JPH04505325A - 組織誘導性腫瘍増殖阻止剤及びその調製方法と使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織誘導性腫瘍増殖阻止剤及びその調製方法と使用法本出願は、１９８８年４月 ２０日に提出した、米国特許出願第１８３、２２４号の一部継続出願であり、そ れは１９８７年ｌＧ月２０日に提出した米国特許出願第１１１，０２２号の一部 継続出願であり、それは１９８６年１０月２０日に提出し、現在は放棄した米国 特許出願第９９２、１２１号の一部継続出願であり、それは１９８６年４月７日 に提出し、現在は放棄した米国特許出願ｊ！！８４７．９３１号の一部継続出願 であり、それは１９８５年４月１９日に提出し、現在は放棄した米国特許出願第 ７２５．００３号の一部継続出願であって、各々の内容は本出願内に参考文献と して参照することにより、ここに含める。

発明の背景 本出願を通して、様々な刊行物が参考文献として引用されている。ここに記述し た、特許を請求する発明のデータとして、熟練している人々に周知の技術状態を もっと十分に記述するため、本出願に参考文献をつけることにより、これらの刊 行物の発表全部をここに含める。

Ｂｉｔｂｅｌ　［Ｂｉｃｈｅｌ、　Ｎｔｔｕｒｅ　２３１：　４４９−４５０（ １９７１）　］は、腫瘍増殖のプラトーにおいて、腹水腫瘍マウスから腫瘍の大 部分を摘出すると、残存している腫瘍細胞の著名な増殖促進が認められると報告 した。腹水腫瘍が十分に発達したマウスから得られた細胞を含まない腹水を、腹 水腫瘍増殖中のマウスに注射すると、明白な腹水増殖阻止を来す。上記Ｂｉｃｈ ｅｌは、進行腫瘍マウス１匹と、もう１匹の初期腫瘍マウスを外科的に結合した （皿体結合）２匹のマウスでも、初期腫瘍の明白な増殖阻止を来すことを確認し た。これらの観察結果に基づいて［Ｂｉｅｈｅｌ、　Ｂｗｒｏｐ、］。

Ｃｘｎｃｅ＋　６：　２９＋−２９６（＋９７０）及び上記Ｂｉｃｈｅｌコ、肢 体結合マウスの腹膜を通して循環し、十分に発達した腹水腫瘍により生じる細胞 を含まない腹水中に存在する、拡散性の阻止因子が存在するという仮乳がたてら れた。この阻止因子の性賀は特性付けされなかったが、腹水腫瘍の増殖速度はマ ウスに存在する腫瘍組織量に依存し、その腫瘍組織量は、生じた阻止因子量で測 定されると推測された。

腫瘍増殖阻止活性を有する物質は、既に記述されている。

ＭＣＭｚｈｏｎ　ら　（Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｌｌ、　Ａｅｘｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　７９．　４５６−４６０　（１９８２）］は、非悪性疾患ラットの肝細胞の 増殖を阻止するが、悪性疾患ラットの肝細胞の増殖を阻止しない２６．０ＯＮｔ Ｈｏｏの物質を、ラット肝細胞から精製した。ニワトリを髄の培養細胞中にも、 これとは別の増殖阻止物質が確認されている［ＫｓＨｔら、Ｅｘｐｅｒｉｍｔａ ｊｘｌ　Ｎｓａ＋ｏｌｏｇ７５１１：　３４７−３６０（１９７０）；　Ｈ＊＋ ｒｉＢｊｏｎら。

？ｏｅ、Ｍｉｌｌ、Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　？？　：　４２３−４２７（１ ９８０）；　５ｊｅｃｋら。

Ｊ、Ｃ！ＩＩ　Ｂｉａｌ、　８３：　５６２−５７５（１９７９）　コ　。

１１ｏｌｌＢら　［Ｐ＋ｏｅ、Ｎｒｔｌ、Ａｃ５ｄ、Ｓｃｉ、７７　＋　５９８ ９（１９ｇＧ）；　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　Ｉｎｋ、Ｒｔｐｏｒｔ＋　７：　５２ ５−５２６（１９８３）　］　は、アフリカミドリザルのＢ２Ｏ−１細胞から分 離した物質がＢ２Ｏ−１細胞、ヒト乳癌細胞及び正常なヒト乳房細胞の増殖を阻 止することを報告した。

最近、この阻止物質が生化学的に特性付けされ［Ｔ＋ｃｋｅｒら。

２重鎖ヒト血小板由来ポリペプチドと同一であるか、高度に関係のあることが明 らかにされた［Ａ＋＋ｏｉＩら、］、Ｂｉｏ１．　Ｃｂｅｍ２５ｇ　＋　７１５ ５−７１６０（１９８３）コ。ヒト血小板［５ｐｏｒｎ及びＲｏｂｔｒ＋ｓ。

国際特許番号ＷＯ８４１０１１０６］又はヒト胎盤［Ｆｒｏｌｉｋら。

（１９８３）ＰＮＡＳ　８０３６７６−３６１１０；　５ｐｏｒｅ　及びＲｏｂ ｔＮ＋　（ＷＯ８４／　０１１０６）コから得られたＴＧＦ−βは、形質転換成 長因子ａ又は表皮細胞成長因子の存在下で、軟寒天における非腫瘍ラットの腎線 維芽細胞及び他の細胞の足場非依存性コロニー増殖を誘導する。

さらに最近になって、この分子の細胞成長の調節物質としての三機能性がＲｏｂ ＋＋Ｉ＋　らによって確認された［Ｐｒｏｅ、　１ｌａＮＡｃｘｄ、Ｓｔｉ、８ ２　：　１１９−１２３（１１８５）　］　、１ｖｓｌｘらは前に［Ｌ　Ｃｅ１ ｌｐｌｚｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐｐ１．　５　：　４０１（１９８２）　３ 　、成長刺激及び成長阻止活性を検定するための微滴定平板法について記述して いる。Ｔｏｄ＋ｔｏら［Ｔｏｄａｔｏら、腫瘍細胞の異賀性：起源と含ｊ！、　 Ｂ＋ｉ＋ｔｏｌ−ＭＨ＋＋癌シンポジウム、策４巻、０ｖｅｎ３　Ａ、Ｉ＋、。

Ｃｏ１ｆＢ、　Ｄ、Ｓ、、　ＢＢｌｉｎ、　Ｓ、Ｂ、、　纒（Ａｃｔｄｅ＠ｉｃ 　Ｐｒｔｔｓ、　１９８２＞。

ｐｐ、　２０５−２２４）コ　及　び　１ｗ１！　ら　［Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｅ、 　Ｆｅｄ、　＾ｔ　ＳＯＣ，Ｅ！ＬＢｉｏ１．４２：　１８３３（１９８３）］ は、培養で増殖したヒト腫瘍細胞の組織培養液から腫瘍阻止活性を分離したと権 告している。これらの報告に記述されている観察結果は予備調査的なもので、詳 細は殆ど得られていない。

共同発明者の中の１人、ＫｓｎＩｌｅｔｂ　Ｋ、Ｉｙｇｌｊは］９Ｂ４年４月２ ０日、米国特許商標間に米国特許出願第６０２．５２０号として“実質的に精製 された腫瘍成長阻止因子（ＴＩＦ）”と題する、特許出願を提出した。本願は培 養で増殖したヒト腫瘍細胞に存在するか、又は同細胞から誘導される明確に定義 されていない物質又は物質類の予備的同定に関するものである。本物質又は物質 類は、以前に報告された膿瘍阻止活性と類似している。［Ｔｏｄ＆ｔｏら、腫瘍 細胞の異質性；起源と含意、Ｂｒ口１　ｏ　ｌ　−Ｍ７　ｔ　ｒ　ｓ癌シンポジ ウム、第４巻、０ｖｅｎ＋、＾、Ｈ，，Ｄ、Ｓ、、　Ｒｘ７１ｉｎ、　Ｓ、Ｂ、 、編（Ａｃ＋ｄｔｍｉｃＰｔｅａ＋、１９Ｂ）、ｐＬ　２０５−２２４）ＨＩｖ ｙｓ　ら、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｅ、Ｆｅｄ、Ａｚ。

Ｓｏｃ、　Ｅｒｐ、Ｂｉｏｌ、４２：　１８３３（１９８３）］　。

Ｔｏｄ！ｔｏ　［Ｔｏｄｘｒｏ、　Ｇ、］癌の後成的調整、　Ｔｅ＋＋ｔ　Ｆａ ｔ　Ｃａｎｃｅ＋Ｒｅｔ＋ｔ＋ｃｈ　Ｃｏｎｆｅ＋ｃｅｃｅ（Ｂｒｉｌｉ＋ｂ　 Ｃｏ１１ｂｉ＋大学；カナダ１バンク−バー）Ａｂｊ、１３（１９Ｂ４）］　は 次に、報告書によればそれぞれ配列決定されアミノ酸残基が７０及び９Ｇから成 る、腫瘍細胞増殖を阻止する特性を有する２つの因子を報告した。しかしＴｉｄ ｘｒｏは因子の起源、組織型、因子が誘導された種或いは因子の精製法を報告し なかった。

発明の要約 本発明は腫瘍増殖阻止活性を有し、図２９に示した１位のアラニンで開始し、１ １２位のセリンで終了するアミノ酸１１２を含有する蛋白を提供するものである 。本蛋白は、図４１に示したヌクレオチド２６３位のメチオニンで開始し、ヌク レオチド１４９６位のセリンで終了するアミノ酸４１２　も含有してもよい。し たがって、この４１２のアミノ酸配列は図２９に示した１位のアラニンで開始し 、１１２位のセリンで終了する成熟蛋白の完全配列も腫瘍増殖阻止活性を有する 蛋白前駆体の完全配列も含有する。最後に、本発明はヌクレオチド２６６位のリ ジンで開始し、ヌクレオチド１４９６位のセリンで終了するアミノ酸４１１を含 有する蛋白を提供するものである。

図の簡単な説明 図１は２３℃におけるゲル濾過クロマトグラフィーを表すものである。酸性化し た粗製の、ヒト謄帯からのエタノール抽出物の２３℃におけるゲル濾過クロマト グラフィーの溶離パターンである。１．０Ｍ酢酸１５０１中の酸性化したエタノ ール抽出物２ｇを、Ｂｉｏ−Ｇｅ１■ＰＩＯを充填した＋４Ｘ　１００　ｃｌｌ のカラム（Ａｍｉｃｏｎ；＃　８６１１ｍにかけ、流速７ｍ１／分で溶離した。

Ｃ型捕集うック’ＬＫＢ）が設備されている５ｏｐｅ＋Ｒｉｅ■（ＬＫＢ　２２ ＋１１を用いて１１画分を捕集した。１２Ｘ７５ｍｍの滅菌スナップトップ試験 管（Ｆｉｌｅｏｎ２［ＩＳｇ）に、各々の画分（１１ｘ画分）から１１を移した 。材料と方法に記述した通りにＴＧ＋活性を測定した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞の 阻止を△で、ミンクｎ　（ｃｃｔ　６４）細胞の阻止をＱで表している。フルス ケール吸光度範囲が１．０　ＡｌＩＦ５のＵｔｉｃｏ＋ｄ　Ｓ■（ＫＬＢ２１３ ８）及びチャートの速度が１ｍ１ＩＺ分の１チヤンネルチヤート記録計（ＬＫＢ 　２２１０）を使用して、２ｇＯｎ１１の吸光度（−）を測定した。

図２は、４℃におけるゲル濾過クロマトグラフィーを表すものである。酸性化し た粗製の、ヒト謄帯からのエタノール抽出物の４℃におけるゲル濾過クロマトグ ラフィー溶離パターンである。１．０Ｍ酢酸１５０１中の酸性化したエタノール 抽出物２ｇを、Ｂｌｏ−Ｇｅ１■ＰＩＯを充填した１４８１０１１ｃｍのカラム （ＡＩｉｃｏｎ＝　８６０１２）にかけ、流速７ｍ１７分で溶離した。Ｃ型捕集 ラック（ＬＫＢ）が設備されている５ｕｐｔｒＲｘｃ■（ＬＫＢ　２２１１）を 用いて１１画分を捕集した。１２ｘ　７５ｍｍの滅菌スナップトップ試験管（Ｆ ＭＩｃｏｎ１０５８）　に、各々の画分（１１７画分）から１ｍｌを移した。材 料と方法に記述した通りに腫瘍増殖阻害活性を測定した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞 の阻止を△で、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻止をＯで表している。フルス ケール吸光度範囲が１．０ＡＵＦＳのＵＶＩｃｏｔｄ　Ｓ■（ＬＫＢ　２１３８ ）及びチャートの速度がｌ　ｍｍ７分の１チヤンネルチヤート記録計［ＬＫＢ　 ０１０）を使用して、２８００ｍの吸光度（−）を測定した。

図３は、４℃におけるゲル濾過クロマトグラフィーの画分による細胞増殖阻止及 びヒトの正常細胞刺激を表すものである。

１．０Ｍ酢酸１５０１中の酸性化した粗製の、エタノール抽出物を、Ｂｌｏ−Ｇ ｅ１■ＰＩＯを充填した＋４Ｘ　１００ｃｍのカラム（Ａ＋ａｉｃｏｎ：９８６ ０１２　）にかけて流速？　＋１１分で溶離した。４℃におけるゲル濾過クロマ トグラフィーの溶離パターンである。Ｃ型捕集ラック（ＬＫＢ）が設備されてい る５ｏｐｅ＋Ｒｓｃ■（ＬＫＢ　２２＋１）を用いて１１ｉｉ１分を捕集した。

１２Ｘ　７５ｍｍの滅菌スナップトップ試験管（Ｆ！Ｉｃｏｎ　２０５８）に、 各々の画分（１１Ｘ画分）から１１を移した。材料と方法に記述した通りに腫瘍 増殖阻止活性を測定した。

人５４９ヒト肺癌細胞の阻止を△で、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻止を○ で表している。ヒトの正常線維芽細胞を口で表している。

フルスケール吸光度範囲が１．ＯＡ［ｌＦｓのＵｔ：ｃｏｒｄ　Ｓ■（ＬＫＢ　 １１３８）及びチャートの速度が１１１１１７分の１チヤンネルチヤート記録計 （ＬＫＢ　２２１Ｇ＋　を使用して、ＮＯａｍの吸光度（−）を測定した。

図４は、ゲル濾過クロマトグラフィーの活性画分の逆相高速液体クロマトグラフ ィーｆ）ＩＰＬＣ）を表すものである。酸性化した、ヒト調帯からのエタノール 抽出物（蛋白６５．８ｍｇ）をＢｌｏ−Ｇｅ１■ＰＩＯのゲル濾過クロマトグラ フィーにかけて得られた第４画分を凍結乾燥して０．０５％のｌ＋１Ｎｕｏ＋ｏ ｔｃｅｊｉｃ　ｘｃｉｄ（ＴＦＡ）ｌＯｍｌに再懸濁した。第４画分は２８０　 ａｗｌ：おける大きな吸光度ピークの後の最初の画分である（図２）。Ｂｔｔｋ ｍ＊ｎ卓上型遠心分離器（Ｂｓｃｋａ＋ｓｎ　Ｔｌ−６）を用いて、サンプル３ ０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除去した。２１サンプルループ が設備されているＬｉ！ａｓの［１６１ｆ注大器で、その上澄を３回注入した。

サンプルをμＢＯＮＤＡＰＡＫ■ Ｃ１８カラム　（０，７８Ｘ　３０ｃｍ）　（ｌＦ＊１ｅｒｓ　＃８４１７６） にかけた。流速を２　ｍｌ／分とし、ＷＮｓｒ＋　ｎ、ｖ、検出計（Ｗ＊１ｔｒ ｔ　４Ｂ＋型）を用いて感度２．　Ｑ　ＡＵＦＳ、　２０６　ｎｍ　（・・・） で流出物をモニター。

０．０５％のＨｉｌｌｕｏ＋ｏ１ｃｅｌｉｃ　１ｅｉｄ　（ＴＦＡ）を含有する 直ｃｅｊｏｃｉＨｉｌｅ濃度をＧ−２５％まで上昇させる３０分間直線的濃度勾 配、その後０．０５％のＴＦＡを含有するｚｃｅｌｏａｉｌｒｉｌｅ　２５−４ ５％までの２４０分間１１！Ｉ的濃度勾配、その後００５％のＴＦＡを含有する ｚｃｔ＋ｏｏｉｌ＋１ｌｃ４５−１００％までの３０分間直線的濃度勾配で溶離 が完了した。１２ｍ１＠分の捕集に５ｕｐｅｒＲｉｃ■（ＬＫＢ　２２１１）を 使用した。１．０Ｍ酢酸５０μｍ及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍ＊　Ａ６０ ０３）　５０μｇが入っている＋２Ｘ　７５ｍ＋ａのポリスチレン製試験管（Ｆ ｘＩｃｏｎ　２０５ｇ）に、各面分から１ｍｌを移し、材料と方法に記述した通 りに腫瘍増殖阻止活性を測定した。Ａ５４９ヒト肺癌細胞の阻止を△で、ミンク 肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻止をＯで表している。溶媒の濃度勾配を太きなダッ シュ（・・・）で表している。

図５は、高速液体クロマトグラフィーからプールした腫瘍増殖阻止活性（ＴＧＩ ）の高速液体クロマトグラフィー再クロマトグラフィーを表すものである（ＴＧ Ｉ−１）。高速液体クロマトグラフィーニよりｘｃ！１ｏｎｉｌｏ＋ｉｌｅ　２ ｇ−３４％の間で溶離した（画分１３−２２１、プールした腫瘍増殖阻止活性画 分（］、　５５ｍｇ　（図４）を凍結乾燥し、０．０５％ｌ＋１ｌｌｕｏ＋ｏｓ ｃ！’ｌｉｅ　ｘｃｉｄ（ＴＦＡ）　２ｍｌに再懸濁した。Ｂｅｃｋｔｎｔａ卓 上型遠心分離器（Ｂｅｅｋｍｔｎ　ＴＪ−６）を用いて、サンプルを３０００　 ｔｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除去した。２１サンプルループが設備さ れているＶａｌｅ口のＵ６に注入器で、その上澄を２回注入した。サンプルをμ ＢＯＮＤＡＰＡＫ■Ｃ１Ｂカラム （ａ、　３９Ｘ　３０ｃｍ＞　［Ｗｇｎｒｘ　＃２１３２Ｎにかけた。流速を１ ｍ１／分とし、Ｗｌｌｅｚ　ｏ、ｖ、検出計　（Ｗ自ｔｒｓ　４８１型）を用い て感度２．０ＡＤＦＳ、　２０６　ｎｍ　（−）で流出物をモニター。０．０５ ％のＴＦＡを含有する２−ｐｒｏｐｘＩｌｏｌ濃度を０−１５％まで上昇させる ２０分間直線的濃度勾配、その後０．０５％ＴＦＡを含有する２−ｐ＋ｏｐｘｎ ｏｌ　１５−３５％までの１２０分間直線的濃度勾配で溶離が完了した。４１画 分の捕集に５ｕｐｅｒ■１Ｃ■（ＬＫＢ　２２１１）を使用した。１．０Ｍ酢酸 ５０μｍ及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇａｓ＾−６０［１３１５０ｕｇが入っ ている＋２Ｘ７５■のポリスチレン製試験管（Ｆ＋１ｃｏｎ　２０５８）に、各 々の画分から１１を移し、材料と方法の記述に従、って腫瘍増殖阻止活性を測定 した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞の阻止を△で、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻 止をＯで表して・いる。溶媒の濃度勾配を大きなダッシュ（・・・）で表してい る。

図６は、高速液体クロマトグラフィーからプールした阻止活性の逆相高速液体ク ロマトグラフィー再クロマトグラフィーを表すものである（ＴＧＩ−２）。高速 液体クロマトグラフィーによりｓｃｃ＋ｏａ目ｏｒｉｌｅ　３５−３９％の間で 溶離した（画分２５−３１）、プールした腫瘍増殖阻止活性画分（０，８１り　 （図４）を凍結乾燥し、０，０５％ｌｒｉ＋１ａｏｒａｓｃｓ＋ｉｃ　＊ｃｉｄ 　（ＴＦＡ）　２　ｍｌに再懸濁した。　Ｂｅｃｋｍ＊ｎ卓上型遠心分離器（Ｂ ｅｃｋｍｘｎ　Ｔｌ−６）を用いて、サンプルを３００゜ｒｐｍで３０分間遠心 分離し、不溶物を除去した。２１サンプルループが設備されているｂｉｔ口のｌ １１６ｘ注入器で、その上澄を２回注入した。サンプルをｕ　ＢＯＮＤＡＰＩＫ ＠Ｃカラム（０，３９ｘ　３０ｃｍ）　（Ｌｌｅｒｓ　２７３２４）　にかけた 。流速を１１７分とし、１Ｆｉｌｅｒｓ　ｎ、ｔ。

検出計（Ｌｌｅｒｓ　４Ｂ＋型）を用いて感度１．０　ＡＵＦＳ、　２０６ｎｉ （−）で流出物をモニターした。０．０５％のＴＦＡを含有する２−Ｈ６Ｈａｏ ｌ濃度を０−１５％まで上昇させる２０分間直線的濃度勾配、その後０．０５％ ＴＦＡを含有する２−ｐｒｏｐｘａｏｌ　１５−３５％までの１２０分間直線的 濃濃度配で溶離が完了した。４ｍ１画分の捕集に５ｕｐｔｒＲｚｃ■（ＬＫＢ２ ２１１）を使用した。１．０Ｍ酢酸５０μｌ及びウシ血清アルブミン（５ｉ１１ Ａ−６００３）　５０Ｍｇが入っている１２Ｘ　７５ｍｍのポリスチレン製試験 管（ＦＩＩＣＯｆ＋　２＋１５１ｔ）に、各々の画分から１ｍｌを移し、材料と 方法に記述した通りに腫瘍増殖阻止活性を測定した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞の阻 止を△で、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻止をＯで表している。溶媒の濃度 勾配を大きなダッシュ（・・・）で表している。

図７は、ヒト謄帯抽出物の陽イオン交換クロマトグラフィーを表すもノテある。

ＣＭ−ＴＩＩＩＳＡＣＩＩＹＬ■を、１．　Ｇ　Ｍ　（Ｄ　ＮｔＣＩを含有する ｐｌＩ４．ＯのＯ，１Ｍ　ｘｍｍｏｎｉｎｍ　ｔｃ！＋１１ｅ同容量に再懸濁し た。この樹脂を３時間平衡化し、４℃で脱気した。この樹脂Ｎｍｌを１、６　Ｘ 　４０ｃｍのカラム（Ｐｈａ＋ｍ１ｃｉａ；　０９−０３６２−０１）に充填し 、カラムの２倍量のｐｌ＋４．０．１．０　Ｍ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｘｃｅｌｔ ｌｅで、次に０、　ｆｆ１Ｍ　ｓｍｍｏａｉａｍ　ｘｅＣｆＮｔで洗浄した。流 出物が平衡バッファー　（ｐＨ４，０の０、ＯＩＭ　ｓｍｍｏｎｉｎＩｎｘｅｅ ｌｔｌｅ）の伝導度及びｐＨと合うまでカラムを洗浄した。ヒト腰帯の酸性化し た、エタノール抽出物１ｇを１．ＤＭの酢酸５０１に再懸濁し、ｐＨ及び伝導度 が平衡１　バッファーのそれと合うまで、４℃で、カラム平衡バッファーで透析 した。酸性化し、透析したエタノール抽出物を４℃、流速１１／分でカラムにか け、ｌ１ｖｉｃｏ＋ｄ■５（ＬＫＢ　２１３８）を使用して感度１．ＩＩＡ［ｌ ＦＣで測定した吸光度（−）　Ａ２＆［ｌが最低値になるまで平衡バッファーで 洗浄した。次に、グラジェントミキサー（Ｐｂｓ＋＋ｕｃｉｔ　ＧＭ−１，＃１ ９−０４９５−０１）を利用して、０．０１Ｍから１．０Ｍまでモル濃度勾配を 直線的に上昇させたｐＨ４，０のｓｍｍｏｎｉｎｍｘｃｅｌ＋ｌｅ　２０＋１ｍ ｌで洗浄した。グラジェントの最後に、ｐＨ４，０の１．０　Ｍ　ＩＩｏｎｉｕ ｍ　ｇｃｓｊｓｌｅ　３０　ｍｌをさらに追加し、カラムを通過させた。５ａｐ ｅｒＲｚｃ■フラクシヨンコレクター（ＬＫＢ　２２１１）の１２Ｘ　１００ｍ ｍのポリスチレン製試験管（Ｃ＋＋ｌｅｍｂｉＩＤｉｇｇａｏｓｌｉｃｓ　Ｂ− ２５６４）に２１画分を捕集した。１．０Ｍ酢酸５０μｍ及びウシ血清アルブミ ン（Ｓｉｇｍ１＾６０Ｑ３）　５０Ｍｇが入っている１２Ｘ　７５■の試験管（ Ｆｘｌｅｏｎ　２Ｇ５Ｂ）に各々の両分から１１を移し、凍結乾燥し、さらに材 料と方法に記述した通りに腫瘍増殖阻止活性を測定した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞 の阻止を△で、ミンク肺（ＣＣＬ　６４）細胞の阻止をＯで表している。食塩濃 度勾配を大きなダッシュ（・・・）で表している。

図８は、陽イオン交換クロマトグラフィーからプールした画分の再クロマトグラ フィーを表すものである。図９に記述した通りにＣトＴＲｌ５ＡＣＲＹＬ■を調 製した。Ｃ１１ｌｌ＋及びＣＭ　ＩＶを含有する画分に由来する物質をプールし 、凍結乾燥した後、０．１Ｍ酢酸５０ｍ１に再懸濁し、さらにｐＨと伝導度が平 衡バッファーと合うまで、カラム平衡バッファーにより４℃で透析した。流速１ １／分、４℃でこのサンプルをカラムにかけ、さらに二〇カラムを平衡バッフｙ 　−１２０ｍ１で洗浄した。［Ｉｙｉｃｏ＋ｄ■５（ＬＫＢ　２１３８）を使用 して感度１．０ＡＵＦｃで吸光度（）　ｆ２８ｈｍ）をモニターした。グラジェ ントミキサー（Ｐｈ！ｒｍｘｃｉｓ　Ｇト１．１１９−０４９５−Ｎ）を用いて 、０．ＯＩＭから１０Ｍまでモル濃度勾配を直線的に上昇させたＰＩ１４．Ｏの ＩＩｏｎｉｕｍ　ａｅｃｔｘｌｅ　ＩＯＱ　ｍｌを使用した。グラジェントの最 後に、ｐＨ４，０の１．０　Ｍ　ｓｍａｏｎｉｕｍ　ｘｃｓｌｚｌｅ　３０　ｍ ｌ　をさらに追加し、カラムを通過させた。５Ｉｌｐｅ山ｅ■フラクシジンコレ クター（ＬＫＢ　２２１１）の＋２Ｘ　１００ｍｍのポリスチレン製試験管（Ｃ ｏｌｌｌｒａｂｉｘ　Ｄｉｘｇｖｏｓｌｉｔｓ　Ｂ−２５５４）に２１画分を捕 集した。１．０Ｍ酢酸５０μｍ及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍ畠Ａ６００３ ）　５Ｇμｇが入っている＋２Ｘ　７５ｍ１１の試験管（Ｆｘｌｅｏｎ　２Ｇ５ Ｈに各々の両分から１１を移し、凍結乾燥し、さらに材料と方法に記述した通り に腫瘍増殖阻止活性を測定した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞の阻止をΔで、ミンク肺 ｆｃｃＬ　６４）細胞の阻止を○で表している。塩濃度勾配を大きなダッシュ（ ・・・）で表している。

図９は、４℃における陽イオン交換クロマトグラフィーによるＴＧＩの分画を表 すものである。第２連の実験に記述した通りに調製した蛋白抽出物１．６５Ｂを ２０ｍＭｓｍｍｏｎｉｕｍ　＊ｃｔ＋＊Ｉｔ（ｐＨ４，５）で長時間透析し、２ ０　ｍＷ　ｇｉｉｏｆｉｉｕｍ　ｔｃｅｌｘｌｅ（ｐＨ４，５）中で予め平衡化 Ｌ　ｌ’：ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬｏ（７）５　ｍｌ　（’Ｉ　Ｘ　６．３　 ｃｍ）　力５　ムｌ：：カケ、１．６５ｍ１画分（１２ｘ　１００ｍｍポリスチ レン試験管）を捕集した。

サンプルをカラムにかけた後で、ｌｅｔ光路石英キュベツトを用いてＢｚＩｌ＋ ｃｈ　＆ａｄ　Ｌｏｍｂ　１０００分光光度計で測定した２８０ｎｍ（−）の吸 光度が基準値（Ｇ、Ｈ３未満）に戻るまで、ｐ）１４．５の２０ｍＭｘｍｍｏｎ ｉｕｍ　＋ｃｅｔｘｔｅでこのカラムを洗浄した。塩直線的濃度勾配（２Ｇ　Ｉ ＩＭ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｇｃｅｊａｌｔ中０−１．０ＭのＮｔＣＩ、　ｐＨ４ ，５）を利用し、１．６５ｍ１画分の２８θ■における吸光度を上記の通り測定 した。

１．０Ｍ酢酸５０μ！及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｎｓ　Ａ６０Ｇ３）５０ Ｍｇが入っている＋２Ｘ７５ｍｍの試験管に、指示された分画から１０μｍを移 し、凍結乾燥し、さらに材料と方法に記述した通りにＡ３４９ヒト肺癌細胞に対 する阻止活性を測定した（・・・）。水でＩＨ倍希釈した適当なサンプルの伝導 度を測定（ＹＳＩ　３２型伝導度肝）することにより、Ｎ５Ｃｌ濃度勾配（・・ ・）を決定した。

図１０は、４℃の陰イオン交換クロマトグラフィーにょるＴＧＩの分画を表すも のである。東２連の実験に記述した通りに調製した蛋白抽出物１．６５Ｍ１ｇを ２０ａｌＪ　Ｔ＋ｉ＋−１１ｃＩ　（ｐＨ８，０）で長時間透析し、３．０００ １　ｇで１５分間遠心分離して清澄にした。

ＤＥＡＥ−Ｔｌ！ｌ５ＡＣＲＹＬ■は、樹脂ヲ最初＋：１．ＯＭ　Ｎ５Ｃｌ　を 含有すル２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ　（ｐＨ８，０）に３時間懸濁し、次に ０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，ｆｌ）に１時間懸濁して調製した。沈 澱した樹脂をＢｕｃｈｎｅｒロート上、水］０００　ｍｌで洗浄し、最後に２０ 　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨｌＯ）に再懸濁し、脱気してから５１カラム（ Ｉ　Ｘ　６．３ｃｍ１に注ぎ入れ、２ＯｍＭ　Ｔｔ口、　ＨＣＩ　（ｐＨ８，０ ）でこの樹脂を平衡化した。清澄にしたサンプルをカラムにかけ、図９及び材料 と方法に記述した通りに、Ｈｈｍにおける吸光度（−）、ミンク肺細胞に対する 阻止活性（０−０）及びＮ１Ｃｌ濃度勾配（・・・）を測定した。２ｈＭＴｒロ ーＨＣＩ　（ｐＨ８，０）中のＮ５Ｃｌの直線的濃度勾配は０−１．０Ｍの範囲 であった。

図１１は、４℃の陽イオン交換クロマトグラフィーによるＴＧＩの分画を表すも のである。最後の平衡バッファーがｐＨ４，５の２０ｍＷ　ｚｍｍｏｎ：Ｉｌｍ 　５ｔｔｌＪＩｔであったこと以外は図７に記述した通りにＣＭ−ＴＲＩＳＡＣ ＲＹＬｏを調製した。上記のように調製した蛋白抽出物（９，９ｍ１）を２０５ Ｍ　ｔｍｍｏｎｉｎｉ　＊ｃｔｌＮｔ　（ｐＨ４，５）で長時間透析し、２１１ ｍＭ＊ｍａｏｌｌｉａ謬１Ｃξｌ５１ｇ　［ｐＨ４，５）中ＣＭ−ＴＩＩＩＳＡ ＣＲＹＬ＠の１５−１（１，５Ｘ　８．　Ｓｅｗ）カラムにかけた。図７に記述 した通りに、２８ｈａにおける吸光度（−）及びＡ３４９ヒト肺癌細胞に対する 阻止活性（Ｏ・・・Ｏ）を測定した。Ｏ−１，０ＭのＮｔｅｌ直線的濃度勾配の 体積は１５０１であった。各々の両分の体積は３．７１であった。

図１２は、陽イオン交換クロマトグラフィーによる活性画分の逆相高速液体クロ マトグラフィー（ＩＩＰＬＣ）を表すものである。

！！［１１に記述した、ＣＭ−ＴＩＩＩＳＡＣｆｆｉＴＬ■を使用した陽イオン 交換クロマトグラフィーによるヒト済帯の分画５９から７８までをプールし、凍 結乾燥後、０．０５％ｊｒｉｆｌｉｏ＋ｏ＊ｃ＊ｌｉｃ　ｓｃｉｄ（ＴＦＡ）Ｉ Ｄｍｌを再懸濁した。２１サンプルループを設備したＷＪｉｒｌｓの［１６に注 入器により３回注入して、合計で、蛋白２４０μｇを含有する透析物の２０％を 注入した。次に、このサンプルをμＢＯＮＤ−ＡＰＡＫ　＠Ｃカラム　（０，３ ９Ｘ　３０ｃｍ）　（１ｓＩｔｒｓ　２）３２４）にかけた。流速を１１／分と し、Ｗｓｌｓｒｔ　ｕ４．検出計（Ｗ＊ｔｓｒｓ　４！１１型）を用いて感度０ ．５ＡＵＦＳ、　２０６　ｎ＋ａで流出物をモニターした（−）。０．０５％の ＴＦＡを含有する＊ｃｅ１ｏｃｉ１ｏｒｉｌｅ濃度を０−２５％まで上昇させる ５分間１線的濃度勾配、その後０，０５％ＴＦＡを含有するａｃｅ＋ｏｎｉｌｏ ＋１ｌｅ２５−４５％までの１５５分間直線的濃勾配、その後の０．＋１５％ｒ ＦＡを含有するａｅｅ１ｏｎｉ１ｏ＋ｉｌ＊４５−８０％までの１５５分間直線 的濃勾配、さらにその後の０，０５％ＴＦＡを含有する＊ｃｓｌｏｎＮｏｒｉｌ ｅ　８０−１００％までの５分間直線的濃度勾配で溶離が完了した。１１画分の 捕集に５ｕｐｅｒＲｘｃ■（ＬＫＢ　２２１１）を使用した。１．ＧＭ酢酸５０ μｍ及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍｘ　ＡＯ２！１１）　５０Ｍｇが入って いる１２Ｘ７５ＩＩｍのポリスチレン製試験管（ＦＩＩＣＯｌｌ　２０５１１） に、各画分から５００μｍを移し、材料と方法に記述した通りに腫瘍増殖阻止活 性を測定した。Ａ３４９ヒト肺癌細胞の阻止を△で、ミンク肺（ＣＣＬ　６４） 細胞の阻止をＯで表している。溶媒の濃度勾配を大きなダッシュ（・・・）で表 している。

図１３は、疎水性相互作用クロマトグラフィーＰｈ！ｎ７ｌ−５ｅｐｂａｒｏｓ ｅを表すものであるｏｐＨ４，５の４．０　Ｍ　ｘｍｌＩｏｎｉｕｍｘｃｅｌｘ ｔｔでＰｈｅｎ７１−５ｅｐｈａ＋ｏ＋＋　（Ｐｂｓ＋Ｉｃ１ｘ）を平衡化し、 樹脂１５ｍ１を　１．５Ｘ２０ｃｍのカラム（Ｐｈｘ＋ａ＋ｃ目）　に注ぎ入れ た。４．０ＭａｍｍｏｎＩＩ１ｍ　ｚｔｅ＋ｘｒｅ　中の５ｐｅｃ＋＋＋＋ｐｏ ＋■３　（分子量カットオフ３、５００）中で透析して平衡化した３６．０ＩＩ ｌ中に、ｅｔｈｅｒ　ｅｔｂｊａＯｌ沈澱したＴＧ１３１１ｇを流速１０１／分 でカラムにかけた。０Ｄ２８ｏの吸光度が０に達した後で、４．０　Ｍ−０，０ ４Ｍ濃度が減少するｇｒｎｔｎｏｎｉａｒａ　＊ｃｅｌｓｌｅ　（短い破線・・ ・）及び０−５０％まで濃度が上昇するｐＨ４，５のＮｂ７１ｅｎｅ　ｇ１７ｃ ｏｌ’　（Ｍ＊ｌ１ｉｎｋｒｏｄｌ）　（長い破線・・・）を含むグラジェント を、フローアダプター（ＰｂＴｒｉｓｃｉＩＡＣ１６）で使用した。グラジェン トの総量は１５０１で、Ｒｅ＋ｌ山ｃ　■フラクションコレクター（ＬＮＢＩを 使用して１．９ｍ１画分を捕集した。１，０Ｍ酢酸中のウシ血清アルブミン（Ｓ ｉＢ＊＾０２１１１）５０Ｍｇが入っている！２Ｘ　７５１１ｍのプラスチック 製滅菌スナップトップ試験管（Ｆｘｌｅｏｎ）に、各面分から３０μｍを移した 。最初の手法に記述した通りに、ミンク肺細胞ＣＣＬ　６４及びＡ３４９細胞の 腫瘍増殖阻止活性を測定した。活性の概要が類似しているため、Ａ３４９細胞に 対する活性は示していない。阻止パーセントとして腫瘍増殖阻止活性をプロット し、・で表した。腫瘍増殖阻止活性のピークは、１、１８Ｍ　１ｍｍａｎｉｕｍ 　ｘｃｅ目ｆ＋　％　４２％　ｔｔｂ７１ｅｎｅ　ｇｌＢｏｌで溶離した。

分光光度計（Ｂ■ｂ　＆　Ｌｏｒａｂ、　Ｓｐｅ山ｏｎｉｃ”１００１）で測定 した２８０　ｎｍにおける吸光度で蛋白質濃度を表した。

生化学的に活性な画分Ｈ−１００をプールし、Ｇ、１Ｍ酢酸で透析した。０Ｄ２ ８０の吸光度によりプールした両分の蛋白質濃度を測定した。回収した蛋白質は １．４月であった（表７参照）。処理した阻止単位量は３０ｍｇ中に１．　Ｓ６ Ｘ　１０６、回収量は１．４＋＋ｇ中に１．５Ｘ１０６であった。

図１４＾は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　（μＢｏｎｄｐ畠 ｋ　ｏＣ１８）を表すものである。（細切した）腰帯組織の基質成分に由来し、 しかもＰｂｅＢｌ−３ｔｐｈｚｒｏｓｓクロマトグラフイーで生じた生化学的に 活性な、プールした画分から得た、凍結乾燥したＴＧｌ　１１１ｇを、１０％ｘ ｅｅ１ｏｎｉｌｏｒｉｌｅを含有する０、０５％＋ｒｉｌｌｏｏｒｏｓｃｅｌｉ ｅ　ｘｃｉｄ　（ｒＦＡ）２．０ｍｌ　に希釈した。この段階でＲＰＨＰＬＣに 使用した蛋白質置は、ＰｂｅＨＩ−５ｅｐｈＩｒｏｓｔを使用したクロマトグラ フィーによって得られた生化学的に活性な総蛋白質置の５０％を表している。蛋 白質溶液を２分間音波処理しくＢｒ＊ｎ＋ｏａ　Ｂ−２２０５ｏｎｉｃ＊１ｏｒ ）、（μＢＯＮＤＡＰＡＣ＠Ｃｌ８１カラム（０，３９ｘ　３０ｃｍ）に注入す る前に、３．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して（Ｂｅｃｋｍ＊ｎ　Ｔ］５型） 粒子状の物質を除去した。段階的グラジェントを使用して、流速１．０＋ｅｌ／ 分で蛋白質を溶離した。１５分間で２５％まで１ｅｅ１０ｆｉｉ１ｏ１ｉ１！濃 度を最初に上昇させ、２５％で１０分間、溶離を継続した。次に２分間で２７％ まで濃度を上昇させ、２７％で１０分間、溶離を継続した。その次に２分間で２ ８％まで濃度を上昇させ、２８％で１０分間継続し、最後に１０分間で１００％ まで濃度を上昇させた。シリコーン処理したガラス製試験管に両分を捕集した。

溶媒の濃度勾配を短い破線で表している。２１０Ｉで蛋白質の吸光度をモニター した（−）。各々の画分量は１．０１であった。ＲＰＨＰＬＣに使用した装置は 、正確に図１２に記述した通りである。各試験管から５１を取り、ＣＣＬ　６４ 及び＾５４９に対する腫瘍増殖阻止活性を前述の通りに評価した。ＣＣＬ　６４ 細胞株に対する活性を・で表している。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動に、分 画４７−５１を別々にプールした（矢印）。３５０．０００阻止単位をこのクロ マトグラフィー手法に使用すると、プール画分の回収単位は、画分３９−５１１ 　カ１５１Ｎｏ　、画分５９−７１が１４．８５０　（合計１６４、８５０）で あった。増殖阻止活性は、２７％及び２Ｂ−３０％の５ｃｅｊｏｎｉｌｏ＋ｉｌ ｅで溶離した。

図１４Ｂは、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）　（μＢＯＮＤＡ ＰＡＫｏＣ１ｇ）を表すものである。細切したヒト腰帯組織の基質成分に由来し 、しかもｐｂｅＢｌ−Ｓｅｐｂｔ＋ｏ＋ｔクロマトグラフィーで生じた生化学的 に活性な、プールした両分から得たＴＧｌ　３４５　μｇを、１０％ｌＣｅ１０ ｆｉｉ１ｏｒ１１ｅを含有する０、０５％　ｒＢＩＩｕｏｒｏｓｃＢｉｔＩｃｉ ｄ（ＴＦＡ）２．０　ｍｌに希釈した。図＋４Ａの記述に正確に従って、蛋白質 を調製し、クロマトグラフィーにかけた。各１．０１のサンプルから、１０μｍ を阻止活性試験に使用した。このサンプルは、Ｐｂ５ｎ７１−３ｒｐｂｘ＋ｏｓ ｅクロマトグラフイーに由来する、プールした生化学的に活性な両分総量の３０ ％を表している。このカラムに使用した阻止単位は３１２．５００であった。回 収された両分４６−５０の単位は６２．５０（１、画分５１−５５は５０．１１ ００単位、両分５６−７２は９０．０００であった（合計２０２．５００単位が 回収された）。

図１５は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動Ｓｏ ｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃ７１５ｕｌｌ［ｔ　Ｐｏ１７ｓｃｒ７１ｘｉｉｄｅ　５１ １ｂＧｅｔ　Ｅｌｔｃｌｒｏｐｈｏ＋ｔ＋１ｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示すもの である。２つの同一クロマトグラフィー法による、μＢＯＮＤＡＰＡＫｏＣ１ｇ によるクロマトグラフィーで得られた生化学的に活性な蛋白質（図１４Ａで矢印 をつけた）の凍結乾燥プールを、ゲル電気泳動用にプールし、調製した。ＰＨ６ ，８のＯ，ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　（Ｓｉｇｎａｌ、１５％１１７ｃｅ＋ｏ ｌ　（Ｋｏｄｔｋ）　、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するサン プルバッファー１００μｍにサンプルを希釈した。このサンプルを２分間沸騰さ せて（シリコン処理した）ガラスに付着していた可能性がある蛋白質を除去し、 ジスルフィド結合還元のため、その５０１１を、１０％β−ｍｓｒｃ、ｐｔｏ＊ ＋ｂ＊ｎｏｌ　（Ｂｉ山。■）を含有しているサンプルバッファー５０μｍに移 した。このサンプルを２分間沸騰させて、非還元サンプル及び還元サンプルを、 ２つの幡１．５ｍ＋ａのスラブゲルに別々にかけ（レーン２）、ゲル当たり３０ ｍＡという一定の電流下で４．５時間にわたって、電気泳動垂直セル（ＢｉｏＲ ＊ｄ、１５５型）内で１０−２１１％の＊ｅｒ７１ｓ＋ｏｉｄ！グラジェントに よる電気泳動にかけた（Ｂｏｅｆｆｅｒ　ｐｏｗｅｒｓｕｐｐ１７Ｐｓ１２ＧＯ ＤＣ）　、　５％β−ｍｓｒｃ＊ｐｌｏｅｉｈ１ｎｏｌ還元及び非還元分子量標 準（Ｐｂ＊ｒｍ＊ｅｉｘｌを、その対応する分子量の数値で示した。以下にこれ を示す。ｐｈｏｓｐｂｒ７１ｘｓｅ　Ａ、　９６　ｋＤ＊、ウシ血清アルブミン 、６８　ｋＤ＊、　ｏｙｇｌｂ＋ｕ＋ｉｎ、４３　ｋＤ＊　、ｔｌｒｂｉｎｉｃ 　＊ｎｈ７ｄｒ＊ｓｓ、３０ｋＤｓ　５ｓｏ２ｂｔｘｎ　ｌ＋１ｐｉｉｎ　１ｎ ｂｉｂＨｏ＋、２１　ｋＤ＊　、１７ｓｏＢｎｅ、１４．４　ｋＤ＊。

Ｄ＋、　Ｂｒｏｃｓ　Ｍｓｇｕｎから与えられた精製血小板由来ＴＧＦ−β５０ ｎ！をサンプルバッファーに希釈し、非還元条件下１）及び還元条件下（ｂｌ　 で電気泳動にかけ、これをレーン１に示した。５．７％酢酸４７％ｍｅｔｈａｎ ｏｌ中０．１２５％Ｃｏｏｍ鳳＋＋ｉｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０（Ｂｉｏｉｌｔ ｄｌで１０分間、このゲルを染色しくゲル中の蛋白質を固定するため）　、Ｃｏ ｏｍ＊５ｓｉｔ　Ｂｌ＋ｕを含まない同じ溶液中で一晩、脱染色した。Ｍｅ＋ｒ ＋１が記述した通り、銀手法により（ＢｉｏＲ１ｄ銀染色キット　＄１６１−０ ４４３）　このゲルを再染色した。レーン１（丁ＧＦ−β）には、約１．０００ −１．５００　（５０Ｂ）単位の増殖阻止活性が、レーン２には約８．　Ｇｏｏ −２０，０８０単位の増殖阻止活性が含有されている。

図１６は、２回の別個のクロマトグラフィーから合わせた、先のＩＩＰＬｃ手法 （図１４）による活性画分の逆相高圧液体クロマドグ５７　イー　（ＨＰＬＣ） 　ＩμＢＯＮＤＡＰＡＫｏＣＩ）　ヲ表ｔ　モ（７）　テアル。個々ノ試験管（ １３Ｘ１００ｍｍのシリコン処理したガラス製試験管）の凍結乾燥物を１０％ｐ ｒｏｐｚｎｏｌを含有する０、ｌｌ＋ｉ目ｎｏｒｏｒｃｅｌｉｅ　ｔｃｉｄ（Ｔ ＦＡ）　４．０ｍｌ　に懸濁し、２分間音波処理してから　１．Ｇｍｌ／分でμ ＢＯＮＤＡＰＡＫ■ＣＭカラム（０，３９Ｘ　３０ｃｍ）に注入した。蛋白質の 溶離は、０．０５％ＴＦＡを含有する２−ｐ＋ｏｐ＊ｎｏｌの濃度を１０分間で １０％から２０％まで上げ、次に５０分間で２０％から５０％まで濃度を上げ（ １分間当たり０．６％）、２０分間で最終的に１００％まで濃度を上げて完了し た。溶媒の濃度勾配を短いダッシュで示している。

溶離した蛋白質の吸光度を２１ｈｍ　（・・・）でモニターした。

ＲＰＨＰＬＣに使用した装置は、正確に図１２に記述した通りである。

各々の画分量は１．０１で、各試験管からその一部２００μｉを取り、生化学的 活性を測定した（・）。阻止活性は、約４０−４５％の２−ｐｔｏｐｘｎｏｌで カラムから溶離した。１２．０００単位の活性をこのカラムにかけた。以下の両 分を凍結乾燥し、ヨウ素化してから５ｆｌＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動にかけた （図１７）。この画分に含まれていた合計単位の数は、両分＄５６　（Ｏ単位） 　、ｔ５Ｈ４Ｈ単位）、＄５９−６５　＋１１．７５０単位）　、＄６６−６８ ＋１８５単位）であった。

図１７は、ＳＤＳ　ｐｏｌＨｃｒｙ＋ｌ＊ｍ１ｄｅスラブゲル電気泳動及びオー トラジオグラフィを表すものである。図１６に示したμＢＯＮＤＡＰＡＩ■ＣＮ カラムによるクロマトグラフィーで得られた特異的に活性な両分と不活性な両分 の凍結乾燥サンプルを、テキストの記述に従ってヨウ素化した。図１５に記述し た通りに、非還元及び還元サンプルバッファーの両方にサンプルを溶解し、５− ２０％ｔｃＢ目１１ｄ！グラジェントを用いて電気泳動にかけ、蛋白質バンドを 分析し、遊離している放射性ヨウ素を除去した。脱染色溶液から放射標識が消失 するまで、ゲルの染色及び脱染色を行った。ゲル乾煽器（Ｒｏｅｌｌｅｒ）を使 用してこのゲルを乾燥し、さらにＩＡ■型フィルム（Ｋｏｄ＊ｋ）を用いて１週 間、オートラジオグラフィーにかけた。非放射性標準も電気泳動にかけ、ゲルの 左に数値を示した。図１６より、このゲルにかけた阻止単位の計算値は参５８（ １８９単位）、レーン１、＄５９−６５　＋２．０６８単位）、レーン２．１６ ６−６１１　＜４６単位）、レーン３、＄５６　（０単位）、レーン４、図１８ に記述した通りのμＢＯＮＤＡＰＡＩ！＠ＣＮカラムクロマトグラフィーによる ヒト非細切腰帯の活性画分（４０８単位）、レーン５、同一基質／血管標本の非 活性画分、レーン６、Ｂｙυｅｅ　ＩＪｓＨｎが精製した血小板由来ＴＧＦ−β （２５６単位、約０．４＋＋ｇ）、レーン７であった。

図１８は、逆相高圧液体クロマトグラフィー　（ＩＩＰＬｃ）（μＢＯＮＤＡＰ Ａｌ’ｃＮ）　ヲ表ｔモ（７）Ｃ”アル。ｔｔ　ＢＯＮＤＡＰＡＫｏＣＩ８　ｈ 　５ムから２７％ｇｃ！Ｈ＋ｎｉ＋ｏ＋ｉｌｅで溶離した（プール■）、先の（ 図＋４Ａ及び図１４Ｂと同機の）　ＨＰＬＣ手法で得られた非細切腰帯の活性画 分をプールし、シリコン処理したガラス製試験管（＋６Ｘ１００ｃｍｌ内で凍結 乾燥して１．０１とし、最終濃度０．１％１ｒｉｌｌｏｏｒｏｔｅｅｌｉｃ　ｔ ｃｉｄ（ＴＦＡＩ　及び２０％　２−ｐｒｏｐ易ｃｏｌ　に希釈した。

このサンプルを２分間音波処理し、μ！１（ＩＮＤＡＰＡＫ＠ＣＮ力　ラ　ム（ ０，３９Ｘ　３０ｃｍ）　Ｈ１ｍｌ／分で注入した。蛋白の溶離は、０１％ＴＦ Ａを含有する２−ｕｏｐｘｎｏｌ濃度を５分間で２０％から３５％まで上昇させ 、次に５０分間で３５％から５０％に（１分当たり０．３７５％）、さらに５分 間で５０％からＩＮ％に上昇させて完了した。溶媒の濃度勾配を短いダッシュで 表している。各１．０１サンプルから１０μｍを取って生化学的活性を試験した （・）。ＲＰＩＩＰＬＣに使用した装置は、図１４に記述した通りである。活性 画分は３９％−４３％で溶離し、活性のピークは４０−４１％で溶離した。この カラムにかけた阻止単位の計算値は３７．０００であつた。蛋白質濃度は測定で きなかりた。２１ｈｍにおける吸光度を連続線で表している。

図１９は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬＣ）（μＢＯＮＤＡＰＡ Ｋ■ＣＮ）を表すものである。２Ｂ−３０％の３（ｅＩＨｉｌｏｒｉｌｅでＣ１ １ｌ樹脂から溶離した（プール１１）、先のＩＩＰＬｃ手法（図１８と同一のク ロマトグラフィー）で得られた活性画分を、図１８に記述した通り、プールして μＢＯＮＤＡＰＡＫ”　ＣＮカラムにかけた。濃度勾配溶離及び装置は図１８に 記述した通りである。各試験管から１００μｊ取って生化学的活性を試験した（ ・）。生化学的活性は、４４％−４６％で溶離し、活性のピークは４４％で溶離 した。このカラムにかけた増殖阻止単位の計算値は２１．０００であった。蛋白 質濃度は測定できなかった。

図２０は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（μＢＯＮＤＡＰＡＫ ■ＣＮ）を表すものである。図１８（ピーク■）及び図１９（ピーク１１）で生 化学的活性を表している（ピークのみ）溶離プロフィールは、比較のため別々の クロマトグラムで追跡した。プールｌは４０−４１％、プール１１は４４％で溶 離した。

図２１は、Ａ４３１コンデイシヨンドメデイウムの逆相ＨＰＬＣを表すものであ る。腫瘍細胞コンディジランドメディウムから得られた腫瘍増殖阻止活性に対す るＤＴＴの影響を調査するため、４×ＩＯ８個のＡ４３１細ｍ（１１Ｏｍｌ）か ら得られた凍結乾燥コンディシヲンドメディウムを、テキストの記述に従って処 理した。人４３１細胞の凍結乾燥コンディションドメディウムを、４Ｉｌｌｌｌ ＩのＩＩｃＩ　５ａｌに再懸濁し、４℃、３．５０ＯＲＰＭで１５分間遠心分離 して不溶物を除去した（　ＲＣ５Ｂ−９ｃｒｖｘ　ｌ　ｌ■ＳＡ　６ＮＯ−ター ）　ｏ　１．５ａｌのマイクロフユージ試験管に上澄を移し、４℃で１５分間、 Ｅｐｐｅａｄｏｒ＋■マイクロフニージで遠心分離した。２８０　ａｍの吸光度 により蛋白質濃度を測定した。その一部、蛋白質６８０μｇを含有する０、２１ を、０．１Ｍの　ｘｍｍｏｎｉａｅ　ｂｉｅｔ＋ｂｏｎ＋ｌｅ　１．８　ｉｆに 加えた。

このサンプルを室温で２時間インキュベートし、凍結乾燥した後、０．０５％の ｔ＋ｉ！ｌｏｏ＋ｏｇｃｅｌｉｃ　５ｃ１ｄ　２　ｍｌに再懸濁した。この物質 （２，０ｍ１）をど、Ｏｍｌ／分の速度で半調製逆相μＢＯＩＩＩＩＡＰＡＫ■ Ｃ１８カラムに注入し、！ｃｃｌｏｎｉｌｏ＋ｉｌｅ　Ｑ％で開始して５０分間 で５０％まで直線的に上昇させて、２．０１画分を捕集した。前述の通り、ミン ク細胞株（ＣＣＬ　６４）　（−０−０−）及びヒト腫瘍細胞株（Ａ５４９）　 Ｉ−△−△−）１こ対する、各両分の１１グラジエントの腫瘍増殖阻止活性を検 定した。２０６　ｎｍにおける吸光度を連続線で示しである。

図２２は、ＤＴＴで処理したＡ４３１コンデインヨンドメデイウムの逆相ＨＰＬ Ｃを表すものである。腫瘍細胞コンディションドメディウム中の腫瘍増殖阻止活 性に対するＤＴＴの影響を調査するため、４　Ｘ　１０８個のＡ４３１細胞（１ ｌｈｌ）から得られた凍結乾燥コンディションドメディウムを、前述の通りに処 理した。Ａ４３１細胞の凍結乾燥コンディションドメディウムを、４ｍＭのＨＣ Ｉ　５ａｌ　に再懸濁し、４℃、３．５１］０１１ＰＭで１５分間遠心分離して 不溶物を除去した（　ＲＣ５Ｂ−５ｏｒｖｉ　ｌ　Ｆ　Ｓ＾６０００−ター）　 ａ　１．５ａｌのマイクロフユージ試験管に上澄を移し、４℃で１５分間、Ｅｐ ｐ！ｎｄｏｒｆ■マイクロフユージで遠心分離した。２８０ｎｍの吸光度により 蛋白質濃度を測定した。その一部、蛋白質６８０μｇを含有する０、２ａｌを、 最終濃度６５ｍＭの［ｌＴＴを含有する０、１Ｍのａｍｉｏｎｉｕｉ　ｂＩｃｌ ｒｂｏｎｇＥｔｌ、８ａｌ　に加えた。このサンプルを室温で２時間インキュベ ートし、凍結乾燥した後、０．０５％のＨｉ！１ｕｏｎｕｃｅｌｉｅ　＊ｃｉｄ 　２　ｍｌに再懸濁した。この物質（１，０ｍ１）を半調製逆相μＢＯＮＤＡＰ ＡＫ■Ｃ１８カラムに注入し、前述の通り直線的グラジェントで開始して、２． ０１画分を捕集し、ミンク肺細胞株（ＣＣＬ　６４）　（−〇　−０−）及びヒ ト腫瘍細胞株（Ａ　５４９）　（−Ｄ−Ｄ−）に対する腫瘍増殖阻止活性を検定 した。２０６　ｎ１１における吸光度を連続線で示しである。

図２３は、細菌内のＴＧＦ−β１ポリペプチド産生に、ｐＡ丁＋１１１及びｐｉ ｓ−１発現ベクターを用いたＩｒｐＢ・＋ＴＧＦ−β１プラスミド構築物の図解 である。

図２４は、Ｐマロ１ｉＰマロＩＩ　ＴＧＦ−ｆｌ　ｃＤＮＡプローブとハイブリ ッド化したヒト腫瘍ＤＮＡの５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析を表すものである 。

ＳＣＣは、標準食塩クエン酸バッファーで、Ｏ，１５ＭのＮｌＣｌ及び０１５Ｍ のクエン酸ナトリウムから成る（ｐＨ７、ｏ）。

図２５は、高ストリンジエンシー洗浄でＴＧＦ−ＩＩ　ｃＤｌｌＡプローブにハ イブリッド化したファージサブクローンの制限地図を表すものである。このクロ ーンは、ＴＧＦ−β１ゲノムの位置に相当する。ファージクローンのＳｕｌ　ｌ −３ｉｔ　ｌ　フラグメントをｐＵＣにサブクローン化した。制限酵素部位の略 語は、Ｓ−３ａｌ　Ｉ　；　Ｋ−Ｋｐｎｌ　；　Ｅ−Ｅｃｏ　Ｒ１；　ＨＪｌｉ ａｄ　ＩＩＩ　；　Ｂ−Ｂｌｍ　Ｆｌｌ　；　８ｇ−Ｂｌｌ　ｆｌを表す。

図２６は、低ストリンジエンシー条件下で、ＴＧＦ−ｆｌ　ｃＤＮＡプローブの みにハイブリッド化したファージサブクローンの制限地図を表すものである。

図２７は、ＴＧＦ−β１及び腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白をコードしている関 連遺伝子のヌクレオチド配列及び予測されるアミノ酸配列の比較を表すものであ る。同一アミノ酸を箱で囲った。

（Ａ）は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白をコードしている遺伝子に相当する。

図２８は、ｐＵＣにサブクーロンした腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコード している関連遺伝子のＢｓｍ　Ｈｌフラグメントの制限地図を表すものである。

リピートフリーフラグメント（Ｂｕ＋ＨＩ−ＴＩＱＩ）の位置を棒線で示しであ る。

図２９は、腫瘍増殖阻止活性を育する蛋白質をコードしている１、７ｋｂのｃＤ ＮＡのヌクレオチド配列の一部とそれに対応するアミノ酸配列を表すものである 。

図３０は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしているＴＧＦ−β１関連 遺伝子の、１．７ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１サブクローンの制限地図を表すものである 。

図３１は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしている遺伝子とＴＧＦ− β１及びＴＧＦ−β２との、ヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列の比較を 表すものである。（Ａ）は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしている 遺伝子に相当する。

図３２は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしている遺伝子のＥｃｏ　 Ｒ１−Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｌ、７　ｋｂ　ｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用 いたＡ６７３、Ａ３４９、Ａ４９Ｂ細胞系のＮｏ＋ｊｈｓ＋ｍ　ｂｌｏｔ分析を 表すものである。

図３３は、ＴＧＦ−β１関連遺伝子ならびに腫瘍増殖阻止活性を冑する蛋白質を コードしている遺伝子のゲノム配列のＰマｖ　ＩＩ−ＴｔｑＩプローブを用いた Ａ６７３、Ａ３４９、Ａ４９８細胞系のＮｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析を表す ものである。

図３４は、Ｐｉｔ　Ｉ−Ｂｔｌ　１丁ＧＦ−βｌプローブを用いるＡ６７３、Ａ ３４９、Ａ４９８細胞系のＮｏ目ｈｓ＋ｎ　ｂｌｏｔ分析を表すものである。

図３５は、ＴＧＦ−β１前駆体の完全な遺伝子コード配列を含むＴＧＦ−βｌ　 ｃＤＮ＾をプローブに用いたＡ６７３、Ａ３４９、Ａ４９８細胞系の！ｉｏ＋ｌ ｈｅ＋ｎ　ｂｌｏｔ分析を表すものである。

図３６は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしている遺伝子のＥｅｏ　 Ｒ１−Ｂｔｌ　Ｉｔ　ｃＤＮ＾フラグメントをプローブに用いた腰帯及びＡ６７ ３細胞系のｍＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析を表すものである。

図３７は、ＳＤＳ　ｐｏｌＨｅＢｒｌ＋ｗｉｄｅゲル電気泳動による溶解産物３ 種の、ｊ＋ｐＢ＋＋ｌｌ瘍増殖阻止活性を有する蛋白質の融合蛋白質の産生を表 すものである。ＦＡ）は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしている遺 伝子に相当する。

図３８は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質の融合蛋白質を認識する抗体のＷｅ ＋ｌｔ＋ｎ　ｂｌｏｔ分析を表すものである。（Ａ）は、腫瘍増殖阻止活性を有 する蛋白質の最後のアミノ酸１５０個に相当するポリペプチド配列を表している 。

図３９は、１ｒｐＢ：：ＴＧＦ−β１融合蛋白質（レーン１及び４）、ｔｒｐＥ ：＋（Ａ）融合蛋白質（レーン２及びレーン５）、ＴＧＦ−βｌ蛋白賀ｆＲ＆　 Ｄ　Ｓ、暮１ｅ＋＋＋から購入）（レーン３及び６）を含み、１２．５％　ＳＤ Ｓ−ｐｏｌＨｃｒＹｒｌｔｍｉｄｔゲルで分離される細菌の全細胞溶解産物を表 すものである。この蛋白質を電気泳動的にｅｉ＋ｏｃｅｌｌｉｌｏｓ！フィルタ ー（ボアのサイズ１μ■）まで移動させ、抗原ペプチド非存在下（レーン１．２ ．３）又はモルの３００倍過剰存在下（レーン４．５．６）で、アフイニテイ精 製した抗ペプチド抗体１００　μｇとインキュベートした。製薬会社の指示に従 って、ヤギの抗ウサギ抗体と結合したｔｌｋｒｌｉｎｓ　ｐｂｏ＋ｐｂｔｊ＊＋ ｔ　（Ｐｒｏｓ＠Ｈ）を使用して抗体を検出した。

図４０は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードして−）るｍＲＮＡの図解 で、コード配列を箱で囲んである。胎盤（１，７Ｋｂ）、腰帯（１，９Ｋｂ）、 Ａ６７３　（１，７Ｋｂ）　ライブラリーカラ得られりｃＤＮＡ挿入の相対的範 囲を示している。箱のダッシュ部分は、ＴＧＦ−β類と高い相同性を示すＣ末端 領域を表して（する。胎盤ｃＤＮＡの５　’　ＥｃｏＲｌ−Ｂｇ　Ｉ　Ｉ制限フ ラグメントを棒線で示して（する。

図４１は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードしてし）るヌクレオチド配 列及び推定されるそのアミノ酸配列を表すものである。仮想上のグリコジル化部 位及びポリアデニル化信号（こ下線を引いた。１１６４位の星印で成熟蛋白の開 始を表した。

図４２は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードして（する遺伝子のヌクレ オチド配列及び予測されるアミノ酸と、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２との比較 を表すものである。同一アミノ酸を箱で囲んだ。成熟アミノ酸配列は３１５位で 開始する。（Ａ）　＋ｔ、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質をコードして（する 遺伝子１こ相当する。

図４３は、腫瘍増殖阻止活性を有する蛋白質コードして０る遺伝子と、丁ＧＦ− β１及びＴＧＦ−β２間の同一性マトリ・ツクスプロットを表すものである。

図４４ハ、ｐＯＲＦＸ及びｐＢｌｏ＋−ＴＧＦ−β３プラスミド番；由来するｐ ｃＭＶ−ＴＧＦ−β３発現プラスミドの構造を図解したものである。

リッド化により測定された、Ｃ）ＩＱ親細胞（レーン１）、ＴＧＦ−β３　ｃＤ Ｎ＾でトランスフェクシヨンしたＣＯＯ細胞（ＣＩＩＯ６，３５）（レーン２） 及び２０　ｎＭ　Ｍｌ！で増殖したＣＩＯ６，３５ｆＣＦＩＯ６ｊ５　／２０　 ｎＭ）　（レーン３）のＴＧＦ−β３　ｍＲＮＡ発現レベルを表すものである。

図４６Ａは、精製ＴＧＦ−β１を使用したミンク細胞増殖阻止の用量反応を表す ものである。ＭＴＴ（３−Ｃ４，５−Ｄｉｉｓｌｈ７１１ｂｉ＊ｚｏｌ−２−７ １］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙ口！ｔｒｔ＋ｏｌｉａｍ　ｂ＋ｏｍｉｄｅ；　Ｔ ｈ１ｚ！ｏ１７１　ｂｌＩｔ）の代謝で細胞増殖を定量した。（ｌｊｏｓｓ＋ｅ ｇｃ、Ｔ、（１９８３）　Ｌ　Ｉｉｍｕｎｏｌ。

Ｍｓ＋ｈｏｄ＋　６５．　５５−６５）。

図４６Ｂは、酸活性化血清を含まない上澄ＣＩＯ６，３５／　２ｈＭ　トランス フェクタント及びＣＨＯ６，３５トランスフエクタントを用−箋たミンク細胞増 殖阻止の用量反応を表すものである。ＭＴＴの代謝で細胞増殖を定量した。

図４７は、抗原に使用された種々のＴＧＦ−β３ペプチドの相対的位置を表すも のである。

図４８Ａは、還元条件下のゲルからの検出にβ３１１１及びβ３ｖ抗体を使用し たＣＨＯ６，３５／　２ｈＭ　）ランスフエクタントのコンディションドメディ ウム（ならし培地）に由来するＴＧＦ−β３のイムノプロットを表すものである 。

図４８Ｂは、非還元条件下のゲルからの検出にβ３１１１及びβ３マ抗体を使用 したＣＨＯ６，３５／　２ｈＭ　トランスフエクタントのコンディシタンドメデ ィウムに由来するＴＧＦ−β３のイムノプロットを表すものである。

図４９は、検出にβ３ｖ抗体を使用したＣＩＯ６，３５／　２ｈＭ　Ｉ・ランス フェクタントの細胞抽出物（４９Ａ）及びコンデイシタンドメデイウム（４９Ｂ ）のＷｅｓｌｃ＋　ｂｌｏｔを表すものである。

図５０は、βＶ抗体による本来の組換え型ＴＧＦ−β３蛋白質の免疫沈降を表す ものである。

図５１は、βＶ抗体（図５１Ａ、　Ｃ）及びコントロール抗体＜　５１８．０） によるヒト腰帯のパラフィン切片の染色を表すものである。

図５２は、精製ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ−β１の銀染色ゲルを表すものである。

図５３は、ミンク細胞増殖のＴＧＦ−β３阻止の抗体中和を表すものである。

発明の詳細な説明 本発明は、１位のアラニンで始まり　１１２位のセリンで終わる図２９に示され る１１２個のアミノ酸を含む腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質を提供する。

好ましくは、このタンパク質は、図２９に示されように１位のアラニンで始まり 　１１２位のセリンで終わる、１１２個のアミノ酸を有する精製タンパク質であ ってよい。この１１２個のアミノ酸を有するタンパク質は、腫瘍増殖阻止活性を 有するタンパク質の成熟形態である。

腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質の生物学的に活性な誘導体も提供され、こ の誘導体は、１位のアラニンで始まり１１２位のセリンで終わる図２９に示され るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。

このタンパク質は、ヌクレオチド２６３位のメチオニンで始まりヌクレオチド１ ４９６位のセリンで終わる図４１に示される４１２個のアミノ酸を含んでもよい 。従って、この４１２個のアミノ酸の配列は、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパ ク質の前駆体配列全体と成熟タンパク質配列全体とを含む。

更に、図４１に示される４１２個のアミノ酸を含むタンパク質の生物学的に活性 な誘導体が提供される。この生物学的に活性な誘導体は、ヌクレオチド２６３位 のメチオニンで始まりヌクレオチド１４９６位のセリンで終わる図４１に示され るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。ヌクレオチド２６６位 のりシンで始まりヌクレオチド１４９６位のセリンで終わる図４１に示される４ １１個のアミノ酸を含むタンパク質が提供される。

更に本発明は、　１位のアラニンで始まり　１１２位のセリンで終わる図２９に 示される１１２個のアミノ酸を含む、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質をコ ードする核酸分子を提供する。この核酸分子は、ヌクレオチド２６３位のメチオ ニンで始まりヌクレオチド１４９６位のセリンで終わる図４１に示されるタン／ ＜り質全体をコードすることが可能である。あるいは、この核酸分子は、１位の アラニンで始まり　１１２位のセリンで終わる図２９に示される機能タンパク質 にある１１２個のアミノ酸だけをコードすることも可能である。これらの核酸分 子はＣＤＮＡかゲノムＤＮＡかｍＲＮＡであることが可能であり、１位のシトシ ンで始まり２５２９位のグアニンで終わる図４１に示されるヌクレオチド配列全 体を含んでもよく、又は、　１位のコドンのグアニンで始まり１１２位のコドン のシトシンで終わる図２９に示される成熟タン、＜り質の１１２個のアミノ酸の 配列を含むだけでもよい。

特定のアミノ酸とこれらのアミノ酸をコードする核酸とが変更されてもよく、従 って、そのタンパク質の機能を変化させることなく、例えば変異体のような、そ の生物学的に活性な誘導体を生じさせることが可能であることは、当巣者には明 白だろう。本発明は、機能タンパク質を生じさせるアミノ酸と核酸配列の全ての 変形を包含する。

更に本発明は、本発明の核酸分子を含むプラスミドと、適切な宿主細胞内に前記 プラスミドを有する宿主−ベクター系とを提供する。この宿主−ベクター系は、 本発明のタンノくり質を生産するのに適した、当業で公知のいずれかのプラスミ ドとベクターとを含む。適切な宿主細胞は、細菌細胞か真核細胞であってよい。

更に本発明は、本発明の宿主−ベクター系を増殖して腫瘍増殖阻止活性を有する タンパク質を宿主内で産生させ、このようにして産生されたタンパク質を回収す ることから成るタン１＜り質の生産方法を提供する。

これに加えて、本発明は、腫瘍増殖阻止活性を有するタン／々り質から得られる ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、９位のアルギニンで始まり２８ 位のロイシンで終わる図２９に示される２０個のアミノ酸を含む。更に本発明は 、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質に含まれるエピトープに特異的に結合す る抗体を提供する。この抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであっ てもよい。

本発明は、　９位のアルギニンで始まり２８位のロイシンで終わる図２９に示さ れる２０個のアミノ酸を含むポリペプチドに含まれるエピトープに特異的に結合 する抗体も提供する。この抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであ ってもよい。

腫瘍を診断する方法も、本発明において提供される。この方法は、対象者の試料 を本発明の抗体と適切な条件下で接触させ、タンパク質に含まれるエピトープと 抗体との間に複合体を形成し、こうして形成された複合体を検出し、これによっ て腫瘍を診断することから成る。尚、本出願人は、上記の術語「適切な条件」が 、当業で公知である複合体形成を可能にするいずれの条件をも意味することを意 図している。

本発明は、本発明の抗体と医薬的に許容し得るキャリアとを含む医薬組成物を提 供する。医薬的に許容し得るキャリアは、当業で公知の全てのキャリアを含む。

このキャリアの非限定的な一例は、生理的食塩水である。

更に本発明は、有効腫瘍治療量の前記医薬組成物を対象に投与することから成る 、腫瘍治療方法を提供する。更に本発明は、有効増殖型疾患治療量の前記医薬組 成物を対象に投与することを含む、増殖型疾患の治療方法を提供する。こうした 医薬組成物は、様々な増殖型疾患を治療するために使用することが可能である。

こうした医薬組成物が有効であり得る増殖型疾患の例には、動脈硬化症、炎症、 乾癖がある。

腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質は、適切な医薬キャリアと共に腫瘍増殖阻 止活性を有するタンパク質又はその生物学的に活性な誘導体を有効量含む医薬組 成物の形で、使用することも可能である。この有効量は、治療されるべき微候や 患者や腫瘍進行の段階に応じて、当業者に公知の方法を用いて、様々な腫瘍増殖 阻止剤の間で変化させてよい。同様に、生理食塩水や他の水溶液やゲルやクリー ムやその類似物のような適切なキャリアが、当業者に公知である。

こうした腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質は、例えば癌腫細胞や黒色腫細胞 や白血病細胞のようなヒト腫瘍細胞を、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質を 有効腫瘍阻止量含む医薬組成物と接触させることによって、該細胞の増殖を阻止 する方法に使用することが可能である。こうした腫瘍増殖阻止活性を有するタン パク質は、腫瘍増殖阻止活性を有する有効量のタンパク質と適切な医薬キャリア とを含む医薬組成物を火傷（やけど）や創傷に接触させることによって、火傷を 治療し、創傷の治癒を促進するための方法に使用することも可能であ゛る。

更に本発明は、１位のアラニンで始まり　１１２位のセリンで終わる図２゛９に 示される１１２個のアミノ酸を含む腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質を適切 な医薬キャリア中に含む、増殖型疾患の治療に有効な組成物を、対象に有効量だ け投与することを含む、対象の増殖型疾患の治療方法をも提供する。様々な増殖 型−患を、本発明のタンパク質を使用して治療することが可能である。増殖型疾 患の例には、動脈硬化症、炎症、乾癖がある。

更に、本発明の様々なタンパク質は、免疫モジュレータ−としても使用可能であ る。

本発明によって、図４１に示される４１２個のアミノ酸を含むタンパク質又はそ の生物学的に活性な誘導体を有効量、適切な医薬キャリア中に含む医薬組成物も 提供される。この医薬組成物は、ヒト腫瘍細胞の増殖阻止方法に使用することが 可能である。

この方法は、腫瘍増殖阻止有効量の前記医薬組成物に該細胞を接触させることか ら成る。

前記４１２個のアミノ酸を有するタンパク質を含む医薬組成物を用いて増殖型疾 患を治療する方法が開示される。この方法は、ることから成る。

更に、前記４１２個のアミノ酸を有するタンパク質を含む医薬組成物は、火傷の 治療や創傷の治癒のための方法にも使用できる。この方法は、有効量の前記医薬 組成物と火傷や創傷とを接触させることから成る。

更に、腫瘍の存在の検出方法が開示される。この検出方法は、例えば血液や羊水 や腹膜液や腹水や脳を髄液や尿のような一体から得られた試料中に存在する、腫 瘍増殖阻止活性を冑するタンパク質の量を定量的に決定し、この決定された量を 、正常な検体から得られた試料中に存在する前記タンパク質の量と比較し、有意 の差の存在、例えば、有意に多い量の存在が、腫瘍の存在を示すものであること から成る。

腫瘍の存在を検出するための別の方法も開示される。この方法は、検体からの試 料中に存在する腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質の量及び形質転換成長因子 α　（ＴＧＦ−α）の量の両方を別個に定量的に決定し、検体からの前記試料中 に存在するＴＧＦ−αの量に対する、前記試料中に存在する腫瘍増殖阻止活性を 有するタンパク質の量の比を決定し、前記試料中に存在する腫瘍増殖阻止活性を 有するタンパク質の量の比を決定し、正常な検体からの試料における相当する比 をめ、検体からの試料の場合の比を、正常な検体からの試料の場合の比を比較し て、比が有意に変動することが腫瘍の存在を示すものであることから成る。

腫瘍のタイプ分類（タイピング）のための方法が開示され、この方法は、腫瘍を 有する検体からの試料に関して、その試料中に存在するＴＧＩ−１、ＴＧＩ　、 　ＴＧＩ−２、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質、Ｃｌ１、又は＾４３１細 胞のコンディシジンドメディア（ｃｏｎｄｉ目ｏｎｅｄ　ｍｔｄｉｉｌ　から回 収可能なポリペプチドの各々の量を決定し、これらの量における特異的量又は相 対的量の存在（例えば、ＴＧＩ量の有意の増大、比ｒＴＧＩ−１：　ＣＭ−ＩＪ のような比の有意の変化）が、特定の腫瘍の型を示すものであることから成る。

更に本発明は、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質又はその生物学的に活性な 断片の（例えば免疫反応抑制活性のような）活性を阻害する方法を提供し、この 方法は、１位のアラニンで始まり　１１２位のセリンで終わる図２９に示される １１２個のアミノ酸を含む腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質に含まれるエピ トープに対して特異的に結合する抗体の有効量に、細胞を接触させることをから 成る。

最後に、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質又はその生物学的に活性な断片の （例えば免疫反応抑制活性のような）活性を阻害する別の方法が開示される。こ の方法は、９位のアルギニンで始まり２８位のロイシンで終わる図２９に示され る２０個のアミノ酸を育するポリペプチドに含まれるエピトープに対して特異的 に結合する抗体の有効量に、細胞を接触させることから成る。

本発明が、以下の「実験の詳説」の節で例証される。この節は単に本発明の理解 を補助するためにだけ示されるのであって、後述の請求項で明示される本発明に 対して、いかなる限定も与える意図はなく、本発明を限定するものと解釈されて はならない。

更に本発明はＴＧＦ−β３を産生ずる方法を提供し、この方法は、ａ）ヌクレオ チド２６３で始まりヌクレオチド１４９８で終わる図４！に示されるヌクレオチ ド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、且つ、丁ＧＦ−β３の前駆体 をコードするＤＮＡを調製し、ｂ）こうして調製されたＤＮＡを、発現ベクター 内に、適当なプロモーターに関して、適当な宿主細胞内で該ＤＮＡの発現を可能 にするような位置で挿入し、 Ｃ）前記ＤＮＡの発現を可能にする条件下で、前記発現ベクターによって前記宿 主細胞を形質転換し、 ｄ）前記ＤＮＡが発現させられ、ＴＧＦ−β３前駆体が産生され、そのように産 生されたＴＧＦ−β３前駆体が培地の中に分泌されるような条件下で、前記形質 転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、 り活性化剤で、分泌されたｒＧＦ−β３前駆体を含む前記培地を処理し、前記↑ ＧＦ−β３前駆体をＴＧＦ−β３に転換し、ｆ）こうして産生されたＴＧＦ−β ３を回収することから成る。

上記の方法は、真核生物の宿主細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞に対して使用す ることが特に意図されている。現在は、例えばＤＨＦＲ−Ｃｌｌ０細胞のような ＣＨＯ細胞が特に好ましい。

この方法の実施には、当業者に公知の様々なプロモーターが使用できる。現在、 その好ましいプロモーターは、例えばｄｈｆｒ遺伝子に関連したプロモーターの ような誘導可能プロモーターである。

最後に、丁ＧＦ−β３前駆体を成熟ＴＧＦ−β３に転換するために、酸のような 活性化剤が使用される。当業者は、活性化剤として使用可能なタイプの酸を容易 に認識するだろう。

実験の詳細 ４つの組の実験を以下で説明する。各々の一連の実験は、腫瘍増殖阻止活性を示 すタンパク質を単離する方法を含んでいる。

第１の一連の実験では、腫瘍増殖阻止活性を示す６つの別々のタンパク質が精製 された。これらのタンパク質は、ＴＧＩ　、ＴＧＩ−１、ＴＧＩ−２、ＣＭ　１ 〜＋Ｖと呼ばれた。第２と箪３の一連の実験では精製方法が改善され、その結果 として、腫瘍増殖阻止活性を育するタンパク質がより一層精製された形で得られ た。第４の一連の実験では、ＴＧＦ−βｌがクローンされ、腫瘍層Ｗ阻止活性を 有するタンパク質をコードする関連遺伝子を単離するために使用された。丁ＧＩ Ｉ　とＴＧＩ−２のどちらが腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質に対応するか は未だ確定されていないが、この対応の正確な性質がまだ明らかではないものの 、そうした対応が存在するということは当業者には理解できるだろう。

第１の一連の実験 材料と方法 組織抽出物からの組織由来腫瘍増殖阻止剤ｆＴＧＩ）の単離Ｄｘｙｏ＋Ｉ他（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ＋、＾ｃ１１．６３：１５０　（１９６２））と Ｒｏｖｅ＋１＋他（Ｐ＋ｏｃ、　Ｎｔｌｌ、＾ζ＊ｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、７７： ３４９４　（ＩＨＯＩ）による酸／エタノール抽出法の変形方法を使用して、ヒ トのへその緒又は胎盤細胞を抽出した。

この抽出のための緩衝液は、４℃において１９２１の蒸留水と混合した、３７５ １の９５％（マ／ｖ）エタノール（厳密、１９Ｇプローフ、Ｕ、Ｓ、１ｎｄｕｓ ＋＋目Ｉ　Ｃｈｅｍｉｅａｌｌ、ｔＵＮＩＩ７０）と、７．５１の濃ＨＣ１と、 ３３ｒｎｘのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ＞（Ｓｉｎｇ　Ｐ−７ ６２７１と、１ＩＩｌのＡｐｒｏｆｉｎｉｎ　（０，９％のＮｌＣｌと０．９％ のベンジルアルコール中の、１１当たり１９８個のトリプシンインヒビターユニ ットを含むＳｉｇｍａ　Ａ６［１１２）　とから成る。４００〜６００ｇの凍結 したヒトのへその緒又は胎盤（＾ｄ１ａｃ！ｄＢｉｏｌｃｃｈｎｏｌｏｇｉ＋＋ ）　（−８０℃で貯Ｍ）を、６時間かけて４℃で解凍した。この解凍した組織を 、４℃に冷やしたＣｏ口ｉｎ＊＋１　フードプロセッサー（Ｍｏｄｅｌ　ＤＬＣ −７−ＰＲＯ）の中に入れ、４℃の抽出緩衝液２００１中に懸濁させた。この＠ 濁した組織をフードプロセッサーで均一化した。均一化を開始して１分後に、こ の懸濁液がクリーム色がかった白色になった。更に別の４℃の抽出緩衝液２００ １を、この白色懸濁液に加えた。懸濁液が濃い暗茶色に変化した。この組織懸濁 液を４℃で合計１０分間に亙って均一化した。組織ホモジネート１ｇ当たり６１ の最終体積となるまで、この均一化した組織混合物に抽出緩衝液を加えた。

この均一化した組織懸濁液を、３インチの撹拌棒を備えた大型　４１　ビーカー に移し、Ｌｓｂ−１ｉｎｅ　ＬＩｌｉｍ＊Ｈｓｓｌｉｒ　ｍｕＨｉ−ｍｉｔｅｒ 、　Ｍｏｄｅｌ　Ｎ２７Ｂの最大攪拌能力の半分で攪拌した。４℃における攪拌 を伴った夜通しの抽出の後に、そのホモジネートを１１遠心分離ボトル（Ｓｏｒ ｗｌｌ）に移し、Ｓｏｒｗ＊ｌｌ　Ｈ−６０００Ａ　Ｏ−ターを備えたＳｏ＋マ ｔｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離機内で、４℃において３０分間に亙って３５０Ｏｒ ｐｍ　（ＲＣＦ＝３５０）で遠心分離した。その上澄み液を大型４１ビーカーに 移し、濃水酸化アンモニウムを緩慢に加えることによってＰＨ５，０に調整した 。９＋１が増大するにつれて、上澄み液の色が茶色からオレンジ色の溶液に変化 した。この溶液を体積全体に対し１％の量の、２．ＯＭの酢酸アンモニウム（ｐ Ｈ，５，２）を加えることによって、沈殿させた。この沈殿物を、４℃において Ｓｏ＋ｗｔｌｌ　ＲＣ−３Ｂ内で４時間に互って４５０Ｏｒｐｍ　（ＲＣＦ・５ ９００）で遠心分離することによって、除去した。その上澄み液を大型６１フラ スコに移し、このフラスコに４体積の無水エーテル（−２０℃）　（Ｂ’７ｋｅ ｒ　９２４４−３）　と２体積の９５％エタノール（４℃）を加えた。生じた沈 殿物を沈降させるために、その混合物を４８時間に亙って一２２℃で静置した。

４８時間の沈殿が終わりに、そのエーテル化した材料を換気フード（’ｌａ’ｍ ！ｈＯｏｄｊ内で周囲温度にした。酸性化エタノール抽出物を周囲温度に加温す ることによって、その沈殿物の凝集を促進させた。エーテルとエタノールの透明 な有機相を水アスピレータで取り除き、残留有機相を蒸発させるために沈殿物を 換気フード内に数時間放置した。その「乾燥」沈殿物を１．０Ｍ酢酸中に溶解し 、３５００の分子カットオフを有する透析膜（Ｓｐｒｃ＋ｒｏｐｏｒ　３．　５ ｐｒｃ＋ｒｏｍ　Ｍｅｄｉｃｌｌ　１ｎｄｕ＋ｔ＋ｉｔ＋、Ｌｏｓ　人ｎｇｅｌ ｅｓ。

ＣＡＩ　を使用して、１．０Ｍ酢酸（Ｂｘｋｅ＋　１９５０７−５）に対して十 分に透析した。この透析された酸性化エタノール抽出物を、２５０１Ｃｏ＋ｎｉ Ｂコニ力ル遠心分離管（Ｃｏｉｎｉｎｇ　２５３５０）内で凍結乾燥し、未精製 酸性化エタノール抽出物として貯蔵した。

酸性化エタノール抽出物からＴＧ＋を沈殿させるための別の方法では、４体積の エーテルと２体積のエタノールの添加の代りに、２体積のエタノール（４℃）だ けを添加する。酸性化エタノ多量である場合にその処理方法とその処理の規模拡 大とを困難なものにする引火性の高い溶媒の使用を必要とする段階が取り除かれ るということであった。

ゲル濾過クロマトグラフィー 凍結乾燥された未精製酸性化エタノール抽出物を、１．０Ｍ酢酸（ｆｉｌ　〜３ ０　ａｔ／ｍｌ）中に再懸濁させ、５ｏｒｖ＊ＩＩ　Ｈ−６ＧＯＯＡ　Ｏ−ター を備えた５ｏｔ７Ｊｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離機内で４℃において３０分間に亙 って３５００＋ｐｍで遠心分離することによって清澄化してから、サンプルをカ ラムに加えた。ＩＮ　−１５０ｍｌのサンプル体積を、２３℃又は４℃の１．０ Ｍ酢酸中のＢｌｏ−Ｇｅ１　（登録商標）ＰＩＧ。

１００〜２００メツシユ（Ｂｉｏ−Ｒｉｄ；１５０〜１０４Ｇ）上でクロマトグ ラフィーにかけた。

そのカラム（１４Ｘ　１ＧＧ　ｃｍ）　（Ａｍｉｃｏｎ；　Ｌ８６０１２）は、 ２３℃又は４℃の１．０Ｍ酢酸中の平衡化され且つ脱ガスされたｆｌｉｏ−Ｇｔ ｌ　（登録商標）Ｐｌｏを、】３．８！含んだ。１，０Ｍ酢酸中に２．０　Ｂ／ ｍｌの濃度で５０１の青色デキストランｆＳｉｇｎｓ　番Ｄ５７Ｓｌ）を加える ことによって、その空隙容量を測定した。検度ｆＣｓｌｉｂｒｓｌｉｏｎ）後に 、１，０Ｍ酢酸中の１００　＋ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａｔ Ａ−４５０３１を１００ｍ１使用して、そのカラムを「コンディショニング」し 、その後で１．０Ｍ酢酸を用いて十分に洗浄した。

サンプルをカラムに加えた後に、Ｃタイプの補集ラック（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 　＋ｘｅｋ）を備えた５ａｐｅ＋ＲＩｃ　（登録商標）　（ＬＫＢ　２２＋１） を使用して、１１の分画を７１／分の流量でプラスチック製の２１の組織培養回 転管（Ｆｇｌｅｏｎ；３２０７）の中に集めた。分画を、２．０ＡＵＰＳの吸光 度範囲に設定された２８０１のＵｗｉｃｏｒｄ　（登録商標）　５（ＬＫＢ　２ １３８）によってモニターし、単一チャンネルチャートレコーダー［５ｉＢｌｅ 　ｃｂａｎｎｓｌ　ｃｈａｒｔ　Ｔｔｔｏｒｄｅｒ）　（ＬＫＢ２２１０）によ って記録した。１１のアリコートを各々の分画から取り出して凍結乾燥し、下記 のように腫瘍増殖阻止活性に関して評価分析した。各々の分画の残分を、Ｖｉ口 ｉｔ　ｔ＋ｅｔｓｚ−ｍｏｄｔｌ　２４を使用して、２１凍結乾燥ジａｒ−（Ｖ ｉｓｉｔ　（登録商標）　＄６５０３−２０５０）内で凍結乾燥した。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）！１ｉｏ−Ｇｅｌ　（登録商標’）　 Ｐ−１０カラムから得たＴＧＩ活性を有する個々の分画を凍結乾燥し、各々の分 画中のタンパク質の量に応じてｌ〜ｌｏｍｌの０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｐ ｉｔｒｃｔ　＄２８９０１）中に再懸濁させた。）ＩＰＬＣのために使用する水 を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製システムを使用して生成した。全ての［！ＰＬＣクロ マトグラフィー操作における開始緩衝液は、０．０５％のＴＦＡを含むＭｉｌｌ ｉ−Ｑ水から成った。サンプルの注入の前に、そのサンプルから不溶性材料を取 り除くために、ＢｅｃｋＩｎｘｎ卓上遠心分離機（Ｂｅｃｋ旧ｎ丁］−６）内で ３ＮＯ＋ｐｍで２０分間にサンプルを遠心分離した。上澄み液を、個々の実験に 応じて、Ｌｅｅ口ａＢｏｎｄｔｐｇｋ　（登録商標）分析用Ｃ１８カラム（０， ３９Ｘ　３０ｅｍ）　（Ｌｔ…ＰＮ２７３２４）又は半予備カラム（ｉｅｍｉｐ ＋ｅｐｇ＋＊ｔｉｗｅ　ｃｏｌｕｍｎ）　（０，７８Ｘ　３０ｃｍ）　（Ｗ＊ｌ ｅｒ＋ＰＮ８４１７６）のいずれかに注入した。カラム溶離のためにｕｔｔｅｒ ｓ勾配溶離自動制御装置（＊ｏｊｏｍ＊ｔｅｄ　ｇｒｔｄｉｔｌ　ｃｏｎｌ＋ｏ ｌｌ！＋）　（ＷａｌｓｒｓＭｏｄｔｌ　５１０）を使用し、２０６ｕｅに設定 された可変波長［ＩＶ検出器［ｔ＊ｒｉｔｂｌｅ　ｖＩｙｅｌｅＢｌｈ　ｕ、ｔ 、ｄｅｔｃｃｆｏｒ）　（Ｗｔｊｅｒｓ　Ｌ＊ｍｂｄ畠−Ｍｓｘ。

Ｍｏｄｔｌ　４８１）によってカラム溶離を監視した。溶離のために使用した溶 媒は、０．０５％のＴＦＡを含むアセトニトリル（Ｂ＊に！ｒ　９０１７−３） 又は２−プロパツール（Ｆｉｓｈｅｒ、　Ａ４５２）のどちらかだった。Ｂタイ プの補集ラックを備えた５ａｐｔ＋Ｒ＊ｃ　（登録商標’）　（ＬＫＢ　２２１ １）を使用して、分画をケイ素化試験管（＋１ｌｉｃｏｎｉ＋ｔｄ　ｊｅｓｔ　 ｌ＋＋ｂｅ）［Ｐｉｅｒｃｅ、　Ａｑｉｓｔｉｌ　Ｎ２７９９）　（１３Ｘ　１ ００ｍｓ又はｔａｘ　１００ｍｓ）の中に捕集した。各々の捕集分画からのアリ コートを、下記のように腫瘍増殖阻止活性に関して評価分析した。

イオン交換クロマトグラフィー 酸性化エタノール／エーテル抽出物からの凍結乾燥材料と、１１ｉｏ−Ｇｓｌ　 （登録商標）　Ｐ−１０ゲル濾過クロマトグラフイーから得られた凍結乾燥した 様々な分画との両方に対して、別々にイオン交換クロマトグラフィーを行った。

これらの操作では、　ＣＭとＳＰとＤＥＡＥ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ　（登録商標 ）　（ＬＫＢ＞イオン交換樹脂とを使用した。クロマトグラフィー用のサンプル を、１．０１１酢酸中で約２０ｍｔ／ｍｌの最終濃度になるまで希釈した。これ らのサンプルを、そのｐＨと伝導率が開始（平衡化）緩衝液と等しくなるまで４ ℃で透析した。こうしたイオン交換クロマトグラフィーの操作は全て４℃で行わ れた。

これらの樹脂の各々を、水性懸濁液として、ｌ、Ｑ　１ｌｌＮ＊ＣＩを含む同一 の体積の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐ［Ｉ４）中に懸濁させた。

各々の樹脂を３時間以上に亙って平衡させ、４℃で脱ガスした。

２０　ｍｌの樹脂を１．６Ｘ２０ｃｍのカラム（Ｐｈ＊ｒｍ＊Ｃ目；　＄１９− ０３６２−０１）の中に充填し、２力ラム体積の１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐ Ｈ４，０）とそれに続いてＬＯＩＭ　酢酸アンモニウムｌｐＨ４，１１）　とを 使用して洗浄した。その流出液の伝導率が平衡化緩衝液（即ち、Ｏ，０１Ｍ酢酸 アンモニウム、Ｆｉｓｂ＊ｒＡ６３７）　（ｐＨ４，０）の伝導率に正確に一致 するまで、カラムを洗浄した。サンプルを１１７分の流量で前記樹脂に加え（１ １／２０　ｍｌ樹脂）、その光学濃度が水平化する（例えばゼロ光学濃度に近接 する）まで平衡化緩衝液で洗浄し、濃度０．０１〜１．ＧＭの酢酸アンモニウム （ｐＨ４，Ｏ）のカラムフローアダプターを通して、２００　ｍｌの上昇モル濃 度直線勾配（Ｐｈ１ｒｓｔｃ目勾配ミキサー（ｌｒ＊ｄｉｅ＋ｌ　ｍ１ｘｅｒ） 　ＧＭ−１，審１９−０４９５−Ｏｆ）を加えた。幾つかの実験では、第２の勾 配を同じカラムに加えた。この第２の勾配の範囲は、１．０Ｍ酢酸アンモニウム （ｐＨ４，Ｏ）から１．０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，０）中の５０％アセト ニトリルまでだった。２１の分画を、Ａタイプの補集ラックを備えた５ｏｐｅｒ Ｒｘｅ　（登録商標）　Ｆｒｔｃ目ｏｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（ＬＫＢ　２２１ １１　内の、ポリスチレン管［Ｎ　Ｘｌ［１０ｍｍ１　（ＣｏｌｕｍｂｉＩＤｉ ＢｎｏＮｉｃ＋　；　Ｂ２５６４）の中に捕集した。こうしたカラムクロマトグ ラフィーは全て、２８０ａ＋ｅ　フィルターを有するＵｗｉｃｏｒｄ　Ｓ　（Ｌ ＫＢ　２Ｎ８）と単一チャンネルレコーダーｆＬＫＢ　２００）とを使用して行 った。分画を光学濃度に従って１００υ１〜１１の範囲で区分けし、腫瘍増殖阻 止活性に関して評価分析した。

ｂ、　ＤＥＡＥ−丁ＲＩＳＡＣＲＹＬを使用するクロマトグラフィーＣト及びと ＳＰ−丁ＲＩＳＡＣＲＹＬ　（登録商標）クロマトグラフィーに関して説明され たものと全く同じに、クロマトグラフィー樹脂の調製とクロマトグラフィー手順 とを行ったが。ただし、使用する平衡化緩衝液が１１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ ６，０）であり、勾配溶離が０．１Ｍ〜１．０Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ６， ０）の範囲内に及び、且つ、サンプルが上記の平衡化緩衝液中で平衡化さ腫瘍増 殖阻害活性に関する単分子層検定１０％ウシ胎仔血清（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ 、Ａ。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　１４−５０１Ｂ）、２％Ｌ−グルタミ　ン　（Ｗｈｉ ｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ１７−６０５−Ａ）、１％ペニ シリン及び１％ストレプトマイシンを含有する５０μｍのＤｕｌｂｅｃｃｏの修 正したＥａｇｌｅ培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　１２−６１４３）中で、９６ウニル組織培養プレート 上で、試験細胞を継代培養した。ヒト肺癌細胞、Ａ３４９、及び正常ヒト繊維芽 細胞（ＨｕＦ）は、１ウエル当たり５ｘ１０３細胞の播種密度を要した。ミンク 細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ　６４）は４．５ｘｌＯ３細胞／ウエルの播種密度を要 した。

腫瘍増殖阻害活性に関して検定すべきカラム分画からのアリコートを、１Ｍ酢酸 に溶解したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ　Ａ−６００３）の１ｍｇ ／ｍｌ溶液５０μｌを含有する滅菌１２ｘ７５ｍｍ試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０ ５８）に移し、凍結乾燥した。検定直前に、凍結乾燥した試料を、試験される各 細胞型に対して、４００μｍ中に再懸濁した。再懸濁試料の１００μｍアリコー トを、試験細胞を含有するウェルに添加した。各試料を、３通りに検定した。細 胞を、５％Ｃｏ２／９５％空気の増湿化雰囲気中で３７℃で７２時間、インキュ ベートした。インキニベーシタン期間終了時に、各ウェルに、１　ｕ　Ｃｉ　／ 　ｍ　ｌの５−　［工２５ＩＦヨードー２゛デオキシウリジン（１２５１ＵｄＲ ）（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ；ＮＥＸ−０７２）を含有する１０ ０μｍの完全培地を入れて、２４時間おいた。単分子層を洗浄緩衝液Ａ（Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏの燐酸塩緩衝化塩水、１０ｍＭＭｇＣ１２を有し、１ｍｇ／ｍｌ　Ｂ ＳＡ含有、ｐＨ６，８）で１回洗浄し、メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ　Ａ４５２） 中で１０分′間一定し、１５分間空気乾燥した。細胞に取り込まれた”　Ｉ　Ｕ 　ｄ　Ｒを２００μｍのｌ　ＯＮ　ＮａＯＨで可溶化し、ｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ ■（Ｓｋａ、ｔｒｏｎ　Ｉｎｃ、。

７０７２）を用いて、可溶化”ＩＵｄＲを置薬した。細胞増殖量゛は、増殖の対 数期に細胞のＤＮＡに取り込まれた１２５ＩＵｄ玉の程度で概算した。検定結果 を出す前に、細胞増殖の量を肉眼的に見るためにＺｅｉｓｓ■の倒立顕微鏡を用 いて各ウェルを観察した。増殖の阻害又は刺激は、未処理対照細胞に取り込まれ た　１２５ＩＵｄＲに対する試験アリコートを含有する試験細胞（例えば、ヒト 腫瘍細胞）に取り込まれた１２５１　Ｕ　ｄ　Ｒの割合として表わした。処理細 胞の顕微鏡観察によって観察された阻害又は刺激は、それぞれ１２５１　Ｕ　ｄ 　Ｒの取り込みの減少又は増化と良く対応した。

ＴＧＩ活性の特性付け ａ、熱処理 Ｂｉｏ−Ｇｅｔ＠　Ｐ−１０上でのゲル濾過クロマトグラフ。

イーから得られた分画２．４Ｊ及び６からのアリコート１　ｍ　ｊを１２ｘ７５ ｍｍポリスチレン試験管（Ｆａｌｃｏｎ２０３４）中で凍結乾燥し、１．０Ｍ酢 酸中に再懸濁した。試料を沸騰水浴中で３４間過熱し、凍結乾燥して、上記のよ うに腫瘍増殖阻害活性に関して検定した。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動各クロマトグラフィー手順から 得られた試料からのアリコートを電気泳動用に凍結乾燥した。試料を、Ｏ，１Ｍ トリス−ＨＣ１（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、；Ｔ−１５０３）、ｐＨ６，８，１５％グリ セロール（Ｋｏｄａｋ；１１４−９９３９）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　；　１１６−０３０２）、及び５％　２−メルカプト エタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１６１−０７１０）を含有する８０μｍの試料緩 衝液で希釈し、本質的に上記のように５〜２０％アクリルアミド直線勾配上で電 気泳動した（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、Ｕ、Ｋ１１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２２７．８ ８０−６８５）ｏ試料を２分間沸騰させ、その後９℃で４時間、３０ｍＡ／ゲル の定電流（Ｈｏｅｆｆｅｒ電源；ｐｓ　１２００ＤＣ）下で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　 Ｍｏｄｅｌ　１５５　ＶｅｒｔｉｃａｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｃｅ １ｌ　（Ｂｉｏ　−■ Ｒａｄ　１６５−１４２０）中の１．５ｍｍ幅ノスラブゲルに適用した。水浴循 環器（Ｈａａｋｅ、Ａ３１）によって一定温度を維持した。ゲルを５．７％酢酸 及び４７％メタノール中に溶解した０、５％クマシーブルー　Ｒ２５０（Ｂｉｏ −Ｒａｄ　＃１６−０４００）で−晩染色し、染料を含まない同一溶液中で色抜 きした。低濃度の蛋白質を明示する特定のゲルをＭｅｒｒｉｌによる記載のよう に銀法によって再染色した（Ｍｅｒｒｉｌ、Ｃ，Ｒ，、Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｄ、。

Ｓｅｄｍａｎ、Ｓ、ａｎｄ　Ｅｂｅｒｔ、Ｍ、Ｈ，（１９８１）２１１　：　１ ４３７−１４３８）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　銀染色キット　；＃１６１−０４４３） 　。

結果 室温及び４℃でのＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−１０上でのゲル濾過クロマトグラフィー による腫瘍増殖阻害活性の比較増殖阻害活性は、５．０００−１６．０００ダル トンの範囲の見かけの分子量を有するＢｌｏ−Ｇｅ１■　Ｐ−１０樹脂を用いる ゲル減退クロマトグラフィーによって溶離されるヒト腰帯の酸性化エタノール抽 出物から得た。時々、活性の別のピークが３０００〜５０００ダルトンの範囲の 分子量で観察された。

分子量の計算は、４　ｘ　１００　ｃ　ｍのカラム中の１リツトルの樹脂上でク ロマトグラフィー処理される分子量基準（即ち、カルボニックアンヒドラーゼ　 −２９，０００，ＲＮアーゼ−１４，４００，インシュリン　−６，０００）の 溶離プロフィールを基礎とする。そのカラム由来、及び大型の１４ｘ１００ｃｍ カラム由来の溶離プロフィールは重ね合わせ可能であった。同様にクロマトグラ フィー処理したヒト胎盤からの酸性化エタノール抽出物は、腰帯抽出物と非常に よく似た溶離プロフィールを示した。

暦帯酸性化エタノール抽出物からの分ｌｉ１〜３は、非常に濃い褐色である；そ の色は、分画が進展すると次箪に消える。幸いにも、（ＴＧＩ）は最高蛋白質濃 度を含有する分画工、２、及び３では溶離したけれども、活性の大多数は、図１ 及び２に明瞭に示されているように、観察された蛋白質ピークを通り越して延び る。ヒト胎盤物質からの抽出物は、ヒト済帯からの物質で観察されたものより大 きな主要蛋白質ピークに関するＴＧＩのオーバーラツプを示した（データは示さ れていない）。

５〜２０％ポリアクリルアミド勾配上での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動され たゲル濾過クロマトグラフィーからの同一容積の７リコートは、分１ｉ４により 、分−１〜３の場合よりかなり低い蛋白質が見出されることを実証する。分画５ 及び６においては、５．６００及び１４，０００の主要蛋白質領域が観察され、 分画７では、非常に少ない蛋白質が残存するが、しかしながら阻害活性は、図２ に示すように、分画１０に延びている。

低蛋白賀領域で溶離する大多数の活性の明白な利点は、それがＴＧＩの精製をさ らに促進することである。

１！１１及び２にそれぞれ示される室温及び４℃で実施したＢｌｏ−Ｇｅ１＠Ｐ −１０クロマトグラムを比較すると、阻害活性は４℃でより良好に保存されるこ とが明らかに示されている。２３℃では、活性は分画６を過ぎると観察されず（ 図１）、一方４℃では、活性は４以上の分画〜分画１０に延びている。

最も重要なことは、抽出物を４℃でクロマトグラフィー処理した場合、回収され る活性の正味量が少なくとも２倍以上であることである。というのも、８０％又 はそれ以上の腫瘍増殖阻害活性は４℃では７分画で（図２）、２３℃では３分画 のみで得られるからである。これは分画３（２３℃）で溶離する同量の活性の濃 度によるものではなく、むしろ分画７（４℃）に広がっているが、しかし腫瘍増 殖阻害活性の産生の実際的増化によることは明らかである。両力ラムから得られ る分画５の１　ｍ　］アリコツーを別々に、及びこれらの分画の１１５〜１／１ ２５希釈物を、ヒト肺腺癌（Ａ５４９）及びミンク締固ＩＩ（ＣＣＬ６４）の両 方で試験した（表１）。未希釈分画の腫瘍増殖阻害活性は、４℃でのクロマトグ ラフィー処理で得られた分ｍ５においては２倍高かうた。さらに、４℃でのクロ マトグラフィー処理により得られた分ｍｓの２５倍希釈物は、ヒト腫瘍細胞系に 対する最大腫瘍増殖阻害活性を産生じ続けた。２３℃でのクロマトグラフィー処 理による等価希釈の分画は、検出可能な活性を示さなかった。同様の観察は、ミ ンク細胞系に関してはなされなかうた。この情報は図１及び２で観察された活性 に基づくものではなく、それぞれの５番目の分画において等価のＴＧＩ活性を示 した２つの別々のカラムからのものであった。

正常ヒト繊維芽細胞（ＨｕＦｓ）及び形質転換化ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）に及 ぼすＴＧＩｓの効力の比較■ Ｂｉｏ−Ｇｅｔ　Ｐ−１０樹脂上でクロマトグラフィー処　理したヒト腰帯酸性 化エタノール抽出物から得られた分画のアリコート（４℃）を、材料と方法の項 に上記のように、ヒト正常及び形質転換細胞における腫瘍増殖阻害活性に関して 試験した。図３に示すように、ヒトＡ３４９細胞に対する腫瘍増殖阻害活性（白 抜き三角形）は分画３〜１２の範囲であったが、−方これらの同一分画は、正常 ヒト繊維芽細胞の増殖刺激の８５％の増大を誘発した。したがって、阻害活性は ヒト腫瘍細胞に特異的である。この観察された阻害活性は、光学顕微鏡検査で、 そして正常ヒト繊維芽細胞に及ぼすその刺激作用により間接的に実証されるよう に、細胞毒性によるものではない。ＴＧＩは”正常”上皮由来細胞において以前 に試験されており、同様の結果が観察されている。

表１ ゲル濾過クロマトグラフィーによる腫瘍増殖阻害活性の回収に及ぼす温度の影響 Ａ３４９　（ヒト癌） 未希釈　５７３゜ １／Ｓ　６２　２５ １／＋２５　１５　７ ミンク肺ｆｃｃＩ　６４＞ 未希釈　９１４３ １１５　９Ｑ　１３ １／＋２５　３１　２ １２０μｇを含有する分画５に関するゲル濾過からの１ｍｌアリコート（図１及 び２）を用いて、ＴＧＩ活性を検定した。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）■ Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−１０カラムにより一部精製し、その’＆逆’ＭＡＨＰＬＣ （μＢＯＮＤＡＰＡＫ■　Ｃ１１ｌ樹脂）ヲ用いてさらに精製したヒト腰帯の酸 性エタノール抽出物からのＴＧＩは、Ａ３４９　ヒト癌及び確立されたミンク細 胞系、ｃｃＬ６４の増殖を阻害したが、しかし正常ヒト繊維芽ａｉｍの増殖は［ Ｆ］ 阻害しなかった。図４は、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−１０クロマトグラフイ一工程か ら得られた凍結乾燥分画４の直線的アセトニトリル勾配（１９，８ｍｇ／３ｍｌ の０．０５％トリフルオロ酢酸）を用いたＨＰＬＣにより得られた腫瘍増殖阻害 活性の溶離プロフィールを示す。

Ａ３４９　ヒト癌及びミンク細胞に対する増殖阻害活性の２つのはっきりしたピ ークの証拠が観察された。２８〜３４％（分画１３〜２２）アセトニトリル及び ３５〜３９％（分画２５〜３１）アセトニトリル間に溶離する分画を別々にプー ルし、２−プロパツールの直線勾配を用いてＣ１１ｌμＢＯＮＤＡＰＡＫ■　カ ラムで再クロマトグラフィー処理した。

腫瘍増殖阻害活性の最初のピークをＴＧＩ−４、第二のピークをＴＧＴ−２と名 付けた。図５はＴＧ　Ｉ−１の溶離プロフィール及び腫瘍増殖阻害活性を示す（ 図４）。注入物質の濃度は１．５ｍｇ／ｌ、５ｍｌの０．０５％トリフルオロ酢 酸ＣＴＦＡ）であった。ＴＧＩ−１活性は、２−プロパツールの線勾配を用いて １７〜２３％間で溶離する（図５）。同様に、図６は、２−プロパツールの線勾 配を用いて２３〜２７％（分画１７〜２３）間で再クロマトグラフィー処理され たＴＧＩ−２（０，８ｒｏｇ／ｌ、８ｍｌ　０．０５％　ＴＦＡ）をしめす。

図４及び５に示された腫瘍増殖阻害活性は、Ａ３４９ヒト癌細胞に対してよりも ミンク細胞に対して一貫して２０％高かった。

ヒト胎盤の酸性エタノール抽出物はＴＧＩ活性を有したが、これはさらに、ゲル 濾過クロマトグラフィ一工程後、０．０５％ＴＦＡを含有する直線的アセトニト リル勾配を用いてＣＩ８カラムの２６〜３４％アセトニトリル間で溶離した。

イオン交換クロマトグラフィー ヒト澗帯の凍結乾燥した酸性エタノール抽出物１ｇを、直接、０、ＯＩＭ　酢酸 アンモニウム、ｐＨ４，０中のＣＭ−ＴＲＴ　５ＡＣＲＹＬ＠上でのイオン交換 クロマトグラフィーにかけた。０．０１〜１．０Ｍ　酢酸アンモニウム、ｐＨ４ ，０の線勾配を用いた。図７は、ＣＭ−Ｉ、ＣＭ−ＩＩ、ＣＭ−Ｉｌｌ、及びＣ Ｍ−Ｉ　Ｖと名付けた少なくとも４つの別□々の腫瘍増殖阻害活性を示す。ＣＭ −１は、６０％阻害で、Ａ３４９ヒト癌細胞のみを直ちに阻害した（表２）。Ｃ ＭピークＴＩ及びＩＩＩは、Ａ３４９ヒト癌（それぞれ８０及び６３％）及びミ ンク細胞（それぞれ６１及び７６％）に対して同様の腫瘍増殖阻害活性を有する 。活性の最後のピーク（ＣＭ−Ｉ　Ｖ）は、ミンクに対する活性に特異性を示す （即ち、ミンク細胞（９５％）はＡ３４９ヒト癌細胞（６９％）よりも阻害され た）。

ＣＭ−１は負に荷電した樹脂に保持されず、ＣＭ−ＩＩはわずかに妨害されたが 、これはそれらがともに、勾配を０．０１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４、Ｏで開 始する前に溶離されたためであった。

表２ 陽イオン交換クロマトグラフィーからのＴＧＩ活性ＣＭ　ｒＶ　６９　９５ 阻害活性を有する全蛋白質は、それらがｐＨ４，０で可溶性であり、負に荷電し た樹脂に結合するために酸性蛋白質であるけれども、ＣＭ−１１Ｉ及びＩＶは、 ＣＭ−ＴＲＩ　５ＡＣＲＹＬ■樹脂とよりしっかり結合するために、おそらくわ ずかに塩基性よりであると考えられる（０．５Ｍ　酢酸アンモニウムより上で溶 離する）。これは、ＴＧＩ活性が正に荷電した樹脂（即ち、ＤＥＡＥ−ＴＲＩ　 ５ＡＣＲＹＬ■）に保持されないという蔓実により実証される（データは示され ていない）。さらに酸性の阻害因子は、それらのそれぞれの活性において、Ａ３ ４９　ヒト癌細胞に対してさらに特異的であると考えられる。ＴＧＩ活性のこれ ら４つのピーク（ＣＭ−１゜ＣＭ−Ｉ　１．ＣＭ−ｒ　ｒ　Ｉ、及びＣＭ−ＩＶ ）を、繰り返し観察した（ＣＭ−ＴＲＩ　５ＡＣＲＹＬ■を用いた６つの別々の クロマトグラフィー手順）。ＣＭ−Ｉ　Ｉ　Ｉ及びＣＭ−Ｉ　Ｖにおいて観察さ れた腫瘍増殖阻害活性がカラムから早期に溶離され得る物質を産生じなかったこ とを確証するために、そしてさらに活性の各ピークが別々の存在であるという概 念に対する支持を提供するために、ＣＭ−Ｉ　Ｉ　Ｉ及びＣＭ−Ｉ　Ｖからの物 質をプールし、凍結乾燥して、それを得たカラムと同一条件下でＣＭ−ＴＲＩ　 ５ＡＣＲＹＬ■を用いて再クロマトグラフィー処理した。ＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ −Ｉ　Ｖは、それを得た元のカラム分画の場合と正確に同じ位置で溶離した（０ ．５Ｍ　酢酸アンモニウム以上）（図１０）。ミンク細胞に対してはさらに高い 腫瘍増殖阻害活性が認められ、２つの細胞系に対する阻害活性間の差異は、２５ 〜３０％あたりのピークでまったく同一の活性を残存した。

組織由来癌細胞増殖阻害活性（ＴＧＩｓ）の物理学的及び生物学的特性 ■ Ｂ　１ｏ−Ｇｅ　ｌ　Ｐ−１０によるゲル濾過クロマトグラフィーから得られた 分画２．４、及び６をいずれも過熱処理した（表３）。試験した全分画が、過熱 又は酸処理後、腫瘍増殖阻害活性を保持した（表４参照）。分画２．４、及び６ は、ヒト癌細胞増殖を阻害し、正常ヒト細胞増殖を刺激することが判明した。

表３ ゲル濾過クロマトグラフィーからの分画のＴＧＩ　（ＴＧＩ）活性に及ぼす加熱 処理の影響４　６３　６５　７！ｌ　８０ ６　７０　６３　’８２　７１ ＴＧＩ活性から試験した分画の蛋白質濃度は１５〜３００μｇの範囲であった。

組織由来腫瘍細胞増殖阻害活性（ＴＧＩ）の物理学的及び生物学的特性カラム分 画 分１１ｉ２　分画４　分画６ １．０Ｍ酢酸に安定　二　十　＋ １００℃での沸とうに安定　＋　＋　＋ヒト癌細胞を阻害する　÷　÷　＋ 王宮ヒト細胞を阻害する　−−一 東二シリーズの実験 材料及び方法 血液、静脈及び動脈を除去した組織抽出物からの組織由来腫瘍増殖阻害剤（ＴＧ Ｉｓ）の単離 静脈及び動脈をヒト済帯組織から除去し、残りのａＳを大規模に洗浄して、血液 を除去し、その後、実験の第一シリーズ中に上記のように、酸／エタノール抽出 した。

組織を洗浄及びホモジェナイズするための緩？Ｅ液（ＰＢＳ−ＰＡ）は、１６ｇ ｍのＮ　ａ　Ｃ］、２２．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４”Ｈ２Ｏ，０，４ｇｍのＮａＨ ２ＰＯ４”　７Ｈ７Ｈ２Ｏ１１１６のフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳ Ｆ）（Ｓｉｇｍａ　Ｐ７６２７）　、及び３．３ｍｌのアプロチニン（Ａｐｒｏ ｔｉｎｆｎ）（０，９％ＮａＣ１及び０，９％ベンジルアルコール中の１９．８ 単位／ｍｌのトリプシン阻害剤を含有するＳｉｇｍａ　Ａ６０１２）を含有し、 ＨＣＩ及びＮａＯＨでｐＨ７，４に調節された２リツトルの水で構成された。抽 出緩衝液は、３７５ｍ１の９５％（Ｖ／Ｖ）エタノール（厳密。１９０プルーフ 。Ｕ、Ｓ、ＩｎｄｕｓｔｒｉｃａｌＣｈｅｍｉｃａｌｓ、＃ＵＮ１１７０）　、 ７．５ｍｌの濃ＨＣＩ、３３ｍｇのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ ）（Ｓｉｇｍａ　Ｐ−７６２７）　、及び１ｍｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ　 Ａ６０１２）に４℃の蒸留水１９２の凍結ヒト済帯（Ａｄｖａｎｃｅｄ 、＠。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｅｓ　、−８０℃で保存）を、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｐ　 Ａ　ｌ；ｌ：　４℃で２時間浸漬して溶かした。個々の腰帯を取り出し、ＰＢＳ −ＰＡで濯いだ。４℃で切開して、腰帯から静脈及び動脈を除去した。切開した 腰帯を新鮮なＰＢＳ−ＰＡで洗浄して、残留血液及び血管屑を除去した。

組織を４℃の冷却Ｃｕ１ｓｉｎａｒｔフードプロセツサー（ＤＬＣ−７−ＰＲＯ Ｗ）１．Ｚ入れ、４℃（７）ＰＢＳ−ＰＡ２００ｍｌ中に懸濁した。懸濁組織を フードプロセッサーでホモジェ”ＣＰＢＳ−ＦＡを加えた。組織懸濁液を４℃で 計１０分間ポモジェナイズした。ホモジェネートを２００ｍ１の遠心管（Ｓｏｒ ｖａｌｌ）に移し、５ｏｒｖａｌ］　ＧＳＡｏ−ターを装備した５ｏｒｖａｌｌ 　ＲＣ５Ｂ遠心分離器中で、４℃で５分間、９０００ｒｐｍ　（ＲＣＦ＝１３， ０００）ｔ’遠心分離した。上澄液を取り出して捨て、新鮮なＰＢＳ−ＦＡを用 いてペレットを再懸濁して、元のホモジェネート容積にした。

ペレットを、上澄液が透明になって汚染血液又は血液生成物による赤味がなくな るまで、上記のように遠心分離と再懸濁を繰り返して、洗浄した。その結果生じ た洗浄ペレットは、白色であった。洗浄ペレットを抽出用緩衝液中に再懸濁して 、元の切開組織１グラム当たり６ｍｌの最終容積とした。ホモジェネートを３イ ンチの攪拌棒付きの大きな４リツトルビーカーに移して、ＬＡＢ−１ｉｎｅ　Ｍ ｕｌｔｉｍａｇｎｅｓｔｆｒ■マルチミキサー、１１２７８型の最大攪拌能力の 半分の力で攪拌した。４℃で攪拌しながら一晩抽出後、ホモジェネートを１リツ トル遠心管（Ｓｏｒｖａ　１　］）に移して、５ｏｒｖａｌｌ二　Ｈ−６０００ Ａ　Ｏ−ターを装備した５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離器中で、４℃で３ ０分間、３５００ｒｐｍ！　（ＲＣＦ−３５７０）で遠心分離した。上澄を大型 ４リツトルビーカーに移し、濃水酸化アンモニウムを徐々に添加しながら−ｐＨ を５．０に調節した。ｐＨの増大に伴って、上澄は依然とび　して透明であった がわずかに黄色味がかった。酢酸アンモニラ嗟　ムの２．０Ｍｍ液、ｐＨ５，２ を、総容積の１％の量で添加した。この工程で生じた沈殿はすべて、４℃で５ｏ ｒｖａｌｌ■ＲＣ−３Ｂ中で４時間、４５０Ｏｒｐｍ　（ＲＣＦ＝５９ＱＯ）吋 　で遠心分離して、除去した。上澄を大型６リツトルフラスコに移し、これに４ 容積の無水エーテル（−２０’Ｃ）（Ｂａｋｅｒｚ　＃９２４４−３）及び２容 積の９５％エタノール（４℃）を加）　えた。その混合液を−２０”Ｃで４８時 間、静かに放置し、その結果沈殿が生じるようにした。

４　４８時間の沈殿の終了時に、その物質をヒユームフード中で室温にした。酸 性化エタノール抽出物を室温に暖めると、沈殿１　の凝集が増大する。エーテル 及びエタノールの透明有機相をウォーターアスピレータ−で除去し、沈殿をヒユ ームフード中に数時間そのままにして、残留有機相を蒸発させる。抽出物上に乾 燥窒素ガスを静かに流して、沈殿物とともに存在する残留有機相の蒸発を促した 。”乾燥°沈殿物を１．０Ｍ酢酸に溶解して、３５００の分子量カットオフを有 する透析膜■ （Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ　３　、ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓ ｔｒｉｅｓ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いて１．０Ｍ酢酸（Ｂａｋｅｒ ３９５０７−５）に対して広範に透析した。透析した酸性化抽出物を２５０ｍ１ のＣｏｒｎｉｎｇ　円錐遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ　２５３５０）中で凍結乾燥し 、粗製酸性化エタノール抽出物として貯蔵するか、又は２０ｍＭＮＨＯＣＨ、ｐ Ｈ４，５に対して広範に透析した。

第一シリーズの実験中に上記のように調製した組織からの初期酸／エタノール抽 出物の腫瘍増殖阻害活性と、上記のように調製した組織の活性との比較 上記のように組繊を調製した場合に認められた特異的活性及び総回収活性の改良 を、表５に示す。この表は、第一シリーズの実験で詳述された手順（以後、”初 期手順”と称する）にしたがって処理した場合、及び上記のように（以後、°変 法“と称する）処理した場合の、凍結腰帯からの蛋白質及び腫瘍増殖阻害活性の 産生を比較する。

２つの手順にはいくつかの差異が認められるが、これはその後のＴＧＩの精製に 関して重要である。例えば、組織の湿重量を基礎にして、初期手順による酸性化 エタノール抽出は蛋白質として０．３３％を回収したが（１０００ｇの組織から ３．３ｇ）、一方変法に依った場合は、蛋白質として０．０１５％のみ（３４０ ｇの組織から０．０５ｇ）を抽出しただけであった。

活性の収率は、６６％未満（３４０ｇ対１０００　ｇ）の組織からは、初期手順 （２ｘ１０６単位）の場合より変法による方が５０％多かった（３．３ｘＬ０６ 単位）ため、抽出の全効率が改良された。初期手順は、腰帯１グラム（湿重量） 当たり２０００単位の腫瘍増殖阻害活性を生じた。変法は、謄帯１グラム（湿重 量）当たり９７００単位の腫瘍増殖阻害活性を生じた。抽出の全効率は、変法に より５倍に改良された。さらに、酸性化エタノールにより低蛋白質が抽出された ため、抽出蛋白質を沈殿させるのに必要なエーテル及びエタノールの容積は、も っと少ない。最後に、変法により抽出される蛋白質の量及び異なる蛋白質の数は より少なく、シたがつて、用いるべきその後の精製手順は、純粋物質を生成する ためにより少量のクロマトゲラフイー物質、より短い処理時間、及びさらに少な い工程を要する。

陽イオン交換樹脂ＣＭ−ＴＲＩ　５ＡＣＲＹＬ■上で変法を用いて抽出されたＴ Ｇｒの分画化は、０〜１．０ＭＮａＣｌの直線的塩勾配によって結合物質を溶離 した場合、大量の使用蛋白質から単一ピークとして解明された。図９は、ＣＭ− ［Ｆ］ ＴＲｌ５Ａ、ＣＲＹＬ　カラムにＴＧＩを適用後に、樹脂と結合していない物質 （即ち分画１〜２４）からは阻害活性が検出されなかったことを示す。ＮａＣ１ （−−）の量をしだいに増して直線的に付加すると、有意量の阻害活性（−−− −一）（分画３９〜４９）の除去前に、樹脂に結合する大多数の蛋白質が除去さ れた（分画２５〜３８）。結合ＴＧＩを除去するのに最も有効なＮａＣ］濃度は 、約０．６Ｍであった（分画４４）。図９を図８と比較すると、図９の実験で溶 離された阻害活性は、図７に示したＣＭ−ＴＲＴ　５ＡＣＲＹＬ■樹脂由来のＣ Ｍ−ＩＩＩ及びＣＭ−ＴＶの溶離に最も密接に対応したが、これは溶離のための 塩濃度（ＮａＣ１，図９；Ｎ　Ｈ４０２Ｃ２Ｈ３，図８）が同様である（０．６ Ｍ、図１１゜０．６〜０．７Ｍ、図８）ためであることが示唆される。上記の情 報はさらに、変法で組織を処理すると、ＴＧＩの単一ピークが好ましく単離され 、したがってその結果その因子の特性が改良されることも示唆する。

変法による組織からのＴＧＩ抽出の別の特性は、それが陰イオン交換樹脂と結合 しないことである。図１０は、図の凡例に記載のようにｐＨを８，０に調節した 後、陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ■に抽出物（同量の図９で 用いたもの）を適用すると、非結合物質（分画１〜３０）に関連した大多数の阻 害活性が生じたが、一方大量の使用蛋白質（２８０ｎｍでの吸光度により測定’ ）　（−一−−−−−−）はカラム樹脂に結合したことを示す。これらの結果は 、図１０の条件下では、汚染蛋白質をＴＧＩから除去し得るし、したがってそれ はＴＧＩの精製に有用な手法であることを示す。さらに、これらの結果は、ｐＨ ｓ、ｏでは、ＴＧＩは、陰イオン交換樹脂と結合しないため、陽イオンであるこ とを示す。最後に、図１０の結果は、変法により抽出した場合のＴＧＩは、これ らがいずれも陰イオン交換樹脂と結合しなかつたつため、イオン特性において、 初期手順においてイオン交換樹脂で抽出したポリペプチド（ＴＧｒ−１、ＴＧＩ −２、ＣＭ−１、ＣＭ−ＩＩ。

ＣＭ−ＩＩＩ、及びＣＭ−Ｔ　Ｖ）と同様であることを示す。

ＣＭ−ＴＲＴ　５ＡＣＲＹＬ■により大量の試料を再現可能的に分画化し得るし 、したがってより多くのＴＧＩをその後の精製手順に供給できる。図１１では、 ９．９ｍｇの組織抽出物を、より小さなＣＭ−ＴＲＩ　５ＡＣＲＹＬ■カラム（ ５ｍｌ）上でのより小さな試料サイズ（２，６５ｍｇ　タンパク質）に関する図 １０の場合と同じクロマトグラフィー条件下で、ＣＭ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ■カ ラム（１５ｍｌ）に適用した。

ＮａＣ１の線勾配による大多数の蛋白質性物質からの腫瘍増殖阻害活性の分解は 、両実験において本質的に同じであった。

図１２は、μＢＯＮＤＡＰＡＫ（９Ｃ１８カラム上でのＨＰＬＣによるＣＭ−Ｔ ＲＩ　５ＡＣＲＹＬカラムからのプールされた試料のフラクシヨンを示す。試料 適用後、０〜２５％の直線的増大アセトニトリル濃度によって、有意な阻害活性 は観察されなかった。しかしながら、Ａ３４９　（ヒト肺癌）及びＣＣＬ、６４ 　（ミンク肺、０−０）の両方に対する腫瘍増殖阻害活性は２８〜３４％アセト ニトリル（分画２１〜３１）間に単一ピークで溶離したが、一方２０６ｎｍで吸 収する大多数の物質はより低い（分画１１〜１９）及びより高い（分画３７〜５ ０）アセトニトリル濃度で溶離された。

ＴＧＩ　（初期手順ではＴＧＴ−１及びＣＭ−ＩＩＩ及びＣＭ−ＩＶという）の 見かけの分子量は、公知の分子量の適当な蛋白質基準を用いてゲル濾過クロマト グラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０，データは示していない）により測定 した。したがって、ある種の妨害蛋白質（例えばヘモグロビン）が存在しない場 合、ＴＧＩの見かけの分子量は非変性条件下で２０ｋＤａ〜３０ｋＤａであると 確定されている。

本明細書に詳述された変法は、初期手順に記載されたように調製したＴＧＩ抽出 物から不活性又は妨害化合物を除去するための強力で簡単な手法を記載する。さ らに、変法は、必要なりロマトグラフイー物質の量を低減し、したがってＴＧＩ の調製時間を減少することにより、ＴＧＩの単離に使用する種々のクロマトグラ フィ一工程の効率を改良する。さらに、そして明示したように、本明細書中に記 載のような腰帯からのＴＧＩの抽出は、以前に記載された手法の場合よりもさら に再現可能的にＴＧＩ及びその他の蛋白質をクロマトグラフィー処理し得る。

変法にしたがって単離したＴＧＩは、逆相高速液体クロマトグラフィー及びＣＭ −ＴＲｒ　５ＡＣＲＹＬ■イオン交換クロマトゲラフイーの両方におけるクロマ トグラフィー特徴に関して特性付けられている。ＴＧＩは、ＲＰＨＰＬＣによる ＴＧＩ−１（図５及び１２を比較）と同様又は同一の行動をとることが判明して おり、したがりて、同様又は同一の疎水性特性を有しており、さらに陽イオン交 換樹脂上でＣＭ−ｒ　Ｉ　Ｉ及びＣＭ−ＴＶと同様又は同一に行動しく図９及び １１を比較）、シたがって同様又は同一のイオン特性を有することも示されてい る。

したがって、変法で単離した場合のＴＧ　ｒ、及びＴＧｒ−１、並びにＣＭ−ｒ 　Ｉ　Ｉ及びＣＭ−Ｉ　Ｖは、同様又は同一のイオン及び疎水性特性を有する同 様又は同一の化合物であって、したがって同様又は同一の組成物である、と結論 される。したがって、本明細書に記載の変法は、さらなる分析及び特性付けのた めのより純粋な形態のＴＧＩを生成するためにより有効な方法を提供する。

実験第三シリーズ 酸性化エタノール抽出及びエーテル／エタノール沈殿用いた緩衝液及び装置は実 験操作の各段階で実験東ニジリーズで述べたものを用いた、ヒトの腰帯２００〜 ４００ｇの血管から切除したものかあるいは完全な形で残っているもののどちら かを１／２インチ片に切断し、４０”ＣでＰｕ５−ＰＡで血液の大部分を洗った 。腰帯はふるいを通して重力により排液した後、ホモジナイズ（均質化）するた めＰＢＳ−ＰＡの最大容量２０ｏ１の入った４℃に冷却しであるフードプロセッ サーに移した。組織は１５分間ホモジナイズした後、２００ｍ１のプラスチック 容器を用い、ＧＳＡローター（Ｓｏｒｖ！ｌｌｌを装着したＲＣ−５Ｂ遠心機を 用い５．００Ｏｒｐｍで１ｏ分間、ＰＢＳ−ＰＡを用いて遠心を繰り返し血液を 洗い流した。この遠心操作は、２８０Ｉにおける光学濃度が０．０５以下になる まで行ない、結果、得られたペレットの本質的な色は白であった。実験第一シリ ーズにおいて述べられたように、このペレットを２１のガラスのビーカーに移し 、抽出用緩衝液に懸濁して最終容量が組織オリジナル（原）湿重量１ｇ当たり３ １に調製しこれを４℃で２４時間攪拌した。この懸濁液を１．０１プラスチツク 製容器で１１６ＧＯＯＡローター（Ｓｏ＋ｖａｌｌ）を装着したＲＣ−３Ｂ遠心 機（Ｓｏｒマ１１１）を用い３．５０Ｏｒｐｍで３０分間遠心した。得られた上 清（ｒａｐｅｒｖｘｆｚｖｌ）を２１のビーカーに移し、最初濃水酸化アンモニ ウムでｐＨ５，０に調整しその後最終濃度が総容量の１％になるように２Ｍ酢酸 アルミニウム溶液を添加してｐｌｕｓ、　２に調整した。

この溶液は澄明かあるいはわずかに黄色く色づいてみえる状態を維持した。

以前述べたようにエーテル／エタノール沈殿の次に、上清をフラスコから綿状沈 殿を含むフラスコの底から上３／４インチ以内のところまでサイフオンで移した 。沈殿物及び残留エーテル／エタノール溶液は２５０１のプラスチック製コニカ ル容器（Ｃｏｉｎｉｎｇ　：２５３５Ｇ）に移し、ＧＳＡ　Ｏ−ター、５０００ 　ｒｐｍで２０分間、Ｓｏｌマｔｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心機で遠心した。この操作 段階は、沈殿物のすぐ上のエーテル／エタノール上清からのＴＧＩ’　Ｓの損失 を減少させるため計画した。得られたペレットは０，１Ｍ酢酸で懸濁し、エーテ ル／エタノール沈殿物を含むフラスコも１．０Ｍ酢酸で洗ってフラスコの壁に残 っているＴＧＩタンパク賀を除去した。

２８０　ａｍでの光学濃度は０．５　と１．０の間であり、各分離調製品の最終 容量は１００１を越えなかった。

ＴＧＩ含有含有タンパ溶質溶液カットオフ分子量３．５００の透析膜（Ｓｐｅｃ ｌｒｏｐｏｒ３）を用いて、１．０Ｍ酢酸で１日、４．０Ｍの酢酸アンモニウム ＰＨ４，５を２回交換して１〜２日間、透析を行なった。

腫瘍成長阻害活性もエーテル−エタノール沈殿操作段階を省略することで組織の 酸性化エタノール抽出から得られるという事実は特筆すべきことである。しかし 、エーテル−エタノール沈殿を用いた“ｓｌ＊ｎｄｓｒｄ　（標準）”分離調製 品に比べてこの調製品の特異活性は５０％以下であり、活性の総収率は１０−３ ０％以下であった。

疎水性相互作用クロマトグラフィ 透析されたタンパク質はクロマトグラフィ用レジン（樹脂）としてフェニル−セ ファロース＠（Ｈ＊＋ｍ５ｃｉ＊）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィに かけた。フェニル−セファロース■は４，０Ｍ酢酸アンモニウム、ｐｌ’１４． ５で平衡化した。透析（少なくとも２４から４８時間）後、タンパク質溶液の伝 導度及びｐＨを測定し、そして透析物（透析物の出ていく濾膜の外側の液体）と 平衡化緩衝液の伝導度が同じになった時を透析の終末点とした。タンパク質は、 タンパクｉｉ［２，ｏｍπ当たり樹脂１１を用いて１．６Ｘ２．ｆｌｃｓのクロ マトグラフィ用のカラム（Ｋ−２０−Ｐｈｔ＋１ｓｃｉｓ）に充填された樹脂上 に、１分間に１．０ｍｌの速度でポンプ　（Ｍｉｅ＋ｏｐｅｒｐｌｅｘ■ポンプ ｔ２Ｎ２−ＬＫＢ）で注入した。

カラムは０Ｄ２８ｏがゼロになるまで洗った後、エチレングリコール（Ｍｇ１１ ｉｎｋ＋ｏｄｌｌ　の濃度を０から５０％まで増加させながら、これを含む酢酸 アンモニウムｐＨ４，５の濃度を４．ＯＭから００４Ｍまで減少させる濃度勾配 法を用いて、腫瘍成長阻害活性をカラムより溶出した。溶離勾配液の総容量は各 々個別の分離調製のために使われた樹脂の総容量の１０倍であった。結合タンパ ク質はだいたい５０番目の分画を越えてから溶出された。実験の箪−シリーズで 述べたように、ミンクＣＣＬ６４及びＡ３４９セルラインに対する阻害活性を測 定するために、１０μｍのサンプル（試料）をＢＳＡ　Ｉウシ血清アルブミン） ５０μｇを含むプラスチックチューブ（ポリスチレン）に移した。

図＃１３に示したように、腫瘍成長阻害活性は酢酸アンモニウム１．５Ｍ、エチ レングリコール３１％の時カラムより溶出しはじめ、酢酸アンモニウム４０ＩＩ Ｍ及びエチレングリコール５０％時までに完全にカラムより溶出し終わった。生 物学的に活性な分画をプールし、Ｏ，１Ｍ酢酸で透析した後、ポリプロピレン５ Ｑｓｌチユーブ（Ｓｃｉｔｌ百ｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｌ＋　＃０２３９０−５１１ ）あるいはシリコナイズしたガラスの凍結乾燥用フラスコ（Ｖｉｒｔ目）で凍結 乾燥した。

逆相高圧液体クロマトグラフィ 凍結乾燥した生物学的に活性な物質を１０％アセトニトリルを含む０．０５％ト リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　の　１．０〜３，０１中に希釈し、１６Ｘ　１００ 　ｍｍのシリコナイズした使い捨てのガラスチューブに入れ、２分間超音波処理 した後、３００Ｇ＋ｐｍで１０分間遠心して（Ｂｔｃｋ＋ｎｘａ　Ｍｏｄｔｌ　 ＴＪ−６）不溶性物質を除去した後見にμＢｏ山ｐｔｋ＠ＣＩ８樹脂（Ｌｌｔｒ 　Ａ＋ｓｏｃ、０．３９Ｘ　３０ｃｍ、　ＰＮ２７３２４）を用いた逆相高圧液 体クロマトグラフィ（ＲＰＨＰＬＣ）にかけた。ｌｔｇ以下のＴＧＩが各カラム に添加された、それで各分離調製に対して必要なカラム操作数は、フェニル−セ ファロースによるクロマトグラフィにより得られた活性分画の総タンパク質濃度 に依存した。この添加量はタンパク質１．０ｍｇ／ｍｌに相当する１、０光学密 度ユニットの値を用いた０Ｄ２８ｏに近いものであった。タンパク質は溶出移動 相として０．０５％ＴＦＡを含む１００％アセトニトリルを用いた濃度勾配方式 で、１分間に　１．０１の速度でカラムから段階的に溶出された。濃度勾配は１ ５分間でアセトニトリル（ＣＨＣＮ）２５％まで上昇させそのまま２５％（ＣＨ ３ＣＮ）で１０分間溶出した。２分間で２７％まで上昇させそのまま１７％で１ ０分間溶出し、２分間で２８％まで上昇させそのまま２８％で１０分間溶出し、 １０分間以上かけて３０％まで上昇させ、更に１０分間で４４％まで、もう１０ 分間で１００％まで上昇させ、結果を得た。タンパク質の吸光度は２１ｈａでモ ニター（記録）シ、その他すべての１．０１分画からＯ，ＯＯ５＋ａｌ相当量（ ＊１ｉＢｏ＋）を移し、ＣＣＬ６４及びＡ３４９セルラインの両方に対して腫瘍 成長阻害活性を測定した。図ｔ１４Ａと１４Ｂに示されているように腫瘍成長阻 害活性Ｃよ最初２７％アセトニトリルで溶出しそして２Ｂ−３０％まで溶出が持 続した。精製の各段階で、生物学的活性分画をプールし、続０てけることにより 総腫瘍成長阻害活性を測定した。ブールした分画中に存在する腫瘍成長阻害活性 を本操作開始時の物質の相当量の活性と比較した。従って、活性及びタンｌ々り 質（測定可能な場合）のカラム回収率が得られた。

図１４Ａで矢印で示された範囲（画分４７−５１）は、２つの分離したＣ１ｇク ロマトグラフィ操作（１つはフェニル−セファロースカラム、１つは単離より誘 導）で得られた分画をブールしたもので、非−還元状態下（図１５人）及び０． ５％β−メルカプトエタノールの存在下（還元状態）（図１５Ｂ）の両方で５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにかけた。クロマトグラムのこの範囲（図１４Ａ）は最高の生物学 的活性及び最小のタンパク質汚染量（２１０ｆｉｍでの最高の特異活性及び最低 の吸光度）を証明した。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる実験の詳細ｌ；つ０ては図１１ ５に記録しである。レーン２の非−還元状態下（図１５Ａ）において、生物学的 に活性な分画は、少なくとも４つの主要なタンパク質バンドを含むことが示され ている。レーン１番よ血小板（Ｂｒｍｃｓ　ＭＢｍｎ、　０ｒｉｏｎ　Ｓｔ！ｌ ＠Ｈｔ＊ｌ＋ｈ　５ｃｉｔ＋＋Ｃｅ　ｈｉｗｔｒ−ｓｉｌｙ、　Ｐｏｒ山ｎｄ、 　Ｏｒｅｇｏｎ　：　オレゴン、ポートランド、オレゴン州立保健科学大学、　 Ｂｒｕｃ！ＭＢｕｎにより提供された）由来のＴＧＦ−βの精製分離調製品を含 む。このタン／（り質に因ると考えられる生物学的活性は、ＥＧＦ　２．０−２ ．５　ｕ／　ｍｌのように成長因子の存在下においてのみ、軟寒天測定法におし ）て正常ラット腎細胞（ＮＲＫ）に対して固定独立成長をさせる可能性がある。

従って、その成長促進活性は他の生物活性タンノくり質に直接依存している（Ｒ ｏｂｅｒｔｓ　Ｃ１＋１．、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ＊＋ｂｏ＋　Ｃｏａｔ 、　Ｃｅ１１４７７８　Ｆ１９８２）。

腫瘍成長阻害活性に対する我々の測定で、ＴＧＦ−βはタンパク質ｌａｇ当たり １−３０ユニツトの阻害活性を所有することが示された。比較によって、図１５ Ａ、ＴＧ＋分離調製品（レーン２）の１つのタンパク質バンドもまたＴＧＦ−β （レーン１）のようにだいたいｋＨ”２５ｋＤｘの同じ位置に移動したと思われ る。同じ試料サンプルを５％β−メルカプトエタノールの存在下、電気泳動した ところ、Ｍｒ２６ｋＤｓに移動したタンパク賀バンドは消失しそして新しいバン ドがおおよそ１２．５ｋＤｘ図１５Ｂで確認された（レーン２）。図１５８　丁 ＧＦ−β（レーン１）もまた還元後その移動位置は１３ｋＤｇに変わった。ＴＧ Ｉ含有試料サンすル中の他の全てのタンパク質は依然として同じ移動位置であっ た。従って還元に対しては非感受性であった。各試料サンプル毎のゲルに添加し た阻害活性のユニットはレーン１　丁ＧＦ−βに対しては約１．０００−１．５ ００（５ｈｇ）及びレーン２　７ＧＩに対しては１０，０００から２０．０００ であった（図＋５ＡとＢ）。

更にＲＰＩＩＰＬＣＣ１１ｌクロマトグラフイ操作より得たＴＧ＋の生物学的に 活性な分画をｃＮμｍＢＯＮＤＡＰＡＫ　＠カラム（０，３９ｘ　３ＧｃｍＷｓ ｌｓｒｓ　ＰＮ　１１４０４２）　を用いたＲＰ）ＩＰＬＣにより精製した（図 ＄１６）。

生物学的に活性な分画は１６Ｘ　１００ｍｍのシリコナイズしたガラスチューブ 中で凍結乾燦し、そして０．０５％ＴＦＡ含有１０％プロパツール１．０−３． 　Ｏｍｌ中に溶解した後カラムに添加した。カラム溶出は２−プロパツールの直 線濃度勾配法を用いて、１０分間で１０から２０％、次に１５分間で２０から５ ０％（０，６％／分）、そして最終的に２０分間で５０−１０［１％まで上昇さ せ、１．Ｏｉｌ／分の速度で実施した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のための生物学的に活性な分画のヨウ素化活性な凍 結分画５６．　５８．　５９−６５．　６６−６８を図番１８に示した。そして ７１Ｆ−βの約４ｔｘｔをクロラミンＴ法でヨー素化した（ＭｃＣｏｎ＊ｈｅ７ ．　Ｐ、Ｊ、ｓａｄ　Ｄｉｘｏｎ、Ｆ、Ｊ、（１９６６）Ｉｌｌ、　Ａｒｃｈ、 ｏｆＡｌｌｔＢ７２９．１８５−１８９）。各分画を０．１Ｍ酢酸１００μｍに 再懸濁し、そして１．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８゜８３μｍを添加してｐＨを７ ．０に調整した。キャリヤーフリーのヨー素化ナトリウム　＋１２５Ｎ鳳１０μ ｌを添加し、その後　１．ｈｌ／ｍｌのクロラミンＴ（Ｓｉ！ｍ＊ｎｊｃＨ８７ ）　２μｌを加えた。チューブを１分間振動させた後、１．０ｉｔ／ｍｌのメタ 重亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍ＊　＄５９０００）　を２μ！添加して反応の終 点とした。２分後、各試料サンプルの０．０５１を２倍濃度の試料サンプル緩衝 液０．０５ｍ１プラス５％β−メルカプトエタノールを含有するシリコナイズし たガラスチューブ（１０Ｘ　７５ｖｍ）に移し、５ＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲル電 気泳動用とした。

試料サンプルの残りは、２倍濃度の試料サンプル緩衝液０、０５ｍ１中に希釈し 、そして、約２００，０００　ＴＣＡ沈殿性放射活性カウントを５０５−ＰＡＧ Ｅの個々のレーンに添加した（ｌｌＵ＃＋７）。ゲル中にタンパク質を固定する ために、０．１２５％クーマシーブルーで１０分間、ゲルを染色した。そしてフ リーの放射活性ヨー素を除くために徹底的に脱色した。脱色溶液が、ガンマカウ ンター（Ｂｓｃｋｍｘｎ、　Ｒ目Ｂｍｍｔ　１１２９４）でこの脱色溶液１．０ １をカウントして判定して、検出可能レベルの放射活性を含まなくなった時、ゲ ルをゲル乾燥機（１？ｏｅ＋＋ｅｒ−５Ｅ１１５０）を用いて乾燥し、後、オー トラジオグラフィのためにＸ−線フィルム（Ｋｏｄｌに−ＩＡＩ）に露出した（ −週間）。

生物学的に活性ＴＧ＋が添加された全てのレーンはＭｒ　２４　ＫＤＡに移動し たタンパク質のかすかなバンドを示した。このタンパク質のバンドもまた血小板 由来のＴＧＦ−βの２５６阻害ユニツトを含むレーン７においてＭｒ　２６　ｋ Ｄｚバンドと供に水平面に直接、移動した（図番１７．レーン７矢印）。

レーン１，２．３及び５は腫瘍成長阻害活性を各々、およそ１８０、２Ｎ０．４ ６及び４０ｇユニット含んでいる。この各レーンにおいて、Ｍｒ　２５　ｋＤＩ バンドが観察された。一方、腫瘍成長阻害活性を所有しなかったレーン４と６に このタンパク質バンドはなかった。最も活性な分画を含むレーン２　（図１６よ り）では、２つのかすかなバンドをＭｒ　２６　ｋＤｌ　と３１１　ｋＤｔに認 めた。レーン３は、Ｍｒ　２６　ｋＤｔにバンド１つだけをもつように見える。

丁ＧＩの精製の最終段階の後、タンパク質濃度は、標準のタンパク賀濃度測定法 を用いた場合、検出レベル以下であったため測定できなかった。そのために、Ｍ ｒ　２６　ｋＤｔに移動したバンド（レーン２．３及び７より）を乾煽したゲル から削り取り、レーン２及び３に添加したタンパク質濃度を外挿するためにガン マカウンターでカウントした。ＴＧＦ−βの０．４■がゲルに添加され、そのゲ ルのＭｒ　２６　ｋＤｔのカウントが５．５９３　ｃｐｓと既知であることから 、レーン２とレーン３における２６　ｋＤｔの位置でのカウント３６２（レーン ２）及び１９５（レーン３１ｃｐ■は各々２６ｐｔ及び１４ｐ！に相当する。こ れらの計算はチロシンの数と各チロシン毎のヨウ素化の程度が同じであったと仮 定して行なっている。Ｍｒ２６　ｋＤ＊バンドの存在は腫瘍成長阻害活性の存在 に一致しているけれども（図１７）、特にレーン２において、活性の量（ユニッ ト）は、ゲルに添加されたヨウ素化タンパク質（０，４１）の強度により判断し た場合、ＴＧＦ−βタンパク質量との間に相関関係をなかつた。従つて、丁Ｇ１ は丁ＧＦ−βよりも高い阻害活性、少なくとも１対数高い活性を証明した。

ＲＰｆｌＰＬＣＣ１ｇクロマトグラフィ、図１４＾により活性の広範なピークが 得られたため；図１４Ｂにおいて、活性には２つのピークがある可能性が考えら れた、１つは２７％と他は２８−３０％である。

これら分離ピークによって示された範囲をブール１、ＣＮカラムを用いたＲＰＩ ＩＰＬＣにより別々にクロマトグラフィを行なった。プロパツールの勾配の傾斜 を変化させた。その結果２−プロパツールの増加速度は、１分間に０．６％のか わりに０．３７５％になった。このわずかな勾配の変化は４０〜４５％２−プロ パツールの間に添加してくる活性タンパク質をよりよく分離するために考え出さ れた。

図審１８は、以前のＣＩ８カラムでの分離操作で２７％アセトニトリルでプール された活性分画（ブール■）のＣＮカラムからの分離プロフィールを図に説明し ている。最も活性な分画（分画＃１４）は、４０−４１％２−プロパツールで溶 出した。もっと低量の活性は、およそ４４％２−プロパツールで２重ピークとし てこのピークが溶出した後、溶出していることが認められた。同様にＣＩＢカラ ムでの分離操作でＨ−３０％アセトニトリルで溶出・プールされた活性ピーク由 来の活性物質（プールＩ＋）の再クロマトグラフィは、ＣＮカラムの４４％２− プロパツールより溶出画分に一致する活性のピークを示した（図１９）。２７％ アセトニトリルで溶出した活性の最初のプール（ブール■）は、２ｇ−３０％ア セトニトリルで溶出したプールＩ＋に含まれるある活性物質を含有していた、従 ってこの活性物質のピークは少量ではあるが４０−４１％２−プロパツールのプ ール■のクロマトグラム中に現われる（図１８）。ＴＧＩをさらに精製する上で 最も重要なことは、ブールＩに対しては４０−４１％及びブールＩＩに対しては ４４％で溶出してくるＴＧｌ活性の２つの主要ピークを完全に分離することであ った。

Ｃ１ｇカラムより溶出したブール■はブール１１よりも多い総阻害活性８２％を 含有していた。図１２０は２つの分離クロマトグラフ、図２０（プール■）、と ２１（プールＩ＋）よりの活性のピークのトレーシング（模写）である。この図 （＄２０１はＣ１８カラムプール■及びブール１！より溶出した異なる活性分画 として２つの明瞭な阻害活性ピークを図解している。

Ｃ１８カラムによるクロマトグラフィの後、もし活性分画を、ＣＮクロマトグラ フィの前に凍結乾燥しないと、ＴＧｌの生物学的活性はより良い保存状態が得ら れることが認められた。そのため、この試料サンプルは部分的凍結乾燥（完全で はなく）で濃縮し、−２０℃で保存した。

■　多様な腫瘍セルラインのならし培養液中で培養した腫瘍成長阻害活性 腫瘍細胞ならし培養液で培養したＴＧＩ活性に対するジチオスレイトールの作用 ヒト腫瘍Ａ４３１　（ＩＩ表皮癌腫）　、Ａ６７３　（横絞筋肉腫）及びＴ２４ （膀胱癌腫）細胞を１０％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭを含む完全成長培地 ２０ｍ１を入れた７１５（１（１５０ｃｍ”　）フラスコの中に合して成長させ た。合した単層はＤｍｌｂｔｃｃｏ’　ｓ　リン酸緩衝化生理食塩水（ＤｙＩｂ ｅｃｔｏ’　ｓ　ｐｈｏｓｐｂｓｌｔ　ｂｉｆｌｔｒｅｄ　５ｘｌｉｎｅ）で２ 回洗浄し、血清−フリーＤＭＥＭをフラスゴ毎に１０〜１２１を添加し２４４時 間インキュベートた。ならし培養液（１００〜１１５　ｍｌ）を１−４　Ｘ　１ ０８ｃｅｌｌ＋（細胞数）より集めた。赤白血痰セルラインに５６２を１１あた り１０６ｅｒｌｌｓ　（細胞数）の細胞密度に懸濁して成長させた血清−フリー のならし培養液１リツトルを集めた。細胞の破片は、ならし培養液を、ＲＣ−５ Ｂ　ＧＳＡ　＋Ｎｏｒ−５ｏｒｎ＊ｌｌで８０Ｏｒｐｍ、６０分、４℃で遠心し て、培養液より除去した。上滑をならし培養液１００ｍ１あたり１Ｍ酢酸１ｍｌ で処理し、５ｐｅｃｌｒｅｐｏｒ３透析チニ−ブ（Ｓｐｔｅｊｒａｍ　Ｍｔｄ： ｃｓｌ　ＬｓｂｏｒｓｔｏｒＩｅｓ）で１Ｍ酢酸を何回も交換しながら徹底的に 透析した後、凍結乾燥した。凍結乾燥し、酸でＪＩ＆理したならし培養液をＡ４ ３１．　Ａ６７３及びＴ２４に対しては５．０゜１容量、そしてに５６２由来培 養液に対しては１．５ｍｌ容量を４ｍａＨｃＩに再懸濁した。不溶性物質はＲＣ −５１遠心機（Ｓｏｒｖ＊ｌｌ。

５Ａ６１１１１０−タ）で３．４０Ｄｒｐ■、１５分間４℃で遠心して除去した 、得られた上滑は　１．５１のマイクロフニージチューブに移した。

Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｉエツペンドルフ）のマイクロッエージで４℃、１５分間 遠心の後、上溝を１．５１のマイクロッエージに移し一２０℃で保存した。タン パク質濃度は２８０ｎｍの吸光度で測定した。個々の試料サンプルの腫瘍成長阻 害活性はジチオスレイトール（ＤＴＴ）による還元に対する感受性で試験した。

各々０．５ｍｌを０、ＩＭ　ＮＨＨＣＯ３，４，５ｍｌを含む２本のチューブに 移した。

１方のチューブは最終濃度が６５ｍＭになるようにＤＴＴを加えた後、両方のチ ューブを室温で２時間インキュベートした。それからインキュベート混合液をＳ ｐ！ｃＨｏｐｏ＋　６透析チユーブに移し、ＩＭ１％陵で２日間透析してＤＴＴ を除いた。透析された試料サンブルは最初の実験操作で述べられたようにしてそ の腫瘍成長阻害活性を測定した。標的細胞として、ミンク細胞、ＣＣＬ６４及び Ａ５４９細胞を使用して、Ａ４３１．　Ａ６７３．　［５６２及びＴ２４セルラ インにより得たならし培養液由来のＴＧＩ活性に対するＤＴＴの作用を表６と７ に各々要約した。この表ではミンク及びＡ３４９両細胞に対して、Ａ６７３．　 Ｋ５６２、及びＴ２４より得たならし培養液由来の腫瘍成長阻害活性は還元後火 なわれたこと（表６）、しかるに一方、Ａ３４９細胞に対して優先的阻害活性を 示したＡ４３１細胞より得たならし培養液由来の腫瘍成長阻害活性は、還元後わ ずかに減少したのみであったことを示している（表７、第１段）。

Ａ４３１ならし培養液の逆相ＨＰＬＣ Ａ４３１細胞４Ｘ１０８より得た凍結乾燥したならし培養液（１１０１）は、凍 結乾燥した物質を溶解するために４ｍＭ　［ＩＣｌ　５．０ｍｌが使われたこと を除いて以前述べられたような過程で処理された。

既に述べられたように不溶性沈殿を遠心により除去し、タンパク質濃度を測定し た。０．１Ｍ重炭酸アンモニウムあるいは６５１Ｍ　ＤＴＴを含むこの同じ緩衝 液１．８１に０．２１相当量（６８０Ｍｇタンパク質）を添加した。室温で２時 間インキュベージジンした後、還元化および非還元化試料サンプルの両方を凍結 乾燥し、そしてＲｐＨＰＬＣ用に０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＩ　２． Ｏｍｌ中に再懸濁した。Ｃ１６半分離（＋ｅａｉ−９ｒｃＰ凰ｒｔｔｉマｅ）カ ラムに注入後、タンパク質は、アセトニトリルを５０分間で０−５０％まで上昇 する直線勾配法を用いて１分間に１．０１の速度で溶出した。最初の操作法にお いて述べられたように、ミンク及びＡ３４９両方のセルラインに対する成長阻害 活性を測定するために、各２．０１分画から１．０１相当量を除去した。図ｔ２ １は、阻害活性には２つのピークがあり、１つは２５％アセトニトリルで溶出し 、ＣＣＬ６４及びＡ３４９両細胞を阻害するもので、もう１つは３０−３６％ア セトニトリルで溶出し、Ａ３４９セルラインに対して優位な阻害活性を示すこと を図解している。ＤＤＴ処理後（図２２）、活性の第一ビーク（２５％アセトニ トリル）はもはや存在せず、一方、Ａ３４９細胞に選択的である活性はその活性 を保持していた。

実験第三シリーズからの結論 ＩＮＦ帯からの血液及び脈管構造の除去は、ＴＧＩの特異活性を実験第一シリー ズでの結果以上に約１００倍に増加させたと＋１１う事実は”ｍｏｄＨｉｃｓ目 ｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｓｒｅ　（修正実験操作法）″として参照された実験第ニジ リーズにより既に証明された（表５）。

“１目ｅｒａｓ＋ｔ　ｐｒｏｔｔｄｉｒｅ　（代替操作法）”として参照される 実験茶三シリーズにおいては、脈管構造を除く血液の除去のみが実験第ニジリー ズによって示されたように同じ平均程度の特異活性のＴＧＩを得るのに必要であ ったことが証明された。事実、間質組繊を含まずに切開された、脚帯の脈管組構 は、腰帯間質組織のみと同様の活性の腫瘍成長阻害活性を証明した（データは示 されていない）。更に、腫瘍成長阻害活性は、抽出された物質をエーテル／エタ ノール沈殿せずに回収可能であることを証明している。

抽出のために使われた組織１ｇ当たりの酸性化エタノール量容量は、第−実験操 作法及び修正実験操作法の両方で述べられたよりも５０％少なかった。従って、 抽出されたタン／（り質の総容量も少なく、そのために、沈殿のために必要なエ ーテル及びエタノール量も１／２量であった。このことは、フラスコの壁に残留 するであろうタンパク質を最小にした。更に、沈殿を溶量により、その結果最終 容量も最小に保てた。明らかな利点は、タンパク質／活性損失の最小化であり、 それによって、必要とされる試薬の少量化も含むより効率的な抽出法を創造する 。また、切開した慶帯よりも腰帯全部を切り刻んだ方が単調で飽きあきする分離 調製に費やす時間をかなり短縮した。クロマトグラフィ法による精製前の慶帯２ ００−４００グラム（湿重量）より得た最終分離調製品の平均特異活性は約１− ３．０Ｘ１０’ユニット／４Ｏ−５０Ｂであった（表８参照）。

これらの結果は、”１ｌｏｄｉｌｉｅｄ　ｐｒｏｃ＜ｄ＋＋ｒｅ　（修正実験操 作法）″に対して報告された実験結果の範囲内であり、それゆえに第一実験操作 法に比べてタンパク賀回収率及び特異活性においては同じ程度の改善を示してい る（表５）。従って抽出の全体効率は°修正実験操作法”において報告されたよ うに、およそ５倍に改善された。

表８にヒト慶帯から活性ＴＧＩを得るために使われた現在の操作法を要約した。

精製の最初の２段階（［ＩＩＣ及びＣａ１ｌでのＲＰＨＰＬＣ）で活性ユニット は６０−１００％の間の回収率で得られた。

このことはＩＸＩＧ’ユニット／マイクログラムの特異活性で４０．０００増加 率を表わしている（３００ｇｊｌ帯湿重量より　１３Ｘ１０’総ユニツト）。お そらくタンパク質の汚染は、ＴＧＩの生物学的活性の安定化に寄与しており、そ のため精製操作の結果として、活性がより不安定になった事実が認められた。Ｃ １８カラムでのＲＰ−１１ＰＬｃの後に得られた活性分画を凍結乾燥したことに より回収率の最大損失が生じた。このことは、精製操作の最終段階においてＣＮ カラムに添加されるユニットの総数を大きく減少させた。この損失は凍結乾燥に よる活性分画の濃縮により改善されたが完全ではなかった。この精製最終段階に よるユニットの回収率は６Ｇ−１００％の間であった。

“東−実験操作法°において、以前、クロマトグラムは、分離調製品の主要なも のを多様に変えた、このことは、改善のための続く段階の考案を困難にする原因 となつた。修正及び代替の両実験操作法に述べられた現今の方法論は、全てのク ロマトグラムの再現性、タンパク質の回収率、及び各段階での活性収率、個々の 腰帯分離調製品由来の利用可能物質について説明している。この改善は最初のフ ェニル−セファロースを用いたクロマトグラフィの段階において、酸性化、エタ ノール抽出前はヘモグロビン（変性）を除去し及びヘモグロビン以外の汚染タン パク質をより効果的に除去した直接の結果である。

精製操作の最初のクロマトグラフィ段階としてフェニル−セファロースを用いた 疎水性相互作用クロマトグラフィ　（１’１ｌｃ）の使用により活性の全体的収 率（総ユニット）及び特異活性（ｗｎｉｌｓ／−ｇ）が大きく改善することが証 明された。

ＣＭ−Ｔ　ｒ　ｉ目、、、、＠によるイオン交換クロマトグラフィの後、１１１ 当たり　４．２Ｘ　１Ｇ’ユニツトの特異活性を得た。一方、フェニル−セファ ロースクロマトグラフィは１．０？ＸＩｆ１６μ／ａｔの特異活性をもつＴＧＩ をもたらした。この段階において、フェニル−セファロースクロマトグラフィは 精製操作に約２０倍の精製度をもたらした。しかし、フェニル−セファロースク ロマトグラフィにより得られたＴＧＩ含有タンパク質はＣ）ｌ−Ｔｒｉｔ＊ｃＢ ｌ　（ＣＭ　−トリサクリル）クロマトグラフィ由来のＴＧＩ含有物質よりも２ ６倍高い特異活性を示した。もし生物学的に活性な物質が存在するならば均質な 精製のために多くの段階を必要とするようなタンパク質を仮定して、そのＴＧＩ 含有タンパク質の全体的回収率（阻害ユニット）及び特異活性を改善するための 実験が考案された。

“修正実験操作法”における血液の除去及び“代替実験操作法”におけるフェニ ル−セファロースクロマトグラフィの使用の両方はこの目的の仕上げに大きな助 けとなった。この精製操作法へのフェニルーセフアロースクロマトグラフイの導 入は、いりそう高い特異活性（Ｌ−２Ｘ１０’ユニツト／クロマトグラム）をも つ物質をもたらした、この高い特異活性は出発物質の最小量（湿組織重量）での 精製開始を可能にし、そして均質な最終精製までに必要な段階を少なくした。１ ．５Ｍ酢酸アンモニウム、３７％エチレングリコールで溶出したＴＧＩ活性の一 つのピークは、フェニル−セファロースクロマトグラフィに従って得られた（図 １３）。これはまた、宵−実験操作法と比較して、ＣＭＴｒｉｓｓｃｒ７１　（ トリサクリル）■を用いた“修正実験操作法”のＴＧＩの分離における主要な改 善でもあった（図７）。

“代替実験操作法”によるＴＧＩの精製に導入された別の改善は、“第−及び修 正実験操作法”において使われた直線勾配溶出法（図１２）よりもむしろＣ１８ ＲＰＨＢＰＬＣからのアセトニトリルによる段階的溶出法（図１４Ａと１４Ｂ） の使用であった。この方式でのカラム溶出で、生物学的に不活性な汚染物質の約 ９０％を活性の主要ピークから分離することが可能である。最も重要なことのひ とつは腰帯湿組織物質の２００〜４００ｇがフェニル−セファロースクロマトグ ラフィ後充分少量のタンパク質を供給し、その結果、最大で３つ最低で２つのＲ ＰＨＰＬＣＣ１Ｂ及び分析カラムカラム各々に１．０１１！以下を完全分離調製 品のために添加するということである（　＋／Ｉ！Ｊ１４Ａ及び１４Ｂ：ｌ。

ＣＩ８樹脂でのＲＰＨＰＬＣによりいっそう高度に精製された生物学的に活性な タンパク質を相当量で得るための能力は、フェニル−セファロースクロマトグラ フィより得た高特異活性の腫瘍成長阻害活性の分離に直接関係している。Ｃト丁 ｒｉ＋５ｃｒ７１＠によるクロマトグラフィ（修正実験操作法）の後、総生物学 的活性分画のわずか２０％を１つのＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１Ｂ）にかけた、一方、フ ェニル−セファロースクロマトグラフィから得てプールしである総生物学的活性 分画の５０％をＣＩ８カラムに一度に添加した。これらの個々の比較実験におい て、ＣＭ　ＴＲｌ５ＡＣＲＹＬ■を用いたりａマドグラフィ用の開始物質は９． ９Ｂであり、フェニル−セファロースに対しては４２ＩＩｇであった。従って、 もしＣＭ−丁ＲＩＳＡＣＲＹＬ［Ｆ］に対して同じ量の開始物質が使われたなら ば、総分離調製品のわずか４．７％が次のＣＩ８段階で使われることになる。阻 害活性の相当量がＣＩ８カラムに添加されるため１／１００量の試料サンプル（ ０，５曙１に比較して０．　（１０５ｍｌ）が同じ程度の阻害活性を達成するた めに使われた。実験操作のこの点において、はとんどの生物学的活性分画は、５ ＯＳ−ＰＡＧＥを銀染色すると、６つの主要タンパク質バンドに分離した。

ＣＩ８カラムでの［ＩＰＬＣの後、有効タンパク質量が標準タンパク質測定法（ Ｏｎ　２　ｒ、、ｒ、あるいはＬｏｖ＋７法）の検出能以下であったため、タン パク質濃度は測定できなかった。従って、タンパク賀濃度は２０マイクログラム ／■１以下であったと推測される。ＴＧｌはさらに精製するために、活性分画を プールし、凍結乾燥しＲＰＩＩＰＬＣＣＮカラムに添加した。溶媒２−プロパツ ールの勾配を１分間に０．６％増加させると、活性はタンパク質のほとんどの表 面（右側？）に置換することが認められた（ｌｌＵ１６）。様々の活性分画をヨ ー素化し、５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離した。レーン２に説明されたほとんどの生物 学的活性を示す分画（図１６１分画５Ｇ−６５）は、同位体でラベルされた２本 のバンドを含有していた。一本は２５ｋＤｓそして一本は３０ｋＤＩである、ま たレーン３において、分画６６−６８は２５ｋＤＩに均質なバンドを含んでいた 。レーン７、分画＃５８は活性であり、少なくとも５つのバンドを含有する。

タンパク質の主要ピークであり生物学的に活性ではない分画審５６は、２６　ｋ ＤＩバンドを除く分！ｉ＃５８のタンパク質バンド全てを含んでいた（図１７． レーン１）。

図１７に示されたゲルより、３つの主要な結論が導き出される。

１、２６　ｋＤｓタンパク質は生物学的に活性な物質を含む分画にいつも存在し そして同様に、生物学的に活性でない分画には常に存在しない。２．７Ｇ＋は、 血小板及びＴＧＦ−βとして表わされる他の組織由来の遍在タンパク質に類似し た質的活性を示した、このＴＧｒは、図１５Ｂと図１７において示されたように 、５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＭｒ　２５　ｋＤｇのタンパク質として泳動する。３ ９図１７レーン２で、最も高い生物学的活性を示している活性分画（２，ＯＮユ ニット）は、阻害活性２５６ユニツトを含むレーン７において得られたＴＧＦ− βの２５　ｋＤ＊バンドの出現に、強度（ヨー素化タンパク質）を比較しない。

このことは特異活性における量的違いを意味している。

アセトニトリルでのＣＩ８カラムからの段階的勾配溶出法の使用で活性の２つの ピーク、１つは２７％、１つは２Ｂ−３０％で溶出、を分離した（図１４Ａと１ ４Ｂ）。図１４Ａと１４Ｂにおいて示されているように似たようなプロフィール を示すカラムより、２つの分離したプール、プール■（２７％）及びプールＩ＋ 、（Ｈ−３０％）の中に個々の分画を組み合わせた後、このプールしたものを、 図１６に示したよりももっと浅い勾配を用いたＲＰＨＰＬＣＣＮカラムに添加し た（０．６％／ｓｉｎに比べて０．３７％／ｍ＋＋＋）。プールＩは２−プロパ ツール４（１−４１％で溶出（図１８）、そしてプール１１は２−プロパツール ４４％で溶出した（図１８）。予想したように、Ｃ１１ｌカラムから溶出した疎 水性タンパク質（プール１１）の多くが、ＣＮカラムから疎水性に溶出しつづけ たことは特記すべき重要なことである。従って、成長阻害活性の２つの明瞭なピ ークは“代替実験操作法”のタンパク質精製法を用いて得られた。

活性の最初のピーク、プールＩはプール１１よりも多い阻害ユニット８２％を含 んでいる。

血小板由来、丁ＧＦ−βとして表わされる精製タンパク質は、我々の阻害測定に おいても生物学的に活性であるがしかし、所有する活性はプール■の１／１０〜 １／１０Ｇに一致する。プール１１ブール１１、及びＴＧＦ−βの全てのケース での活性がＭｒ　２６　ｋＤｇのタンパク質バンドの存在に一致する（図１５と Ｉ？）ため、これら全てのタンパク質は、成長阻害及び／あるいは成長制御タン ノ々り賀のファミリー（−族）に類似しているかあるいは属して−するという可 能性が推測される。これらのタンパク質のＣ１ｇ及びＣＭ樹脂両方での異なる溶 出、及びＴＧＩの高い特異的活性のために、二者択一的にＴＧＩ　はＴＧＦ−β よりも完全に異なっている可能性がある（　ＴＧＦ−βプロフィールの上昇は示 していない）。更に生化学的な特＃ｋ（アミノ酸配列）もこの疑問を解決するは ずである。結論としてＴＧＩ　は、より高い阻害活性をもち、そして本試験での 比較のために使われた血小板由来のＴＧＦ−βとは異なる（溶出位置）と考えら れる。

Ａ４３１より得たならし培養液は２つのタイプの成長阻害活性をそしてＡ３４９ 及びＣＣ１６４ミンク細胞両方を阻害する。このＴＧＩの阻害の選択性は、ヒト 脚帯抽出物においてＴＧＩ−１及びＴＧＩ−２に対して得られた選択性に類似し ている。第２番目アセトニトリル３０−３６％の間に溶出する丁Ｇ＋はミンク細 胞以上Ａ３４９細胞の阻害に対して高い特異性を示す。出願人には、ある一般的 な特徴を持っている別々の存在のファミリー（−族）を現在予期している。各− 族のメンバーは、単層培養におけるミンク肺ＩＩ！！胞ライン（ＣＣＬ６４）及 びヒト癌腫セルライン（ＡＳ４９）の両方に対して腫瘍成長阻害活性を示す、分 子量２６．　Ｏｎダルトンの、ジスルフィド結合により結合されたポリペプチド ２重合体である。この−族は、新しい別々の因子ＴＧＩ−１とＴＧＩ−２及び以 前明らかにされた因子ＴＩＦ−１とＴＧＦ−βを包含する。現在、Ｔ１ト１とＴ ＧＦ−βが、ＴＧｌ４とＴＧＩ−２両方と区別され得る同じポリペプチドである ことが予期されている。別個のものであるＴＧｌ−１とＴＧｌ２はＴＧＦ−βと は両方とも同じではない。ＴＧｌ−１と丁ＧＩ−２は各４丁ＧＦ−βより高い特 異活性をもうている。ＴＧＩ−１とＴＧｌ２の両方は、２−プロパノールを溶媒 にしたＣＭ−カラムを用いた高圧液体クロマトグラフィで丁ＧＦ−βとは異なっ て溶出する。更に、ＴＧＩ−１とＴＧＩ２は２−プロパツールを溶媒にしてＣＮ カラムを用いた高圧液体クロマトグラフィで互いに異なって溶出する。

ヒト腫瘍細胞ライン（Ａ５４９）のならし培養液由来のＣＭ−１とポリペプチド の２つの因子もまた明らかにされた、両方がヒト腫瘍細胞ライン（Ａ５４９）の 成長を実質的に阻害する能力をもち、一方、確立されたミンク肺細胞ライン（Ｃ ＣＬ　６４）の成長阻害能力はもたないため、ＣＭ−１がＡ４３１細胞より得た ならし培養液由来ＴＧＩ　と同じであることが予期されている。またｃＭ−ｉは 、ＴＩＦ−２の初期の特徴に類似していることも予期されている。

４シリーズの実験 腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の単ＴＧＦ　ｍｌ　ｃ ＤＮＡの配列は発表されている（Ｄｔ＋ｙｎｅｋ、　Ｒ，等、１１ｓｌｌｌｒｅ 、３１６巻、７０１〜７０５頁）。この配列に基づいて、本願発明の発明者等は 、市販のλｇｉｌ＋　ヒト胎盤ライブラリー（ＣＩｏｎ＊Ｉｅｃｈ　：登録商標 ）からＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡを単離するのに用いる２５マーのオリゴヌクレオ チドプローブ（ＴＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣ丁ＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＧ）を合成 した。これらの実験および下記の実験を行うために、標準的分子生物学上の方法 を利用した（例えば、Ｌｎｉ＆＋ｉｔ、　Ｔ、等、１９８２年、１Ｊｏｌｅｃｎ ｌｉ＋　Ｃ１ｏｎｉＢ。

＊　１ｔｂｏ＋ｇｌｏ＋７　ｍｔｎｎ！ｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｓｒ ｂｏｒ　Ｌｓｂｌ　ａ制限地図を作成し、部分配列分析を行うことによって、そ のクローンが、３９０のアミノ酸のＴＧＦ−β１前駆物質の完全コーディング配 列を含有しているが、５′末端と３′末端の両方からいくつかの非翻訳配列を欠 いている（５′末端からの４３９　ｂｐと３′末端からの約２００のｂｐ）こと が分かった。

ＴＧＦ−β１の細菌での発現 ＴＧＦ−β１遺伝子のセグメントを、２つの類縁の誘導発現ベクター、すなわち ｐＡＴＨＩＩ　（ＳｐｉｌｌｄｌＢ等、）、Ｙｉｒｏｌ、、４９巻、１３２〜１ ４１頁、１９８４年）とｐＫＳ−１（ｐＡＴＨｌｌの誘導体）を使って、Ｉｒｐ 　Ｅ　：：ＴＧＦ−Ｉ１融合タンパク賀として、イー−）リ　（Ｅ、ｃｏｌｉ） 内で発現させた。ｐＡ丁［１１１：：ＴＧＦ−βｌ構築体は、Ｂｉｌ　ｌ−５ｔ ｌ　ｌ断片を、ｐＡＴＢ　１１の多数クローン化部位にクローン化することによ って製造した。Ｂｓｌ　Ｉ−８＊ｌ　ｌ断片はＴＧＦ−β１のアミノ酸残基２４ ９〜３９１をコードする。ｐｉｓ−１：：ＴＧＦ−β１構築体は、Ｎ５ｅ１−　 Ｓｍｌ　ｌ断片を、ｐｉｓ　１の多数クローン化部位にクローン化することによ って製造した。

上記のＮ＊＊　ｌ−５ｓｌ　ｌ断片は、ＴＧＦ−β１のアミノ酸残基２５〜３９ １（図２３）をコードする。

その発現プラスミドを含有する細菌（イー・コリＲＲ１１を、５０ｇｇ／鳳１の アンピシリンと２ｈｔ／ｍｌのトリプトファンを補充した１１のＭ９培地（１１ 中に、１０ｇのＮ　ａ　ＨＰ　Ｏ４と水、３ｇのＫＨＰｏ　、０．５ｇのＮａＣ ｊ、ＩｇのＮ）Ｉ４Ｃｒｔ　、　５ｇのカザミノ酸、１１のＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４、 Ｏ−２ｍ　ｌの　０．５Ｍ　ＣａＣ１２，５ｍｌの４０％グルコース、１０１の １１／１チアミンＢ１を含有）中で一夜増殖させた。−夜培養物の１７２１を、 アンピシリンを補充したＭ９培地５１で希釈し、多量に通気しながら３０℃で１ 時間増殖させた。タンパク質の発現は、１２．５μｍの２１！／１インドールア クリル酸（ＩＡＡ）を添加することによって誘発し、さらに２時間３０℃で増殖 させた。１１を遠心分離しく上澄み液は可溶性画分である）、生成したベレット を１００　μｍのＴＥＮ　ｉｌｌ液液５０　ｍＷのトリス−塩酸ｐＨ７，５、Ｏ １５ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

０．３ＭのＮ＊ＣＩ）中に再懸濁させた。次に、連続して以下のものを添加した 。

１０μｍの１０ｍ（７ｍｌリゾチーム、氷上１５分間。

２μｍの１０％ＭＰ−４０、氷上１０分間。

ｌ５Ｏｕｌの１．ｓ　Ｍ９　ＮａＣ１，１２ｍＭのＭｇＣｌ２および０．４μｍ の１．９＋ａｇ／ｉｆ　ＤＮアーゼ、氷上１時間。

次に、不溶性画分を、マイクロ遠心分離器で５分間遠心分離して集めた。生成し たペレットを　１００μＩのＴＥＮ緩衝液で２回洗浄し、最後に、０．ＯＩＭの リン酸ナトリウムｐＨ７，２，１％のβ−メルカプトエタノール、１％のＳＤＳ 、６Ｍの尿素含有液５０μｍに溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。

標準の５ＤＳ−ＰＡＧＥ法とクーマシーブルー染色法によって、構築された発現 プラスミドが、予想された分子量（５３ｋｄと４５ｋｄ）を有する融合タンパク 質を産生ずることが分かった。ウェスタンプａｙト（Ｔｒｒｖｂｌｎ等、Ｐｒｏ ｔ、Ｎａ１１．　Ａｃｘｄ、ｌｃｉ、７６巻、４３５０〜４３５４頁、１９７９ 年）の前記両タンパク質は、市販の、ＴＧＦ−β１に対するポリクローナル抗血 清（Ｒ１ａｄ　Ｄ　５７ｓｌｅ＋ａ＋　ｌ＋ｃ、）と反応丁ＧＦ−β１と相同性 を有する配列を同定するために、成熟形の丁ＧＦ−βｌ　ｃＤＮＡ配列の大部分 を含有するＰマ＊　Ｉｆ−Ｐマａ　ＩＩ　プローブを、３２Ｐで標識し、そして 、ＥＣ０ＲＩ　、　Ｂｉｎｄ　ＩＩＩもしくはＳｓｌ　１で消火した全ひとＤＮ Ａのサザンプロット（Ｓｏｕｔｈ！ｒｎ、１．　ＭＤＩ。

Ｒｉａｌ、　９８巻、５０３〜５１７頁、１９７５年）のスクリーニング（標準 法）に用いた。各消火において、２つのバンドが、厳格さく　ｓ＋＋１Ｄｔｃ＋ ＋ｃｙ）の低い洗浄で（２，５Ｘ５ＳＣ，６５℃）で現われた（図２４）。洗浄 の激シサカ増大スルと（０，０１ｘ　ＳＳＣ，６５℃）、雑種形成バンドが１つ だけ各消火物中に残った（図２４）。光の強くハイブリダイズしているバンドは ＴＧＦ−β■のようであり弱くハイブリダイズしているバンドは、腫瘍成長阻害 活性を育するタンパク質をコードする関連遺伝子である。腫瘍成長阻害活性を有 するこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列とそのアミノ酸配列を図２９ に示す。

７ＧＦ−β１と相同性で腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝 子を単離するために、慢性骨髄性白血病細胞系（［５６２）のＤＮＡで構築した ヒトファージライブラリーをスクリーニングするのにＴＧＦ−β１クローン由来 のＰｙｏ　Ｉｆ−Ｐｖｕ　Ｉｔプローブを使用した。ＴＧＦ−βｌと、腫瘍成長 阻害活性を有するタンパク質をコードする関連遺伝子（図２９）とに対応する２ つのゲノム遺伝子座がクローン化され、ファージのｐＵＣサブクローンのマツピ ングが綱ｗｉ酵素分析法で行われた（図２５と２６）。Ｋ５６２ライブラリーの 構築や、組換えクローンのスクリーニングと単離は、奉賀的には、Ｇ＋ｏＩｖｅ ｌｄ等、Ｇ！ｎｔｓ　１３巻、２２７〜２３７頁、１９８１年の方法にしたがっ て行った。

↑ＧＦ−β１に関連するタンパク質をコードする配列を含有し腫瘍成長阻害活性 を有するファージＤＮＡクローンを、５ｓｕＸＡで切断し、生成した制限断片を Ｍ１３にクローン化した。その組換えプラークを、ＴＧＦ−β１のＳＨｌ−Ｐｖ ｕ　Ｉｆプローブでスクリーニングした。６つのハイブリダイズしているゲノム クローンを５ｉｓｅｔ等の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎｓ口、＾ｅｓｄ、Ｓｃｉ、、７４ 巻、５４６３〜５４６７頁、１９７７年）で配列化して、約ＨＯｂｐの領域が、 丁ＧＦ−β１のｃＤＮＡと相同であることが分かった（図２７）。ＴＧＦ−βｌ のアミノ酸配列と、これらの実験でクローン化した関連遺伝子を比較したところ 、それらは８２％相同であることが分かった。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする関連遺伝子のリピート・フリ ー・プローブを得るために、この遺伝子の８１ｄｌ−Ｂｓｄｌサブクローン由来 の各種の制限断片を、全ヒト１１ＮＡのみならずＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡとハイ ブリダイズさせた。腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の Ｂ＊ｍ［１ｌ−Ｔｓｑｌ断片が、ＴＧＦ−βｌ　ｃＤＮＡと交差ハイブリダイゼ ーションを行うことが分かった。腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコード する遺伝子中の上記断片の位置を図２８に示す。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする配列・のＢ＊ｍＨＩ−Ｔ＊ｑ 　ｌユニークプローブを、λ〜ｇｊｌ’ｌヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ＣＩ ｏｎｔ＋ｅｃｂ　：登録商標）をスクリーニングするのに使用した。２つの強く ハイブリダイズするクローンと、４つの弱くハイブリダイズするクローンが単離 された。ＤＩＩＡ配列の分析によって、弱くハイブリダイズするクローンが、Ｔ ＧＦ−β１に相当することが分かった（図２９）。１つの強くハイブリダイズす るクローンを単離して、１．７ｋｂのＥｃｏＲ１挿入断片をρＯＣ８にサブクロ ーン化した。このクローンの制限地図を図３０に示す。

このクローンの制限断片をＭ１３にサブクローン化し、５ＩＨｔｒ等の方法で配 列を決定した。この遺伝子の推定アミノ酸配列は、ＴＧＦ−β１　：　ＴＧＦ− β２；グリオブラストーマＴ細胞サプレッサー因子（Ｇ−ＴｓＦ）因子；インヒ ビン／アクチビン；ミニーラー阻害物質（ＭＩＳ）　：および全体が保存されて いる６つのＣ末端システィン残基を有するショウジヨウバエのデカペンタブレシ ック（ｄｓｅｔｐｅ＋＋１ｓｐｌＢｔｃ）転写複合体；を含む遺伝子ファミリー 　（ＭｓｓｓＢ＋＋＠、Ｊ、、Ｃ＠１１．４９巻、　４３７〜４３ｇ頁、１９８ ７年）と広範囲にわたって相同性を示す。ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２との比較 結果を図３１に示す。腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードするｃｌＨ ＾配列（図２９）は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードするゲノム ＤＮＡ由来の配列（５！２２７）と一致した。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列を含有する１７ ｋｂのゲノムＤＮＡ　Ｉｆｒ片をクローン化した（２６図参照）。腫瘍成長阻害 活性を育するタンパク質をコードする１、７ｋｂのｃＤＮＡクローンの５′と３ ′の部分を、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質のゲノム遺伝子座とハイブリ ダイズさせた結果、前記の１．７ｋｂのｅＤＮＡ配列が、ゲノムクローンの中に 完全に含有されていることが分かった。腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の 全長のメツセージが３．５ｋｂであることを考慮すると、追加の５′と３′のフ ランキング（隣接）配列を単離して完全遺伝子を得ることができる。これは、ゲ ノムファージとコスミドライブラリーを、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質 をコードする遺伝子に対して特異的なプローブでスクリーニングすることによっ て行われる。

ＴＧＦβ１において、配列Ｒ−Ｒは（図３１の１位と２位に示す）、成熟タンパ ク質を生成する、タンパク賀分解反応の切断部位を示す。腫瘍成長阻害活性を有 する関連のタンパク質では、配列Ｒ−に−に−Ｒが、対応する切断部位を示すよ うである。

予測される切断部位に対してＮ末端になる領域において、ＴＧＦβ１と、腫瘍成 長阻害活性を有するタンパク質をコードする関連遺伝子とは、７％の相同性しか 示さない。しかし上記タンパク質は両方とも、フィブロネクチン受容体が認識で きる配列Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｌをこの領域に含有している。

細胞系のどの種類が腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする関連遺伝 子を発現するのかを決定するために、５′末端のＥＣ０ＲＩ−８１１ＩＩプロー ブを用いてノザーンハイブリダイゼーシジンを実施した（図３２）。これによっ て、Ａ６７３　（横絞筋肉腫）　Ａ４９ｇ　（腎臓癌腫）、およびＡ３４９　（ 肺腺癌）中の弱いハイブリダイゼーションシグナル中に約３．５ｋｂのａＲＮＡ があることが分腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする関連遺伝子の ３′領域由来のゲノムプローブ（タンパク質加水分解による切断の予想部位の下 流に相当する）を、同じノザーンプロットをスクリーニングするのに使用した。

３つの強いハイブリダイゼーションシグナルがＡ６７３とＡ４９８の両方に観察 された。すなわちＴＧＦ−βＩ　（２，５ｋｂ）、腫瘍成長阻害活性を有する関 連タンパク質（３，５ｋｂ）、および他の関連遺伝子（４，２ｋｂ）に相当する ものである（図３３）。これらの結集は、このプローブが、腫瘍成長阻害活性を 有するタンパク質と相同の配列と交差反応すると予測されることと一致している 。

次に、Ａ６７３、Ａ３４９およびＡ４９８の細胞系を、Ｐｌｊ　ｌ−Ｂ１１　Ｉ 　ＴＧＦ−β１プローブを用いてノザーンプロット分析した。このプローブは丁 ＧＦ−β１に対して高度に特異的なはずである。なぜならば、このプローブはタ ンパク質加水分解反応による切断部位に対するＮ末端に相当する配列を含有し、 その部位では、ＴＧＦ−β１は、この遺伝子ファミリーのその外のメンバーに対 してほとんど相同性を示さないからである。公知の２．５　ｋｂの大きさのＴＧ Ｆ−β１ｍＲＮ＾に基づいて予測されるように、２．５ｋｂのｍＲＮＡバンドと の強いハイブリダイゼーションが、３つの細胞系全部に観察された。

いくつもの弱いハイブリダイゼーションバンドも４．２ｋｂと３．５ｋｂに観察 された（図３４）。

次に、Ａ３７３、Ａ３４９およびＡ４９Ｂ細胞系をノーサンプロット法で分析し た物を、ＴＧＦ−β１前駆物質の完全コーディング配列を含有するＴＧＦ−β１ 　ｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。このプローブはＴＧＦ−β１と相同性 の配列と交差ハイブリダイゼーションすると予測される。予測どおりに、ＴＧｒ −βｌに相当する　２．５ｋｂのｍＲＮＡバンド、およびＴＧＦ−β２に相当す ると考えられる４、２ｋｂのｍＲＮＡバンドとに強くハイブリダイズした（図３ ５）。

ヒト腰帯およびＡ６７３細胞系由来のｍＲＮＡのノーサンプロット法によって分 析したものも、膿瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする関連遺伝子の ＥｃｏＲＩ−Ｂｌｌ　ＩＩ　ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、スクリーニ ングした（５Ｕ３６）。この図には、各レーンにおいてｍＲＮＡのレベルを規格 （標準）化する対照の役目をするアクチンプローブを用いた結果を示す。腰帯は 、アクチンａＲＮＡレベルに規格化されると、いままで試験した起源の、腫瘍成 長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の最高レベルのｍＲＮＡを発 現する。

ＥＣ＠Ｒ１で消火し、次いで腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする ＴＧＦ−β１関連遺伝子の５ＨＩ−＾マＩＩ　ＣＤＮＡ断片をプローブとして用 い、厳しさく　ｒｔ＋ｉｎｇｅｎｃ７）の弱い洗浄（２，５ｘＳｓＣ１６５℃） 下と強い洗浄（０，３Ｘ　ＳＳＣ，６５℃）下でハイブリダイズさせた各種の異 なる腫瘍ＤＮＡについて、サザンプロット分析を行った。サザンプロット分析の 結果は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関する他の 遺伝子座が存在する可能性があることを示している。なぜならば上記のプローブ が、弱い洗浄の条件下の場合にのみ観察される２つのバンドＣ３ｋｂと１２ｋｂ ）とハイブリダイゼーションするからである。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の全長ＣＤＮＡクロー ンを得るために、ヒト繊維芽細胞の岡山・パークのｅＤＮ＾ライブラリーのプロ ットを、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の１．７　ｋ ｂ　ｃＤＮＡクローンの５　’　ＥｃｏＲｌ−Ｂｇｌ　ＩＩプローブを用いてス クリーニングした。３，２ｋｂのハイブリダイズしているバンドが、中位の激し さの洗浄下（０，３ｘ　ＳＳＣ，６５℃）で目視可能になる。

腫瘍成長阻害活性を育するＴＧＦ−βｌｌ５Ｉ連タンパク質に対する特異性を有 する抗体の製造 ＨｐＥ遺伝子の小領域に融合された、腫瘍成長阻害活性を有する関連タンパク質 のＣ末端の１５０のアミノ酸を含有するキメラ細菌タンパク質を構集した。この ような融合タンパク質は、「腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の、アミノ酸 数が９〜２８の成熟形から誘導されたペプチド」に対して産生された抗体によっ て認識されることが見出された。この抗体は、Ｃａｒｐ：：腫瘍成長阻害活性を 有するタンパク質コの融合タンパク質の方を、「ｌ＋ｐ：：ＴＧＦ−β」融合タ ンパク質よりも高度に認識し、そのペプチドは、抗体の結合性についても、腫瘍 成長阻害活性を有するタンパク質と特異的に競合する。

腫瘍成長阻害活性を育するＴＧＦ−β１関連タンパク質をコードするＤＩＩＡ配 列を、ｐＫｓベクターにクローン化した。このベクターは、誘導ｔｒｐプロモー ターと多数のクローン化部位を宵するｐＡＴＨＩ＋誘導体である。得られた構築 物は、ＩｒｐＥ遺伝子の最初の２２個のアミノ酸、腫瘍成長阻害活性を有するタ ンパク質のＣ末端の＋５ｆ１個のアミノ酸で構成されているキメラタンパク質を 産生ずる。これらのクローンを含有する形質転換細胞を、第一に、制限エンドヌ クレアーゼ分析を行ってスクリーニングし、最終的に、キメラタンパク質の産生 について、ｓＤｓポリアミドゲル電気泳動法でスクリーニングした。３つのクロ ーンｐ１１６、ｐ１３４およびｐＨ５のタンパク質産生物を図３７に示す。これ らの細胞をこれら細胞が初期ｌｏｇ相に到達するまで、所定の培地内で増殖させ 、次いで、ＨｐＥ誘導物であるインドールアクリル酸（ＩＡＡ）の存在下もしく は非存在下で３時間インキュベートした。

得られた細胞を集め、溶解し、そのタンパク質を、１２．５％ＳＯＳポリアクリ ルアミドゲル上で電気泳動を行わせた。図３７は、上記のゲルの１つをクーマシ ーブルーで染色したものの写真である。この写真で見ることができるように、ｐ １１６とｐ１３５の溶解物は、分子量が約ｉ９．　ｏｎダルトンで、その相対数 がＩＡＡの存在下で増大するタンパク質を産生ずる。対照的に、ｐ１３４はこの タンパク種を産生しない。ｐ１１６とｐ１３５の両者は、次のものを含んでいる 。つまり、１９．５００ダルトンの分子量の融合タンパク質を産生ずるはずの定 位（向き）にクローン化された、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の配列を 育することが制限分析によってわかったプラスミドを含有している。ｐ１３４プ ラスミドは、逆の向きに、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の配列をもって いることが見出された。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の一部に相同のペプチドを抗原として使用 して抗体の特異性を調べるため、ｒ　ｊｒｐＥ：：腫瘍成長阻害活性を有するタ ンパク質」の融合タンパク質を利用した。配列中の残基９のアルギニンがセリン で置換されている以外、腫瘍成長阻害活性を有する成熟タンパク質の残基９〜２ ８に相当するポリペプチドを合成した。このペプチドをＩＰＩＩＰＬＣで精製し 、キーホールリンペットヘモシアニンに結合させて、ウサギの免疫原として使用 した。

最初の注射（５００Ｊｇ）をしてから３３日後に、１ウェル当り１００Ｊのペプ チドを用いて、標準ＥＬＩＳＡ法で、抗血清をスクリーニングした。１匹のウサ ギが、該抗体の１：２５希釈物に、１．００Ｄ単位のシグナルを示した。このウ サギから最初に採血してから１０日後に、２５０　ｍｇの結合抗原を追加免疫注 射した。最初に採血してから２０日後に次の採血を行い試験したところ、前記ペ プチドの抗原に対する抗体反応が２０倍になっていた。最初の採血をしてから４ ０日後の３回目の採血では、抗血清のｌ　：　１１０００希釈物に、１．０００ 単位のシグナルが得られたが、このシグナルは２回目の採血の１６倍の抗体力価 である。この抗体は、ＴＧＦ−β１配列由来の相同ペプチドとほとんど交差反応 性を示さなかった。

ＴＧＦ〜βｌ由来のペプチドは、成熟ＴＧＦ−β１タンパク質の４〜１９番のア ミノ酸で構成されている。残基９〜１９の１１個の共通アミノ酸のうち７１が、 腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質とＴＧＦ−β１との間に保存されている。

前記ペプチドを認識する抗体が、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質を認識で きるかどうかを決定するために、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質とＴＧＦ −β１との融合タンパク質に対する抗体を、ウェスタンプロット分析に用いた。

ＷＪ３ｇに見られるように、上記の抗ペプチド抗体は、腫瘍成長阻害活性を有す るタンパク質の融合タンパク質と強く反応したが、一方＋ｒｐ：：ＴＧＦ−β１ 融合タンパク質とは弱く反応したにすぎない。両方の融合タンパク質は、市販の 抗−ＴＧＦ−β１抗体（Ｒｅｎｄ　ＤＳＨ１ｅｍｓ社）によって認識された（図 ３８）。

図３８で分かるように、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質を認識する抗ペプ チド抗体も、細菌タンパク質に対し高レベルのバックグランド反応性をもってい る。この交差反応性を減少させるために、本発明者等は、抗原として用いたオリ ジナルのペプチドを含有するＣＮＢｒ−セファロースカラムで、上記抗体を精製 した。得られた抗体は、腫瘍成長阻害活性を育するタンパク質のペプチドに対す る高い力価を保持し、相同ペプチドの丁ＧＦ−β１に対する低い交差反応性を示 した（データは提示していない）。次に、精製したペプチド抗体を、ＴＧＦ−β １との交差反応性について、ウェスタンプロット分析法によって試験した。

結果を図３９に示す。精製抗体は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の融合 タンパクｇ！（レーン２）および高分子量のタンバク質種と非常に強く反応する が、一方、他の細菌タンパク質とのハイブリダイゼーシッンは、未精製の抗体に 比べて大きく減少することが分かった（図３８）。上記精製抗体は、ＴＧＦ−β １融合タンパク質（レーンｌ）や市販の丁ＧＦ−β１　（Ｒｓａｄ　ＤＳ７ｓｌ ＋ｍｓ社）の精製物（レーン３と６）と無視できる反応性しか示さない。精製抗 体を、３００１倍過剰モルのペプチドとともにブレインキュベートして競合試験 を行った（レーン４．５および６）。その抗体を過剰のペプチドとともに室温で ６０分間ブレインキュベートしたところ、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質 の融合タンパク質とのハイブリダイゼーシヨンは著しく減少したが（レーン５） 、ＴＧＦ〜β１融合タンパ融合タンパ石質すトレースバックグランド反応性や他 の細菌タンパク質との雑種形成は減少しなかった（レーン４）。したがって、上 記の抗ペプチド抗体は、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質の配列を含有する タンパク質を特異的に認識する。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質と融合したＴＧＦ−β１の真核発現 ヒト組換えＴＧＦ−β１はサルＣＯ５細胞内で発現した。ＴＧＦ−β１ｃＤＮＡ の完全前駆物質をコードする配列を、ｐｓＶＬＸ核発現ベクター　（Ｐｈ＊ｒ■ １ｃ目社から入手）を用いてＳＶ４０プロモーターの下流でクローン化した。こ の構築物を、標準のリン酸カルシウム沈澱法（Ｇ目ｂｔｍとｗｔｎｄｓ＋　Ｅｂ 　、　ＶｉｒｏｌｏＢ、５２巻、４５６〜４６７頁、１９７３年）を用いてＣＯ ５細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、約４　Ｘ　１０６ の細胞を、血清を含有しない培地で２日間増殖させた。次いで、得られた順化培 地を集め、酸相にして生物活性について試験した。ＴＧＦ−β１でトランスフェ クトした細胞由来の順化培地で、単層ミンク肺試験細胞系（ＣＣＬ６４）の成長 を３２％しか阻害しなかつたｐｓＶＬベクターだけでトランスフェクトしたＣＯ ３細胞由来の順化培地に比べて、ＣＣＬ６４細胞の成長を５９％まで阻害するこ とが分かった。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードする配列の全長クローンは、発現 分析を行うのに現在入手できないので、ｒ　ＴＧＦ−β１；：腫瘍成長阻害活性 を有するタンパク質」のキメラ融合構築物を次によって、つまり、腫瘍成長阻害 活性保有タンパク質のコード配列でＴＧＦ−β１前駆物賀の３′配列を置換する ことによって、製造した。これらの２つのタンパク質が相同でそのシスティン残 基の保存位置がわかれば、このような構築物をＣＯ５細胞にトランスフェクトす ると、その新規な融合タンパク質は、腫瘍成長阻害活性を有する、生物学的に活 性な成熟タンパク質になることができる。「＋＋ｐＥ：：腫瘍成長阻害活性を有 するタンパク質をコードする遺伝子」の融合体であって、５ｖ４０プロモーター 、またはマウス乳癌ウィルス（ｉｌＭＴＶ）の長い末端繰返し単位の調節配列下 でクローン化された融合体で構成されている別の構築物を製造し、一時的なトラ ンスフエフシコン実験において生物活性について試験することができる。

４　シリーズの実験からの結論 上記の４シリーズの実験では、腫瘍成長阻害活性を有するタンパク質をコードす る関連遺伝子を単離するのに、ＴＧＦ−β１をクローン化して用いた。丁Ｇｉｌ もしくはＴＧＩ−２のどちらが、ｒＴＧＦ−β１に関連しかつ腫瘍成長阻害活性 を有するタンパク質」に対応するかということは決定されなかったが、当業者な らば、このような対応が存在することは（この対応の正確な特性は明確にすべき であるが）分かるであろう。

第５シリーズの実験 腫瘍増殖阻害活性を有するタンパクをコードする遺伝子のより一層の配列決定 腫瘍成長阻害活性を有するタンパクをコードする遺伝子の、λ　１ｔ１１　ヒト 胎盤ｃＤＮＡライブラリー［クローンチック（Ｃｌｏ山ｃｈＨ，２Ｘ１０’個の 独立クローンコを、第８７頁１５〜１８行および図２８に記載されているように 、リピートフリー・プローブでスクリーニングすることにより、１．７ｋｂのｃ ＤＮＡクローンが単離された。ノーザン分析によると、腫瘍増殖阻害活性を有す るタンパクのｍＲＮＡは約３．５ｋｂであることがわかったが、このことは我々 が全長ＣＤＮＡを得ていなかったことを示している。

５′側配列の追加情報を得るために、本発明者は、λ　ｇ＋１１ヒト謄帯ｃＤＮ ＾ライブラリー［クローンチック（ＣＩｏｎｌｓｃｈＨ，５ｘ１０’　（Ｉの独 立クローン］を、胎盤ｃＤＮＡクローンに由来する　５′ＥｃｏＲ１−ＪＩ　Ｉ Ｉ制限断片（図４０、トＢとして図示）でスクリーニングした。これにより、１ ．９ｋｂのｃＤＮＡが単離された（図４０）。

配列分析によって、このクローンが、１８０　！の追加のヌクレオチドからなる ５′側配列情報を含んでいることが判明した。このｃＤＮＡを腰帯ライブラリー から単離することによって、この遺伝子が、この組織中で活発に転写されること が再び確認される。

腫瘍成長阻害活性を有するタンパクをコードする遺伝子に対するより一層のｃＤ ＮＡ配列情報を得るために、Ａ６７３細胞からｍＲＮＡを単離し、ＣＤ１Ｉ＾ラ イブラリーを調製した。５μｇのポリ　（Ａ）＋１Ｎ＾から出発して、アメルシ ャム（Ａ＊ｅｒｓｈｓｍｌ　ｃＤＮＡ合成系を用い、製造業者の手順に従って、 約２Ｘ１０６個のクローンからなるランダムプライムド（ｒ＊ａｄｏｍ　ｐｒｉ ａ６ｄ）　ｅＤＮＡライブラリーをλを目θ中に構築した。約１１．７　ＸＩＯ ’　ａｌの未増幅ｅＤＮＡクローンを、１．９ｋｂのｃＤＮＡクローンの５′末 端近傍の配列に対応する２５　ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブ （５’　−ＡＴＡＴＡＧＣＧＣ了Ｇ丁ＴＴＧＧＣＡＡＴＧ丁ｃｃＴ−３’　）　 でスクリーニングし、１．７ｋｂの挿入物を含む唯一の陽性クローンを同定した 。

３つの重複するｃＤＮＡ　（図４１）の分析によって、２５２９塩基の配列が判 明し、最大のオーブンリーディングフレームは１２３６塩基であうな。本発明者 は、これらの重複するｃＤＮＡに配列の違いが全くないことを見い出したが、こ のことはそれらが同一の遺伝子の転写物に由来していたことを示している。本発 明の配列は、１０３１ｂｐの完全な３′側非翻訳領域を含んでおり、ポリ（Ａ） 部分の２５ｂｐ上流にはポリアデニル化シグナルを有する。５′側非翻訳領域は ２６２　ｂｐを有するが、ノーザン分析によって推定されるｉＲＮ人の寸法から 判定すると、約１ｋｂを欠いている。腫瘍増殖阻害活性を育するタンパクをコー ドする遺伝子の推定アミノ酸配列は、ＴＧＦ−β１およびβ２に対して広範囲に わたる相同性を示す（１！１４２）　［プリンク（Ｄｅｒ７ｎｃｋ）ら、（１９ ８５年）ネイチャー（Ｎｓｌｃｒｅ）　、３１６巻、７０１〜７１１５頁；デ・ マルチイン（ｄｅ　Ｍｔｒｔｉｏ）ら、（１９１１７年）エンボ・ジャーナル（ ＥＭＢＯ１，）、６巻、３６７３〜３６７７頁；マディセン（Ｍ畠ｄｉｓｅＩｌ ）ら、（１０８年）ＤＮＡ　７巻、１〜８頁］。

丁ＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、それぞれ００個および４１４個のアミノ酸 残基からなる前駆体形で産生される［プリンク（Ｄｅ＋ｙ＋＋ｃｋｌら、（１９ ８５年）ネイチャー　（Ｎｕｎ＋ｅ）　、３１６巻、７０１〜７０５頁；デー？ ルティン（ｄｅ　Ｍｔｒｔｉｏ）ら、（１９８７年）エンボ・ジャーナル（ＥＭ ＢＯＪ、　’）　、６巻、３６７３〜３６７７頁］。腫瘍増殖阻害活性を有する タンパクをコードする遺伝子に対して本発明者が得たＣＤＮＡ配列（図４１）は 、４１２個のアミノ酸をコードするオーブンリーディングフレームを含んでおり 、終止コドンに先行する最初はＡＴＧは１６２ヌクレオチド上流にある。ＴＧＦ −β１　［プリンク（ＤｓＢｎｃｋｌら、（１９１１５年）ネイチャー（Ｎ［ｕ ＋ｅ）、３１６巻、７０１−７０５頁］およびＴＧＦ−β２［デ・マルチイン（ ｄｅ　ｋｌ＊ｒｔｔｍ）ら、（ｌＮ７年）エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、） 、６巻、３６７３〜３６７７頁コについて見い出されているように、腫瘍増殖阻 害活性を有するタンパクの推定開始コドンは、コザック共通配列［コザック（Ｋ ｏ＋ｓｋ）、（１９８６年）セル（Ｃ！ｌｌ）　、４４巻、２８３〜２９２頁］ の一部を形成しない。興味深いことに、６ヌクレオチド下流には、Ａが一３位に ある第２のＡＴＧが存在し、ＴＧＦ−β２の開始コドンと共に一列に整列してい る［デ・マルチイン（ｄｅ　Ｌｒｊｉｎ）ら、（１９８７年）エンボ・ジャーナ ル（ＥＭＢＯＬ）、６巻、３６７３〜３６７７頁］。ＴＧＦ−β１およびβ２の Ｃ末端側にある１１２個の残基からなるホモダイマーは、これらのタンパクの生 物学的活性形を表す。成熟形への切断部位に先行して、ＴＧＦ−β１および−β ２は、それぞれ４個および５個の塩基性残基からなる伸張部分を育する。腫瘍増 殖阻害活性を冑するタンパクをコードする遺伝子には、星印によって示された推 定切断部位に先行する５個の塩基性残基が存在する（図４１）。丁Ｇｒ−β１お よび−β２の成熟形は、８０／　１１２個の同一残基を共育する。この遺伝子の 対応する　１１２個のＣ末端側アミノ酸は、　ＴＧＦ−βｌおよび−β２に比較 して、それぞれ８６／　１１２個およびＨ／＋１２　（１の同一残基を示す（図 ４２）。残っている違いの多くは、保存的な置換を表す。すべての３つのタンパ クは、この領域におけるシスティン残基の厳密な保存を示す。腫瘍成長増殖活性 を育するタンパクをコードする遺伝子の前駆体部分のＮ末端領域はＴＧＦ−β１ に対しては約３５％の相同性およびＴＧＦ−β２に対しては４５％の相同性を示 す。比較によると、ＴＧＦ−β１およびβ２前駆体の対応する配列は３３％の配 列相同性を育する（図４２）〔プリンク（Ｄｅｒｙ＋＋ｃｋＪら、（１９１１５ 年）ネイチャー（Ｎ畠ｔｕｒｅ）、３１６巻、７Ｇ１〜７０５頁；デ・マルチイ ン（Ｉ！ＭｘｒｊｉｉＪら、（Ｈ８７年）エンボージャーナル（ＥＭｉｌＯＪ、 ）、６巻、３６７３〜３６７７頁コ。相同性マトリックスプロット（ｈｏｍｏｌ ｏｌＹｍ＊ｊｒｉｗ　ｐｌ＋ｊ）は、明らかに、ＴＧＦ−β１に比べて、腫瘍増 殖阻害活性を育するタンパクをコードする遺伝子とＴＧＦ−β２との間に、大き い類似性を示している（図４３）。腫瘍増殖阻害活性を育するタンパクをコード する遺伝子のＮ末端側部分には、潜在的な糖付加部位が４つ含まれており、その うちの１つは３つのタンパクすべてに保存されている。また、３つのタンパクは 、すべて、前分泌シグナルペプチド配列を表現しうる疎水性のＮ末端を有する〔 パールマン（ｐ＠ｒＩｍ＊ｎ）およびハルボルソン（Ｈ＞ｒマｏｒｉｏ口）、（ １９８３年）ジャーナル・オブ・モ１ノキュラー・バイオロジー（］、　Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、）、　１０７巻、３９１〜４０９頁コ。興味深いことに、ＴＧＦ −β１と腫瘍増殖阻害活性を有するタンパクをコードする遺伝子とは共に（ＴＧ Ｆ−β２は除いて）、フィブロネクチン結合配列ＲＧＤを含んでいる［ルオスラ ッチ（Ｒａｏ＋ｌｓｈ日）およびビニールシュバッファー（Ｐｉｅｒｓｃｈｂｘ ｃｈｔｒ）　（１９８６年）、セル（Ｃｔｌｌ）　、４４巻、　５１７〜５１８ 頁］。ＴＧＦ−β１および一β２との類似性によれば、腫瘍成長阻害活性を有す るタンパクは、タンパク分解を受けて成熟ポリペプチドを産生ずる４１２アミノ 酸前駆体として合成されそうである。ＴＧＦ−β１および−β２との機能的およ び構造的な相同性によると、腫瘍増殖阻害活性を有するタンパクは、癌の治療、 創傷治癒および免疫抑制において、治療活性を有すると考えられる。

命名に関する注意 腫瘍成長阻害活性を有するタンパクの配列が広範囲にわたってＴＧＦ−β１およ びＴＧＦ−β２と一致しているので、以下で腫瘍成長阻害活性を有するタンパク をＴＧＦ−β３と命名した。

ＴＧＦ−β３発現構築物 全長ＴＧＦ−β３タンパクをコードするＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡの　１５００ｂ ｐ　Ａｌａ　１−Ｈ１！　＋制限断片（その部位は図４１に示されている）を、 ブルースクリプト・プラスミド［ストラドジーン（ＳＩ＋ｔ＋Ｂｅ＋＋ｅ）　、 う・ホヤ（Ｌｌ　］０１１１１　、Ｃ＾］にクローン化して、プラスミドｐＢｌ ｕｅ−ＴＧＦ−β３を得た。このベクターのｆ１遺伝子間領域は、ｆｌヘルパー ファージによる宿主細菌の感染によって、１本鎖ＤＮＡの生産を可能にする。Ｔ ＧＦ−β３の推定開始コドンは、翻訳の効率に影響を与えることが示されている コザック共通配列［ＣＣＡＣＣ［ＡＴＧコＧ、コザック（Ｋｏｘｔｃｋ）　、セ ル（Ｃｅ　ｌ　１）４４巻、２８３〜２９２頁、１９８６年］の一部を形成しな い。組換えＴＧＦ−β３タンパクの高い収率を増進するために、ナカマエ（Ｎ＊ に＊ｍｓｙ＊）およびニックシュタイン（Ｅｃｋ＋　ｌｅ　ｉｎ）の方法ロヌク レイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｎｃｌｅｉｃ　Ａｅｉｄ＋　Ｒｅｓ、）　、 １４巻、９６７９〜９６９８頁、１９８６年コを用いて、ＣＡＣＡＣ〔Ａ丁Ｇ］ ＡをＣＣＡＣＣＣＡＴＧ　］　Ａに変更することによって、開始コドンの隣接配 列をより効率的な翻訳配列へ変異誘発した。変異誘発は配列分析によって確認し た。引き続いて、変異誘発したｐＢＩａｓ−ＴＧＦ−β３をｃＤＮ＾挿入物に隣 接する２つのポリリンカー制限部位であるＫｐｎ　ＩおよびＳｐｔ　Ｉで切断し た。この断片を、　ｒｐａ　＋および１ｈ＊　Ｉで切断した真核生物発現ベクタ ーｐ（ＩＮＦＥＩ　［バーバード（Ｂｅｒ■＋ｄｌら、エンボ・ジャーナル（２ Ｍ８０　Ｊ、）、６巻、２８３〜２９２頁、１９８７年］中にクローン化した。

この構築物（ｐｃＭＶ：ＴＧＦ−β３）中において、ＴＧＦ−β３　ｃＤＩＩＡ 配列は、サイトメガロウィルス直接的初期プロモーターによって転写ｒｔａｍさ れる（図４４参照）。

ＤＮＡ形質移入および遺伝子増幅 ＴＧＦ−β３を発現する安定な形質転換体は、ｐｃＭＶ−ＴＧＦ−β３構築物（ 図４４）を、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＩＩＦＲ）遺伝子（それ自体のプロモー ターによって駆動されるハムスターＤＩＩＦＲミニ遺伝子を含むｐＤｃｌｌｌＰ プラスミド）と共に、ＤＩＩＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズ・ハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞中に、同時形質移入することによって得られた〔ウルラウブ（Ｕ＋ １ｓａｂ）およびチェイシン（Ｃｈ＊ｔｉｎ）　、プロシーディング・オブ・ナ ショナル・アカデミ−Ｑオブ・サイエンス・オブ◆ジ・ユナイテッド・スティン ・オブ・アメリカＣＰｒｏｃ、　ＮｓＮ、＾ｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、 ７７巻、４２１６〜４２２０頁、１９８０年〕。

標準的なＣａ　Ｐ　Ｏ＜　・ＤＮＡ沈澱法［プラノ１ム（Ｇｒｘｈｌｍｌ　およ びファン・デア・ニブ（マ＊ｎ　ｄｕ　Ｅｐ）　、ヴアイロロジー（Ｖｉｒｏｌ ｏｇＦ）　、５２巻、４５６〜４５７頁、１９７３年コをＤＮＡ形質移入ニ用イ タ。ｐｃＭＶ二ＴＧＦ−３（５，７ｋｂ　）およびｐＤＣ！ＩＩＰ　（２，５ｋ ｂ）を、それぞれ１０μｇ１５０Ｂの割合でＣｓＰＯ４によって共沈させ、沈澱 物に０．５Ｘ　１０６個のＣｌｌ０ｆ　ＤＩＩＦＲ−）細胞を添加した。

＋ ｔｌＢＦＲ表現型を有する形質転換体の選択は、１０％透析ウシつ児血清を補足 したアルファＭＥｌｌｌ［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランド・アイランド（Ｇａ ｓｅｄ　Ｉｓｌ！ｎｄ）　、ＭＹｌ中で実施した。選択培地中における１０〜１ ４日間の培養した後に現れたコロニーを標準的な方法によって単離し、拡張した 。

遺伝子増幅としては、−次形質移入体を、メトトレキセート［Ｍｌｘ　；　シグ マ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｎｓ　Ｃｈｅ＋ｅｉｃｘｌＣｏ、　）　、セ ントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｗ口）、ＭＯコの濃度を増加させながら、段階的な選 択に付した。第１回目の選択は、２ｈＭのｋＨｘで実施した。丁ＧＦ−β３発現 レベルは、ＴＧＦ−β３１ＲＩＩＡの発現をアクチンの発現に規格化するＲＮ＾ サイトドツト（ｃｙｊｏｄａｔ）ハイブリダイゼーシヨンによって測定した。初 期の高い発現を示す３つのクローンのうち２つ（クローンＣ１１０６ｊ５および Ｃ１１０９，１）は、２０　Ｊのｋｉ！濃度で、増大した丁ＧＦ−β３　１ＲＮ Ａ発現を示した（図４５）。Ｃ［ＩＯ細胞由来の全ＲＮＡ（７，５Ｍｇ）　（レ ーン１）。

ＣＢＯ６ｊ５　（レーン２）、およびＣＩＯ６，３５／　２０　ｏｌｌｌ　（レ ーン３）を、１．２％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分画し、ニトロセ ルロース上ヘプロットし、ＴＧＦ−β３特異的プローブ（Ｉｌｌｌｌツクローン ｃｏＲｌ−Ｓ膳＊　Ｉ　ｃＤＮＡ制限断片）を用いて探査した（図４０を参照） 。最も高い発現レベルを有したＣＢＯ６，３５／　２ｈＭ（２０口Ｍ　Ｍｊｘで の一次形質移入体Ｃ［ＩＯクローン６．３５＋を調整培地からの一次タンパク精 製および後続の遺伝子増幅のために選調整培地を酢酸で最終濃度０．１Ｍまで処 理し、系列希釈物を生物学的活性について試験した。ミンク肺由来の細胞系であ る、ＣＣＬ　６４　［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃａ１ｌｒＩＣｏｌｌｓｃ目０１１）、ロックビル（Ｒ ｏｃｋマ１ｌｌｔ）、ＭＤＩは、済帯から単離された天然に存在するＴＧＦ−β ３に対して非常に鋭敏であることが見い出された。それゆえ、この細胞系を最初 に選んで、イワタ（Ｉｖ＊ｌｘ）らの方法［キャンサー・レサーチーズ（Ｃｓｎ ｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４５巻、２６１１９〜２６９４頁、１９８５年］に従って 、調整培地を組換えＴＧＦ−β３タンパクの生物学的活性について試験した。Ｔ ＧＦ−β１（精製物）またはＴＧＦ−β３　（調整培地由来）によって生じたＣ ＣＬ　６４ミンク肺細胞の増殖阻害は図４６に示されている。図４６Ａは、精製 丁ＧＦ−β１［カルバイオケム（Ｃｔｌｂｉｏｃｂｅｍ）　］を用いた増殖阻害 の用量応答を示す；５０％阻害は、０．１１１冨のＴＧＦ−β１を用いて得られ た。

２０　ｎＭ　Ｍｌ！で選択された形質移入体由来の調整培地と、親の形質移入体 由来の培地とを比較することによって、ミンク細胞増殖阻害活性の増大が見い出 された。図４６Ｂは、ＣＨＯ６，３５／　Ｈ＋＋Ｍ形質移入体（黒丸）およびＣ ［１０６１５形質移入体（白丸）の酸活性・化血清非含有上清の生物学的活性を 示す。得られた５０％阻害は、それぞれ３ｈｇ／ｍｌおよび５Ｂ／ｍｌ　ＴＧＦ −β１活性に等しい。

親Ｃｌ１Ｏ（ＤＨＦＲ−）由来の調整培地は、いずれの形質移入体よりも、はる かに低い増殖阻害を示した（データは示せず）。これらの結果は、明らかに、Ｔ ＧＦ−β３　ｃＤＮＡが転写されること、およびＴＧＦ−β３　ｍ！ＩＮＡが翻 訳され、生物学的に活性なタンパクが生産されることを示唆している。ＥＧＦが 存在すれば、ＴＧＦ−β３を含む、ＣＯＯ６，３５由来の酸性化調整培地は、Ｎ ＲＫ細胞の軟寒天増殖を促進することができた。軟寒天中におけるＮＩＩＫ細胞 の増殖は、創傷治癒における重要なパラメータである細胞外基賀タンパクの生産 を刺激することによって誘発できることが示されＴＧＦ−β３タンパクの様々な 部分的アミノ酸配列に対応するペプチドを、ｊＢｏｃ化学を用いて、アプライド ・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ＋ｊｓｍｓ）のペプチド合成 装置（４３０＾型）で合成した。ペプチドは、グルタルアルデヒドによってキー ホール・リンペット・ヘモシアニンに結合させ、ウサギの免疫化に用いた。最初 に酵素結合抗体免疫吸着アッセイを用いて、抗体価を同定した（表９を参照）。

このために、および次の免疫学的実験ノタメニ、バー　ロ’７　（ｌ！＋＋Ｉｏ ｖ）およびレーン（Ｌｌｎｅ）が、１９８８年に、アンチボディーズ・ア・ラボ ラトリ−・マニュアル（Ａｌｉｂｏｄｉｃ＋、　Ａ　Ｌｉｂｏｒ＊ｌｏ＋！ｉ１ ｇｎｕ＆ｌ）に記載しているような標準的技術を採用した。β３ｖまたはβ３１ １１ペプチドを注射した免疫化ウサギ由来の高力価抗血清は、アフイープレツブ （Ａ！ｆｉ−ｐｒ！９）　１１１　［パイオーラッド（Ｂｊｏ　Ｒｓｄ）、リッ チモンド（Ｒｉｃｂｓｏｍｄ）　、ＣＡ］に結合させた各々のペプチドβ３抗原 からなるアフィニティーマトリックスを用いて精製した。

表　９ ペプチド　配　列　エリザ（Ｅｌｉｓｓ）力価Ｉ　ＥＥＭ［１ＧＥＩＥＥＧＣ丁 ＱＥＮＴＥＳＥＹ　１　：　６．ＧＧ。

ＩＩ　ＬＧＤＩＬＥＩＩＩＩＩＥＶＭＥＩ［ＦＫＧＶＤＮＥＤＤ　１　：　１０ ，０００ＩＩ　５ＧＤＩＬＥＮＩ［！ＨＭＥＨ１：　１９．００ＧＩＩＩ　ＤＴ ＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣ１：　２６，０００ＩＴ　ＣＶＩＩＦＬＹＩＤｒＲＱＤ ＬＧ［Ｗ［ＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣ１：　Ｈ，０００Ｖ　ＴＬＲ５ＡＤＴ丁１１Ｓ ＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＹ　１　：　２６，０００ＶＩ　ＣＶＰＱＤ ＬＥＰＬ↑ＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＶＶＫＳＣＩ　：　４．０１ｌ ｉｌアフイニテイー精製されたβ３１１１抗血清は、ＴＧＦ−β１または−β２ のいずれかに由来の同起源ペプチド配列に比べて、β３＋１１ペプチドに対する ３００倍より高い特異性を示す。さらに、この抗血清の著しい交差反応性は、Ｔ ＧＦ−β１または−β２タンパクのいずれに対しても観察されていない。しかし ながら、この抗体の調整培地から天然の組換えＴＧＦ−β３タンパクを免疫沈降 させる能力は非常に限られたものである。アフィニティー精製されたβ３ｖ抗血 清は、ＴＧＦ−β１由来の対応ペプチド配列に比べて、β３ｖペプチドに対する 少なくとも１０１１倍の選択性を示す。また、この抗体は、天然のＴＧＦ−β３ タンパクを効率よく免疫沈降させることができる（図５０を参照）。しかしなが ら、このポリクローナル血清は、ＴＧＦ−β２同起源ペプチド配列および丁ＧＦ −β２タンパクの両方と反応する抗体の着しい集団（約３０〜５０％）を含んで いると思われる。

図４８は、ＣＨＤ　６．３５／２０　ｎＭの形質移入体によって生産された調整 培地中のＴＧＦ−β３の、検出用β３　Ｉｌ＋およびβ３ｖ抗体を用いた免疫プ ロットを示す。ペプチド遮断実験については、抗体を、プロットと共にインキュ ベートする前に、８０倍モル過剰量のペプチドと予備インキュベートした。検出 については、ヤギ抗ウサギＩｇＧに結合させたアルカリホスファターゼ〔ザイメ ッド（Ｚ！ｉ＋ｅｄ）、サンフランジ７、　ニア　（Ｓｓｎ　Ｆｒｒ＋＋ｃｉ＋ ｅｏ）、ＣＡ］を第２の抗体として用いた。図４８Ａはゲルのウェスタンプロッ トを示し、その試料は電気泳動の前に還元反応に付すのに対して、図４８Ｂは非 還元条件下における試料のウェスタンプロットを示す。各図において、レーン１ 〜３および４〜６は、それぞれβ３ｖおよびβ３　ＩＩ＋抗血清と免疫プロット した調整培地に対応し、レーン２および５は過剰の同起源ペプチドの存在下で実 施した免疫プロットに対応するが、レーン３および６は過剰量の無関係なペプチ ド配列の存在下における免疫プロットを表す。

アフィニティー精製されたβ３　ＩＩ＋およびβ３ｖ抗血清を用いた。還元条件 下における、ＣＨＯ６，３５／　２ｈＭ細胞由来の調整培地のウェスタンブロッ ティングでは、５０　ｋＤｓおよび１２ｋＤｚのバンドが検出された。我々は、 ジエントリー（Ｇｓｎｔｒ７）ら［モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏ１ ．　Ｃｓ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、）　、７巻、３４１８〜３４２７頁（１９８７年） ］およびマジソン（Ｍｗｄｉ亀６１１）ら［ＤＮＡ　。

８巻、２０５〜２１２頁（１９０年）コによって以前に報告されたＴＧＦ−β１ およびτＧＦ−β２のプロセッシングからの類推により、これらのバンドは丁Ｇ Ｆ−β３の前駆体形および成熟形に対応すると考えている（図４８）。非還元条 件下では、１００　ｋＤｓおよび２４ｋＤＩのバンドが観察されたが、我々は丁 ＧＦ−β３の前駆体形および成熟形のホモダイマー形に対応すると考えている。

見かけの前駆体は、いくつかのグリコジル化タンパクの特性を示す幅の広いバン ドとして現れる。ＴＧＦ−β３の前駆体形のシグナルペプチド配列の切断に続い て、（還元条件下では）分子量４３　ｋＤｓのタンパクが期待されるだろう。Ｔ ＧＦ−β３の一次配列によると、４つのＮ結合グリコジル化部位が存在するが、 このことは、さらに、検出された前駆体タンパクがグリコジル化されているかも しれないことを示している。図４９は、検出用β３ｖ抗体を用いたＣＨＯ６，３ ５／　ＨｎＭ形質移入体の細胞抽出物（４９Ａ）および調整培地（図４９Ｂ）の ウェスタンプロットを示す。細胞抽出物の調製としては、まず、リン酸緩衝食塩 水で細胞を洗浄し、次いで、ゲル電気泳動の前に、５ＤＳ−βメルカプトエタノ ールを用いて、直接、細胞を溶解した。ペプチドのブロック化（レーン２および ４）としては、プロットとのインキュベージタンの前に、抗体を１００倍モル過 剰量の特定ペプチドと共にインキュベートした（■　タンパクＡを検出に用いた ）。還元条件下におけるＣＩＯ６，３５／　２０ｎＭの細胞抽出物においては、 潜在的な前駆体形に対応する５０　ｋＤｓバンドだけが検出される（図４９）。

抗血清の特異性は、ウェスタンブロッティングの前に、ペプチド免疫原で抗体を 予備吸収することにより示された（図４８および４９）。予想通り、ｍＲＮＡお よび生物学的活性のデータによると、胎盤Ｃｌ０（ＤＩＩＦＲ−）細胞の調整培 地中のＴＧＦ−β３は、抗血清によって、まったく検出されなかった。

また、両方の抗血清は、天然の組換えＴＧＦ−β３タンパクの免疫沈降について も試験された（図５０）。Ｃｌｌ０−６．３５／　２０ｎｌＪを集密的になるま で増殖させ、５％透析ウつ胎児血清および５％非透析ウつ胎児血清の存在下にて 、メチオニンを含有しないＤＭＥＭ中で、２４時間、［３５Ｓコメチオニンによ って標識した。培地を集め、４℃にて、２時間、１０μｇ／ｉｆのアフィニティ ー精製された抗体および２０μｇ／ａｌ（１：２希釈）のタンパクＡアガロース で免疫沈降させた。免疫沈降タンパクを、１２．５％の５０５ポリアクリルアミ ドゲル上で分離すると、ウェスタンブロッティングによって検出されたように、 ＴＧＦ−β３の成熟形（１２ｋＤ畠）および前駆体形（５０ｋＤｓ）と同様に移 動する２つのタンパクが現れた。

しかしながら、１つの余分な免疫沈降タンパクが４３ｋＤに見られた。このタン パクは、グリコジル化されていない前駆体またはタンパク分解による分解産物の いずれかに対応するかもしれない。β３ｖ抗体は、　ＴＧＦ−β３タンパクの免 疫沈降において、β３１１１抗体よりもはるかに効率的であることが証明された 。免疫沈降の特異性は、８０倍モル過剰量の同起源ペプチドまたは無関係なペプ チド配列のいずれかと共にブレインキュベートすることによって定量した。特異 的なペプチドは３つのバンドすべての完全な競合を示したが、無関係なペプチド は示さなかった。

予想通り、丁ＧＦ−β３タンパクにおけるアミノ酸組成およびメチオニンの分布 によると、５０　ｋＤｘのものは著しく多くの８３５標識を含んでいる。

また、βＶアフィニティー精製抗体をヒト腹帯のパラフィン切片に用いた（図５ １）。繊維芽細胞および上皮細胞（第５１図Ａ）には腹帯血管系の平滑筋繊維と 同様に付着したが（図５１０）、結合組織および細胞外マトリックスのいずれも 、この抗血清は付着しなかった。対照のウサギポリクローナル抗血清（Ｐ２１０ ｐｈ１／３”　：ＱＳ＋に対するＩｇ、カタログ番号ＰＣＯ２）は、まったく付 着を示さなかった（図５１ＢおよびＤ）。この組織における強い付着は、我々が 腹帯由来の抽出物は組換えＴＧＦ−β３タンパクと同一の理化学的性質に類似し たものを備えた高レベルの組織由来腫瘍増殖阻害因子を有することを示した初期 のデータと一致する。また、腹帯は最も高いレベルの丁ＧＦ−β３　ｍＲＮＡを 発現することが見い出された。

タンパク精製 ２ｈＭメトトレキセートの存在下で集密的になるまで増殖させたＣＩＯ６，３５ ／　２ｈｉｌ細胞から調整培地を調製した。細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、 血清を含まない培地と共に２時間インキュベートして残存する血清タンパクを除 去した。血清を含まない新鮮な培地と共に４８時間インキュベートした細胞から 調整培地を誘導した。調製培地を遠心分離し、酸性化し、１Ｍ酢酸に対して［ス ペクトラポア（５ｐｅｃ＋ｒｘｐｏｒ）　３メンブレン（遮断分子量３，５ＧＯ ）、トークス（Ｔｈｏｍａｃ）　、フイラデラフイア（Ｐｂｉｌ＋ｄ＋１ｉｐｈ ｉｘ）、ＰＡ］透析し、引き続いて凍結乾燥した。酸可溶物を、１Ｍ酢酸で平衡 化したバイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ）　Ｐ−６０カラム（４Ｘ　１００ｃｍ１にか けた。１０ｍ１を含む画分を集め、検出用のβ３　Ｉ１１抗体を用いて、所定量 の選択されたカラム画分をウェスタンプロット分析によって分析した。２ピーク の交差反応性バンドが見い出されたが、これらはそれぞれＴＧＦ−β３の前駆体 形および成熟形に対応する。成熟ＴＧＦ−β３タンパクを含有する画分をプール し、部分的に凍結乾燥した。このプールを、２ＭＴｔ口でｐＨ７まで中性化し、 バーロウ（Ｔｌｌ　ｒ　ｌ　ｏｖ）およびレーン（Ｌｘｎｅ）　Ｅアンチボディ ーズ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　、ア・ラボラトリ−・マニュアル（＾Ｌａｂｏ ｒｓｌｏｒｒ　ＭｅｏＩｌｔｌｌ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨｘ＋ｂｏｒＬｔｂｏ＋ｚｔｏＢ）　、コールド ・スプリングｅ　／Ｘ−バー、１９８８年］によって記載された標準的な手順を 用いて、ジメチルビメリミデートでタンパクＡアガロースに結合したβ３ｖ抗体 のアフィニティーカラムに通した。緩衝液Ａ　（０，１Ｍ　Ｔ目＋−ＨＣｌｐＨ ７，５，１０ｍＭ　ＥＧＴＡ　、　１ｍＭ　ＰＭＳＦ、　１％Ｔｒｉｔｏｏ）お よび緩衝液Ａ＋ＩＭ　Ｎ息Ｃ１で、最後に２ｈＭ丁丁目−＋１ｃＩ　ｐｌ］７． ５で充分に洗浄した後、　ＴＧＦ−β３タンパクを５０ａｌｌグリシン−〇Ｃ１ ｐｉ！２．０で溶出した。図５２は精製ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β１　〔カ ルバイオケム（ＣＩｌｂｉｎｃｈ＋Ｉｌ）　］の銀染色を示している。充填緩衝 液中、１０ａｌｌ　ＤＴＴの不在下（レーン１および３）または存在下（レーン ２および４）で試料を処理しながら、ＴＧＦ−β３　（１００μｇ）（レーン１ および３）およびＴＧＦ−β１（レーン２および４）を、１２．５％ポリアクリ ルアミドゲル上で電気泳動した。画分を銀染色およびウェスタンプロット分析に よって分析し、ピーク画分をプールした。銀染色したゲルは、還元条件下および 非還元条件下で、それぞれ１２　ｋＤｘおよび２４　ｋＤ！の単一バンドを示し た（図５２）。単一の銀染色バンドの検出は調製物が９０％より高い物質である ことを示している。

培養細胞系の増殖に対する組換えＴＧＦ−β３の影響様々な細胞系の増殖に対す るＴＧＦ−β３の影響を表１０に示す。

増殖は「東１シリーズの実験」の材料および方法に関する部分に記載した腫瘍増 殖阻止活性の単層アッセイの変形を用いて定量した。細胞は、９６ウエルの細胞 培養プレート上にて、１００μｌの培地中、２×１０３細胞／ウエルの播種密度 で継代培養した。ＭＣＦ−７を除いて、１０％ウシ胎児血清および２％Ｌ−グル タミンを含有するダルベツコの修正イーグル培地中で維持し、アッセイを行った 。ＭＣＦ−７は１０％ウシ胎児血清、２％Ｌ−グルタミンおよび１％ピルビン酸 ナトリウムを含むダルベツコの修正イーグル培地中で維持した。未処理の対照ウ ェル中の細胞が９０％の実密度になったら、細胞を、２５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ− β３で処理し、５−［１１ヨード−２′デオキシウリジンによって、２４時間標 識し、上記のように採取した。

表１０では、組換え丁ＧＦ−β３だけで、ミンク肺細胞（ＣＣＬ　６４）と、肺 、皮膚、結腸および胸部の腫瘍組織からのヒト腫瘍細胞とを著しく阻害しながら 、正常なヒト繊維芽細胞に対しては最小の影響しか及ぼさないことが観察される 。

ＴＧＦ−β３活性を中和する抗体 精製された組換えＴＧＦ−β３を、３．１２５〜Ｇ、　０４９　ｎｇ／　ｍｌの 濃度で、５μｇ／ｌのアフィニティー精製されたポリクローナル・ウサギ抗体（ β３１１１およびβ３ｖ抗血清）と共に、３７℃にて、３時間、インキュベート した。対照ＴＧＦ−β３は、抗体を用いずにインキュベートした。抗体処理した ＴＧＦ−β３および対照の未処理ＴＧＦ−β３によるミンク細胞の増殖阻害は、 上記のようにして定量された。図５３は、β３ｖ抗血清（黒い四角）が、抗体の 存在しない場合（黒丸）またはβ３　ＩＩ＋抗血清で処理した場合（白い四角） における同一濃度のＴＧＦ−β３の増殖阻害活性に比べて、ミンク細胞に対する ＴＧＦ−β３の増殖阻害活性を減少させることを示している。いずれの抗血清も 、τＧＦ−β３が存在しなければ、ＣＣＬ　６４細胞の増殖に対して著しい影響 を及ぼさなかった。ＴＧＦ−β３ペプチドβＶに対する抗体は、明らかにＴＧＦ −β３の増殖阻害（阻止）活性を中和している。

ＦＩＧ、１゜ ＪＬ／オ 五分 ＦＩＧ、１０゜ １し分 ＦＩＧ、１１゜ １ｉか ＦＩＧ、１３゜ 儂Ａ　（Ｍ） ＦＩＧ、（４Ａ。

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ＦＩＧ、　４１　。

日Ｇ、　４３゜ ＦＩＧ、　４４゜ 日Ｇ、　４５゜ Ｆ工ＧＵＲＥ　４６Ａ Ｑ　、０００１　．００１　．０１　．１　１　１０ＴｅＦ−Ｂｉ標４’）ｔ　 （ｎ９） Ｆ工ＧＵＲＥ　４６Ｂ 日Ｇ、４７ −−−ｍ−゛−゛、？ ｑ￥聞几ペア°＋ド＋　◆　・ ＦＩＧ、　４９　Ａ、　−ＦＩＧ、　４９　Ｂ。

ＦＩＧ、　５０゜ ＦＩＧ、　５１　Ａ。

ＦＩＧ、　５１　Ｂ。

ＦＩＧ、　５１　Ｃ。

ＦＩＧ、　６１　Ｄ。

Ｆｌｅ、　５２゜ Ｆ工ＧＵＲＥ　５３ ＴＣ７Ｆ−已う４・Ｐ主、つ守ん′シも中和、０１　．１　１　１０ ７ＣＦ−ａ３　（ｎｇ／ｍｌ） 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１１月１８日 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２７５３２、発明の名称　組織誘 導性腫瘍増殖阻止剤及びその調製方法と使用法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、二ニー・ヨーク・１１０３０　、マンハセット、コミ ユニティ・ドライブ・３５０、ザ・ボウエスーマークス・ビルディング 名　称　オンコジーン・サイエンス・インコーホレーテッド５、補正書の提出年 月日　１９９１年８月１３日６、添附書類の目録 請求の範囲 １、　各ポリペプチドが第２９図に示された配列を有し、１位のアラニンで始ま り１］、２位のセリンで終わる１１２個のアミノ酸から成る見掛けの分子量が約 １３．．０００ダルトンであり、非還元条件下でジスルフィド結合により結合さ れた２つの該ポリペプチドから構成されるダイマーであり、見掛けの分子量が約 ２６、０００ダルトンである腫瘍増殖阻止活性を有する、生物学的に活性な組換 えタンパク質。

２、　各ポリペプチドがヌクレオチド２６３位のアデノシンで始まりヌクレオチ ド１４９８位のシトシンで終わる第４１図に示される配列によりコードされてお り、非還元条件下でジスルフィド結合により結合された２つの該ポリペプチドか ら構成されるダイマーであり、ＴＧＦ−β３の前駆体である組換えタンパク質。

３、　請求の範囲第１項又は２項の組換えタンパク質をコードする発現プラスミ ド。

４、　宿主細胞内に請求の範囲第３項のプラスミドを含む宿主ベクター系。

５、　適当な宿主細胞が細菌細胞である、請求の範囲第４項の宿主ベクター系。

６、　適当な宿主細胞が真核細胞である、請求の範囲第４項の宿主ベクター系。

７、　宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求の範囲第６項の宿で組換えタンパク 質を産生させ、こうして産生されたタンパク質を回収することから成る組換えタ ンパク質の製造方法。

９、ＹＬＲ５ＡＤＴＴ）ＩＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＹ　１７）アミ ノ酸配列を有するペプチド。

１０、請求の範囲第１項の組換えタンパク質のエピトープと特異的に結合する抗 体。

＋１．　請求の範囲第１０項のモノクローナル抗体。

＋２．　請求の範囲第８項のポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体 。

＋３．　請求の範囲第１２項のモノクローナル抗体。

１４、　ヒト検体からの試料を請求の範囲第１０項の抗体と接触させ、該抗体と 該タンパク質のエピトープとの間に複合体を形成させ、こうして形成された複合 体を検出し、これによって腫瘍を診断することから成る、腫瘍の診断方法。

１５、治療上有効量の請求の範囲第１０項の抗体及び医薬上許容し得るキャリア から成る医薬組成物。

＋６．　有効腫瘍治療量の請求の範囲第１５項の組成物を検体に投与することか ら成る、検体における腫瘍の治療方法。

１７、有効増殖型疾患治療量の請求の範囲第１５項の組成物を検体に投与するこ とから成る、検体における増殖型疾患治療方法。

１８、有効量の請求の範囲第１項の組換えタンパク質及び医薬キャリアを含む医 薬組成物。

１９、　ヒト腫瘍細胞を有効腫瘍増殖阻止量の請求の範囲第１８項の組成物と接 触させることから成る、該細胞の増殖阻止方法。

２０、増殖型疾患の治療に有効な量の請求の範囲第１８項の組成物を検体に投与 することから成る、検体における増殖型疾患の治療方法。

２１、やけど又は創傷を請求の範囲第１８項の医薬組成物と接触させることから 成る、やけどの治療又は創傷の治癒方法。

２２、検体からの試料中に存在する請求の範囲第１項の組換えタンパク質の量を 定量的に決定し、こうして決定された量を正常検体からの試料中に存在する量と 比較し、有意な量の差が腫瘍の存在を示すものであることから成る、腫瘍の存在 の検出方法。

２３、検体からの試料中に存在する形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）及び請求 の範囲第１項の組換えタンパク質の夫々の量を定量的に決定し、該試料中に存在 する請求の範囲第１項のタンパク質の量のＴＧＦ−αの量に対する比をめ、正常 な検体からの試料に対する相当する比をめ、正常な検体に対する比と前記検体に 対する比を比較して、該比に於ける有意な変動が腫瘍の存在を示すものであるこ とから成る、腫瘍の検出方法。

２４、ＴＧＦ−β３を含む細胞を活性阻止量の請求の範囲第１０又は１２項の抗 体と接触させることから成る、ＴＧＦ−β３活性を阻止する方法。

２、特許請求の範囲第２４項の方法であって、該活性が免疫抑制活性である前記 方法。

２Ｆ＋、（ａ）　ＴＧＦ−β３の前駆体をコードし、ヌクレオチド２６３位に始 まりヌクレオチド１４９８で終る第４１図に示されるヌクレオチド配列と同一か 、又は機能的に均等であるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを調製し、（ｂ）　 こうして調製したＤＮＡを発現ベクター内に、適当なプロモーターに関して適当 な宿主細胞中で該ＤＮＡの発現を可能にするような位置で挿入し、 （Ｃ）　該ＤＮＡの発現を可能にする条件下で該宿主細胞を該発現ベクターで形 質転換し、 （ｄ）　こうして形質転換させた宿主細胞を、該ＤＮＡが発現し、ＴＧＦ−β３ の前駆体が産生され、こうして産生されたＴＧＦ−β３前駆体が該培地中に分泌 されるような条件下で、適当な培地中で培養し、 （ｅ）　分泌されたＴＧＦ−β３の前駆体を含む培地を活性化剤で処理し、該前 駆体を生物学的に活性なＴＧＦ−β３に変換し、 （ｆ）　こうして産生された生物学的に活性なＴＧＦ−β３を回収すること、 から成る、生物学的に活性なＴＧＦ−β３の製造方法。

２７、宿主細胞が真核細胞である請求の範囲第２６項の方法。

２８、真核細胞が哺乳細胞である請求の範囲第２７項の方法。

２９、＃乳細胞がＣＨＯ細胞である請求の範囲第２８項の方法。

３０、適当なプロモーターが誘発性プロモーターである請求の範囲第２６項の方 法。

３１、誘発性プロモーターがＭＭＴＶである、請求の範囲第３０項の方法。

３２、活性化剤が酸を含む、請求の範囲第２６項の方法。

手続補正書 平成３年１２月６呻罰

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第２９図に示された、１位のアラニンに始まり１１２位のセリンで終わる１ １２個のアミノ酸から成る、腫瘍増殖阻止活性を有するタンパク質。 ２．請求の範囲第１項の生物学的に活性な誘導体であって、腫瘍増殖阻止活性を 有する該誘導体が１位のアラニンで始まり１１２位のセリンで終る第２９図に示 されたアミノ酸配列と実質的に同一である該誘導体。 ３．請求の範囲第１項の精製タンパク質。 ４．１１２個のアミノ酸を有する請求の範囲第３項のタンパク質。 ５．ヌクレオチド２６３位のメチオニンで始まりヌクレオチド１４９６位のセリ ンで終る第４１図に示される４１２個のアミノ酸から成るタンパク質。 ６．請求の範囲第５項の生物学的に活性な誘導体であって、該タンパク質がヌク レオチド２６３位のメチオニンで始まりヌクレオチド１４９６位のセリンで終る 第４１図に示されるアミノ酸配列と実質的に同一である該誘導体。 ７．ヌクレオチド２６６位のリジンで始まりヌクレオチド１４９６位のセリンで 終る第４１図に示される４１１個のアミノ酸から成るタンパク質。 ８．請求の範囲第１項のタンパク質をコードする核酸分子。 ９．請求の範囲第４項のタンパク質をコードする核酸分子。 １０．請求の範囲第５項のタンパク質をコードする核酸分子。 １１．第２９図に示される請求の範囲第８項のｃＤＮＡ。 １２．１位のコドンのグアニンで始まり１１２位のコドンのシトシンで終る第２ ９図に示される請求の範囲第９項のｃＤＮＡ。 １３．１位のシトシンで始まり２５２９位のグアニンで終る第４１図に示される 請求の範囲第１０項のｃＤＮＡ。 １４．請求の範囲第８項の核酸分子を含むプラスミド。 １５．適当な宿主細胞内に請求の範囲第１４項のプラスミドを含む宿主ベクター 系。 １６．適当な宿主細胞が細菌細胞である、請求の範囲第１５項の宿主ベクター系 。 １７．適当な宿主細胞が真核細胞である、請求の範囲第１５項の宿主ベクター系 。 １８．請求の範囲第１５項の宿主ベクター系を増殖して該宿主内でタンパク質を 産生させ、こうして産生されたタンパク質を回収することから成る、タンパク質 の製造方法。 １９．９位のアルギニンで始まり２８位のロイシンで終る２０個のアミノ酸から 成る、請求の範囲第１項のタンパク質から得られたポリペプチド。 ２０．請求の範囲第１項のタンパク質に含まれるエピトープと特異的に結合する 抗体。 ２１．請求の範囲第２０項のモノクローナル抗体。 ２２．請求の範囲第１９項のポリペプチド内に含まれるエピトープと特異的に結 合する抗体。 ２３．請求の範囲第２２項のモノクローナル抗体。 ２４．適当な条件下でヒト検体からの試料を請求の範囲第２０項の抗体と接触さ せ、該抗体と該タンパク質に含まれるエピトープとの間に複合体を形成させ、こ うして形成された複合体を検出し、これによって腫瘍を診断することから成る、 腫瘍の診断方法。 ２５．請求の範囲第２０項の抗体及び医薬上許容し得るキャリアから成る医薬組 成物。 ２６．有効腫瘍治療量の請求の範囲第２５項の組成物を検体に投与することから 成る腫瘍の治療方法。 ２７．有効増殖型疾患治療量の請求の範囲第２５項の組成物を検体に投与するこ とから成る、増殖型疾患治療方法。 ２８．適当な医薬キャリア中に請求の範囲第１項のタンパク質又はその生物学的 に活性な誘導体を有効量含む医薬組成物。 ２９．ヒト腫瘍細胞を有効腫瘍増殖阻止量の請求の範囲第２８項の組成物と接触 させることから成る、該細胞の増殖阻止方法。 ３０．増殖型疾患の治療に有効な量の請求の範囲第２８項の組成物を検体に投与 することから成る、検体における増殖型疾患の治療方法。 ３１．やけど又は創傷を請求の範囲第２８項の医薬組成物と接触させることから 成る、やけどの治療又は創傷の治癒方法。 ３２．適当な医薬キャリア中に、請求の範囲第５項のタンパク質又はその生物学 的に活性な誘導体を有効量含む医薬組成物。 ３３．ヒト腫瘍細胞を有効腫瘍増殖阻止量の請求の範囲第３２項の組成物と接触 させることから成る該細胞の増殖阻止方法。 ３４．増殖型疾患の治療に有効な量の請求の範囲第３２項の組成物を検体に投与 することから成る、検体における増殖型疾患の治療方法。 ３５．やけど又は創傷を請求の範囲第３２項の医薬組成物と接触させることから 成る、やけどの治療又は創傷の治療方法。 ３５．検体からの試料中に存在する請求の範囲第１項のタンパク質の量を定量的 に決定し、こうして決定された量を正常検体からの試料中に存在する量と比較し 、有意な量の差が腫瘍の存在を示すものであることから成る、腫瘍の存在の検出 方法。 ３７．検体からの試料中に存在する形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）及び請求 の範囲第１項のタンパク質の夫々の量を定量的に決定し、該試料中に存在する請 求の範囲第１項のタンパク質の量のＴＧＦ−αの量に対する比を求め、正常な検 体からの試料に対する相当する比を求め、正常な検体に対する比と前記検体に対 する比を比較して、該比に於ける有意な変動が腫瘍の存在を示すものであること から成る、腫瘍の検出方法。 ３８．腫瘍を有する検体からの試料に対して、ＴＧＩ−１、ＴＧＩ、ＴＧＩ−２ 、請求の範囲第１項のタンパク質、ＣＭ−１、又は該試料中に存在するＡ４３１ 細胞の調整培地から回収し得るポリペプチドの各々の量を定量的に決定し、それ らの特異的量又は相対的量の存在が特異的な腫瘍の型を示すものであることから 成る、腫瘍のダイビング法。 ３９．細胞を有効量の請求の範囲第２０項の抗体と接触させることから成る、腫 瘍増殖阻止活性を有するタンパク質又はその生物学的に活性な誘導体の活性を阻 止する方法。 ４０．細胞を有効量の請求の範囲第２２項の抗体と接触させることから成る、腫 瘍増殖活性を有するタンパク質又はその生物学的に活性な誘導体の活性を胆止す る方法。 ４１．請求の範囲第３９項の腫瘍増殖活性を有するタンパク質の活性を阻止する 方法であって、該活性が免疫抑制活性である前記方法。 ４２．請求の範囲第４０項の腫瘍増殖活性を有するタンパク質の活性を防止する 方法であって、該活性が免疫抑制活性である前記方法。 ４３．（ａ）ＴＧＦ−β３の前駆体をコードし、ヌクレオチド２６３位に始まり ヌクレオチド１４９８で終る第４１図に示されるヌクレオチド配列と実質的に同 −であるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを調製し、 （ｂ）こうして調製したＤＮＡを発現ベクター内に、適当なプロモーターに関し て適当な宿主細胞中で該ＤＮＡの発現を可能にするような位置で挿入し、 （ｃ）該ＤＮＡの発現を可能にする条件下で該宿主細胞を該発現ベクターで形質 転換し、 （ｄ）こうして形質転換させた宿主細胞を、該ＤＮＡが発現し、ＴＧＦ−β３の 前駆体が産生され、こうして産生されたＴＧＦ−β３前駆体が該培地中に分泌さ れるような条件下で、適当な培地中で培養し、 （ｅ）分泌されたＴＧＦ−β３の前駆体を含む培地を活性化剤で処理し、該前駆 体をＴＧＦ−β３に変換し、（ｆ）こうして産生されたＴＧＦ−β３を回収する こと、から成るＴＧＦ−β３の製造方法。 ４４．宿主細胞が真核細胞である請求の範囲第４３項の方法。 ４５．真核細胞が哺乳細胞である請求の範囲第４４項の方法。 ４６．哺乳細胞がＣＨＯ細胞である請求の範囲第４５項の方法。 ４７．適当なプロモーターが誘発性プロモーターである請求の範囲第４３項の方 法。 ４８．誘発性プロモーターがｄｈｆｒに関連のある、請求の範囲第４７項の方法 。 ４９．活性化剤が酸を含む、請求の範囲第４３項の方法。