KR102211959B1

KR102211959B1 - Ｄｕｓｐ５를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102211959B1
Application number: KR1020140107569A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 문수진; 박진실; 문영미; 임미애; 김은경; 변재경; 김성민; 서현범
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2021-02-05
Also published as: KR20160022038A; WO2016027990A1

Abstract

본 발명은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, STAT3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 DUSP5을 이용한 STAT3의 활성 억제 방법에 관한 것으로, 본 발명은 DUSP5는 파골세포 분화와 관련된 RANKL, RANK, NFATc1 및 TRAP의 발현 또는 활성을 효과적으로 억제할 수 있고, Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 작용이 동시에 가능하며, STAT3의 인산화 억제를 통해 STAT3의 활성을 억제할 수 있어, 골대사성 질환 및 STAT3 매개로 인한 질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 유용하게 활용 가능할 것이다.

Description

ＤＵＳＰ５를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for preventing or treating metabolic bone disease comprising DUSP5 as active ingredients}

본 발명은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, STAT3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 DUSP5을 이용한 STAT3의 활성 억제 방법에 관한 것이다.

뼈는 골세포(osteocyte), 파골세포(osteoclast), 조골세포(osteoblast)와 같은 뼈세포(bone cell), 수산화인회석(hydroxyapatite crystal), 교원질 섬유(collagenous fibers), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans)과 같은 뼈 기질(bone matrix) 및 골수의 공동(bone marrow cavity), 혈관(vascular canals), 소관(canaliculi), 골소강(lacunae)과 같은 공간으로 구성되어 있다(Stavros C. M., Endocrine Reveiws, 21(2), 115-137 (2000)). 뼈는 몸을 기계적으로 지지하고, 중요장기를 보호하며, 조혈작용(hemopoeisis)에 필요한 미세 환경을 제공하고, 칼슘 및 여러 미네랄을 저장하는 역할을 한다.

뼈의 성장, 발달 및 유지는 일생을 거쳐 연속적으로 일어난다. 노화된 뼈는 파괴되고 이를 대신하여 새로운 뼈가 재형성(regeneration)된다. 이러한 교체(turnover)는 파골세포와 조골세포로 구성된 BMU(Basic Multicellular Units)에서 주로 일어나는데, 이 과정은 성장과 스트레스로 인한 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 뼈의 기능을 유지하게 하는 역할을 한다. 노화된 뼈의 파괴 또는 흡수는 파골세포가 그 일을 수행한다. 반면, 새로운 뼈의 형성은 조골세포가 담당한다. 파골세포는 뼈의 표면에 부착하여 산과 분해효소를 분비함으로써 뼈를 구성하는 인회석 결정 및 교원질과 같은 뼈 기질(bone matrix)을 제거하여 뼈를 파괴하고, 조골세포는 뼈 기질을 합성하여 분비하고 칼슘과 인의 농도를 조절하여 골격을 형성한다(Stavros C. M., Endocrine Reviews, 21(2), 115-137 (2000)).

골 대사성 질환은 생체 내에서 파골세포와 조골세포의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 골 대사성 질환의 대표적인 예로는 골다공증을 들 수 있다. 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골 대사성 질환은 이외에도 유방암, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소, 원발성(Primary)으로 뼈에 생성된 종양(예, 다발성 골수종), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병(Paget's disease) 등이 있다.

또한, 골수종은 심한 통증을 동반하면서 뼈가 쉽게 골절이 되는 질환으로 종양세포가 파골세포의 활성을 증진시켜 발생한다. 유방암이나 전립선암은 쉽게 뼈로 전이되어 역시 파골세포의 활성을 증진시켜 뼈를 파괴시킨다. 류마티스성 관절염이나 퇴행성 관절염이 있는 경우에도 면역반응에 의해 생성된 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF), 인터루킨-1, 인터루킨-6 등이 관절강에 존재하는 파골세포의 활성을 증진시켜 관절 부위에 국소적인 뼈의 파괴가 일어난다. 치주질환을 일으키는 세균이 감염되어 염증을 일으키면 면역반응의 결과, TNF, 인터루킨-1, 인터루킨-6 등 염증성 싸이토카인이 만들어지고 이들이 파골세포의 분화를 촉진시켜 치아를 지지하고 있는 치조골을 파괴하게 된다.

최근에 골다공증을 비롯한 이러한 골대사성 질환의 치료를 위한 분자생물학적 연구가 활발하게 이루어지면서 골형성 촉진 인자와 파골 억제 인자가 개발되었는데, 골형성 촉진 인자로는 불소제재, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 티지에프-베타(TGF-β), 골형성 단백질(bone morphogenetic protein), 인슐린유사 성장호르몬(insulin like growth factor) 등이 있다. 파골 억제 인자로는 에스트로겐(estrogen), 칼시토닌(calcitonin), 비타민 D와 그의 유사체(Vitamin analogues), 비스포스포네이트(bisphosphonate) 등이 알려져 있다(Jardine et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 31, 211 (1996)).

그러나 이러한 치료제들 모두 치료 효과가 미비하고 근본적인 치료가 어려우며 부작용이 많이 발생하고 있어 효과적인 치료제라고 볼 수 없다.

따라서 보다 근본적인 원인을 개선할 수 있으며 부작용이 적은 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 특허출원 제2004-0003003호

따라서 본 발명의 목적은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 STAT3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 세포에 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 DUSP5 염기서열을 포함하는 발현벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 DUSP5 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 STAT3의 활성 또는 발현을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DUSP5는 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DUSP5의 펩타이드는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DUSP5는 RANKL, RANK, NFATc1 및 TRAP의 발현 또는 활성을 억제하여 파골세포 분화를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골대사성 질환은 골다공증(osteoprosis), 파제트병(paget disease), 골전이암(metastatic cancer) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthiritis), 뼈전이암(bone metastatic cancer), 고형암 뼈전이, 고형암 뼈전이에 의한 근골격 합병증, 악성 종양으로 인한 과칼슘혈증, 다발성 골수종, 원발성(primary) 뼈 종양, 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈흡수 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DUSP5는 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DUSP5는 STAT3의 인산화를 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DUSP5는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 DUSP5 염기서열을 포함하는 발현벡터의 형태로 상기 조성물에 함유되어 있는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 STAT3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3 매개 질환은 관절염, 복막염, 다발성 경화증, 건선, 천식, 부종, 기관지 경련, 알레르기, 염증성 질환, 자가면역질환, 감염성 질환 및 괴사성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 세포에 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 DUSP5 염기서열을 포함하는 발현벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 DUSP5 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 STAT3의 활성 또는 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.

도 1은 DUSP5에 의한 관절염 치료 효과를 확인한 것으로, 콜라겐으로 관절염이 유발된 마우스 군을 대상으로 DUSP5 투여에 의한 관절염 지수 및 관절염 발병정도를 분석한 결과와(도 1a), 관절파괴 완화 정도를 면역조염색법으로 확인한 결과(도 1b) 및 마우스 혈청 내 면역글로불린의 감소 정도를 분석한 결과(도 1c)를 나타낸 것이다.
도 2는 DUSP5에 의한 항염활성을 분석한 결과로, 관절염 유발 마우스 군을 치사시킨 후, 관절 조직 내의 염증성 인자의 발현 정도를 면역염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 것이고(도 2a), 도 2b는 혈관형성 인자에 대한 발현 정도를 면역염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DUSP5에 의한 Th17 세포 및 Treg 세포의 분화에 미치는 영향을 분석한 결과로서, pcDNA-DUSP5와 MOCK 벡터 주입에 따른 Th17 세포 및 Treg 세포 분화를 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이고(도 3a), 도 3b는 IL-17, Foxp3, CD4, CD25에 대한 항체를 사용하여 면역형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이고, 도 3c는 RT-PCR을 수행하여 각 인자들의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 DUSP5에 의한 ERK, Th17 및 Treg의 조절활성 여부를 분석한 결과로서, 4a는 CD4+ T 세포에 pcDNA-DUSP5와 MOCK 벡터로 각각 형질도입한 후, 각 세포내에서 DUSP5, IL-17, ERK 및 Foxp3의 유전자 발현 정도를 RT-PCR을 수행하여 분석한 결과이며, 도 4b는 세포 배양액을 대상으로 IL-17, IL-21 및 TNF-a의 생성양을 ELISA를 이용하여 분석한 결과이며, 도 4c는 DUSP5 siRNA 처리 후, 세포 내에서 DUSP5, IL-17, ERK 및 Foxp3의 발현 정도를 RT-PCR을 수행하여 분석한 결과이며, 도 4d는 IL-17, IL-21 및 TNF-a의 생성양을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 DUSP5에 의한 STAT3 및 STAT5를 조절하는 활성에 대한 영향을 분석한 결과로서, 5a는 CII로 면역화 시킨 마우스로부터 비장을 수득하고 비장 세포 내에서 DUSP5 처리에 의한 STAT3 및 STAT5의 인산화 정도를 면역형광염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 것이고, 도 5b는 웨스턴 블럿을 통해 인산화 정도를 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 도 5c는 ERK의 인산화 정도를 면역형광염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DUSP5에 의한 파골세포 분화 억제활성을 분석한 결과로서, 6a는 질환모델의 마우스 조직 내에서 RANKL, RANK, NFATc1의 발현 정도를 조직염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고, 6b는 질병마우스 모델의 골수로부터 파골세포분화를 유도한 후, DUSP5 처리에 의한 TRAP 양성 세포의 감소정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, 6c는 DUSP5의 과발현 및 발현 억제시 세포 내에서 파골세포 분화와 관련된 인자의 발현정도에 미치는 영향을 RT-PCR을 수행하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

DUSP5(Dual-specificity phosphatase 5)는 MAPKs의 억제제의 역할을 하는 것으로 알려져 있고, DUSP1 및 DUSP4와는 달리 ERK의 활성을 억제하는 작용을 하며, 반면 JNK 및 p38 MAPK은 활성을 억제하지 않는 것으로 알려져 있다.

따라서 DUSP5 세포 내 신호전달에서 다양한 역할을 하고 있을 것으로 예상하고 있으나, 아직 이 분자에 대한 연구는 많이 진행되지 못하고 있는 실정이다.

일부 선행기술에서는 DUSP5이 암을 진단하기 위한 마커로 사용될 수 있음을 개시하고 있고(KR 20110078453A), 비만 진단을 위한 용도로 사용할 수 있다는 내용이 개시되어 있을 뿐(KR 20090031400A), 본 발명과 같이 골대사성 질환을 치료할 수 있으며, 자가면역질환을 포함하여 STAT3 매개 질환을 예방 및 치료할 수 있다는 내용에 대해서는 보고된 바가 없다.

이러한 점에서 본 발명에서는 DUSP5의 의약 용도 측면에서 새로운 용도를 규명한 점에 특징이 있으며, 특히 본 발명에서 규명한 DUSP5의 의약 용도는 골대사성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 용도로 사용할 수 있고, STAT3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있으며, STAT3의 활성 또는 발현을 감소시키는 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 DUSP5가 파골세포의 분화를 억제하는 활성이 우수함을 실험을 통해 확인할 수 있었는데, 특히 파골세포 분화에 관여하는 인자인 RANKL, RANK, NFATc1 및 TRAP의 발현 또는 활성을 억제하는 작용이 있음을 확인할 수 있었다.

파골세포는 대식세포 계열의 전구세포에서 다양한 분화유발인자들에 의해 분화되는 것으로 알려져 있다. 특히, 조골세포로부터 분비되는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로의 분화와 활성화를 유발한다. 분화한 파골세포는 NF-kB, c-Fos, c-jun, AP-1, NFATc1의 활성화와 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정, Src, Akt MITF 활성화 등을 통하여 TRAP(tartarate resistant acid phosphatase) cathepsin K, calcitonin receptor 등 파골세포 특이 단백질 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

이러한 점에서 본 발명의 DUSP5는 파골세포 특이 단백질 및 파골세포 분화 관련 인자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 효과가 있어 파골세포 분화로 인한 골대사성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 상기 골대사성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 골다공증(osteoprosis), 파제트병(paget disease), 골전이암(metastatic cancer) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthiritis), 뼈전이암(bone metastatic cancer), 고형암 뼈전이, 고형암 뼈전이에 의한 근골격 합병증, 악성 종양으로 인한 과칼슘혈증, 다발성 골수종, 원발성(primary) 뼈 종양, 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈흡수 질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 DUSP5는 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 작용을 동시에 유도할 수 있는 특징이 있다.

각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역 질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

한편, STAT(Signal transducers and activators of transcription)는 신호전달 및 전사조절 단백질로서, 사이토카인, 호르몬, 성장인자 등의 세포외 자극에 의해 활성화되어 타이로신 잔기가 인산화되고, SH2 도메인의 상호작용으로 이량체(dimer)가 형성되어 핵 안으로 들어가 특정 프로모터에 결합하게 된다. 이런 STAT 단백질의 신호체계는 탈인산화 작용 및 단백질 분해에 의해 억제될 수 있다.

특히, 최근에는 다양한 암종에서 STAT1, STAT3 및 STAT5의 활성화된 형태가 발견되고 있는데, STAT3는 백혈병과 같은 혈액암 뿐만 아니라, 유방암, 두부경부암, 흑색종, 난소암, 폐암, 췌장암, 전립선암과 같은 다양한 고형암에서 활성화되어 있어 중요한 항암 타겟이 되고 있다(Hua Yu and Richard Jove, Nature Review Cancer.,2004, 8, 945).

또한, STAT3의 활성은 세포사멸을 억제하고, 신생혈관(angiogenesis)을 유도하며, 면역회피를 유도하는 것으로 알려진 바 있다((Wang T. et al., NatureMedicine., 2004, 10, 48). 따라서 STAT3 활성 억제는 복합적인 항암 기작으로 종양을 제어할 수 있는 효과가 있고, STAT3 단백질은 종양뿐만 아니라 다양한 세포내 기능에도 관여하므로 이의 저해제 발굴은 면역억제제로의 개발도 가능하다.

일반적으로 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.

특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.

또한, T 세포는 Treg 세포 이 외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.

따라서 본 발명의 DUSP5는 골대사성 질환 뿐만 아니라, 면역질환을 예방 및 치료할 수 있고 또한, STAT3 매개로 인한 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

STAT3 매개 질환은 STAT3 경로의 활성화에 의해 유발되는 질환을 의미하는 것으로, 당업계에 공지된 바에 의하면 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6의 과발현, 과분비 또는 과다활성이 STAT3 경로를 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있고, 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6은 염증성 질환, 자가면역질환, 파괴성 골질환, 감염성 질환, 퇴행성 질환 및 괴사성 질환 등에 의해 발현, 분비 또는 활성이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 이들 질환은 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6에 의해 유도되는 STAT3 경로 활성화에 기인하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 질환에 대한 치료제 개발에 있어서, STAT3의 활성화를 억제하는 물질은 이들 질환을 치료할 수 있는 방법의 하나임은 자명하다.

따라서, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 STAT3 매개 질환의 비제한적인 예는 관절염, 복막염, 다발성 경화증, 건선, 천식, 부종, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 기관지 경련, 알레르기, 염증성 질환, 자가면역질환, 파괴성 골질환, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 괴사성 질환 및 염증성 치주질환을 포함할 수 있다.

특히 본 발명의 DUSP5은 STAT3의 인산화 억제를 통해 활성을 억제한다는 것을 확인하였고, 이로써 본 발명은 시험관 내에서 세포에 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 DUSP5 염기서열을 포함하는 발현벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 DUSP5 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 STAT3의 활성 또는 발현을 감소시키는 방법도 제공할 수 있는 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 조성물에 함유된 유효성분인 DUSP5는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 DUSP5와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 DUSP5의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 DUSP5의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 DUSP5의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.

또한 DUSP5 단백질은 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, DUSP5 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 DUSP5 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 DUSP5 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

따라서 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 DUSP5를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 DUSP5를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있는데, DUSP5 단백질을 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

따라서 DUSP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 폴리뉴클레오티드, 즉, 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 DUSP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다. DUSP5 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

DUSP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 DUSP5 단백질을 발현하는 발현벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다. 세포내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 본 발명에 있어서 DUSP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다는 의미는, DUSP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 자체를 유효성분으로 포함하는 것과, DUSP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터를 유효성분으로 포함한다는 것을 의미한다.

또한, 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 '치료' 또는 '치료요법' 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 대상질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 대상질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 대상질환을 경감시킴.

(4) 대상질환의 재발을 예방함, 및

(5) 대상질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 DUSP5 단백질을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 DUSP5 단백질의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

Dusp5 에 의한 류마티스 관절염 치료 효과

본 발명자들은 Dusp5가 류마티스 관절염의 치료 효과가 있는지 여부를 알아보기 위하여 콜라겐으로 유도된 관절염 마우스 모델을 제조하고 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이때 실험에 사용된 각 마우스의 무게(체중)는 300g 인 마우스를 사용하였다.

<1-1> 실험동물 준비 및 관절염 지수 평가

시험동물은 6주령의 수컷 DBA/1J계 마우스를 사용하였으며, 관절염 동물모델을 제조하기 위해, 제 2형 콜라겐 (Cll) 을 4㎎/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액 (dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N Nacl) 으로 투석하여 M. 투베르쿨로시스 (tuberculosis) 를 함유하는 complete Freund's adjuvant (CFA, Chondrex) 와 동량으로 섞은 후 상기 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕ (즉 100㎕/100㎍) 으로 주사하였다. 이로부터 2주 후 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's adjuvant (IFA, Chondrex) 와 섞은 후 100㎕ (즉 100㎕/100㎍)를 한쪽 뒷다리(발바닥(foot pad))에 주사하였다.

DBA1/J 마우스에 제 2형 콜라겐을 피내 주사하여 관절염을 유도한 다음 관절염 유도 후 8일째에 Hydrodynamic injection 기법을 이용하여 DUSP5유전자를 포함하고 있는 pcDNA-DUSP5 100ug과 대조군으로 MOCK 벡터를 각각 정맥 주사하였다. 이후 관절염을 유도한 후 18주 동안 관절염 지수를 평가하였으며, 관절염 지수의 평가는 1점에서 4점까지 평가하여 그래프로 나타내었다.

-평가 기준-

0점: 부종이나 종창이 없다.

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적

2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적

3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우

마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 마우스 1 마리당 최고의 질병 지수는 16 이다.

또한, 상기 DUSP5유전자를 포함하고 있는 pcDNA-DUSP5 벡터 제조는 DUSP5 cDNA clone(진뱅크번호: NM_001085390.1)을 제한효소 HindIII과 Xho 1으로 잘라 pcDNA3.1+(Invtrogen)에 삽입하여 DUSP5 cDNA가 삽입된 재조합 벡터(pcDNA-DUSP5)를 만들고, 재조합된 벡터로 E. coli를 형질 전환시킨 다음 plasmid extraction kit(Qiagan)로 플라스미드 DNA를 분리하고, 재조합된 유전자의 염기서열을 분석하여 방향과 염기서열이 정확한 재조합 플라스미드 벡터를 선택한 다음, 이를 배양하여 다량의 플라스미드 벡터 DNA를 확보하였다.

<1-2> 관절염 파괴 억제와 염증 억제 효과 분석

상기 <1-1>의 실험에서 사용한 마우스 군을 대상으로 DUSP5가 관절 조직에서 관절의 파괴와 염증성 세포를 억제하는 효과가 있는지 확인하기 위해, 각 마우스 군을 안락사 시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린 (formalin)으로 고정하였고, 충분히 고정된 조직을 물로 세척(washing)하여 과도한 양의 고정시약을 제거하고 조직을 농도차가 있는 알코올(graded alcohol)을 이용하여 탈수시켰다. 뼈에서 석회질을 제거한 후 수분과는 혼합되지 않는 파라핀을 묻혔다. 유기 용매인 벤젠에 용해시킨 파라핀을 탈수된 조직으로 침투시킨 다음, 고온(60℃)에서 액체상태인 순수한 파라핀으로 처리하여 완전히 침투시켰다. 조직을 함유한 파라핀을 저온에서 식혀 고체상태로 만든 후 적당한 크기로 잘라서 다듬었다(trimming). 관절 절편(5㎛)을 준비하고 접착제로 처리한 유리 슬라이드에 조직을 올려놓고, 조직의 파라핀을 자일렌과 같은 유기용매로 제거하였다. 염색약은 대부분 수용액이므로 조직이 붙은 슬라이드를 고농도의 알코올에서 저농도의 알코올 수용액으로 처리하여 함수(hydration)시켰고, 헤마톡실린(hematoxylin) 수용액으로 일차염색을 한 후 에오신(eosin)으로 이차염색을 하는데 처음에는 진하게 염색한 후 알코올 용액으로 과도하게 염색된 표본의 염색정도를 적당하게 맞추는 분별(differentiation) 과정을 거쳐 염색했다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘블루(Toluidine blue)와 사프라닌 O (safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시하였다.

또한, 관절염 동물 모델의 관절 내 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 염증성 세포와 신생혈관과 관련된 인자인 VEGF 및 MMP9의 발현에 미치는 영향 분석을 위해 면역조직화학 염색방법을 수행하였는데 면역조직화학염색방법은 Vectastain ABC kit 을 사용하였다. 즉, 일차항체를 4℃ 에서 12이상 반응 시킨 후 PBS로 수세하고 바이오틴이 결합된 이차 항체 (antirabbit IgG antibody)를 20분간 반응시킨 다음 PBS로 수세한 후 과산화효소가 결합된 스트렙타아바딘 용액을 다시 20분간 반응시킨 후 수세하고 DAB chromogen 를 사용하여 발색시켰다. 메이어스 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 대조염색한 후 증류수로 수세하고 수성 접착제로 포매하여 광학현미경으로 IL-1β, IL-6, TNF-α, VEGF 및 MMP9의 발현정도를 관찰하였다. 대조군으로는 일차 항체 대신 PBS로 반응시킨 군을 사용하였다.

또한, 이러한 염증성 사이토카인 및 혈관신생인자의 발현 정도 분석은 면역조직화학 염색법 이외에도 mRNA의 발현양 분석을 진행하였는데, 상기 실험에 사용한 조적으로부터 각각 cDNA를 분리하고 하기 기재된 각 유전자의 발현 정도를 측정할 수 있는 프라이머를 사용하여 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 realtime PCR 을 이용하여 측정하였다.

프라이머 서열

프라이머명	프라이머 서열(5‘-3’)
IL-1β 정방향	GGA TGA GGA CAT GAG CAC ATT C
IL-1β 역방향	GGA AGA CAG GCT TGT GCT CTG A
IL-6 정방향	ATG CTC CCT GAA TGA TCA CC
IL-6 역방향	TTC TTT GCA AAC AGC ACA GC
TNF-α 정방향	ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC
TNF-α 역방향	TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT
VEGF 정방향	TCT TCA AGC CGT CCT GTG TG
VEGF 역방향	AGG ACC ATT TAC ACG TCT GC
MMP9 정방향	CTG TCC AGA CCA AGG GTA CAG CCT
MMP9 역방향	GAG GTA TAG TGG GAC ACA TAG TGG
β-actin 정방향	GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA G
β-actin 역방향	TGT AGT TTC ATG GAT GCC ACA G

<1-3> 염증성 자가 항체 생성의 억제 분석

관절염 생체모델에서 DUSP5에 의해 염증성 자가 항체 생성이 억제되는지 알아보기 위해, 상기 실시예에서 제조한 관절염이 유도된 마우스 군에 DUSP5가 발현되는 벡터를 주입한 후, 각 마우스로부터 혈액을 채취하고 원심분리기를 이용하여 혈청을 분리 하였으며, 혈청 내 Total IgG와 CII에 특이적인 Total IgG와 IgG2a 항체를 효소결합 면역측정법(ELISA)을 통해 수행하였다. 일반적으로 관절염이 발병되는 경우, 혈청 내 전체적인 IgG는 증가되고 IgG2a가 특이적으로 증가된다고 알려져 있다. 따라서 각 실험군의 혈청을 sandwich ELISA를 이용하여 Total IgG와 항체 특이적인 Total IgG, IgG2a, IgG1을 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 각각의 단클론성 anti-mouse IgG 와 CII로 상온에서 1시간 반응시키고 이후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. Mouse contorl serum를 1/2씩 연속 희석하여 스탠다드(standard)로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 1시간 반응하였다. 이후 anti-mouse IgG-HRP, anti-mouse IgG1-HRP, anti-mouse IgG2a-HRP 1시간 실온 반응시키고 4회 세척한 다음, TMB system으로 발색하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

<1-4> 분석 결과

상기 <1-1> 내지 <1-3>과 같은 실험을 수행한 결과, 먼저 관절염 지수 분석에서는 도 1a에 나타낸 바와 같이, DUSP5이 과발현 되는 재조합 벡터가 주사된 관절염 마우스 군에서의 관절염 지수는 MOCK 벡터를 주사한 대조군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났으며, 관절염 발병 분석 결과 역시, DUSP5이 과발현 되는 재조합 벡터가 주사된 마우스 군이 MOCK 벡터를 주사한 대조군에 비해 관절염 발병 지수가 현저히 억제되는 것으로 나타났으며, 거의 관절염이 발병되지 않는 수준의 결과를 나타내었다.

또한, Safranin O과 Toluidine blue 방법으로 분석한 관절 파괴 정도는 대조군에 비해 DUSP5이 과발현 되는 재조합 벡터가 주사된 마우스 군에서 염증 지수 및 관절파괴 지수가 현저하게 감소되는 것으로 나타났고, 이러한 감소는 대조군에 비해 약 3배 억제 효과가 있는 것으로 나타났다(도 1b 참조).

또한, 자가 항체 생성에 미치는 DUSP5의 영향을 분석한 결과, DUSP5가 주사된 마우스 군의 경우 혈청 내 면역글로블린의 양이 감소되는 것으로 나타났고, 관절염 자가 항원인 제 2형 콜라겐에 특이적인 CII-IgG, CII-IgG1 및 CII-IgG2a의 양도 현저하게 억제되는 것으로 나타났다(도 1c 참조).

나아가 DUSP5가 관절염 동물 모델의 관절 내에서 염증인자인 IL-1β, IL-6, TNF-α 과 신생혈관과 관련된 인자인 VEGF 및 MMP9의 생성에도 영향을 미치는지 분석한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, IL-1β, IL-6, TNF-α 의 염증성 사이토카인 및 VEGF 및 MMP9 모두 대조군에 비해 DUSP5가 주사된 마우스 군에서 현저하게 억제되는 효과가 있음을 알 수 있었고(도 2a 및 2b 참조), 이러한 억제는 유전자의 발현 억제로부터 이루어짐을 알 수 있었다(도 2c 참조).

따라서 이러한 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명의 DUSP5가 관절염 발생을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 관절의 파괴와 관절 내 염증성 세포의 침윤, 신생혈관 관련 인자 발현 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있으며, 염증성 항체 및 CII 항원에 특이적인 염증성 자가 항체 역시 선택적으로 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

<실시예 2>

Dusp5에 의한 Th17 및 Treg 동시조절 효과

<2-1> T 세포 분리

세포의 분리는 상기 실험에서 사용한 마우스를 대상으로 분리하였는데, CII로 1차 면역시키고 56일 후에 마우스를 치사한 후, 비장(spleen)과 림프노드(draining lymph node)의 세포와 조직을 분리하였다. 이때 실험군은 DUSP5를 발현하는 벡터를 주입한 마우스 군을 사용하였고, 대조군으로는 MOCK 벡터를 주입한 군을 사용하였다.

<2-2> 유세포 분석기를 통한 분석

상기 <2-1>에서 준비한 세포들을(비장 및 림프노드 세포) 모으고 당업계에서 사용되고 있는 유세포분석을 위한 FACs buffer로 세포들을 세척한 후, 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 15분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. Anti Foxp3-FITC와 anti IL-17 PE를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 FACs buffer로 세척한 후, 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 DUSP5 과발현에 따른 IL-17 사이토카인의 발현 및 Foxp3의 발현 정도를 분석하였다.

<2-3> 공초점 현미경 분석

또한, DUSP5 과발현에 따른 Th17 및 Treg 세포수 분석을 위해, 상기 방법으로 수득한 마우스의 비장 및 림프노드를 이용하여 동결절편(Optimal Cutting Temperature compound; O.C.T. compound)을 포매시킨 다음 액화질소에서 조직을 급속 냉각시키고, 냉동 절편기를 이용하여 7㎛ 두께로 슬라이드에 부착하였다. 이후 절편을 아세톤으로 고정 하고, 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였다. 그리고 Treg 분석에는 PBS(pH7.5)에 1:100으로 희석된 1차 항체 FITC-labeled anti-mFoxp3 Ab, PE-labeled anti-mCD4 Ab, APC-labeled anti-CD25 Ab로, Th17 세포 분석에는 FITC-labeled anti-mCD4 Ab, PE-labeled anti-mIL-17로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, 다음 날 PBS 용액으로 세척하고, 염색한 조직을 공초점 현미경으로 분석하였다.

<2-4> RT-PCR 분석

DUSP5 과발현에 따른 Th17 및 Treg의 동시 조절을 유전자 발현 수준에서 분석하기 위해, TH17 세포분화에 관련된 인자 및 Treg 세포분화에 관련된 인자의 유전자 발현 정도를 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 분석을 위한 각 세포들은 상기 유세포 분석을 위해 사용한 세포군을 사용하였고, 이들 세포군으로부터 총 RNA를 수득한 후, 하기 표의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.

프라이머 서열

프라이머명	프라이머 서열(5‘-3’)
IL-17 정방향	CCT CAA AGC TCA GCG TGT CC
IL-17 역방향	GAG CTC ACT TTT GCG CCA AG
IL-21 정방향	CCC TTG TCT GTC TGG TAG TCA TC
IL-21 역방향	ATC ACA GGA AGG GCA TTT AGC
IRF4 정방향	GCA GCT CAC TTT GGA TGA CA
IRF4 역방향	CCA AAC GTC ACA GGA CAT TG
AHR 정방향	AGC AGC TGT GTC AGA TGG TG
AHR 역방향	CTG AGC AGT CCC CTG TAA GC
RoRrt 정방향	TGT CCT GGG CTA CCC TAC TG
RoRrt 역방향	GTG CAG GAG TAG GCC ACA TT
Foxp3 정방향	GGC CCT TCT CCA GGA CAG A
Foxp3 역방향	GCT GAT CAT GGC TGG GTT GT

<2-5> 분석결과

유세포분석기를 이용한 분석 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 관절염이 유도된 마우스에 DUSP5를 주입한 군의 경우, DUSP5를 주입하지 않은 대조군에 비해 비장 및 림프노드에서 TH17 세포군의 수는 모두 감소하는 것(비장세포의 경우 4.83에서 3.10으로 감소하고, 림프노드의 경우 3.30에서 1.21로 감소)으로 나타난 반면, Foxp3가 발현되는 Treg 세포군의 수는 DUSP5을 주입한 군이 대조군에 비해 증가하는 것으로 나타났는데, 비장세포의 경우 7.76에서 11.06으로 증가하였고, 림프노드의 경우 8.43에서 11.04로 증가하는 것으로 나타났다.

또한, 공초점 현미경 분석 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 DUSP5을 주입한 실험군의 경우 IL-17+의 TH17 세포군이 2배 이상으로 감소된 것으로 나타났으며 Foxp3를 발현되는 Treg 세포군은 1.6배 증가한 것으로 나타났다.

이러한 결과는 RT-PCR 결과를 통해서도 유사하게 확인할 수 있었는데, TH17 세포분화와 관련된 인자인 IL-17, IL-21, IRF4, AHR, RORrt의 유전자 발현은 모두 DUSP5의 과발현에 의해 효과적으로 억제되는 것으로 나타났고, 반면 Foxp3의 발현은 증가하는 것으로 나타났다(도 3c 참조).

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 토대로, 본 발명의 DUSP5는 TH17 세포의 분화 및 활성은 억제하면서 동시에 Treg 세포의 분화 및 활성은 촉진시키는 작용을 갖는다는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 작용은 TH17/Treg 세포분화와 관련된 유전자의 발현 조절을 통해 이루어진다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3>

In vitro에서 Dusp5의 ERK, Th17 및 Treg 조절에 미치는 영향분석

앞서 기술한 실시예 2의 내용은 질병 마우스 모델 내에 DUSP5 발현벡터를 주입하여 마우스 내에서 TH17/Treg 세포분화에 미치는 영향을 살펴보았다면 하기 실험에서는 이러한 활성을 in vitro 실험을 통해 재입증하였다.

이를 위해 먼저 비장(spleen)과 림프노드(draining lymph node)의 세포로부터 CD4⁺T 세포 분리는 비장(spleen)과 림프노드(draining lymph node) 세포를 CD4 코팅된 마이크로비드와 4℃에서 15분 동안 반응시켰고, MACs 버퍼로 세척한 뒤, CD4⁺T세포를 분리하였다. 분리된 CD4⁺T세포는 PBS로 세척하였고 55℃에서 30분 동안 불활성화된 10% 우태아 혈청, 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 g/mL)이 포함된 세포 배양액 (RPMI1640 배지, Gibco BRL, USA)에서 배양하였다. 이후, 분리된 CD4⁺T세포로부터 Th 17 세포로의 분화를 위해, 세포 1× 10⁶에 대하여 anti-CD3 항체가 1μg/mL로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/mL, TGF-β 2ng/ml, IL-6 20ng/ml, anti-IL-4 10ng/ml, anti-IFNr 10ng/ml를 동시에 함께 처리한 후, 3일 동안 세포를 배양하여 Th17세포로 분화를 유도하였다.

<3-1> RT-PCR을 이용한 분석방법

In vitro 실험을 위한 세포는 상기 CII로 1차 면역시킨 후 35일된 마우스의 비장으로부터 CD4 T세포를 분리하였고, 분리한 세포를 대상으로 pcDNA-DUSP5 또는 MOCK 벡터로 형질도입시킨 후, 4시간 뒤 이들 세포를 Th17분화 조건인 anti-CD28 항체 1μg/mL, TGF-β 2ng/ml, IL-6 20ng/ml, anti-IL-4 10μg/ml, anti-IFNr 10μg/ml를 세포에 처리하고 20시간 배양한 다음, 세포들을 수집하고 앞서 기술한 방법인 RT-PCR 방법을 수행하여 Th17분화 조건하에서 DUSP5 과발현에 따른 IL-17, Foxp3 및 ERK2의 mRNA 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, DUSP5를 과발현시킨 경우, IL-17 및 ERK2의 발현은 감소되는 것으로 나타난 반면, Foxp3의 발현은 현저하게 증가하는 것으로 나타났다.

<3-2> ELISA를 이용한 분석방법

또한 본 발명자들은 in vitro에서 DUSP5에 의해 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는지 확인하기 위하여, 상기 <3-1>에서 사용한 세포들의 배양 상층액을 수집하고 상층액을 단클론성 항-IL-17, 항-TNF-a 및 항-IL-21를 각각 2μg/mL으로 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후, biotinylated 항-IL-17, 항-TNF-a 및 항-IL-21을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-a 및 IL-21 모두 DUSP5에 의해 생성이 억제되는 것으로 나타났고, 특히 IL-17은 그 억제효과가 탁월한 것으로 나타났다.

<3-3> siRNA 처리의 의한 IL-17, ERK2 및 Foxp3 발현변화 분석

앞서 <3-1>에서는 DUSP5의 과발현에 따른 IL-17, ERK2 및 Foxp3 발현변화를 분석하였는데, 이번엔 <3-1>에서 비장으로부터 분리한 CD4 T세포를 대상으로 DUSP5에 대한 siRNA(Dharmacon, DUSP5 siGENOME SMARTpool (M-057231-01-0010), 19 and siGENOME non-targeting siRNA pool (D-001810-01-20))를 처리하여 세포 내에서 DUSP5의 발현이 억제되도록 하였다. siRNA 처리 후 4시간 배양한 다음, 이들 세포를 상기 <3-1>의 Th17분화 조건에서 20시간 동안 배양하고 세포들을 수집하여 앞서 기술한 방법인 RT-PCR 방법을 수행하여 IL-17, Foxp3 및 ERK2의 mRNA 수준을 분석하였다.

분석 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, DUSP5의 발현이 억제된 상태에서 Th17로 분화된 세포 내에서는 Foxp3의 발현은 현저히 억제된 것으로 나타났고, IL-17 및 ERK2의 mRNA 수준은 증가한 것으로 나타났다.

<3-4> siRNA 처리에 의한 염증성 사이토카인의 발현변화 분석

상기 <3-3>에서 사용한 각 실험 세포군의 세포 배양액을 수집하고 <3-2>에 기술된 ELISA 분석방법을 사용하여 DUSP5의 발현이 억제된 상태에서의 IL-17, TNF-a 및 IL-21의 생성 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, DUSP5의 발현이 억제되는 경우 Th17로 분화된 세포 내에서는 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-a 및 IL-21의 생성이 모두 증가하는 것으로 나타났다.

<실시예 4>

Dusp5의 STAT3 및 STAT5에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 본 발명의 DUSP5가 STAT3 및 STAT5의 활성에도 영향을 미치는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 상기 실시예 1에서 CII로 1차 면역시키고 DUSP5 발현벡터를 주입한 군과 MOCK 벡터를 주입한 마우스를 각각 치사시키고, 비장을 분리한 후, 조직 내에서 DUSP5에 의한 STAT3 및 STAT5의 인산화 정도를 공초점 현미경 분석 및 웨스턴 블럿을 통해 관찰하였다.

먼저 공초점 현미경 분석을 위해 상기 <2-3>에서 사용한 방법과 같이, 마우스의 관절을 분리하고 동결절편(Optimal Cutting Temperature compound; O.C.T. compound)으로 제조한 후, 이를 포매시킨 다음 액화질소에서 조직을 급속 냉각시키고, 냉동 절편기를 이용하여 7㎛ 두께로 슬라이드에 부착하였다. 이후 절편을 아세톤으로 고정 하고, 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였다. 그리고 인산화된 STAT3 및 STAT5를 검출하기 위해 PE-표지된 anti-STAT3 Tyr 705(pSTAT3 ^{Tyr 705}), PE-표지된 anti-STAT3 Ser 727(pSTAT3 ^{Ser 727}) 및 anti-STAT5 Tyr 694(pSTAT3^{Tyr 694})로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, 다음 날 PBS 용액으로 세척하고, 염색한 조직을 공초점 현미경으로 분석하였다. 또한 동일 방법으로 ERK의 활성화 정도를 분석하기 위해 PE-표지된 anti-ERK 항체를 사용하여 상기와 같은 실험을 수행하였다.

또한, 이러한 결과를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였는데 통상적인 웨스턴 블럿 방법을 사용하여 분석하였는데, 이때 각 항체는 pSTAT3 ^{Tyr 705}(1:200),pSTAT3 ^{Ser 727}(1:200) 및 pSTAT5^{Tyr 694}(1:200)를 Cell signaling사로부터 구입하여 사용하였다.

분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, DUSP5를 주입한 군의 경우 주입하지 않은 대조군에 비해 CD4+pSTAT3(Tyr705)+ T 세포 및 CD4+pSTAT3(Ser727)+ T 세포수는 감소하는 것으로 나타난 반면 CD4+pSTAT5(Tyr694)+ T세포는 증가하는 것으로 나타났다(도 5a). 이러한 결과는 웨스턴 블럿 결과를 통해서도 동일한 경향을 보였는데, DUSP5에 의해 STAT3의 인산화는 감소된 것으로 나타났고, STAT3의 인산화는 증가하는 것으로 나타났다(도 5b 참조).

또한, 도 5c의 결과를 통해 본 발명의 DUSP5는 CD4+ERK+ 세포수는 감소시키고 ERK의 인산화 역시 감소시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 DUSP5이 STAT3 및 STAT5의 활성에도 영향을 미친다는 것을 알 수 있었고, STAT3 및 STAT5의 활성 조절을 통해 DUSP5이 TH17 및 Treg의 분화에 영향을 준다는 것을 알 수 있었으며 특히 DUSP5에 의한 STAT3 및 STAT5의 활성은 서로 상반되는 결과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

이로써 본 발명자들은 질환이 유발된 마우스 모델을 대상으로 한 상기의 분석 결과로, DUSP5는 TH17/Treg 세포를 조절하는 전사인자 및 ERK의 활성을 조절하여 TH17/Treg를 동시 조절할 수 있다는 것을 확인하였다.

< 실시예 5>

Dusp5 의 파골세포 분화 억제효과

<5-1> RANKL , RANK , NFATc1 및 TRAP 분석

상기 실시예 1에서 CII로 1차 면역시키고 DUSP5 발현벡터를 주입한 다음 56일 후 마우스를 치사시켜 관절조직 및 마우스의 골수세포를 얻었다. 이때 대조군으로는 DUSP5 발현벡터 대신 MOCK 벡터를 주입한 군을 사용하였다. 수득한 관절조직을 대상으로는 파골세포를 유도하는 RANKL, RANK, NFATc1 의 발현정도를 확인하기 위하여 면역조직화학 염색방법으로 측정하였다. 이를 위하여 Vectastain ABC kit 을 사용하였고 일차항체(RANKL, RANK, NFATc1에 대한 항체)를 4℃에서 12시간 이상 반응 시킨 후 PBS로 세척하고 바이오틴이 결합된 대한 이차 항체 (antirabbit IgG antibody)를 20분간 반응시킨 다음, PBS로 수세한 후 과산화효소가 결합된 스트렙타아비딘(streptavidin) 용액을 다시 20분간 반응시키고 다시 세척한 다음, DAB chromogen 를 사용하여 발색시켰다.

그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서의 관절은 파골세포의 표지자인 RANKL, RANK, NFATc1의 발현이 증가되어 있는 것으로 나타난 반면, DUSP5을 주입한 마우스의 관절에서는 이러한 파골세포 표지자들의 발현이 현저하게 감소된 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 상기 실험에 사용한 마우스 군으로부터 골수세포를 수득하고 상기 골수세포로부터 단핵구를 수득한 다음, DUSP5 벡터를 주입한 동물모델의 골수를 RANKL(50ng/ml)과 M-CSF(10ng/ml) 자극한 다음 파골세포 인자인 TRAP 양성 세포를 commercial kit을 사용하여 TRAP 염색하여 관찰하였다.

분석 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, DUSP5를 처리한 군의 경우, 처리하지 않은 군에 비해 TRAP의 양성 표지세포수 및 TRAP의 발현 정도가 감소한 것으로 나타났다.

<5-2> In vitro 에서 DUSP5 에 의한 파골세포분화 억제효과 분석

또한, 본 발명자들은 상기 <5-1>의 실험을 통해 본 발명의 DUSP5가 파골세포 분화를 억제하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 이에 in vitro 실험을 통해 다음과 같이 파골세포 분화 억제 활성을 확인하였는데, 즉 이를 위해 RAW264.7 세포주를 대상으로 RANKL(50ng/ml)로 세포를 자극시킨 후, 자극된 세포를 대상으로 각각 pcDNA-DUSP5 벡터 및 MOCK 벡터(대조군)를 주입하고, 또한 자극된 세포를 대상으로 각각 DUSP5에 대한 siRNA 및 scrambled siRNA(대조군)를 처리한 다음, 72시간 동안 이들 세포주를 배양하였다. 이후 DUSP5, Cathepsin K, integrin beta3, RANK 및 TRAP의 유전자 발현 정도를 RT-PCR을 통해 분석하였다.

프라이머 서열

프라이머명	프라이머 서열(5‘-3’)
Cathepsin K 정방향	CAG CAG AGG TGT GTA CTA TG
Cathepsin K 역방향	GCG TTG TTC TTA CGA GC
Integrin-β 정방향	CTG TGG GCT TTA AGG ACA GC
Integrin-β 역방향	GAG GGT CGG TAA TCC TCC TC
RANK 정방향	CGA GGA AGA TTC CCA CAG AG
RANK 역방향	CAG TGA AGT CAC AGC CCT CA
TRAP 정방향	TCC TGG CTC AAA AAG CAG TT
TRAP 역방향	ACA TAG CCC ACA CCG TTC TC

분석 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, DUSP5에 대한 siRNA를 처리하여 세포 내에서 DUSP5의 발현을 억제한 경우, 파골세포 인자인 Cathepsin K, integrin beta3, RANK 및 TRAP의 유전자 발현은 증가하는 것으로 나타난 반면, RAW264.7 세포에 DUSP5을 과발현 시킨 경우, 이들 파골세포의 인자들은 모두 발현이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명자들은 본 발명의 DUSP5이 파골세포의 분화를 효과적으로 억제할 수 있어 파골세포 분화로 인한 골질환의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for preventing or treating metabolic bone disease comprising DUSP5 as active ingredients <130> pn1407-198 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 384 <212> PRT <213> dual specificity protein phosphatase 5_amino acid sequence <400> 1 Met Lys Val Thr Ser Leu Asp Gly Arg Gln Leu Arg Lys Met Leu Arg 1 5 10 15 Lys Glu Ala Ala Ala Arg Cys Val Val Leu Asp Cys Arg Pro Tyr Leu 20 25 30 Ala Phe Ala Ala Ser Asn Val Arg Gly Ser Leu Asn Val Asn Leu Asn 35 40 45 Ser Val Val Leu Arg Arg Ala Arg Gly Gly Ala Val Ser Ala Arg Tyr 50 55 60 Val Leu Pro Asp Glu Ala Ala Arg Ala Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Val Ala Ala Val Val Val Leu Asp Gln Gly Ser Arg His Trp 85 90 95 Gln Lys Leu Arg Glu Glu Ser Ala Ala Arg Val Val Leu Thr Ser Leu 100 105 110 Leu Ala Cys Leu Pro Ala Gly Pro Arg Val Tyr Phe Leu Lys Gly Gly 115 120 125 Tyr Glu Thr Phe Tyr Ser Glu Tyr Pro Glu Cys Cys Val Asp Val Lys 130 135 140 Pro Ile Ser Gln Glu Lys Ile Glu Ser Glu Arg Ala Leu Ile Ser Gln 145 150 155 160 Cys Gly Lys Pro Val Val Asn Val Ser Tyr Arg Pro Ala Tyr Asp Gln 165 170 175 Gly Gly Pro Val Glu Ile Leu Pro Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr 180 185 190 His Ala Ser Lys Cys Glu Phe Leu Ala Asn Leu His Ile Thr Ala Leu 195 200 205 Leu Asn Val Ser Arg Arg Thr Ser Glu Ala Cys Ala Thr His Leu His 210 215 220 Tyr Lys Trp Ile Pro Val Glu Asp Ser His Thr Ala Asp Ile Ser Ser 225 230 235 240 His Phe Gln Glu Ala Ile Asp Phe Ile Asp Cys Val Arg Glu Lys Gly 245 250 255 Gly Lys Val Leu Val His Cys Glu Ala Gly Ile Ser Arg Ser Pro Thr 260 265 270 Ile Cys Met Ala Tyr Leu Met Lys Thr Lys Gln Phe Arg Leu Lys Glu 275 280 285 Ala Phe Asp Tyr Ile Lys Gln Arg Arg Ser Met Val Ser Pro Asn Phe 290 295 300 Gly Phe Met Gly Gln Leu Leu Gln Tyr Glu Ser Glu Ile Leu Pro Ser 305 310 315 320 Thr Pro Asn Pro Gln Pro Pro Ser Cys Gln Gly Glu Ala Ala Gly Ser 325 330 335 Ser Leu Ile Gly His Leu Gln Thr Leu Ser Pro Asp Met Gln Gly Ala 340 345 350 Tyr Cys Thr Phe Pro Ala Ser Val Leu Ala Pro Val Pro Thr His Ser 355 360 365 Thr Val Ser Glu Leu Ser Arg Ser Pro Val Ala Thr Ala Thr Ser Cys 370 375 380 <210> 2 <211> 1179 <212> DNA <213> dual specificity protein phosphatase 5 DNA sequence <400> 2 gaattcaagc ttatgaaggt cacgtcgctc gacgggcgcc agctgcgcaa gatgctccgc 60 aaggaggcgg aggcgcgctg cgtggtgctc gactgccggc cctacctggc cttcgccgcg 120 tcgagcgtgc gcggctcgct caacgtcaac ctcaactcgg tggtgctgcg gcgggcccgg 180 ggcggcgcgg tgtcggcgcg ctacgtgctg cccgacgagg cggcccgcgc tcggctgctg 240 caggagggcg gcggcggtgt ggcggcggtg gtcgtgctgg accagggtag ccgccactgg 300 cagaagctgc gggaggagag cgccgcgcgc gtcgtgctca cctcgctgct ggcctgcctg 360 cccgccggcc cgcgggtcta cttccttaaa ggggggtatg agaccttcta ctcacagtat 420 cctgagtgct gtgtggatgt gaagcccacc tcacaagaga agatcgaagg cgagagaagc 480 ctcctcagcc agtgtggaaa gcccgttctc agcgtcgcct acagaccagc ctatgaccag 540 ggtggcccgg ttgaaatcct tcccttcctc taccttggaa gtgcctacca cgcatccaag 600 tgcgagttcc tcgccaacct gcacatcaca gccctgctga atgtttcccg ccggacctcc 660 gaggcctgca ccacccacct acactacaag tggatccccg tggaggacag ccacactgct 720 gacattagct cccactttca agaagcaata gattttattg actgtgtcag ggaagaagga 780 ggcaaggtcc tggtccactg cgaagctggg gtttcccggt cgcccaccat ctgcatggct 840 tacctcatga agaccaagca gttccggctg aaggaggcct tcgattacgt caagcagagg 900 aggagcgtgg tctctcccaa ctttggcttc atgggacagc tccttcagta tgaatctgag 960 atcctgccct ccacacccac cctccagccg ccctcctgcc aaggggaggc agccagctcc 1020 acgtttatag gccatttaca gacactgagc cctgatatgc agggcaccta ctgcacattc 1080 cgtacctcag tgctggcacc ggtgcccacc cactccacag tcccagagct ccacaggagc 1140 cccgtggcca cagccacatc ctgctgatct agactcgag 1179

Claims

DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DUSP5는 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
DUSP5의 펩타이드는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되어 있는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DUSP5는 RANKL, RANK, NFATc1 및 TRAP의 발현 또는 활성을 억제하여 파골세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 DUSP5는 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DUSP5는 STAT3의 인산화를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DUSP5는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 DUSP5 염기서열을 포함하는 발현벡터의 형태로 상기 조성물에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
DUSP5를 유효성분으로 모두 포함하는 STAT3 매개로 의해 유발된 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제9항에 있어서,
상기 DUSP5는 STAT3의 인산화를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 STAT3 매개로 의해 유발된 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 DUSP5는 서열번호 1의 펩타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 STAT3 매개로 의해 유발된 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 DUSP5의 펩타이드는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되어 있는 것을 특징으로 하는 STAT3 매개로 의해 유발된 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 DUSP5는 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 STAT3 매개로 의해 유발된 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
시험관 내에서 세포에 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열번호 2의 DUSP5 염기서열을 포함하는 발현벡터로 상기 세포를 형질전환시켜 DUSP5 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 STAT3의 활성 또는 발현을 감소시키는 방법.