KR101723786B1

KR101723786B1 - Ｉｌ―２１을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 ｂ 세포 림프종 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101723786B1
Application number: KR1020150043338A
Authority: KR
Inventors: 조석구; 김나연
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2017-04-06
Also published as: US10155024B2; US20160008435A1; KR20150112890A

Abstract

본 발명은 IL-21(Interleukin-21)을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

ＩＬ―２１을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 Ｂ 세포 림프종 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating B-cell lymphoma comprising IL-21 expressing mesenchymal stem cells}

본 발명은 IL-21(Interleukin-21)을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

B 세포는 여러 항원에 각각 특이적인 항체를 발현하므로, B 세포의 종류는 상당히 다양한데, 이러한 다양성은 면역계에 있어 중요하다. 인간의 각 B 세포는 다수의 항체 분자를 생성할 수 있는데, 외래 항원이 중성화되면 이러한 항체 생성은 거의 실질적으로 감소한다. 그러나, 경우에 따라서는 특정 B 세포 증식이 감소되지 않고 계속되는데, 이러한 증식으로 인해 "B 세포 림프종"으로 불리는 종양이 발생할 수 있다.

B 림프구의 악성 성장을 특징으로 하는 대표정인 종양으로, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma; NHL)을 들 수 있다. 미국 암 협회(American Cancer Society)에 따르면, 비-호지킨 림프종으로 진단받은 환자 중 65%가 중급 또는 고급의 림프종으로 분류된다. 중급 림프종으로 진단된 환자는 평균 생존 기간이 진단 후 2 내지 5년이며, 고급 림프종으로 진단된 환자는 평균 생존 기간이 진단 후 6개월 내지 2년이다. 이와 같은 B 세포 림프종의 통상적인 치료법으로는, 자가유래 또는 동종이계 골수 또는 간상부 세포 이식, 화학요법 및 방사선 치료 등을 들 수 있다. 그러나, 치료 후 몇 개월 내에 재발하는 것이 일반적이다.

현재 B 세포 림프종의 치료와 관련하여, 단백질 키나제 C 억제제 (국내 공개특허 제2012-0133389호), CD20 에 대한 단클론항체(국내 공개특허 제2008-0039844호), 항-사이토카인 항체 및 항-CD20의 병용(국내 공개특허 제2002-0091170호) 등의 기술이 개발되어 있으나, 뚜렷한 치료 효과는 검증되지 않았다.

한편, 인터루킨-21(IL-21)은 활성화된 CD4+ T 림프구와 자연살해 T 세포(natural killer T cell)에서 주로 생성되며 수지상세포(dendritic cell)와 단핵 백혈구(monocyte)를 포함한 대부분의 림프구 아형의 면역반응을 증폭시킨다. 특히, IL-21은 자연살해세포(natural killer cell)와 CD8+ T 림프구의 증식과 분화를 촉진시킨다. 따라서, IL-21은 항종양 면역반응과 연관성을 가지고 있지만, IL-21을 이용한 치료법으로 알려진 재조합 IL-21 단백질, IL-21를 발현하는 플라스미드 DNA, 또는 IL-21을 발현하는 바이러스의 전신적 투여는 종양병소로 이동하는 능력이 제한적이기 때문에 강력한 항 종양 효능을 보이지 않는다.

따라서, IL-21을 종양병소에 효율적으로 전달하며 IL-21의 항종양 효과를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있고 생물학적 안전성이 높은 약제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제2012-0133389호 대한민국 공개특허 제2008-0039844호 대한민국 공개특허 제2002-0091170호

본 발명의 목적은 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포의 B 세포 림프종의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, B 세포 림프종의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 약제학적 유효량을 B 세포 림프종 개체에 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 IL-21을 발현하는 벡터를 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 IL-21을 종양병소에 효율적으로 전달하며 IL-21의 항종양 효과를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있고 생물학적 안전성이 높은, 새로운 세포 기반의 종양 치료법을 제공할 수 있다.

도 1은 IL-21 및 GFP를 발현하는 아데노바이러스를 중간엽 줄기세포에 감염시킨 후 면역형광염색 및 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과(A)와, PCR(B) 및 샌드위치 ELISA(C)를 통하여 IL-21의 발현량을 확인 및 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 B 세포 림프종 세포에서의 B 세포 림프종 세포의 세포사멸 효과(A)와 항종양 사이토카인 분비능(B)을 나타낸 것으로, IL-21을 발현하는 아데노바이러스의 처리군(rAd/IL-21) 및 IL-21을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨 중간엽 줄기세포 처리군(IL-21/MSC)에서의 결과이다.
도 3은 실험 동물에 B 세포 림프종을 유도한 후, 각 대조군 및 실험군에서 시간(일 수)의 경과에 따른 무병생존율(실제로 마우스가 사망하였을 때 전체 생존율)(A)과, 비장과 간으로의 A20 림프종의 전이 여부를 확인한 결과(B)를 나타낸 것으로, 무처치 대조군(control), IL-21을 발현하는 아데노바이러스의 투여군(rAd/IL-21), 중간엽 줄기세포 투여군(MSC), IL-21을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨 중간엽 줄기세포 투여군(IL-21/MSC)에서의 결과를 나타낸다. 또한, 질환을 유도하지 않은 정상 동물(Normal)의 경우에서의 생존율을 함께 나타내었다.
도 4는 실험 동물에 B 세포 림프종을 유도한 후, 각 대조군 및 실험군의 동물을 41일째 안락사하여 주요 종양병소인 간(A: ELISA)과 비장(B: RT-PCR) 조직에서 생성된 IL-21의 발현을 조사한 결과로, 무처치 대조군(control), 중간엽 줄기세포 투여군(MSC), IL-21을 발현하는 아데노바이러스의 투여군(rAd/IL-21), IL-21을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨 중간엽 줄기세포 투여군(IL-21/MSC)에서의 결과를 나타낸다.
도 5는 실험 동물에 B 세포 림프종을 유도한 후, 각 대조군 및 실험군의 동물을 41일째 안락사하여 얻은 비장을 단일세포로 분리하여 세포 내에서 분비되는 사이토카인 함량과, NK 세포 및 골수유래억제세포(MDSC)의 수를 측정한 결과로, 무처치 대조군(control), 중간엽 줄기세포 투여군(MSC), IL-21을 발현하는 아데노바이러스의 투여군(rAd/IL-21), IL-21을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨 중간엽 줄기세포 투여군(IL-21/MSC)에서의 결과를 나타낸다.
도 6은 IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 B 세포 림프종 특이적인 살해 효과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 중간엽 줄기세포에 IL-21을 도입하여 IL-21을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 제조하였다 (도 1). IL-21을 과발현하는 중간엽 줄기세포의 상층액을 B 세포 림프종 세포에 처리한 결과 재조합 IL-21 단백질을 처리한 경우보다 세포사멸 효과가 뛰어났고, 특히 TNF-α와 IFN-α의 발현이 중간엽 줄기세포 투여군에 비해 각각 10배, 30배 이상 증가되어 있어 IL-21을 과발현하는 중간엽 줄기세포는 IL-21의 전달능력뿐만 아니라 직접적인 종양 효과를 나타냄을 확인하였다(도 2). 또한, B 세포 림프종이 전신에 확산된 마우스에 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포를 투여하여 치료한 결과, 기존에 알려진 IL-21 바이러스 치료법보다 생존율이 향상된 것을 관찰하였다(도 3A). 아울러, 무처치 대조군의 경우 A20 림프종이 간과 비장으로 전이되는데, IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포는 간으로의 전이를 예방하는 것을 알 수 있었다(도 3B). 또한, 이러한 향상된 생존율은 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포가 IL-21를 발현하는 바이러스보다 주요 종양병소인 간과 비장으로 IL-21을 더욱 효과적으로 전달한 점과 연관성이 있음을 확인하였다(도 4). 또한, 비장을 분리하여 면역세포를 분석한 결과, 중간엽 줄기세포와 IL-21을 단독 처리한 군은 대조군 대비 면역세포의 향상이 관찰되지 않으나, IL-21을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 처리한 군에서는 항종양 효과를 담당하는 NK 세포, IFN-γ를 분비하는 CD8과 CD4 T 세포가 증가되어 있고, 골수유래억제세포의 수는 현저히 감소되어 IL-21을 과발현하는 중간엽 줄기세포는 생체 내에서 강력한 항종양 면역반응을 유도함과 동시에 면역억제세포를 조절하여 직접적으로 종양의 미세환경을 개선함을 확인하였다(도 5). 마지막으로, 다양한 종양세포주에서 IL-21을 과발현하는 중간엽 줄기세포의 세포사멸효과를 실험한 결과, B 세포 림프중에 대해 강력한 세포사멸 효과를 보이고, 난소암과 만성골수성 백혈병 세포에 대해 미약한 세포사멸 효과를 보이며, B 세포 외 다른 림프계 종양세포에 대해서는 세포사멸 효과를 보이지 않았다(도 6).

따라서, 본 발명은 이러한 결과를 바탕으로 중간엽 줄기세포에 IL-21를 도입하여 새로운 세포 기반의 종양 치료법을 개발하였다.

이에, 하나의 양태로서, 본 발명은 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 B 세포 림프종의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포의 용도를 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 약제학적 유효량을 B 세포 림프종 개체에 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 IL-21을 발현하는 벡터를 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 성체 줄기세포의 일종으로, 배아 줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암(cancer)화나 윤리적인 문제에서 자유로울 뿐 아니라 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되고 있다.

본 발명에서, 중간엽 줄기세포는 골수 등에서 분리할 수 있다. 또한, 중간엽 줄기세포는 환자 자신으로부터 채취하거나 혈액은행의 데이터베이스를 이용하여 HLA(human leukocyte antigen) 타입이 일치되는 골수로부터 분리하여 사용함으로써 개체간의 면역거부반응을 최소화시킬 수 있다.

본 발명은 항종양 효과를 나타내는 IL-21을 유전자 형태로 중간엽 줄기세포에 도입하여 종양병소에 전달하고 해당 부위에 발현시킴으로써, 기존의 단백질 치료제 또는 바이러스 매개 치료제가 가지는 생체 내 분해에 따른 반감기의 감소 및 생리활성의 감소와 같은 문제를 해결하고, 기존의 유전자 치료제가 가지는 전달 효율 및 안정성의 문제를 해결할 수 있으며, 지속적이고 안정적으로 치료 효과를 공급할 수 있다.

본 발명에서 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포는, 당업계의 지식을 바탕으로 자가유래 또는 동종이계 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다. 예컨대, 분리한 중간엽 줄기세포에 IL-21 유전자를 도입한 후 시험관 내에서 적절한 조건으로 증식 및 분화시켜 얻거나, 중간엽 줄기세포를 충분히 증식시킨 다음 여기에 IL-21 유전자를 도입하여 얻을 수 있다.

일구현예로, 상기 IL-21을 발현하는 중간엽 줄기세포는, IL-21을 발현하는 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 벡터는 IL-21 유전자의 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, SV 40, 폴리오마 바이러스, 파필로마 바이러스, 피카르노바이러스, 벡시니아 바이러스 또는 헬퍼 의존성 아데노바이러스 등이 IL-21을 발현하는 매개체로 사용될 수 있다.상기 바이러스들은 재조합 바이러스일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, IL-21을 발현하는 아데노바이러스를 중간엽 줄기세포에 도입하여 사용하였다.

상기 벡터에 도입되는 IL-21 유전자는 IL-21 단백질 또는 이들과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유도체를 코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 기능적으로 동등한 특성을 갖는 유도체란 상기 IL-21과 기능적으로 동등한 특성을 갖는 것으로, 구체적으로, 펩타이드 중의 일부의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체, 및 이 펩타이드 또는 이 펩타이드의 일부의 아미노산 잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체의 아미노기 또는 카르복실기를 수식한 유도체를 의미한다.

본 발명에서 IL-21을 발현하는 벡터를 중간엽 줄기세포에 도입하는 방법은, 공지된 형질도입(transduction) 또는 형질전환(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 원심분리법, 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 B 세포 림프종에 예방 또는 치료 효과를 나타낸다. 본 발명의 B 세포 림프종에는 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL), 소형 림프구성 (SL) NHL, 중급/여포성 NHL, 중급 광범성 NHL, 고급 면역아세포 NHL, 고급 림프아세포 NHL, 고급 소형 미분열 세포 NHL, 거대(bulky) 질환 NHL 및 월덴스트롬(Waldenstrom) 마크로글로불린혈증을 포함하는 다양한 B 세포 림프종이 포함된다.

본 발명에서 "치료" 란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.

본 명세서에 있어서, "개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐, 인간 등일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다.

또한 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> IL - 21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 제조 및 IL -21 사이토카인 측정

Balb/c의 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포 5×10⁵개를 무혈청(serum-free) 배지에 폴리브렌(polybrene) 8㎍/mL 과 mIL-21(마우스의 IL-21)을 발현하는 아데노바이러스(rAD/mIL-21)을 5×10⁷ pfu (100MOI)로 처리 한 다음, 1500rpm으로 30분 원심분리하여 감염시키고 24시간 후 바이러스가 존재하는 상층액을 제거하고 세포배양액을 추가하였다. 바이러스 감염일로부터 3일째 되는 날 세포를 수거하여 IL-21과 함께 발현되는 녹색 형광 단백질(GFP)를 FACS(Fluorescence activated cell sorter)로 측정하고 세포배양액에서 IL-21의 생성을 sandwich ELISA를 이용하여 조사하였다.

IL-21 유전자 도입을 확인하기 위해서, IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포에 TriZol을 처리하고 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 2㎍ 정량하여 oligo dT 프라이머, dNTP mix, reverse transcriptase 효소와 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 β-액틴과 IL-21 유전자에 대한 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 실시하여 각 세포의 유전자의 최초의 양을 측정하였다.

IL-21 사이토카인 분비를 확인하기 위해서는, 96-웰 플레이트에 단클론성 항-IL-21으로 4℃에서 밤새 반응시켰고, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. IL-21 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온 2시간 반응시켰다. 그리고 나서 biotinylated anti-IL-21 2시간 실온 반응시켰고 반응 후 4회 세척하고 ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate 를 희석하여 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 PNPP/DEA 용액을 넣고 발색하였다. 발색 후 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

중간엽 줄기세포는 다른 세포에 비해 바이러스를 통한 유전자의 형질도입(transduction)이 어려우나, 바이러스와 폴리브렌을 함께 처리하고 원심분리를 이용한 spin centrifugation method로 형질 도입했을 경우, IL-21과 함께 발현되는 녹색 형광 단백질의 발현을 유세포분석기를 통해 확인하였고(도 1A), IL-21 유전자의 발현과 실제로 분비되는 IL-21 단백질 역시 상당히 증가함을 PCR(도 1B) 및 ELISA(도 1C)를 통해 확인하였다.

< 실시예 2> IL - 21를 발현하는 중간엽 줄기세포와 일반 중간엽 줄기세포의 사이토카인 분비 비교 및 시험관 내 종양세포 사멸효과 실험

IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포와 일반 중간엽 줄기세포를 수거한 후 TriZol을 처리하고 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 2㎍ 정량하여 oligo dT 프라이머, dNTP mix, reverse transcriptase 효소와 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑 유전자인 β-액틴과 타겟 사이토카인에 대한 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 실시하여 각 세포의 유전자의 최초의 양을 측정하였다. 시험관 내 종양세포 사멸 효과를 확인하기 위해서 재조합 IL-21 단백질 (500ng/mL), 일반 중간엽 줄기세포의 상층액 또는 IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 상층액을 B 세포 림프종 A20 세포에 처리하고 96시간 반응시킨 뒤, 수용성 포르마잔 염색체인 WST-8가 포함된 CCK-8 시약을 처리하였다. 3시간 동안 반응 후 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, B 세포 림프종 A20 세포에 MSC와 IL-21/MSC의 상층액을 처리한 결과, 재조합 IL-21 단백질(rIL-21)보다 세포사멸 효과가 뛰어났다. 일반 MSC에서 소량의 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ와 같은 항종양 사이토카인을 분비하는데 이러한 사이토카인들이 세포사멸 효과를 나타냈을 것이라고 예상된다. 또한, IL-21을 발현하는 MSC는 일반 MSC보다 항종양 사이토카인이 증가되어 있었다. 특히, TNF-α와 IFN-α의 발현이 각각 10배, 30배 이상 증가되어 있었는데 이는 IL-21/MSC의 증가된 세포사멸효과와 연관성 있다. 그렇기 때문에 IL-21를 발현하는 MSC는 IL-21의 전달능력뿐만 아니라 직접적인 종양효과를 나타낸다.

< 실시예 3> B 세포 림프종의 유도 및 IL - 21를 발현하는 중간엽 줄기세포를 이용한 치료 효과 실험

8주령 Balbc 마우스에 동종의 B 세포 림프종인 A20 세포 1×10⁶를 정맥 주사하여 종양모델을 유도하였다. 종양세포를 주입하고 일주일이 되는 날 IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포를 종양세포의 1/10인 1×10⁵를 정맥으로 주입하고 일주일 간격으로 총 4번 치료하였다. 비교군으로, B 세포 림프종을 유도하지 정상 마우스군, 무처치 대조군, 2×10⁷ p.f.u(plaque forming unit)의 IL-21을 발현하는 아데노바이러스 투여군(rAD/IL-21), 1×10⁵의 중간엽 줄기세포 투여군을 사용하였다.

대조군/실험군	설명
Normal	B 세포 림프종을 유도하지 않은 정상 동물
Control	무처치 대조군
rAd/IL-21	IL-21을 발현하는 아데노바이러스 투여군
MSC	중간엽 줄기세포 투여군
IL-21/MSC	IL-21을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨 중간엽 줄기세포 투여군

8주령 Balbc 마우스에 동종의 B 세포 림프종인 A20 세포 1×10⁶를 정맥 주사하여 림프종 질환 모델을 유도한 후, IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포를 정맥으로 주입하여 치료 효과를 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, B 세포 림프종 세포를 정맥으로 주입하면 전신으로 퍼지기 때문에 무처치 대조군의 무병생존율은 27일까지였으며, rAd/IL-21 또는 MSC로 치료하였을 경우, 대조군 보다 무병생존율이 일주일 정도 향상되었다. IL-21/MSC을 투여한 마우스에서는 B 세포 림프종의 발생률이 지연됐을 뿐만 아니라 80일째까지 종양이 생기지 않은 마우스가 30%로 무병생존율이 현저히 향상되었다(도 3A). 또한, 무처치 대조군에서 A20 림프종이 주로 비장과 간으로 전이되는 것을 확인할 수 있었는데, IL-21/MSC 투여군에서는 다른 투여군보다 간으로 전이되는 종양을 예방하는 것으로 나타났다(도 3B).

< 실시예 4> IL - 21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 주요 종양병소인 간과 비장조직으로의 이동능력 확인 실험

종양세포를 정맥 주사할 경우 주요 종양병소인 간으로 전이하므로, 간과 비장 조직에서 생성된 IL-21의 발현을 조사하여 IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 간과 비장조직으로의 이동능력을 확인하였다. 이를 위해, 종양세포를 주입하고 41일째에 Balbc 마우스를 안락사 한 다음 해부하여 간 조직과 비장 조직을 얻었다. 간 조직은 50mM Tris-HCl, 250mM NaCl, 5mM EDTA, protease inhibitor를 포함한 buffer에 넣고 homogenizer를 이용하여 간의 용해물(lysate)를 얻었다. 마우스의 간에서 존재하는 IL-21을 sandwich ELISA를 이용하여 조사하였다. 이를 위하여, 96-웰 플레이트에 단클론성 anti-IL-21으로 4℃에서 밤새 반응시켰으며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. IL-21 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 간의 용해물을 넣고 실온 2시간 반응시켰다. 그리고 나서 biotinylated anti-IL-21 2시간 실온 반응시켰고 반응 후 4회 세척하고 ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 PNPP/DEA 용액을 넣고 발색하였다. 발색 후 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

비장세포는 단일세포로 분리하여 수거한 뒤 TriZol을 처리하고 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 2㎍ 정량하여 oligodT 프라이머, dNTP mix, reverse transcriptase 효소와 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑 유전자인 β-액틴과 IL-21 사이토카인 유전자에 대한 실시간 정량 PCR을 실시하여 각 투여군의 비장에서 IL-21 유전자의 최초의 양을 측정하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, IL-21/MSC 투여군의 간과 비장에서 IL-21의 발현이 다른 투여군 보다 높았다. 이는 IL-21/MSCs가 rAD/IL-21보다 IL-21을 종양병소로 더욱 효과적으로 전달하였음을 알 수 있는 결과이다.

< 실시예 5> IL - 21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 종양 미세환경 개선능력 확인 실험

종양세포를 주입하고 41일째에 Balbc 마우스를 안락사 한 다음 해부하여 비장을 얻었다. 비장을 단일세포로 분리한 뒤 NK 세포에 특이적인 표면 단백질인 CD3, CD49b, 효과기 T세포에 특이적인 표면 단백질인 CD8, myeloid-derived suppressor cell에 특이적인 표면 단백질인 CD11b, Gr-1에 대한 형광 결합 항체를 각각 넣고 반응시켰다. 효과기 CD8+ T 세포 내에서 분비되는 사이토카인을 측정하기 위해서는 비장의 단일 세포에 PMA, Ionomycin, Golgistop을 추가하여 4시간 동안 반응시켰다. 2차 자극을 받은 단일세포를 수거하여 표면 단백질에 대한 항체를 먼저 반응시킨 뒤 세포를 고정하고 세포막을 침투(permeabilization)시키는 시약을 사용하여 반응시켰다. 마지막으로 IFN-γ에 대한 항체를 넣고 반응시켰다. 이렇게 염색된 단일세포는 유세포분석기를 이용하여 분석이 가능하다.

도 5에 나타난 바와 같이, MSC와 IL-21 단독 투여군에서는 대조군에 비해 면역세포가 크게 향상되지 않았다. 하지만, IL-21/MSC 투여군에서는 대조군과 다른 투여군과 비교하였을 때 항종양효과를 담당하는 주요 면역세포인 NK 세포와 항종양 사이토카인인 IFN-γ를 분비하는 CD8과 CD4 T세포가 증가되어 있었다. 또한, 면역억제성 세포인 골수유래억제세포(myeloid-derived supressor cell(MDSC))는 IL-21/MSC 투여군에서 현저히 감소되었다. 따라서, IL-21/MSC는 생체 내에서 강력한 항종양 면역반응을 유도하는 동시에 면역억제세포를 조절하여 직접적으로 종양의 미세환경을 개선함을 확인하였다.

< 실시예 6> IL -21을 발현하는 중간엽 줄기세포의 B 세포 림프종 특이적인 살해효과 실험

사람의 종양세포주에 대한 살해효과를 확인하기 위해서 마우스 IL-21/MSC와 같은 방법으로 사람의 IL-21/MSC를 제조하였다. 시험관 내 종양세포 사멸 효과를 확인하기 위해서 사람의 IL-21를 발현하는 중간엽 줄기세포의 상층액을 사람의 B 세포 림프종 세포 Jiyoye, 난소암 세포 SK-OV3, NK/T세포 림프종 세포 Hank-1, NK세포 림프종 세포 NK-92, 만성 골수성 백혈병 세포 K562에 처리하고 96시간 반응한 뒤, 수용성 포르마잔 염색체인 WST-8가 포함된 CCK-8시약을 추가하였다. 3시간동안 반응 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 다양한 종양세포주에 IL-21/MSC의 상층액을 처리한 결과, IL-21/MSC의 상층액은 특히 B 세포 림프종에 대한 강력한 세포사멸 효과를 보였다. 난소암과 만성골수성 백혈병 세포에 대한 세포사멸효과를 보이긴 했으나 B세포 림프종에 대한 사멸효과는 더욱 강력했으며 B 세포 외에 다른 림프계 종양세포에 대한 사멸효과는 보이지 않았다.

Claims

IL-21(Interleukin-21)을 발현하는 골수 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료를 위한 정맥주사용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 골수 유래 중간엽 줄기세포는 IL-21을 발현하는 벡터가 도입된 골수 유래 중간엽 줄기세포인, 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스 벡터인, 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스인, 약학 조성물.
IL-21을 발현하는 벡터를 골수 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계를 포함하는, 제1항의 정맥주사용 약학 조성물의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스 벡터인, 제조방법
제6항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스인, 제조방법.