JPH04154799A - 蛋白質、ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は骨形成蛋白質（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｐ［ｒｏｔｅｉｎ、　Ｂ　Ｍ　Ｐ　）に類似
したアフリカッメガエルＢＭＰ類をコードするＤＮＡを
含有するＤＮＡ、アフリカッメガエルＢＭＰ類の前駆体
蛋白質（前［杯体ポリペプチドともいう）および成熟蛋
白質（成熟ポリペプチドともいう）、該前駆体蛋白質と
成熟蛋白質の製造方法、および上記蛋白質の用途に関す
る。本明細書において、前駆体蛋白質とは、成熟ペプチ
ドアフリカッメガエルＢＭＰ類のアミノ酸配列を持ち、
かつそのＮ末端側、Ｃ末端側またはその両方にアフリカ
ッメガエルＢＭＰ類ＤＮ［Ａによってコードされるアミ
ノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白質をさす。

灸来豊五批 骨形成作用（ＢＭＰ作用）を有するｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ　　（
Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ｂｅｔａ、　Ｔ　Ｇ　Ｆ　−β）は細胞
増殖の調節をしているだけでなく、細胞の分化の調節な
ど多様な生理活性を持っていることが最近明らかにされ
つつある。特にＴＧＦ−βの骨形成を促進する作用は注
目されており、その強力な軟骨・骨誘導作用を生がして
、骨折あるいは骨粗しよう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉ
ｓ）の治療にＴＧＦを用いようとする試みがなされてい
る（Ｎｏｄａ、　Ｍ。

らジャーナルオブエンドクリノロジ−（Ｊ、　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、　１２４：２９９１−２９９４
，１９８９　；　Ｊｏｙｃｅ、　Ｍ。

Ｅ、ら、ジャーナルオブボーン　ミネラルリサーチ（Ｊ
、　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎａｒａｌ　Ｒｅｓ、）、　４：Ｓ
−２５９，１９８９；　５ｅｙｅｄｉｎ、　Ｓ、　Ｍ、
ら、ジャーナルバイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２８１：５６９３−５６９５
゜１９８６）。しかしながら、ごく最近、骨や軟骨の形
成を促進する因子として互いに分子構造の異なる４種の
骨形成蛋白質（Ｂ　Ｍ　Ｐ　）が同定された。この４種
のヒトＢＭＰ−１，ヒトＢＭＰ−２Ａ、ヒトＢＭＰ−２
Ｂ、ヒトＢＭＰ−３のうちヒトＢＭＰ−２Ａ、ヒトＢＭ
Ｐ−２ＢおよびヒトＢＭＰ−３はＴＧＦ−βと構造がよ
く似ているものの新規なペプチドであり、またこのもの
は動物の皮下あるいは筋肉内に移植すると軟骨と骨の形
成を誘導することが報告されている（Ｊ、　Ｍ、　Ｗｏ
ｚｎｅｙら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　Ｖｏ
ｌ、２４２，１５２８−１５３４，１９８９〕。

発明が解　しようとする課 これらＢＭＰ作用を有する上記ペプチドが局在している
と考えられる骨あるいは該ペプチドを産生じていると思
われるヒト骨肉腫細胞（Ｕ２−Ｏ８）からのペプチドの
単離、精製といった方法は複雑で、また目的とするペプ
チドも少量しか得られないという問題があり、また遺伝
子組み換え技術によるものはヒトに関してのみ成功した
にすぎず、その研究の途についた所というのが現状であ
る。

課　を解　するための手 本発明者らはＢＭＰ作用を有する同様のペプチドを、ア
フリカッメガエルからも採取し、しかもそれを遺伝子組
み換え技術によって製造することができれば、今後の研
究、治療に多大な効果を奏することができると考え、研
究を重ねた結果、次のような知見を得、本発明に到達し
たものである。

即ち、本発明者らは同じ＜ＴＧＦ−βファミリーに属す
るラットインヒビンβＡ鎖の相補ＤＮＡをプローブとし
てアフリカッメガエルのＤＮＡライブラリーよりはじめ
てＢＭＰ−２ＡをコードするＤＮＡおよびそれに関連す
るＤＮＡ　（アフリカッメガエルＢＭＰ類）を５種、続
いて３種のｃＤＮＡ、合計８種をクローニングすること
に成功した。さらにＤＮＡの一部の塩基を同定し、アフ
リカッメガエルＢＭＰ類（Ｂ９．Ｍ３．Ｃ４，Ａ４゜Ａ
５．Ｘｂｒ２２．Ｘｂｒ２３．Ｘｂｒ４１と呼ぶ）のア
ミノ酸配列〔各々、第３図の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（■
）、（ＩＶ）もしくは（Ｖ）、第４図の式（ＶＩ）、（
■）、（■）を参照されたい〕を明らかにし、これらを
遺伝子組み換え技術によって大量に生産する道を拓くこ
とに成功したものである。

本発明は（１）アフリカッメガエルＢＭＰ類、（２）ア
フリカッメガエルＢＭＰ類をコードするＤＮＡを含有す
るＤＮＡ、（３）アフリカッメガエルＢＭＰ類をコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質転換体、お
よび（４）上記（３）の形質転換体の培養、培養物中へ
の蛋白質の生産蓄積、採取を包含するアフリカッメガエ
ルＢＭＰ類の製造方法に関するものである。

本発明の、アフリカッメガエルＢＭＰ類の内の１つであ
るＣ４の、ＴＧＦ−βに相当する９８個または１１４個
のペプチドたる成熟アフリカッメガエルＢＭＰは式（Ｉ
ＩＩ）の６〜１１９番目または２２〜１１９番目のアミ
ノ酸配列で表わされるものであり、分子量は二量体を形
成した場合、糖鎖を除くと約２５゜０００と計算された
。

このものはＷｏｚｎｅｙらの報告したアミノ酸配列と、
分子当り３個なレル４個のアミノ酸の違し）がみられる
。

第３図には本発明で得られた５種の新規なアフリカッメ
ガエルＢＭＰ類のアミノ酸配列を、ＢＭＰ作用を有する
他の既知の蛋白質のアミノ酸配列と比較して示し、βＡ
を基準としてβＡと同じアミノ酸については「、」で示
し、βＡと異なるアミノ酸部分を一文字表式で表示して
いる。第３図におけるＣ０Ｎ５ＥＮＳＵＳは第３図に挙
げたＢＭＰ作用蛋白質の全てに共通するアミノ酸を示す
もので、このＣ０Ｎ５ＥＮＳＵＳを設けたことから、式
中に欠落部分「−」を設けることとなった。したがって
、前駆体および成熟蛋白質部分を表わす番号は、この欠
落部は除外して数えられている。

第４図には更に続いて本発明者が見出した３種の新規な
アフリカッメガエルＢＭＰ類のアミノ酸配列を示してい
る。

またＤＮＡ配列については、本発明のアフリカッメガエ
ルＢＭＰ類をコードするＤＮＡは第２図に示す式（１）
〜（８）（各々がＢ９．Ｍ３．Ｃ４、Ａ４．Ａ５．Ｘｂ
　ｒ２２．Ｘｂ　ｒ２３．Ｘｂｒ４１に相当）の塩基配
列を含有するものであるかあるいはその一部である。Ｗ
ｏｚｎｅｙらはアミノ酸配列は報告しているものの、塩
基配列は明らかにしていない。

成熟ＢＭＰに関する部分〔第３図に示す式（１）の１５
〜１３０番目のアミノ酸配列、式（■）の１４〜１２７
番目のアミノ酸配列、式（ＩＩＩ）の６〜１１９番目ま
たは２２〜１１９番目のアミノ酸配列、式（ＩＶ）の６
〜６３番目のアミノ酸配列、式（Ｖ）の６〜６５番目の
アミノ酸配列、第４図に示す式（ＶＩ）の２８２〜３９
８番目または２９８〜３９８番目のアミノ酸配列、式（
■）の２８８〜４０１番目または３０４〜４０１番目の
アミノ酸配列、もしくは式（ＶＩＩ）の３２８〜４２６
番目のアミノ酸配列に当る〕についてもＴＧＦ−βのＤ
ＮＡとは異なっており、本発明のＤＮＡは新規なもので
ある。

本発明のＢＭＰ成熟ペプチドをコードするＤＮＡとして
は、ＢＭＰの成熟ペプチドのアミノ酸配列をコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよいが、たとえば式（１）〜（８）の塩基配列を含有
するＤＮＡあるいはその一部のＤＮＡであることが好ま
しい。

式（１）〜（８）の塩基配列は本発明で得られたアフリ
カッメガエルＢＭＰ類ＤＮＡ配列であり、式（１）〜（
ＶＩＩ）のアフリカッメガエルＢＭＰ類アミノ酸をコー
ドする塩基配列の一例としては式（１）の６９３〜１０
４０番目、２式（２）の１３４〜４７５番目、式（３）
の４３５〜７２８番目、式（４）の１８３〜３５６番目
、式（５）の１４９〜３２８番目、式（６）の２４９〜
１４４２番目１式（７）の１０４〜１３０６番目、式（
８）の８６〜１３６３番目で表わされるものが挙げられ
る６ 本発明方法におけるＢＭＰ類をコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ
）ＢＭＰ類産生産生細胞メツセンジャーＲＮＡ　（ｍ、
ＲＮＡ）を分離し、（ｉｉ）該ｍＲＮＡから単鎖の相補
ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し
、（ｉｉｉ）該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミド
に組み込み、（ｉｖ）得られた組み換えファージまたは
プラスミドで宿主を形質転換し、（Ｖ）得られた形質転
換体を培養後、形質転換体から適当な方法、例えばＢＭ
Ｐの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、あるいは抗ＢＭＰ抗体を用いたイム
ノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファー
ジあるいはプラスミドを単離し、（ｖｉ）その組み換え
ＤＮＡから目的とするクローン化Ｄ　Ｎ　Ａを切り出し
、（軸）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベク
ター中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製
造することができる。

ＢＭＰをコードするｍＲＮＡは、種々のＢＭＰ産生細胞
、例えばＲＯ３細胞などから得ることができる。

ＢＭＰ産生細胞からＲＮＡを調製する方法としては、グ
アニジンチオシアネート法〔（ジエー・エム・チルブラ
イン（Ｊ、Ｍ、、Ｃｈｉｒｇ讐ｉｎ）ら、バイオケミス
トリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８，５２９
４（１９７９））などが挙げられる。

このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵
素を用いて、例えば岡山（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ）らの方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）　２゜１６１（１９８２）および同誌３　
２８０（１９８３））に従いｃＤＮＡを合成し、得られ
たｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のｐＢ　Ｒ３２２（ジーン（ｇｅｎｅ）　、２．
９５（１９７７））、ｐＢ　Ｒ３２５Ｃジーン、４．１
２１　（１９７ｇ））　、ｐＵ　Ｃ１２〔ジーン、１−
、２５９（１９８２））　、ｐＵ　Ｃ１３［ジーン、月
月２５９（１９８２））、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ（
バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーヨン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ。

ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）　、旦２６７８（１９８３）
）などが挙げられるが、その他のものであっても、宿主
内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用いるこ
とができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクター
としては、たとえばλｇｔｌｌ（ヤング及びデーヴイス
（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓｗ　Ｒ，ｙ
）プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー（
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、
８０．１１９４（１９８３））などが挙げられるが、そ
の他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば
用いることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー
・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載の方法
などが挙げられる。またファージベクターにｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａを組み込む方法としては、たとえばヒューン（Ｈｙ
ｕｎｈ＋Ｔ、Ｖ、）らの方法〔デイ−・エフ・ニークロ
ーニング、アブラフティカルアプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ）よ、４９（１９８５）３などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。

上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２Ｄ
　Ｈ１（プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、）６０，１６０（１９６８））、Ｍ２Ｏ３（ヌクレ
イツク・アシッズ・リサーチ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９Ｌ３０９（１９８１）
）、ＪＡ２２１（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ））、１２０５１７（１９７８））
、　ＨＢｌｏｌ［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー酊ユ４５９　（１９６９））　、　Ｃ６００
Ｃジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、土４４０
（１９５４））などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ　Ｉ　
１１４（ジーン。

２４．２５５（１９８３））、２０７−２１（ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ％８７（１９８４））など
が挙げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
ばティー・マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
。

−Ｉ−Ｌ／キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２４９頁（１９８２
）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウム
クロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる
。

またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増
殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて
導入することができる。

アフリカッメガエルＢＭＰ類ｃＤＮＡを含有するアフリ
カッメガエル・ｃＤＮＡライブラリーは上記の方法など
で得ることが出来るが、市販品として購入することも可
能であり、例えばアフリカッメガエルのｃＤＮＡライブ
ラリーはクローンチックラボラトリーズ（Ｃ１ｏｎｔｅ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、米国）
から入手することができる。

アフリカッメガエル・ＤＮＡライブラリーからアフリカ
ッメガエル・ＢＭＰ類ＤＮＡをクローニングする方法と
しては、例えばファージベクターλｃｈａｒｏｎ２８Ａ
とラットインヒビン（アクティビン）βＡｃＤＮＡをプ
ローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション法
〔ティー・マニアティス（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング（
Ｍ。１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）　、　
（１９８２））などが挙げられる。

このようにしてクローン化されたアフリカッメガエル・
ＢＭＰ類ＤＮＡは必要があればプラスミド、例えばｐＢ
Ｒ３２２，ｐＵｃ１２．　ｐＵｃ１３．　ｐＵｃ１８．
　ｐＵｃ１９゜ｐＵｃ１１８．ｐＵｃ１１９などにサブ
クローニングしてアフリカッメガエル・ＢＭＰ類ＤＮＡ
を得ることができる。

このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法［Ｍａｘａｍ、　Ａ、阿、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ
、　ｗ、、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・ニ
ス・ニー（ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７４，５６０（１９７７））あ
るいはジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９３０９（１９８１））に
よって決定し、既知のアミノ酸配列との比較からアフリ
カッメガエル・ＢＭＰ類ＤＮＡの存在を確認する。

以上のようにして、アフリカッメガエル・ＢＭＰ類をコ
ードするＤＮＡ　（アフリカッメガエル・ＢＭＰ類ＤＮ
Ａ）（式１〜８）が得られる。

後述の実施例１で得られたアフリカッメガエル・ＢＭＰ
類をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの制限酵素断片地図
を第１図に示す。またジデオキシ法で決定したＤＮＡの
塩基配列式１〜８を第２図に、その塩基配列から判明し
たアミノ酸配列式Ｉ〜■、および式■〜■を第３図およ
び第４図に示す。

上記のようにしてクローン化されたアフリカッメガエル
・ＢＭＰ類をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、
または所望により制限酵素で消化して使用することが出
来る。

クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。

該ＤＮＡはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成りＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。さらに該
ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２、ｐＵｃ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＴ
Ｐ５．ｐｃ１９ｊ）、酵母由来プラスミド（例、ｐｓＨ
１９，ｐｓＨ１５）。

あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
、ｔｒｐプロモーター、Ｑａｃプロモーター、ｒｅｃＡ
プロモーター、λＰＬプロモーター、ρｐｐプロモータ
ーなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、５ＰＯＬ
プロモーター、ＳＰ○２プロモーター、ｐｅｎＰプロモ
ーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロモ
ーター。

ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロ
モーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア
属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまたはλＰＬ
プロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが
それぞれ利用できる。

なお、発現にエンハンサ−の利用も効果的である。

このようにして構築されたアフリカッメガエルＢＭＰ類
の成熟ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツカロマイセスセレビシ
ェ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）　Ａ　Ｈ２２。

ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄなどが
挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖｅ
ｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。

マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、６９．２１１０（１９７２）やジ
ーン、　１７．１０７（１９１１１２）などに記載の方
法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（阿ｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
　、１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７
５，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわ
れる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、アフリカッメガエルＢＭＰ類成熟ペプ
チドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質
転換された形質転換体が得られる。

宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉。

ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープニリカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシ
ウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど
が挙げられる。

また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。

培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）　、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。

４３１−４３３．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ　１９７
２）が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリ
ル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら、「プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ）７７．４５０５（１９８０））が挙げられる
。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養
は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要
に応じて通気や攪拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１２２゜５０
１　（１９５２））　、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地〔ヴイロ
ロジー（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）、８，３９６（１９５９
））　、　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１９
９，５１９（１９６７））、　１９９培地〔プロシージ
ング・オブ・ザ・ソサイエテイ・フォー・ザ・バイオロ
ジカル・メデイスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　
ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１　（１９５０）
３などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好まし
い。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加える。

上記培養物からアフリカッメガエルＢＭＰ類の成熟ペプ
チドを分離精製するには、例えば下記の方法により行な
うことができる。

アフリカッメガエルＢＭＰ類の成熟ペプチドを培養菌体
あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の
方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に
懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解な
どによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
やろ過によりＢＭＰの成熟ペプチドの粗抽出液を得る方
法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニ
ジンなどのたんばく変性剤や、トリトンＸ−１００など
の界面活性剤が含まれていてもよい。

培養液中にＢＭＰ類前鮭体たんばくや成熟ペプチドが分
泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で
菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。こ
のようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含
まれるＢＭＰ類前駐体たんばくや成熟ペプチドは、自体
公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことが
できる。

これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法。

限外ろ過法、ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法１等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙
げられる。またＢＭＰ相補ＤＮＡあるいはＤＮＡを大腸
菌由来ＤＮＡ　　１ａｃＺと融合させ発現させた融合蛋
白質に対する抗体を免疫アフィニティカラムとして使用
する方法も考えられる。

本発明のＢＭＰ類発現に当っては、Ｖａｎｇら、プロシ
ージンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　　復１７．２２２０−２２２４．１９
９０に記載されているような、ＣＨＯ細胞に遺伝子を導
入し、ＢＭＰ類を大量に産生させるような方法が具体的
に挙げられる。

かくして生成するＢＭＰ類前馳体たんばくや成熟ペプチ
ドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどに
より測定することができる。また生成物に骨形成活性が
ある場合は、該活性を指標にして測定することもできる
。

作月二（果 本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、大量のＢＭＰ類成熟ペプチドを産生せしめる
ことができ、ＢＭＰ類成熟ペプチド生産を有利に導くこ
とができる。

ここに製造されるＢＭＰ類成熟ペプチドは軟骨基質の主
要成分たるプロテオグリカンの合成を促進することが判
明したので、生体、特に人間の骨・軟骨形成反応のメカ
ニズムの解析や、骨折、骨そしよう症治療剤としても利
用することができる。

該蛋白質をこのような治療剤として用いる場合、哺乳動
物に対してその有効量が用いられ、この有効量は軟骨細
胞におけるプロテオグリカンの合成を促進するために必
要とされる量の蛋白質である。

−船釣には０．００１〜３５μｇ／体重ｋｇの範囲で用
いられるが、この厳密な量については当業者によって適
宜法められるものである。

この蛋白質を治療剤として用いる場合には、注意深く精
製を行ない細菌や発熱物質が存在しないように注意しな
ければならない。

ＢＭＰ類を骨折や骨そしよう症などの治療薬として用い
る場合、そのままあるいは薬学的に許容される担体、賦
形剤、希釈剤と混合したのち、液剤、注射剤、軟膏剤な
どの剤型で非経口的に投与することができる。投与形態
は■患部に近い皮膚表面に投与する、■患部に注入する
、■切開後、患部に直接投与する、などが適当である。

骨折の治療におけるＢＭＰ類の投与量は成人の場合、１
回あたり０．１〜２，０００μｇ、好ましくは２０〜４
００μｇで１日１回の投与が適当である。骨そしよう症
の治療における投与量は成人の場合、１回あたり０．１
〜２００μｇで１日１回の投与が適当である。投与日数
は通常１〜３０日である。治療剤の濃度は液剤では０．
００１〜０．２％、注射剤では０．００１〜０．２％、
軟膏剤ではＱ、００１〜０．２％が適当である。

以上、ＢＭＰ類をコードするＤＮＡのクローニング、Ｂ
ＭＰ類成熟ペプチドの発現ベクターの作製と、それらに
よる形質転換体の製造、該形質転換体を用いたＢＭＰ類
成熟ペプチドの製造及びその有用性等について詳細に述
べた。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍ
１ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅ
ｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。また
アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メツセンジャーリポ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ　ニゲリシン ＡｌａまたはＡ　：アラニン ＶａｌまたはＶ　：バリン ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン １１ｅまたは工　：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ　：セリン ＴｈｒまたはＴ　：スレオニン ＣｙｓまたはＣニジスティン ＭｅｔまたはＭ　：メチオニン ＧｌｕまたはＥ　：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ　：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ　：リジン Ａ　ｒ　ｇまたはＲ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ　：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
　：チロシン ＴｒｐまたはＷ　ニトリブトファン ＰｒｏまたはＰ　ニブロリン ＡｓｎまたはＮ　：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ　：グルタミン なお、本発明のアフリカッメガエルＢＭＰ類成熟ペプチ
ドにおいては、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、
除去、その他のアミノ酸への置換など）されていてもよ
い。

夫旌叢 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＸａｒ３　（ｍｌ−ド
する蛋白はＭ３）　、　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ　ＨＢ　１０１／ｐＸａｒ４（コードする蛋白は
Ａ　４　）　、　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＨＢ１０１／ｐＸａ　ｒ５　（コードする蛋白はＡ５
）　、　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　
１０１／ｐＸａｒ９（コードする蛋白はＢ　９　）　、
　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／
ｐＸａ　ｒ１４　（ｍｌ−ドする蛋白はＣ４）は平成１
年８月２８日から財団法人発酵研究所（１′Ｆ○）に各
々受託番号ＩＦＯ１４９２８、ＩＦＯ１４９２９，ＩＦ
Ｏ１４９３０、ＩＦＯ１４９３１，ＩＦＯ１４９３２と
して寄託され、また本形質転換体は平成１年９月２日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ
）にブダペスト条約に基き各々受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ
−２５７８，ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５７９，ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２５８０，ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５８１，ＦＥＲＭ　
ＢＰ−２５８２として寄託され保管されている。

後述の実施例２で得ら九た形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＸｂ　ｒ２２　（コ
ードする蛋白はアフリカッメガエルＥ３ＭＰ−２Ａ）、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＸ
ｂ　ｒ２３　（：ｆ−ドする蛋白はアフリカッメガエル
ＢＭＰ−２Ｂ）、　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　ＨＢ　１０１／　ｐＸｂ　ｒ４１（コードする蛋白
はアフリカッメガエルＶｇｒ−１）は平成２年８月１０
日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に各々受託番号Ｉ
Ｆ○　１５０８０゜ＩＦＯ１５０８１，ＩＦＯ１５０８
２として寄託され、また本形質転換体は平成２年８月１
６日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（
ＦＲ４）にブダペスト条約に基き各々受託番号ＦＥＲＭ
　ＢＰ−３０６６、ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０６５、ＦＥＲ
Ｍ　Ｂ、Ｐ−３０６７として寄託され保管されている。

実施例１　アフリカッメガエル肝臓由来ＤＮＡライブラ
リーの作成 １）ツメガエル染色体ＤＮＡの調製とライブラリーの作
成 肝臓１ｇを液体窒素中で粉砕し、パウダー状にする。緩
衝液（１）　　（１００μｇ　／　ｍ　Ｑプロティナー
ゼに、０．５％５ａｒｋｏｓｉｌ、　０．５Ｍ　Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　（ｐ　Ｈ８゜０）〕を１０ｍΩ加え、５０℃
で２時間インキュベートする。ＤＮＡサンプルをフェノ
ール処理した後。

緩衝液（２）（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣ
Ｑ　、　５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｎ　　（ｐ　
Ｈ８，０）　）にて透析することによってフェノールを
除く。終濃度１００μｇ／ｍＱとなるようにＲＮａｓｅ
を加え３７°Ｃで３時間インキュベート後、フェノール
処理を２回くり返す。水層を緩衝液（３）［１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣＲ（ｐＨ８，０）
）に対して透析する。約１■の肝臓由来の染色体ＤＮＡ
を得る。このＤＮＡのうち１０μｇを用い制限酵素Ｓ　
ａ　ｕ　３　Ａ　Ｉにて部分的に切断せしめ、Ｃ５ＣＱ
による平衡密度勾配遠心を行い、その長さが１０〜２０
Ｋｂの両分を選びベクターとなるファージｃｈａｒｏｎ
２８Ｄ　Ｎ　ＡをＢａｍＨＩで切断したものに組み込む
。ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）と呼ばれるこの
過程は１５℃、　１６時間の反応にて行われる。このよ
うにｃｈａｒｏｎ２８ベクターにツメガエル染色体ＤＮ
Ａが組み込まれたものはファージ頭部に収められる（イ
ン・ビトロパッケージング）。この操作は市販のパッケ
ージングキットを用いて行う（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
、Ｇｉｇａｐａｋ　Ｇｏｌｄ）　＊　この組み換え体フ
ァージは大腸菌Ｌ　Ｅ　３９２に感染させることにより
増幅される具体的にはファージを過剰量のＬＥ３９２と
混合し３７℃で１０分間吸着させた後ＮＺＹＭ培地（１
３％ａｇａｒを含む）上にブレーティングし、−晩培養
する。

２）スクリーニング シャーレ中に出来たプラークの数からファージ・クロー
ン総数は約１００万と概算される。プローブ（ハイブリ
ダイゼーションにより目的とする遺伝子を検出するため
に用いられるＤＮＡ）としてラットアクティビンβＡｃ
ＤＮＡ［モレキュラーエンドクリノロジー（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）。

上、　３８８−３９６．１９８７）をランダムプライム
法にて３２ＰＩｌｌＩ諏したものが用いられる。シャー
レよりニトロセルロース膜に転写されたプラークはアル
カル処理（０，ＩＮ　Ｎ　ａ　ＯＨ，０，６Ｍ　Ｎ　ａ
　ＣＱ中に３０秒間浸す）を経て、中性に戻される（０
．２ＭＴｒｉｓ　ｔ　０−６Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱｔ　ｐ　
Ｈ７−４）　ｅ上記処理後のフィルターを真空恒温槽で
８０℃、１時間加熱する。加熱後プレハイブリダイゼー
ション液（５０％ホルムアミド、５　ＸＤｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ、　５　Ｘ５ＳＰＥ、０．１
％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＭ熱変性サケ精子ＤＮＡ）中
に浸し、４２℃で４時間インキュベートする。その後、
同ハイブリダイゼーション液とＤＮＡプローブを混合し
た液中で、６０’Ｃで一晩放置される。この操作はプラ
スチック袋中で行なわれる。翌日、袋からニトロセルロ
ース膜を取り出し、２ＸＳＳＣ，０，１％５ＤＳｔ’１
５分、０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳで１５分温度を
段階的に上昇させながら、フィルターのｃｐｍ値が約１
１０００ｃｐになるまで洗浄する。洗浄後ろ紙で洗浄液
を除き、オートラジオグラフィーを行う。フジＸ線フィ
ルムを感光させることによって目的とする遺伝子を含む
プラークを同定する。上記のプラークハイブリダイゼー
ションをくり返すことによって遺伝子をクローン化する
。

なお、２０ＸＳＳＣは０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）、３Ｍ　ＮａＣＱ　；２０ｘＳＳＰＥは０゜
２Ｍリン酸ナトリウム、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、３ＭＮ　
ａ　ＣＱ　　（ｐ　Ｈ７，４）　　：　Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎは１％Ｆｉｃｏｌｌ、　　１
％ポリビニルピロリドン、１％ＢＳＡ　（Ｐｅｎｔａｘ
　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ）である。

３）塩基配列の決定（シーフェンシング）単離された５
つのクローンＡ４．Ａ５．Ｂ９゜Ｃ４，Ｍ３はすべてｐ
ｕｃ１９にサブクローニング（組み換え）された。それ
ぞれプラスミドｐｕｃ１９に組み換える際には、それぞ
れのクローンのプローブによってハイブリダイズするフ
ラグメントを生ずる制限酵素認識部位を利用して組み換
えたが、Ａ４は市販のＳｍａ　ＩサイトにＢｇ１２１１
リンカ−をつけたものを用いた。

塩化ルビジウム法により作製したコンピテントＨＢ　１
０１細胞（大腸菌）に各プラスミドをトランスフオーム
して各形質転換体５種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉＨＢ１０１／ｐＸａｒ３　（コードする蛋白はＭ３）
　、　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１
０１／　ｐＸａｒ４（コードする蛋白はＡ　４　）、　
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／
ｐＸａ　ｒ　５（コードする蛋白はＡ　５）、　　Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　／　ｐ
　Ｘａｒ９（コードする蛋白はＢ　９　）　、　　Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＸａ　ｒ
１４（コードする蛋白はＣ４）を得た。

塩基配列決定のために各クローンのディレーションミュ
ータント（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ）を作成し
、プローブによってハイブリダイズするフラグメントの
中でも最も短いフラグメントを選びｐｕｃ１９から直接
Ｓａｎｇｅｒ法（あるいはｄｉｄｅ。

ｘｙ法）にて塩基配列を決定した。

また塩基配列のアミノ酸への翻訳あるいは相同性の検索
には日本ＳＤＣ社の遺伝子解析用ソフトウェアＧＥＮＥ
ＴＹＸを用いた。

核酸にへ止ぷの桓皿性　上段：％、下段：比べた長さ（
ｂ、ｐ）アミノ　レベルでの相β性 実施例２ アフリカッメガエルＢＭＰ−２Ａをコードしている染色
体ＤＮＡ、Ｘａ　ｒ１４を制限酵素、ＰｓｔＩおよびＨ
ｉｎｄｌｌｌで断片化することによってプローブを調整
し、ツメガエル未受精卵のｃＤＮＡライブラリーをハイ
ブリダイゼーション法によってスクリーニングすること
によって３種類のＣＤＮＡ、Ｘｂ　ｒ２２．Ｘｂ　ｒ２
３．Ｘｂ　ｒ４１を単離した。すでに単離されているツ
メガエルＢＭＰ類の染色体ＤＮＡの構造との比較からＸ
ｂｒ２２はツメガエルＢＭＰ’−２Ａ、Ｘｂ　ｒ２３は
ＢＭＰ−２Ｂ、Ｘｂｒ４１はＬｙｏｎらによって報告さ
れたマウスＶｇｒ−１［プロシージンゲス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪ、Ｓ、Ａ、）　　
８０６．１５３４−４５５８゜１９８９　）と相同性を
持つタンパク質をコードしていることが明らかになった
。

１）アフリカッメガエルＢＭＰ−２Ａプローブの調製 アフリカッメガエル未受精卵のｃＤＮＡライブラリーは
ソーク研究所（Ｃ，Ｋｉｎｔｎｅｒ）より供与を受けた
。このライブラリーはえｇｔｌＯをもとに作成されてお
り、この組み換え体ファージは大腸菌ＮＭ５１４に感染
させることにより増幅される。具体的にはファージを過
剰量のＮＭ５１４と混合し３７℃で１０分間吸着させた
後ＮＺＹＭ培地（１３％ａｇａｒを含む）上にブレーテ
ィングし、−晩培養する。

２）スクリーニング シャーレ中に８来たプラークの数からファージ・クロー
ン総数は約１２０万と概算される。プローブ（ハイブリ
ダイゼーションにより目的とする遺伝子を検出するため
に用いられるＤＮＡ）としてＸａｒ１４を制限酵素、Ｐ
ｓｔｌおよびＨｉ　ｎ　ｄ　ｍで切断化したＤ　Ｎ　Ａ
　（１８５ｂ、ｐ、）をランダムプライム法にて３２Ｐ
標識したものが用いられる。シャーレよりニトロセルロ
ース膜に転写されたプラークはアルカル処理（０，ＩＮ
　Ｎ　ａ　ＯＨ，０，６Ｍ　Ｎ　ａ　ＣΩ中に３０秒間
浸す）を経て、中性に戻される（０゜２Ｍ　Ｔｒ　ｉ　
ｓ、　０．６Ｍ　ＮａＣＱ、　ｐＨ７，４）　、上記処
理後のフィルターを真空恒温槽で８０℃、１時間加熱す
る。加熱後プレハイブリダイゼーシ目ン液（５０％ホル
ムアミド、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉ
。

ｎ、５ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＱ
熱変性サケ精子ＤＮＡ）中に浸し、４２℃で４時間イン
キュベートする。その後、同ハイブリダイゼーション液
とＤＮＡプローブを混合した液中で、６０℃で一晩放置
される。この操作はプラスチック袋中で行なわれる。翌
日、袋からニトロセルロース膜を取り出し、２ＸＳＳＣ
，０，１％ＳＤＳで１５分、０．ＩＸ　Ｓ　Ｓｃ　、　
ｏ、１％ＳＤＳで１５分温度を段階的に上昇させながら
、フィルターのｃｐｍ値が約１１０００ｃｐになるまで
洗浄する。洗浄後ろ紙で洗浄液を除き、オートラジオグ
ラフィーを行う。フジＸ線フィルムを感光させることに
よって目的とする遺伝子を含むプラークを同定する。上
記のプラークハイブリダイゼーションをくり返すことに
よって遺伝子をクローン化する。

なお、２０ＸＳＳＣは０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）、３Ｍ　ＮａＣＱ　；２０ｘＳＳＰＥは０゜
２Ｍリン酸ナトリウム、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、３ＭＮ　
ａ　ＣＱ　　（ｐ　Ｈ７，４）　　；　Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎは１％Ｆｉｃｏｌｌ、　　１
％ポリビニルピロリドン、１％ＢＳＡ（Ｐｅｎｔａｘ　
Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ）である。

３）塩基配列の決定（シーフェンシング）単離された３
つのクローンＸｂ　ｒ２２．Ｘｂ　ｒ２３、Ｘｂｒ４１
はすべてｐｕｃ１９にサブクローニング（組み換え）さ
れた。それぞれプラスミドｐｕｃ１９に組み換える際に
は、それぞれのクローンのプローブによってハイブリダ
イズするフラグメントを生ずる制限酵素認識部位を利用
して組み換えた。

塩化ルビジウム法により作製したコンビテントＨＢＩ○
１細胞（大腸菌）に各プラスミドをトランスフオームし
て各形質転換体３種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
　ＨＢ１０１／ｐＸｂｒ２２　（コードする蛋白はアフ
リカッメガエルＢＭＰ　　２Ａ）　、　　Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ｐＸｂ　ｒ２３　
（コートする蛋白はアフリカッメガエルＢＭＰ−２Ｂ）
。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　／
　ｐ　Ｘ　ｂ　ｒ　４１（コードする蛋白はアフリカッ
メガエルＶ　ｇ　ｒ　−１）を得た。

塩基配列決定のために各クローンのデイレーションミュ
ータント（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｒｎｕｔａｎｔ）を作成
し、プローブによってハイブリダイズするフラグメント
の中でも最も短いフラグメントを選びｐｕｃ１９から直
接Ｓａｎｇｅｒ法（あるいはｄｉｄｅ。

ｘｙ法）にて塩基配列を決定した。

また塩基配列のアミノ酸への翻訳あるいは相同性の検索
には日本ＳＤＣ社の遺伝子解析用ソフトウェアＧＥＮＥ
ＴＹＸを用いた。

各塩基配列を第２図（６）、（７）、（８）にまた各ア
ミノ酸配列を第４図（ＶＩ）、（■）、（■）に示す。

実施例３ アフリカッメガエルＢＭＰ関連遺伝子産物の生物活性に
ついて検討するためＸｂｒ２２．Ｘｂｒ２３、Ｘｂｒ４
１それぞれのｃＤＮＡを動物細胞での発現ベクター、ｐ
　ＣＤ　Ｍ　８　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　ＩＪ。

Ｓ、Ａ、）に挿入し、ＣｏＳ細胞（アフリカミドリザル
腎臓細胞）発現させ培養上清を生物活性測定に用いた。

Ｘｂｒ２２．Ｘｂｒ２３．Ｘｂｒ４１　　ｃＤＮＡはい
ずれも両端をＸｈｏｌリンカ−と連結後、ｐＣＤＭ８の
Ｘｈｏｌ制限酵素切断部位に挿入され、トランスフェク
ション（ＤＮＡの導入）に用いられた。３　Ｘ　１０’
個の細胞を１００ｍｍプラスチック・シャーレに継代培
養後、２４時間目に培地を取り除き１０ｍ１のＴ　Ｂ　
Ｓ　（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）で
１回洗浄する。ＴＢＳで希釈したＤＮＡ溶液（１，５μ
ｇ　　ＤＮＡ）３００μｍと０．１％ＤＥＡＥ−デキス
トラン溶液３００μｍを混合し細胞へ滴下する。

１５分間常温静置後Ｔ　Ｂ　Ｓ　３００μｍで１回洗浄
し、ダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、１０％Ｆ
ＢＳ、ｌ００Ｕ／Ｉｌｌペニシリン、１００ｍｃｇ　／
　ｍｌストレプトマイシン、１１００ｕクロロキンを含
む）で培養する。３時間後、ＴＢＳで２回洗浄し、ＤＭ
ＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０
０ｍｃｇ／ｍｌストレプトマイシン）で培養する。２４
時間後、ＴＢＳで３回洗浄し、ＤＭＥＭ　（１００Ｕ／
ｍ１ペニシリン、１００ｍ　ｃ　ｇ／ｍ　ｌストレプト
マイシン）で４日間培養した後、培地を回収する。回収
した培地を２００Ｏｒ　ｐ　ｍ、５分間遠心して得られ
た上清を培養上清とする。

これらの培養上清をアフリカッメガエルＢＭＰ２−Ａ、
ＢＭＰ−２Ｂ、Ｖｇｒ−１タンパク質を含む試料として
生物活性の検定に用いた。即ち、これら試料を兎軟骨細
胞培養系（Ｋａｔｏ、　Ｙ、ら、エクスペリメンッオブ
リサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ。

）、　１３０ニア３−８１，１９８０　；　Ｋａｔｏ、
　Ｙ、ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、　２６５：　５
９０３−５９０９．　（１９９０）］に添加して、軟骨
基質の主要成分であるプロテオグリカンの合成に及ぼす
影響を検討した。その結果、次表に示すごとく、発現ベ
クターのみをＣＯ８細胞にトランスフェクションした対
照や無処理のＣＯ８細胞培地が、プロテオグリカン合成
に影響しなかったのに対して、本発明で得られた上記３
種蛋白質は、軟骨細胞のプロテオグリカン合成を強く促
進した。

アフリカッメガエルのＢＭＰ−２Ａ、ＢＭＰ−２Ｂ。

およびＶ　ｇ　ｒ　−１の最大活性は、ＴＧＦ−ｂ　ｅ
　ｔａ−１よりも強かった。なおプロテオグリカン合成
はその最終段階であるグリコサミノグリカンへの３５８
−硫酸の取り込みを測定することにより決定した（Ｋａ
ｔｏ、　Ｙ、ら、エクスペリメンツオブリサーチ（Ｅｘ
ｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、　１３０ニア３−８１．
１９８０　；　Ｋａｔｏ、　Ｙ、ら、ジャーナルオブバ
イオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、）、２６５：５９０３−５９０９．（１９９０））
。この結果はアフリカッメガエルおよび他の動物のＢＭ
Ｐ類が軟骨分化を促進することを示している。したがっ
て、骨折治癒促進および各種の軟骨・骨の病気（関節炎
、骨そしよう症など）の治療薬としてのＢＭＰ類の応用
が期待される。

本細胞の種類 ６ＩＩＩｍ直径のプラスチックウェル上に保持されたウ
サギ肋骨軟骨細胞 本標識の種類 ３５Ｓ　１μｃ　ｉ　／１００μｍ培地／ウェル＊培地
種類 ０．３％牛脂児血清を添加した、ＤＭＥＭおよびハムの
Ｆ−１２培地（７）１：１　　；Ｖ／Ｖ）混合物 Ｎｏ、　　添加物　　　　　　　カウント　　　　　平
均±Ｓ、Ｄ、対照に対する％ １　　対照　　　　　　　５１９３　４３２８　４２６
９　　４６９５±　３５１　　１００２　　ｘＢＭＰＺ
Ａ　１５μｍ　　　　　２３６２　２７４９　２７５８
　　２３６２±　１８５　　５６３　　ｘＢＭＰＺＡ　
１／３５μｌ　　　１２１９８１５５０２２１８９１　
１６５３０±４０２３　　３５２４　　ｘＢＭＰＺＡ１
／１０５μｍ　　１０００４　９７３８　８８４８　　
９５３０±　４９４　　２０３５　　ｘＢＭＰ２Ｂ１５
μｌ　　　　　３１７１　２９０６　３２１９　　３０
９９±　１３８　　６６６　　ｘＢＭＰ２Ｂ　１／３５
μｌ　　　１１３１５　９７５０１３１３９　１１４０
１±１３８５　　２４３７　　ｘＢＭＰ２Ｂ１／１０５
μｌ　　１２４２６１３４５７１３３２４　１３０６９
±　４５８　　２７８８　　ｘＶｇｒ−１１５μｍ　　
　５１８８　２８３３４４１６　４１．４６　＝　　９
８０　　８８９　　ｘＶｇｒ−１１／３５μｍ　　７４
８６　８８３４　７２０２　７８４１：　　７１２　　
１６７１０　　ｘＶｇｒ−１１０５μｌ　　　１５２８
６１５６４５１３０３２　１４６５４　：　１１５６　
３１２１１　　　ｐＣＤ阿８５μｌ　　　　　　　　　
　３６０４　　２６９４　　２９２７　　　　３０７５
　　土　　３８６　　　　　６５１２　　ｐＣＤＭ８１
μｌ　　　　　２６３７　４２１９　　　　　３４２８
±　７９１　　７３１３　ＤＮＡ（−）　５μｌ　　　
　３６２５４０５０４７１４　４１３０　＝４４８　　
８８１４　　ＤＮＡ（−）　ｌμｌ　　　　５６９５４
６５７　　　　５１７６±５１９　　１１０ｌ１０１５
Ｄμｌ　　　　　　３６１４　８９６３　３８５０　　
５４７６±２４６８　　１１７１６　　ＤＭＥ１μｌ　
　　　　　４３＆４　３８７４　５７６０　　４６７５
±７９９　　１００１７　　ＴＧＦ−８１３ｎｇ／ｍｌ
　　　　９３８１１２４７４１０９２２１００５８１１
５４６１１１５５　１０９２３±　９９８　　２３３１
８　　Ｉｎｓ、　５μｇ／ｎ１１１９４３１２０４７６
２２７４６２５０６６２７８３５２４９６５　２３４２
０±２８７６　　４９９１９　　Ｉｎｓ、　３ｔｔｇ／
ｍｌ　　　　１３６２０１５３７８１１９８７１１２４
０１２６９９１２６６６　１２９３２±１３１３　　２
７５ｐＣＤＭ８ベクターとしてＰＣＤＭ８を導入した細
胞の培養液 ＤＮＡ（−）細胞と接触しているが、その細胞がＢＭＰ
類をつくっていない培養液 ＤＭＥ　　細胞と接触していない培養液Ｉｎｓ、　　イ
ンシュリン 去ａｔへ ウサギ軟骨細胞を、３ないし４週令の雄ニューシーラン
トラビットの肋骨の成長プレートから前述のようにして
単離した（Ｙ、　Ｋａｔｏら、エクスペリメンタルセル
リサーチ）。該細胞を１０４細胞／６ｎ＋ｍ直径プラス
チック培養ウェルの濃度で１０％の牛脂児血清および抗
生物質を加えた０、１ｍｌのイーグル最少必須培地（Ｍ
ＥＭ）中に植え付けた。

培養液が飽和状態になったとき、この細胞を０．３％の
牛脂児血清を加えた０、１ｍｌのＤＭＥＭおよびハムの
Ｆ−１２培地（１：１混合物）（ＤＦ）中、２４時間予
備的にインキュベートした。この細胞を次いで、種々の
ＣＯ８細胞で調整された工ないし５μｌの培地を添加し
た上記と同じ培地（ＤＦ）０．１ｏ＋１に移した（この
調整培地はＤＭＥＭで希釈もしくは希釈されていないも
ので、最終濃度は１０ないし３０％である）。３時間後
、１μＣｉの３″Ｓ０　、２−を加えた５μｍのＤＭＥ
Ｍを同様に添加し、そしてインキュベーションを更に１
７時間続けた（Ｙ、Ｋａｔｏら、エクスペリメンタルセ
ルリサーチ）。

【図面の簡単な説明】

第１図はアフリカッメガエルＢＭＰ類前能体や成熟ペプ
チドＤＮＡを含むＤＮＡの簡単な制限酵素地図である。 第２図（１）（２）（３）（４）（５）（６）（７）（
８）はアフリカッメガエルＢＭＰ類、Ｂ９、Ｍ３．Ｃ４
，Ａ４．Ａ５．ＢＭＰ−２Ａ、ＢＭＰ−２Ｂ、Ｖｇ　ｒ
−１のＤＮＡの塩基配列を、それから推定されるアミノ
酸配列と共に示し、第３図は第２図（１）〜（５）のＤ
ＮＡより推定されるアフリカッメガエルＢＭＰ類のアミ
ノ酸配列を、他の既知のＢＭＰ作用を有する蛋白質のア
ミノ酸配列と比較して示したものであり、第４図は第２
図（６）〜（８）のＤＮＡより推定されるアフリカッメ
ガエルＢＭＰ類のアミノ酸配列を示した図である。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）アフリカツメガエルＢＭＰ類蛋白質。
2. （２）第３図における式（ I ）の１５〜１３０番目の
   アミノ酸配列、式（II）の１４〜１２７番目のアミノ酸
   配列、式（III）の６〜１１９番目または２２〜１１９
   番目のアミノ酸配列、式（IV）の６〜６３番目のアミノ
   酸配列もしくは式（Ｖ）の６〜６５番目のアミノ酸配列
   、あるいは第４図における式（VI）の２８２〜３９８番
   目または２９８〜３９８番目のアミノ酸配列、式（VII
   ）の２８８〜４０１番目または３０４〜４０１番目のア
   ミノ酸配列、もしくは式（VIII）の３２８〜４２６番目
   のアミノ酸配列で表わされる成熟蛋白質である請求項１
   記載のアフリカツメガエルＢＭＰ類。
3. （３）第３図における式（ I ）、（II）、（III）、（
   IV）もしくは（Ｖ）あるいは第４図における式（VI）、
   （VII）もしくは（VIII）のアミノ酸配列で表わされる
   前駆体蛋白質である請求項１記載のアフリカツメガエル
   ＢＭＰ類蛋白質。
4. （４）アフリカツメガエルＢＭＰ類をコードするＤＮＡ
   を含有するＤＮＡ。
5. （５）アフリカツメガエルＢＭＰ類をコードするＤＮＡ
   が第２図における式（１）、（２）、（３）、（４）、
   （５）、（６）、（７）もしくは（８）の塩基配列もし
   くはその一部を含有する、請求項４記載のＤＮＡ。
6. （６）アフリカツメガエルＢＭＰ類をコードするＤＮＡ
   を含有するＤＮＡを保持する形質転換体。
7. （７）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１／
   ｐＸａｒ３である請求項６記載の形質転換体（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−２５７８）。
8. （８）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１／
   ｐＸａｒ４である請求項６記載の形質転換体（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−２５７９）。
9. （９）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１／
   ｐＸａｒ５である請求項６記載の形質転換体（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−２５８０）。
10. （１０）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１
    ／ｐＸａｒ９である請求項６記載の形質転換体（ＦＥＲ
    ＭＢＰ−２５８１）。
11. （１１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１
    ／ｐＸａｒ１４である請求項６記載の形質転換体（ＦＥ
    ＲＭＢＰ−２５８２）。
12. （１２）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１
    ／ｐＸｂｒ２２である請求項６記載の形質転換体（ＦＥ
    ＲＭＢＰ−３０６６）。
13. （１３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１
    ／ｐＸｂｒ２３である請求項６記載の形質転換体（ＦＥ
    ＲＭＢＰ−３０６５）。
14. （１４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１
    ／ｐＸｂｒ４１である請求項６記載の形質転換体（ＦＥ
    ＲＭＢＰ−３０６７）。
15. （１５）アフリカツメガエルＢＭＰ類をコードするＤＮ
    Ａを含有するＤＮＡを保持する形質転換体を培養し、培
    養物中にアフリカツメガエルＢＭＰ類を生成蓄積せしめ
    、これを採取することを特徴とするアフリカツメガエル
    ＢＭＰ類の製造方法。
16. （１６）請求項１記載のアフリカツメガエルＢＭＰ類蛋
    白質および薬剤学的に許容し得る添加成分の有効量を含
    有する、骨折もしくは骨そしょう症治療用組成物。