KR101969513B1 - 중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유의하게 통과시킬 수 없었던 중추신경계의 뇌-혈관 장벽 및 척수-혈관 장벽을 우수한 효율로 투과할 수 있는 기능을 가져, 낮은 함량을 투여하여 신속하고 빠르며, 보다 효율적인 치료효과를 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 종래 치료제들에 비해 국소적 투여를 간행할 수 있으므로 부작용이 감소되고, 치료제의 국소적 고농도 투여가 가능하므로, 잠재적 새로운 치료 및 처방이 가능하다.

Description

중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Peptides associated with central nervous system diseases, Phamaceutical composition comprising the same as an active ingredient for prevention or treatment of central nervous system diseases}
본 발명은 중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)의 보호성 환경을 가로지르는 미엘린-특이적 T 세포들에 의해서 중추신경계(CNS)에서의 염증 유도에 의해서 야기되는 인간 자가면역 질환이다. MS에 대한 마우스 모델로서, MOG35-55면역화에 이어서 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 17(Th17) 세포들을 발현하는 인터페론-γ(IFN-γ) 또는 인터루킨-17A(IL-17A)에 의해서 유도되는 실험적 자가면역 뇌척수염(encephalomyelitis, EAE)이 광범위하게 연구된 바 있다. Th1 및 Th17 세포들은 뇌 및 척수를 포함하는 중추신경계, 또한 이러한 세포들의 높은 수준에서 염증 및 신경 세포 괴사를 유도한다.
비록 이러한 효과기 세포들이 잠재적인 치료 표적이 될 수 있지만, BBB 및 혈액-척수 장벽(blood-spinal cord barrier, BSCB)에 의해 수많은 치료 생분자들이 중추신경계로 전달되지 못하였기 때문에, 그 치료효과를 나타내기 전에 좌절되어야만 했다(비특허문헌 1, 2).
이를 극복하기 위한 다양한 방법들이 개발되었으나, 개발된 치료 생분자들은 합성 화합물 또는 다른 유기체로부터 유래된 것들이고, 장기 독성 또는 다른 부작용을 가지고 있을 뿐만 아니라, 여전히 BBB 및 BSCB에 의해 침투가 제한되어 충분한 치료 효과를 나타내지 못하는 문제가 존재했다.
일예로 종래 혈액-뇌 장벽에 대한 투과도를 증가시키기 위한 펩타이드 기반의 투과제 또는 약물 전달체에 관한 특허문헌들도 보고된 바 있으며, 예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-0242597호에서는 아미노산 서열이 NH2-아르기닌-프롤린-히드록시프롤린-글리신-티에닐알라닌-세린-프롤린-4-Me-티로신ψ(CH2NH)-아르기닌-COOH인 펩타이드 또는 소정 변형을 갖는 그 구조적 유사체를 포함하는 혈액-뇌 장벽 투과제를 개시하고 있으며(특허문헌 1), 또한 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0026372호에서는 소정 서열목록으로 표시되는 아미노산 서열로서 혈액-뇌 장벽 투과 기능을 보유한 아미노산 서열을 개시하고 있다(특허문헌 2).
특허문헌 1 : 대한민국 등록특허공보 제10-0242597호 특허문헌 2 : 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0026372호
비특허문헌 1: Wingerchuk, D. M. & Carter, J. L. Multiple sclerosis: current and emerging disease-modifying therapies and treatment strategies. Mayo Clinic proceedings 89, 225-240, doi:10.1016/j.mayocp.2013.11.002 (2014) 비특허문헌 2 : Tavazzi, E., Rovaris, M. & La Mantia, L. Drug therapy for multiple sclerosis. CMAJ : Canadian Medical Association journal = journal de l'Association medicale canadienne 186, 833-840, doi:10.1503/cmaj.130727 (2014).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 혈액-뇌 장벽 또는 혈액-척수 장벽에 대해 전달 효율이 뛰어남과 동시에, 우수한 IL-2의 억제활성을 갖고 있는 펩타이드, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이를 이용한 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 2 또는 서열번호 3로 표시되는 CTLA-4 단백질의 세포질 영역의 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드를 포함하는 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
상기 융합펩타이드는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 그 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합체를 제공한다.
상기 단편은 서열번호 2 또는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 융합펩타이드는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 tat(47-57), D-아미노산 치환된 HIV-1 tat(47-57), 아르기닌 치환된 HIV-1 tat(47-57), 드로소필라 안테나피디아(Drosophila Antennapaedia)(43-58), 7 개 이상의 아미노산을 포함하는 바이러스 RNA 결합 펩티드, 7개 이상의 아르기닌을 포함하는 DNA 결합 펩티드, 6 내지 8개 아르기닌을 갖는 폴리아르기닌 폴리펩티드, 7 내지 11개의 라이신을 갖는 폴리라이신 폴리펩티드, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 dNP2 단백질, Hph-1(서열번호 6), Transportan(서열번호 8), Pep-1(서열번호 9), pVEC(서열번호 10), M918(서열번호 11), TP10(서열번호 12), VP22(서열번호 13), Buforin 2(서열번호 14), KALA(서열번호 15), CL22(서열번호 16) 및 Crotamine(서열번호 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것일 수 있다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 dNP2 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 그 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합체를 코팅하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 그 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합체를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 융합체에서 세포 투과성 펩타이드는 혈액-뇌 장벽 또는 혈액-척수 장벽 투과활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 중추신경계 질환은 척수손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 알츠하이머병, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 중추신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하여, 인간을 제외한 동물의 중추신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 유의하게 통과시킬 수 없었던 중추신경계의 혈액-뇌 장벽 및 혈액-척수 장벽을 우수한 효율로 투과할 수 있는 기능과 동시에 IL-2 억제 활성을 가져, 낮은 함량을 투여하여 신속하고 빠르며, 보다 효율적인 치료효과를 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 종래 치료제들에 비해 국소적 투여를 간행할 수 있으므로 부작용이 감소되고, 치료제의 국소적 고농도 투여가 가능하므로, 잠재적 새로운 치료 및 처방이 가능하다.
도 1a는 본 발명에 따른 CTLA-4 단백질의 세포질 영역의 단편에 대한 동정 결과와 변이 부분을 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명에 따른 인간-유래 세포 투과성 펩타이드인 dNP2의 동정 결과에 관한 도면이다.
도 2는 본 발명의 dNP2-ctCTLA-4 융합단백질의 구조와 dNP2-ctCTLA-4 융합단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 ctCTLA-4 펩타이드와 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 융합체의 세포내 전달 효율을 조사하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 1 μM PBS, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 TAT-ctCTLA-4 융합체의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 5a 및 도 5b는 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 6a dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 IFN-γ 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 6b는 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 IL-17A 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 7은 실험예 3의 1)의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 8은 실험예 3의 2)의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 9는 실험예 3의 3)으로부터의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 10은 실험예 3의 4)로부터의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 11은 EAE 유도된 동물모델에서 탈미엘리네이션(demyelination) 및 면역세포 침윤에 대한 본 발명의 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 효과를 룩솔페스트블루(LFB, luxol fast blue) 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 사진이다. 스케일바는 100 ㎛이다.
도 12는 도 11에서 측정된 각 처리군에 따른 척수 조직의 침윤된 면역세포들의 개수를 Image J software 1.48v를 통해서 계수하여 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 13은 본 발명의 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 Th1, Th17, Th2 및 Treg 세포(T 세포)로 처리된 EAE 동물모델에서 척수 세포를 분리한 다음, IL-17A 및/또는 IFN-γ 발현 CD4 T 세포들을 유세포 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 도 13의 결과를 분석하여 그래프로 나타낸 것으로, 척수로부터 단일 세포가 현탁된 분획에서 절대 세포 숫자들을 계수하였으며, 이를 곱함으로써 총 CD4+세포들(a), IFNγ+CD4+세포들(b), IL-17A+CD4+세포들(c) 및 IFNγ+IL-17A+CD4+세포들(d)의 비율을 측정하여, 데이터를 막대 그래프로 표시한 것이다(n=15). 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 15는 0.5, 1, 2 또는 5 μM WT, 1YF, 2YF, DYF의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 16은 아무것도 첨가하지 않고 PBS만 처리한 일차 마우스 CD4-T 세포들에서의 도입 효율을 측정한 그래프이다.
도 17은 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM dNP2-TAMRA, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 세포내 전달 효율을 조사하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM dNP2-TAMRA 융합체, dNP2-CTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
중추신경계(CNS)-침윤성 효과기 T 세포들은 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)의 발병 및 진전에 중추적인 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 허나, 이러한 MS와 관련된 약물들은 현재까지 매우 제한적이다. 왜냐하면 이들 약물들이 CNS로 전달함으로써 침윤성 T 세포들을 조절하는 것이 매우 어렵기 때문이다.
이에 본 발명에서는 상술한 종래 약물들이 가지고 있던 문제점을 극복함과 동시에 조밀하게 조직된 뇌-혈액 장벽 또는 뇌-척수 장벽의 투과성이 우수하면서도 중추신경계 질환과 관련된 새로운 단백질을 개발하고자 노력한 바, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 특징은 세포 내로의 도입이 용이하지 않은 뇌 혈액 또는 척수 혈액에 투과성이 우수하면서도, T 세포(특히 Th17)의 활성을 감소시키므로 자가면역으로 인한 질환의 원인을 감소시킴으로써, 중추신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 단백질을 개발하였다.
본 발명에서 사용된 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는 인간 또는 마우스로부터 얻은 전장 CTLA-4 단백질의 엑속 4 중 일부만을 암호화한 것으로, CTLA-4 단백질 중에서 세포질 도메인으로부터 유래된 서열이다. 인간과 마우스의 CTLA-4 단백질의 아미노산 서열 중에서 서로 100% 일치하는 부분의 아미노산 서열이다. 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 가능성이 낮다.
상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는 CTLA-4 단백질에서 IL-2 발현 억제 활성을 나타내는 CTLA-4의 단편으로, 중추신경계 즉, 뇌-혈관 장벽 또는 척수-혈관 장벽을 고효율로 투과할 수 있는 효과를 더 나타내고 있으며, 인간과 인간을 제외한 동물(마우스)에서 100% 동일한 아미노산 서열을 가지고 있는 단편을 사용함으로써, 이들 모두에 적용할 수 있다.
구체적으로 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는 세포독성 T 림프구 항원 제4형(CTLA-4) 단백질의 188 번째 아미노산 잔기에서부터 213 번째 아미노산 서열까지를 포함하는(서열번호 1) 것으로, 이하에서 'ctCTLA-4' 라고도 한다. 뇌-혈관 장벽 또는 척수-혈관 장벽의 투과성과 예방 또는 치료 효과를 부여하기 위하여 N-말단과 C 말단을 부분적으로 결실된 형태의 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 2 또는 서열번호 3로 표시되는 CTLA-4 단백질의 세포질 영역의 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드를 포함하는 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드에 관한 것이다.
상기 ctCTLA-4 단백질의 단편은 ctCTLA-4 단백질의 201 번째 아미노산 잔기에서부터 210 번째 아미노산 서열까지를 포함하거나(서열번호 2), 218 번째 아미노산 잔기에서부터 223 번째 아미노산 서열까지(서열번호 3)를 포함하는 것으로, 뇌-혈관 장벽 또는 척수-혈관 장벽의 투과성과 예방 또는 치료 효과를 갖는, N-말단과 C 말단을 부분적으로 결실된 형태의 상기 폴리펩티드의 단편일 수도 있다.
상기 융합펩타이드는 서열번호 2 및 서열번호 3이 결합되어 있는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로, 혹시 발생할 수 있는 생물학적 간섭을 최소화하는 장점을 갖는다.
상기 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는 천연에서 추출하거나 합성하거나 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
아래 다양한 실험결과들을 통해 ctCTLA-4 펩타이드가 중추신경계 즉, 뇌-혈관 장벽 또는 척수-혈관 장벽을 고효율로 투과할 수 있을 뿐 아니라, 중추신경계 질환을 야기하는 T 세포(특히 Th17)의 활성을 감소시키는 효과를 갖고 있음을 확인하였다.
다시 말해 상기 CTLA-4 단백질로부터 유래된 상기 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는, 중추신경계로의 이동, 혈액-뇌 장벽 및 혈액-척수 장벽의 투과를 향상시키고, 다발성 경화증 동물모델에 우수한 T 세포를 억제하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 그 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하는 융합체에 관한 것이다.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 그 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드는 상술한 설명과 동일하므로, 여기서는 생략하도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 그 단편 또는 그 단편들의 융합펩타이드의 일측 또는 양측 말단에 세포 투과성 펩타이드를 더 포함함으로써, 중추신경계 혈관 내로의 투과성을 보다 향상시킬 수 있으며, 이러한 융합체는 '융합 단백질'이라고도 할 수 있다.
상기 융합체는 활성화된 T 세포들에서 음으로 사이토카인 생산을 조절하였으며, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서도, 예방적 및 치료적 모델들 모두에서 저해 효과를 나타내었는 바, 탈미엘리네이션 (demyelination) 및 CNS-침윤성 T 헬퍼 1 (Th1) 및 T 헬퍼 17(Th17) 세포들의 감소를 야기하였다.
본 발명에서 "융합체" 또는 "융합 단백질"이란 ctCTLA-4 펩타이드, 또는 그 단편 또는 융합펩타이드와 세포 투과성 펩타이드를 포함하며, 이들의 유전적 융합이나 화학적 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 tat(47-57), D-아미노산 치환된 HIV-1 tat(47-57), 아르기닌 치환된 HIV-1 tat(47-57), 드로소필라 안테나피디아(Drosophila Antennapaedia)(43-58), 7 개 이상의 아미노산을 포함하는 바이러스 RNA 결합 펩티드, 7개 이상의 아르기닌을 포함하는 DNA 결합 펩티드, 6 내지 8개 아르기닌을 갖는 폴리아르기닌 폴리펩티드, 7 내지 11개의 라이신을 갖는 폴리라이신 폴리펩티드, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 dNP2 단백질, Hph-1(서열번호 6), Transportan(서열번호 8), Pep-1(서열번호 9), pVEC(서열번호 10), M918(서열번호 11), TP10(서열번호 12), VP22(서열번호 13), Buforin 2(서열번호 14), KALA(서열번호 15), CL22(서열번호 16) 및 Crotamine(서열번호 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것일 수 있다.
대부분의 세포 투과성 펩타이드들은 다양한 세포주에 대해 인비트로 투과 효율이 높은 것으로 알려져 있고, 여기에 카고 단백질을 결합하면, 세포 투과성이 상승될 것이라 예측할 수 있다. 허나 일반적으로 일차 세포(primary cells)에 대해서 상기 세포 투과성 펩타이드들은 오히려 투과 효율이 훨씬 낮음이 확인되어 왔고, 이로 인해 상기 세포 투과성 펩타이드들이 인간에서의 임상적인 응용에 커다란 제한을 받아 왔다(Simon, M. J., Gao, S., Kang, W. H., Banta, S. & Morrison, B., 3rd. TAT-mediated intracellular protein delivery to primary brain cells is dependent on glycosaminoglycan expression. Biotechnology and bioengineering 104, 10-19, doi:10.1002/bit.22377 (2009)). 헌데 본 발명에서는 중추신경계 특히 뇌-혈관 장벽 또는 척수-혈관 장벽 투과성을 갖는 ctCTLA-4 단백질 또는 이의 단편에 세포 투과성 펩타이드을 결합함으로써, 종래에는 예측할 수 없었던 인간에서의 임상적인 응용 효과가 현저히 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 상기 세포 투과성 펩타이드가 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 dNP2 단백질일 때, 뇌-혈관 장벽 또는 척수-혈관 장벽에 대한 투과활성이 현저히 상승하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합체를 코팅하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다. 또는 상기 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드를 코딩하는 유전자와 상기 세포 투과성 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터일 수 있다.
상기 재조합 발현벡터는 상기 세포 투과성 펩타이드와 상기 IL-2 억제활성을 갖는 펩타이드의 서열(서열번호 1, 2, 3 또는 4) 및 상기 융합체의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 재조합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 또한 상기 재조합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 융합체는, 이를 유효성분으로 하여 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있다. 이는 중추신경계 염증성 질환들을 치료하는데 효과적인 치료제가 될 수 있다.
상기 중추신경계 질환은 척수손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 알츠하이머병, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
당해 기술분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1 일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하여, 인간을 제외한 동물의 중추신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 약학 조성물을 생체 또는 세포 내 주입은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육 내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막 내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 수행될 수 있다. 상기 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비면역원성, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노 바이러스와 같은 벡터 유기체에 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서 어떤 실용적인크기의 재조합 유전자 발현 구조물에도 사용될 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
<실험방법>
1) 세포주 및 세포 배양
Jurkat(인간 백혈병 세포들) 세포들을 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구입하였으며, 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제들로 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지 중에 보관하였다. HeLa(인간 자궁경부암 세포) 세포들은 ATCC로부터 구입하였으며, 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제들로 보충된, GlutaMAX를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's media(DMEM) 중에서 배양하였다. 모든 세포들은 5% 이산화탄소 배양기 중에서 37 ℃로 보관하였다. 전술한 모든 시약들은 Thermo Scientific Hyclon으로부터 구입하였다.
2) 마우스
6주 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 Orient Bio (Daejeon, Korea)로부터 구입하였다. 마우스들은 한양대학교 내의 특수 무균 시설에서 사육 및 보관하였으며, 시설 조건은 일정 온도(21 ± 1 ℃), 습도(50 ± 5%), 및 12 시간 명/암 사이클을 유지하고, 정기적으로 식사 및 멸균수를 제공하였다. 본 발명에서 사용된 모든 동물 프로토콜은 한양대학교 동물 관리 및 사용 위원회에 의해서 허가를 받았다.
3) 인 비트로 전달 효율
Jurkat T 세포들을 RPMI 1640 배지 중에서 웰 당 5.0 × 105세포들의 농도로 24-웰 플레이트 중에서 배양하였다. 세포들을 접종한 이후에, 각 단백질을 표시된 시간들에서 첨가하였다. 배양 이후에, 세포들을 회수하였으며, 인산-완충 식염수(PBS)로 3회 세척하였다. 세포내 형광을, fluorescence-activated cell sorting(FACS) Canto II flow cytometer(BD Bioscience) 상에서 분석하였으며, 데이터를 FlowJo software(Tree Star, INC.)를 사용하여 분석하였다. 6 주령 C57BL/6 마우스로부터 채취한 비장을 3 ml의 PBS를 함유한 60 × 15 mm 세포 배양 접시 상에 놓았다. 단일 세포 현탁액을 0.45 μm 기공을 갖는 세포 스트레이너 (strainer)를 사용하여 물리적으로 제조하였으며, 10 ml의 신선한 PBS를 첨가한 이후에 원심분리하였다.
적혈구 세포들을 ACK 완충용액(0.15 M NH4Cl, 10mM KHCO3, 1 mM EDTA-2Na, pH 7.2)중에 용해시켰다. 웰 당 1.0 × 106개의 비장세포들을 접종한 다음, 본 발명에 따른 단백질들의 전달 효율을 분석하였다. 세포들을 항-마우스 CD4-PerCP-Cy5.5 및 항-마우스 CD19-PE-Cy7 또는 항-마우스 F4/80 PerCP-Cy5.5, 항-마우스 MHCII-PE, 항-마우스 CD11b-PE-Cy7 및 항-마우스 CD11c-APC FACS 항체들로 염색함으로써 다양한 세포 유형들로 세분하였다. 항체들은 eBioscience로부터 구입하였다.
4) 인 비트로 독성 분석
세포들의 생존도는 수용성 테트라졸륨-8 기반의 세포 계수 키트-8 (CCK-8, Dojindo)을 사용하여 측정하였다. 총 5.0 × 103개의 HeLa 세포들을 96-웰 플레이트 상에 접종하였으며, 10, 30, 50 또는 100 μM 각각의 ctCTLA-4 단백질들 또는 PBS로 24 시간 동안 처리하였다. 배양 이후에, 세포들을 PBS로 세척하고, CCK-8 용액으로 2 시간 동안 더 배양하였다. 이어서, 450 nm에서 플레이트 리더를 사용하여(Bio-Rad), 광학 밀도 수치를 분석하였다.
5) 인간 PBMC의 분리 및 각각의 ctCTLA-4 단백질들의 인 비트로 전달 효율
본 실험에서 서술된 프로토콜은 한양대학교 기관 검토 위원회(IRB)의 승인을 받았다. 인간 혈액 샘플은 건강한 공여자로부터 얻었으며, 혈액 림프구들은 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)를 사용하여 밀도 원심분리에 의해서 분리하였다. 분리된 림프구들은 웰 당 1.0 × 106세포들로 접종하였으며, 각각의 ctCTLA-4 단백질들의 전달 효율을 분석하였다. 세포들을 eBioscience로부터 구입한 항-인간 CD4-PE-Cy7, 항-인간 CD19-APC, 항-인간 CD11b-PE-Cy7 또는 항-인간 CD11c-APC FACS 항체들로 더욱 염색하였다.
6) 일차 CD4 + T세포들의 생체 영상화
6 주령의 C57BL/6 마우스를 안락사시키고, CD4+ T 세포들 및 림프절들을, CD4+ T cell negative selection kit(StemCell Technologies, INC)를 사용하여 비장으로부터 분리하였다. RPMI 배지 중 분리된 CD4+ T 세포들을 Chamlide 챔버 내에 탑재된 항-CD44 항체-코팅된 유리 커버슬립 상에 접종하였다. 이어서, 단백질 용액을 챔버에 가해주고, 저속촬영 영상화를 개시하였다. DIC 및 GFP 영상들은 5분 간격으로 2 시간 동안 기록하였다. 얻어진 저속촬영 영상들을 MetaMorph 또는 Image J software 1.48v을 사용하여 분석하였다.
7) 본 발명에 따른 단백질의 전달 메커니즘
분리된 비장세포들을 각각의 ctCTLA-4 단백질들의 존재 하에서 1 시간 동안 다양한 온도(4 ℃, 25 ℃ 또는 37 ℃)에서 배양하였다. 비장세포들 또는 HeLa 세포들을 헤파린 (0, 10, 20 또는 50 μg/ml), 메틸-베타-시클로덱스트린(0, 3, 또는 5 mM), 클로르프로마진(0, 10 또는 30 μM) 또는 아밀로라이드(0, 1, 2 또는 5 mM)으로 37 ℃에서 30 분 동안 전처리한 다음, 각각의 ctCTLA-4 단백질들로 처리하였으며, 부가적으로 각각의 ctCTLA-4 단백질들과 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 모든 세포들에 대해서 트립신 처리를 하였으며(트립신, Thermo Scientific Hyclone), FACS 완충용액(10% FBS, 5% 소듐 아지드 및 1% EDTA를 함유하는 PBS)으로 세척하였다. 헤파린, MβCD, 클로르프로마진 및 아밀로라이드는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
8) 다광자 현미경을 사용한 생체 영상화
뇌의 인 비보 다광자 영상화를 위해서, 수컷 C57BL/6 마우스(23g-25g)에 대해서 외과적 수술을 수행함으로써 두개골에 관찰 윈도우를 도입하였다. 동물들은 이소플루란 흡입을 통해서 마취시켰으며, 직장 프로브에 의해서 조절되는 온혈성 히팅 패드 시스템을 사용하여 체온으로(37 ℃ - 38 ℃) 유지되었다. 이소플루란 수준은 마취를 유도하기 위해서 3%로 셋팅되었으며, 두개골 윈도우 수술 또는 다광자 영상화 동안 1.5%로 유지되었다. 동물들은 생리적 건강을 확인하기 위해서 전체 과정을 통해서 세밀하게 모니터링하였다. 모든 수술 과정은 성균관대학교의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC)에 의해서 승인되었다. 동물들을 정위(stereotaxic) 프레임 중에 고정하였으며(David Kopf Instruments, Tujunga, CA), 우측 반구 상에 직경 3 mm의 원형 두개골 윈도우를 생성하였고, 이는 ML, +2.5 mm, AP, -1.5 mm에 중심을 둔다. 개두술 이후에, 5 mm의 관찰 구멍을 구비한 커스텀화 챔버 플레이트(Narishige Inc., Tokyo, Japan)를 개방된 개두술 영역 상에 위치시키고, 치과용 수지를 사용해서 고정하였다. 이어서, 개두술 윈도우를 살균 인공 뇌척수액으로 채우고(125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 10 mM 글루코오스, pH 7.4), 7 mm 커버슬립으로 덮었다. 개두술 윈도우는 시아노아크릴 접착재를 사용하여 밀봉하였으며, 다광자 현미경 관찰을 위해서(TCS SP8 MP, Leica Microsystems CMS GmbH), 동물들을 두부-고정 장치(MAG-1, Narishige INC.)에 위치시켰다. 여기는 900 nm Ti:사파이어 레이저(Chameleon Vision II, Coherent INC.)를 사용하여 수행하였으며, 발광된 형광 신호는 585/40 밴드-패스 필터 큐브를 통해서 하이브리드 검출기(HyD) 상에서 검출하였다. 뇌 조직으로의 캐리어 펩타이드의 전달을 추적하기 위해서, 캐리어 펩타이드를 꼬리 정맥을 통해서 주사한 이후에(2.5 mg/animal), 20 분 간격으로 2 시간 동안 3D z-스택 영상들을 얻었다. 영상화된 뇌 크기는 354.29 × 354.29 μm2(1024×1024픽셀)였으며, 25× 수-함침 대물 렌즈(N.A. 0.95)를 사용하여 얻었다. 영상화 깊이는 뇌 표면으로부터 대략 450-500 μm였으며, 해상도는 1 μm였다. 영상을 얻은 이후에, 해당 영상들을 LAS AF 3.2.0(Leica Microsystems CMS GmbH) 및 Imaris 7.7.2(Bitplane) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
9) 면역조직화학 분석
6 주령 C57BL/6 마우스에 대해서 5 mg의 각각의 ctCTLA-4 단백질들을 복강내 주사함으로써 dNP2-dTomato의 전신적 전달 효율을 분석하였다. 마우스는 주사 후 2 시간 경과 시점에서 안락사시켰다. 이어서, 조직들을 수거하고, PBS로 세척한 다음, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 모든 수거된 조직들은 O.C.T. 화합물(WAKO Chemical)을 사용하여 동결시켰다. 동결된 블럭들을 크라이오스탯(Thermo Scientific)을 사용하여 6 μm 두께의 박편들로 절단하였으며, 형광 마이크로스코피를 통해서 검사하였다(Leica Microsystems). EAE 유도된 마우스에서 뇌 및 척수 조직을 분석하기 위해서, 2.5 mg 각각의 ctCTLA-4 단백질들을 정맥주사하고 1 시간 경과 후에 동물들을 안락사시키고 15 ml의 PBS, 이어서 15 ml의 4% 파라포름알데히드로 경심관류로 관류시켰다. 뇌조직을 제거하고, PBS로 세척하였다. 이어서, 조직을 4% 파라포름알데히드로 1 시간 동안 실온에서 후-고정시킨 다음, 30% 수크로오스 중에서 24 시간 동안 4 ℃로 저온보호시켰다. 뇌 조직들은 O.C.T. 화합물(WAKO Chemical)을 사용하여 동결시켰다. 동결된 블럭들을 크라이오스탯(Thermo Scientific, Logan, UT)을 사용하여 40 μm 두께의 박편으로 잘랐다. 박편들을 냉각 아세톤 중에서 -20 ℃로 30 분 동안 배양하였으며, 실온에서 PBS로 30분 동안 세척하였다. 세척된 샘플들을 투과화 완충용액(PBS 중의 0.5% Triton X-100)으로 10 분 동안 배양하였으며, 다시 20 분 동안 차단 완충용액(3% BSA, 0.1% Tween-20)으로 배양하였다. 항-마우스 CD4-FITC(eBioscience), 항-마우스 GFAP(Millipore), 항-마우스 Iba-1(WAKO chemical) 또는 항-마우스 NeuN(Abcam)을 사용하여 밤새도록 일차 항체 염색을 수행하였다. 핵은 항체 결합 이후에 Hoechst 33342 염료(Invitrogen) 또는 DAPI(Vector Laboratory)를 사용하여 염색하였다. 모든 박편 샘플들은 공초점 현미경(TCS SP8, Leica Microsystems CMS GmbH)에 의해서 분석하였다.
10) EAE 유도
7 주령 암컷 C57BL/6 마우스를 DBL로부터 구입하였다. 본 발명에서 서술된 프로토콜은 한양대학교의 동물 실험 윤리 위원회로부터 승인받았다. EAE는 Freund's 아쥬반트 에멀젼 (adjuvant-incomplete Freund 및 4 mg/ml의 Mycobacterium tuberculosis, BD Difco) 중의 MOG35-55 펩타이드 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) 100 μg으로 피하 면역화시킴으로써 유도하였다. 피하로 주사된 총 에멀젼 부피는 200 μl였다. 면역화 후 0 시간 및 48 시간 경과 시점에, 마우스에 복강내로 200 ng의 백일해 독소 (List Biological Laboratories INC.)를 처리하였다. 임상적 질병 징후에 대해서 동물들을 매일 점수화하였다. 100 μl의 PBS에 희석된 각각의 ctCTLA-4 단백질들을 투여량 또는 신선한 PBS 단독을 복강내로 주사하였다. 실험 말미에 마우스들을 안락사시켰으며, 중추신경계의 림프구들을 Percoll (GE Healthcare) 밀도-구배 원심분리에 의해서 분리하였다. 분리된 림프구들의 표면을 항-마우스 CD4 PerCP-Cy5.5 항체 (eBioscience)로 염색하였다. 또한, 림프구들을 Fixation/Permeabilization 농축 및 희석 키트 (eBioscience)를 사용하여 항-마우스 IFN-γ-FITC 및 IL-17A-APC 항체들 (eBioscience)로 염색하였다. 세포들을 FACSCanto flow cytometer 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 조직학적 분석을 위해서, 척수 조직의 파라핀 블럭을 탈파라핀화하고 Luxol fast blue 중에 함침시켰다. 조합 염색을 위해서, 헤마톡실린 및 에오신을 사용하였다(Dako). Image J software 1.48v을 사용하여 척수 조직의 백색 영역 중에 존재하는 침윤 세포들을 계수하였다.
12) 인 비보 독성 분석
세 가지 군의 C57BL/6 마우스에 대해서 반복적으로 PBS, 5 mg/kg의 각각의 ctCTLA-4 단백질들을 각각, 격일 간격으로, 14일 동안 주사하였다. 마우스의 체중 변화를 매일 모니터링하였다. 15일 경과 시점에서, 마우스를 희생시켰으며, 비장, 간 및 뇌의 모폴로지를 주의 깊게 관찰하였다. 비장세포 및 흉선세포들에 대한 각 단백질의 세포독성을 Annexin V 및 7-AAD 염색 키트(BD bioscience)를 사용하여 분석하였다. 림프절 및 비장 내 천연 CD4 T 세포들의 백분율을, 항-마우스 CD4-PerCP-Cy5.5, 항-마우스 CD62L-FITC 및 항-마우스 CD44-PE FACS 항체들(eBioscience)로 염색한 후에, 각각의 조직으로부터 분리된 림프구들로 분석하였다. 단백질들의 간 독성은 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 활성 분석 키트(BioVision) 및 아스파르트산 아미노트랜스퍼라아제(AST) 활성 분석 키트(BioVision)를 사용하여 분석하였다.
13) 통계
데이터는 two-tailed Student's t-tests를 사용하여 분석하였다. 0.05 미만의 P 수치를 유의미한 값으로 고려하였다.
<제조예 1> 펩타이드, 그 단편 및 융합펩타이드의 합성/분리정제
서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 합성하였다.
이때, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드(이하, 'ctCTLA-4'라고도 함), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 단편(이하, 'ctCTLA-4-fm1'이라고도 함), 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 단편(이하 'ctCTLA-4-fm2'이라고도 함), 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 융합 펩타이드(이하 'ctCTLA-4-fm3'이라고도 함), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드(이하 'dNP2'라고도 함), 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드(이하 'Hph-1'이라고도 함), 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드(이하 'TAT'이라고도 함)로 표기하였다.
상기 아미노산 서열에 합당한 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide)를 각각 합성한 후 95 ℃에서 3분 방치하여 형성된 2차 또는 3차 구조를 제거하고(denaturation) 50 ℃ 그리고 72 ℃로 온도를 바꾸어 DNA 2중 가닥을 만들었다. pRSET-b 벡터에 끼워 넣기 위하여 센스와 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드 이외의 제한효소 특이 서열을 5'과 3'에 넣었다. 이후 대장균에 넣어 대량 증폭하였다. 이후 서열의 온전성을 확인하고 대장균에 넣어 발현 유도하였다. 상기 각각의 균주로부터 발현된 각각의 펩타이드를 정제하였다.
<제조예 2> 펩타이드의 변이체의 합성/분리정제
서열번호 8 내지 10의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 합성하였다. 서열번호 8 내지 10의 펩타이드 변이체는 서열번호 1에서 도 1a에 표기한 1Y, 2Y의 Y 아미노산 잔기를 F로 치환한 것이다.
구체적으로 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 변이체는 1Y로 표기한 부분의 Y 아미노산 잔기를 F로 치환한 것으로 '1YF'로 표기하였고, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 변이체는 2Y로 표기한 부분의 Y 아미노산 잔기를 F로 치환한 것으로 '2YF'로 표기하였으며, 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 변이체는 1Y, 2Y 부분의 Y 아미노산 잔기를 모두 F로 치환한 것으로 'DYF'.로 표기하였다.
상기 아미노산 서열을 이용한다는 점을 제외하고는 제조예 1과 모두 동일하게 펩타이드의 변이체를 합성 및 분리정제하였다.
<제조예 3> 융합체(dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4, TAT-ctCTLA-4)의 제조.
제조예 1에서 제조된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 세포 투과성 펩타이드와 융합하기 위하여, ctCTLA-4 펩타이드의 N-말단에 서열번호 5 또는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 세포 투과성 펩타이드가 연결될 수 있도록 하는 프라이머를 제작하여, dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 또는 TAT-ctCTLA-4 유전자를 PCR 반응을 통해 생산하고 이를 벡터(pRSET-b)에 삽입하여 대장균 균주에서 단백질을 발현, 정제한 후 세포 내에 전달효율을 확인하는 실험을 진행하였다. 구체적인 실험과정에 대해 아래에 서술하였다.
1) 코딩 유전자의 제조
제조예 1에서 제조된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 N-말단의 일부를 코딩하는 DNA 염기서열에 서열번호 5 또는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 코딩하는 DNA 염기서열을 추가하여 포워드 프라이머를 제작하였다. 각 프라이머와 서열번호 및 제한효소 인식부위를 표 1에 정리하여 나타내었다.
PCR 반응은 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 유전자가 포함된 pRSETb 벡터를 주형으로 하여 상기 서열번호 18 내지 서열번호 21의 프라이머들을 이용하였다.
95 ℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95 ℃에서 주형의 열 변성반응 20초, 50 ℃에서 프라이머와 주형이 결합하는 중합반응 20 초, 72 ℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.
번호 프라이머 염기서열
서열번호 18 dNP2-ctCTLA-4의 1차 포워드 프라이머 AAGATTAAGAAAGTCAAGAAGAAAGGAAGAAAGGAATTCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTA
서열번호 19 dNP2-ctCTLA-4의 2차 포워드 프라이머 GCTAGCAAGATTAAGAAAGTCAAGAAGAAAGGAAGAAAGGGATCCAAGATTAAGAAAGTCAAGAAGA
서열번호 20 TAT-ctCTLA-4의 포워드 프라이머 GCTAGCTATGGACGCAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGCCGCGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTA
서열번호 21 Hph-1-ctCTLA-4 프라이머 TATGCGCGTGTGCGACGTCGTGGCCCACGTCGAGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTA
한편, 상기 포워드 프라이머들 중에서 dNP2-ctCTLA-4의 경우에는 dNP2(KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK)의 서열이 매우 길어 두 번에 나누어 PCR을 수행하였다.
2) 재조합 발현벡터의 제조.
dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 또는 TAT-ctCTLA-4 융합체를 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 pRSETb에 상기 제조예 3의 1)에서 제조된 유전자(DNA) 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다.
제조예 3의 1)에서 증폭된 DNA 절편을 NheI과 HindIII (NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단 (sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSETb를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSETb 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.
분리된 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 또는 TAT-ctCTLA-4 융합체 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응 시켰다.
이렇게 연결시킨 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 또는 TAT-ctCTLA-4 가 삽입된 원형의 pRSETb 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 암피실린 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 암피실린 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다.
상기 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 또는 TAT-ctCTLA-4가 삽입된 pRSETb 벡터임을 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 시킨 후, DNA 염기서열 분석(바이오닉스)을 통하여 최종적으로 확인할 수 있었다.
3) 단백질의 분리 및 정제
상기 제조예 3의 2)로부터 제조된 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4, TAT-ctCTLA-4 또는 dNP2-ctCTLA-4-fm3가 삽입된 pRSETb 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환 시킨 후 항생제인 클로람페니콜 34 μg/㎖와 암피실린 50 μg/㎖가 포함된 LB 평판배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50㎖에 접종하여 37℃에서 10시간 배양하여 이를 새로운 액체 LB 배지 500㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 대장균의 양이 분광광도계로 배양액을 측정하였을 때, O.D 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 온도는 20℃, 회전 속도는 150rpm로 맞춰진 진탕 배양기에서 14시간을 더 배양하였다. 이렇게 대장균주가 발현한 단백질은 앞쪽에 pRSET-b 벡터에 코딩되어 있는 6X-His tag을 포함하고 있다. 이를 이용해 하기의 실험 방법으로 단백질을 정제하였다.
배양액을 원심분리로 모은 후 native condition의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재 부유시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아두었다. 그리고 초음파 세포 파쇄기인 VCX-130(Sonics & Materials)을 사용해 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤 Ni-NTA agarose(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합하도록 하였다. 이후에는 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA agarose와 결합된 단백질 산물만을 column에 결합할 수 있도록 하였다. 20mM, 250mM의 imidazole 용액으로 세척한 뒤, 3 M의 imidazole 용액을 이용해 최종적으로 용출해냈다. 이렇게 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 또는 TAT-ctCTLA-4 융합체를 최종적으로 순수 분리 정제하였다. 정제된 단백질 중 일부를 12% SDS-PAGE를 통하여 확인하여 도 2에 나타내었다.
<제조예 4> dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 제조.
제조예 1에서 제조된 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 융합 펩타이드(이하 'ctCTLA-4-fm3'이라고도 함)와 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드(dNP2)를 포함하는 융합체(이하, 'dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체'라고도 한다)는, ㈜코스모진텍에 의뢰하여 합성하였다.
<제조예 5> 대조군(dNP2-EGFP)의 합성 및 분리정제
제조예 1로부터 제조된 서열번호 5의 세포 투과성 펩타이드를 녹색 형광 단백질(EGFP)과 융합하기 위하여 dNP2의 N-말단에 EGFP가 연결될 수 있도록 하는 프라이머를 제작하여 dNP2-EGFP 유전자를 PCR 반응을 통해 생산하고 이를 벡터(pRSET-b)에 삽입하여 대장균 균주에서 단백질을 발현, 정제하였고, 전반적인 과정은 프라이머를 제외하고는 제조예 3과 모두 동일하게 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.
[서열번호 22] 1 차 포워드 프라이머
AAGATTAAGAAAGTCAAGAAGAAAGGAAGAAAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG
[서열번호 23] 2차 포워드 프라이머
GCTAGCAAGATTAAGAAAGTCAAGAAGAAAGGAAGAAAGGGATCCAAGATTAAGAAAGTCAAGAAGA
<제조예 6> 대조군(dNP2-TAMRA)의 합성
제조예 1로부터 제조된 서열번호 5의 세포 투과성 펩타이드를 형광 라벨링 화합물 TARMA와 융합한 융합체를 제조하기 위하여, 이를 ㈜코스모진텍에 의뢰하여 합성한 것을 사용하였다.
<실험예 1>
1) 마우스 비장세포(면역세포) 안으로 ctCTLA-4 펩타이드와 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 융합체의 전달 효율 비교
상기 제조예 1의 과정에서 정제된 ctCTLA-4 펩타이드와 상기 제조예 3의 과정에서 정제된 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 융합체들의 세포 내 도입 효율을 비교하고자 하였다.
구체적으로 상기 실험방법 중 '3) 인 비트로 전달효율'을 사용하여 측정하였고, 간략하게 다음과 같다.
마우스 비장세포들은 1 μM ctCTLA-4 펩타이드, dNP2-ctCTLA-4 또는 Hph-1-ctCTLA-4 융합체와 함께 1 시간 동안 배양하였으며, 세포 내로 전달된 ctCTLA-4 펩타이드 또는 CPP가 결합된 ctCTLA-4 융합체들을 항-HA 항체로 염색하였고, 신호는 PE-접합된 항-토끼 IgG 항체로 증폭하였다. 상기 세포를 회수하여 유세포 분석기를 이용하여 세포 내 형광을 측정함으로써 일차 마우스 CD4-T 세포에서의 ctCTLA-4 단백질 도입 효율을 측정하였다.
도 3은 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 ctCTLA-4 펩타이드와 dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 융합체의 세포내 전달 효율을 조사하여 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 1 μM의 ctCTLA-4 펩타이드는 세포 투과성 펩타이드(이하, 'CPP'라고 함)와 결합하지 않아도 세포 내 전달 효율이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
다만, CPP가 결합될 경우(dNP2-ctCTLA-4, Hph-1-ctCTLA-4 융합체) 세포 내 전달 효율이 더 향상되는 것을 알 수 있고, 바람직하게 dNP2-ctCTLA-4 융합체의 세포 내 전달 효율이 가장 높은 것을 확인하였다. 구체적으로 dNP2-ctCTLA-4 융합체는 Hph-1-ctCTLA-4 융합체와 ctCTLA-4 펩타이드보다 약 10배 이상 세포 내 전달 효율이 높은 것을 알 수 있다.
상기 실험을 통해 CPP와 ctCTLA-4가 결합한 융합체 중에서 가장 전달 효율이 우수한 dNP2-ctCTLA-4 융합체를 선별하였고, 이하 실험에서 종래 CPP 중에서 대표로 dNP2를 사용한 dNP2-ctCTLA-4 융합체를 제조하여 이를 중심으로 비교 및 분석하였다.
<실험예 2>
1) CPP-ctCTLA-4 융합체의 CPP 종류에 따른 IL-2 발현 억제능 평가
항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해서 활성화된 비장세포에 1 μM PBS, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 TAT-ctCTLA-4 융합체를 각각 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IL-2 발현 억제 효능을 측정하여 이를 도 17에 나타내었다.
우선 96 웰 플레이트에 항-CD3(anti-mouse CD3), 항-CD28(anti-mouse CD28) 단일클론항체를 각각 0.1 ㎍/웰의 농도로 37 ℃에서 5 시간 동안 코팅한 후, 7 주령의 C57BL/6로부터 비장세포를 분리하고, 분리된 비장세포를 단일 세포가 되도록 현탁한다. 상기 과정을 통해 현탁된 2.5 X 105 cell의 비장세포를 상기 항-CD3(anti-mouse CD3), 항-28(anti-mouse CD28) 단일클론항체가 코팅된 웰에 분주하여, 1 μM PBS, dNP2-ctCTLA-4 융합체　및 TAT-ctCTLA-4 융합체로 처리 한 후 24 시간동안 활성화 하였다.
도 4는 1 μM PBS, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 TAT-ctCTLA-4 융합체의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 4에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 ctCTLA-4 단백질은 종래의 세포 투과성 펩타이드(TAT, dNP2, Hph-1)와 결합함에 의해 IL-2 발현이 PBS 처리한 것에 비해 40% 내지 70% 감소효과를 갖는 것을 확인하였다.
이 중에서도 dNP2-ctCTLA-4 융합체의 경우가 70% 감소효과를 갖는 가장 우수한 효과임을 알 수 있다(구체적으로 TAT-ctCTLA-4 융합체보다 약 2배 이상의 효과를 나타냄).
2) ctCTLA-4의 IL-2 발현 억제능 평가
상기 제조예 3의 과정에서 정제된 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 상기 제조예 5의 과정에서 정제된 dNP2-EGFP 융합체(대조군)의 IL-2 발현 억제능을 비교하고자 하였다.
항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해서 활성화된 비장세포에 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체를 각각 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IL-2 발현 억제 효능을 측정하여 이를 도 4a에 나타내었다. 이때 상기 ELISA는 Biolegend사에서 시판하는 kit를 이용하였으며, 이의 표준 protocol대로 수행하였다.
또한 PMA/inomycin에 의해서 활성화된 비장세포에 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체를 각각 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IL-2 발현 억제 효능을 측정하여 이를 도 4b에 나타내었다.
이때 상기 활성화된 비장세포들은 1 μM PBS, dNP2-ctCTLA-4 융합체 또는 dNP2-EGFP 융합체의 존재 하에서 항-CD3/CD28 항체 또는 PMA/아이오노마이신으로 24 시간 동안 활성화하였다.
도 5a 및 도 5b는 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 5에 나타난 바와 같이, dNP2-ctCTLA-4 융합체는 IL-2 발현을 억제하였으나, dNP2-EGFP 융합체는 IL-2 발현을 억제하지 못하고 있음을 확인할 수 있다.
게다가 본 발명의 dNP2-ctCTLA-4 융합체는 PMA 및 아이오노마이신 (ionomycin) 자극으로 활성화된 비장세포에서는 아무런 효과를 나타내지 않았는데, 이를 통해 dNP2-ctCTLA-4 융합체의 표적이 근접 TcR 신호 분자들임을 확인할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 dNP2-ctCTLA-4 융합체는 특이적 표적 지향성을 갖고 있음을 알 수 있다.
또한 IL-2 발현 억제 효과가 dNP2에 의한 것이 아닌 ctCTLA-4에 의한 것임을 확인하였다.
3) ctCTLA-4의 IFN-γ와 IL-17A 발현 억제능 평가
상기 제조예 3의 과정에서 정제된 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 상기 제조예 5의 과정에서 정제된 dNP2-EGFP 융합체(대조군)의 IFN-γ와 IL-17A 발현 억제능을 비교하고자 하였다.
항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해서 활성화된 비장세포에 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체를 각각 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IFN-γ와 IL-17A 발현 억제 효능을 측정하여 이를 도 6에 나타내었다.
도 6a dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 IFN-γ 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 6b는 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 IL-17A 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 6에 나타난 바와 같이 활성화된 비장세포들에서 인터페론-γ(IFN-γ) 및 인터루킨-17A(IL-17A) 발현 수준은 dNP2-ctCTLA-4 융합체에 의해서 현저하게 감소하고 있음을 알 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 dNP2-ctCTLA-4 융합체는 dNP2-EGFP 융합체에 비해 3 배 이상 감소한 수치를 갖는 것을 확인하였다.
<실험예 3>
1) ctCTLA-4의 다발성 경화증 마우스 모델(EAE 유도된 동물모델)에서의 예방 효과
다발성 경화증의 마우스 모델에서 ctCTLA-4의 저해 효과를 분석하기 위해서, 본 발명에서는 표준 EAE 모델로서, MOG35-55 펩타이드로 면역화되고 백일해 독소로 처리된 C57BL/6 마우스를 사용하였다
이때 상기 EAE는, 전술한 바와 같이, 7 주령의 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. MOG 면역화 후 7일 경과 후에 마우스에 복강내 주사에 의해서 PBS, 25 μg dNP2-ctCTLA-4 융합체 또는 dNP2-EGFP 융합체를 각각 처리하였으며, 이어서 격일 간격으로 처리하였다(예방 계획, n=15). 마우스를 EAE 유도하고 난 후부터 매일 관찰하고 EAE 임상 징후를 점수를 매겨 도 7에 나타내었다.
도 7은 실험예 3의 1)의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
EAE 임상 징후 평가는 하기 제시된 표 2에 기재된 등급에 따라 점수를 매겼다.
점수 설명
0 정상적으로 거동하는 상태-신경학적 징후 없음
0.5 꼬리를 말지 못할 정도로 마비가 되어 있는 상태
1 꼬리를 전혀 움직이지 못하는 상태
2 기우뚱한 걸음-마우스가 걸을 때 뒷다리가 불안정한 상태
2.5 한쪽 뒷다리가 완전히 마비된 상태
3 두쪽 뒷다리가 완전히 마비된 상태--마우스가 뒷다리로 서는 것이 어렵다. 다만 나머지 부분은 여전히 움직인다.
3.5 앞다리도 정상적으로 움직이지 못하는 상태
4 마우스의 사지가 모두 마비되어, 전혀 다리를 움직이지 못하고 얇아지고 여위어가는 상태
5 사망
도 7에 나타난 바와 같이, dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리된 마우스의 임상 점수는 dNP2-EGFP 융합체 또는 PBS로 처리된 마우스에 비해서 임상 징후가 급격히 상승하지 못하고, 낮게 유지되는 것을 확인하였다.
이에 반해 dNP2-EGFP 융합체 또는 PBS로 처리된 마우스는 9일부터 임상 징후가 발생하기 시작하였고 이후 매우 급격하게 상태가 나빠졌으며, 뒷다리가 모두 마비되거나 사지가 모두 마비되는 상태까지 병증이 심해지는 것을 확인할 수 있다. 허나 dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리된 마우스는 11일부터 임상 징추가 발생하였고, 이후 매우 완만하게 증상이 발생하고 있으며, 최대 꼬리가 마비되어 있는 상태까지 진행될 뿐이였으므로, 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 dNP2-ctCTLA-4 융합체가 중추신경계 질환 특히 다발성 경화증에 대해 예방효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
2) 다발성 경화증 마우스 모델(EAE 유도된 동물모델)에서 CPP-ctCTLA-4 융합체의 CPP 종류에 따른 예방 효과
다발성 경화증의 마우스 모델에서 CPP 종류에 따라 ctCTLA-4 융합체의 예방 효과를 분석하기 위해서, 본 발명에서는 표준 EAE 모델로서, MOG35-55 펩타이드로 면역화되고 백일해 독소로 처리된 C57BL/6 마우스를 사용하였다
이때 상기 EAE는, 전술한 바와 같이, 7 주령의 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. MOG 면역화 후 7일 경과 후에 마우스에 복강내 주사에 의해서 PBS 또는 25 μg dNP2-ctCTLA-4 융합체와 Hph-1-ctCTLA-4 융합체를 각각 처리하였으며, 이어서 격일 간격으로 처리하였다(예방 계획, n=15). 마우스를 EAE 유도하고 난 후부터 매일 관찰하고 EAE 임상 징후를 점수를 매겨 도 8에 나타내었다.
도 8은 실험예 3의 2)의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
EAE 임상 징후 평가는 상기 제시된 표 2에 기재된 등급에 따라 점수를 매겼다.
도 8에 나타난 바와 같이, Hph-1-ctCTLA-4 융합체로 처리된 마우스는 PBS 만으로 처리된 마우스에 비해 다소 늦은 9일째부터 임상 징후가 발생하기 시작하였고, 이후 PBS 만으로 처리된 마우스보다 완곡하게 상태가 나빠졌음을 확인하였다. 즉 Hph-1-ctCTLA-4 융합체도 혈액-뇌 장벽 또는 혈액-척수 장벽으로의 투과특성이 우수하고, 인 비보 뇌 조직 영역화 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 실질적으로 중추신경계 질환 특히 다발성 경화증에 대해 예방 또는 지연효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
허나 dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리된 마우스는 11일부터 임상 징추가 발생하였고, 이후 매우 완만하게 증상이 발생하고 있으며, 최대 꼬리가 마비되어 있는 상태까지 진행될 뿐이였으므로, 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 dNP2-ctCTLA-4 융합체가 중추신경계 질환 특히 다발성 경화증에 대해 예방효과가 가장 우수하다는 것을 확인하였다.
3) 다발성 경화증 마우스 모델(EAE 유도된 동물모델)에서 ctCTLA-4의 투여량에 따른 예방 효과
다발성 경화증의 마우스 모델에서 ctCTLA-4의 투여량에 따른 저해 효과를 분석하기 위해서, 본 발명에서는 표준 EAE 모델로서, MOG35-55 펩타이드로 면역화되고 백일해 독소로 처리된 C57BL/6 마우스를 사용하였다
이때 상기 EAE는, 전술한 바와 같이, 7 주령의 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. MOG 면역화 후 7일 경과 후에 마우스에 복강내 주사에 의해서 PBS 또는 100 μg dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체를 각각 처리하였으며, 이어서 격일 간격으로 처리하였다(예방 계획, n=15).마우스를 EAE 유도하고 난 후부터 매일 관찰하고 EAE 임상 징후를 점수를 매겨 도 9에 나타내었다.
도 9는 실험예 3의 3)으로부터의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
EAE 임상 징후 평가는 상기 제시된 표 2에 기재된 등급에 따라 점수를 매겼다.
도 9에 나타난 바와 같이 dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리된 마우스의 임상 점수는 dNP2-EGFP 융합체 또는 PBS로 처리된 마우스에 비해서 매우 현저하게 감소하였다는 것을 확인할 수 있다.
즉, 도 9의 결과는 투여량만 다른 도 7의 결과와 매우 유사한 경향인 것을 확인할 수 있는데, 이를 통해 융합체의 투여량은 동물모델에서의 임상점수에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있다.
4) 다발성 경화증 마우스 모델(EAE 유도된 동물모델)에서 ctCTLA-4의 치료 효과
이미 질병이 진전되어 그 평균 임상 점수가 1인 동물모델 내로 100 μg의 dNP2-ctCTLA-4 융합체 또는 dNP2-EGFP 융합체를 복강내로 주사하여, 치료 효과를 살펴보았다.
본 실험예에서는 표준 EAE 모델로서, MOG35-55 펩타이드로 면역화되고 백일해 독소로 처리된 C57BL/6 마우스를 사용하였는데, EAE는, 전술한 바와 같이, 7 주령의 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. MOG 면역화 후 평균 임상 점수가 1이 될 때까지 방치한 다음(10 일경), 마우스에 복강내 주사에 의해서 PBS 또는 100 μg dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체를 각각 처리하였으며, 이어서 격일인 12 일경에 한번 더 처리하고, 이후부터 매일 처리하였다(예방 계획, day 10, n=5). 마우스를 EAE 유도하고 난 후부터 매일 관찰하고 EAE 임상 징후를 점수를 매겨 도 10에 나타내었다.
도 10은 실험예 3의 4)로부터의 실험결과를 나타낸 그래프로, 이 그래프는 각각의 그룹에서 (x축에서의) 질환 유도 후 일자에 대한 (y 축에서의) EAE 동물모델에 대한 임상점수를 나타낸다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
EAE 임상 징후 평가는 상기 제시된 표 2에 기재된 등급에 따라 점수를 매겼다.
도 10에 나타난 바와 같이, 2.0 임상 점수까지 병증이 진행된 마우스에 dNP2-ctCTLA-4 융합체의 처리함으로써 1.0 임상 점수까지 병증이 개선된 것을 확인하였다.
다시 말해 본 발명의 데이터를 종합하면 dNP2-ctCTLA-4 융합체는 인 비트로 및 인 비보에서 활성화된 T 세포 반응을 조절할 수 있고, 다발성 경화증과 같은 중추신경계 질환(뇌-혈관 장벽 및 척수 혈관 장벽의 투과가 요구됨)들을 조절할 수 있는 면역조절 단백질로 사용될 수 있다는 것을 보여주고 있다.
이에 반해 dNP2-EGFP 융합체로 처리할 경우에는 임상점수가 개선되지 않고, 그대로 유지되거나 2.5 이상의 임상 점수로 병증이 더 깊어지는 것을 확인하였다.
5) 다발성 경화증 마우스 모델(EAE 유도된 동물모델)에서의 ctCTLA-4의 탈미엘리네이션(demyelination) 현상 및 면역세포의 침윤 억제 효과
도 11은 EAE 유도된 동물모델에서 탈미엘리네이션(demyelination) 및 면역세포 침윤에 대한 본 발명의 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 효과를 룩솔페스트블루(LFB, luxol fast blue) 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 사진이다. 스케일바는 100 ㎛이다.
도 12는 도 11에서 측정된 각 처리군에 따른 척수 조직의 침윤된 면역세포들의 개수를 Image J software 1.48v를 통해서 계수하여 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 EAE 동물모델에서의 탈미엘리네이션(demyelination) 현상 및 면역세포의 침윤 억제 효과를 확인한 결과 다른 동물세포에 비해 dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리된 동물모델에서 탈미엘리네이션 현상과 면역세포의 침윤 정도가 감소되었음을 확인하였다. 이를 통해 dNP2-ctCTLA-4 융합체를 처리한 마우스 모델에서 척수 조직의 염증이 현저히 감소하였음을 알 수 있다.
6) 다발성 경화증 마우스 모델(EAE 유도된 동물모델)에서의 ctCTLA-4의 유세포 분석
도 13은 본 발명의 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 dNP2-EGFP 융합체의 Th1, Th17, Th2 및 Treg 세포(T 세포)로 처리된 EAE 동물모델에서 척수 세포를 분리한 다음, IL-17A 및/또는 IFN-γ 발현 CD4 T 세포들을 유세포 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 도 13의 결과를 분석하여 그래프로 나타낸 것으로, 척수로부터 단일 세포가 현탁된 분획에서 절대 세포 숫자들을 계수하였으며, 이를 곱함으로써 총 CD4+세포들(a), IFNγ+CD4+세포들(b), IL-17A+CD4+세포들(c) 및 IFNγ+IL-17A+CD4+세포들(d)의 비율을 측정하여, 데이터를 막대 그래프로 표시한 것이다(n=15). 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 13 및 도 14에 나타난 바와 같이 dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리한 경우에만 척수 조직에서 침윤된 IFN-γ- 및/또는 IL-17A-생산 CD4 T 세포들의 비율 및 개수가 유의하게 감소하고 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 4> 서열번호 2, 3의 단편 펩타이드와 서열번호 4의 융합 펩타이드의 성능 평가.
1) ctCTLA-4 펩타이드와 이들의 변이체에 대한 IL-2 발현 억제능 평가.
상기 제조예 1의 과정에서 정제된 ctCTLA-4 펩타이드(본 실험예에서 'WT'로 표기하였다)와 상기 제조예 2의 과정에서 정제된 1YF, 2YF 또는 DYF 변이체들의 IL-2 발현 억제능을 비교하고자 하였다.
항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해서 활성화된 비장세포에 0.5, 1, 2 또는 5 μM WT, 1YF, 2YF, DYF를 각각 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IL-2 발현 억제 효능을 측정하여 이를 도 15에 나타내었다.
이때 상기 활성화된 비장세포들은 1 μM PBS, 0.5, 1, 2 또는 5 μM WT, 1YF, 2YF, DYF의 존재 하에서 항-CD3/CD28 항체로 24 시간 동안 활성화하였다.
도 15는 0.5, 1, 2 또는 5 μM WT, 1YF, 2YF, DYF의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 15에 나타난 바와 같이 1YF, 2YF, DYF는 IL-2의 발현 억제 효능이 WT에 비해 현저히 저하되는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 ctCTTLA-4 펩타이드에서 1Y와 2Y가 위치하는 영역의 아미노산 단편이 IL-2의 발현 억제 활성에 큰 기여를 하고 있음을 확인하였다.
다시 말해 상기 1Y, 2Y 아미노산 잔기를 포함하는 영역의 아미노산 서열을 포함하는 ctCTLA-4 단편 펩타이드(서열번호 2, 3)도 본 발명과 같은 우수한 IL-2 발현 억제 효과를 얻을 수 있음을 확인한 것이다.
상기 실험을 통해 ctCTLA-4에서 활성을 나타내는 단편 펩타이드를 확인한 바, 이하 실험에서 상기 ctCTLA-4의 단편 펩타이드들을 융합한 융합 펩타이드(서열번호 4)를 이용하여 실험하였다.
2) dNP2-TAMRA, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 마우스 모델에서 CD4 T 세포의 활성화(activation) 저해여부 분석
본 발명의 dNP2-TAMRA, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체가 마우스 모델에서 CD4 T 세포의 활성화(activation)를 저해하는 지를 확인한 실험이다.
이때 CD25는 T 세포가 활성화되었을 때 그 발현양이 증가하는 활성화 마커이고, 본 실험을 상술한 CD25의 발현량을 통해 CD4 T 세포의 활성화(activation)를 저해 여부를 분석하였다.
구체적으로 상기 실험방법은 다음과 같다.
96 well plate에 0.1 ug의 anti-CD3, anti-CD28 antibody를 37 ℃, 0.5 % 이산화탄소 세포 배양기에서 5 시간 동안 코팅한다. 이후 분리해낸 쥐의 비장 세포를 각 well당 2.5 X 105 씩 분주한다. 여기에 PBS 혹은, 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM 의 dNP2-TAMRA, dNP2-ctCTLA-4 혹은 dNP2-ctCTLA-4-Fm을 처리한 뒤 24 시간동안 37 ℃, 0.5% 이산화탄소 세포 배양기에서 배양한다. 이후 세포를 APC 형광이 융합된 anti-CD4 mAb, PE 형광이 융합된 anti-CD25 mAb 으로 4 ℃에서 20 분간 염색하였다. 이후 상술한 과정을 통해 제조된 세포를 유세포분석기 (FACS)를 통하여 분석하여 CD25의 발현양을 비교하였다.
도 16은 NA 또는 PBS 처리한 일차 마우스 CD4-T 세포들(NA&PBS)에서의 도입 효율을 측정한 그래프이고, 도 17은 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM dNP2-TAMRA, dNP2-ctCTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 세포내 전달 효율을 조사하여 나타낸 그래프이다.
여기서 NA란 T 세포가 활성화될 수 있는 자극을 주지 않은 것으로 음성 대조군에 해당하며, PBS는 T 세포가 활성화될 수 있도록 anti-CD3, anti-CD28 monoclonal antibody로 자극을 준 것으로, 이는 일종의 양성 대조군이다.
도 16에서 NA는 적색 그래프이고, PBS는 청색 그래프이다. 이때 PBS 처리한 것에 있어서, CD3은 T 세포의 리셉터(receptor)이며, CD28은 co-리셉터(co-receptor)로, 이들을 타겟팅하는 nmonoclonal antibody를 이용하여 T 세포 리셉터에 자극을 준 것이다.
즉, 도 16에 나타난 바와 같이 T 세포 리셉터로 처리된 PBS 그래프는 CD25 발현양이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있는데 반해, NA 그래프는 아무런 자극도 포함하고 있지 않으므로 CD25 발현량이 변함없이 유지되는 것을 확인할 수 있다.
도 17에 나타난 바와 같이, 각 농도별로 처리할 경우 dNP2-ctCTLA-4는 농도에 비례하여 CD25 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있고, dNP2-ctCTLA-4-fm3도 이와 유사한 정도의 효능을 보이고 있음을 알 수 있다. 반면 dNP2-TAMRA는 ctCTLA-4와 같은 활성이 없는 물질이기 때문에 CD25 발현을 억제하지 못하는 것을 확인할 수 있다.
아울러 dNP2-CTLA-4 융합체의 경우 2 μM 이상을 사용하여야만 유의한 정도의 효과를 나타내고 있음을 알 수 있는 데 반해, dNP2-ctCTLA-4-fm 융합체는 dNP2-ctCTLA-4 융합체와 유사하게 0.1 μM의 농도에서도 세포 내 전달 효율이 우수한 것을 확인하였다.
3) 다른 종류의 ctCTLA-4 단백질들의 IL-2 발현 억제능 평가
항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해서 활성화된 비장세포에 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM dNP2-TAMRA 융합체, dNP2-CTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체를 각각 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IL-2 발현 억제 효능을 측정하여 이를 도 18에 나타내었다.
이때 상기 활성화된 비장세포들은 1 μM PBS, 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM dNP2-TAMRA 융합체, dNP2-CTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 존재 하에서 항-CD3/CD28 항체로 24 시간 동안 활성화하였다.
도 18은 0.1, 0.5, 1, 2 또는 5 μM dNP2-TAMRA 융합체, dNP2-CTLA-4 융합체 및 dNP2-ctCTLA-4-fm3 융합체의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타낸다; Student's t-test.
도 18의 결과는 상기 도 14에서의 결과와 유사한 경향을 갖는 것으로 나타났다. 구체적으로 dNP2-TAMRA 융합체의 경우 IL-2의 발현을 전혀 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
또한 dNP2-CTLA-4 융합체의 경우에도 IL-2 발현 억제 효과를 관찰하긴 했으나, 다만 2 μM이상에서 유의한 정도의 효과가 관찰되었다.
마지막으로 dNP2-ctCTLA-4-fm 융합체는 본 발명의 ctCTLA-4의 단편을 이용한 것으로, 실시예 2의 dNP2-ctCTLA-4 융합단백질과 유사한 정도의 우수한 IL-2 발현 억제 효과를 갖고 있음을 확인하였다.
<결론>
본 발명에 따른 실시예 1의 ctCTLA-4 펩타이드는 B7 결합과 무관하게 유전자 이식된 NOD 마우스에서 면역 조절 기능들이 나타내었다. 특히 본 발명은 CTLA-4 유전자의 엑손 4 중 일부만을 암호화하는 CTLA-4(ctCTLA-4)의 B7 독립적 형태의 기능을 밝혀내었다.
종래에 ctCTLA-4와 유전적으로 유사한 CTLA-4의 또 다른 동형 단백질인 1/4 CTLA-4이 T 세포 활성화를 강화하고, 자가면역을 촉진한다는 점을 밝힌 바 있다(Liu, S. M. et al. Overexpression of the Ctla-4 isoform lacking exons 2 and 3 causes autoimmunity. Journal of immunology 188, 155-162, doi:10.4049/jimmunol.1102042 (2012); Ichinose, K. et al. Brief report: increased expression of a short splice variant of CTLA-4 exacerbates lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and rheumatism 65, 764-769, doi:10.1002/art.37790 (2013)). 그러나, 1/4 CTLA-4의 대안적 스플라이싱은 프레임-시프트를 유도하며, 이는 ctCTLA-4와는 완전히 다른 아미노산 서열을 야기한다(Ichinose, K. et al. Brief report: increased expression of a short splice variant of CTLA-4 exacerbates lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and rheumatism 65, 764-769, doi:10.1002/art.37790 (2013); Ueda, H. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature 423, 506-511, doi:10.1038/nature01621 (2003)).
또한, 본 발명에 따른 ctCTLA-4 단백질과 세포 투과성 펩타이드를 결합한 융합단백질도 밝혀내었는데, 이는 T 세포 활성화를 억제하며, 자가면역성 뇌척수염 모델에서 효능있는 치료적 효과를 나타내었는 바, T 세포에서의 CTLA-4 세포질 도메인의 수준이 그 기능에 중요한 역할을 하고 있음을 암시하는 것이다.
비록 dNP2-ctCTLA-4 융합체가 거대식세포 및 수지상 세포 내부로도 전달될 수 있지만, 그러한 세포들에서 Toll-유사 수용체(TLR) 리간드 자극에 의한 염증성 사이토카인 생산에 유의미한 변화는 관찰되지 않은 반면에, 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포들에 의해서 IL-2 및 IFN-γ의 생산이 성공적으로 억제되고 있음을 확인하였다.
이는 본 발명에 따른 융합체는 EAE에 대한 저해 메커니즘이 선천적 면역 세포들의 억제에 의해서 매개되는 것이 아니며, 이보다는 효과기 T 세포 기능들을 저해함으로써 이루어진다는 것을 의미하는 것이다.
아울러 본 발명의 인 비보 실험들은 dNP2-ctCTLA-4 융합체로 처리한 경우에, 심지어 동물모델에서 꼬리가 마비된 이후에 처리되는 경우에서도, 임상적 증상들을 개선하고 있음은, 본 발명에 따른 융합체가 매우 강력한 예방 또는 치료효과를 갖고 있음을 나타내는 것이다.
이를 통해 본 발명에 따른 dNP2-ctCTLA-4 융합체에 의한 효과기 T 세포 기능들의 저해가 유의미한 인 비보 독성 없이 질병 증상들의 진전을 조절하거나 또는 회복을 촉진할 수 있다는 것을 의미한다.
요약하면, 본 발명에서는 신규한 효능성 ctCTLA-4 펩타이드 및 ctCTLA-4 펩타이드와 세포 투과성 펩타이드를 결합한 융합체를 개발하였고, 이러한 펩타이드 또는 이의 단편 또는 융합체가 뇌 및 척수로 전달할 수 있다는 점을 명확하게 밝혔다.
본 발명에 따른 ctCTLA-4 펩타이드 및 ctCTLA-4 펩타이드와 세포 투과성 펩타이드를 결합한 융합체는 CNS-침윤성 T 세포들 내부로 전달하는 기술에 기초한 새로운 치료법들은 다발성 경화증을 조절하는데 효과적일 수 있으며, 특히 dNP2-ctCTLA-4 융합체의 경우 그 효율 및 안정성이 가장 최적화되어 있음을 확인하였다.
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sequence of ctCTLA-4-fm3 <400> 4 Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of dNP2 <400> 5 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Hph-1 <400> 6 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of TAT <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Transportan <400> 8 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Pep-1 <400> 9 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of pVEC <400> 10 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of M918 <400> 11 Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly 1 5 10 15 Pro Pro Arg Val Arg Val 20 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of TP10 <400> 12 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ile Leu 20 <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VP22 <400> 13 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Buforin2 <400> 14 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg 20 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of KALA <400> 15 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala 20 25 30 <210> 16 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CL22 <400> 16 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Phe Leu Gly Phe Trp Arg Gly Glu 1 5 10 15 Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu 20 25 30 Lys Gly Lys 35 <210> 17 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Crotamine <400> 17 Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly His Cys Phe Pro Lys Glu Lys 1 5 10 15 Ile Cys Leu Pro Pro Ser Ser Asp Phe Gly Lys Met Asp Cys Arg Trp 20 25 30 Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys Gly Ser Gly 35 40 <210> 18 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first forward primer of dNP2-ctCTLA-4 <400> 18 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aaggaattct acccatacga tgttccagat 60 tacgcta 67 <210> 19 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second forward primer of dNP2-ctCTLA-4 <400> 19 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccaagat taagaaagtc 60 aagaaga 67 <210> 20 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TAT-ctCTLA-4 <400> 20 gctagctatg gacgcaagaa gcgccgccag cgccgccgcg gatcctaccc atacgatgtt 60 ccagattacg cta 73 <210> 21 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Hph-1-ctCTLA-4 <400> 21 tatgcgcgtg tgcgacgtcg tggcccacgt cgaggatcct acccatacga tgttccagat 60 tacgcta 67 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first forward primer of dNP2-ctCTLA-4 <400> 22 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aaggtgagca agggcgagga gctgttcacc 60 g 61 <210> 23 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second forward primer of dNP2-EGFP <400> 23 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccaagat taagaaagtc 60 aagaaga 67

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 4로 표시되는 CTLA-4 단백질의 세포질 영역의 단편; 및 세포 투과성 펩타이드를 포함하고,
    상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 tat(47-57), 6 내지 8개 아르기닌을 갖는 폴리아르기닌 폴리펩티드, 7 내지 11개의 라이신을 갖는 폴리라이신 폴리펩티드, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 dNP2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것을 특징으로 하는, 융합체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제4항에 있어서,
    상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 dNP2 단백질인 것을 특징으로 하는, 융합체.
  9. 제4항에 따른 융합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  10. 제4항에 따른 융합체를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 융합체에서 세포 투과성 펩타이드는 혈액-뇌 장벽 또는 혈액-척수 장벽 투과활성을 갖는 것을 특징으로 하는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 중추신경계 질환은 척수손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 알츠하이머병, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제10항에 따른 약학 조성물을 개체에 투여하여, 인간을 제외한 동물의 중추신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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