HU218845B

HU218845B - Új növekedési/differenciáló faktorokat kódoló DNS-szekvenciák, e faktorokat tartalmazó gyógyszerkészítmények, DNS-molekulák, gazdaszervezetek, antitestek, diagnosztikai eljárások

Info

Publication number: HU218845B
Application number: HU9402143A
Authority: HU
Inventors: Gertrud Hötten; Helge Neidhardt
Original assignee: Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh.
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 2000-12-28
Also published as: HUT67683A; AU666170B2; CA2129820C; ES2141761T3; JP3193050B2; EP0625989B1; HU9402143D0; WO1993016099A3; DE69327645D1; PT625989E; JPH07503847A; JPH09182593A; UA48105C2; NZ249113A; RU2208638C2; DK0625989T3; AU3497193A; DE69327645T2; ATE188996T1; EP0625989A1

Description

A találmány a TGF-[l-családba tartozó új növekedési/differenciálódási faktorokat kódoló DNS-szekvenciákra vonatkozik. Részletesen: a találmány TGF-βszerű proteineket kódoló új DNS-szekvenciákra, e DNS-eket tartalmazó rekombináns DNS-molekulákra, ezeket tartalmazó gazdasejtekre, az említett proteinek ezen gazdaszervezetek tenyésztésével végzett előállítására, s az említett proteint tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik. A növekedési faktorok TGF-βcsaládja, melybe a BMP, a TGF és az Inhibin-rokon proteinek (Roberts és Spom, Handbook of Experimental Pharmacology, 95, 419-472, 1990) tartoznak, gyógyászati kezelések és alkalmazások széles területén különös jelentőséggel bír. Ezen faktorok hasznosak a sebgyógyítási és szövet-helyreállítással kapcsolatos eljárásokban, sőt a TGF^-család jó néhány tagja szövetinduktív, elsősorban oszteoinduktív, s ennek megfelelően központi.szerepet játszik a porc- és csontfejlődésben.

Wozney (Progress in Growth Factor Research, 1, 267-280, 1989) és Vale és munkatársai (Handbook of Experimental Pharmacology, 95, 211-248, 1990) különböző, a BMP (csont morfogenetikus proteinek) és az inhibincsoporttal rokon növekedési faktorokat írnak le. Ezen csoportok tagjai nagymértékű szerkezeti hasonlóságot mutatnak. A protein prekurzora egy aminoterminális egyszálú szekvenciából, egy propeptidből és egy körülbelül 110 aminosavból álló karboxi-terminális szekvenciából épül fel, amely aztán a prekurzorról lehasítva képezi az érett proteint. A csoportok tagjait az aminosavszekvenciára vonatkozó homológia alapján határozzák meg. Az érett protein tartalmazza a legjobban konzervált szekvenciákat, különösen hét ciszteingyököt, amelyek a család tagjai között őrződnek meg. A TGF ^-szerű proteinek multifunkcionális, hormonálisán aktív növekedési faktorok. Rendelkeznek továbbá rokon biológiai aktivitásokkal, mint például a sejtek kemotaktikus vonzása, a sejtek differenciálódásának elősegítése, valamint szövetindukáló képesség, mint a porc- és csontindukáló képesség. Az 5 013 649 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban BMP-2 proteinek (csont morfogenetikus protein) elnevezésű oszteoinduktív proteineket kódoló DNS-szekvenciákat írnak le. A WO 89/10409 a BMP-3 BMP proteint úja le. Sok sejttípus képes továbbá szintetizálni a TGF^-szerű proteineket, és láthatóan valamennyi sejt rendelkezik TGF^-receptorokkal.

Összefoglalva: ezen proteinek szerkezeti különbségeket mutatnak, amelyek pontos biológiai működésükben jelentős változatosságot eredményeznek. Ezenfelül e proteinek különböző szövetek és fejlettségi stádiumok széles körében megtalálhatók. Ennek megfelelően a pontos funkciójukat illetően (például hogy milyen celluláris fiziológiai környezetet igényelnek, milyen az élettartamuk, milyen cél hatására lépnek működésbe, igényelnek-e járulékos faktorokat, milyen a lebomlás elleni rezisztenciájuk) különbözőknek kell lenniük. így, bár számos, szövetinduktív, különösen oszteoinduktív képességet mutató proteint leírtak már, a szervezeten belüli természetes szerepük s még inkább gyógyászati alkalmazhatóságuk még értelmezésre szorul. A TGF-βcsalád oszteogenezist, illetve más szövetek differenciálódását/indukcióját illetően jelentős, ezidáig ismeretlen tagjainak előfordulását nagyrészt ismerni véljük. Ezen új, TGF^-szerű proteinek izolálásának fő problémáját azonban az jelenti, hogy működésüket ez idáig nem írták le elég pontosan ahhoz, hogy megkülönböztető biológiai vizsgálatot lehessen tervezni. Másrészről a család ismert tagjainak nukleotidszekvenciát illető homológiája a klasszikus nukleinsav-hibridizációs technikák alkalmazásához túl alacsony lehet. Mindazonáltal az új TGF^-szerű proteinek további izolálására és jellemzésére sürgősen szükség van annak érdekében, hogy megszerezzük a kívánt gyógyászati kívánalmakkal rendelkező indukciós és differenciálódási proteinek teljes készletét. Ezek a faktorok hasznosnak bizonyulhatnak defektusok gyógyításában, valamint a csont és/vagy más szövetek - mint a vese és a máj - degeneratív rendellenességeinek kezelésében.

Ilyenformán a találmány alapvető technikai problémája lényegében az, hogy olyan DNS-szekvenciákat bocsássunk rendelkezésre, amelyek a TGF^-proteincsalád új, mitogén és/vagy differenciálódásinduktív (például oszteoinduktív) képességgel rendelkező tagjait kódolják.

A fenti technikai problémát oly módon oldjuk meg, hogy rendelkezésre bocsátjuk a találmány 1-16. igénypontban jellemzett tárgyait. A találmány egyéb sajátosságai és előnyei nyilvánvalóak lesznek az előnyben részesített megvalósítások és az ábrák alapján. A következőkben megadjuk a szekvenciák és az ábrák rövid leírását.

Az 1. azonosítási számú szekvencia az MP-52 nukleotidszekvenciáját adja meg, azaz az érett pepiidnek megfelelő, embrió eredetű szekvenciát és az MP-52 propeptidjét kódoló szekvencia nagy részét.

Az MP-52 5’-végén a propeptidszekvencia némely részét ez idáig nem karakterizáltuk.

A 2. azonosítási számú szekvencia a májból származó MP-121 szekvencia már karakterizált nukleotidszekvenciáját adja meg.

A 3. azonosítási számú szekvencia az MP-52 aminosavszekvenciáját adja meg, amit az 1. számú szekvenciából vezettünk le.

Az 1. ábra az MP-52 és az MP-121 aminosavszekvenciájának és néhány rokon proteinszekvenciájának összehasonlítását mutatja be. Az 1/a. ábra az MP-52 és a BMP proteincsalád néhány, a hét konzervált cisztein közül az elsővel kezdődő tagjának összehasonlítását mutatja be. Az 1/b. ábra az MP-121 és az inhibin proteincsalád néhány tagjának összehasonlítását ábrázolja. A azt jelzi, hogy az adott aminosav valamennyi összehasonlított protein esetében azonos; a „+” azt jelzi, hogy az adott aminosav az ΜΡ-52-vel (1/a. ábra), illetve az ΜΡ-121-gyel (1/b. ábra) összehasonlított proteinek közül legalább egyben azonos.

A 2. ábra a találmányban alkalmazott oligonukleotid primer nukleotidszekvenciáit és e szekvenciák más ismert, TGF^-családba tartozó szekvenciákkal történő összehasonlítását ábrázolja. A M adenint vagy cito2

HU 218 845 Β zint, az S citozint vagy guanint, az R adenint vagy guanint és a K guanint vagy timint jelent. A 2/a. ábra az OD primer szekvenciáját ábrázolja, míg a 2/b. ábra az ÓID primer szekvenciáját mutatja be.

A találmány új, TGF-P-szerű proteinekre vonatkozik, s a megfelelő génekben lévő DNS-szekvenciákat bocsát rendelkezésre. Az ilyen szekvenciák közé tartoznak az

ATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACA és

CTTCTCAAGGCCAACACAGCTGCAGGCACC szekvenciákat tartalmazó nukleotidszekvenciák, nevezetesen az 1. és 2. azonosítási számú szekvenciák, az említett szekvenciák allélszármazékai és az említett szekvenciák genetikai kódjának eredményeképpen degenerált DNS-szekvenciák. Az ilyen szekvenciák közé tartoznak továbbá a fentebb említett DNS-szekvenciákkal szigorú körülmények mellett hibridizáló DNS-szekvenciák, melyek a következő aminosavszekvenciákat tartalmazzák:

Met-Asn-Ser-Met-Asp-Pro-Glu-Ser-Thr vagy

Leu-Leu-Lys-Ala-Asn-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr.

Annak ellenére, hogy az említett alléi-, degeneratív és hibridizálószekvenciák a természetesen előforduló mutációk (mint például kis deléciók vagy szubsztitúciók) következtében szerkezeti eltéréseket mutathatnak, rendszerint lényegében azonos hasznos tulajdonságokkal rendelkeznek, lehetővé téve alapvetően azonos gyógyászati alkalmazásukat.

A találmány értelmében a „hibridizáció” kifejezés hagyományos hibridizációs feltételeket jelent, előnyösen 6xSSC sókoncentrációval 62-66 °C-on, majd 1 órás mosás 0,6xSSC-vel és 0,1% SDS-sel 62-66 °C-on. A hibridizáció kifejezés elsősorban szigorú hibridizációs feltételekre vonatkozik, 4xSSC sókoncentrációval 62-66 °C-on, majd 1 órás mosás 0,1 xSSC-vel és 0,1% SDS-sel 62-66 °C-on.

A kódolt proteinek fontos biológiai működései közé tartozik a mitogén- és oszteoinduktív képesség, amelyek Roberts és munkatársai (PNAS, 78, 5339-5343, 1981), Seyedin és munkatársai (PNAS, 82, 2267-2271, 1985), valamint Sampath és Reddi (PNAS, 78, 7599-7603, 1981) által leírt módszerekkel határozhatók meg.

A találmány előnyben részesített tárgyait képezik a fentebb meghatározott és gerincesekből, elsősorban emlősökből, például sertésből vagy szarvasmarhából, valamint rágcsálókból, például patkányból vagy egérből, s főleg emberszabásúakból, például emberből nyerhető DNS-szekvenciák.

A találmány különösen előnyben részesített tárgyát képezik az MP-52 és MP-121 elnevezésű DNS-szekvenciák, amelyeket az 1. és 2. azonosítási számú szekvencia ábrázol. Az MP-52 megfelelő transzkriptumai embriogén szövetből nyerhetők, s olyan proteint kódolnak, amelyek jelentős aminosavhomológiát mutatnak a BMP-szerű proteinek érett részével (lásd 1/a. ábra). A BMP2 (=BMP2A) és a BMP4 (=BMP2B) proteinszekvenciáit Wozney és munkatársai (Science, 242, 1528-1534, 1988) írták le. A BMP5, BMP6 és BMP7 megfelelő szekvenciáit Celeste és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 9843-9847,1990) írták le. Az MP-52 propeptid részében találtak néhány tipikus szekvenciahomológiát is, amelyek kizárólag az ismert BMP-szekvenciákra specifikusak, míg az MP-52 prekurzor részének egyéb részei jelentős eltéréseket mutatnak a BMP prekurzoroktól. Az MP-121 mRNS-ét májszövetben mutatták ki, s a neki megfelelő aminosavszekvencia homológiát mutat az Inhibin proteinláncokkal (lásd 1/b ábra). A TGF-P-szerű proteineket kódoló cDNS-szekvenciákat még nem izolálták májszövetből valószínűleg annak köszönhetően, hogy a TGF-β-specifikus promoterek kis mennyiségben vannak jelen ebben a szövetben. Embriogén szövetben azonban az ismert TGF-P-szerű proteineket kódoló szekvenciák viszonylag nagy mennyiségben fordulnak elő. Az utóbbi időben a TGF-p-szerű proteinek egy csoportjának jelenlétét kimutatták a májban is. Az e csoport ismert faktoraival rokon kiónok magas háttérszintje jelenti a fő nehézséget az új TGF-p-rokon szekvenciáknak az említett - és valószínűleg egyéb - szövetekből történő kimutatásában. A találmányban a klónozást az alábbiakban leírtak szerint végeztük. A DNSszekvencia klónozását követően a TGF-p-szerű proteinek termelésére képes gazdasejtek és az említett proteinek előállítása ismert rekombináns DNS-technikák alkalmazásával könnyen megvalósítható, melynek során az említett proteineket kódoló expressziós plazmidokat állítunk elő, s egy gazdasejtet ilyen expressziós plazmiddal transzformálunk, a transzformánst megfelelő tápközegben tenyésztjük, és kinyerjük a TGF-P-szerű aktivitással rendelkező terméket.

A találmány továbbá a fentebb leírt, tetszés szerint expressziós kontrollszekvenciához kapcsolt DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-molekulákra is vonatkozik. Az ilyen vektorok hasznosak lehetnek a tartósan vagy átmenetileg transzformált sejtekben a TGF-P-szerű proteinek termelésére. A transzformációhoz és az azt követő tenyésztéshez alkalmazható jó néhány állat-, növény-, gomba- és baktériumrendszer. A találmányban alkalmazható vektorok lehetőleg tartalmaznak olyan szekvenciákat, amelyek szükségesek a gazdasejtben zajló replikációhoz, s önállóan replikálódnak. Szintén előnyös szelektálható, markergéneket tartalmazó vektorok alkalmazása, miáltal a transzformált sejtek könnyen kiszelektálhatok.

A találmány további tárgyaként gazdasejtet bocsátunk közre, amely képes a TGF-p-család valamely proteinjének termelésére. Az alkalmazható gazdasejtek közé tartoznak a különböző eukarióta és prokarióta sejtek, például az E. coli, rovarsejtek, növényi sejtek, emlőssejtek, valamint gombák (például élesztő).

A találmány egy további tárgyaként a fentebb leírt DNS-szekvenciák által kódolt, TGF-p-családba tartozó proteint bocsátunk rendelkezésre, amely biológiai sajátosságokat mutat, úgymint szövetinduktív, még inkább oszteoinduktív és/vagy mitogéntulajdonságokat, melyek minden valószínűség szerint fontosak a gyógyászati kezelések szempontjából. A protein említett sajátosságai - homodimerek vagy heterodimerek kialakulásától függően — változók lehetnek. Az ilyen struktú3

HU 218 845 Β rák a klinikai felhasználás során is alkalmasnak bizonyulhatnak. A TGF-p-család különösen előnyös proteinjének (MP-52) aminosavszekvenciáját a 3. azonosítási számú szekvencia ábrázolja.

A találmány egy további tárgyaként eljárást bocsátunk közre TGF-fl-szerű proteinek előállítására. Az ilyen eljárás a találmány szerinti DNS-szekvenciával transzformált gazdasejt megfelelő tápközegben való tenyésztését és az előállított TGF-P-szerű proteinek tisztítását foglalja magában. Ilyenformán ez az eljárás a kívánt protein előállítását olyan mennyiségben teszi lehetővé, amely elégséges a gyógyászati alkalmazáshoz, valamint a sejttenyésztési technikákat felhasználó, végrehajtásukhoz növekedési faktort igénylő alkalmazásokhoz. A gazdasejt-baktériumokból (például Bacilusból vagy Escherichia coliból), gombákból (például élesztőből), növényekből (például dohányból, burgonyából vagy Arabidopsisból) és állatokból, különösen gerinces sejtvonalakból (például az Mo, COS vagy CHO sejtvonalból) nyerhetők.

A találmány további tárgyaként különösen érzékeny eljárást biztosítunk az mRNS-ek kis mennyiségének megfelelő DNS-szekvenciák szóban forgó szövetekben történő izolálására. A találmány szerinti eljárás négy különböző lépés kombinálását foglalja magában. Elsőként izoláljuk az mRNS-t, és felhasználjuk az oligonukleotid primerekkel végzett amplifikációs reakcióhoz. Az oligonukleotid primerek szekvenciái a szóban forgó génnel kapcsolatos aminosavszekvenciákból származó degenerált DNS-szekvenciákat tartalmaznak. Ez a lépés a szóban forgó géncsalád ismert tagjainak amplifikálását eredményezheti, így ezeket a nemkívánatos termékeket eliminálni kell. Ezt olyan restrikciós endonukleázok felhasználásával tudjuk megvalósítani, melyekről ismert, hogy emésztik a géncsalád korábban analizált tagjait. Az amplifikált DNS-populáció említett restrikciós endonukleázokkal történő kezelése után a megmaradt, kívánt DNS-szekvenciákat gélelektroforézissel izoláljuk, majd egy harmadik lépésben amplifikációs reakcióval újra amplifikáljuk, s negyedik lépésként - a szekvenálás érdekében - alkalmas vektorokba klónozzuk. Az érzékenység és hatékonyság növelése érdekében a második és harmadik lépést ismételten hajtjuk végre a találmány egyik megvalósítási módja szerint legalább kétszeri ismétléssel.

Egy előnyben részesített megvalósítási módban a fentebb leírt izolálási eljárást alkalmazzuk DNS-szekvenciák májszövetből történő izolálásához. A fenti eljárás különösen előnyös megvalósítási módjában a PCRkísérlethez használt egyik primer homológ az mRNS poliA farkával, míg a másik primer egy génspecifikus szekvenciát tartalmaz. A leírt eljárás különböző lépéseinek (mint például az amplifikálási reakciók vagy a szekvenálótechnikák) kivitelezésében alkalmazott technikák a szakemberek számára ismertek, s ezeket például Sambrook és munkatársai („Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) írták le.

A találmány további tárgyát gyógyszerkészítmények képezik, amelyek a találmány szerinti TGF-p-család proteinjének gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazzák. Az ilyen készítmények tetszés szerint tartalmazhatnak gyógyszerészetileg megfelelő hordozót. Az ilyen gyógyszerkészítmények felhasználhatók sebek gyógyításában és szövet-helyreállításban csakúgy, mint a csont-, porc- vagy fogbetegségek gyógyításában, lehetőség szerint más rokon proteinekkel vagy növekedési faktorokkal együtt. Ilyenformán a találmány szerinti gyógyszerkészítmény - nem kizárólagosan - magában foglalja az MP-52 kódolt proteint, összefüggésben az MP-121 kódolt proteinnel, s tetszés szerint egyéb ismert biológiailag aktív anyagokkal, mint az EGF (epidermális növekedési faktor) vagy a PDGF (vérlemezke eredetű növekedési faktor). A TGF-P-szerű proteinek másik lehetséges klinikai alkalmazása az immunreakció szuppresszoraként való felhasználás, amellyel megelőzhető a szervtranszplantátumok kilökődése. A találmány szerinti proteinket tartalmazó gyógyszerkészítmények profílaktikusan is alkalmazhatók, vagy felhasználhatók a kozmetikai (plasztikai) sebészetben. Ezenfelül a készítmény alkalmazhatósága nem korlátozódik kizárólag emberekre, hanem állatokra, főleg háziállatokra is kiterjed.

Végül a találmány további tárgya egy antitest vagy antitestfragmens, amely specifikusan képes kötődni a találmány szerinti proteinekhez. Az ilyen specifikus antitest kitenyésztésének módszerei közismertek. Az ilyen antitest előnyösen monoklonális antitest. Az ilyen antitestek vagy antitestfragmensek hasznosak a diagnosztikai módszerekben.

A következő példák részletesen jellemzik a találmányt, de nem szolgálnak a találmány korlátozásául.

1. példa

Az MP-121 izolálása

1.1 Humán máj szövetből (40 éves férfi) Chirgwin és munkatársai (Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979) módszerével teljes RNS-t izoláltunk. A teljes RNS-ből oligo (dT) kromatográfiával poliA⁺ RNS-t különítettünk el a gyártó útmutatásai alapján [Stratagene Poly(A) Quick columns].

1.2 A reverz transzkripciós reakcióhoz a májszövetből származó poliA⁺ RNS-t (1-2,5 pg) 5 percig 65 °C-on melegítettük, majd jégen gyorsan lehűtöttük. A poliA⁺ RNS-hez pg-onként reverz transzkripciós reagenst (27 egység RNS-védő (Pharmacia), 2,5 g pg oligo d(T)i2_₁₈ (Pharmacia), 5 X puffért (250 mM Tris/HCl pH 8,5; 50 mM MgCl₂; 50 mM DTT; 5 mM mindegyik dNTP-ből; 600 mM K.C1) és 20 egység madár myeloblastosis vírus reverz transzkriptázt (AMV, Boehringer Mannheim) adtunk. A reakcióelegyet (25 pl) 2 órán keresztül 42 °C-on inkubáltuk. A máj cDNS-készletet -20 °C-on tároltuk.

1.3 Az amplifikációs reakció elindításához tervezett OD és ÓID dezoxinukleotid primereket (2. ábra) automata DNS-szintetizáló berendezésen (Biosearch) állítottuk elő. A tisztítást denaturáló poliakrilamidgél-elektroforézissel végeztük, a gél fő sávját pedig izotachoforézissel izoláltuk a gélről. Az oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy a TGF-p-család néhány ismert tagjának nukleinsavszekvenciáját sorba állítottuk, s kiválasztot4

HU 218 845 Β tűk a legnagyobb konzerváltságot (hasonlóságot) mutató régiókat. E régió egy összehasonlítását a 2. ábrán mutatjuk be. A klónozás elősegítéséhez mindkét oligonukleotid tartalmazott EcoRI restrikciós helyeket, s az OD ezenfelül az 5'-terminálison tartalmazott egy Ncol restrikciós helyet.

1.4 A polimeráz láncreakcióhoz templátként máj eredetű cDNS-t használtunk (50 pl reakcióelegyben). Az amplifikálást a következő reakcióelegyben végeztük: 1 xPCR-puffer [16,6 mM (NH₄)₂SO₄; 67 mM Tris/HCl, pH 8,8; 2 mM MgCl₂; 6,7 μΜ EDTA; 10 mM β-merkapto-etanol; 170 μg/ml BSA (Gibco)], 200 μΜ mindegyik dNTP-ből (Pharmacia), 30 pmol mindegyik oligonukleotidból (OD és ÓID) és 1,5 egység Taq polimeráz (AmpliTaq, Perkin-Elmer Cetus). A PCR reakcióelegy kiindulási anyagként 30 ng poli(A⁺) RNS-nek megfelelő cDNS-t tartalmazott. A reakcióelegyet paraffinnal fedtük be, s a PCR-t 40 ciklusban végeztük (1. ciklus: 80 mp, 94 °C/40 mp, 52 °C/40 mp, 72 °C; 2-9. ciklus: 60 mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/60 mp, 72 °C; 10-29. ciklus: 60 mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/60 mp, 72 °C; 30-31. ciklus: 60 mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/90 mp, 72 °C; 40. ciklus: 60 mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/420 mp, 72 °C). Hat PCR-reakcióelegyet összegyűjtöttünk, majd egymást követően azonos térfogatú fenollal, fenol/kloroform (1:1 v/v) és kloroform/izoamil-alkohol (24:1 v/v) eleggyel végzett extrakcióval tisztítottuk, s etanolos kicsapással koncentráltuk.

1.5 A kapott PCR-pool fele elegendő volt az Sph I (Pharmacia) és az AlwN I (Biolabs) restrikciós enzimekkel végzett emésztéshez, míg a másik felét az Ava I (BRL), AlwN I (Biolabs) és Tfi I (Biolabs) restrikciós enzimekkel végzett sorozatreakciókkal emésztettük. A restrikciós endonukleázos emésztést 100 μΐ térfogatban 2-12 órás reakcióval 37 °C-on (a Tfi I esetében 65 °C-on) végeztük, mindegyik enzimből 8 egység felhasználásával a gyártók által ajánlott pufferben.

1.6 Valamennyi DNS-mintát elektroforézissel ffakcionáltuk, 4%-os agarózgél (3% FMC Nusieve agaróz, Biozym és 1% agaróz, BRL) és Trisborát-puffer (89 mM Trisbase, 89 mM bórsav, 2 mM EDTA, pH 8) felhasználásával. Etidíum-bromidos festést követően a hasítatlan amplifikációs termékeket (körülbelül 200 bp; a méretmarkereket párhuzamosan futtattuk) levágtuk a gélről, és fenolos extrakcióval izoláltuk, melynek során az összeaprított, levágott agarózhoz azonos térfogatú fenolt adtunk, majd ezt 10 percig fagyasztottuk, vortexteztük és centrifugáltuk. A vizes fázist összegyűjtöttük, az interfázist azonos térfogatú ΤΕ-pufferrel újraextraháltuk, centrifugáltuk, s a két vizes fázist összekevertük. A DNS-t kétszeri fenol/kloroform és egyszeri kloroform/izoamil-alkohol extrakcióval tovább tisztítottuk.

1.7 Az etanolos kicsapást követően az izolált DNS egynegyedét vagy egyötödét az első amplifikációhoz alkalmazott feltételek mellett reamplifikáltuk azzal a különbséggel, hogy a ciklusok számát 13-ra csökkentettük (1. ciklus: 80 mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/40 mp, 72 °C; 2-12. ciklus: 60mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/60 mp, 72 °C;

13. ciklus: 60 mp, 93 °C/40 mp, 52 °C/420 mp, 72 °C). A reamplifikált termékeket tisztítottuk, a fentebb leírt enzimekkel emésztettük, s a hasítatlan termékeket a fentiek szerint agarózgélről izoláltuk. A reamplifikációt és az azt követő restrikciós emésztést és a gélről történő izolálást egyszer ismételtük.

1.8 Az utolsó, gélről történő izolálást követően az amplifikációs termékeket 4 egység EcoRI-gyel (Pharmacia) 2 órán keresztül 37 °C-on emésztettük (a gyártó által ajánlott puffer felhasználásával). A restrikciós elegy egynegyedét az SK+ pBluescriptII vektorhoz (Stratagene) ligáltuk, amelyet hasonlóképpen EcoRIgyel emésztettünk. A ligálás után valamennyi enzimkombinációból származó 24 kiónt szekvenciaanalízissel tovább analizáltuk. Az AlwN I-gyel és Sph I-gyel emésztett minta nem tartalmazott új szekvenciákat, csak BMP6- és inhibin βΑ-szekvenciákat. Az Ava I, AlwN I és Tfi I enzimekkel emésztett mintákban 19 azonos, MP - 121-nek elnevezett új szekvenciát találtunk. E többségben talált szekvenciától egy szekvencia két nukleotidban különbözött. A HB101 E. coli törzzsel végzett ligálási reakciót és transzformációt Sambrook és munkatársai (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989) által leírtak alapján hajtottuk végre. A transzformánsokat ampicillinrezisztenciára szelektáltuk, és a plazmid-DNS-eket standard eljárások szerint izoláltuk (Sambrook és munkatársai, 1989). Az analízist a kétszálú plazmidok „Sequenase Version 2.0” szekvenáló kit (United States Biochemical Corporation) felhasználásával végzett „didezoxi-ribonukleotid láncterminációs szekvenálásával” hajtottuk végre.

A kiónt Frohman (Amplifications, Perkin-Elmer Corporation, 5. kiadás, 1990) által részletesen leírt módszenei a cDNS 3’-végéhez toldottuk. Az MP-121 első fragmensének izolálásához használt máj eredetű mRNS-sel megegyező mRNS-t reverz transzkripciónak vetettük alá adaptor primerhez kapcsolódó, oligo dTből álló (16 gyök) primer felhasználásával [AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC(T)₁₆], Az amplifíkációt az adaptor primer (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) és az ΜΡ-121-szekvencia egy belső (intemális) primerének (GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA) felhasználásával végeztük. Az amplifikációs termékeket az MP-121 beillesztett intemális primerének (ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG) és az adaptor primer felhasználásával reamplifikáltuk. A reamplifikációs termékeket az Sphl restrikciós enzimmel végzett emésztést követően a hasonlóképpen emésztett pT7/T3 U19 vektorba (Pharmacia) klónoztuk, s a „Sequenase Version 2,0” szekvenáló kittel (United States Biochemicals Corporation) szekvenáltuk. A kiónokat az ismert ΜΡ-121-szekvencia 3’-végével mutatott átfedéseik alapján karakterizáltuk.

2. példa

Az MP-52 izolálása

A fentiekben (1. példa) leírt eljárás alapján egy további cDNS-szekvenciát, az ΜΡ-52-t izoláltuk, melynek során humán embrió (8-9 hetes) szövetéből származó RNS-t alkalmaztunk. A PCR-hez kiindulási anyagként 20 ng poli(A⁺ RNS-nek megfelelő cDNS-t használtunk. A reamplifikációs lépést mindkét enzimkombiná5

HU 218 845 Β cióval kétszer ismételtük. A ligálás után mindegyik enzimkombinációból származó 24 kiónt szekvenciaanalízissel tovább analizáltuk. Az AlwN I és Sph I restrikciós enzimekkel emésztett minta egy új szekvenciát eredményezett, amelyet ΜΡ-52-nek neveztünk el. A többi klón 5 főleg BMP6- és egy BMP7-szekvenciát tartalmazott. Az Ava I, AlwN I és Tfi I restrikciós enzimekkel emésztett minta nem tartalmazott új szekvenciákat, hanem főként BMP7- és kevés inhibin βΑ-szekvenciát.

A ki ónt a fentebb leírt módszerrel (1. példa) a 3’- 10 véghez toldottuk. Az MP-52 első ffagmensének izolálásához használt embrió eredetű mRNS-sel megegyező mRNS-t az 1. példában leírtaknak megfelelően reverz transzkripciónak vetettük alá. Az amplifikációt az adapter primer (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) 15 és egy MP-52 belső primer (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) felhasználásával hajtottuk végre.

Az amplifikációs termékeket az MP-52 egy beillesztett adaptor printerének (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) és egy beillesztett belső primerének 20 (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) felhasználásával reamplifikáltuk. A reamplifikációs termékeket Nco I restrikciós enzimmel végzett emésztést követően egy hasonlóan emésztett vektorba klónoztuk [pUC 19 (Pharmacia 27-4951-01), amely egyedüli Nco I restrik- 25 ciós helyet tartalmazó módosított, összetett klónozási hellyel rendelkezik] és szekvenáltuk. A kiónokat az ismert ΜΡ-52-szekvencia 3’-végével mutatott átfedéseik alapján karakterizáltuk. Ezen kiónok némelyike az 1. azonosítási számú szekvenciával ábrázolt szekvencia 30 3’-végének utolsó 143 bázispárját és a 0,56 kb hosszú 3’-transzlálatlan régiót (melynek szekvenciáját nem ábrázoljuk) tartalmazza. Ezen kiónok egyikét - Ausubel és munkatársai (Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Inter- 35 Science, 1989) által részletesen leírt hagyományos módszerrel - humán genomkönyvtár (Stratagene 946203) screeneléséhez próbaként alkalmaztuk. 8xl0⁵ lambda fág közül egy fágot (lambda 2.7.4), mely körülbelül 20 kb nagyságú inszertet tartalmazott, izoláltunk, és 40 DSM 7387 deponálási számon helyeztünk letétbe. Ez a klón a leírt amplifikációs módszerekkel mRNS-ből izolált szekvencián kívül az 5’-végre vonatkozó szekvenciainformációt is tartalmaz. A szekvencia analíziséhez körülbelül 7,5 kb hosszúságú Hind III fragmenst szub- 45 klónoztunk egy hasonlóan restrikciós enzimmel emésztett vektorba (Bluescript SK, Stratagene 212206). Ezt az SKL 52 (H3) MP12 elnevezésű plazmidot DSM 7353 deponálási számon szintén letétbe helyeztük. Az erre a kiónra vonatkozó szekvenciajellemzőket az 1. 50 azonosítási számú szekvencia leírásánál adjuk meg. Az 1050. számú nukleotidnál a meghatározott cDNS és a megfelelő genomszekvencia egy bázispárban különbözik (cDNS: G; genom DNS: A). Feltételezzük, hogy a genomszekvencia a helyes, mivel ezt az embriószövet- 55 bői származó amplifikált genom DNS (amelyet az mRNS készítéséhez használtunk) szekvenálásával is megerősítettük. A genom DNS az 1. azonosítási számú szekvencia 332. és 333. bázispárja között körülbelül 2 kb nagyságú intront tartalmaz. (Az intron szekvenciáját nem ábrázoljuk.) A helyes exon/exon kapcsolódást az e régiót tartalmazó cDNS-ből származó amplifikációs termék szekvenálásával igazoltuk. Ezt a szekvenálási információt a részletesen Frohman által leírt (Amplifications, Perkin-Elmer Corporation, 5. kiadás, pp. 11-15, 1990) eljárás némiképp módosított változatának segítségével nyertük. Ugyanazt az embrió eredetű RNS-t, amelyet az MP-52 3’-végének izolálásához használtunk, az ΜΡ-52-szekvencia 5’-irányban orientált belső primerének (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT) felhasználásával reverz transzkripciónak vetettük alá. Az egyszálú cDNS 5’-végéhez - terminális transzferáz felhasználásával - poliA farkat toldottunk. Kétlépéses amplifikálást végeztünk, melynek során először oligo dT-ből és adaptor primerből álló prímért [AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC(T₁₆)], majd egy adaptor prímért (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) és az ΜΡ-52-szekvencia belső primerét (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) használtuk. Az amplifikációs termékeket az előzővel megegyező adaptor primer és az ΜΡ-52-szekvencia beillesztett belső primerének (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) felhasználásával reamplifikáltuk. A reamplifikációs termékeket megszakítás nélkül az ΜΡ-52-szekvencia egy beillesztett adaptor primerével (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) és egy beillesztett belső primerével (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) újra reamplifikáltuk. A végső reamplifikációs terméket tompa végűként EcoRV restrikciós enzimmel emésztett Bluescript SK vektorba (Stratagene 212206) klónoztuk. A kiónokat a lambda 2.7.4 DNS-ével mutatott szekvenciaátfedéseik alapján karakterizáltuk.

Az SKL 52 (H3) MP12 plazmidot a DSM-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig) 7353 deponálási számon 1992. 10. 12-én helyeztük letétbe.

A lambda 2.7.4 fágot DSM 7387 deponálási számon 1993. 1.13-án helyeztük letétbe. SZEKVENCIAAZONOSÍTÁSI SZÁM: 1. SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid SZEKVENCIA HOSSZA: 1207 bázispár SZÁL: kétszálú

ALAK: lineáris

MOLEKULA TÍPUSA: DNS

EREDETI FORRÁS: SZERVEZET: humán

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: embriószövet SAJÁTOSSÁGOK: humán TGF-p-szerű proteint (MP-52) kódoló szekvencia

ACCGGGCGGC CCTGAACCCA AGCCAGGACA CCCTCCCCAA ACAAGGCAGG CTACAGCCCG 60

GACTGTGACC CCAAAAGGAC AGCTTCCCGG AGGCAAGGCA CCCCCAAAAG CAGGATCTGT 120

HU 218 845 Β

CCCCAGCTCC TTCCTGCTGA AGAAGGCCAG

GCCGTTTCGC CCACCCCCCA TCACACCCCA

GTCCGATGCT GACAGAAAGG GAGGCAACAG

CACCATCACC AGCTTTATTG ACAAAGGGCA

GAGGTACGTG TTTGACATTA GTGCCCTGGA

GATCTTGCGG AAGAAGCCCT CGGACACGGC

TGCCCAGCTG AAGCTGTCCA GCTGCCCCAG

GCGCTCCGTG CCAGGCCTGG ACGGATCTGG

CCGAAACTTT AAGAACTCGG CCCAGCTGTG

GGCCGTGGAC CTCCGTGGCC TGGGCTTCGA

CCTGTTCCTG GTGTTTGGCC GCACCAAGAA

CCGCTCTGGC CAGGACGATA AGACCGTGTA

GCGGGCCCCA CTGGCCACTC GCCAGGGCAA

CAGTCGGAAG GCACTGCATG TCAACTTCAA

ACCCCTTGAG TACGAGGCTT TCCACTGCGA

CCTGGAGCCC ACGAATCATG CAGTCATCCA

CACACCACCC ACCTGCTGTG TGCCCACGCG

CTCTGCCAAC AACGTGGTGT ATAAGCAGTA

CAGGTAG 1207

SZEKVENCIAAZONOSÍTÁSI SZÁM: 2. SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid SZEKVENCIA HOSSZA: 265 bázispár SZÁL: egyszálú

ALAK: lineáris

MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez

CATCCAGCCT GAGGGCTACG CCATGAACTT

AGGCATGCCT GGTATTGCTG CCTCCTTTCA

CACAGCTGCA GGCACCACTG GAGGGGGCTC

GTCTCTGCTC TATTATGACA GGGACAGCAA

AGTAGAGGCC TGTGGGTGCA GTTAG 265

SZEKVENCIAAZONOSÍTÁSI SZÁM: 3. SZEKVENCIA TÍPUSA: aminosav SZEKVENCIA HOSSZA: 401 aminosav EREDETI FORRÁS: -

GGAGCCCGGG	CCCCCACGAG	AGCCCAAGGA 180
CGAGTACATG	CTCTCGCTGT	ACAGGACGCT 240
CAGCGTGAAG	TTGGAGGCTG	GCCTGGCCAA 300
AGATGACCGA	GGTCCCGTGG	TCAGGAAGCA 360
GAAGGATGGG	CTGCTGGGGG	CCGAGCTGCG 420
CAAGCCAGCG	GCCCCCGGAG	GCGGGCGGGC 480
CGGCCGGCAG	CCGGCCTCCT	TGCTGGATGT 540
CTGGGAGGTG	TTCGACATCT	GGAAGCTCTT 600
CCTGGAGCTG	GAGGCCTGGG	AACGGGGCAG 660
CCGCGCCGCC	CGGCAGGTCC	ACGAGAAGGC 720
ACGGGACCTG	TTCTTTAATG	AGATTAAGGC 780
TGAGTACCTG	TTCAGCCAGC	GGCGAAAACG 840
GCGACCCAGC	AAGAACCTTA	AGGCTCGCTG 900
GGACATGGGC	TGGGACGACT	GGATCATCGC 960
GGGGCTGTGC	GAGTTCCCAT	TGCGCTCCCA 1020
GACCCTGATG	AACTCCATGG	ACCCCGAGTC 1080
GCTGAGTCCC	ATCAGCATCC	TCTTCATTGA 1140
TGAGGACATG	GTCGTGGAGT	CGTGTGGCTG 1200

EREDETI FORRÁS: 40 SZERVEZET: humán

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: májszövet SAJÁTOSSÁGOK: humán TGF-p-szerű proteint (MP-121) kódoló szekvencia

CTGCATAGGG CAGTGCCCAC TACACATAGC 60

CACTGCAGTG CTCAATCTTC TCAAGGCCAA 120

ATGCTGTGTA CCCACGGCCC GGCGCCCCCT 180

CATTGTCAAG ACTGACATAC CTGACATGGT 240

SZERVEZET:humán

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: SAJÁTOSSÁGOK: humán TGF-P-szerű protein (MP-52)

HU 218 845 Β

PGGPEPKPGH

PFRPPPITPH

RYVFDISALE

RSVPGLDGSG

LFLVFGRTKK

SRKALHVNFK

TPPTCCVPTR

PPQTRQATAR

EYMLSLYRTL

KDGLLGAELR

WEVFDIWK.LF

RDLFFNEIKA

EMGWDDWIIA

LSPISILFID

TVTPKGQLPG

SDADRKGGNS

ILRKKPSDTA

RNFKNSAQLC

RSGQDDKTVY

PLEYEAFHCE

SANNWYKQY

GKAPPKAGSV

SVKLEAGLAN

KPAAPGGGRA

LELEAWERGR

EYLFSQRRKR

GLCEFPLRSH

EDMWESCGC

PSSFLLKKAR

TITSFIDKGQ

AQLKLSSCPS

AVDLRGLGFD

RAPLATRQGK

LEPTNHAVIQ

R

EPGPPREPKE

DDRGPWRKQ

120

GRQPASLLDV

180

RAARQVHEKA

240

RPSKNLKARC

300

TLMNSMDPES

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. A TGF-p-család proteinjét kódoló DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciák 20 közül való:

(a) az ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA nukleotidokat tartalmazó DNS-szekvencia, ahol a protein leolvasási kerete az első nukleotidon kezdődik;

(b) a CTT CTC AAG GCC AAC ACA GCT GCA GGC ACC nukleotidokat tartalmazó DNS-szekvencia, ahol a protein leolvasási kerete az első nukleotidon kezdődik;

(c) DNS-szekvenciák, melyek az (a) és (b) pont szerinti DNS-szekvenciákból származtathatók, és azoktól a genetikai kód degeneráltsága következtében térnek el;

(d) az (a), (b) vagy (c) pont szerinti DNS-szekvenciákhoz hibridizáló DNS-szekvenciák, melyek a 35 Met-Asn-Ser-Met-Asp-Pro-Glu-Ser Ther vagy Leu-Leu-Lys-Ala-Asn-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr aminosavszekvenciát tartalmazó proteint kódolják;

(e) az (a), (b), (c) és (d) pont szerinti DNS-szekvenciákhoz szigorú feltételek mellett hibridizáló DNSszekvenciák.
2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely gerinces-DNS-szekvencia, közelebbről emlős-DNS-szekvencia, előnyösen főemlős-, humán-, sertés-, szarvasmarha- vagy rágcsáló-DNS-szekvencia, és előnyösen pat- 45 kány- vagy egér-DNS-szekvencia.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely az 1. azonosítási számú szekvencián bemutatott nukleotidokat tartalmazó DNS-szekvencia.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-szekven- 50 cia, amely a 2. azonosítási számú szekvencián bemutatott nukleotidokat tartalmazó DNS-szekvencia.
5. Rekombináns DNS-molekula, amely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazza.
6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, amelyben az említett DNS-szekvencia működőképesen kapcsolt egy expressziót szabályozó szekvenciához.
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns 25 DNS-molekulát tartalmazó gazdaszervezet.
8. A 7. igénypont szerinti gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy baktérium, gomba, növényi sejt vagy állati sejt.
9. Eljárás a TGF-p-család proteinjének előállításá30 ra, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy 8. igénypont szerinti gazdaszervezetet tenyésztjük, majd az említett TGF-β-proteint kinyerjük a tenyészetből.
10. A TGF-p-család proteinje, amelyet az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvencia kódol.
11. A 10. igénypont szerinti protein, amely a 3. azonosítási számú szekvenciával rendelkező aminosavszekvenciát tartalmazza.
12. Gyógyszerkészítmény csont-, porc- vagy fogelégtelenségek ellen, valamint seb- és szövetgyógyítási eljá40 rásokhoz, azzal jellemezve, hogy a 10. vagy 11. igénypont szerinti, TGF-P-családba tartozó proteint adott esetben gyógyszerészetileg alkalmas hordozóval együtt tartalmazza.
13. Antitest vagy antitestfragmens, azzal jellemezve, hogy specifikusan képes kötődni a 10. vagy 11. igénypont szerinti proteinhez, de nem kötődik a BMPhez vagy az inhibincsoport tagjaihoz.
14. A 13. igénypont szerinti antitest vagy antitestfragmens, amely monoklonális antitest.
15. Diagnosztikai eljárás az új fehérjék azonosítására, azzal jellemezve, hogy a 13. vagy 14. igénypont szerinti antitestet vagy antitestfragmenst alkalmazzuk.