し、沈澱を乾燥後、２μｌの滅菌
脱塩水に溶解した。次に、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造）で消化後、末端を脱リン酸化したλｇｔ１
０ファージＤＮＡ（Clontech社） １μｇと、ＥｃｏＲ
Ｉアダプターを付加したｃＤＮＡ ４００ｎｇを、５μ
ｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液中で、１６℃、１８時間
インキュベーションしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにて結合
した。さらに、ｃＤＮＡと結合したλｇｔ１０ファージ
ＤＮＡをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ（Stratagene
社）を用いてファージ粒子へパッケージングした。
−２００カラム（１×４ｃｍ）に展開し、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡと０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）にて、末端にＥｃｏＲＩアダプタ
ーを付加したｃＤＮＡを溶出した。溶出したｃＤＮＡを
エタノール沈澱で回収し、沈澱を乾燥後、２μｌの滅菌
脱塩水に溶解した。次に、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造）で消化後、末端を脱リン酸化したλｇｔ１
０ファージＤＮＡ（Clontech社） １μｇと、ＥｃｏＲ
Ｉアダプターを付加したｃＤＮＡ ４００ｎｇを、５μ
ｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液中で、１６℃、１８時間
インキュベーションしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにて結合
した。さらに、ｃＤＮＡと結合したλｇｔ１０ファージ
ＤＮＡをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ（Stratagene
社）を用いてファージ粒子へパッケージングした。
【００６６】得られたファージ粒子を常法に従い大腸菌
Ｃ６００ｈｆｌＡ株に感染、増幅を行い、ファージ粒子
を回収した。一連の操作により、１００ｎｇのｃＤＮＡ
あたり約２００万のファージクローンを得た。回収さ
れたファージ懸濁液の一部（１００万クローン相当）
に、ＳＤＳ（ナカライテスク）、ＥＤＴＡがそれぞれ終
濃度１％、１０ｍＭになるように添加し、フェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを精
製した。
Ｃ６００ｈｆｌＡ株に感染、増幅を行い、ファージ粒子
を回収した。一連の操作により、１００ｎｇのｃＤＮＡ
あたり約２００万のファージクローンを得た。回収さ
れたファージ懸濁液の一部（１００万クローン相当）
に、ＳＤＳ（ナカライテスク）、ＥＤＴＡがそれぞれ終
濃度１％、１０ｍＭになるように添加し、フェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを精
製した。
【００６７】（２）ＣｈＭ−ＩＩタンパク質をコードす
るｃＤＮＡのＰＣＲ法によるクローニング 上記のようにして得られたｃＤＮＡを鋳型に用い、Ｃｈ
Ｍ−ＩＩタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法
により増幅した。ファージ粒子から回収したＤＮＡ ５
ｎｇを鋳型に反応液 {５０ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬）、
１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ 2、０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン（Ｄｉｆｃ
ｏ社）、０．２ｍＭ ４ｄＮＴＰ（東洋紡績）}中で、
０．５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）に
てｃＤＮＡの増幅反応を行った。その際、プライマーと
しては、特開平５−２５５３９８号公報に記載のＣｈＭ
−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列から推測し設計したプ
ライマー、５’−ＣＣＩＴＧＧＧＣＩＡＴＩＡＴＩＴＧ
(Ｃ／Ｔ）ＧＣ−３’（配列表の配列番号：４、２０ヌ
クレオチド、Ｉはイノシン）および５’−(Ａ／Ｇ）Ｔ
Ｃ(Ａ／Ｇ）ＣＡ(Ａ／Ｇ）ＴＴ(Ｃ／Ｔ）ＴＣＩＡＴ(Ａ
／Ｇ）ＴＧＩＡＴ(Ａ／Ｇ）ＴＧ−３’（配列表の配列
番号：５、２４ヌクレオチド）を、それぞれ終濃度０．
２ｍＭになるように添加して、全量で１００μｌの反応
液量とした。
るｃＤＮＡのＰＣＲ法によるクローニング 上記のようにして得られたｃＤＮＡを鋳型に用い、Ｃｈ
Ｍ−ＩＩタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法
により増幅した。ファージ粒子から回収したＤＮＡ ５
ｎｇを鋳型に反応液 {５０ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬）、
１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ 2、０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン（Ｄｉｆｃ
ｏ社）、０．２ｍＭ ４ｄＮＴＰ（東洋紡績）}中で、
０．５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）に
てｃＤＮＡの増幅反応を行った。その際、プライマーと
しては、特開平５−２５５３９８号公報に記載のＣｈＭ
−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列から推測し設計したプ
ライマー、５’−ＣＣＩＴＧＧＧＣＩＡＴＩＡＴＩＴＧ
(Ｃ／Ｔ）ＧＣ−３’（配列表の配列番号：４、２０ヌ
クレオチド、Ｉはイノシン）および５’−(Ａ／Ｇ）Ｔ
Ｃ(Ａ／Ｇ）ＣＡ(Ａ／Ｇ）ＴＴ(Ｃ／Ｔ）ＴＣＩＡＴ(Ａ
／Ｇ）ＴＧＩＡＴ(Ａ／Ｇ）ＴＧ−３’（配列表の配列
番号：５、２４ヌクレオチド）を、それぞれ終濃度０．
２ｍＭになるように添加して、全量で１００μｌの反応
液量とした。
【００６８】合成ＤＮＡプライマーは、ＡＢＩ３９４
ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社）を用いて合成した。増幅反応は、９４℃、１０分間
のインキュベーションの後、９４℃、１分間（変性ステ
ップ）、５０℃、１．５分間（アニーリングステッ
プ）、７２℃、３分間（伸長ステップ）のインキュベー
ションを３０サイクル繰り返すことにより行った。最後
に７２℃、７分間のインキュベーションを行い、反応を
終了した。反応後、反応液の１／１０を５％ ポリアク
リルアミドゲルにて電気泳動し、ゲルを臭化エチジウム
（Sigma社）で染色し、紫外線光（ＵＶ）下で解析し
た。
ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社）を用いて合成した。増幅反応は、９４℃、１０分間
のインキュベーションの後、９４℃、１分間（変性ステ
ップ）、５０℃、１．５分間（アニーリングステッ
プ）、７２℃、３分間（伸長ステップ）のインキュベー
ションを３０サイクル繰り返すことにより行った。最後
に７２℃、７分間のインキュベーションを行い、反応を
終了した。反応後、反応液の１／１０を５％ ポリアク
リルアミドゲルにて電気泳動し、ゲルを臭化エチジウム
（Sigma社）で染色し、紫外線光（ＵＶ）下で解析し
た。
【００６９】また、上記反応液のうち０．５μｌを鋳型
として用いて、２回目の増幅反応を行った。２回目の増
幅反応は、１回目の増幅反応に準じて行った。プライマ
ーとしては、一回目の増幅反応の際に用いたプライマー
より内側に位置するプライマー、５’−ＴＧ(Ｃ／Ｔ）
ＧＡ(Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＣＡ(Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＴＧ(Ｃ／
Ｔ）Ｇ−３’（配列表の配列番号：６、１９ヌクレオチ
ド）および５’−(Ｃ／Ｔ）ＴＧＩＡＴＩＣＣＩＧＧ(Ａ
／Ｇ）ＴＡＩＡＣ(Ｃ／Ｔ）ＴＴ−３’（配列表の配列
番号：７、２１ヌクレオチド）を用いた。反応は、９４
℃、１０分間のインキュベーションの後、９４℃、１分
間、４８℃、１．５分間、７２℃、３分間のインキュベ
ーションを３０サイクル繰り返すことにより行った。最
後に７２℃、７分間のインキュベーションを行い、反応
を終了した。
として用いて、２回目の増幅反応を行った。２回目の増
幅反応は、１回目の増幅反応に準じて行った。プライマ
ーとしては、一回目の増幅反応の際に用いたプライマー
より内側に位置するプライマー、５’−ＴＧ(Ｃ／Ｔ）
ＧＡ(Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＣＡ(Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＴＧ(Ｃ／
Ｔ）Ｇ−３’（配列表の配列番号：６、１９ヌクレオチ
ド）および５’−(Ｃ／Ｔ）ＴＧＩＡＴＩＣＣＩＧＧ(Ａ
／Ｇ）ＴＡＩＡＣ(Ｃ／Ｔ）ＴＴ−３’（配列表の配列
番号：７、２１ヌクレオチド）を用いた。反応は、９４
℃、１０分間のインキュベーションの後、９４℃、１分
間、４８℃、１．５分間、７２℃、３分間のインキュベ
ーションを３０サイクル繰り返すことにより行った。最
後に７２℃、７分間のインキュベーションを行い、反応
を終了した。
【００７０】反応後、反応液の１／１０を５％ ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて解析した。
ゲルを臭化エチジウムで染色し、約２００ ｂｐ付近の
ゲル断片をＵＶ下で回収した。回収したゲルは、緩衝液
（０．２５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１％ ＳＤＳ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。ホモジネート
を３７℃で２時間振蕩し、フェノール／クロロホルム抽
出を行い上清の水層を回収した。回収した水層に、等容
量の５Ｍ酢酸アンモニウムを添加した後、２倍容量のエ
タノールを添加し、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心
分離を行いｃＤＮＡを回収した。
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて解析した。
ゲルを臭化エチジウムで染色し、約２００ ｂｐ付近の
ゲル断片をＵＶ下で回収した。回収したゲルは、緩衝液
（０．２５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１％ ＳＤＳ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。ホモジネート
を３７℃で２時間振蕩し、フェノール／クロロホルム抽
出を行い上清の水層を回収した。回収した水層に、等容
量の５Ｍ酢酸アンモニウムを添加した後、２倍容量のエ
タノールを添加し、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心
分離を行いｃＤＮＡを回収した。
【００７１】次に、ｃＤＮＡを乾燥した後、１６μｌの
滅菌脱塩水に溶解し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
［３３ｍＭ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）、６６ｍ
Ｍ 酢酸カリウム（和光純薬）、１０ｍＭ 酢酸マグネシ
ウム（和光純薬）、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ４ｄＮ
ＴＰ］中で６単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと、３７
℃、３０分間反応させた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによ
り末端を平滑化したｃＤＮＡをフェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱を行い精製した。 精製したｃ
ＤＮＡを乾燥後、２０μｌの滅菌脱塩水に溶解した。次
に、５μｌのｃＤＮＡ溶液と、あらかじめ制限酵素Ｓｍ
ａＩ（宝酒造）で消化後、脱リン酸化し、精製したプラ
スミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造）１００ｎｇを、１
０μｌの反応液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼにて１６℃、
１２時間反応させることにより、プラスミドベクターｐ
ＵＣ１８のクローニング部位（ＳｍａＩ部位）に挿入し
て結合した。
滅菌脱塩水に溶解し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
［３３ｍＭ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）、６６ｍ
Ｍ 酢酸カリウム（和光純薬）、１０ｍＭ 酢酸マグネシ
ウム（和光純薬）、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ４ｄＮ
ＴＰ］中で６単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと、３７
℃、３０分間反応させた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによ
り末端を平滑化したｃＤＮＡをフェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱を行い精製した。 精製したｃ
ＤＮＡを乾燥後、２０μｌの滅菌脱塩水に溶解した。次
に、５μｌのｃＤＮＡ溶液と、あらかじめ制限酵素Ｓｍ
ａＩ（宝酒造）で消化後、脱リン酸化し、精製したプラ
スミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造）１００ｎｇを、１
０μｌの反応液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼにて１６℃、
１２時間反応させることにより、プラスミドベクターｐ
ＵＣ１８のクローニング部位（ＳｍａＩ部位）に挿入し
て結合した。
【００７２】この反応液 ３μｌを用いて、大腸菌ＪＭ
１０９株のコンピテントセル（COMPETENT HIGH、東洋紡
績）を形質転換し、直径９ ｃｍのシャーレ中の寒天培
地に菌液を塗布し、培養した。この際、寒天培地として
は、アンピシリン（Ａｍｐ、和光純薬）を終濃度５０μ
ｇ／ｍｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ、Sigma社）
を終濃度０．００４％、イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Sigma社）を終濃度１ｍ
Ｍの濃度で含有した１．５％ ＬＢ寒天培地 ［１．５％
寒天（和光純薬）、１％ バクトトリプトン（Difco
社）、０．５％ 酵母抽出物（Difco社）、０．５％ Ｎ
ａＣｌ］（以下、Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ−Ａｍｐ
寒天培地という）を用いた。培養は３７℃で１８時間行
った。培養後、Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ−Ａｍｐ寒
天培地上に出現した耐性菌で、かつＸ−Ｇａｌにより発
色していない菌のコロニーを１００個選択し、各々５ｍ
ｌの、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ培地（１％
バクトトリプトン、０．５％ 酵母抽出物、０．５％ Ｎ
ａＣｌ）中で３７℃、１２時間、振盪培養した。
１０９株のコンピテントセル（COMPETENT HIGH、東洋紡
績）を形質転換し、直径９ ｃｍのシャーレ中の寒天培
地に菌液を塗布し、培養した。この際、寒天培地として
は、アンピシリン（Ａｍｐ、和光純薬）を終濃度５０μ
ｇ／ｍｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ、Sigma社）
を終濃度０．００４％、イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Sigma社）を終濃度１ｍ
Ｍの濃度で含有した１．５％ ＬＢ寒天培地 ［１．５％
寒天（和光純薬）、１％ バクトトリプトン（Difco
社）、０．５％ 酵母抽出物（Difco社）、０．５％ Ｎ
ａＣｌ］（以下、Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ−Ａｍｐ
寒天培地という）を用いた。培養は３７℃で１８時間行
った。培養後、Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ−Ａｍｐ寒
天培地上に出現した耐性菌で、かつＸ−Ｇａｌにより発
色していない菌のコロニーを１００個選択し、各々５ｍ
ｌの、５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ培地（１％
バクトトリプトン、０．５％ 酵母抽出物、０．５％ Ｎ
ａＣｌ）中で３７℃、１２時間、振盪培養した。
【００７３】次に、常法に従い、菌体からプラスミドＤ
ＮＡを調製した。すなわち、菌体を１０，０００×ｇ、
１０分間の遠心分離により培養液から回収した。回収し
た菌体を、培地の１／２５容量の、１ｍｇ／ｍｌのリゾ
チーム（生化学工業）を含む溶液Ｉ ［５０ｍＭ Ｄ
（＋）−グルコース（和光純薬）、２５ｍＭ トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁
した。菌体懸濁液を氷上に１０分間静置後、溶液Ｉの２
倍容量の溶液ＩＩ（１％ ＳＤＳ、０．２ Ｎ ＮａＯ
Ｈ）を添加し、穏やかに混和後、氷上にさらに１０分間
静置した。次に、溶液Ｉの１．５倍容量の溶液ＩＩＩ
（６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムに１１．５ｍｌの酢酸と
２８．５ｍｌの滅菌脱塩水を混和した溶液）を添加し、
氷上に１５分間静置した。静置後、１０，０００×ｇ、
１０分間の遠心分離により上清を回収し、上清の２／３
容量のイソプロパノールを混和して、氷上にさらに１０
分間静置した。静置後、１０，０００×ｇ、１０分間の
遠心分離を行い、核酸を回収した。核酸を乾燥後、培地
の１／２５容量の、０．１ ｍｇ／ｍｌのリボヌクレア
ーゼＡ（Sigma社）を含むＴＥ緩衝液 ［１０ｍＭトリス
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解し、３７
℃、３０分間インキュベーションした。
ＮＡを調製した。すなわち、菌体を１０，０００×ｇ、
１０分間の遠心分離により培養液から回収した。回収し
た菌体を、培地の１／２５容量の、１ｍｇ／ｍｌのリゾ
チーム（生化学工業）を含む溶液Ｉ ［５０ｍＭ Ｄ
（＋）−グルコース（和光純薬）、２５ｍＭ トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁
した。菌体懸濁液を氷上に１０分間静置後、溶液Ｉの２
倍容量の溶液ＩＩ（１％ ＳＤＳ、０．２ Ｎ ＮａＯ
Ｈ）を添加し、穏やかに混和後、氷上にさらに１０分間
静置した。次に、溶液Ｉの１．５倍容量の溶液ＩＩＩ
（６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムに１１．５ｍｌの酢酸と
２８．５ｍｌの滅菌脱塩水を混和した溶液）を添加し、
氷上に１５分間静置した。静置後、１０，０００×ｇ、
１０分間の遠心分離により上清を回収し、上清の２／３
容量のイソプロパノールを混和して、氷上にさらに１０
分間静置した。静置後、１０，０００×ｇ、１０分間の
遠心分離を行い、核酸を回収した。核酸を乾燥後、培地
の１／２５容量の、０．１ ｍｇ／ｍｌのリボヌクレア
ーゼＡ（Sigma社）を含むＴＥ緩衝液 ［１０ｍＭトリス
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解し、３７
℃、３０分間インキュベーションした。
【００７４】インキュベーション後、等容量のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）溶液 ［２０％ ＰＥＧ ６０
００（和光純薬）、１．５Ｍ ＮａＣｌ］を混和し、ド
ライアイス上で３０分間静置した。次に、１５，０００
×ｇ 、１５分間遠心分離を行い、プラスミドＤＮＡを
回収した。回収したプラスミドＤＮＡを７０％ エタノ
ールで２回洗浄し、乾燥後、培地の１／５０容量のＴＥ
緩衝液に溶解し、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱を行い、プラスミドＤＮＡを精製した。精製
したプラスミドＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、１％ アガロース（岩井化学）ゲル電気泳
動で解析した。その結果、約３００ ｂｐのｃＤＮＡ断
片を有する組換え体ｐＣＨＭ−２−１を得た。
レングリコール（ＰＥＧ）溶液 ［２０％ ＰＥＧ ６０
００（和光純薬）、１．５Ｍ ＮａＣｌ］を混和し、ド
ライアイス上で３０分間静置した。次に、１５，０００
×ｇ 、１５分間遠心分離を行い、プラスミドＤＮＡを
回収した。回収したプラスミドＤＮＡを７０％ エタノ
ールで２回洗浄し、乾燥後、培地の１／５０容量のＴＥ
緩衝液に溶解し、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱を行い、プラスミドＤＮＡを精製した。精製
したプラスミドＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、１％ アガロース（岩井化学）ゲル電気泳
動で解析した。その結果、約３００ ｂｐのｃＤＮＡ断
片を有する組換え体ｐＣＨＭ−２−１を得た。
【００７５】（３）塩基配列の決定 組換え体ｐＣＨＭ−２−１を４０ｍｌのＬＢ培地に播種
し、３７℃で１５時間培養して調製した菌体培地から、
常法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。調製したプラ
スミドＤＮＡを用いて、ＡＢＩ３７３Ａ シークエンサ
ー（Applied Biosystems社）にてSanger法による塩基配
列の決定を行った。なお、以下に行う塩基配列の決定は
全て本法を用いて行った。
し、３７℃で１５時間培養して調製した菌体培地から、
常法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。調製したプラ
スミドＤＮＡを用いて、ＡＢＩ３７３Ａ シークエンサ
ー（Applied Biosystems社）にてSanger法による塩基配
列の決定を行った。なお、以下に行う塩基配列の決定は
全て本法を用いて行った。
【００７６】決定した塩基配列をもとに推定したアミノ
酸配列は、精製ＣｈＭ−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列
（特開平5-255398の配列番号１４参照）の一部と一致し
た。
酸配列は、精製ＣｈＭ−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列
（特開平5-255398の配列番号１４参照）の一部と一致し
た。
【００７７】（４）完全長ＣｈＭ−ＩＩｃＤＮＡの取得
−下流配列の取得（３’−ＲＡＣＥ法） 上記でｐＣＨＭ−２−１のｃＤＮＡ断片からプローブを
調製し、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する際に鋳型として
用いたウシ胎仔軟骨ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングしたが、完全長ｃＤＮＡを取得することはできなか
った。そこで、完全長ｃＤＮＡを取得する目的で以下の
Rapid Amplification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法によ
るｃＤＮＡの増幅を行った。
−下流配列の取得（３’−ＲＡＣＥ法） 上記でｐＣＨＭ−２−１のｃＤＮＡ断片からプローブを
調製し、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する際に鋳型として
用いたウシ胎仔軟骨ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングしたが、完全長ｃＤＮＡを取得することはできなか
った。そこで、完全長ｃＤＮＡを取得する目的で以下の
Rapid Amplification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法によ
るｃＤＮＡの増幅を行った。
【００７８】ＲＮＡの調製は以下のように行った。ま
ず、推定４週齢（体長４ｃｍ）のウシ胎仔全組織約２０
０ ｇを液体窒素中で粉砕し、２００ｍｌのＲＮＡｚｏ
ｌ溶液（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ社）中でホモジナイズした。
次に、ホモジネートの１／１０容量のクロロホルムを混
和し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層を
回収した。水層と等容量のイソプロパノールを混和し、
１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、トータル
ＲＮＡを回収した。回収したトータルＲＮＡを乾燥させ
た後、１０ｍｌの滅菌脱塩水に溶解した。約２００ ｇ
の組織から約２００ ｍｇのトータルＲＮＡを抽出し
た。次に、常法に従いＲＮＡの精製を行い、１０ ｍｇ
のトータルＲＮＡから約１００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+
ＲＮＡを得た。
ず、推定４週齢（体長４ｃｍ）のウシ胎仔全組織約２０
０ ｇを液体窒素中で粉砕し、２００ｍｌのＲＮＡｚｏ
ｌ溶液（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ社）中でホモジナイズした。
次に、ホモジネートの１／１０容量のクロロホルムを混
和し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層を
回収した。水層と等容量のイソプロパノールを混和し、
１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、トータル
ＲＮＡを回収した。回収したトータルＲＮＡを乾燥させ
た後、１０ｍｌの滅菌脱塩水に溶解した。約２００ ｇ
の組織から約２００ ｍｇのトータルＲＮＡを抽出し
た。次に、常法に従いＲＮＡの精製を行い、１０ ｍｇ
のトータルＲＮＡから約１００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+
ＲＮＡを得た。
【００７９】得られたｍＲＮＡを鋳型に、MarathonTM c
DNA Amplification kit（Clontech社）を用いて、ＲＡ
ＣＥ法によるｃＤＮＡの増幅を行った。以下の反応にお
いて、合成ＤＮＡプライマーは、MarathonTM cDNA Ampl
ification kitに添付されたプライマー以外は、ＡＢＩ
３９４ ＤＮＡ合成機を用いて合成した。反応は、Marat
honTM cDNA Amplification kitに添付された緩衝液およ
びｄＮＴＰを用いて行った。
DNA Amplification kit（Clontech社）を用いて、ＲＡ
ＣＥ法によるｃＤＮＡの増幅を行った。以下の反応にお
いて、合成ＤＮＡプライマーは、MarathonTM cDNA Ampl
ification kitに添付されたプライマー以外は、ＡＢＩ
３９４ ＤＮＡ合成機を用いて合成した。反応は、Marat
honTM cDNA Amplification kitに添付された緩衝液およ
びｄＮＴＰを用いて行った。
【００８０】まず、ｃＤＮＡの合成を行った。精製した
ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ １μｇとｃＤＮＡ合成プライマ
ー、５’−ＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴ(Ｇ／Ａ／Ｃ）(Ｇ／Ａ／Ｃ／Ｔ）−３’（配
列表の配列番号：８、５２ヌクレオチド）を逆転写酵素
にて３７℃で処理し、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。第２
鎖伸長反応、末端の平滑化を行い、ｃＤＮＡの両端へア
ダプタープライマー、［５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’（配列表の配列番号：９、４４
ヌクレオチド）と５’−ＰＯ4−ＡＣＣＴＧＣＣＣ−Ｎ
Ｈ2−３’(配列表の配列番号：１０、８ヌクレオチ
ド）］の結合を行った。最終反応の反応液１０μｌを希
釈し５０μｌとして、以後の増幅反応に１μｌを用い
た。
ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ １μｇとｃＤＮＡ合成プライマ
ー、５’−ＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴ(Ｇ／Ａ／Ｃ）(Ｇ／Ａ／Ｃ／Ｔ）−３’（配
列表の配列番号：８、５２ヌクレオチド）を逆転写酵素
にて３７℃で処理し、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。第２
鎖伸長反応、末端の平滑化を行い、ｃＤＮＡの両端へア
ダプタープライマー、［５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’（配列表の配列番号：９、４４
ヌクレオチド）と５’−ＰＯ4−ＡＣＣＴＧＣＣＣ−Ｎ
Ｈ2−３’(配列表の配列番号：１０、８ヌクレオチ
ド）］の結合を行った。最終反応の反応液１０μｌを希
釈し５０μｌとして、以後の増幅反応に１μｌを用い
た。
【００８１】増幅反応は、ＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡの配
列の一部と相補的なプライマー、５’−ＴＧＴＧＧＣＣ
ＡＧＴＡＣＡＣＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：１
１、１７ヌクレオチド）および３’末端に付加したアダ
プタープライマーと相補的なプライマー、５’−ＣＣＡ
ＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−
３’（配列表の配列番号：１２、２７ヌクレオチド）を
用い、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて行った。反応液
は、全量で５０μｌとした。反応は、９４℃、１分間の
インキュベーションの後、９４℃、３０秒間、６０℃、
３０秒間、６８℃、５分間のインキュベーションを３０
サイクル行い、最後に７２℃、７分間のインキュベーシ
ョンを行って反応を終了した。反応液の１／１０を５％
ＰＡＧＥにて解析した。また、上記反応液のうち５μ
ｌを５０倍希釈し、その５μｌを用いて２回目の増幅反
応を行った。
列の一部と相補的なプライマー、５’−ＴＧＴＧＧＣＣ
ＡＧＴＡＣＡＣＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：１
１、１７ヌクレオチド）および３’末端に付加したアダ
プタープライマーと相補的なプライマー、５’−ＣＣＡ
ＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−
３’（配列表の配列番号：１２、２７ヌクレオチド）を
用い、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて行った。反応液
は、全量で５０μｌとした。反応は、９４℃、１分間の
インキュベーションの後、９４℃、３０秒間、６０℃、
３０秒間、６８℃、５分間のインキュベーションを３０
サイクル行い、最後に７２℃、７分間のインキュベーシ
ョンを行って反応を終了した。反応液の１／１０を５％
ＰＡＧＥにて解析した。また、上記反応液のうち５μ
ｌを５０倍希釈し、その５μｌを用いて２回目の増幅反
応を行った。
【００８２】２回目の増幅反応は、１回目の増幅反応に
準じて行った。希釈反応液５μｌを鋳型に、１回目の増
幅反応に用いたプライマーより内側に位置するプライマ
ー、５’−ＡＧＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＡ−
３’（配列表の配列番号：１３、１８ヌクレオチド）お
よび５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣ
ＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：１４、２３ヌクレオ
チド）を用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにて増幅反
応を行った。反応液は、全量で５０μｌとした。反応
は、９４℃、１分間のインキュベーションの後、９４
℃、３０秒間、６０℃、３０秒間、６８℃、５分間のイ
ンキュベーションを３０サイクル行い、最後に７２℃、
７分間のインキュベーションを行い反応を終了した。反
応終了後、反応液の１／１０を５％ ＰＡＧＥにて解析
した。
準じて行った。希釈反応液５μｌを鋳型に、１回目の増
幅反応に用いたプライマーより内側に位置するプライマ
ー、５’−ＡＧＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＡ−
３’（配列表の配列番号：１３、１８ヌクレオチド）お
よび５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣ
ＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：１４、２３ヌクレオ
チド）を用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにて増幅反
応を行った。反応液は、全量で５０μｌとした。反応
は、９４℃、１分間のインキュベーションの後、９４
℃、３０秒間、６０℃、３０秒間、６８℃、５分間のイ
ンキュベーションを３０サイクル行い、最後に７２℃、
７分間のインキュベーションを行い反応を終了した。反
応終了後、反応液の１／１０を５％ ＰＡＧＥにて解析
した。
【００８３】次に、約２００ｂｐ付近に位置するゲル断
片から、増幅したｃＤＮＡ断片を回収、精製し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにてプラスミドベクターｐＣＲＩＩ（In
vitrogen社）のクローニング部位に挿入して、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−Ｌ
Ｂ−Ａｍｐ寒天培地上に出現した耐性菌で、かつＸ−Ｇ
ａｌにより発色していない３つの形質転換体について、
常法に従いプラスミドＤＮＡを調製し、解析を行った。
さらに、調製したプラスミドＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡ
の塩基配列を決定した。その結果、約２００ｂｐの３’
非翻訳領域の塩基配列を有するｃＤＮＡ断片を持つ組換
え体ｐＣＨＭ−２−３を得た。
片から、増幅したｃＤＮＡ断片を回収、精製し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにてプラスミドベクターｐＣＲＩＩ（In
vitrogen社）のクローニング部位に挿入して、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−Ｌ
Ｂ−Ａｍｐ寒天培地上に出現した耐性菌で、かつＸ−Ｇ
ａｌにより発色していない３つの形質転換体について、
常法に従いプラスミドＤＮＡを調製し、解析を行った。
さらに、調製したプラスミドＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡ
の塩基配列を決定した。その結果、約２００ｂｐの３’
非翻訳領域の塩基配列を有するｃＤＮＡ断片を持つ組換
え体ｐＣＨＭ−２−３を得た。
【００８４】（５）完全長ＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡの取
得−上流配列の取得（５’−ＲＡＣＥ法） ５’−ＲＡＣＥ法の反応は、３’−ＲＡＣＥ法に準じて
行った。合成ＤＮＡプライマーは、MarathonTM cDNA Am
plification kitに添付されたプライマー以外はＡＢＩ
３９４ ＤＮＡ合成機を用いて合成した。反応は、Marat
honTM cDNA Amplification kitに添付された緩衝液およ
びｄＮＴＰを用いた。鋳型としては、３’−ＲＡＣＥ法
の反応と同じく、両端にアダプタープライマーを付加し
たｃＤＮＡを用いた。１回目の増幅反応は、３’−ＲＡ
ＣＥ法で決定したＣｈＭ−ＩＩｃＤＮＡの３’非翻訳領
域の配列を基に設計したプライマー、５’−ＡＧＡＴＣ
ＧＧＣＴＴＧＴＩＣＣＴＣＣＡＴ−３’（配列表の配列
番号：１５、２０ヌクレオチド）および３’末端に付加
したアダプタープライマーと相補的な、３’−ＲＡＣＥ
法の反応の際にも用いたプライマー、５’−ＣＣＡＴＣ
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’
（配列表の配列番号：１２、２７ヌクレオチド）を用い
た。反応液は全量を５０μｌとして、Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼにて増幅反応を行った。反応は、９４℃、１
分間のインキュベーションの後、９４℃、３０秒間、６
０℃、３０秒間、６８℃、５分間のインキュベーション
を３０サイクル行い、最後に７２℃、７分間のインキュ
ベーションを行って反応を終了した。反応後、反応液の
１／１０を５％ ＰＡＧＥにて解析した。また、上記反
応液のうち ５μｌを５０倍希釈し、その５μｌを鋳型
として用いて、２回目の増幅反応を行った。
得−上流配列の取得（５’−ＲＡＣＥ法） ５’−ＲＡＣＥ法の反応は、３’−ＲＡＣＥ法に準じて
行った。合成ＤＮＡプライマーは、MarathonTM cDNA Am
plification kitに添付されたプライマー以外はＡＢＩ
３９４ ＤＮＡ合成機を用いて合成した。反応は、Marat
honTM cDNA Amplification kitに添付された緩衝液およ
びｄＮＴＰを用いた。鋳型としては、３’−ＲＡＣＥ法
の反応と同じく、両端にアダプタープライマーを付加し
たｃＤＮＡを用いた。１回目の増幅反応は、３’−ＲＡ
ＣＥ法で決定したＣｈＭ−ＩＩｃＤＮＡの３’非翻訳領
域の配列を基に設計したプライマー、５’−ＡＧＡＴＣ
ＧＧＣＴＴＧＴＩＣＣＴＣＣＡＴ−３’（配列表の配列
番号：１５、２０ヌクレオチド）および３’末端に付加
したアダプタープライマーと相補的な、３’−ＲＡＣＥ
法の反応の際にも用いたプライマー、５’−ＣＣＡＴＣ
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’
（配列表の配列番号：１２、２７ヌクレオチド）を用い
た。反応液は全量を５０μｌとして、Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼにて増幅反応を行った。反応は、９４℃、１
分間のインキュベーションの後、９４℃、３０秒間、６
０℃、３０秒間、６８℃、５分間のインキュベーション
を３０サイクル行い、最後に７２℃、７分間のインキュ
ベーションを行って反応を終了した。反応後、反応液の
１／１０を５％ ＰＡＧＥにて解析した。また、上記反
応液のうち ５μｌを５０倍希釈し、その５μｌを鋳型
として用いて、２回目の増幅反応を行った。
【００８５】２回目の増幅反応は、１回目の増幅反応に
準じて行った。プライマーとしては、１回目の増幅反応
に用いたプライマーより内側に位置するプライマー、
５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＣＩＴＴＴＴＡＧＡ
−３’（配列表の配列番号：１６、２２ヌクレオチド）
および５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＣＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：１７、２３ヌクレ
オチド）を用いて行った。反応は、９４℃、１分間のイ
ンキュベーションの後、９４℃、３０秒間、６０℃、３
０秒間、６８℃、５分間のインキュベーションを３０サ
イクル行い、最後に７２℃、７分間のインキュベーショ
ンを行って反応を終了した。反応後、反応液の１／１０
を５％ＰＡＧＥにて解析した。次に、約５００ｂｐ付近
に位置するゲル断片から、増幅したｃＤＮＡを回収、精
製し、プラスミドベクターｐＣＲＩＩのクローニング部
位に挿入して、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。Ｘ
−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ−Ａｍｐ寒天培地上に出現し
た耐性菌で、かつＸ−Ｇａｌにより発色していない３つ
の形質転換体について、常法に従い、プラスミドＤＮＡ
を調製した。次に、調製したプラスミドＤＮＡを用い
て、解析を行い、さらに、塩基配列の決定を行った。そ
の結果、約５００ｂｐのＣｈＭ−ＩＩ全コーディング領
域と５’非翻訳領域の配列を有するｃＤＮＡ断片を持つ
組換え体ｐＣＨＭ−２−５を得た。
準じて行った。プライマーとしては、１回目の増幅反応
に用いたプライマーより内側に位置するプライマー、
５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＣＩＴＴＴＴＡＧＡ
−３’（配列表の配列番号：１６、２２ヌクレオチド）
および５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＣＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：１７、２３ヌクレ
オチド）を用いて行った。反応は、９４℃、１分間のイ
ンキュベーションの後、９４℃、３０秒間、６０℃、３
０秒間、６８℃、５分間のインキュベーションを３０サ
イクル行い、最後に７２℃、７分間のインキュベーショ
ンを行って反応を終了した。反応後、反応液の１／１０
を５％ＰＡＧＥにて解析した。次に、約５００ｂｐ付近
に位置するゲル断片から、増幅したｃＤＮＡを回収、精
製し、プラスミドベクターｐＣＲＩＩのクローニング部
位に挿入して、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。Ｘ
−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ−Ａｍｐ寒天培地上に出現し
た耐性菌で、かつＸ−Ｇａｌにより発色していない３つ
の形質転換体について、常法に従い、プラスミドＤＮＡ
を調製した。次に、調製したプラスミドＤＮＡを用い
て、解析を行い、さらに、塩基配列の決定を行った。そ
の結果、約５００ｂｐのＣｈＭ−ＩＩ全コーディング領
域と５’非翻訳領域の配列を有するｃＤＮＡ断片を持つ
組換え体ｐＣＨＭ−２−５を得た。
【００８６】ｐＣＨＭ−２−５の塩基配列を決定した結
果、翻訳開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）の存在を確認する
とともに、ＡＴＧ（Ｍｅｔ）の下流にＣｈＭ−ＩＩ配列
を確認した。ｐＣＨＭ−２−１、ｐＣＨＭ−２−３、ｐ
ＣＨＭ−２−５の配列から、配列表の配列番号１に記載
の塩基配列の解明に成功し、本発明のＣｈＭ−ＩＩ遺伝
子の取得に至った。その結果、シグナルペプチドを含む
ＣｈＭ−ＩＩの全アミノ酸配列は、配列表の配列番号２
に示される配列であることが確認された。
果、翻訳開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）の存在を確認する
とともに、ＡＴＧ（Ｍｅｔ）の下流にＣｈＭ−ＩＩ配列
を確認した。ｐＣＨＭ−２−１、ｐＣＨＭ−２−３、ｐ
ＣＨＭ−２−５の配列から、配列表の配列番号１に記載
の塩基配列の解明に成功し、本発明のＣｈＭ−ＩＩ遺伝
子の取得に至った。その結果、シグナルペプチドを含む
ＣｈＭ−ＩＩの全アミノ酸配列は、配列表の配列番号２
に示される配列であることが確認された。
【００８７】＜２＞組換えＣｈＭ−ＩＩの製造 次に、ＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡを大腸菌で発現させるこ
とにより組換えＣｈＭ−ＩＩの取得を試み、さらに、組
換えＣｈＭ−ＩＩの生物活性を検定した。
とにより組換えＣｈＭ−ＩＩの取得を試み、さらに、組
換えＣｈＭ−ＩＩの生物活性を検定した。
【００８８】（１）ＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡの改変 発現プラスミドベクターｐＰＲＯＥＸ−１（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ社）のプロモーターの下流にＣｈＭ−ＩＩ ｃ
ＤＮＡを挿入するため、プライマー、５’−ＧＧＣＧＣ
ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴ
ＴＧＧＧＣＴ−３’（配列表の配列番号：１８、３６ヌ
クレオチド）および５’−ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡ
ＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＡ−３’（配列表の配列番号：１
９、２４ヌクレオチド）の２つのプライマーを用い、Ｐ
ＣＲ法にて塩基配列の改変を行った。ＣｈＭ−ＩＩ ｃ
ＤＮＡのコーディング領域の全長を有するプラスミド、
ｐＣＨＭ−２−５ ＤＮＡを鋳型に、Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼにて増幅反応を行った。反応は、９４℃、１０
分間のインキュベーションの後、９４℃、１分間、５５
℃、１．５分間、７２℃、２分間のインキュベーション
を３０サイクルと７２℃、７分間のインキュベーション
を行い反応を終了した。
ＢＲＬ社）のプロモーターの下流にＣｈＭ−ＩＩ ｃ
ＤＮＡを挿入するため、プライマー、５’−ＧＧＣＧＣ
ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴ
ＴＧＧＧＣＴ−３’（配列表の配列番号：１８、３６ヌ
クレオチド）および５’−ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡ
ＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＡ−３’（配列表の配列番号：１
９、２４ヌクレオチド）の２つのプライマーを用い、Ｐ
ＣＲ法にて塩基配列の改変を行った。ＣｈＭ−ＩＩ ｃ
ＤＮＡのコーディング領域の全長を有するプラスミド、
ｐＣＨＭ−２−５ ＤＮＡを鋳型に、Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼにて増幅反応を行った。反応は、９４℃、１０
分間のインキュベーションの後、９４℃、１分間、５５
℃、１．５分間、７２℃、２分間のインキュベーション
を３０サイクルと７２℃、７分間のインキュベーション
を行い反応を終了した。
【００８９】次に、改変したｃＤＮＡを常法に従い、プ
ラスミドベクターｐＣＲＩＩのクローニング部位に挿入
した。これをｐＣＲＩＩ−ＣＨＭ−ＩＩと命名した。挿
入したｃＤＮＡの塩基配列を決定し、塩基の置換による
コードされるアミノ酸の変異がないことを確認した後、
制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（宝酒造）でｐＣＲＩ
Ｉ−ＣＨＭ−ＩＩ ＤＮＡを消化して１％ アガロースゲ
ルで電気泳動を行い、改変したｃＤＮＡをアガロースゲ
ルから回収した。次に、回収したｃＤＮＡを、あらかじ
め制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩにて消化した発現プ
ラスミドベクターｐＰＲＯＥＸ−１のクローニング部位
に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この時
用いたプライマー１１には、血液凝固系プロテアーゼ第
１０因子の切断配列が含まれるよう設計した。また、ｐ
ＰＲＯＥＸ−１のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間に挿入し
たＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡは、発現プロモーターの下流
に存在するプラスミドベクター自身の翻訳開始コドンＡ
ＴＧ（Ｍｅｔ）を利用して翻訳されるように設計した。
発現プラスミドベクターｐＰＲＯＥＸ−１は、翻訳開始
コドンの３塩基下流にヒスチジンタグを有しているた
め、発現後にヒスチジンタグを利用して発現蛋白質を精
製しうることが期待される。このようにして、ＣｈＭ−
ＩＩ ｃＤＮＡを発現するプラスミドベクターｐＰＲＯ
ＥＸ−ＣＨＭ−ＩＩを構築した。このようにして構築し
た発現ベクターにより、配列表の配列番号３に記載の組
換え蛋白質が発現されることが期待された。
ラスミドベクターｐＣＲＩＩのクローニング部位に挿入
した。これをｐＣＲＩＩ−ＣＨＭ−ＩＩと命名した。挿
入したｃＤＮＡの塩基配列を決定し、塩基の置換による
コードされるアミノ酸の変異がないことを確認した後、
制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（宝酒造）でｐＣＲＩ
Ｉ−ＣＨＭ−ＩＩ ＤＮＡを消化して１％ アガロースゲ
ルで電気泳動を行い、改変したｃＤＮＡをアガロースゲ
ルから回収した。次に、回収したｃＤＮＡを、あらかじ
め制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩにて消化した発現プ
ラスミドベクターｐＰＲＯＥＸ−１のクローニング部位
に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この時
用いたプライマー１１には、血液凝固系プロテアーゼ第
１０因子の切断配列が含まれるよう設計した。また、ｐ
ＰＲＯＥＸ−１のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間に挿入し
たＣｈＭ−ＩＩ ｃＤＮＡは、発現プロモーターの下流
に存在するプラスミドベクター自身の翻訳開始コドンＡ
ＴＧ（Ｍｅｔ）を利用して翻訳されるように設計した。
発現プラスミドベクターｐＰＲＯＥＸ−１は、翻訳開始
コドンの３塩基下流にヒスチジンタグを有しているた
め、発現後にヒスチジンタグを利用して発現蛋白質を精
製しうることが期待される。このようにして、ＣｈＭ−
ＩＩ ｃＤＮＡを発現するプラスミドベクターｐＰＲＯ
ＥＸ−ＣＨＭ−ＩＩを構築した。このようにして構築し
た発現ベクターにより、配列表の配列番号３に記載の組
換え蛋白質が発現されることが期待された。
【００９０】（２）組換えＣｈＭ−ＩＩの精製 達するまで３７℃で培養した。次に、終濃度１ｍＭにな
るようにＩＰＴＧを添加し発現を誘導した。ＩＰＴＧを
添加した後、培養を４時間継続した。発現を誘導した７
５０ｍｌの菌体を、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心
分離により集菌し、２０ｍｌの結合緩衝液 ［５ｍＭ イ
ミダゾール（和光純薬）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）］に懸濁した。ソ
ニケーションによる菌体破砕、１０，０００×ｇ、１５
分間の遠心分離、２０ｍｌの結合緩衝液への再懸濁を３
回繰り返し、３回目の遠心分離後の沈澱を３５ｍｌの６
Ｍグアニジン塩酸を含む結合緩衝液に溶解し、このうち
２０ｍｌをヒスチジン結合カラム（１×２ｃｍ、Novage
n社）に展開した。
るようにＩＰＴＧを添加し発現を誘導した。ＩＰＴＧを
添加した後、培養を４時間継続した。発現を誘導した７
５０ｍｌの菌体を、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心
分離により集菌し、２０ｍｌの結合緩衝液 ［５ｍＭ イ
ミダゾール（和光純薬）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）］に懸濁した。ソ
ニケーションによる菌体破砕、１０，０００×ｇ、１５
分間の遠心分離、２０ｍｌの結合緩衝液への再懸濁を３
回繰り返し、３回目の遠心分離後の沈澱を３５ｍｌの６
Ｍグアニジン塩酸を含む結合緩衝液に溶解し、このうち
２０ｍｌをヒスチジン結合カラム（１×２ｃｍ、Novage
n社）に展開した。
【００９１】素通り画分、１５ｍｌの６Ｍグアニジン塩
酸を含む結合緩衝液による洗浄画分、６ｍｌの６Ｍグア
ニジン塩酸を含む希釈洗浄緩衝液 ［２０ｍＭ イミダゾ
ール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．９）］による洗浄画分を回収した。次に、イ
ミダゾール濃度のステップワイズ法で溶出を行いイミダ
ゾール濃度６０ｍＭ、０．１ Ｍ、１Ｍで溶出した画分
をそれぞれ２ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌを回収した。最後
に、イミダゾール濃度１Ｍの溶出を再び行い、溶出画分
を２ｍｌ回収した。
酸を含む結合緩衝液による洗浄画分、６ｍｌの６Ｍグア
ニジン塩酸を含む希釈洗浄緩衝液 ［２０ｍＭ イミダゾ
ール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．９）］による洗浄画分を回収した。次に、イ
ミダゾール濃度のステップワイズ法で溶出を行いイミダ
ゾール濃度６０ｍＭ、０．１ Ｍ、１Ｍで溶出した画分
をそれぞれ２ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌを回収した。最後
に、イミダゾール濃度１Ｍの溶出を再び行い、溶出画分
を２ｍｌ回収した。
【００９２】（３）第１０因子によるＣｈＭ−ＩＩから
のヒスチジンタグの切断 ヒスチジン結合カラムクロマトグラフィーで精製した各
標品をＰＤ−１０カラムに展開して脱塩を行った。脱塩
後、各標品より１０μｌを採取し、１５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにて解析し、組換えＣｈＭ−ＩＩの溶出を確認し
た。一方、１Ｍイミダゾール濃度で溶出した画分につい
ては、脱塩を行った後に、蛋白質の定量を行い、総蛋白
質量１０μｇあたり １２μｇの第１０因子（DENNZYME
ApS社）と反応液［０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］ １００μｌ中で３７
℃、２時間反応し、ヒスチジンタグを切断した。反応液
から１０μｌを分取し、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解
析した。泳動後、ゲルをCoomassie Brilliant Blue R
(ＣＢＢ、Sigma社）で染色し、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質
のバンドを確認した。
のヒスチジンタグの切断 ヒスチジン結合カラムクロマトグラフィーで精製した各
標品をＰＤ−１０カラムに展開して脱塩を行った。脱塩
後、各標品より１０μｌを採取し、１５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにて解析し、組換えＣｈＭ−ＩＩの溶出を確認し
た。一方、１Ｍイミダゾール濃度で溶出した画分につい
ては、脱塩を行った後に、蛋白質の定量を行い、総蛋白
質量１０μｇあたり １２μｇの第１０因子（DENNZYME
ApS社）と反応液［０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］ １００μｌ中で３７
℃、２時間反応し、ヒスチジンタグを切断した。反応液
から１０μｌを分取し、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解
析した。泳動後、ゲルをCoomassie Brilliant Blue R
(ＣＢＢ、Sigma社）で染色し、ＣｈＭ−ＩＩタンパク質
のバンドを確認した。
【００９３】（４）組換えＣｈＭ−ＩＩの生物活性 まず、幼若なニュージーランドウサギ（３００−６００
ｇ、 日本チャールズリバー社）の肋軟骨・骨移行部よ
り成長板軟骨を採取し、メスで細切した。次に、この組
織を０．１％エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ和光純薬）を含むカルシウムイオンやマグネシウ
ムイオンを含まない平衡塩緩衝液（ＣＭＦ）中、３７℃
で２０分間インキュベーションした。その後、組織の１
０倍容量の０．２％トリプシン（Difco Laboratolies
社）を含むＣＭＦ中で１時間処理した。ＣＭＦで組織を
洗浄した後、１０倍容量の０．２％コラゲナーゼ（Sigm
a社）を含むＣＭＦ中で３７℃、２時間３０分間、撹拌
して組織を分散した。分離した細胞を１２０μｍ孔径の
ナイロンフィルター（ＮＢＣ工業）でふるいにかけ、分
離された細胞を遠心分離により回収した。回収した細胞
を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ社）を含む
Ｅａｇｌｅ最少基本培地（ＭＥＭ）で３回洗浄後、１型
コラーゲン溶液（５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ３．０；高研）
にてコートした直径６ｍｍの９６穴マルチウェルプレー
ト（Nunc社）に１００００細胞／ｍｌとなるよう播種し
て、１０％ＦＢＳ、３２Ｕ／ｍｌのペニシリン (明治製
菓)、４０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Sigma社）
を含む、Ｆ−１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌ
ｅ培地（ＤＭＥＭ）の１：１混合培地中で（ＦＡＤ培
地、Flow Laboratories社)３７℃、５％ 炭酸ガス濃度
を含む気相下にて培養した。培地交換は１日おきに行
い、ウェルあたり１００μｌの培地を用いた。
ｇ、 日本チャールズリバー社）の肋軟骨・骨移行部よ
り成長板軟骨を採取し、メスで細切した。次に、この組
織を０．１％エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ和光純薬）を含むカルシウムイオンやマグネシウ
ムイオンを含まない平衡塩緩衝液（ＣＭＦ）中、３７℃
で２０分間インキュベーションした。その後、組織の１
０倍容量の０．２％トリプシン（Difco Laboratolies
社）を含むＣＭＦ中で１時間処理した。ＣＭＦで組織を
洗浄した後、１０倍容量の０．２％コラゲナーゼ（Sigm
a社）を含むＣＭＦ中で３７℃、２時間３０分間、撹拌
して組織を分散した。分離した細胞を１２０μｍ孔径の
ナイロンフィルター（ＮＢＣ工業）でふるいにかけ、分
離された細胞を遠心分離により回収した。回収した細胞
を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ社）を含む
Ｅａｇｌｅ最少基本培地（ＭＥＭ）で３回洗浄後、１型
コラーゲン溶液（５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ３．０；高研）
にてコートした直径６ｍｍの９６穴マルチウェルプレー
ト（Nunc社）に１００００細胞／ｍｌとなるよう播種し
て、１０％ＦＢＳ、３２Ｕ／ｍｌのペニシリン (明治製
菓)、４０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Sigma社）
を含む、Ｆ−１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌ
ｅ培地（ＤＭＥＭ）の１：１混合培地中で（ＦＡＤ培
地、Flow Laboratories社)３７℃、５％ 炭酸ガス濃度
を含む気相下にて培養した。培地交換は１日おきに行
い、ウェルあたり１００μｌの培地を用いた。
【００９４】培養軟骨細胞のＤＮＡ合成は細胞の酸不溶
画分への［3Ｈ］チミジン（Amersham社）の取り込みを
指標として測定した。すなわち、上記細胞が９６穴培養
プレート中でコンフルエントに達した後、細胞を０．３
％ＦＢＳを含むＦＡＤ培地に交換し、３７℃で２４時間
培養した。次に、測定する試料（上記（３）項で得られ
た組換えＣｈＭ−ＩＩ）と０．３％ＦＢＳを含むＦＡＤ
培地に交換しさらに２２時間培養した。この場合ＦＧＦ
−２を０．４ｎｇ／ｍｌの濃度で添加、非添加の両方を
検討した。さらに１０μlの［3Ｈ］チミジン（１３０μ
Ｃｉ／ｍｌ）を加え、４時間培養した後、細胞を氷冷し
たＰＢＳ（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、５％ トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ和光純薬）で２回、エタノール／エーテ
ル（３／１、Ｖ／Ｖ）で２回洗浄して遊離の放射活性を
除去した。さらに細胞層を０．１Ｎ水酸化ナトリウムに
溶解して回収し、これを６Ｎ塩酸で中和した後、ＤＮＡ
に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウン
ター（LKB-Wallac 1215 CompuGamma、LKB-Wallac社）で
測定した。その結果、組換えＣｈＭ−ＩＩが軟骨細胞を
増殖させる活性を有することが示された。
画分への［3Ｈ］チミジン（Amersham社）の取り込みを
指標として測定した。すなわち、上記細胞が９６穴培養
プレート中でコンフルエントに達した後、細胞を０．３
％ＦＢＳを含むＦＡＤ培地に交換し、３７℃で２４時間
培養した。次に、測定する試料（上記（３）項で得られ
た組換えＣｈＭ−ＩＩ）と０．３％ＦＢＳを含むＦＡＤ
培地に交換しさらに２２時間培養した。この場合ＦＧＦ
−２を０．４ｎｇ／ｍｌの濃度で添加、非添加の両方を
検討した。さらに１０μlの［3Ｈ］チミジン（１３０μ
Ｃｉ／ｍｌ）を加え、４時間培養した後、細胞を氷冷し
たＰＢＳ（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、５％ トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ和光純薬）で２回、エタノール／エーテ
ル（３／１、Ｖ／Ｖ）で２回洗浄して遊離の放射活性を
除去した。さらに細胞層を０．１Ｎ水酸化ナトリウムに
溶解して回収し、これを６Ｎ塩酸で中和した後、ＤＮＡ
に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウン
ター（LKB-Wallac 1215 CompuGamma、LKB-Wallac社）で
測定した。その結果、組換えＣｈＭ−ＩＩが軟骨細胞を
増殖させる活性を有することが示された。
【００９５】
【発明の効果】本発明のＣｈＭ−ＩＩ遺伝子は新規な遺
伝子であり、それを用いることにより組換えＣｈＭ−Ｉ
Ｉを安定に供給することができる。ＣｈＭ−ＩＩは、軟
骨細胞を増殖させる活性、分化機能を促進する活性を有
することから、医薬品としての利用が期待される。
伝子であり、それを用いることにより組換えＣｈＭ−Ｉ
Ｉを安定に供給することができる。ＣｈＭ−ＩＩは、軟
骨細胞を増殖させる活性、分化機能を促進する活性を有
することから、医薬品としての利用が期待される。
【００９６】
配列番号：１ 配列の長さ：７１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ウシ（Bos taurus） 直接の起源 クローン名：pCHM-2-1、pCHM-2-3、pCHM-2-5 配列の特徴 特徴を表す記号：mat_peptide 存在位置：187..585 特徴を決定した方法：E 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：133..585 特徴を決定した方法：E 配列の特徴 特徴を表す記号：sig_peptide 存在位置：133..186 特徴を決定した方法：E 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 AAGATATGAG AGATGCAGAA TTCTAAGGTT AAATAGCTAG ATAATACTAA TTCAGACTGG 60 AATATTCTTC ACAGAGTGTG TGGGGGCAAG CCTAAGGGTC AAGGAAGAAG CATTCTAGAG 120 AGACAAAGAC AA ATG TTT TCC ACA GGA ACC CTC CTT CTG GCT GCT CTG 168 Met Phe Ser Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ala Ala Leu -18 -15 -10 ATT TCA CCT GCA CTG GCT GGA CCA TGG GCT ATT ATA TGT GCT GGC AAG 216 Ile Ser Pro Ala Leu Ala Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys -5 1 5 10 TCT TCC AAT GAG ATC AGG ACA TGT GAT GGC CAT GGC TGT GGC CAG TAC 264 Ser Ser Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Gly His Gly Cys Gly Gln Tyr 15 20 25 ACG GCT CAG AGA AAT CAG AAG CTT CAC CAG GGT GTA GAT GTC TTG TGC 312 Thr Ala Gln Arg Asn Gln Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys 30 35 40 TCA GAT GGC TCT ACT GTT TAC GCA CCT TTC ACC GGA AAG ATC ATG GGC 360 Ser Asp Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Lys Ile Met Gly 45 50 55 CAG GAG AAA CCT TAT AAA AAC AAA AAT GCC ATC AAT AAT GGT GTT CGG 408 Gln Glu Lys Pro Tyr Lys Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn Gly Val Arg 60 65 70 ATC TCT GGA GGA GGT TTC TGC ATT AAA ATG TTC TAC ATC AAG CCA ATT 456 Ile Ser Gly Gly Gly Phe Cys Ile Lys Met Phe Tyr Ile Lys Pro Ile 75 80 85 90 AAA TAT AAA GGT TCT ATC AAG AAG GGA GAA AAA CTG GGC ACT CTG CTG 504 Lys Tyr Lys Gly Ser Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly Thr Leu Leu 95 100 105 CCC TTG CAA AAA GTT TAC CCT GGA ATA CAA TCC CAC ATA CAT ATT GAA 552 Pro Leu Gln Lys Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Ile His Ile Glu 110 115 120 AAC TGT GAC TTG AGT GAT CCT ACT GTC TAC CTA TAGATGGAGG ACAAGCCGAT 605 Asn Cys Asp Leu Ser Asp Pro Thr Val Tyr Leu 125 130 CTTCTAAAAA GNCAGCCATC TTCTTCAAAC CTAGGCACCT ATCCTGCTTT TCACAAATTT 665 GAGCTCAAAT AGAAACATGA TGAATGAAAG AGAGTAAAAA AAAAAAAAAA 715
【００９７】配列番号：２ 配列の長さ：１５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Phe Ser Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ile Ser Pro Ala -18 -15 -10 -5 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser Asn Glu 1 5 10 Ile Arg Thr Cys Asp Gly His Gly Cys Gly Gln Tyr Thr Ala Gln Arg 15 20 25 30 Asn Gln Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser 35 40 45 Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Lys Ile Met Gly Gln Glu Lys Pro 50 55 60 Tyr Lys Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn Gly Val Arg Ile Ser Gly Gly 65 70 75 Gly Phe Cys Ile Lys Met Phe Tyr Ile Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly 80 85 90 Ser Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys 95 100 105 110 Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Ile His Ile Glu Asn Cys Asp Leu 115 120 125 Ser Asp Pro Thr Val Tyr Leu 130
【００９８】配列番号：３ 配列の長さ：１６５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Gly His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu 1 5 10 15 Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala His Met Gly Ile Gln Ile Glu Gly Arg 20 25 30 Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser Asn Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Cys Asp Gly His Gly Cys Gly Gln Tyr Thr Ala Gln Arg Asn Gln 50 55 60 Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser Thr Val 65 70 75 80 Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Lys Ile Met Gly Gln Glu Lys Pro Tyr Lys 85 90 95 Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn Gly Val Arg Ile Ser Gly Gly Gly Phe 100 105 110 Cys Ile Lys Met Phe Tyr Ile Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly Ser Ile 115 120 125 Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys Val Tyr 130 135 140 Pro Gly Ile Gln Ser His Ile His Ile Glu Asn Cys Asp Leu Ser Asp 145 150 155 160 Pro Thr Val Tyr Leu 165
【００９９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 CCNTGGGCNA TNATNTGYGC 20
【０１００】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 RTCRCARTTY TCIATRTGIA TRTG 24
【０１０１】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 TGYGAYGGNC AYGGNTGYG 19
【０１０２】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 YTGNATNCCN GGRTANACYT T 21
【０１０３】配列番号：８ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：ＮはＧ、Ａ、ＣまたはＴを表す。 配列 TTCTAGAATT CAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT VN 52
【０１０４】配列番号：９ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT 44
【０１０５】配列番号：１０ 配列の長さ：８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACCTGCCC 8
【０１０６】配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGTGGCCAGT ACACGGC 17
【０１０７】配列番号：１２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27
【０１０８】配列番号：１３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTCTACCCC GGCATCCA 18
【０１０９】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23
【０１１０】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 AGATCGGCTT GTNCCTCCAT 20
【０１１１】配列番号：１６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 AGAAGATGGC TGTCNTTTTA GA 22
【０１１２】配列番号：１７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23
【０１１３】配列番号：１８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCGCTCGAA TTCAAATTGA AGGTGGACCT TGGGCT 36
【０１１４】配列番号：１９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGGATCCT ATAGGTAGA CAGTA 24
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 近藤 淳 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするコンドロモジュリン−ＩＩタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 （１）１種のポリペプチドから構成される水溶性タンパ
ク質であってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約１６ＫＤである。 （２）破骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 （３）軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 （４）軟骨細胞を単独または他の細胞増殖因子共存下に
おいて増殖させる活性を有する。 - 【請求項２】 前記コンドロモジュリン−ＩＩタンパク
質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質であるこ
とを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ
酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
少なくともアミノ酸番号１〜１３３からなるアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記
（１）〜（４）に記載の性質を有するタンパク質。 - 【請求項３】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項２記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配列を有
するＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜５８５からなる塩基配列を有
するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡを含有する組換えベクター。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡを含み、かつ、コンドロモジュリン−ＩＩタンパク
質の一部又は全部を発現し得る形質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地で培養
し、その培養物からコンドロモジュリン−ＩＩタンパク
質の一部または全部を採取することを特徴とする、コン
ドロモジュリン−ＩＩタンパク質の一部または全部を製
造する方法。 - 【請求項７】 請求項１記載のＤＮＡによりコードされ
るコンドロモジュリン−ＩＩタンパク質の一部または全
部を有効成分とする医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8304942A JPH10146189A (ja) | 1996-11-15 | 1996-11-15 | 新規な遺伝子およびそれを用いた組換えタンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8304942A JPH10146189A (ja) | 1996-11-15 | 1996-11-15 | 新規な遺伝子およびそれを用いた組換えタンパク質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10146189A true JPH10146189A (ja) | 1998-06-02 |
Family
ID=17939179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8304942A Pending JPH10146189A (ja) | 1996-11-15 | 1996-11-15 | 新規な遺伝子およびそれを用いた組換えタンパク質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10146189A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000037093A1 (fr) * | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Japan As Represented By Secretary Of National Institute Of Infectious Diseases | Inhibiteur de resorption osseuse |
-
1996
- 1996-11-15 JP JP8304942A patent/JPH10146189A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000037093A1 (fr) * | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Japan As Represented By Secretary Of National Institute Of Infectious Diseases | Inhibiteur de resorption osseuse |
| US6723696B1 (en) | 1998-12-22 | 2004-04-20 | Japan As Represented By Secretary Of National Institute Of Infectious Diseases | Bone resorption inhibitors |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040824 |
|
| A02 | Decision of refusal |
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