JP2000508898A - 免疫調節作用を有するシステイン―含有またはメチオニン―含有ペプチド - Google Patents

免疫調節作用を有するシステイン―含有またはメチオニン―含有ペプチド

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Abstract

(57)【要約】 哺乳類の免疫応答の抑制または刺激に機能するシステイン含有またはメチオニン含有ペプチドをコードする核酸分子を記載する。典型的に、これらのペプチドは30以上のアミノ酸残基を含まず、所望よりそのアミノ末端で哺乳類分泌シグナルペプチドと結合し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節作用を有するシステイン−含有またはメチオニン−含有ペプチド組換えペプチドの発現 本発明の分野は、免疫抑制および免疫刺激の両方を含む非抗原特異的免疫調節 である。発明の背景 免疫システムは、適切に働く時、感染および癌の生育から個体を防御する。こ れらの機能を実現するために、癌特異的抗原を含む異種抗原を認識し、これに対 して攻撃を行わなければないが、通常体内の細胞に存在する抗原に対しては攻撃 しない。 提供する防御レベルを改善するために、免疫システムを刺激することが可能で ある。免疫刺激は、個体が慢性または急性感染、または悪性疾病の攻撃下にある 場合に、有益である可能性がある。ジフテリア毒素のような1タンパク質抗原を 含むワクチンが特異的抗原、従って特異的疾病に対する免疫を発生させるために 広範囲に使用されている。免疫系の包括的な刺激が望ましい場合、アジュバント 、インターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子のような非特異 的薬剤で達成できることもある。 時折、免疫システムは自己と非自己の区別をする能力を失う。結果として、個 体は全身性エリテマドーデス、I型糖尿病または関節リウマチのような自己免疫 疾患を発症し得る。これらの個体は、移植臓器または組織レシピエントのように 、免疫応答の抑制により非常に利益を受ける。 免疫応答は、コルチコステロイド、アザチオプリン、シクロスポリン、タクロ リムス(FK506)、ラパマイシンまたはミコフェノール酸モフェチルでの処置 により一般に抑制し得る。加えて、モノクローナル抗体OKT3を含むある免疫 グロブリンがこの目的に使用されている。特異的抗原に対する免疫応答を抑制す ることも可能であり得る。“免疫寛容誘導”と呼ばれているこの方法は、希釈し た形の抗原の静脈内または反復局所投与により達成でき、非常に高投与量の抗原 または抗原の経口投与による処置である。本発明の要約 ある免疫活性ペプチドをコードするDNA分子が免疫調節を必要とする動物の 処置に使用できることが発見された。動物の細胞に挿入した時、DNA分子が転 写され、適当な部位で治療量のペプチドが製造される。あるペプチドは免疫刺激 性であり、癌のような状態の処置に有用である。他のペプチドは免疫抑制性であ り、例えば、自己免疫疾患または移植拒絶反応の処置に使用される。この免疫調 節作用は、抗原特異的であるよりむしろ一般的であるように思え、Tリンパ球の 機能に関連すると考えられる。 本発明のDNA分子は、下記の式に記載する5つのモチーフの一つに含まれる Cys−含有またはMet−含有ペプチドをコードする。ペプチドは所望により細胞性 プロテアーゼにより開裂されるシグナルペプチドと結合している。 一つの態様において、本発明のDNA分子は、式I: An−X−Cys−Cys−Y−Bm (式I) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Asp、Glu、Asn、Gln、HisおよびProからなる群 から選択される; YはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Asp、Glu、Asp、Gln、Tyr、Pheおよ びProからなる群から選択される; nおよびmはnとmの合計が0から26(両端を含む)であるという条件付で選択 された整数;そして 核酸分子は、更に、所望により、Anで免疫活性ペプチドに結合する哺乳類シグ ナルペプチドをコードする〕 のモチーフに適合する4−30アミノ酸残基(好ましくは、4−10、そしてよ り好ましくは4−8、例えば4−7または4−6残基)からなるペプチドをコー ドする。 好ましくは:XはGly、Pro、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、GlnまたはAla;YはG ly、Pro、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ser、Phe、TyrまたはThr;nとmの合計は 0から11(両端を含む);および核酸分子は、更に、所望により、Anで免疫活 性ペプチドに結合する哺乳類シグナルペプチドをコードす る。 より好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した、 XがGlyおよびYがGly、 XがProおよびYがPro、 XがProおよびYがVal、 XがIleおよびYがLeu、 XがProおよびYがGlu、 XがGluおよびYがTyr、 XがProおよびYがPhe、 XがGluおよびYがPhe、 XがAlaおよびYがVal、 XがValおよびYがIle、 XがGlnおよびYがSer、 XがIleおよびYがThr、 XがLeuおよびYがAsp、または XがAspおよびYがIle;AおよびBが上記パラメーターに従って変化する;およ びnとmの合計が0から11(両端を含む)である 式Iのモチーフに適合するペプチドをコードする。 最も好ましくは、式Iのペプチドは、6−8アミノ酸残基からなる。 このような式Iのペプチドの例は以下のものを含む: 本発明の核酸分子は、例えば、AがGly、Lys、Arg、Cys、Ser、Val、Ala、Thr 、Glu、Pro、Trp、Leu、Asp、PheまたはIle;BがLeu、Arg、Ile、Val、Pro、Al a、Tyr、Gly、Trp、Thr、Lys、Met、Asp、GluまたはPhe;およびnとmの合計は 2から4(両端を含む)であるペプチドをコードできる。核酸分子はまた例えばA がPro、Gly、Glu、Ala、Val、Lys、Thr、LeuまたはSer;BがTyr、Pro、Gly、Th r、Arg、Val、Ala、Leu、LysまたはIle;nが1;およびmが1であるペプチド もコードできる。 第2の態様において、本発明のDNA分子は、式II: An−X−Cys−Z−Cys−Y−Bm (式II) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Phe、HisおよびPro からなる群から選択される; ZはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Lys、His、Phe、Tyr、ArgおよびPro からなる群から選択される; YはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Asp、Glu、Lys、Arg、Gln、Tyr、Phe、Ser、Thr およびProからなる群から選択される; nおよびmはnとmの合計が0から25(両端を含む)であるという条件付で選択 された整数;そして 核酸分子は、更に、所望により、Anで免疫活性ペプチドに結合する哺乳類シグ ナルペプチドをコードする〕 のモチーフに適合する5−30アミノ酸残基(好ましくは、5−10、そしてよ り好ましくは5−9、例えば5、6、7または8残基)からなるペプチドをコー ドし得る。 好ましくは:XがGly、Pro、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、GlnまたはAla;YがG ly、Glu、Val、Gln、Arg、Leu、Tyr、Phe、Ile、Ser、Thr、AspおよびProからな る群から選択される;ZがIle、Gly、Thr、Ala、ArgおよびLysからなる群から選 択される;nとmの合計が0から10(両端を含む);そして核酸分子は、更に、 所望により、Anで免疫活性ペプチドに結合する哺乳類シグナルペプチドをコー ドする。 より好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した、 XがGlyおよびYがGly、 XがProおよびYがPro、 XがProおよびYがVal、 XがIleおよびYがLeu、 XがProおよびYがGlu、 XがGluおよびYがTyr、 XがProおよびYがPhe、 XがGluおよびYがPhe、 XがAlaおよびYがVal、 XがValおよびYがIle、 XがGlnおよびYがSer、 XがIleおよびYがThr、 XがLeuおよびYがAsp、または XがAspおよびYがIle;ZがIle、Gly、Thr、AlaまたはLys;AおよびBが上記 パラメーターに従って変化する;nとmの合計が0から10(両端を含む);そし て核酸分子が、更に、所望により、Anで免疫活性ペプチドに結合する哺乳類シ グナルペプチドをコードする 式IIのモチーフに適合するペプチドをコードする。 このような式IIのペプチドの例は以下のものを含む: 本発明の核酸は、例えば、XがVal、Ala、Leu、Ile、Lys、Asp、PheまたはPro ;YがGlu、Val、Gln、Arg、LysまたはPro;ZがGly、Ala、Ile、Arg、Thrまた はLys;およびnとmの合計が1から3(両端を含む)のペプチドをコードできる 。 第3の態様において、本発明のDNA分子は、式III: An−X−Y−Cys−Z−Bm (式III) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはAla、Va1、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Trp、Tyr およびPheからなる群から選択される; YはAla、Val、Leu、Ile、GlyおよびProからなる群から選択される; ZはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Lys、Arg、His、PheおよびProからなる群から選 択される; nおよびmはnとmの合計が0から26(両端を含む)であるという条件付で選択 された整数;そして 核酸分子は、更に、所望により、Anで免疫活性ペプチドに結合する哺乳類シグ ナルペプチドをコードする〕 のモチーフに適合する4−30アミノ酸残基からなるペプチドをコードし得る。 好ましくは:XがGly、Ala、Ile、Asp、Thr、Ser、ArgまたはTrp;YがIle、G lyまたはPro;ZがLys、Ile、Phe、Pro、Ala、TyrまたはGly;そしてnとmの合 計が0から11(両端を含む)である。 より好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した XがGly、YがProおよびZがIle、 XがGly、YがProおよびZがGly、 XがAla、YがProおよびZがAla、 XがIle、YがProおよびZがTyr、 XがAla、YがProおよびZがIle、 XがArg、YがProおよびZがIle、 XがIle、YがProおよびZがIle、 XがAsp、YがProおよびZがIle、 XがTrp、YがProおよびZがIle、 XがTrp、YがProおよびZがGly、 XがGly、YがIleおよびZがIle、 XがThr、YがProおよびZがTyr、 XがAla、YがProおよびZがPhe、 XがSer、YがProおよびZがPhe、 XがGly、YがProおよびZがPro、または XがGly、YがProおよびZがTyr;AおよびBが上記パラメーターに従って変化 する;nとmの合計が0から11(両端を含む)である 式IIIのモチーフに適合するペプチドをコードする。 このような式IIIのペプチドの例は以下のものを含む: 本発明の核酸は、例えば、XがGly、Ala、Ile、Arg、Asp、Trp、ThrまたはSer ;YがPro、GlyまたはIle;ZがGly、Ala、Ile、Tyr、PheまたはPro;およびn とmの合計が1から3(両端を含む)のペプチドをコードできる。 第4の態様において、本発明のDNA分子は、式IV: An−Xp−Y−Cys−Zq−Bm (式IV) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはSer、Glu、Gly、Ala、Leu、Pro、Thr、Val、AsnおよびLysからなる群から選 択される; YはLeu、Arg、Pro、Tyr、Ile、Val、Ser、AlaおよびPheからなる群から選択さ れる; ZはMet、Trp、Tyr、Phe、Gly、Pro、Arg、Asn、Gln、AlaおよびLysからなる群 から選択される; n、m、pおよびqは、pとqが独立して0または1であるが、同時に0ではな い;qが0である場合、mが0;およびn、m、pとqの合計が0から28(両 端を含む)であるという条件付で選択された整数である〕 のモチーフに適合する3−30アミノ酸残基からなる免疫活性ペプチドをコード する。 式IVに適合するペプチドをコードする核酸分子は、更に、所望により、免疫活 性ペプチドのアミノ末端に結合する哺乳類シグナルペプチドをコードする。 好ましくは:pおよびqの両方が1であり、ペプチドが4−20アミノ酸残基 からなる。より好ましくは、ペプチドは4−15アミノ酸残基(例えば、4−9 または4−10アミノ酸残基)からなる。最も好ましくは、所望によりシグナル ペプチドに結合した4−7アミノ酸残基からなる。 より好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した XがGlu、YがProおよびZがMet、 XがGly、YがProおよびZがMet、 XがAla、YがProおよびZがTrp、 XがAla、YがProおよびZがMet、 XがGlu、YがProおよびZがTrp、 XがSer、YがProおよびZがTrp、 XがLeu、YがLeuおよびZがGly、 XがPro、YがArgおよびZがArg、 XがGly、YがTyrおよびZがPro、 XがVal、YがValおよびZがAsn、 XがLeu、YがSerおよびZがGln、 XがSer、YがProおよびZがTyr、 XがAla、YがLeuおよびZがArg、 XがAla、YがProおよびZがTyr、 XがGly、YがAlaおよびZがPro、 XがLys、YがSerおよびZがLys、 XがGlu、YがProおよびZがPhe、 XがGlu、YがProおよびZがTyr、 XがSer、YがProおよびZがMet、 XがAla、YがProおよびZがTyr、 Xが欠失、YがLeuおよびZがPhe、または XがGly、YがProおよびZがTrp;AおよびBが20個の一般的な天然に存在す るアミノ酸から独立して選択される;そしてn、m、pおよびqが上記の条件か ら選択された整数である 式IVのモチーフに適合するペプチドをコードする。 好ましくは、式IVに適合するペプチドは: YがProまたはIle、そしてqが1、そしてZがTyr、Phe、Gly、ProまたはAlaで ある場合、 (i)pが1である場合、XがSer、Gly、AlaまたはThrではない、または (ii)pが0である場合、Yに隣接するAのアミノ酸残基はSer、Gly、AlaまたはT hrではない: という条件から選択される。 式IVのペプチドの例は以下のものを含む: される;そしてn、m、pおよびqは前記の条件から選択される整数である。 哺乳類シグナルペプチド配列を含む式IVのペプチドの例は以下のものを含む: 第5の態様において、本発明のDNA分子は、式V: An−W−X−Y−Zp−Bm (式V) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; WはGly、Pro、Asp、Arg、Ala、Ile、Trp、Ser、Met、CysおよびGluからなる群 から選択される; XはCys、Pro、Ile、Met、Tyr、ThrおよびArgからなる群から選択される; YはCysおよびMetからなる群から選択される; ZはGly、Phe、Val、Ile、Pro、Tyr、Trp、Glu、LeuおよびMetからなる群から選 択される; W、XおよびYは、少なくとも一つのW、XまたはYがMetおよび1個以上のW, XまたはYがCysではないという条件付で選択される; n、mおよびpは、pが0または1;pが0である場合、mは0;そしてn、m およびpの合計が0から27(両端を含む)という条件付で選択された整数である 〕 のモチーフに適合する3−30アミノ酸残基からなる免疫活性ペプチドをコード する。 式Vに適合するペプチドをコードする核酸分子は、更に、所望により、免疫活 性ペプチドのアミノ末端に結合する哺乳類シグナルペプチドをコードする。 好ましくはpが1であり、ペプチドは4−20アミノ酸残基からなる。より好 ましくは、ペプチドは4−15アミノ酸残基(例えば、4−9または4−10ア ミノ酸残基)からなる。最も好ましくは、ペプチドは4−7アミノ酸残基からな る。 より好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した WがGly、Pro、Asp、Arg、Ala、Ile、TrpおよびSerからなる群から選択される; XがCys、Pro、IleおよびMetからなる群から選択される; YがCysおよびMetからなる群から選択される;そして ZがGly、Phe、Val、Ile、ProおよびLeuからなる群から選択される 式Vのモチーフに適合するペプチドをコードする。 より好ましくは、XおよびYの少なくとも一つはMetである。 より好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した WがGly、Asp、Arg、Ala、TrpおよびSerからなる群から選択される; XがProおよびIleからなる群から選択される; YがMet;そして ZがPhe、IleおよびProからなる群から選択される 式Vのモチーフに適合するペプチドをコードする。 最も好ましくは、本発明のDNA分子は、所望によりシグナルペプチドに結合 した WがGlyおよびSerからなる群から選択される; XがPro; YがMet;そして ZがPhe、IleおよびProからなる群から選択される 式Vのモチーフに適合するペプチドをコードする。 本発明の核酸分子は、隣接して配列したMetとcysまたはMetとMetを有するペプ チドをコードし得る。例えば、コードされるペプチドは A−W−Met−Met−Z−B、 A−W−Met−Cys−Z−Bまたは A−W−Cys−Met−Z−B の配列に適合し得る。 あるいは、本発明の核酸は、MetとCysが1アミノ酸を超えないで離されている ペプチドをコードし得る。例えば、コードされるペプチドは A−Met−X−Cys−Z−Bまたは Z−Cys−X−Met−Z−B の配列に適合し得る。 このような式Vのペプチドの例は以下のものを含む: 哺乳類シグナルペプチドを含む式Vのペプチドの例は: 更に、式III、IVまたはVにより示されるモチーフに適合するペプチドは、以 下のペプチドが除かれるという条件付で選択される: 好ましくは、以下の配列が除かれる: 本発明の核酸分子はRNA(例えば、レトロウイルス中)またはDNAであり得 る。好ましくは、天然に存在するヒトポリペプチドでも天然に存在するヒトポリ ペプチドのフラグメントでもない免疫活性ペプチドをコードする。免疫活性ペプ チドの配列が、たまたま天然に存在するポリペプチドのフラグメントであったと しても、本発明はコード配列が、所望によりシグナルペプチドに結合したそのペ プチドのみをコードするため、天然に存在する核酸分子とは異なる。もちろん、 多重コード配列が縦に結合し得、停止コドンおよび可能性として他の非コード配 列により分離されている。 上記のように、核酸は哺乳類シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。 このシグナルペプチドは、哺乳類細胞内の免疫活性ペプチドのアミノ末端に結合 しているとき、細胞外への免疫活性ペプチドの分泌を指向する。シグナルペプチ ドは、典型的に分泌過程中、免疫活性ペプチドから酵素的開裂される。特定のシ グナルペプチドの選択は、処置する動物の種および発現する免疫活性ペプチドの アミノ末端アミノ酸配列に依存する。免疫活性遺伝子配列に結合した分泌性シグ ナル配列の多くの例を図2に示す。核酸分子をヒト患者に投与するとき、下記の ように、シグナルペプチドは通常ヒト分泌性シグナルペプチドである。本発明の 核酸分子はまた、コード配列に操作可能に結合している真核発現コントロール配 列、例えば、哺乳類発現コントロール配列も含む、発現コントロール配列は、組 織または細胞特異的方法で核酸分子によりコードされている1個またはそれ以上 の免疫活性ペプチドの発現を指向する、誘導可能または構造的活性プロモーター であり得る。適当な分泌性シグナル配列および発現コントロール配列の選択は、 当業者の能力の範囲内であり、更にこの選択に関する手引きを下記に示す。 本発明の関連する態様は、免疫活性ペプチドをコードするように標準組換え法 により修飾したウイルス、例えばレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ 随伴ウイルスのような哺乳類発現ベクターである。これらのウイルスベクターは 、哺乳類細胞に感染できるウイルス粒子の一部であり得る。本発明の発現ベクタ ーは、例えば、発現ベクターを培養哺乳類細胞に挿入し、細胞をインビトロで免 疫活性ペプチドの発現をさせる条件下で培養し、細胞から免疫活性ペプチドを回 収することにより、免疫活性ペプチドを製造することに使用できる。ベクターが 分泌性シグナル配列を含む場合、免疫活性ペプチドを、代わりに、細胞を囲む培 地から回収し得る。あるいは、免疫活性ペプチドを、哺乳類に(1)本発明の核酸 分子、(2)本発明の核酸分子を含む発現ベクターまたは(3)核酸を含み、発現す る 細胞のいずれかを挿入することにより、哺乳類(例えば、ヒト、類人猿、マウス 、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、 ヒツジまたはウマ)中で製造させ得る。後者の場合、細胞またはその子孫を核酸 エキソビボで形質導入し得る。このような細胞(特にヒト細胞のような哺乳類細 胞)が本発明の範囲内である。 他の非統合ウイルスベクターは、広い細胞特異性を有し、36kbまでの非ウイ ルス性配列を許容できる単純ヘルペスウイルベースのベクター、およびまた広い 範囲の組織を標的とするSV40ベクターを含む。遺伝子移行に有用であること が既知の他のウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、流行性耳下腺 炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびカナ リア痘ウイルスなどのワクシニアウイルスを含む。ウイルスベクターを必要とし ない細胞を形質導入する既知の方法は、リン酸カルシウム沈降、リポフェクショ ン、エレクトロポレーションまたは微粒子銃法を含む。 本明細書に記載の免疫活性ペプチドは、下記の生物学的アッセイで証明される ように、動物の免疫応答を調節できるその能力のために、このように名付けた。 従って、本発明は患者に免疫抑制剤または免疫刺激剤のいずれかとして機能する 少なくとも1つのペプチドをコードする核酸分子を投与することにより、患者の 免疫応答を調節する方法を特徴とする。この方法は、患者に(1)発現コントロー ルエレメントに結合したコード配列を必須として含む単離核酸分子、(2)発現ベ クター内の核酸分子または(3)免疫活性ペプチドを分泌する細胞のいずれかを投 与することにより行い得る。後者の場合、患者の細胞を本明細書に記載のような 標準法によりエキソビボで形質導入できる。核酸分子、それを含むベクターまた は免疫活性ペプチドを分泌する細胞は、薬理学の分野では通常既知の経路により 患者に投与し得る。これは、患者の血流または脳脊髄液への挿入、滑液への、腫 瘍へのまたは腫瘍の付近への挿入を含む。本発明の核酸分子が、製薬学的に許容 される担体と処方された治療的組成物内に含まれ得ることは当業者には明白であ る。 免疫抑制剤として機能するペプチドをコードする核酸分子を、例えば、腎臓、 心臓、肝臓、眼または肺のような臓器;皮膚または骨髄のような組織;または繊 維芽細胞、神経細胞、膵島細胞、肝細胞または軟骨細胞のような細胞の生物学的 移植を受けた患者に投与し得る。これらの免疫抑制剤発現核酸はまた下記のもの を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患に罹患しているヒトの処置にも使用 できる:(1)関節リウマチのようなリウマチ疾患、全身性エリテマトーデス、シ ェーグレン症候群、強皮症、混合性結合織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター 症候群またはベーチェット病;(2)I型糖尿病;(3)橋本甲状腺炎またはグレー ブス病のような甲状腺の自己免疫疾患;(4)多発性硬化症、重症筋無力症または 脳脊髄炎のような中枢神経系の自己免疫疾患および(5)フェンフィガス・ブルガ リス、フェンフィガス・ベゲタンス、フェンフィガス・フォリアセウス、セネア ー−アッシャー症候群またはブラジリアン・フェンフィグのようなフェンフィガ ス。 免疫刺激剤として機能するペプチドをコードする核酸は、慢性感染、急性感染 、または乳、肺、結腸胃、皮膚、脳、子宮頚、子宮、肝臓、骨、膵臓または造血 システムの癌のような癌に罹患していると考えられる患者に投与し得る。 上記の病気の処置に有用な医薬の製造における本発明の核酸分子の使用もまた 本発明の範囲内である。 “ペプチド”なる用語は、グリコシル化またはリン酸化のような翻訳後修飾に 関係なく、2つ以上のアミノ酸残基の鎖を意味する。 本明細書に関する限り、天然に存在するアミノ酸はL−グリシン(Glu;G)、 L−アラニン(Ala;A)、L-バリン(Val;V)、L−ロイシン(Leu;L)、L−イ ソロイシン(Ile;I)、L−セリン(Ser;S)、L−スレオニン(Thr;T)、L− アスパラギン酸(Asp;D)、L−グルタミン酸(Glu;E)、L−リジン(Lys;K) 、L−アルギニン(Arg;R)、L−ヒスチジン(His;H)、L−メチオニン(Met; M)、L−システイン(Cys;C)、L−アスパラギン(Asn;N)、L−グルタミン( Gln;Q)、L−チロシン(Tyr;Y)、L−トリプトファン(Trp;W)、L−フェニ ルアラニン(Phe;F)およびL−プロリン(Pro;P)である。 本明細書に引用のすべての刊行物、特許および他の参考文献はその全体を引用 して包含させる。 これから記載する好ましい方法、材料および実施例は説明のためのみであり、 限定する意図はない。本発明の他の性質および利点が、以下の詳細な記載、図面 および請求の範囲から明らかになる。図面の簡単な説明 図1は本発明の核酸およびそれがコードするペプチドの例のリストである。星 印は、ラット分泌性シグナル配列と各免疫活性ペプチドの間の境界を示す。 図2は、モロニーマウス肉腫ウイルスレトロウイルスベクターpLXSNの模式図 である。詳細な説明 本明細書に記載の実験は、免疫応答を調節するのに使用できるペプチドをコー ドする核酸分子を利用する。これらの核酸分子を発現ベクターにクローン化し、 哺乳類細胞に形質導入させ、そして恐らく処置動物のTリンパ球の活性を上方制 御することにより、インビボの腫瘍形成の阻害を示した。ベクター構築物 以下の方法は、インビトロ悪性細胞を形質導入するのに使用できるベクターの 構築をするために行った。下記の各ベクターは(a)式I、II、III、IVまたはV で示すモチーフに適合する免疫活性ペプチドおよび(b)形質導入細胞から運び出 すためのペプチドを標的とするシグナル配列および真核発現コントロール配列を コードする配列を含む。標準組換え法は、これらの配列を結合させ、選択したベ クターにクローン化するために使用した。 最初の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドをDNA合成の標準法を使用して製 造した。このオリゴデオキシヌクレオチドは5'末端から:3−4アデノシン残 基、制限酵素部位、シグナルペプチドをコードする配列、免疫活性ペプチドをコ ードする配列、二つの停止コドン、第2の制限酵素部位そして他の3−4アデノ シン残基からなる。制限酵素部位は、オリゴデオキシヌクレオチドと選択のベク ターの間のライゲーションを容易にするために選択した。下記の実施例において 、制限酵素は以下から選択した:EcoRI、BamHI、XhoIおよびHp aI。 各場合において、シグナル配列を免疫活性ペプチドの最初のN−末端アミノ酸 を基本にして選択した。例えば、アラニンをそのN−末端アミノ酸として有する 免疫活性ペプチドは、アラニンをN−末端アミノ酸として有するペプチドに本来 関連しているシグナル配列に結合させた。ラット細胞で行った実験に関して、シ グナル配列は本来ラット細胞中に発生するものから選択した。他の種での使用に 関して、適当なシグナル配列を同様の方法で選択した。ヒトで使用するこれらの 配列を選択するための更なる手引きを下記に示す。下記の実験で使用する各シグ ナルペプチドをコードするDNA配列は、クローニング法を複雑化する制限酵素 部位を含むことを避けるために、修飾が必要であった部位を除いて、天然に発生 するラットDNA配列であった。同様に、各免疫活性ペプチドをコードするDN A配列は、一部分問題となる制限酵素部位の挿入を避けるために選択した。 上記のように製造した一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、下記のように二 本鎖とした。最初のオリゴデオキシヌクレオチドの3'末端の約15ヌクレオチ ドと相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを標準合成法により合成 した。これらの二つのDNA分子を互いにアニールするために、T7 DNAポ リメラーゼ緩衝液(United States Biochemica1s)の溶液に入れ、60℃まで徐々 に加熱し、その温度で30分放置した。一度アニールしたら、製造者の指示に従 って(United States Biochemicals)完全な二本鎖分子がT7 DNAポリメラー ゼにより酵素的に製造された。二本鎖DNAをTE緩衝液(10mMトリス、1 mM EDTA、pH7.5)中のセファデックスG50(Pharmacia,Uppsala, Sewden)カラムを通し、各オリゴヌクレオチドの最後に配置された制限部位に対 応する制限酵素で消化させて精製した。DNAを、標準法に従ってフェノール− クロロホルムで消化し、無水エタノールで−70℃で沈殿させ、遠心して回収す ることにより精製した。DNAペレットを70%エタノールで洗浄し、真空乾燥 させ、TE緩衝液に再溶解させた。 上記のように製造したDNAを適合制限部位を有するベクターに挿入できる。 この場合、DNAを、挿入物の消化により製造されるものと相補的な粘着性末端 を製造するために制限酵素で消化させた、即ち以下の制限酵素の対の一つを有す るモロニーマウス肉腫ウイルスレトロウイルスベクターpLXSN(図2)に挿入した :(1)EcoRI-BamHI、(2)EcoRI-XhoI、(3)EcoRI-HpaI、(4)HpaI-BamHI、 (5)HpaI-XhoIまたは(6)XhoI-BamHI。DNAをベクターに挿入するために、約 20ngのベクターDNAおよび4ngの挿入DNAを含むライゲーション反応を、 16℃でT4 DNAリガーゼ(Boehringer Mannheim)で行った。ライゲーショ ン反応を次いでエレクトロコンピテント大腸菌細胞(DH5α株)を形質転換する のに使用した。形質転換細胞から発育した個々のコロニーを無作為に採取し、挿 入物を含むベクターの存在についてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でチェックし た。所望の構築物(挿入物を有するベクター)を含む細胞のクローンからなるコロ ニーを増幅させ、DNA構築物を標準法により単離および精製した。一度挿入物 の存在および配向を配列決定により確認したら、大規模培養をアンピシリン(5 0μg/ml)を添加したLB培地に樹立し、600nmのODが0.8になるまで生 育させた。クロラムフェニコールを次いで最終濃度180μg/mlで添加し、フ ラスコを37℃で、シェーカーで一晩インキュベートした。DNA構築物を QIAGEN aPlasmdキット(QIAGEN,GmbH,Hilden,Germany)を使用して、製造者の 指示に従って単離した。培養細胞の形質導入 培養細胞を二つのタイプの咄乳類癌から得た:SPMWI細胞を雌ウィスターラッ トで自発的に発症した腫瘍から得、そしてAd9-101細胞を新生雌ウィスターラッ トにアデノウイルスタイプ9を接種した後に発症した腫瘍(Lindvall et al.,19 91,Cancer Immunol.Immunother.33:21-27)から得た。腫瘍を同系ラットの連 続継代により保った。 細胞形を下記のように腫瘍から樹立した。腫瘍を動物から切除し、はさみで細 かく切り、30分、RPMI1640中のDispase grade II(2.4mg/ml;Boehringer Mannheim)で処理し、細胞を脱凝集させた。SPMWI細胞系を腫瘍の19回のインビ ボ継代により樹立し、Ad9-101細胞系を5回のインビボ継代により樹立した。脱 凝集細胞を、4mM l−グルタミン、1mMピルベート、10mM HEPE S緩衝液、10mM NaHCO3および5%ウシ胎児血清(FCS)添加 RPMI1640培地中で、NUNC(Roskilde,Denmark)から得た容器中で培養した。 細胞を形質導入するために、DNA構築物を上記のように製造し、製造者の指 示に従って、レトロウイルスパッケージ細胞系GP+EまたはTRANSFECTAM(登録商 標)(Promega,USA)を有するPsi2でトランスフェクトするのに使用した。トラン スフェクタントを、10%FCS添加RPMI1640中でG418(300μg/ml)で選択 した。トランスフェクタント由来のウイルス積載上清を次いでSPMW1細胞またはA d9-101細胞を感染させるのに使用した。十分形質導入された細胞をG418存在下で 選択し、クローン細胞系を発育させた。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を基本にしたアッセイを使用し、免疫活性ペプ チドをコードするDNAが形質導入細胞内のmRNAに転写されていることを証 明した。 加えて、本発明の核酸で形質導入されたSPMW1細胞からの上清の活性Tリンパ 球の増殖への効果のインビトロの生物学的定量法は、免疫活性ペプチド (D22175AX)が形質導入細胞により発現および分泌され、Tリンパ球増殖における 野生型SPW1細胞の抑制効果に打ち勝つという結論と一致している。形質導入細胞の注入 形質導入腫瘍細胞をトリプシン添加により培養容器から回収し、遠心により集 め、5%正常同系ラット血清添加リン酸緩衝食塩水(PBS)に再懸濁した。実験 群の各ラットは、約200mlの再懸濁細胞を右後足に皮下注射された。コントロ ールとして、同等のラットが同タイプであるが、形質導入されていない、従って 免疫活性ペプチドを発現または分泌しない腫瘍細胞の皮下注射をされた。インビボ腫瘍サイズ評価 腫瘍細胞を接種した日およびその後36日までの種々の間隔で、後足の注射部 位を触診した。腫瘍を感知したとき、最大直径をカリパスで測定した。第2の測 定を最初と垂直に行った。腫瘍の容量を式V=0.4(a・b2)(式中、V=容量( mm3)、a=最大直径(mm)、b=最大直径に垂直な直径(mm))を使用して計算した 。実施例1:D22175AX-発現SPMW1細胞による免疫刺激 細胞培養中のSPMW1哺乳類癌細胞を、免疫活性ペプチドD22175AXをコードする 挿入物を含むレトロウイルスベクターで感染させた。形質導入細胞を上記のよう にG418で選択したが、クローン化しなかった。約25,000形質導入腫瘍細胞 を各8匹のラットの後足に皮下的に注射した。コントロールとして、同等のグル ープのラットに同時に約25,000野生型(即ち、非形質導入)SPMW1細胞を注射 した。インビボで発達した腫瘍のサイズを、注射後15日まで両方のグループで 上記式に従って推算した。注射後の任意の日に、D22175AX-発現SPMW1細胞から発 達した腫瘍の平均サイズは野生型SPMW1細胞から発達した腫瘍のサイズの1/1 0よりも小さかった(表1)。この結果は、D22175AXをコードし、恐らく発現する 構築物がインビボ腫瘍生育を阻害することを証明する。 表1:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例2:ヌードラットにおけるD22175AX-発現SPMW1細胞による免疫刺激の欠失 D22175AX-発現SPMW1胞をまた“ヌード”ラットの右後足に皮下的に注射した。 これらの動物は胸腺を有せず、従ってTリンパ球を製造しない。5匹の動物に皮 下的に約25,000非クローン化D22175AX-発現SPMW1細胞を皮下的に注射し、 同等な数の野生型SPMW1細胞を5匹に注射した。接種後にこれらの二つのグルー プで発達した腫瘍は、同等な速度で生育し(表2)、免疫適格性ラットに D22175AX-発現SPMW1細胞を接種したときに見られる腫瘍生育の阻害は、T細胞介 在免疫応答が関与することを示す。 表2:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例3:D22175AX-発現Ad9-101細胞による免疫刺激 細胞培養中のAd9-101哺乳類癌細胞を、免疫活性ペプチドD22175AXをコードす る挿入物を含むレトロウイルスベクターで感染させた。細胞を、実施例1記載の ようにG418で選択したが、クローン化しなかった。約10,000細胞を各5匹 のラットの後足に皮下的に注射した。コントロールとして、同等のグループのラ ットに約10,000野生型Ad9-101細胞を注射した。注射後の任意の日に、 D22175AX-発現Ad9-101細胞から発達した腫瘍の平均サイズは野生型Ad9-101細胞 から発達した腫瘍のサイズの1/10よりも小さかった(表3)。従って、 D22175AXは明らかに少なくとも二つのモデルシステムで腫瘍生育を阻害する。表3:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例4:二つのD22175AX-発現Ad9-101クローン;クローン8およびクローン9 による免疫刺激 4つの異なるD22175AX-発現Ad9-101クローン細胞系由来の細胞をラットに注射 し、同じペプチドを発現する異なる形質導入クローンが同様に腫瘍生育阻害に有 効であるかどうかを測定した。野生型Ad9-101細胞はこの実験でコントロールと して適した。各グループの5匹の動物は、非クローン、クローン6、クローン7 、クローン8、クローン9または野生型Ad9-101系の約50,000細胞を含む皮 下注射をされた。表4に示すように、すべての形質導入クローンは、少なくとも 13日後に野生型Ad9-101よりも有意に遅い腫瘍生育を示した。 表4:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例5:D22175AX-発現Ad9-101細胞による免疫刺激はTリンパ球により介在さ れる Tリンパ球が、免疫活性ペプチドのインビボ発現に応答して活性化されるかど うかを測定するために、実施例4から発展させた以下の実験を行った。ラットに 野生型Ad9-101細胞またはD22175AX-発現Ad9-101細胞(クローン8またはクローン 9)のいずれかを皮下的に注射した。各動物を腫瘍が50−100mm3のサイズに 到達したときに殺し、約2.5×105細胞を腫瘍に関連するリンパ節、即ち腫瘍 に同側性である鼠蹊部と傍−大動脈リンパ節から回収した。細胞をまた正常ラッ ト(腫瘍がない)のリンパ節からも回収した。各ラット由来のリンパ細胞を同種集 団として、または約7.5×103致死的照射(8000rad=80Gray)野生型Ad9 -101細胞と共培養した。同種および異種培養を平衡して96ウェルプレート(NUN C,Roskilde,Denmark)の全10ウェルに設置し、5日間、4mM L−グルタ ミン、1mMピルベート、10mM Hepes緩衝液、15mM NaHCO3、5 0μM β−メルカプトエタノールおよび10% FCS添加RPMI1640培地で生 育させた。培養5日目に、細胞を[3H]−チミジン(0.5μCi)に6時間さらし た。本培養条件下で単核球、ナチュラル・キラー細胞およびBリンパ球のような 他の細胞タイプが存在するが、Tリンパ球のみが5日目に有糸分裂活性として応 答できた。培養中の細胞の有糸分裂を反映する酸不溶性物質に取りこまれた放射 活性は、シンチレーションカウンターで測定した。同種培養リンパ細胞に取り込 まれた放射活性の量を、リンパ節および照射腫瘍細胞を含む異種培養に取り込ま れた放射活性の量から引いた。(取り込まれた放射活性は、腫瘍細胞 が共培養前に致死的に照射され、従って増殖できないため、単にリンパ細胞の増 殖に帰するものである。)二つの試験から得られたデータは、カウント毎分(cpm) として示し、表5に示す。 表5:培養リンパ細胞により3H−チミジン取り込み これらの結果は、致死的照射(しかし恐らくまだ抗原性である)野生型Ad9-101 細胞存在下で、D22175AX-発現Ad9-101細胞(クローン8またはクローン9)を注射 した動物から回収したTリンパ球の有糸分裂活性は、実質的に正常(非注射)また は野生型Ad9-101腫瘍細胞を注射された動物由来のTリンパ球の有糸分裂活性よ りも有意に大きいことを証明する。このデータは、野生型腫瘍細胞での“予防接 種”が野生型腫瘍細胞による続く攻撃に対する動物のTリンパ球の能力を実質的 に減少させるが、D22175AX-発現腫瘍細胞での予防接種はこの阻害に打ち勝つだ けでなく、動物のTリンパ球を非免疫化動物のTリンパ球よりも野生型腫瘍細胞 での攻撃に対して実質的により感受性とすることを示す。実施例6:照射D22175AX-発現Ad9-101細胞による免疫化は野生型Ad9-101による 続く腫瘍形成を阻害する この実験において、ラットに、10,000rad(100Gray)で照射したAd9- 101野生型細胞または同様に照射したクローン9細胞のいずれかを接種した。(照 射は細胞が1回以上分割するのを防止するが、直接タンパク質合成に影響しない 。)動物は照射細胞(1×106細胞/動物/用量)を14日間離れて2回の皮下注 射を受け、一方コントロール動物のグループはリン酸緩衝食塩水(PBS)の同等 量の同等な注射を受けた。2回目の注射の14日後(この時までに照射細胞が注 射部位からすべてなくなっていることが予測される)、動物を10,000非照射 Ad9-101野生型細胞の注射で攻撃し、腫瘍生育を評価した。照射クローン9を注 射された動物内で発達した腫瘍は、PBSまたは照射野生型Ad9-101細胞を注射 されたラットで発達した腫瘍よりも平均で有意に小さかつた(表6)。従って、 D22175AXの抗腫瘍作用は、D22175AX-発現細胞が恐らく試験動物体内から排出さ れた後でさえ、存在した。 表6:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例7:D22139AA-発現、D22069AX-発現またはD7208-発現Ad9-101細胞による 免疫調節 3つの異なる免疫活性ペプチドの腫瘍生育における効果を比較するために、ラ ットにD22139AA、D22069AXまたはD7208のいずれかを発現する形質導入Ad9-101細 胞を接種した(図1参照)。免疫活性ペプチドD22139AA(シグナル配列なし)は、直 接遅延型過敏症(DTH)アッセイに投与した場合免疫刺激性であることが先に示 されているが、D22069AXおよびD7208(それぞれシグナル配列なし)は免疫抑制と 一致した活性を示す。約2,000形質導入細胞を各ラット(5匹動物/グループ )に皮下注射し、発達した腫瘍を測定した。表7に示すように、D22139AA発現非 クローン化細胞は、野生型Ad9-101細胞から発達したものより幾分遅く生育する 腫瘍を形成し、DTH試験で観察されたこのペプチドの免疫刺激性活性と一致し た。比較して、D22069AXまたはD7208のいずれかを発現する細胞から発達した腫 瘍は、野生型Ad9-101細胞から発達した腫瘍より早い生育(少なくとも22日後) をし、DTH試験におけるこれらのペプチドの免疫抑制活性と一致した。これは 、下記の遅延型過敏症アッセイが本発明の核酸分子から発現されるペプチドの免 疫調節作用の有用な予測法であることを示す。 表7:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例8:D22139AX-発現細胞の種々のクローンの接種 D22139AX-発現Ad9-101細胞のいくつかのクローンが樹立されている。各ラット (n=5動物/グループ)は、野生型AD9-101細胞、非クローン化D22139AX-発現 Ad9-101細胞または1、2、3、5、6、7および9と命名されたD22139AX-発現 Ad9-101クローンの一つのいずれかを注射された。腫瘍生育を上記のように評価 した。クローン6、クローン7、野生型または非クローン化D22139AX-発現細胞 を注射した動物から集めたデータを表8に示す。非クローン化D22139AX-発現 Ad9-101細胞から発達した腫瘍は、平均で、野生型Ad9-101細胞から発達した腫瘍 より幾分小さく、表7に示す実験の結果と矛盾がないが、クローン6および7か ら発達した腫瘍は有意に小さかった。加えて、クローン1、2、3、5および9 は、本質的に35日まで腫瘍生成はなかった(クローン2からのデータを表8に 示す)。 表8:触診腫瘍の推算容量(mm3) 実施例9:IL−7の発現は腫瘍生育に効果がない 上記の実験範例で見られる免疫調節効果が式I、II、III、IVまたはVに適合 するペプチドをコードする核酸分子の発現によるものであることを証明するため に、これらの式に適合しないペプチドをコードする核酸分子を実施例1に記載の 範例に従って実験した。IL−7(インターロイキン7)で形質導入した約1,0 00SPMW1細胞を各7匹のラットの後足に皮下注射した。コントロールとして、 ラットの同等なグループに約10,000野生型(即ち、非形質導入)SPMW1細胞を 同様に注射した。インビボで発達した腫瘍のサイズを両方のグループで注射後1 7日まで推算した。表9に示すように、IL−7の発現は腫瘍生育に効果を有せ ず、従って恐らく動物免疫応答に効果を有しない。 表9:触診腫瘍の推算容量(mm3) 免疫刺激剤を同定するための更なるアッセイ 以下のアッセイを、本発明の遺伝子治療により由来し得る免疫刺激性ペプチド を同定するために使用できる。遅延型過敏症(DTH)試験 DNA分子が免疫応答を調節するペプチドをコードする能力を、マウスの遅延 型過敏症(DTH)試験を使用して測定できる。このアッセイの詳細なプロトコー ルは、例えばCarlsten et al.(1986,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 81:322)に見ることができる。簡単に、雄または雌のBalb/cのようなマウスを4 −エトキシメチレン−2−フェニルオキサゾリン−5−オン(OXA;Sigma Chemical Co.)にさらすことにより感作する。0日に3%OXA含有無水エタノ ール−アセトン(3:1)溶液150μlを動物の剃った腹に適用する。免疫活性 ペプチドそれ自体(例えば、局所的またはIV投与により)、またはこのペプチドを コードする核酸を使用した遺伝子治療による処置を次いで開始する(投与方法は 下記)。感作約1週間後、動物の耳の厚さを、両方の耳をピーナッツ油のような 油中に溶解した1%OXA 20μlの局所投与により攻撃する前にOditestス プ リングカリパスで測定する。攻撃24および48時間後に再び耳の厚さを測定す る。苦痛を小さくするために、攻撃および測定を軽い麻酔下に行う。 DTH反応の強度をvan Loveren et al.(1984,J.Immunol.Methods 67: 311)に記載のように測定し、式:Tt24/48−Tt0(mm単位)(式中、t0 、t24およびt48はそれぞれ攻撃前、24時間後、および48時間後の耳の 厚さを示す)に従って示す。ペプチドまたは遺伝子治療の耳の厚さを調整する能 力は、免疫応答を調整する能力の指標である:厚さの相対的増加は強くなった応 答を示すが、厚さの相対的減少は免疫抑制を示す。腫瘍成長の阻害 免疫応答を刺激するペプチドをコードする核酸は、上記哺乳類癌モデルと同様 のモデルシステムを使用して同定できる。これらの付加的モデルシステムは、樹 立細胞系もしくは動物の誘発または自発的腫瘍由来の不死化細胞で開発される。 腫瘍生育のアッセイに反応する他の細胞系は、多くの異なる種で発達させた広範 囲の腫瘍から樹立された細胞形を維持するAmerican Type Culture Collection (ATCC)から容易に入手可能である。例えば、腫瘍遺伝子の過発現または腫瘍抑制 遺伝子の阻害のために腫瘍を発症するトランスジェニック動物が腫瘍生育アッセ イに適した腫瘍細胞の第2の源を提供する。あるいは、動物の自発的または誘導 腫瘍(例えば、ヒトの自発的腫瘍)を使用する。これらの源由来の細胞を培養し、 免疫活性ペプチド候補物をコードする核酸で形質導入し、試験動物に移植する。 平衡して培養するが、しかし非形質導入しないかもしくは“空”ベクターまたは 非免疫活性ペプチドをコードするベクターでのみ形質導入した細胞をコントロー ル動物に移植する。ペプチド候補物を発現する移植された細胞が腫瘍を製造でき ないか、コントロール動物より有意に小さい腫瘍を製造する場合、コードされる ペプチドは有効な免疫刺激剤と考えられる。このアッセイの変法として、形質導 入細胞を照射し、非照射野生型細胞と注射前に混合し、野生型腫瘍細胞のインビ ボでの生育における分泌ペプチドの効果を測定する。異なる源の不死化細胞から 開発したモデルシステムは、ペプチドが広範囲に有効であるかまたはあるタイプ の癌の処置に特に有効であるかを測定するための手段を提供し得る。免疫化アッセイ 免疫応答を刺激するペプチドをコードする遺伝子はまた実施例6に記載の“免 疫化”法により種々のモデルシステムで同定できる。A.T.C.C.から得た不死化細 胞または上記のように一次腫瘍組織から樹立させた不死化細胞を関心の、致死的 照射した遺伝子で形質導入し、動物に注入する。コントロールとして、動物に照 射野生型腫瘍細胞を注入する。続いて、両方のグループの動物を野生型腫瘍細胞 で攻撃し、腫瘍形成を試験する。ペプチドが治療の可能性のある免疫刺激剤であ る場合、野生型細胞での攻撃後の腫瘍生育は、ペプチド発現細胞で免疫化した動 物で抑制される。腫瘍の配列由来の不死化細胞を使用したモデルシステムである 遺伝子の分析を行うことにより、ペプチドをコードする遺伝子が、広いベースの ワクチンとして働くか、または主に遺伝子特定の形の癌に対して主に有効である かを決定することが可能である。この方法の変法として、試験動物として、腫瘍 を自然に発症するトランスジェニック動物(例えば、マウス)を使用できる。この ような動物由来の形質導入、照射腫瘍細胞を、腫瘍を発症する前の同じ系の他の 動物の免疫化に使用できる。続く自然または誘導腫瘍形成および生育を次いで免 疫化動物で評価する。腫瘍退行のアッセイ ペプチドコード遺伝子をのアッセイの他の方法は、それを腫瘍が形成された後 に動物に投与することである。動物は腫瘍形成のトランスジェニックモデルまた は野生型腫瘍細胞の注射に続いて腫瘍を発症したものであり得る。一定サイズの 腫瘍が試験動物で形成されたら、動物にペプチドコードベクターもしくは生存ま たは致死的照射のいずれかのペプチド発現細胞を注射する。コントロールと比較 した腫瘍サイズまたは数の減少、または死亡までの延長された期間が癌の処置に おける免疫刺激ペプチドをコードする遺伝子の有用性の非常に強い証拠を提供す る。 上記の各アッセイにおいて、実施例5に示した実験を行うことにより、問題の 遺伝子生産物により、免疫系が抑制されることを示すことが可能であった。この 実験は、遺伝子生産物が、免疫系と無関係な機構よりむしろTリンパ球の活性化 の刺激によりその作用を働かせることを証明する。 腫瘍生成阻害に不活性であるか腫瘍発生を促進するペプチドを下記のように更 に試験し、それらが免疫抑制剤として有用であるかどうかを測定した。免疫抑制剤を同定するためのアッセイ 以下の方法は、あるペプチドが遺伝子治療に有用に移行できる免疫抑制剤であ るかどうかを決定するために使用できる。移植パラダイム ペプチドが免疫抑制剤として機能できるかどうかを決定するために、十分確立 された移植パラダイムの状況に従って、直接または遺伝子治療により投与できる 。 推定免疫抑制ペプチドまたはそれをコードする核酸分子を、同種または異種皮 膚移植片、臓器移植または細胞移植を動物に行う前に、ラット、マウス、ウサギ 、モルモットまたはイヌのような慣用の実験動物に全身的または局所的に標準法 で投与する。あるいは、移植片それ自体を本発明の核酸で形質導入する。同じ遺 伝的背景であるか、H−2座位が不適当な組み合わせであるC57B1-10、B10.BRお よびB10.AKM(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)のようなマウスの種は種々 の臓器移植の評価に非常に適している。 ドナー心臓のホストの腹部大血管への融合による心臓移植を行う方法は、最初 にOno et al.(1969,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.57:225;Corry et al., 1973,Translpantation 16:343もまた参照)により公開された。この手術法に従 って、ドナー心臓の大動脈を宿主の腹部大動脈に吻合し、ドナー心臓の肺動脈を 隣接大静脈に標準微小血管法を使用して吻合する。一度心臓を適所に移植し、リ ンゲル乳酸液で37℃に暖めたら、正常洞リズムが再開する。移植心臓の機能を 、腹壁を経由した心室収縮の触診により頻繁に評価できる。拒絶は、心筋収縮の 停止と定義する。本発明に関して、移植臓器が宿主に耐容性である時間を延長し た場合、あるペプチドは十分免疫抑制性であると見なす。 免疫活性ペプチドの効果は皮膚移植に続いてまた評価できる。齧歯類での皮膚 移植を行うために、ドナー動物を麻酔し、十分に厚い皮膚を尻尾の部分から除去 する。レシピエント動物もまた麻酔し、移植ベッドを皮膚の一部を剃った横腹か ら除くことにより調製する。一般に、このパッチは約0.5×0.5cmである。 ドナー由来の皮膚を移植ベッドに合うように成形し、配置させ、ガーゼで多い、 包帯をする。移植片は手術後6日目から毎日調べることができ、移植上皮の半分 以上が非生存の場合に拒絶と見なす。 免疫抑制をアッセイする他の方法は、本発明の核酸で形質導入した細胞で、そ れを同種または異種動物に移植する。形質導入移植細胞が、形質導入していない コントロール移植細胞よりも長く生存した場合、核酸分子は恐らく免疫抑制ペプ チドをコードする。自己免疫疾患モデル 自己免疫疾患のモデルはペプチドのインビボでの評価の他の手段を提供する。 これらのモデルは当業者に既知であり、あるペプチドが遺伝子治療に移行された 場合に特異的自己免疫疾患の処置に治療的に有用である免疫抑制剤であるかどう かを測定できる。 動物でモデルとなっている自己免疫疾患は、関節リウマチのようなリウマチ疾 患および全身性エリテマドーデス(SLE)、I型糖尿病ならびに甲状腺および神 経系の自己免疫疾患を含む。例えば、SLEの動物モデルはMRLマウス、BX SBマウスおよびNZBマウスおよびこれらのF1ハイブリッドを含む。これら の動物はリウマチ疾患進行の特定の態様を実験するために交配できる;NZB種 は、NZWマウスと交配したとき、重症ループス腎炎を発症する(Bielschowsky et al.,1959,Proc.Unic.Otago Med.Sch.37:9;Fundamental Immunology, 1989,Paul編,Raven Press,New York,NYもまた参照)。同様に、致死的腎炎へ の移行が、NBZXSWR交配の子孫で見られる(Data et al.,1976,Nature 263:412)。SNF1マウスの腎領域の組織学的見かけは十分特徴付けされてい る(Eastocott et al.,1983,J.Immunol.131:2232;Paul,前掲)。従って、動 物の全般的健康状態および腎組織の組織学的見かけを、免疫活性ペプチドをコー ドする遺伝子の投与がSLEの動物モデルの免疫応答の抑制に有効であり得るか どうかの測定に使用できる。 SLE、MRL-lpr/lprを発症するマウスのMRL種の一つは、またヒトの関節 リウマチに似た関節炎の形を発症する(Theofilopoulos et al.,1985,Adv. Immunol.37:269)。あるいは、実験的関節炎をラットに、1:1でフロインド 完全アジュバントと混合したII型コラーゲン(2mg/ml)(全量100μl)を尻尾 の付け根に注射することにより誘導できる。関節炎は免疫化2−3週間後に発症 する。 免疫活性ペプチドをコードする遺伝子の関節状態を抑制する能力は、遺伝子を Tリンパ球および/または関節の滑液細胞にターゲティングすることにより評価 できる。Tリンパ球を標的とする一つの方法は以下である:脾臓細胞懸濁液を関 節炎発症2−3日後に製造し、コラーゲン(100μg/ml)と共に48時間イン キュベートしてコラーゲン活性化Tリンパ球の増殖を誘導する。この時間中、細 胞を関心のペプチドをコードするベクターで形質導入する。コントロールとして 、平衡培養は、非形質導入か、または“空”ベクターによる形質導入である。細 胞を次いで腹腔内注射する(5×107細胞/動物)。処置の効果をChernajovsky et al.(1995,Gene Therapy 2:731-735)に記載のように、続く2週間疾病症状 を追跡することにより評価する。コントロールと比較した症状の減少が、関心の ペプチドおよびそれをコードする遺伝しが自己免疫疾患処置に有用な可能性のあ る免疫抑制剤として機能することを示す。 あるいは、ペプチドコードベクター、例えばアデノウイルスベクターを直接関 節滑液に導入する。この例の有効なコントロールは、ベクター配列のみを担持す るアデノウイルスの同じ動物の反対側の関節または第2の動物の関節への内部へ の注射である(Evans et al.,1995,Trends in Mol.Med.27:543-546)。 免疫活性ペプチドをコードする遺伝子の、I型糖尿病の場合の免疫応答を抑制 する能力は、オタワのBio-Breeding Laboratoriesでのウィスターラットの商品 コロニーで開発されたBBラット種で試験できる。これらのラットは、ヒトI型 糖尿病のように、自然に膵臓島細胞およびインシュリンに対して抗体を製造する 。これらの動物での本格的な糖尿病の発症前に、本発明のベクターを、上記のよ うに、それらのTリンパ球または膵島細胞を標的とするようにする。ヒト治療 ヒトの癌、感染、自己免疫疾患または移植片拒絶の処置のためのペプチドコー ド遺伝子の使用は、インビボまたはエキソビボベースの治療研究いずれかにより 利用できる。エキソビボによるヒト治療 この実験は、患者から回収した細胞(例えば、腫瘍細胞、滑膜細胞またはTリ ンパ球)を必須とし、それらを培養で樹立させ、それらを本発明の核酸で形質導 入する。形質導入過程は、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポ レーション、ウイルス感染および微粒子銃遺伝子移入を含むエキソビボ遺伝子治 療で使用される標準法により達成される。次いで、十分形質導入された細胞を例 えば医薬耐性遺伝子を介して選択する。次いで、細胞を所望により(例えば、腫 瘍細胞に関して)致死的に照射し、患者に注入または移植する。 関節リウマチの処置に関して、感染関節の滑液をIL−2または抗ヒトCD3 モノクローナル抗体でエキソビボで刺激し、同時に関連遺伝子構築物で感染させ る。細胞を患者に、例えば、静脈投与により再挿入し、それらが疾病関節に入り 、炎症部位でペプチドを製造する。レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベ クターはこのエキソビボ感染法に適している。インビボによるヒト治療 インビボ実験は、本発明の構築物の直接の患者への送達、それの関心の細胞ま たは組織へのターゲティングを必要とする。例えば、原発腫瘍の外科的除去後、 残りの細胞を、免疫刺激ペプチドをコードするレトロウイルスベクターを含む組 成物で、腫瘍の付近を処置することにより標的とし得る。手術の代わりに、原発 腫瘍への直接ベクターのその場所への注射により処置する。原発腫瘍部位から遠 い悪性細胞には、ベクターを静脈内に送達することにより到達し得る。腫瘍細胞 のターゲティングは、増殖細胞を標的とするレトロウイルスの使用により達成で きる。あるいは、ベクターまたはウイルス粒子で操作された細胞結合リガンドを 使用して、標準法に従って特異的細胞の好ましいターゲティングを達成する。 非ウイルスベクターシステムの例は、静電気力によりポリ−L−リジンに結合 したプラスミドから抗性される分子複合体である。ポリ−L−リジンは、腫瘍細 胞のレセプターに結合できるリガンドに共有結合する(Cristiano et al.,1995, J.Mol.Med.73:479-486)。相対的に腫瘍特異的発現を誘導するプロモーター を更なるレベルのターゲティングを達成するために使用できる:例えば、肝細胞 性癌のためのα−フェトプロテインプロモーター(Huber et al.,1991,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,88:8039-8043)または黒色腫のためのチロシナーゼプロ モータ一(Hart et al.,1995,Br.Med.Bull.51(3):647-655)。あるいは、構 造的プロモーター、例えばSV40プロモーターまたはCMVプロモーターを使 用する。 関節リウマチを、滑膜細胞を本来の場所に感染させるための、罹患関節へのベ クターの直接の接種を介して処置する。長期発現が所望の場合アデノ随伴ウイル スベクターを、短期発現のためにはアデノウイルスベクターを使用し得る。これ らのベクターの両方ともウサギの滑膜細胞への感染が既知である(Evans et al. Gene therapy for arthritis.In Wilff,J.A.編The lapeutics:Methods and Applications of Direct Gene Transfer.Birkhauser,Boston,MA,1994 230- 343)。 他の態様も以下の請求の範囲の範囲内である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 31/70 A61K 31/70 35/56 35/56 48/00 48/00 C07K 5/10 C07K 5/10 7/04 7/04 // A61K 35/76 A61K 35/76 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S D,SZ,UG),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU ,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH, CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,G B,GE,GH,HU,IL,IS,JP,KE,KG ,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT, LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,N O,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG ,SI,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UG, US,UZ,VN,YU (72)発明者 セーンストランド,ベンクト スウェーデン、エス―224 65ルンド、ペ ア・ヘンリク・リンクス・ヴェーグ9番

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.式I: An−X−Cys−Cys−Y−Bm (式I) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Asp、Glu、Asn、Gln、HisおよびProからなる群 から選択される; YはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Asp、Glu、Asp、Gln、Tyr、Pheおよ びProからなる群から選択される; nおよびmはnとmの合計が0から26(両端を含む)であるという条件付で選択 された整数である; 但し、配列番号139から156は式Iから除外される; コード配列は、更に、所望により、免疫活性ペプチドのアミノ末端で結合する哺 乳類シグナルペプチドをコードする〕 の免疫活性ペプチドをコードするコード配列を含む核酸分子。 2.XがGly、Pro、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、GlnおよびAlaからなる群から 選択される;YがGly、Pro、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ser、Phe、TyrおよびTh rからなる群から選択される;そしてnとmの合計が0から11(両端を含む)で ある、請求項1記載の核酸分子。 3.XがGlyおよびYがGly、 XがProおよびYがPro、 XがProおよびYがVal、 XがIleおよびYがLeu、 XがProおよびYがGlu、 XがGluおよびYがTyr、 XがProおよびYがPhe、 XがGluおよびYがPhe、 XがAlaおよびYがVal、 XがValおよびYがIle、 XがGlnおよびYがSer、 XがIleおよびYがThr、 XがLeuおよびYがAsp、または XがAspおよびYがIle;そしてnとmの合計が0から11(両端を含む)である、 請求項1記載の核酸。 4.免疫活性ペプチドが: からなる群から選択される、請求項1記載の核酸。 5.式II: An−X−Cys−Z−Cys−Y−Bm (式II) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Phe、H isおよびProからなる群から選択される; ZはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Lys、His、Phe、Tyr、ArgおよびPro からなる群から選択される; YはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Asp、Glu、Lys、Arg、Gln、Tyr、Phe、Ser、Thr およびProからなる群から選択される; nおよびmはnとmの合計が0から25(両端を含む)であるという条件付で選択 された整数; 但し、配列番号139から159は式IIから除外される; コード配列は、更に、所望により、免疫活性ペプチドのアミノ末端に結合する哺 乳類シグナルペプチドをコードする〕 の免疫活性ペプチドをコードするコード配列を含む核酸分子。 6.XがGly、Pro、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、GlnおよびAlaからなる群から 選択される;YがGly、Glu、Val、Gln、Arg、Leu、Tyr、Phe、Ile、Ser、Thr、A spおよびProからなる群から選択される;ZがIle、Gly、Thr、Ala、ArgおよびLy sからなる群から選択される;そしてnとmの合計が0から10(両端を含む)で ある、請求項5記載の核酸分子。 7.XがGlyおよびYがGly、 XがProおよびYがPro、 XがProおよびYがVal、 XがIleおよびYがLeu、 XがProおよびYがGlu、 XがGluおよびYがTyr、 XがProおよびYがPhe、 XがGluおよびYがPhe、 XがAlaおよびYがVal、 XがValおよびYがIle、 XがGlnおよびYがSer、 XがIleおよびYがThr、 XがLeuおよびYがAsp、または XがAspおよびYがIle;そしてnとmの合計が0から10(両端を含む)である、 請求項5記載の核酸分子。 8.免疫活性ペプチドが: からなる群から選択される、請求項5記載の核酸分子。 9.式III: An−X−Y−Cys−Z−Bm (式III) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Trp、Tyr およびPheからなる群から選択される; YはAla、Val、Leu、Ile、GlyおよびProからなる群から選択される; ZはAla、Val、Leu、Ile、Gly、Lys、Arg、His、PheおよびProからなる群から選 択される; nおよびmはnとmの合計が0から26(両端を含む)であるという条件付で選択 された整数; 但し、配列番号139から159は式IIIから除外される; コード配列は、更に、所望により、免疫活性ペプチドのアミノ末端に結合する哺 乳類シグナルペプチドをコードする〕 の免疫活性ペプチドをコードするコード配列を含む、核酸分子。 10.XがGly、Ala、Ile、Asp、Thr、Ser、ArgおよびTrpからなる群から選択 される;YがIle、GlyおよびProからなる群から選択される;ZがLys、Ile、Phe 、Pro、Ala、TyrおよびGlyからなる群から選択される;そしてnとmの合計が0 から11(両端を含む)である、請求項9記載の核酸分子。 11.XがGly、YがProおよびZがIle、 XがGly、YがProおよびZがGly、 XがAla、YがProおよびZがAla、 XがIle、YがProおよびZがTyr、 XがAla、YがProおよびZがIle、 XがArg、YがProおよびZがIle、 XがIle、YがProおよびZがIle、 XがAsp、YがProおよびZがIle、 XがTrp、YがProおよびZがIle、 XがTrp、YがProおよびZがGly、 XがGly、YがIleおよびZがIle、 XがThr、YがProおよびZがTyr、 XがAla、YがProおよびZがPhe、 XがSer、YがProおよびZがPhe、 XがGly、YがProおよびZがPro、または XがGly、YがProおよびZがTyrである、請求項9記載の核酸分子。 12.免疫活性ペプチドが: からなる群から選択される、請求項9記載の核酸分子。 13.コード配列が からなる群から選択されるポリペプチドをコードするコード配列を有する、核酸 分子。 14.コード配列が からなる群から選択される、請求項13記載の核酸分子。 15.分子が更に哺乳類発現コントロール配列を更に含む、請求項13記載の 核酸。 16.式IV: An−Xp−Y−Cys−Zq−Bm (式IV) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; XはSer、Glu、Gly、Ala、Leu、Pro、Thr、Val、AsnおよびLysからなる群から選 択される; YはLeu、Arg、Pro、Tyr、Ile、Val、Ser、AlaおよびPheからなる群から選択さ れる; ZはMet、Trp、Tyr、Phe、Gly、Pro、Arg、Asn、Gln、AlaおよびLysからなる群 から選択される; n、m、pおよびqは、pとqが独立して0または1であるが、同時に0ではな い;qが0である場合、mが0;およびn、m、pとqの合計が0から28(両 端を含む)であるという条件付で選択された整数である; 但し、配列番号139から159は式IVから除外される; コード配列は、更に、所望により、免疫活性ペプチドのアミノ末端に結合する哺 乳類シグナルペプチドをコードする〕 の免疫活性ペプチドをコードするコード配列を含む、核酸分子。 17.pおよびqの両方が1であり、nとmの合計が0から16(両端を含む) である、請求項16記載の核酸分子。 18.pおよびqの両方が1であり、nとmの合計が0から11(両端を含む) である、請求項16記載の核酸分子。 19.pおよびqの両方が1であり、nとmの合計が0から3(両端を含む)で ある、請求項16記載の核酸分子。 20. XがGlu、YがProおよびZがMet、 XがGly、YがProおよびZがMet、 XがAla、YがProおよびZがTrp、 XがAla、YがProおよびZがMet、 XがGlu、YがProおよびZがTrp、 XがSer、YがProおよびZがTrp、 XがLeu、YがLeuおよびZがGly、 XがPro、YがArgおよびZがArg、 XがGly、YがTyrおよびZがPro、 XがVal、YがValおよびZがAsn、 XがLeu、YがSerおよびZがGln、 XがSer、YがProおよびZがTyr、 XがAla、YがLeuおよびZがArg、 XがAla、YがProおよびZがTyr、 XがGly、YがAlaおよびZがPro、 XがLys、YがSerおよびZがLys、 XがGlu、YがProおよびZがPhe、 XがGlu、YがProおよびZがTyr、 XがSer、YがProおよびZがMet、 XがAla、YがProおよびZがTyr、 Xが欠失、YがLeuおよびZがPhe、または XがGly、YがProおよびZがTrpである、請求項16記載の核酸分子。 21.免疫活性ペプチドが: からなる群から選択される、請求項16記載の核酸分子。 22. からなる群から選択されるポリペプチドをコードするコード配列を有する、核酸 分子。 23.コード配列が からなる群から選択される、請求項16記載の核酸分子。 24.式V: An−W−X−Y−Zp−Bm (式V) 〔式中、各Aおよび各Bは20個の一般的な天然に存在するアミノ酸から独立し て選択される; WはGly、Pro、Asp、Arg、Ala、Ile、Trp、Ser、Met、CysおよびGlu からなる群から選択される; XはCys、Pro、Ile、Met、Tyr、ThrおよびArgからなる群から選択される; YはCysおよびMetからなる群から選択される; ZはGly、Phe、Val、Ile、Pro、Tyr、Trp、Glu、LeuおよびMetからなる群から選 択される; W、XおよびYは、少なくとも一つのW、XまたはYがMetおよび1個以上のW, XまたはYがCysではないという条件付で選択される; n、mおよびpは、pが0または1;pが0である場合、mは0;そしてn、m およびpの合計が0から27(両端を含む)という条件付で選択された整数である ; 但し、配列番号139から159は式IVから除外される; コード配列は、更に、所望により、免疫活性ペプチドのアミノ末端に結合する哺 乳類シグナルペプチドをコードする〕 の免疫活性ペプチドをコードするコード配列を含む、核酸分子。 25.pが1およびnとmの合計が0から16(両端を含む)である、請求項2 4記載の核酸分子。 26.pが1およびnとmの合計が0から11(両端を含む)である、請求項2 4記載の核酸分子。 27.pが1およびnとmの合計が0から3(両端を含む)である、請求項24 記載の核酸分子。 28.WがGly、Pro、Asp、Arg、Ala、Ile、TrpおよびSerからなる群から選択 される; XがCys、Pro、IleおよびMetからなる群から選択される; YがCysおよびMetからなる群から選択される;そして ZがGly、Phe、Val、Ile、ProおよびLeuからなる群から選択される 請求項24記載の核酸分子。 29.少なくとも一つのXおよびYがMetである、請求項24記載の核酸分子 。 30.WがGly、Asp、Arg、Ala、Trp、およびSerからなる群から選択される; XがProおよびIleからなる群から選択される; YがMet;そして ZがPhe、IleおよびProからなる群から選択される 請求項24記載の核酸分子。 31.WがGlyおよびSerからなる群から選択される; XがPro; YがMet;そして ZがPhe、IleおよびProからなる群から選択される 請求項24記載の核酸分子。 32.隣接して配列したMetおよびCysを有する免疫活性ペプチドである、請求 項24記載の核酸分子。 33.1アミノ酸を超えないで離されているMetとCysを有する免疫活性ペプチ ドである、請求項24記載の核酸分子。 34.免疫活性ペプチドが: からなる群から選択される、請求項24記載の核酸分子。 35. のポリペプチドをコードするコードは配列を有する核酸分子。 36.コード配列が である、請求項35記載の核酸分子。 37.コード配列が、免疫活性ペプチドに結合したシグナルペプチドをコード する、請求項1、5、9、16または24のいずれかに記載の核酸分子。 38.シグナルペプチドが、(a)核酸が発現される哺乳類細胞からの免疫活性 ペプチドの分泌を指向する、および(b)免疫活性ペプチドを細胞から酵素的に開 裂させる、請求項37記載の核酸分子。 39.コード配列が、更にコード配列に操作可能に結合した哺乳類発現コント ロール配列を含む、請求項1、5、9、16または24のいずれかに記載の核酸 分子。 40.発現コントロール配列が誘導可能プロモーターを含む、請求項39記載 の核酸分子。 41.発現コントロール配列が、構造的に活性なプロモーターを含む、請求項 39記載の核酸分子。 42.発現コントロール配列が、免疫活性ペプチドの組織特異的発現を指向す る、請求項39記載の核酸分子。 43.発現コントロール配列が、免疫活性ペプチドの細胞特異的発現を指向す うる、請求項39記載の核酸分子。 44.請求項1、5、9、16または24の核酸分子を含む、哺乳類発現ベク ター。 45.ベクターがウイルスベクターである、請求項44記載の亜Hツ現ベクタ ー。 46.ウイルス粒子が請求項45記載のベクターを含む、哺乳類細胞に感染で きる、ウイルス粒子。 47.請求項39記載の核酸分子を含む哺乳類細胞。 48.哺乳類細胞に請求項39記載の核酸分子を挿入し、細胞を免疫活性ペプ チドを発現させる条件下で培養し、免疫活性ペプチドを細胞から、あmたは細胞 の周りの培地から回収する段階を含む、免疫活性ペプチドの製造法。 49.哺乳類の細胞に請求項39記載の核酸分子を挿入することを含む、哺乳 類中で免疫活性ペプチドを製造する方法。 50.請求項47記載の哺乳類細胞に挿入することを含む、哺乳類中で免疫活 性ペプチドを製造する方法。 51.患者に請求項39記載の核酸分子を投与することを含む、患者の免疫応 答を調節する方法。 52.投与を、患者の血流中への核酸分子の挿入により行う、請求項51記載 の方法。 53.投与を、患者の滑液中への核酸分子の挿入により行う、請求項51記載 の方法。 54.投与を、患者の腫瘍の周辺に挿入することにより行う、請求項51記載 の方法。 55.請求項47記載の細胞を患者に投与することを含む、患者の免疫応答を 調節する方法。 56.細胞が患者の細胞の子孫であり、エキソビボで、核酸分子が子孫細胞ま たは子孫細胞の前駆体に挿入されている、請求項55記載の方法。 57.投与を、患者の血流中への核酸分子の挿入により行う、請求項55記載 の方法。 58.投与を、患者の滑液中への核酸分子の挿入により行う、請求項55記載 の方法。 59.投与を、患者の腫瘍の周辺に挿入することにより行う、請求項55記載 の方法。 60.免疫活性ペプチドが哺乳類で免疫抑制性である、請求項1、5、9、1 6または24のいずれかに記載の核酸分子。 61.免疫活性ペプチドが哺乳類で免疫刺激性である、請求項1、5、9、1 6または24のいずれかに記載の核酸分子。 62.免疫活性ペプチドが患者で免疫抑制性である、請求項51記載の方法。 63.患者が自己免疫疾患に罹患している疑いがある、請求項62記載の方法 。 64.免疫活性ペプチドが患者で免疫刺激性である、請求項51記載の方法。 65.患者が腫瘍に罹患している疑いのある、請求項64記載の方法。 66.シグナルペプチドがヒトシグナルペプチドである、請求項37記載の核 酸分子。 67.治療における、請求項1、5、9、16または24のいずれかに記載の 核酸分子の使用。 68.患者の免疫応答の調節に使用する医薬の製造における請求項1、5、9 、16または24のいずれかに記載の核酸分子の使用。 69.患者が自己免疫疾患または腫瘍に罹患している、請求項68記載の使用 。 70.患者が感染作動体が原因の疾病に罹患している、請求項68記載の使用 。 71.患者が臓器、組織または細胞移植片のレシピエントである、請求項68 記載の使用。 72.AがGly、Lys、Arg、Cys、Ser、Val、Ala、Thr、Glu、Pro、 Trp、Leu、Asp、PheまたはIle;BがLeu、Arg、Ile、Val、Pro、Ala、Tyr、Gly 、Trp、Thr、Lys、Met、Asp、GluまたはPhe;およびnとmの合計が2から4(両 端を含む)ものである、請求項2または3記載の核酸分子。 73.AがPro、Gly、Glu、Ala、Val、Lys、Thr、LeuまたはSer;BがTyr、Pr o、Gly、Thr、Arg、Val、Ala、Leu、LysまたはIle;nが1;そしてmが1であ る、請求項2または3記載の核酸分子。 74.XがVal、Ala、Leu、Ile、Lys、Asp、PheまたはPro;YがGlu、Val、Gl n、Arg、LysまたはPro;ZがGly、Ala、Ile、Arg、ThrまたはLys;およびnとm の合計が1から3(両端を含む)ものである、請求項10または11記載の核酸分 子。 75.XがGly、Ala、Ile、Arg、Asp、Trp、ThrまたはSer;YがPro、Glyまた はIle;ZがGly、Ala、Ile、Tyr、PheまたはPro;およびnとmの合計が1から 3(両端を含む)ものである、請求項10または11記載の核酸分子。 76.請求項1、5、9、16または24のいずれかに記載の核酸分子および 製薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。 77.免疫活性ペプチドが: YがProまたはIleおよびqが1、およびZがTyr、Phe、Gly、ProまたはAlaであ る場合 (i)pが1である場合、XがSer、Gly、AlaまたはThrではないか、または (ii)pが0である場合、Yに隣接したAのアミノ酸残基はSer、Gly、Alaまた はThrではない という条件付で選択される、請求項16記載の核酸分子。
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