JPH06501161A - 抗腫瘍免疫性の強化と遺伝子治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗腫瘍免疫性の強化と遺伝子治療のための組成物及び方法本発明は、一般的には ガンの免疫療法に関し、特に、例えばインターロイキン−２のような、腫瘍に対 する免疫応答性を強化するポリペプチドをコードする外来遺伝子を含む腫瘍細胞 系の調製に関する。本発明は免疫的に強化された腫瘍細胞を用いて免疫化するこ とによるガン療法を含む。

本発明は、遺伝的に異なる細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びＩｎ　ｖｊｖｏにおいて 選択的に除去する事ができる方法も提供する。本発明のこの態様に対する好適な 実施例には、免疫的に強化されたポリペプチドをコードする第一の外来遺伝子及 び、好ましくは誘導的プロモータに制御された“致死″または゛自殺”ポリペプ チドをコードする第二の外来遺伝子を含む細胞が含まれる。第二の外来遺伝子を 導入すると、致死ポリペプチドをコードする遺伝子に作用的に連動したプロモー タを誘導してポリペプチドの転写を開始させる二とにより腫瘍細胞を選択的に殺 す能力が付与される。ジフテリア毒または単純庖疹ウィルスのチミジンキナーゼ は致死遺伝子の例である。例として採用されたプロモータは６−１６ブロモータ であり、これは低レベルのインターフェロンにより誘導される。ガン療法におい て細胞を用いた方法も提供される。

活性化免疫療法は、治療法、特にヒトのガンの再発防止に有力なアプローチであ ると考えられている。特異的活性化免疫療法（現在研究されている最も有力なア プローチの一つ）には、免疫システムの特異的なエフェクタ細胞（Ｔリン、＜球 など）を活性化するため腫瘍細胞（変異導入、／１ブテンによる処理、または外 来遺伝子の発現により変化させることができる）で免疫化して腫瘍細胞に対する ホスト免疫応答を活性化することが含まれる。非特異的活性化免疫療法では、ナ チュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、またはリンフ才力イン活性化キ リング（ＬＡＮ）を活性化するために微生物由来または化学的な免疫モジュレー タを利用することができる。残念ながらこれらのアプローチの有望性はいまだ実 現されていない。

ガンの免疫学における最も決定的な疑問の一つは、なぜ免疫システムは腫瘍を除 去できないかということである。１９７０年代にはＨｅｗｉｔｔが、多くの腫瘍 は腫瘍に特異的な抗原すなわち腫瘍抗原を発現せず、このため免疫システムによ り“異物“であると認識されないと言明した。確かに、抗体に認識される、腫瘍 細胞表面の抗原のうち腫瘍に特異的なものは事実上存在せず、さらに、最も自然 発生的なマウス腫瘍を同系のホストに移植しても除去されなかったことからこの 腫瘍は“免疫抗原性が低い“と見なされた（Ｈｅｖｌｔｔ　ｅｔ　ａｌ）。しか し、これらの同一の腫瘍は変異導入により腫瘍細胞表面に新たな抗原が発現され た時、“免疫抗原性が高く”なった（Ｖａｎ　Ｐｅｔ　ａｎｄ　Ｂｏｏｎ、　１ ９８２）。

免疫システムが腫瘍を除去できない原因が、腫瘍抗原の欠損によるものではなく 、むしろこれらの腫瘍抗原に対する応答が不十分であることによる可能性もある 。このため、ホストの免疫応答性を強化するために腫瘍細胞の免疫抗原性を強め る方法が免疫療法の進展の鍵となり得る。

腫瘍抗原に対する応答の欠損は、少なくとも部分的にはＴ細胞の助けが欠損して いることによる。Ｔｈ機能の分子的基盤は、ＣＴＬｓ　（これらが有するＴ細胞 受容体は当初適当な抗原−ＭＨＣＩ合体により占めらている）に作用する、例え ばインターロイキン−２（ＩＬ−２）のようなリンフ才力インの局部的な分泌で ある（Ｍｏｌｌｅｒにより記述、１９８０）。ＮＫ及びＬＡＫ細胞の細胞毒とし ての可能性はＩＬ−２によっても強化される（Ｇｒｎ＊　ａｔ　ａｌ、＋　１９ ８２：　Ｐｈｊｌｌｉｐｓ　ａｎｄ　Ｌａｎ１ｅｒ。

１９８８、０ｒｔａｌｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１Ｂ　）　６インターロイ キン　２の全身注射による腫瘍免疫性の強化を試みても、これらの研究は全身投 与されたＩＬ−２により妨害される。このため、補助的なＴ細胞の助けを施すこ とにより腫瘍に対する免疫性を強化する方法が、ガン治療に長らくめられていた より有望な選択肢であると思われる。

免疫療法におけるその他の困難は、患者に、生きている腫瘍性細胞を投与するこ とに固有の問題に起因する。過去においては、免疫化に使用される腫瘍細胞は、 免疫化に先立ち、例えば放射線照射やマイトマイシンＣ処理により増殖能を低下 させるよう処理された。残念ながら、復製を阻害するこれらの方法はいずれも細 胞の免疫抗原性をも大きく減少させる。８−１０，０００　Ｒａｄｓにより照射 された、変異原誘導変異体はもはや免疫抗原性を有しないことが示された（Ｓｅ ｌｌａ、　１９８９；　Ｂｏ。

ｎ、　１．９８５　）。同様に、ＩＦＮ−γのＩＬ−２を分泌するマウス腫瘍細 胞は放射線照射の後、免疫性を失う。さらに、腫瘍細胞をｍｓ製することによっ ても、免疫応答性の確固たる証拠を欠損する。このため、免疫応答を誘導した後 除去することができる、活性型免疫抗原性腫瘍細胞を利用する手段の開発は有効 性が高い。

本発明は、例えばインターロイキン−２のような、腫瘍抗原に対するホストの免 疫応答性を誘導することができ、選択された免疫強化遺伝子を冑する新たな免疫 強化腫瘍細胞変異体を提供する。また、本発明は、免疫強化性遺伝子及び致死遺 伝子システムの両方を含んだ変異体を提供する。最初の一般的な実施例において 、本発明は、ヒトまたはトリ、サカナなどの他の哺乳類のようなを椎動物による 、腫瘍の免疫応答性を強化するための細胞の調製を提供する。調製物には、免疫 強化性のあるインターロイキンをコードする外来遺伝子を有する腫瘍由来の細胞 が含まれる（例えば、細胞外からの遺伝物質を挿入することにより導入されたも の、例えばトランスフェクションされ、選択された安定な細胞系など）。好適な 実施例においては、インターロイキンは、インターロイキン−２である。出願人 は原理に縛られることはないが、インターロイキン−２遺伝子が、恐らく初期的 にはＴリンパ球の媒介により、特異的な免疫応答性を誘導する能力を細胞に授け ることが、証拠により示唆された。

関連した実施例において、本発明はまた、腫瘍に対する非特異的抵抗性を強化す る組成物を提供する。その実施例は、好ましくはインターフェロン　ガンマをコ ードする外来遺伝子を含む細胞の調製を提供する。本発明の実行には必要ないが 、種々の遺伝子を組み合わせることにより、腫瘍に対する免疫性の強化に非常に 宵月な、あるいは相乗作用のある効果を生しる可能性もある。このため、本発明 はまた、１つ以上の外来遺伝子を含む免疫療法用の細胞を提供する。例えば、細 胞は、インターコイキン遺伝子またはインターフェロン遺伝子のいずれか、また は両方、及び別の免疫強化性ポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む。

免疫強化性ポリペプチドは、動物内に存在する腫瘍に対する、宿主の免疫システ ムの応答性を強化するポリペプチドとして定義できる。本発明の実行には、少な くとも２つのカテゴリーの免疫強化遺伝子が使用される。第一のカテゴリー、゛ 免疫強化性抗原“には、ウィルス膜蛋白質、細菌細胞抗原のような、動物に対し て異物である種々の抗原、及びこのような抗原を発現する細胞によって免疫化さ れた動物中で免疫応答性を引き出す可能性のある他の抗原をコードする遺伝子が 含まれる。このカテゴリーの遺伝子は、ここでは“免疫強化性抗原”と呼ぶ。

このカテゴリーにおいて好ましい種には、例えばウィルス膜蛋白質（例えば、イ ンフルエンザ凝集素（ＨＡ）遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子、 ワクシニア遺伝子、または水庖性ロ内炎ウィルス遺伝子など）などが含まれる。

適切な細菌由来抗原には、例えばＭ、ｔｕｂｅｃｕｒｌｏｓｆｓの６５ｋＤａ抗 原及び他の細菌由来抗原が含まれる。他の免疫強化性遺伝子には、宿主に対して 異質遺伝子型の組織適合性抗原及び他の同覆抗原をコードする遺伝子が含まれる 。免疫強化性遺伝子の第二のカテゴリーには、宿主に対して免疫抗原性を示さな いが免疫システムの細胞（Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはリンフ才 力イン活性化キラー細胞など）の活性を活性化または強化することにより免疫性 を強化する蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。このカテゴリーに含まれる免 疫強化性遺伝子は、“インターロイキン′として分類される数種のリンフ才力イ ン（さらに特定すると、インターロイキン−２、−４、−５、−６、−１、また は−３）をコードする。同じメカニズムで働く必要はないが、やはりこのカテゴ リーに含まれるものとして、インターフェロンとして知られる蛋白質（さらに特 定すると、インターフェロン　ガンマ）がある。

遺伝子は、分子生物学において既知の技術により取得することができ、特定の標 的細胞に適したベクターとともにトランスフェクションまたはトランスフォーメ ーションされることにより、選択された標的細胞（通常腫瘍由来のもの）中に導 入される。本発明のある種の態様の実行は、ＳａｍｂｒｏｏｋらによるＭｏ１ｅ ｃυｆａｒ　ＣｌａｎＪｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　５ ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒ ｅ唐刀A　１９８９ （参考文献に挙げられている）に記載された特定の技術により容易になるであろ う。

本発明の態様の一つにおいて、最低一つの、免疫強化性抗原をコードする遺伝子 及び、上述の第二の免疫強化性遺伝子のカテゴリーから選択された第二の免疫強 化性遺伝子を含む、選択された標的細胞を使用することができる。本発明は、二 二に記述する生存細胞調製物をを椎動物に導入することにより、その動物の腫外 科手術による切除、放射線照射、または適切な技術により腫瘍を減少させてかる ｍＲＮＡの転写を特異的に促進することができ、その結果、例えば細胞内代謝の 阻害などにより直接的、または間接的に宿主細胞を殺すことができる。

この様に、この実施例に従い、本発明は、選択されたポリペプチドをコードすポ リペプチドにより細胞に対して毒性を示す分子に変換される）によって、細胞を 死滅させることができる。“機能的な連結°とは、プロモータが、致死ポリペプ チドをコードするＤＮＡに関連した部位に位置しており、これによりそのプロモ ータが致死ポリペプチド構造遺伝子の転写を効果的に制御することができるこし 、この細胞には、免疫強化性ポリペプチドをコードする第一の遺伝子と、細胞る ことか好ましい。

本発明のこの態様には、ＳＶ４０、サイトメガロウィルス、またはアクチンプロ モータなどの多くの適当なプロモータを使用することができるが、後述の６−１ ６インターフエロン　α／βプロモータが特に宵月である。代替的に、細胞内毒 性のために外来基質の添加が必要なポリペプチドをコードする遺伝子を使用する 場合（例えば、ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒを必要とする単純庖疹チミジンキナーゼ など）、単純庖疹プロモータのような構成的プロモータを使用できる。

多くの適当な致死遺伝子が使用され得る。適当な例には、単純庖疹ウィルスチミ ジンキナーゼ遺伝子、及びジフテリア毒Ａ鎖が含まれる。

免疫強化性遺伝子及び致死遺伝子を含む細胞は、さらに、第二の免疫強化性ポリ ペプチドをフードする第三の外来遺伝子を含有することもできる。好適な実施例 においては、第三の外来遺伝子は、第一の免疫強化性ポリペプチドがサイトメガ ロである場合免疫強化性抗原をコードし、第一の免疫強化性ポリペプチドが抗原 である場合サイトメガロをコードする。

本発明は、新たな細胞派生物を作製する方法も含む。本発明は、例えば、選択さ れた疾病の治療に用いられる細胞の作製を含む。ここには、選択されたポリペプ チドをコードする第一の外来遺伝子の細胞への導入、及び細胞死滅能を有するポ リペプチドをコードするＤＮＡと機能的に連結したプロモータ（好ましくは選択 的に誘導可能なプロモータ）を含む第二の外来遺伝子の細胞への導入による、第 −及び第二の両方の外来遺伝子を有する細胞の作製が含まれる。選択的に誘導可 能なプロモータを使用することにより、そのプロモータを誘導することによって 細胞を死滅させることができる。上述の細胞、遺伝子、プロモータ、及び致死遺 伝子は、本発明のこの態様においても使用することができる。

もちろん、本発明は、遺伝子療法、さらに特定するとガンの免疫療法に使用され る方法も含む。を椎動物の遺伝子療法のだめの方法には、選択されたポリペプチ ドをコードする第一の外来遺伝子の細胞への導入、及び細胞死滅能を存するポリ ペプチドをコードするＤＮＡと機能的に連結したプロモータを含む第二の外来遺 伝子の細胞への導入による、第−及び第二の両方の外来遺伝子を安定に保持する 細胞の作製；及び好ましくは注射による、動物への細胞の投与が含まれる。ブロ モータが選択的に誘導可能なプロモータである好適な実施例においては、致死ポ リペプチドの合成を促進するためのプロモータの誘導という工程が付加される。

代替的には、例えば単純庖疹チミジンキナーゼ遺伝子などと連結して構成的プロ モータが使用される場合、例えばｇａｎｃｙｃｌｏｖｌｒのような第二の毒性媒 体の投与が、付加的な工程としてこの方法に追加される。もちろん、単純庖疹チ ミジンキナーゼ遺伝子を選択的に誘導可能なプロモータの制御下に置くこともで き、この場合、プロモータの誘導と第二媒体の添加の両方を行なうことができる 。

この方法は、例えば、黒色腫、乳ガン、肉腫、結腸ガン、及び卵巣ガンなどを含 む種々の腫瘍に対する免疫療法に使用することができる。

本発明の、これら、及び他の態様は、特定の実施例の記述を図面と併せて読むこ とにより、より明白となる。

図１ ＣＴ２６細胞、及びＩＬ−２にトランスフェクトされたＣＴ２６−ＩＬ−２＋細 胞のＩｎ　ｖｌｖｏ注人後のＣＴＬの誘導。ＣＴ２６またはＣＴ２６−ＩＬ−２ ＋のいずれかの細胞（１×１０６）をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの左脇腹に 皮下注射した。２週間後、ひ臓細胞を採取し、ＩＬ−２存在下で、マイトマイシ ンＣにより処理されたＣＴ２６と共に５日間培養した。培養終了時、異なるエフ ェクターターゲット比率で５１Ｃ「標識ターゲットと混合し、４時間５１ｃ、放 出活性測定を行なった。

（ａ）ＣＴ２６　ｖｓ　ＣＴ２６−ＩＬ−２＋細胞により発生したＣＴＬｏ　（ ｂ）ＣＴ２６−ＩＬ−２＋細胞により免疫化されたマウス由来のひ臓細胞による 、ＣＴ２６リンスの抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８ブロッギング６　（Ｃ）ＣＴ２６−Ｉ Ｌ−２１細胞により免疫化されたマウス由来のひ臓細胞による、ＣＴ２６リシス の抗ＭＨＣクラス　■及び抗ＭＨＣクラス　ＩＩブロッキング。

図２ ＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２＋細胞の注入により誘導された、ＣＴ２６細胞に対する防 御的免疫。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスの左脇腹にＩ　Ｘ　１０６個のＣＴ２ ６−ＩＬ−２＋細胞を皮下注射し、ついで、２週間後または４週間後のいずれか に右脇腹に１×１０５個０ＣＴ２６細胞を皮下的に免疫投与した。ＣＴ２６−Ｉ 　Ｌ−２＋によりあらかじめ免疫化を行なわない場合のＣＴ２６の増殖も併せて 示した。腫瘍の増殖は、毎週、触診及び測定により評価した。各グループにつき ２０匹のマウスについての共通の（ｐｏｏｌｅｄ）結果を示した。データは、Ｋ ａｐｌａｎ−Ｍｅｔｅｒ　ｐｌｏｔにて表示した。

図３ ＣＴ２６−ＩＬ−２＋細胞及びＣＴ２６−ＨＡ＋細胞へのｉｎ　ｖｊｖｏ応答に 対する、Ｔ細胞サブセット除去の影響。精製された抗ＣＤ４または抗ｃＤ８を腹 腔内注射して、Ｉｎ　ｖｊｖｏにおいてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスのＣＤ４ ”　、ＣＤ８”のいずれが、またはＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞を除去し た。ついで、これらのマウスの左脇腹に１×１０　個のＣＴ２６−ｎｅｏ−ＩＬ −２＋細胞を皮下注射した。

インフルエンザ凝集素遺伝子を用いてトランスフェクトすることにより免疫抗原 性を付与したＣＴ２６−ＨＡ＋系マウス（正常マウス、及びＣＤ−４除去マウス ）における増殖も併せて示した。腫瘍の増殖は毎週測定し、図２に示した。Ｔ細 胞サブセットの特異的な除去は、実験法の中に記述した。

図４ マウス抗Ｈ２ＫｋまたはＨ２Ｎ　によりそれぞれ前処理されたｓＰｌまたはＣＴ ２６細胞への、標識ヤギ抗マウスイムノグロブリンの結合に基づく蛍光強度分布 。

図５ ＳＰＩ細胞を、ＩＯＵ／ｍｌのＩＦＮγにより２４時間処理した。細胞を洗浄し 、ＦＡＣ３解析のための試料を採取した。細胞をＩＦＮγ非存在非存右下るｉｎ 　ｖＨｒＯ培養に戻し、４８．７２．９６時間目にＦＡＣＳ解析のための試料を 採取した。

図は、マウス抗Ｈ２Ｋｋにより前処理された、ＩＦＮγ処理ＳＰＩ細胞への、標 識ヤギ抗マウスイムノグロブリンの結合に基づく蛍光強度分布を示している。

図６ マウスＩＦＮγ遺伝子によりトランスフェクトされたＳＰＩ細胞の異なる３つの クローンについて、Ｈ２Ｎ　の発現を検討した。図は、マウス抗！（２Ｋｋによ りに 前処理された細胞への、標１ヤギ抗マウスイムノグロブリンの結合に基づく蛍光 強度分布を示している。

図７ ６匹のヌードマウスのグループに１×１０５個の６Ｌ細胞を皮下注射した。その 結果生じた６つの腫瘍のうち２つを採取し、！ｎ　ｖｌｔｒｏで培養してＩＦＮ γの生産及びＨ２Ｋｋの発現を検討した。個々の腫瘍、６Ｌ−Ａ及び６Ｌ−Ｂを 同系マウスに注入し、その腫瘍形成能を検討した。

以下の例は、本発明の選択された態様を説明しているが、特許請求の範囲に特定 されているもの以外はこれに限定されるものではない。

例Ｉ 以下の例は、本発明の態様の一つの応用により得られた結果を記述しているーー 外来の免疫強化サイトカイン、この場合、インターロイキン−２、をコードする 遺伝子によりトランスフェクトされた細胞を投与することによる抗腫瘍免疫の強 化。

ＣＴ２６細胞はＭ、Ｂｒａｔｔａｉｎより取得した（Ｂｒａｔｔａｉｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８０　）　ｏ　Ｂ　１６黒色腫細胞のＦＩＯサプライン（Ｆｉｄ ！ｅｒ、　１９７５）　ＮＩＴ　ＤＣＴ　ｔｕｔｏｒ　ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙよ り取得した。ＲＥＮＣＡは、ＭｕｒｐｈｙとＨａｕｓｈｅｓｋｙ　（１９７３） により最初に記述されたマウス腎細胞ガンである。５Ｓ−５は我々の研究室の一 つ（Ｐ、Ｆ、）においてｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｅｎｅにより誘発された 自然発生哺乳類アデノカンドーマ軸ｄｅｎｏｃａｎｔｈｏｓａ　）である。ＭＨ ＣＮＫ標的細胞系であるＹＡ　Ｃ−１（Ｋｌｅｓｓｊｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１ −　９７５）は、Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋ＋ｎｓ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪ　、 Ｖａｇｎｅｒの好意により提供サレタ。

２、トランスフェクション ＤＮＡは、リン酸カルシウムとの共沈殿により細胞内に導入した（Ｇｒａｈａｍ 　ａｎｄｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　１９７３；讐１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　 １９７９）　、　ＣＴ２６−　ｒ　Ｌ−２”細胞系は、ウサギβ−グロビンイン トロン、スプライス、及びｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルを育し、サイトメガロウ ィルスプロモータの転写制御を受けるマウスＩＬ−２ｃＤＮＡクローンを含むウ シパピローマウィルス発現ベクターであるプラスミドベクターｐＢＣＭＧ−ｎｅ ｏ−ｍｌＬ−２５μｇを用いてトランスフェクトすることにより取得した；これ はＴｈ５　ネオマイシン抵抗性遺伝子も含む（ＫａｒａｓｕＦａｌａ　ａｎｄ　 Ｍｅｌｃｈｅｒｓ、　１９１１８：　Ｋａｒａｓｕｙａｓａ　ｅｔ　ａｌ、、１ ９８９）　ｏ細胞に沈殿物を１４〜１６時間暴露し、Ｃａ”＊たはＭｇ２　＋を 含まないＨａｎｋｓ　″　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎを用 いて一回洗浄し、１０％　Ｆｅ２を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ　−ｓ　ｍｏｄｉｆｉ ｅｄ　Ｅａｇｌｅ　−ｓ培地を再度添加し、３７℃で培養した。４００μｇ／ｍ ｌの６４１８中での選択は細胞を沈殿物に暴露してから４８時間後に開始した。

ＣＴ２６−ｎｅｏ−ＩＬ−２系は、ｐ　ＢＣＭＧ−ｎ　ｅ　ｏ　−Ｉ　Ｌ−２か らサイトメガロウィルス初期プロモータ、ウサギβ−グロビンイントロン、及び ｍ１Ｌ−２配列を除去したプラスミドを用いてＣＴ２６細胞をトランスフェクト することにより作製した。血球凝集素を発現するＣＴ２６−ＨＡ＋細胞系（Ｆｅ ａｒｏｎにより記載、１９１１ｉりは、Ｇ４１８選択に先立ち、ＣＴ２６に５μ ｇのプラスミドベクターｐＢＶ１−ＭＴＨＡ及びｐＳＶ２−ｎｅｏを同時にトラ ンスフェクトすることにより作製した。本研究ではＦＡＣ９３，クローン５を使 用した。Ｂ１６−１−２”　トランスフェクト細胞は、ＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２” 　トランスフェクト細胞と同様に（しかしＧ４１８選択後は限定された希釈によ りクローニングされた）作製した。

３．１Ｌ−２活性測定 トランスフェクトされた細胞のｒ　Ｌ−２活性は既に報告されている方法（Ｊａ ｎｉｓ　ａｔ　ａｌ、、　１１８９　）で、ウェルにつき３０００個のＣＴＬＬ −２を含む９６穴マイクロタイタープレートに希釈液を移すことにより測定した 。２４時間後、［３１１チミジンを１２時間添加し、その後ＰＨＤ細胞ハーベス タにより取り込み量を測定した。ＩＬ−２１ｍｌあたりのユニット数は、ＣＴＬ Ｌ−２の最大増加量の半数を与える土浦希釈液の逆数として計算した。

たはＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２＋細胞を左脇腹に皮下注射してから２週間後にひ臓を 除去した。ＣＴ２６ｍ胞のマイトマイシンＣ処理は、それらの細胞を５０μｇ　 ／　ｍｌのマイトマイシンＣ中で３７℃４５分間インキュベートした後ＲＰＭＩ −１０ＦＣ５で３回洗浄することにより行なった。ｒｎ　ｖ８ｔｒｏ刺激は、各 ウェルにつき２Ｘ１０　ＣＴ、；）５ステイミニレータと６Ｘ１０６ひ蔵細胞レ スポンダ及び２０−５０　Ｕ／ｍ１組み換えマウスＩＬ−２の入った２４穴プレ ート中で行なった。

５１Ｃｒ放出活性測定は、９６穴■底プレート中で種々の数のエフェクタ細胞を 各ウェルにつき５０００個の５＋Ｃ，標識ターゲットと混合することにより行な った。

３７℃４時間後、各ウェルにつき１００μｍを採取してガンマカウンタ中で計測 した。比リシスバーセント（口ｃ　ｐｍ８．ｐ−ｃ　ｐｍｌ、ｎ］　／　［ｃ　 ｐｍ、ａ、　−ｃ　ｐ以外は同様の方法で、ＢＩ３黒色腫システムについてのＣ ＴＬ活性測定を行なった。抗体ブロッキングは、以下の抗体の硫酸アンモニウム 精製調製物の１：１０Ｏ希釈液を５１Ｃ「放出活性測定開始時にマイクロウェル に添加することにより行なった：　ＣＤ４に対するＧＫｌ、５．モノクローナル 抗体（ＭＡｂ）　（Ｄｉａｌｙｎｊｓａｔ　ａｌ、、　１９８３０　；　ＣＤ８ ．　２に対する２、４３．Ｉ−Ａ　＋１−Ｅｄに対するＭＡｂ　（Ｂａｔｔａｃ ｈａｒａｙａ　ｅｔ　ａｌ、、　１Ｂ９Ｊ）　；　２８−１４−８．　Ｌ’に対 するＭＡｂ（Ｏｚａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）　；　３５−１−２．　 Ｋｄ＋Ｄｄに対するＭＡ　ｂ　（Ｏｚａｔｏ　ｅｔａｌ、、　１９８２）。すべ てのブロッキング抗体は、段階希釈した抗体をフロー血球計測解析により測定し たひ臓リンパ球に対する飽和結合を示す最低濃度の５〜１゜倍の濃度を用いて慎 重に活性測定した。使用に先立ち、ブロッキング特異性を以下のように評ｉした ：　ｉｎ　ｖｊｔｒｏにおいて抗ＣＤ４及び抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体は二次ＰＰ Ｄ−増殖応答を８０％以上阻害し、ａｌｌｏ−ＣＴＬリシス（Ｂ６抗ＢＡＬＢ／ ｃ）を５％以上阻害する；抗ＣＤ８及び抗ＭＨＣクラスＩ抗体は二次ＰＰＤ増殖 応答を５％以上阻害し、ａｌｌｏ−ＣＴＬリシスを８０％以上阻害する。

５、　）ｎ　ｖＬｖｏ抗体除去 １ｎ　ｖ）ｖｏ抗体除去は、腫瘍注入の１〜２日前に開始した。ＣＤ４の除去に はＭＡｂ　ＧＫｌ、５を、ＣＤ８の除去にはＭＡｂ　２．４３を使用した。硫酸 アンモニウムにより精製した腹水（ＦＡＣ３上で＞１　：　２０００にて胸腺細 胞を染色することによりタイター測定した）を、最初の３週間は一日おき、その 後は週に一回腹腔内に注入した（各マウスにつき０．１ｍ１）。Ｔ細胞サブセッ トの除去は腫瘍注入当日、注入後３週間目、５週間目に２．４３またはＧＫｌ、 ５により染色後、フルオロセイン　イソチオシアネート標識ヤギ抗体をラットＩ ｇＧに結合することによりリンパ節細胞をフロー血球計測解析して計測した。各 解析時、正常濃度の対合（０１）ｌ）Ｏｓｉｔｅ）サブセット存在下で適当なサ ブセットの〉９９％が除去された（単一除去の場合）。

腫瘍系ＣＴ２６の免疫抗原性は低い；少量の細胞（ＩＸＩＯ〜ｌＸｌ０’）を同 系（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスに注入することにより、致死的な腫瘍が引き起こされ 、検出可能量の腫瘍特異的ＣＴＬは誘導されない（Ｆｅａｒｏｎ　ｅｔ　ａｔ、 、　１９８８　）。

ＣＴ２６細胞に、ネオマイシン抵抗性遺伝子及びマウスＩＬ−２ｃＤＮＡを含む ウシパピローマウィルス（Ｂ　Ｐ　Ｖ）ベクターをトランスフェクトした。トラ ンスフェクトされた細胞を、ネオマイシンアナログＧ４１８中で選択し、はぼ同 じ大きさの５０個以上の保存クローンから調製されたＧ４１８抵抗性系（ＣＴ２ ６−ＩＬ−２＋）をその後の研究のために選択した。

Ｉ　Ｌ−２生産を測定するために、ＣＴ２６−ＩＬ−２＋系を各ウェルにつき５ Ｘ１．Ｏ’細胞ずつ２４穴プレートに入れ、３８後上清（各ウェルにつき１，５ ｍ１）を採取して段階希釈後、ｒＬ−２−依存性ＣＴＬＬ−２細胞系に移した。

それらは４０ＵのｒＬ−２活性を有しくＩＵは、２４時間の活性測定において最 大ＣＴＬＬ刺激の５０％を誘導する量として定義される）、これによりＣＴ２６ 〜ｆ　Ｌ−２＋細胞力伏量のＩＬ−２を分泌していることが示された。ＣＴ２６ 細胞親株及びＩＬ−２ｃＤＮＡ挿入物断片を有するＢＣ〜ＩＧベクターによりト ランスフェクトされたＣＴ２６細胞のいずれの上清も検出可能なＩ　Ｌ−２活性 を示さなかった。

でも検出可能な全身的ＣＴＬ活性をほとんど引き起こさないことが過去に示され ていた（Ｆｅａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）　ｏ　しかし、Ｉ　Ｌ−２を 生産するＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２２細胞を皮下注射した後、二次的なｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ刺激を行なうと大量の抗ＣＴ２６ＣＴＬ活性がひ臓において検出された（図 １ａ）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＣＴ　Ｌ活性の大部分はＣＤ８及びＭＨＣクラスＩ に対する抗体によりブロックされるが、ＣＤ４またはＰ、ＩＨＣクラスＩＩに対 する抗体によってはブロックされない（図１ｂ及び１ｃ）ａこれは、ＣＴ２６− Ｉ　Ｌ−２”細胞が、内因性の、ＭＨＣクラス１抵抗性ＣＤ８”　ＣＴＬを実際 に活性化することを示している。事実上、他のＢＡＬＢ／Ｃ由来Ｉｉ瘍ターゲッ ト（Ｓ　Ｓ　−５）またはＭＩ（ＣクラスＩ　ＮＫ９−ゲット、ＹＡＣ−１（エ フェクターターゲット比率が１００：１においてく５％の比リシス）に対する細 胞溶解は認められなかった。これらの結果はＣＴ２６−ＩＬ−２１免疫化により 誘導されるエフェクタ細胞の大部分が抗原特異的及び〜ＩＩ（Ｃクラス■特異的 であり、また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて測定される微弱な活性はＮＫ及びＬＡ Ｎ細胞によるものであることが示される。

免疫に関連するかどうかを調べた。ＣＴ２６−ＩＬ−２“細胞をＩＸｌｏＢｍま での最大量皮下注射しても、注射後８週間までに腫瘍は認められなか、た。これ に対して、Ｃ７２６１１株細胞を注射したすべての動物において注射後２週間ま でに腫瘍が存在した（表１）。このように、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスは、 ＣＴ２６−ＬＬ−２＋をＣＴ２６親株の３〜４けた多い量除去することができる 。ＣＴ２６−ＩＬ−２＋細胞の除去が、局部的に生産されたＩＬ−２にょるＣＴ ２６特異的エフェクタ細胞の活性化によって起こることを示すために、Ｉ　Ｌ− ２挿入断片を除去し全ＢＰＶベクター配列のみを有するプラスミドを用いてＣＴ ２６細胞をトランスフェクトした。ＣＴＬＬ機能的活性測定によりＩ　Ｌ−２を 分泌しないことを確認したこれらのトランスフェクト細胞（ＣＴ２６−ｎｅｏ− ＩＬ−２）は、トランスフェクトされていないＣＴ２６細胞と同程度の割合でＢ ＡＬＢ／ｃマウス中にマウを作った（表１）。さらに、左脇腹へのＩ　Ｘ　１０ ６個のＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２＋細胞の注射は、反対側の脇腹における１×１０５ 個のＣＴ２６細胞の増殖を阻害しないことが観察された。このように、ＣＴ２６ −ＴＬ−２＋にょるＩＬ−２生産の効果は当初は全身的というより、むしろ局部 的な免疫応答を刺激すると思われる。

ｊｎν１ｔｒｏで測定したとおり、ＣＴ２６−　ＩＬ−２＋細胞を用いた免疫化 により２週間後には全身的なＣＴＬが誘導されるという結果を得たため、これが ｉｎ　ｖｉｖＯにおけるＣＴ２６親株細胞に対する抗腫瘍応答と関連するかどう かを調べた。

実［、ＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２”　細胞のａ入１．：より、ｌＸ１０５１１１のＣ Ｔ２６細胞１：侵されたマウスは２週間完全に防御された（図２）。この防御は 永続的ではなく、約５０％のマウスにおいて免疫後４週間で腫瘍が発生した（図 ２）。ＣＴ２６−ＩＬ−２＋により免疫化してから２週間後に他のＢＡＬＢ／Ｃ 腫瘍（ＳＳ−５、ＲＥＮＣＡ）を注入したところ正常に増殖したことがら、この 防御は腫瘍特異的であると考えらる（データ示さず）。

よるものであり、ＭＭＣに制限されたＣＴＬ機能の大部分はＣＤ４−８＋サブセ ブトの働きによるものであるため、次にＣＴ２６−ＩＬ−２”細胞の除去に対す るこれらのサブセットのＩｎ　ｖｉｖｏにおける選択的欠損の効果を検討した。

過去の研究でＣＴ２６細胞が、インフルエンザ凝集素のような外来遺伝子により トランスフェクトされることにより免疫抗原性を示すことが示されている（ＣＴ ２６−ＨＡ”　；　Ｆｅａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌ９８１１１　）。“助け られない°仮説は、ＣＴ２６−Ｉ　Ｌ−２＋細胞により誘導される免疫応答の強 化が、少なくとも部分的には、導入された外来の凝集素遺伝子産物に対してＭＨ ＣクラスＩＩに制限されたエピトープに応答するＣＤ４”ヘルパーＴ細胞に媒介 されることを示している。ＣＴ２６−ＨＡ＋細胞が、ＣＤ４除去マウスから除去 されないことはこの仮説を支持している（図３）。総括すると、これらの結果に より、免疫化は抗腫瘍ＣＴＬ応答の発生においてＴｈ機能を効果的にバイパスす るという概念が支持される。

５、ＣＤ８＋細胞はｉｎ　ｖｉｖｏにおける腫瘍除去に必要であるとができず、 これは、このＴ細胞サブセットがｉｎ　ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍応答に関与して いることを示している（図３）。しかし、腫瘍の増殖キネティクスにおいては、 正常なりＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６の増殖キネティクスと比較して大き な遅延があることは特筆すべきである。この部分的な応答が残存ＣＤ４−８＋細 胞の働きによるものである可能性はあるが、これらは初期腫瘍注入時及びｆｎ　 ｖｉｖｏ抗体処理中のいずれにおいても、フロー血球計測解析により検出されな かった。ＣＤ４及びＣＤ８の両方が欠損している場合でも腫瘍増殖において同様 の遅延が認められた。このため、ＩＬ−２応答性ＣＤ４”　８−エフェクタ細胞 集団も、１ｎ　ｙｆｖｏ抗腫瘍応答に関与していると思われる。３種のＩ　Ｌ− ２応答性候補は、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、及びγδＴ細胞受容体を育するＴ細胞 である（Ｐａｒｄｏｌｌ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７；　Ｂｒｅｎｎｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８８：　Ｒａｕｌｅｔ、　１９１１９）　ｏこれらの集cの 細胞の大部分はＣＤ４−８−であるため、これらはＣＤ８欠損マウスにおいてま だ存在している可能性がある。退行腫瘍の組織学的解析に基づき、抗腫瘍応答に 関与する他の潜在的エフェクタ細胞にはマクロファージやマスト細胞などがある ことが判明した（データ示さず）。

６、ＩＬ−２生産黒色腫細胞によるＣＴＬの発生及びＩｎ　ｖｆｖｏ免疫誘導全 身的な免疫の誘導が、ＩＬ−２を分泌するよう構築された腫瘍の一般的な特徴で あるかどうかを検討するため、ＢＣＭＧ−ＩＬ−２ベクターを用いて第二の低免 疫抗原性腫瘍、Ｂ１６黒色腫をトランスフェクトした。Ｂ１６黒色腫は、Ｃ５７ Ｂ　Ｌ／６由来の非常に悪性のメラニン細胞腫瘍である。トランスフェクション 後、ＣＴＬＬ細胞に対する場合と同様の条件下で活性測定し、細胞と同等または それ以上の、生物活性を有するＩＬ−２を生産するＧ４１８抵抗性クローンを選 択した（Ｂ１６−Ｉ　Ｌ−２”　）。表２は代表的なりローンの結果を示してい る。

少量の８１６黒色腫細胞は同系のＣ５７Ｂ　Ｌ／６マウス中に腫瘍を引き起こす が、Ｂ１６−ＩＬ−２＋細胞は完全に除去された。ＣＴ２６腫瘍共存下では、Ｂ １６−ＩＬ−２＋細胞を注入されたマウスにおいて、Ｂ１６親株腫瘍に対してよ り多くのＣＴＬ活性を生じた。Ｂ１６−ＩＬ−２＋細胞を注入されたＣ　５７　 Ｂ　Ｌ／６マウスは、ｉｎ　ｖｌｖｏにおいて、Ｂ１６細胞に対して用量依存的 に防御的免疫を形成する。この防御はＣＴ２６システムにおいて見られたものほ どは大きくなく、Ｉ　Ｘ　１０６個の８１６−ＩＬ−２＋細胞で免疫化したマウ スのうち約半数においてｌＸ１０５個の８１６親株細胞に暴露された後、最終的 に腫瘍が発生した（表２）。

Ｂ１６黒色腫細胞におけるＭＨＣクラスＩの発現が非常に低い（ＣＴ２６細胞に おける場合の約５〜１０倍低い）ことは特筆すべきである（データ示さず）。

これは、Ｂ１６黒色腫細胞の増殖速度が速いこともある程度関与するが、Ｂ１６ においては、ＣＴ２６システムと比較して、親株腫瘍に対する防御効率が明白に 低いことに起因すると思われる。

ここに示した結腸腫瘍及び黒色腫のデータに加えて、ＩＬ−２にトランスフェク トされたマウスＣＢＡ−５ＰＩ肉腫及びラットＤｕｎｎｉｎｇ前立腺ガンにおい ても同様の結果が近年観察された（データ示さず）。広く異なる細胞起源の２種 の腫瘍において類似の効果が認められたという事実は、ここに概説した原理が種 々のガンに対して一般化できることを示唆している。しかし他の研究で、ＣＢＡ マウス由来の自然発生補乳類腺ガンにＩＬ−２遺伝子をトランスフェクトし、親 株腫瘍の増殖に対してＣＢＡマウスを免疫化するのに使用したところ、これらの 研究においては、ＩＬ−２”　トランスフェクト細胞は親株腫瘍に対する際立っ た免疫性を誘導しなかった。

さらに、ＨＡを発現する及び／またはＩ　Ｌ−２またはＩＦＮ−γを分泌するい くかのトランスフェクト細胞も調製した。二重にトランスフェクトされた細胞は 、腫瘍の免疫抗原性を強化すると考えられている。

例ＩＩ ガンマインターフェロンをコードする外来遺伝子によりトランスフェクトされた Ｉｌ！瘍細胞の作製および非特異的腫瘍抵抗性強化の実験以下の例は本発明の他 の態様、恐らく１９２８球以外の細胞に依存するメカニズムを通して腫瘍抵抗性 を非特異的に強化することが可能なサイトカインをコードする遺伝子による細胞 のトランスフェクシヨンを示している。以下の例では、ガンマインターフェロン をコードする遺伝子によりトランスフェクトされた腫瘍細胞をマウスに注射する ことにより腫瘍抵抗性の非特異的強化を行なった。

さらに特定すると、ＩＦＮγを発現するマウスＩＦＮγ遺伝子によりトランスフ ェクトされたＳＰＩマウマウガン細胞（ＳＰＩ／ＩＦＮγ）は同系の宿主中では 増殖できず、ヌードマウス中で増殖する。ＳＰＩ／ＩＦＮγ細胞の除去はＩＦＮ γ生産量に関連し、この応答の心性アームにおけるＴ細胞の関与も考えられるが 、初期的には非特異的細胞メカニズムにより媒介されると思われる。ＳＰＩはＨ ２ＫＫネガティブであるが、ＩＦＮγ生産時にクラス■抗原を発現する。しかし 、クラスＩ　ｋｉＨｃの発現は、発現の必要性はあると思われるが、腫瘍増殖を 阻害するには不十分である。なぜなら、８Ｕ／ｍｌのＩＦＮγがクラス■抗原を 誘導可能であるにもかかわらず、腫瘍形成の阻害には＞６４Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ の分泌が必要だからである。同様の結果はマウス結腸ガンＣＴ２６　（この腫瘍 は構成的にクラスＩ　ＭＨＣ抗原を発現する）についても得られ、これによりク ラスＩ　ＭＨＣの発現は、ＩＦＮγにより誘導される除去応答に対して必須では ないという主張が支持された。ＳＰＩ／ＩＦＮγ細胞が親株ＳＰＩ細胞に対して 防御されないことにより、微弱または非免疫抗原性腫瘍細胞に対する防御応答の 誘導には、ＩＦＮγ生産またはクラスＩ　ＭＨＣ発現以外の因子が必要であると 考えられる。

６週令〜８週令の雌ＣＢＡ及びＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ＣマウスはＦｒｅｄｅｒｉ ｃｋ　Ａｎｉｍａｌ　ＰａｃｉｌＩｔｙ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅから入手した０２、腫瘍 ＳＰＩ自然発生咽乳類腺ガンの起源は既に報告されている（Ｆｒｏｓｔ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８７）。ＳＰＩは、同系マウス中で、皮下注射後即座に増殖し、 その免疫抗原性は低く、クラスＩ　ＭＨＣ抗原を微量にしか発現しない。ＣＴ２ ６結腸腺ガンはＨｌＢｒａｔｔａｉｎから入手した（Ｂｒａｔｔａｊｎ　ｅｔ　 ａｌ、＋　１９８０　）　、　ＭＤＷＩはＭＤＡＹ−ＤＩリンパ腫の免疫抗原変 異体である（Ｋｅｒｂｅｌ、　１９７９）。

３、培養条件 細胞は、５０．０ＯＯＵのベニンジン及びストレプトマイシン、１５０ｍｇＬ− グルタミン、２０ｍＭ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンス ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　、３７５ｒｎｇ　重炭酸ナトリウム、及びｌＯ％ウシ 胎児血清（ｌｒｖｉｎｅ　５ｃｊｅｎｔｉ４ｉｃ、　５ａｎｔａ　Ａｎａ、　Ｃ ＾）を含有するＧＩＢＣＯＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地中で培養した。すべての腫 瘍は、Ｇｅｎ　Ｐｒｏｂｅ　ＲＮＡハイブリダイゼーション法により周期的に改 賀ψ／１ｓｉａ存在を試験した：唇賀ψ／ＪｆｌＡの混入は見られなかった。さ らに、細胞のマウス抗体生産も試験しくＭｉｃｒｏｂｔｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓ ｏｃｉａｔｅｓ、　ＢｅＬｈｅｓｄａ、　ＭＤ）　、１３種のマウス病原性ウィ ルスを検出した。

本研究に使用したモノクローナル抗体は以下のとおりである：マウス抗Ｄｋ／Ｋ ｄ　（クローン１５−５−５Ｓ）はＤｒ、Ｂ、Ｅ、ＥＩｌｉｏｔｔ　（Ｑｕｅｅ ｎ　−ｓ　Ｕｎｔｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｋ！ｎｇｓｔｏｎ、　０ｎｔａｒｌｏ、　 Ｃａｎａｄａ　）の好意により取得した◇マウス抗Ｋｄ　（クローン１６−１− １１Ｎ）はＬｌｔｔｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｃｈａｒｌｅｓ、　ＳＣ）から購 入した。マウス抗に’／Ｄｋａｂ（クローンＨ１００−２７１５５）、抗１−Ａ ｋ　（クローン１４Ｖ１８Ｌ及び抗ＤｋはＣｅｄａｒｌａｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ 　（Ｏｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄａ）から購入した。

マウス抗Ｉ−Ａｋ抗血清はＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　（Ｓａｎ　Ｊｏ ｓｅ、　ＣＡ）より入手した。

５、１ｎｖｌｔｒｏ　ＩＦＮ７処理 組み換えマウスＩＦＮ７はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、Ｃ３ａｎ　Ｆｒａｎ ｃｌｓｃｏ、　ＣＡ　）より入手した。３×１０５個の腫瘍細胞を１０ｃｍプラ スチック皿５枚に入れ、１〜１００Ｕ／ｍｌのｒＦＮｒと共に４日間培養した。

４日月、ＩＦＮγ処理細胞を採取し、１〜１００Ｕ／ｍｌのｒＦＮｒと共にさら に３日間培養した。ついで、それらの細胞についてクラスＩ　またはクラス１１ ＭＭＣ抗原の発現を解析した。

スマンを使用して細胞を組織培養プレートからかきとり、マウス抗Ｄｋ、Ｄｄ、 またはＩＡ　またはＩＡｄ抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄 後、細胞をＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に４℃で３０分間インキ ュベートし、１％　バラホルムアルデヒドで固定後−週間以内に血球計測器を用 いて観察した。

７、ＤＮＡによる細胞のトランスフェクションリン酸カルシウムとの共沈殿（Ｇ ｒａｈａｓ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　１９７３　）またはりボッエフ チン試薬の使用（Ｆｅｌｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）のいずれかの方 法でＤＮＡ：ＳＰｌまたはＣＴ２６細胞にトランスフェクトした。５ＰＩ−ｎｅ ｏ及びＣＴ２６／ｎｅｏ細胞系は、１μｇのプラスミドベクターｐＳＶ２ｎｅｏ と１μｇのマウス肝臓ＤＮＡの混合物をトランスフェクトすることにより取得し た。５ＰＩ−ｒＦＮｒ系は、ＳＰＩ細胞を１μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ及び１０μｇ のｐＧＥＭ３−５ＶＭｕ　ｒＦＮｒをトランスフェクトすることにより取得した 。後者は、ＳＶ４０プロモータ及びマウスｒＦＮｒ遺伝子を含むｐＧＥＭベクタ ーであり、Ｄｅｐａｒｔｗｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｓｎｕｎｏｌｏｇｙ　ａｔ　ｔｈｅ 　Ｍ、Ｄ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ＣｅｎｔｅｒのＤｒ、Ｒ，５ｕｚ ｕｋ奄■D意 により提供された。ｇｅｎｅｔｌｃｌｎ中で選択した後、各プレートからのコロ ニーをプールし、ＩＦＮγ生産を検討した。

性測定は、マウスＬＴＫ細胞中での水痘性口内炎ウィルスの増殖阻害に基づいて いる。対照群のウェルは、組み換えｒＦＮｒまたは培地のみで処理した。実験に 用いた細胞培養物の上清を採取して２倍希釈し、いくつのウェルが生存ＬＴＫ細 胞を含有しているかを計測することによりｖＳｖウィルスの増殖阻害能を評価し た。

１９７ｇ　）により測定した。

により報告された方法（１９７３）で取得した。

クラス！抗原を発現するかどうかを確定した。さらに、外来ＩＦＮγの添加が、 ＳＰＩまたはＣＴ２６細胞系に対して細胞増殖抑制効果を有するかどうかを決定 ０００Ｕ／ｍｌ　ｒＦＮｒ中では１７％阻害される。トランスフェクトされ、２ ５６Ｕ／ｍｌ　ｒＦＮｒ　（６Ｌ）を分泌するＳＰＩ細胞の増殖速度は、ＳＰＩ 親株細胞のものと同じである。同様に、６４Ｕ／ｍｌ　ｒＦＮｒを生産するＣＴ ２６細胞は、ＣＴ２６親株細胞と同じ増殖速度を有する。

示している。Ｈ２Ｋｋを発現するＳＰＩは６〜７％以下にととまったが、すべて ＩＡｋを発現した（データ示さず）。これと比較して、ＣＴ２６細胞は、クラス ■及りラスＩＩＭＨＣ抗体の両方を発現した（クラスＩＩのデータは示さず）。

ＳＰＩ細胞を外来ｒＦＮγで処理しても、クラスＩＩ抗原の発現は変化しないが 、抗Ｋｋ抗体については、ＦＡＣ５曲線の右側への著しい移行が即座に検出され た。

ＣＴ２６細胞において構成的に発現しているクラスＩまたはＩＩ抗原に、ＩＦＮ γ処理を行なってもなんら効果はなかった。

ついで、ＳＰＩ細胞のクラス■発現に対する、外来ＩＦＮγの効果の持続性を決 定した。これらの実験は、ｒＦＮｒの持続的な生産及びクラスＩ　〜ＩＨＣ抗原 の発現のための手段としてのｒＦＮｒによるトランスツユクシ３ンの実行の基礎 となった。ＳＰＩ細胞を、３日間１００Ｕ／ｍｌのｒＦＮｒで処理した。細胞を 洗浄し、Ｈ２Ｋｋ発現を評価するか、または再度培養した。これを、ｒＦＮｒを 培地から除去してから２４．４８．７２及び９６時間後に繰り返した。図５はｒ ＦＮｒを培地から除去してから４８時間以内にＨ２Ｋｋ発現がベースラインレベ ルに戻っていることを示している。ＴＦＮγ処理細胞をＩｎ　ｖｉｖｏに注入し た時、Ｈ２の発現が同様の減少を示すと考えるのが妥当である。

１、クラスＩ　ＭＨＣ発現におけるＩＦＮγトランスフェクンヨンの影響トラン スフェクション後、ＳＰｌ及びＣＴ２６系の両方のＩＦＮγ分泌を試験した。ｒ ＦＮｒの分泌量に基づき、３種の５Ｐｌ−ＩＦＮγ細胞集団（ＩＣ，３Ｃ及び６ Ｌ）を研究用に選択した。この結果を表３に示す。ＣＴ２６／ＩＦＮγ細胞は同 じ様にｒＦＮｒを生産したが、生産の度合いはＳＰＩ／ＩＦＮγ細胞と比較して 少なかった（２５６Ｕ／ｍｌに対して８Ｕ／ｍｌ）。興味深いことに、３種のＳ ＰＩ／ＩＦＮγ細胞系すべてにおいて、ＭＨＣクラスＩ発現が同じ様に増加した （図６、ＣＴ２６細胞に対する結果は以下に示す）。さらに、３種の系フェクト されたＳＰＩ細胞は、クラスＩ　ＭＭＣ抗原を発現しなかった。

できなかった、ＳＰ１親株細胞系は１０３細胞を皮下注射しただけで増殖した。

ス中で増殖しなかった。ｎｅｏＲ遺伝子のみによりトランスフェクトされたＳＰ １細胞は、トランスフェクトされていないＳＰＩ細胞と同様に増殖した（Ｋｅｒ ｂｅｌｅｔ　ａｌ、、　１９８７　）。

導することを示している。この応答は、ナイロンウール吸着性（ＮＷＡ）ひ臓細 異的メカニズムが６Ｌ細胞の除去に関連していることを示唆している。この見解 は、我々の実験で抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ３抗体プラス補体によって免疫 ひ臓細胞が除去された後、ひ臓細胞毒応答が減少しなかったことによって支持さ れた（データ示さず）。

６Ｌ細胞の非特異的除去特性をさらに検討するために、Ｉ　Ｘ　１０６個の６Ｌ 細胞をｌＸｌ０５（ＷのＳＰ！細胞と混合してＣＢＡマウスの左脇腹に注入した 。５週間後１０匹のうち５匹において腫瘍が形成された。ｌＸ１０４個のＳＰＩ 細胞を注入した同系ＣＢＡマウスにおいては２週間以内に腫瘍が形成された。増 殖した５つの腫瘍を採取し、組織培養を行ない２日間増殖させた後、ｇｅｎｅｔ ｉｃｉｎに暴露した。すべてのケースにおいて、培養細胞はｇｅｎｅｃｔｔｔｎ 存在下では増殖できなかったことから、これらは５００ｇｇ／ｍｌのｇｅｎｅｃ ｕｔｎに感受性を示すＳＰ１親株細胞であることが示された（６Ｌ細胞は、もと もとＩＦＮγ遺伝子との共沈殿に使用されたｎｅｏＲを有する）。ＳＰＩ細胞と 混合された６Ｌの増殖が著しく阻害されるという事実は、６Ｌ細胞に誘導された 非特異的メカニズムが、１ｎｖｆｖｏにおける増殖の阻害に、部分的には関与し ている可能性を示唆している。

この結論は、ＣＢＡマウスを６Ｌにより免疫化してもＳＰＩ親株細胞の抗原投与 に対する防御ができなかったという実験（表５）にも間接的に支持された。免疫 化された動物の５０％は、反対側の脇腹へのＩ　Ｘ　１０’個の細胞の注入に対 して防御された。しかし、免疫化された動物の１００％において、わずか５Ｘ１ ０４個のＳＰ１細胞により腫瘍が誘発された。さらに、左脇腹に６Ｌ、右脇腹に ＳＰｌを同時に注入した動物においては、６Ｌ細胞は増殖できなかつたが、ＳＰ Ｉは、ＳＰＩ細胞の増殖になんら影響を示さなかった。

４、クラスＩ　ＭＨＣ抗原発現の役割 ＩＦＮγ生産の効果はクラスＩ　ＭＨＣ発現の強化に限られるのか、または局部 的なＩＦＮγの生産は宿主に対して他の効果を有するのかを検討した。６Ｌ細胞 を６匹のヌードマウスに注入し、腫瘍を形成させた。これら腫瘍のうち２腫瘍（ ６Ｌ−Ａ及び６Ｌ−Ｂ）を採取して、再培養した。ついでこれらの細胞系につい てＩＦＮγ生産及びＲ２発現を検討した。６Ｌ−ＢはＩＦＮγを６４倍多く生産 しているにもかかわらず、６Ｌ−Ａと６Ｌ−Ｂは同レベルのＨ２Ｋｋを発現した （図７）。６Ｌ−Ａ及び６Ｌ−Ｂを６つのＣＢＡマウマウに再注入したところ、 低レベルにＩＦＮγを生産する６Ｌ−Ａ細胞は、Ｒ２に’を発現しているにもか かわらずすべての動物中で増殖した。これに対して、ＩＦＮγを高生産する６Ｌ −Ｂ細胞は増殖しなかった。

５、ＣＴ２６腫瘍 ついで、クラスＩ　ＭＨＣ抗原を構成的に発現するマウス腫瘍細胞のＩＦＮγ発 現の効果を決定した。ＣＴ２６マウス腺ガン細胞にｐＧＥＭ−５ＶＭｕ−ＩＦＮ γプラスミドをトランスフェクトしたところ、トランスフェクトされた細胞の初 期プールは８Ｕ／ｍｌのＩＦＮγを分泌した。皮下注射でｌＸ１０５、または静 脈注射でＩ　Ｘ　１０’注入した場合、ＣＴ２６／ＩＦＮγ細胞は最終的には増 殖したが、その速度はＣＴ２６親株細胞と比較して非常に遅かった。

ＣＴ２６／ＩＰ’Ｎγ細胞がｉｎ　ｖｉｖｏで増殖できないことは、それらがＩ ＦＮγを生産することに直接関与しており、　ｉｎ　ｖｌｔｒｏにおいて８Ｕ／ ｍｌのＩＦＮγがＣＴ２６の増殖に影響を与えないことからｆＦＮγが細胞変性 に直接影響することによるという説明はできない。ＣＴ２６／ＩＦＮγは、ｉｎ 　ｖｉｖｏにおいて増殖が抑制され、それと同時に、免疫化されたマウスのひ１ 中で検出される細胞毒性応答を誘導した（データ示さず）。ＣＴ２６親株細胞は 検出可能な細胞毒性応答を示さない。

例ＩＩＩ 以下の例は、本発明の他の態様、すなわち望ましい場合に選択的に破壊される免 疫抗原性腫瘍細胞の作製、について記述している。本発明のこの態様においては 、細胞は、望ましいポリペプチド（例えば免疫強化ポリペプチド）をコードする 選択された遺伝子と、宿生細胞を破壊（死滅）することができるポリペプチドを コードする第二の遺伝子によりトランスフェクトされる。″破壊遺伝子°または “致死遺伝子“と呼ばれる第二の遺伝子は、非常に誘導性の高いプロモータによ り制御されていることが望ましい。このように、トランスフェクトされた細胞の 一部またはすべてを宿主細胞から除去することが望まれた時点で（例えば、トラ ンスフェクトされた腫瘍細胞の投与から約１４日後）、誘導可能なプロモータを 直接的または間接的に活性化して致死ポリペプチドの合成を刺激することにより （例えば、ポリペプチドの転写を開始するのに十分な量の誘導物質を宿主に投与 する）、このような除去を開始することができる。この態様に特異的な例を以下 に記述する。

Ａ、免疫強化ポリペプチドをコードする遺伝子の選択及びトランスフェクション 所定の状況における使用に最も有利な免疫強化遺伝子の選択は、例えば腫瘍の型 、局在、及び患者の免疫特性などを含む、いくつかのパラメータに依存する。

このようなポリペプチドをコードする遺伝子は、現在入手可能であるか、または 伜ｊえばＳａｍｂｒｏｏｋらによる１４ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ垂窒奄■ ｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９　（本発明の参考文献に挙げられ ている）において記載されている技術のような現在の分子生物学的技術を用いて 取得することができる。一般に、標的細胞型のトランスフェクションは、基本的 には上述の例Ｉに記載の方法に従って行なった。以下にさらに詳細に記載した例 においては、トランスフェクションのために選択された遺伝子は、免疫強化ポリ ペプチド、ＩＬ−２、インターフェロン　ガンマ、及びインフルエンザ凝集素を コードしている。

Ｂ、特異的に誘導される致死遺伝子システムの選択及びトランスフェクション】 、適切なプロモータの選択 本発明に関連して、恐らく、例えば、サイトメガロウィルス、Ｓ　Ｖ４０．また はアクチンなどのようなプロモータを使用することができるが、ここでは好適な 実施例として、インターフェロン誘導性６−１６ブロモータを選択した。正常な 血液中のＪＦＮレベルは非常に低いため、このプロモータを使用にはいくつかの 利点がある。このため、ＩＦＮの注入は、非常に高い特異性でこの遺伝子に働く 。

ヒトの、ＩＦＮに制御された遺伝子６−１６は、ＩＦＮα／βに強く制御される 。６−１６の０．９Ｋｂ　ｃＤＮＡは、アミノ末端にシグナル配列を有する１３ キロダルトンの蛋白質をコードしている；しかじ、その機能及び細胞内における 局在（分泌型または膜結合型）は不明である（Ｋｅｌｌｙ、　ｉ９ｇｅ　）。未 処理細胞においては、細胞質においても、核においても６−１６ｍＲ，ＮＡは検 出されない。

６−１６ｍＲ，ＮＡの合成は、インターフェロン　アルファ処理の後５分で検出 される；核における合成は３時間でピークに達し、８〜１２時間後に元のレベル まで低下する（Ｆｒｆｅｄｍａｎ、　１９１１４．　Ｋｅｌｌｙ、　１９８６　 ）　、しかし、６−１６ｍＲＮＡは、転写後制御を受け、核における合成終了後 １２時間経過しても細胞質内でその存在が検出された（Ｆｒｆｅｄｓａｎ、　１ ９８４）　ｏ　６−１６プロモータの強いｉＭ御は、６−１６ブロモータに選択 マーカー遺伝子を連結することによりＩＦＮ抵抗性変異株を取得する手段きして 使用した（また、これにより低レベルの非制御発現の戻し選択を行なうこともで きる）　（Ｐｅｌｌｅｇｒｆｎｔ、　１９８９）。

６−１６のプロモータ領域（Ｐｏｒｔｅｒ、　１９８１１）　、ｃｉｓ−ａｃｔ ｉｎｇ　Ｉ　Ｆ　Ｎ制御配列及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ因子（これにより相 互作用を起こす）をクローニングし、５゛プリージヨン解析、トランスフェクシ ョン実験、ＤＮａｓｅフットプリンティング、ゲル分離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写 、及びプロモータのレボータ遺伝子への連結によりこれらの部分の特定を行なっ た（Ｄａｔｅ、　１９８９．　Ｐｏｒｔｅｒ、　１９８ｇ）、（Ｃｂｅｒｎａｊ ｏｖｓｋｙ、１９８９）。

６−１６ブロモータは、ＩＦＮ制御配列を含む４０塩基のダイレクトリピート（ −１６８〜−８９）を有し、これによりＩＦＮが異種プロモータにより誘導され ることが確認された（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、　１９８９．　Ｐｏｒｔｅｒ 、　１９８ｇ）　０この領域は、分子Ｒ５５キロダルトンの核蛋白質を結合して おり、ｉｎ　ｖｆｔｒｏにおいて、ｒＦＮの制御を受けるＤＮＡ−蛋白質複合体 を形成することができる（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、　１９９０）。

−４５０に位置する他のＣＣ１５−ａｃｔｉｎ因子は、８０キロダルトンの核蛋 白質と構成的に結合しており、ダイレクトリピートと結合することによりこのブ ロモータの制御発現を低下するよう作用する。この因子自体はいかなる転写機能 も示さないものと思われる。

さらに、６−１６のプロモータは、プロモータの非コード鎖に位置するＣＣＡＡ Ｔボックス及びＴＡＴＡボックスを有する（Ｐｏｒｔｅｒ、　１９１１１１）　 （（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、　１９８９）　（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、 　１９９０）。

２、致死遺伝子の選択 本発明に使用できる致死遺伝子には、細胞内代謝を阻害または停止する（特にＤ ＮＡ合成、転写及び複製のような重要な細胞機能の阻害、または他の必要な細胞 機能の停止につながるもの）［々の蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。本発 明の例において有用と思われる致死遺伝子の例として、レシン　ベータ鎖、百日 咳前などをコードする遺伝子がある。以下に記述するとおり、ある特定の致死遺 伝子の選択は、その遺伝子が導入される細胞の生理学的特性に制限されることが 多い。

増殖の速い腫瘍または細胞に対しては、ＤＮＡ合成を特異的に阻害する媒体が有 効である。しかし、例えば増殖速度が遅く、活発に増殖しない腫瘍などに対して は、このようなりＮＡインヒビタはあまり有効ではない。このような場合は、例 えば蛋白質の翻訳のような、細胞の他の機能を特異的に阻害する媒体がより適し ている。このような細胞型のそれぞれに適した致死遺伝子システムの例を以下に 記述する。

ＤＮＡ合成阻害に対しては、単純庖疹ウィルス由来の酵素、チミジンキナーゼを コードする遺伝子が好ましい。この酵素はチミジンアナログのｇａｎｃｙｃｌｏ ｖｉｒ（ＧＡＮＣ）　（１−（−ｄｅｏｘｙ−２−ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｄ−ａｒ ａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ　）−５−ｅｔｈｙｌｕｒａｃｙｌj、 をリン酸化し、この物質はその後細胞細胞キナーゼによって５″三リン酸に変換 されＤＮＡポリメラーゼを阻害する（Ｍａｎｓｏｕｒ、　Ｉ９Ｈ，Ｍａｎｓｕｒ ｉ、　１９８７）　、　Ｈ５Ｖ−ｔｋ及び細胞内ｔｋ酵素を発現する細胞に対す るＧＡＮＣの選択的効果は、Ｈ９Ｖ−ｔｋ蛋白質の基質要求性が、細胞内ｔｋの 基質要求性よりも緩いという事実に基づいている。このため、Ｉ（ＳＶ−ｔｋを 発現する細胞はＧＡＮＣの毒性効果に対して感受性がある；正常細胞は抵抗性が ある。

蛋白質合成阻害に対しては、ジフテリア毒（Ｄ　Ｔ　−Ａ）のα鎖をコードする 遺伝子が好ましい。ＤＴ−Ａ　ＡＤｐ−ｒｔｂｏｓｙ＋ａｔｅｓ　ｅｌｏｎｇａ ｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２は蛋白質合成を阻害し、細胞を死亡させる。この遺 伝子は、エラスターゼ！遺伝子のエンハンサ／プロモータに連結した時、トラン スジェニックマウス中ですい臓細葉細胞を特異的に破壊するのに効果的である（ Ｐａｌ＊ｆｔｅｒ、　１９８７）。

３、選択的に誘導可能な致死遺伝子構築物の構築以下の予言的な例は、本発明に 関連して選択された細胞のトランスフェクションに適した遺伝子構築物の構築に ついて記述している。

ａ、６−１６プロモータにより制御される単純庖疹ウィルスｔｋ遺伝子の構築プ ラスミドｐＡＧｏ由来の、ｋ遺伝子のコーディング配列及びポリアゾニレ−ジョ ンシグナルの全領域（５７塩基からなる５゛非翻訳領域を含む）を含有するＢｇ ｌｌｌ−ＰｖｕＩＩ　（１７７５ｂｐ）断片を単離し、塩基−４までの全プロモ ータ領域を制御する６−１６プロモータを有するＸｈｏ［−Ｈｐａｌ　！　（２ ゜３Ｋｂ）断片と共にクローニングした。クローニングは３つの工程により行な った。まず、Ｈ５Ｖ　ｔｋのＢｇｌｌｌ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＵｃ１８のＢａｍ Ｈｌ−５ｍａ　Ｉ部位にサブクローニングし、プラスミドＴＫ　ｐｒを作製した 。Ｓｍａｌ及びＥｃｏＲＩを用いて消化し、３６０及び４Ｋｂの二つの断片が得 られることを確認した。

ついで、６−１６プロモータのＸｈｏｌ（その上流にｐＵｃ１８のＨｉｎｄｌｌ Ｉから５ａｌｔまでのポリリンカ一部位を有する）−Ｈｐａ　Ｉ　Ｉ断片をｐＵ Ｃ１８のＡｃｃｌ−ＨｉｎｄｌｌＩ部位にサブクローニングして、プラスミド６ −１６−Ｘｈｏ　Ｉ−Ｈｐａ　Ｉ　Ｉを作製した。最後に、プラスミド６−ｌ６ −Ｘｈ。

Ｉ−ＨｐａｌｌからＨｉｎｄｌｌｌ−Ｘｂａｌ断片（２，３Ｋｂ）を単離し、Ｔ Ｋ　ｐｒのＸｂａＩ−Ｈｔｎｄｌｌ１部位に挿入してプラスミド６−１６ＴＫを 作製することにより６−１６のプロモータをｔｋ遺伝子の上流にクローニングし た。このプラスミドにおいては、ｔｋ遺伝子は６−１６プロモータの制御を受け る。

ｂ、６−１６プロモータにより制御されるジフテリア毒α遺伝子の構築６−１６ プロモータにより制御されるＤＴ−Ａ遺伝子の作製にも６−１６ＴＫのクローニ ングと同様の方法を用いた。まず、プラスミドｐ　Ｄ　Ｔ　−Ａ　（ｔｌｎｊｖ ｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏ１ｏｒａｄｏのＤｒ、　１．Ｍａｘｖｅｌｌの好意に より提供された）から７９５ｂｐのＢｇ１１１断片（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ ｌＩに挟まれている）をサブクローニングした。ｐＤＴ−Ａはジフテリアαの全 コーディング配列を有する。毒性ポリペプチドは、α鎖（２４キロダルトン）及 びβ鎖（３８キロダルトン）の両方を有するポリ蛋白質であるため（Ｍａｘｗｅ ｌｌ、　１９８７．　Ｌｅｏｎｇ、　１９８３）　、α鎖のみを発現するよう以 下のとおりＤＮＡを改変した。

イニシエータメチオニンコドンを、ＧＴＧからＡＴＧに置換し、最初の２アミノ 酸をＡｓｐ−Ｐｒｏに改変した。さらに、ＤＮＡのカルボキシ末端に、Ｓ■ａｌ ｌＳＶ４０　を抗原由来の合成５ｅｒ−Ｌｅｕ−終始コトンとスプライスシグナ ル（ポリアゾニレ−ジョンシグナルは含まない）を含むようにした（Ｍａｘｗｅ ｌｌ、　１９８６、　Ｐａｌ＋＋Ｉｔｅｒ、　１９１１７　）。

ＤＴ−Ａ挿入物をクローニングするために、ＤＴ−ＡをＨｉｎｄｌｌＩで消化し 、ついでＳＶ４０の９４０ｂｐ　Ｈｔｎｄｌ［Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片（Ｔ抗原のポ リアゾニレ−ジョン配列を有する）に連結した。挿入物をＥｃｏＲＩで再度消化 した。その結果、挿入物は両端にＥｃｏＲ１部位を有し、ＤＴ−Ａ断片はその３ ゛にポリアゾニレ−ジョンシグナルを含むことになる。この１．７Ｋｂ断片を６ −１６プロモータブラスミドのＥｃｏＲ１部位にクローニングした。

挿入の方向性はＢｇｌｌｌで消化することにより確認した。６−１６ブロモータ 中の−６０３、及びＤＴ−Ａ　７９５ｂｌ）断片の両端に各１個の計３個のＢｇ Ｉ１１部位がある。正しい方向で挿入されている場合、Ｂｇｌｌｌ消化物は、６ −１６プロモータの６００断片、ＤＴ−Ａの７９５断片、及び残りのプラスミド となる。逆向きの場合は、消化断片は、７９５　（ＤＴ−Ａ断片）及び１．　５ Ｋｂ（９４０ｂｐのＳＶ４０　３−及びポリアゾニレ−ジョン配列、及び６０３ ｂｐの６−１６プロモータ、及び残りのプラスミドを含む）となる。

４、選択された遺伝子の標的細胞への導入選択された免疫強化及び致死遺伝子は 、当業者に既知のいかなる方法で細胞に導入されてもよい。しかし好適な実施例 においては、細胞へのトランスフェクションにはリン酸カルシウム共沈殿法（Ｇ ｒａｈａｓ、　１９７３）　、リポフエクションまたはエレクトロポレーション を用いた。選択された免疫強化遺伝子（例えばＨＡまたはサイトカイン）により トランスフェクトされた細胞は、次に致死遺伝子によりトランスフェクトされる 。または、逆に、最初に致死遺伝子構築物をトランスフェクトしてもよい。致死 遺伝子構築物は、致死遺伝子に加えて、トランスフェクト細胞を検出及び選択す るための適当なマーカー及び選択遺伝子を含むことが好ましい。これらの中でも 細菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むマーカープラスミドｐＨＣ１１０（ Ｈａｌｌ、　１９８３）　、及び選択マーカーｐｓＶ２ｈｙｇｒ。

（Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒ、　１９８４　）が好ましい。分子比１５：１５：１ で、細胞にこれらのマーカーをトランスフェクトし、４００μｇ／ｍｌのｈｙｇ ｒｏｓｙｃｉｎ　Ｂ中で選択したＯさらに、選択されたクローンは、ｇａｎｃｙ ｃ＋ｏｖｔｒまたはＩＦＮに感受性を示し、Ｘ−ｇａ　ｌで発色する（Ｐｒｉｃ ｅ、　１９８７．　Ｔｈｏｓｐｓｏｎ、　１９１ｉ９　）。

５、前臨床的研究 ジフテリア毒とｇａｎｃｙｃ＋ｏｖｔｒの毒性の分子メカニズムは異なるため、 異なる細胞型において細胞毒応答を得るのに必要なｇａｎｃｙｃ＋ｏｖｔｒまた はＩＦＮ濃度を決定するために、数種の異なる活性測定法を行なう必要があると 思われる。以下に記述する生物活性測定法を行なった。

１コピーのＨ８Ｖ　ｔｋ遺伝子を含むマウス胚幹部（ｓｔｅ謬）細胞のブレーテ ィング効率に影響する（９０％以上）ことが知られているｇａｎｃｙｃｌｏｖｉ ｒ濃度は１０−６〜５Ｘ１０’Ｍである。Ｈ３Ｖ−ｔｋによりトランスフェクト された腫瘍細胞の９０％以上を死滅させるのに必要なｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ　 ８度は、ブレーティング効率活性測定、及び［３Ｈ］チミジンの取り込み活性測 定により決定することができる。ブレーティング効率活性測定は、段々に濃度を 上げたｇａｎｃｙｃ　Ｉ　ｏｖ　ｉ　ｒと共に１θ　個の細胞を１０ｃｍ２プレ ートにブレーティングすることにより行なった。

３日毎に培地を取換え、新たなｇａｒ＋ｃｙｃ＋ｏｖｉｒを添加した。９日後、 細胞をＧｔｅ麿Ｓａにより染色し、各プレートにつき数個のコロニーについて検 討を行なった。［３Ｈ］チミジンの取り込み活性測定は、ＨＳＶ−ｔｋ腫瘍細胞 を用いて、生体液について行なった以下の実験と同様の方法で行なった。

ＧＡＮＣのＤＮＡへの取り込みは、細胞外及び細胞内Ｈ３Ｖ　ｔｋ酵素濃度の両 方に依存すると思われる。ＩＦＮの添加によりｔｋ高生産が誘導された細胞は、 ＧＡＮＣに対する感受性が増加している。この相乗作用は、これら細胞毒媒体の 両方の濃度を増加させていく実験（この時片方の濃度は一定にしておく）により 検討された。毒性の増加は、［３Ｈ］チミジンの取り込み活性測定とブレーティ ング効率活性測定の両方により評価した。

Ｃ１生体液中のｇａｎｃｙｃｌｏｖ［ｒ　４１度の決定血清などのような生物試 料中のｇａｎｃｙｃ＋ｏｖｔｒ濃度を迅速に検討するために、ＨＳＶ　ｔｋ遺伝 子によりトランスフェクトされ、ＨＡＴ培地中で選択されたＬＴＫ細胞を用いて ［３Ｈコチミジンの取り込み活性測定を行なった。活性測定は、チミジン合成酵 素によるｄＵＭＰからのｄＴＭＰの合成を阻害するが、ＨＧＰＲＴプリンサルベ ージ経路を経由してＡＭＰ及びＧＭＰを合成することができるよう、アミノプテ リン（１，８ｎ、ｇ／ｍｌ）及びヒポキサンチン（１，３６ｎｇ／ｍｌ）存在下 で行なった。このような条件下では、［３Ｈ］チミジンの取り込みは、リン酸化 され、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する三リン酸派生物へとプロセシングされた後 のｇａｎｃｙｃｌｏｖｉ　ｒによるＤＮＡ合成阻害の量に主に依存し、［３Ｈ］ チミジンの取り込みは内因性のＵ　Ｍ　Ｐ　／　Ｔ　Ｍ　Ｐブールには依存しな い。細胞はｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒに対して極度に感受性が高いため、これらの 細胞が、内因性の晒乳類ｔｋ遺伝子を含んでいないという事実は非常に有用性が 高い。

ＤＮＡ合成の活性測定は以下の通り行なった。細胞を、９６穴マイクロプレート に、各ウェルにつき１５〜２５Ｘ１０３細胞ずつ接種した。細胞を３連で、ヒポ キサンチンとアミノプテリン存在下で、既知１度のｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒを添 加するか、または添加せずに培養した。２４〜２８時間後、細胞を［３Ｈ］チミ ジン　９１５　ｍｃｉ／ｍｌ；２５　Ｃｆ／ｍｌ　；Ｉ　Ｃｉ＋３７　ＧＢｑ； 　（Ａ＊ｅｒｓｈａｍ）により１時間標識した。ついで、細胞をリン酸緩衝生理 食塩水により２回洗浄し、５％トリクロロ酢酸により４℃で３０分間処理し、５ ％トリクロロ酢酸を用いて３回洗浄した。沈殿物を０．１ｍｌの０．２Ｍ　Ｎａ ＯＨに３７℃で３０分間溶解し、Ｏ，０１ｍ１の２Ｍ　ＣＨＩで中和した：放射 活性はβ−シンチレーシ３ンカウウソを用いて決定した。生物試料由来のｇａｎ ｃｙｃｌｏｖｉｒ　１４度は、試料の２倍希釈液中で検出することができ、標準 物質の阻害曲線と比較することにより阻害の程度をめた。

９０％以上の細胞毒性を発生させるのに必要なＩＦＮの用量と、暴露時間を検討 するために、高感度の比色定量法を用いて、６−１６　ＤＴ−Ａプラスミドによ りトランスフェクトされた細胞における蛋白質の合成阻害を測定した。

６−１６　ＤＴ−Ａプラスミド、ｐＳＶ２ｎｅｏ　（Ｇ４１８中における選択用 ）、及びｐｃＨｌｌｏ　（、初期ＳＶ４０プロモータの制御を受けている、細菌 由来のβ−ガラクトシダーゼ酵素を含有する）によりトランスフェクトされた腫 瘍細胞を０４１８中で培養することにより選択した。抵抗性を示す細胞クローン を単離し、サザンブロツティングにより、すべてのプラスミドが存在することを 確認した。選択されたクローンは、ＩＦＮにより死滅し、検出可能なレベルのβ −ガラクトシダーゼ活性を有する。

ジフテリア毒の活性化に起因する蛋白質合成の阻害により、β−ガラクトシダー ゼ量が減少するが、これは、基質ｐＮＰＧ　（ｐ−ｎｉけｃ）ｐｈｅｎｙｌ−β −Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｅ　）を用いた比色定量法により検出す ることができる。この、β−ガラクトシダーゼ基質は、β−ガラクトシダーゼに より分解されると黄色く発色し、この黄色い生成物の蓄積は、ＥＩＩＳａプレー ト中で２２０ｎｍの波長により測定することができる。この酵素的システムはｔ ｏ　ｖｌｖｏにおいても有用である。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する細 胞の存在は、基質Ｘ−ｇａｌ（分解すると、細胞中に青い沈殿物を生成する）を 用いることにより、組織学的試料中で目で確認することができる。このため、こ の定量法により、ＩＦＮ処理の後、動物組織中に致死遺伝子構築物を有する腫瘍 細胞が存在するかどうかをその場（組織中）で決定することができる。

６、　！ｎ　ｖｉｖｏ実験 以下の予言的な例では、種々のマウス腫瘍モデルにおける本発明の応用を記述し ている。

ＣＴ２６細胞を、免疫強化遺伝子及び／または致死遺伝子存在下、または非存在 下で同系ＢＡＬＢ／ｃ動物に注入する。同様に、ＳＰＩ及び以下に記述するＲＥ ＮＣＡ細胞を、それらの同系宿主であるＣＢＡ及びＢＡＬＢ／Ｃマウスにそれぞ れ注入する。致死遺伝子を発現する細胞の免疫抗原性を評価するために、１×１ ０〜１０７個の細胞を、動物の右脇腹に注入し、同時にトランスフェクトされて いない親株細胞を左脇腹に注入する。動物の５０％を死亡させるのに必要な腫瘍 細胞の数を、Ｒｅｅｄ　ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈの方法ＣＲｅｅｄ、　１９３ｇ） により、既に報告されている通りに行なった（Ｆｅａｒｏｎ、　１９１１１り。

Ｈ４Ａ細胞系は、桶乳類腺ガンにインフルエンザウィルス凝集素（ＨＡ）遺伝子 をトランスフェクトすることにより作製した。ＨＡを発現する細胞を、既に報告 されている通り、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　 Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣ３）　（Ｆｅａｒｏｎ、　ｅｔａｌ、、　１９８９）を 用いて４回選択し、Ｈ４Ａ細胞系を取得した。Ｈ４Ａは、同系宿主中で、Ｉ　Ｘ 　１０’用量の抗原投与に対して増殖することができないが、１×１０５　Ｈ４ Ａ細胞を皮下注射した場合、増殖することができる。細胞が増殖するにもかかわ らず、動物は細胞毒性Ｔ細胞応答を示すが、この応答は不十分であるか、または 腫瘍の増殖を相殺するには遅すぎる。

ＣＢＡマウスにＨ４Ａまたは、ＨＳＶ−ｔｋまたはＤＴＡのいずれかでトランス フェクトされたＨ４Ａを注射する。その結果生じる腫瘍が異なる大きさく２〜４ ｍｍ、６〜８ｍｍ、１ｍｍまたは２ｍｍ）になった時、すべての動物を以下のよ うに処理することにより、注入された細胞を殺す。

Ｈ４Ａ　ＧＡＮＣ Ｈ４Ａ　ＩＦＮ−α Ｈ４Ａ　ＧＡＮＣ＋ＩＦＮ−α Ｈ４Ａ−ＨＳＶ　ｔｋ　なし Ｈ４Ａ−ＨＳＶ　ｔｋ　ＧＡＮＣ Ｈ４Ａ−ＨＳＶ　ｔｋ　ＩＦＮ−α Ｈ４Ａ−ＨＳＶ　ｔｋ、　ＧＡＮＣ＋ＩＦＮ−αＨ４Ａ−ＤＴＡ　なし Ｈ４Ａ−ＤＴＡ　ＧＡＮＣ Ｈ４Ａ−ＤＴＡ　Ｉ　ＦＮ−α Ｈ４Ａ−ＤＴＡ　ＧＡＮＣ＋ＩＦＮ−αＩ　Ｆ　Ｎ　−ａ　（Ｈｏｆｆ纜ａｎ− ＬａＲｏｃｈｅ、　Ｎｕｔｌｅｙ　Ｎ、Ｊ、）の初期用量は、連続した２週間に おいて週に３回、５Ｘ１０’ユニツト／皮下注射を与えることとする。ＧＡＮＣ （Ｓｙｎｔｅｘ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　）は、当初、２０ｍｇ／ｋｇ ／日を皮下注射で投与する。

ついで、初期腫瘍が除去された動物について：ａ）ひ臓の細胞毒性Ｔ細胞応答を 検討する：ｂ）Ｉ×１０４．１×１０５、または５×１０５の親株細胞による抗 原投与を行ない、親株腫瘍の抗原投与に対する免疫性を検出する。

ｂ、ＣＴ２６／ＩＦＮγ ＣＴ２６マウス結腸ガンにＩＦＮγをトランスフェクトし、ＩＦＮγを発現差せ ると、部分的に免疫抗原性を示す。用量１×１０５個のＣＴ２６細胞の抗原投与 により、正常動物は３週間以内に死亡する；しかし、ＣＴ２６／ＩＦＮγ細胞を 注入した動物の６０％は、８週以上生存する。これらの細胞は免疫抗原性を有す ると思われるが、これらが生じる応答は、腫瘍の増殖を阻害するには不十分であ ることがある。さらに、活性型ＣＴ２６／ＩＦＮγにより免疫された動物は、親 株ＣＴ２６の抗原投与に対して防御されない。さらに、放射線照射されたＣＴ２ ６／ＩＦＮγ細胞も、親株細胞の抗原投与に対して防御されない。

ｃ、ＲＥＮＣＡモデル ＲＥＮＣＡは、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腎細胞ガンである。同系マウス の副腎に５Ｘ１０’　ＲＥＮＣＡ細胞を注入すると、２週間でａｕｌｃｍの腫瘍 が形成する。

腫瘍を存する腎臓を外科手術により除去すると、すべての動物において２週間以 内に肺への広範囲な転移が起きる。

Ｃ，ヒトの免疫療法 ヒトの治療には必要な制限があるため、本発明は、ヒト患者にはまだ試験してい ない。しかし、例えば、結腸、乳房、卵巣、黒色腫、及び肉腫のような選択され た腫瘍を有するヒトにおける本発明の使用はよく検討する余地がある。一般に、 本発明は、個別の初期腫瘍を除去されているが、再発の危険性が高い患者の治療 に選択されることが好ましい。通常の状況では、患者からの腫瘍細胞は単離され 、適切な免疫強化遺伝子及び致死遺伝子によりトランスフェクトされる。もちろ ん、免疫強化遺伝子が、インターロイキン−２のようなサイトカインである場合 、ヒトのサイトカインをコードする遺伝子を使用することが望ましい。トランス フェクションの後、細胞を選択し、選択された遺伝子により適切にトランスフェ クトされている細胞系を取得する。

腫瘍細胞抗原の投与に先立ち、外科手術による切除、放射線照射などの、腫瘍を 軽減する処置が施されていることが理想的である。ついで、選択された期間（通 常、約２週間）、宿主を細胞により免疫化する。この期間中、懸案となっている 特定の腫瘍に対する患者の免疫状況を評価するために適切なアッセイを行なう。

免疫化が局部的である場合、すべての症例で全身的な免疫性が観察されるとは限 らないことは認識されるべきであり、そのため、このような研究のためには、腫 瘍部位からリンパ球を取得する必要がある。いかなる場合においても、宿主がそ の腫瘍細胞に対して効果的に免疫化される所定の期間経過後、残存している免疫 化用腫瘍細胞は、致死遺伝子により除去される。使用される、選択的に誘導可能 なプロモータがここに記述した６−１６ブロモータである場合、致死遺伝子の転 写開始には十分であるが、患者に対して急性毒性を示すほど高くない用量のアル ファインターフェロンを患者に投与する。アルファインターフェロンは、ワクチ ンを導入した部位に局部的に投与することもできる。単純庖疹チミジンキナーゼ 遺伝子が使用される場合、ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒの投与が必要である。チミジ ンキナーゼ遺伝子が６−１６ブロモータにより制御されている場合、ｇａｎｃｙ ｃ＋ｏｖｔｒ及びインターフェロンアルファの両方の投与が保証される。これら の投与のそれぞれについての絶対的なパラメータは現在までに確認されていない が、ここに提供されたことを助けとして当業者により容易に確認されるであろう 。

＊＊＊＊＊＊＊亭＊ 前述の本発明の説明は、特許事情の都合上、また説明及び解説を目的とするため に、特定の実施例に関している。しかし、本発明の範囲と精神に反することなく 多くの改変及び変更を行なうことができることは当業者に明白である。

例えば、外来遺伝子を標的細胞に導入するのに多くの方法を使用することができ る。さらに、本発明に関連して、種々の選択された遺伝子をトランスフェクショ ンに使用できる。例えば、選択的に誘導可能な致死遺伝子の調製のような、本発 明の特定の態様は、免疫療法に限らず、ｉｎ　ｖＩｖｏにおいて、遺伝子組み換 え細胞を特異的に破壊したい場合に広範囲に応用することができる。さらに、本 発明によるトランスフェクトされた細胞系は、ｅＸ　ｖｉｖｏにおける免疫化に も有用である。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇにより発行された米国特許第４，６ ９０．９１５号に記載の方法による、患者への注入のためのＬＡＫ細胞の活性化 、または、細胞毒性を示すＴリンパ球のｉｎ　ｖｊｔｒｏでの活性化や、！Ｌ− ２依存性細胞系などのサイトカイン依存性細胞系の増殖促進などである。単に、 致死遺伝子の転写及び翻訳を誘導するだけで、トランスフェクトされた細胞のＩ ｎ　ｖｉｔｒｏ培養物を一掃することができることは、さらなる有用性がある。

このため、技術の範囲内で適切に変更を行なうことにより、利用することができ ることは明白である。以下の特許請求の範囲において、本発明の真の精神及び範 囲の中でこのようなすべての同様な改変及び変更を網羅することは、出願人の望 むところである。

参考文献 以下の参考文献は、本発明の特定の態様を理解または実行する上で助けになるで あろう。このリストに含まれる参考文献は、本発明に関連する従来の技術を代表 するものではない。

Ｂａｔｔａｃｈａｒｙａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、１ｓｓｕｎｏ１．１２７：２４ ８８−２４９５゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９１１２）。

Ｊａｎｋｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｔ、　ＵＳＡ１１４：５４０９−５４１３　（１９１１７ａj。

Ｋａｒａｓｕｙａｓａ　ａｎｄ　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｉｍｕｎｏ ｌ、１８：９７−１０４　（１９１ｉ８）。

Ｗｊｌｌｊａｇｓｂｕｒｇ、　ＶＬ　Ｎｏｖ、　９−１１，１９８７；　２８１ １＋３２３−３３８　（１９８９）。

Ｍｕｒｐｈｙ　ａｎｄ　Ｈａｕｓｈｅｓｋｙ、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｉｎ５ｔ、　５０：１Ｏ１３−１０２５（１９７３）。

Ｐａ１ｓｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５０：４３５−４４３　（１９ １１７）。

Ｐｅｌｌｅｇｒｌｎｉ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｆｏ＋、　９ （ＩＩ）：４８０５−１２　（１９Ｈ）。

Ｐｈｆｌｌｌｐｓ　ａｎｄ　Ｌａｎｆｅｒ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６ ４：１１１４−８２５　（１９８６）。

Ｐｏｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｍｂｏ　Ｊ、　７（１）：８５−９２　（１ ９ｇ！１）。

Ｐｒ１ｃｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ Ａ　８４：１５６−１６０　（１９８７）。

Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｉｕｕｎｏｌ。　１２５：２６８５− ２８７２　（１’１８０）。

５ｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｆｎ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ 　７：９７−１０５　（１９８９）。

５ｔｔｋｏｖｓｋｙ　ａｎｄ　Ｐａｕｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３２２：３０６　（１ ９１１ｇ）。

Ｔｅｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　５７：５０３−５１２　（１９８９ ）。

Ｔｈｏ層ｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、Ｃｅ１ｌ　５６：９１７−３１０　（１９８ ９）。

Ｖａｎ　Ｐｅｌ　ａｎｄ　Ｂｏｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　１ｊｓＡ　７９：４７Ｌｇ−４７２２（１９１１Q）。

ｖａｎ　Ｂｏａｅｈｓｅｒ　ａｎｄ　Ｈａａｓ、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、 　１５０：１１３４−１１４２　（１９７９）。

Ｗａｌｌｆｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５−３０１−３０５　（ １９８５）。

ｖｉｄｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６６：１４４７ −１４５５　（１９１１７）。

Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１ ．　［ＩＳＡ　７６：１３７３−１３７６　（１９７９）。

Ｖ［Ｉｔｒｏｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ ｔｌｔ、　８１：１８３　（１９７ｇ）。

Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４７ ：８９７−９１１　（１９７１１）。

１厘（１２ ＦＩＧ、３ 左脇腹への注入後の退散 ＦＩＧ、４Ａ　ＦＩＧ、４１３ ＦＩＧ、＋［：　ＦＩＧ、’ｌ）［） 蛍光強度（ｌ　ｏ　ｇ）　蛍光強度（ｌｏｇ）ＦＩＧ、５Ａ　ＦＩＧ、５［３ 蛍光強度（ｌｏｇ）　蛍光強度（ｌｏｇ）ＦＩＧ、５Ｅ　ＦＩＧ、５Ｆ 蛍光強度（ｌｏｇ）　蛍光強度（ｌｏｇ）ＦＩＧ、ｆ５Ａ　ＦＩＧ、ｆ）ＥＩ Ｆ■Ｇ、ｆ＋［ＦＩＧ、ｆ）［） Ｆ■〔，７Ａ Ｆ■Ｇ、７［３ 国際調査報告 ｍｓｒｏｍ＋。＋＋ｓｌ　Ａ＊ｍ＋５ｖ−Ｎ。…５１１．。、弧、１゜Ｆ＋ｙｍ 　ＰＣＴ／ｌシｌ／Ｈａ　ｌｔｕｐｐｉｗ＋ｗｏｌ　ｍ　（ｉｌｌ　、ｐｓｔ＋ ｎｔ　Ｍフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ ／／Ａ６１に３７１０２　ＡＤＵ　８３１４−４Ｃ３７／６６　ＡＢＤ　Ｚ　８ ３１４−４ＣＣ１２Ｎ　１５／１９ （７２）発明者　ポゲルステイン　バートアメリカ合衆国　メリーランド州　バ ルチモア　ブレトンウェイ　３７００ （７２）発明者　チェルナジョフスキー　ユチ英国　ロンドン　ロウスレイアベ ニュー１４ニー Ｉ （７２）発明者　フィーロン　エリツク　アールアメリカ合衆国　メリーランド 州　バルチモア　＃９０４　ノースチャールズストリート　３７００ （７２）発明者　パードール　ドリューアメリカ合衆国　メリーランド州　バル チモア　ローランドスプリングストライブ

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫増強ポリペプチドをコードする第一の外来遺伝子と、プロモータの誘導 により細胞を死滅させることができるポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的 に連結したプロモータ含む第二の外来遺伝子を有する細胞に由来する、腫瘍に対 する免疫応答性を強化するための組成物。
2. ２．前記プロモータが、選択的に誘導可能なプロモータであることを特徴とする 請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記プロモータが、６−１６インターフェロン誘導性プロモータであること を特徴とする請求項２に記載の組成物。
4. ４．前記第二の外来遺伝子が、ジフテリア毒のアルファ鎖をコードする遺伝子に 機能的に連結する選択的に誘導可能なプロモータを含むことを特徴とする請求項 ２または請求項３に記載の組成物。
5. ５．前記第二の外来遺伝子が、単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼをコードする 遺伝子に機能的に連結する選択的に誘導可能なプロモータを含むことを特徴とす る請求項２または請求項３に記載の組成物。
6. ６．前記免疫強化性ポリペプチドが、サイトカインであることを特徴とする請求 項１、請求項２または請求項３に記載の組成物。
7. ７．前記免疫強化性ポリペプチドがインターロイキン−であることを特徴とする 請求項６に記載の組成物。
8. ８．前記インターロイキンがインターロイキン−１であることを特徴とする請求 項７に記載の組成物。
9. ９．前記インターロイキンがインターロイキン−２であることを特徴とする請求 項７に記載の組成物。
10. １０．前記インターロイキンがインターロイキン−３であることを特徴とする請 求項７に記載の組成物。
11. １１．前記インターロイキンがインターロイキン−４であることを特徴とする請 求項７に記載の組成物。
12. １２．前記インターロイキンがインターロイキン−５であることを特徴とする請 求項７に記載の組成物。
13. １３．前記インターロイキンがインターロイキン−６であることを特徴とする請 求項７に記載の組成物。
14. １４．前記免疫強化性ポリペプチドが、腫瘍の宿主にとって異物の抗原であるこ とを特徴とする請求項１、請求項２または請求項３に記載の組成物。
15. １５．前記抗原が、組織適合性抗原であることを特徴とする請求項１４に記載の 組成物。
16. １６．前記抗原が、ウイルス膜蛋白質抗原であることを特徴とする請求項１４に 記載の組成物。
17. １７．前記抗原が、細菌性抗原であることを特徴とする請求項１４に記載の組成 物。
18. １８．前記抗原が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの ６５ｋＤａ抗原であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
19. １９．前記ゲノムが、第二の免疫強化性ポリペプチドをコードする第三の外来遺 伝子を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
20. ２０．前記第二の外来遺伝子が、第一の外来遺伝子が免疫強化性サイトカインを コードする場合は免疫強化性抗原をコードし、第一の外来遺伝子が免疫強化性抗 原をコードする場合は免疫強化性サイトカインをコードすることを特徴とする請 求項１に記載の組成物。
21. ２１．前記選択されたポリペプチドをコードずる第一の外来遺伝子と、細胞を死 滅させることができる第二の選択されたポリペプチドをコードするＤＮＡに機能 的に連結したプロモータを含む第二の外来遺伝子を有する、脊椎動物由来の細胞 。
22. ２２．前記プロモータが、選択的に誘導可能なプロモータであり、そのポリペプ チドを誘導することにより第二のポリペプチドが細胞を死滅させることができる ことを特徴とする請求項２１に記載の細胞。
23. ２３．前記プロモータが、６−１６インターフェロンプロモータであることを特 徴とする請求項２２に記載の細胞。
24. ２４．前記ポリペプチドヘの基質の添加により、第二のポリペプチドが細胞を死 滅させることができることを特徴とする請求項２１に記載の細胞。
25. ２５．ａ．選択されたポリペプチドをコードする第一の外来遺伝子の細胞への導 入と、 ｂ．細胞を死滅させることができる第二の選択されたポリペプチドをコードする ＤＮＡに機能的に連結したプロモータを含む第二の外来遺伝子の細胞への導入に より、細胞内に第一及び第二の両方の外来遺伝子を保持する細胞を作製すること を特徴とする、選択された疾病に対する遺伝的療法に用いる細胞を作製する方法 。
26. ２６．前記プロモータが、選択的に誘導可能なプロモータであることを特徴とす る請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記細胞を死滅させるためにプロモータを誘導する付加的な工程を有する ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. ２８．前記動物に請求項２１〜２７に記載のいずれかの組成物を投与することを 特徴とする、脊椎動物に対する遺伝的療法の方法。
29. ２９．ａ．選択されたポリペプチドをコードする第一の外来遺伝子の細胞への導 入と、 ｂ．細胞を死滅させることができる第二の選択されたポリペプチドをコードする ＤＮＡに機能的に連結したプロモータを含む第二の外来遺伝子の細胞への導入に よる、細胞内に第一及び第二の両方の外来遺伝子を保持する細胞の作製と、 ｃ．細胞の、動物への投与を特徴とする、脊椎動物に対する遺伝的療法の方法。
30. ３０．前記プロモータが、選択的に誘導可能なプロモータであることを特徴とす る請求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記プロモータを誘導するための付加的な工程を有することを特徴とする 請求項３０に記載の方法。
32. ３２．腫瘍由来の、免疫強化性インターロイキンをコードする外来遺伝子を有す る細胞の調製を特徴とする、脊椎動物に対する免疫応答を強化するための細胞調 製方法。
33. ３３．腫瘍由来の、インターロイキン−２をコードする外来遺伝子を有する細胞 の調製を特徴とする、脊椎動物に対する免疫応答を強化するための細胞調製方法 。
34. ３４．前記外来遺伝子がトランスフェクションにより細胞に導入されることを特 徴とする請求項３２または請求項３３に記載の組成物。
35. ３５．前記インターフェロンをコードする外来遺伝子を含有する細胞を調製する ことを特徴とする、脊椎動物の、腫瘍増殖に対する非特異的抵抗性を強化するた めの組成物。
36. ３６．前記インターフェロンがインターフェロンγであることを特徴とする請求 項３５に記載の方法。
37. ３７．前記外来遺伝子がトランスフェクションにより腫瘍に導入されることを特 徴とする請求項３５に記載の組成物。
38. ３８．前記細胞が、さらに、付加的な免疫強化性ポリペプチドをコードする外来 遺伝子を含有する、請求項３２または請求項３５に記載の組成物。
39. ３９．前記付加的な免疫強化性ポリペプチドが、哺乳類に対して異物である抗原 であることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
40. ４０．前記抗原が、ウイルス膜蛋白質であることを特徴とする請求項３８に記載 の組成物。
41. ４１．前記抗原が、細菌細胞抗原であることを特徴とする請求項３８に記載の組 成物。
42. ４２．前記抗原が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの ６５ｋＤａ抗原であることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
43. ４３．前記免疫強化性ポリペプチドがサイトカインであることを特徴とする請求 項３８に記載の組成物。
44. ４４．前記サイトカインがインターロイキン−１であることを特徴とする請求項 ３８に記載の組成物。
45. ４５．前記サイトカインがインターロイキン−３であることを特徴とする請求項 ３８に記載の組成物。
46. ４６．前記サイトカインがインターロイキン−４であることを特徴とする請求項 ３８に記載の組成物。
47. ４７．前記サイトカインがインターロイキン−５であることを特徴とする請求項 ３８に記載の組成物。
48. ４８．前記サイトカインがインターロイキン−６であることを特徴とする請求項 ３８に記載の組成物。
49. ４９．前記サイトカインがインターフェロンであることを特徴とする請求項３８ に記載の組成物。
50. ５０．前記サイトカインがガンマインターフェロンであることを特徴とする請求 項３８に記載の組成物。
51. ５１．請求項３２〜３７に記載のいずれか１つの組成物の生存調製物を動物に導 入する工程を有することを特徴とする、脊椎動物の、腫瘍に対する免疫応答性を 強化する方法。
52. ５２．請求項３８に記載の組成物の生存調製物を動物に導入する工程を有するこ とを特徴とする、脊椎動物の、腫瘍に対する免疫応答性を強化する方法。
53. ５３．調製物の導入に先立ち、脊椎動物内の腫瘍細胞の数を減少させるための付 加的な工程を有することを特徴とする請求項５１に記載の方法。
54. ５４．前記減少が、外科手術による切除であることを特徴とする請求項５３に記 載の方法。 表１▲数式、化学式、表等があります▼ａ左後足に皮下注射され、腫瘍増殖が観 察されたＢＡＬＢ／ｃマウス。 ｂ すべてのマウスにおいて３週間以内に腫瘍が形成した。 ｃすべてのマウスにおいて２週間以内に腫瘍が形成した。 ｄ大部分のマウスにおいて２週間以内に腫瘍が形成し、すべてのマウスにおいて ３週間以内に腫瘍が形成した。 ｅ６〜１２週において腫瘍を有さないマウスが観察された。 表２▲数式、化学式、表等があります▼ａＢ１６−ＩＬ−２＋は、実験方法に記 載の通り、ｐＢＣＭＧ−ｎｅｏ−ｍＩＬ−２をトランスフェクトすることにより 作製した。 ｂ表１と同様に、細胞は左脇腹に皮下注射した。 ｃ腫瘍増殖は毎週測定した。７週間にわたって動物を観察した。腫瘍形成は、す べて注射後２週間以内に発生した。 ｄ１×１０５個の親株Ｂ１６細胞による抗原投与は、図３と同様にＢ１６−ＩＬ −２＋細胞による免疫化後２週間後に、右脇腹に行なった。７週間にわたって動 物を観察した。数字は、腫瘍を形成した動物の数を示している。これらの腫瘍は 、抗原投与後３〜５週の間に発生した。７週間にわたって腫瘍を形成しない動物 が観察された。 ｅＣＴＬ活性測定は、図１ａと同様に、マイトマイシンＣ処理Ｂ１６細胞による 刺激の５日後に行なった。数字は、１００：１のエフェクターターゲット比率で ８時間５１Ｃｒ放出活性測定を行なった後の特異的リシスの％を示している。 表３ ▲数式、化学式、表等があります▼ ＣＢＡマウスグループに、１０５、５×１０５、または１０６個いずれかの、３ つの異なるトランスフェクションプレート由来の細胞（１Ｃ、３Ｃ、６Ｌ）を皮 下注射した。９０日にわたって、動物の腫瘍増殖を観察した。 ＊ ２４日間の増殖 ｅ９０日間の増殖 表４ ▲数式、化学式、表等があります▼ ＣＢＡマウスグループに、５×１０５個のＳＰ１またはＳＰ１／ＩＦＮγ（６Ｌ ）細胞のいずれかを皮下注射した。２週間後、動物を殺し、それらのひ臓細胞を 、放射線照射したＳＰ１または６Ｌ細胞と共にインキュベートした。５日後、リ ンパ球を回収し、ナイロンウールを通過させて、吸着性及び非吸着性ひ臓細胞を 、１１１Ｉｎｏｘ標識表示標的細胞に表示比率で添加した。 ＮＷＡ−ナイロンウール吸着性 ＮＷＮＡ−ナイロンウール非吸着性 表５ ▲数式、化学式、表等があります▼ ＣＢＡマウスを、０日目及び１４日目に１０６個の６Ｌ細胞により免疫化した。 １９日目に、免疫化動物及びコントロール動物に１０４または１０５個の親株Ｓ Ｐ１細胞を抗原投与した。ついで、動物の腫瘍増殖を観察した。 ＊腫瘍を有するマウスの数／抗原投与されたマウスの数表６ ▲数式、化学式、表等があります▼ ＢＡＬＢ／ｃマウスグループにＣＴ２６細胞またはＣＴ２６／ＩＦＮγ細胞を皮 下注射または静脈注射し、腫瘍増殖及び生存を観察した。 ＊腫瘍を有するマウスの数／抗原投与されたマウスの数発明の詳細な説明