KR102261407B1 - Hvem을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HVEM(Herpesvirus entry mediator)을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포외 결합영역에 HVEM과 결합하는 BTLA 또는 CD160 단백질 자체를 포함하고 있어, 이를 발현하는 T 세포는 HVEM이 발현된 암세포에 특이적으로 결합하여 IL2 농도를 증가시키고 암세포를 선택적으로 용해시키므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HVEM을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체{Chimeric antigen receptors targeting Herpesvirus entry mediator}
본 발명은 HVEM(Herpesvirus entry mediator)을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)에 관한 것이다.
면역계는 다양한 병으로부터 인체를 보호하는 특정 기전을 가지고 있으며, 특히 세균 및 바이러스 등의 병원체를 검출하고 제거하는 기능을 한다. 또한, 면역계는 암의 형성 및 성장을 방지하기 위해 건강한 세포와 병이 있는 세포를 구별하며, 이는 건강한 상태에서 병적인 상태로의 전이를 나타내는 항원을 인식함으로써 이루어진다. 이에 암을 치료하기 위한 면역 요법으로서, 면역세포를 강화시키거나 유전적으로 변형시켜 주입하는 세포치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
과거, 면역 요법은 종양에서 분리된 T 세포(T cell)를 이용해 생체외에서 증식시키는 방법을 이용했으나, T 세포의 증식성을 조절하기가 어렵고 이질적인 T 세포군이 형성되어 항원 특이적 T 세포를 수득하는 데 어려움이 있었다. 이에, 유전자 재조합 기술을 기초로한 인공 수용체인 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 면역요법에 적용하는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. CAR는 T 세포가 특정 항원을 인식하여 세포 독성을 나타낼 수 있도록 설계된 인공 수용체로서, 암세포를 항원으로 인식하는 세포외 결합영역(ectodomain), 막관통 영역(transmembrane domain), 및 세포내 신호영역(endodomain)으로 구성된다. 세포외 결합영역은 특정 항원이 있는 암세포의 세포막 리간드를 인지하고, 막관통 영역은 세포외 결합영역과 세포내 신호영역을 연결하며, 세포내 신호영역은 세포외 결합영역으로부터의 신호를 세포내에 전달하여 T 세포의 면역반응을 활성화 시키게 된다.
CAR-T 세포를 이용한 면역 요법은 실제로 임상시험에서 암에 대한 치료 효과가 있다. 사망률이 높고 항암치료에 효과가 잘 나타나지 않는 급성림프구성백혈병(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL) 환자 5명을 대상으로 한 임상시험에서 빠른 속도로 치료 효과가 나타났고(Brentjens RJ et al., Sci Transl Med., 5(177):177ra38, 2013), 44명의 급성림프구성백혈병 환자를 대상으로 연구한 결과, CAR-T 세포 치료 후 전체 생존기간이 증가했다(Jae H Park et al., 2015 American Society of Hematology Meeting and Exposition, Abstract#682, 2015). 또한, B세포 비호지킨림프종(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL) 또는 만성림프구성백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL) 환자에서 기존 치료법인 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide) 단독 사용 또는 플루다라빈(Fludarabine)의 병용 요법 보다 CD19 CAR-T 세포가 더 우수한 치료효과를 나타냈다(Cameron J Turtle et al., 2015 American Society of Hematology Meeting and Exposition, Abstract#184, 2015).
CAR-T 세포는 상기와 같이 면역 치료제, 특히 암 치료제로서 매력적인 부분이 있으나, 정상 세포 또는 조직에의 부작용 야기 등과 같은 잠재적 위험 요소를 포함하고 있으며, 이는 정상 조직에서도 낮게 발현될 수 있는 항원을 CAR-T 세포가 인식하는 것에 기인한다. 이를 극복하기 위한 수단으로 인공수용체를 추가, 암세포 특이적인 항원 인식 능력을 증가시킨 차세대 CAR-T 세포가 개발되고 있으나, 한편으로는 상기와 같은 부작용이 거의 없는 신규한 암특이적 마커를 발굴하는 것 또한 중요하다.
본 발명은 HVEM을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 이의 암 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포외 결합영역(ectodomain), 막관통 영역(transmembrane domain), 및 세포내 신호영역(endodomain)을 포함하는 키메라 항원 수용체로서, 상기 세포외 결합영역은 HVEM(Herpesvirus entry mediator)에 특이적으로 결합하는 영역인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포외 결합영역에 HVEM과 결합하는 BTLA 또는 CD160 단백질 자체를 포함하고 있어, 이를 발현하는 T 세포는 HVEM이 발현된 암세포에 특이적으로 결합하여 IL2 농도를 증가시키고 암세포를 선택적으로 용해시키므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 세포외 결합영역에 HVEM과 결합하는 BTLA 또는 CD160을 포함하는 CAR의 유전자 구조체(construct)를 나타낸 도이다.
도 2는 CAR이 도입된 T 세포에서 세포내 영역인 CD3ζ의 발현을 확인한 도이다.
도 3은 CAR이 도입된 NKT 세포에서 세포내 영역인 CD3ζ의 발현을 확인한 도이다.
도 4는 HVEM을 과발현시킨 K562 세포에서 HVEM의 발현을 확인한 도이다.
도 5는 CAR이 도입된 T 세포 및 K562 세포를 공동배양한 뒤 IL2 농도 변화를 확인한 도이다.
도 6은 CAR이 도입된 NKT 세포 및 K562 세포를 2:1의 비율로 공동배양한 뒤 K562 세포의 용해를 확인한 도이다.
도 7은 CAR이 도입된 NKT 세포 및 K562 세포를 5:1의 비율로 공동배양한 뒤 K562 세포의 용해를 확인한 도이다.
도 8은 CAR이 도입된 NKT 세포 및 K562 세포를 10:1의 비율로 공동배양한 뒤 K562 세포의 용해를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포외 결합영역(ectodomain), 막관통 영역(transmembrane domain), 및 세포내 신호영역(endodomain)을 포함하는 키메라 항원 수용체로서, 상기 세포외 결합영역은 HVEM(Herpesvirus entry mediator)에 특이적으로 결합하는 영역인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
상기 세포외 결합영역은 특정 항원이 있는 암세포의 세포막 리간드를 인지해 주신호를 전달하는 부분으로서, 표적 항원에 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외 결합영역은 BTLA(B and T lymphocyte attenuator) 또는 CD160(cluster of differentiation 160) 단백질을 포함할 수 있다.
상기 BTLA 또는 CD160 단백질은 HVEM에 특이적으로 결합하는 단백질로서, 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, HVEM과의 특이적 결합력을 유지할 수 있는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 이러한 변이체는 본 발명의 BTLA 또는 CD160 단백질 서열과 80％, 90％, 95％, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 BTLA 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있고, 상기 CD160 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 막관통 영역은 세포외 결합영역과 세포내 신호영역을 연결하는 부분으로서, 세포막의 한면(세포외)에서 세포막의 다른면(세포내 또는 세포질)을 통해 걸쳐있을 수 있다. 막관통 영역은 알파 나선(alpha helix) 및 베타 배럴(beta barrel)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 수용체의 구성요소로서 막관통 영역은, 당업계에 알려진 막관통 영역을 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 막관통 영역은 CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 영역을 포함할 수 있고, 더 구체적으로 CD8 또는 CD28 단백질을 포함할 수 있다.
상기 CD8 또는 CD28 단백질은 T 세포 표면의 천연 마커(natural marker)로서, 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 상기 기재한 바와 같이 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 CD28 단백질의 막관통 영역은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 세포내 신호영역은 T 세포의 면역반응을 활성화시키는 부분으로서, 면역세포 신호전달 경로를 자극 또는 활성화시키기 위한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 수용체의 구성요소로서 세포내 신호영역은, 당업계에 알려진 세포내 신호영역을 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28, CD137, 및 CD134로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포내 신호영역을 포함할 수 있고, 더 구체적으로 CD3ζ 또는 FcεRIγ 단백질의 세포내 신호영역을 포함할 수 있다.
CD3 단백질은 다섯 개의 서브유닛으로 이루어지고, 이 중 CD3ζ 서브유닛(CD3 zeta)은 세 개의 ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation) 모티프를 함유하며, 상기 모티프는 TCR(T cell receptor)-CD3 복합체에서 중요한 형질 도입 영역이다. 한편, FcεRIγ는 주로 비만 세포와 호염기성 과립구 표면에 분포하고, 하나의 ITAM 모티프를 함유하며, CD3ζ와 구조, 분포 및 기능이 유사하다. 상기 CD3ζ 또는 FcεRIγ 단백질의 세포내 신호영역은 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 상기 기재한 바와 같이 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 CD3ζ 단백질의 세포내 신호영역은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 본 발명의 키메라 항원 수용체와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 당업계에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있고, 그 활성을 저하시키지 않는 하나 또는 그 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 유전자 서열과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자에서, BTLA를 암호화하는 부분은 각각 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, CD160를 암호화하는 부분은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, CD28을 암호화하는 부분은 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, CD3ζ를 암호화하는 부분은 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 유전자는 키메라 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 당업계에 알려진 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 격리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이를 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 조성물로서, 본 발명은 당업계에 알려진 벡터를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 벡터는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 파지미드, 코스미드 또는 바이러스일 수 있으며, 상기 바이러스는 파지 또는 파지 유도체일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 비 플라스미드 또는 비 바이러스 화합물일 수 있고, 구체적으로, 폴리리신 화합물 또는 리포좀일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스벡터, 아데노-관련 바이러스벡터, 레트로 바이러스벡터, 렌티 바이러스벡터 등을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 벡터를 도입할 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열을 적절히 선택하고, 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 등을 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 렌티 바이러스벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 벡터로 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자를 세포에 도입하여 세포를 형질전환시킬 수 있고, 형질전환에는 당업계에 알려진 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 상기 세포는 키메라 항원 수용체를 세포막에서 발현 할 수 있어야 하고, 구체적으로, 상기 세포는 T 세포, NKT 세포, 조절 T 세포(regulator T cell), NK 세포(natural killer cell) 또는 B 세포(B cell)등의 면역세포일 수 있으며, 골수, 말초혈액, 말초혈액 단핵세포 또는 제대혈로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포는 T 세포 또는 NKT 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하여 암세포의 항원을 인지할 수 있고, 이를 통해 암세포에 특이적으로 결합해 항암 효과를 나타낼 수 있다.
상기 암은 당업계에 알려진 암종을 제한없이 포함할 수 있고, 구체적으로, HVEM을 발현하는 암세포를 포함하는 암종일 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 피내 투여될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 상기 약제학적 담체는 생리학적으로 허용되고, 인간에게 투여될 때 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 구체적으로, 상기 약제학적 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 또는 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등일 수 있고, 안정화제 또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있고, 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 세포외 결합영역에 HVEM과 결합하는 BTLA 또는 CD160 단백질 자체를 포함하는 CAR를 제작하여(도 1 참조), 상기 CAR를 도입한 T 세포 또는 NKT 세포와 HVEM을 과발현시킨 골수성 백혈병 세포를(도 2 내지 4 참조) 공동 배양하면 IL2 농도가 증가하고(도 5 참조), 골수성 백혈병 세포가 선택적으로 용해됨을(도 6 내지 8 참조)확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HVEM을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 제조
1-1. CAR의 제조
HVEM과 결합하는 BTLA 또는 CD160 단백질 자체를 포함하는 CAR 구조체(construct)를 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, BTLA를 포함하는 BTLA-28z 구조체는(도 1), BTLA cDNA(Origene, RC219458)를 주형으로 BTLA-F_XhoI 프라이머 및 BTLA-CD28Z-R 프라이머를 이용해 PCR을 수행하고, CD19scFv-28z cDNA를 주형으로 BTLA-CD28Z-F 프라이머 및 FMC63-28Z-R_EcoRI 프라이머를 이용해 PCR을 수행한 뒤, 각각의 PCR 산물을 겔 추출(gel extraction)한 것을 주형으로 BTLA-F_XhoI 프라이머 및 FMC63-28Z-R_EcoRI 프라이머를 이용해 PCR을 수행함으로써 제작하였다. 한편, CD160을 포함하는 CD160-28z 구조체는(도 1), CD160 cDNA(Origene, RC204886)를 주형으로 CD160-F_XhoI 프라이머 및 CD160-CD28Z-R 프라이머를 이용해 PCR을 수행하고, CD19scFv-28z cDNA를 주형으로 CD160-CD28Z-F 프라이머 및 FMC63-28Z-R_EcoRI 프라이머를 이용해 PCR을 수행한 뒤, 각각의 PCR 산물을 겔 추출한 것을 주형으로 CD160-F_XhoI 프라이머 및 FMC63-28Z-R_EcoRI 프라이머를 이용해 PCR을 수행함으로써 제작하였다. PCR에 이용된 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.
프라이머 명칭 염기서열(5'-3') 서열번호
BTLA-F_XhoI atc gtc ctc gag atg aag aca ttg cct gcc 9
BTLA-CD28Z-R agg agg agg ata cat aac ttc aat act ata cag gag cca ggg tct gct 10
BTLA-CD28Z-F agc aga ccc tgg ctc ctg tat agt att gaa gtt atg tat cct cct cct 11
FMC63-28Z-R_EcoRI atc gtc gaa ttc tta gcg agg ggg cag ggc 12
CD160-F_XhoI atc gtc ctc gag atg ctg ttg gaa ccc ggc 13
CD160-CD28Z-R agg agg agg ata cat aac ttc aat gaa gcc tga act gag agt gcc ttc 14
CD160-CD28Z-F gaa ggc act ctc agt tca ggc ttc att gaa gtt atg tat cct cct cct 15
1-2. 렌티바이러스 벡터의 제조
실시예 1-1에서 제작한 CAR 구조체를 하기의 방법으로 벡터에 삽입하여 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 구체적으로, pLVX-BTLA-28z는, 실시예 1-1에서 제작한 BTLA-28z 구조체와 pLVX-puro 벡터를 XhoI 제한효소 및 EcoRI 제한효소로 절단(cutting)한 후 라이게이션(ligation)함으로써 제조하였고, pLVX-CD160-28z는, 실시예 1-1에서 제작한 CD160-28z 구조체와 pLVX-puro 벡터를 XhoI 제한효소 및 EcoRI 제한효소로 절단한 후 라이게이션함으로써 제조하였다.
실시예 2. HVEM을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 도입된 세포의 제조
2-1. CAR이 도입된 T 세포 제조
상기 실시예 1에서 제조한 CAR를 발현하는 T세포를 제조하였다.
구체적으로, Jurkat 세포주에 1350 V, 10 ms 조건에서 전기천공법(electroporation)을 3번 수행하여, 실시예 1에서 제조한 pLVX-BTLA-28z 또는 pLVX-CD160-28z를 일시적으로 형질감염(transient transfection)시켰다. 감염된 세포의 용해물을 SDS-PAGE gel에 로딩하고, 1시간 후 PVDF 막으로 단백질을 트렌스퍼(transfer)한 뒤 항-CD3ζ 항체(BD, Cat.# 51-6527GR)를 이용하여 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, pLVX-BTLA-28z 또는 pLVX-CD160-28z가 형질감염된 세포에서 CAR의 CD3ζ 세포내 신호영역 부위의 발현을 확인할 수 있었다.
2-2. CAR이 도입된 NKT 세포 제조
상기 실시예 1에서 제조한 CAR를 발현하는 NKT세포를 제조하였다.
구체적으로, 293T 세포주에 실시예 1에서 제조한 pLVX-BTLA-28z 또는 pLVX-CD160-28z와 함께 pMDLg/pRRE(Addgene, Cat.# 12251), pRSV-Rev(Addgene, Cat.# 12253) 및 pMD2.G(Addgene, Cat.# 12259)를 코트렌스펙션(co-transfection)시킨 후, 이를 KHYG-1 세포주에 감염시켰다. 감염된 세포의 용해물을 SDS-PAGE gel에 로딩하고, 1시간 후 PVDF 막으로 단백질을 트렌스퍼한 뒤 항-CD3ζ 항체(BD, Cat.# 51-6527GR)를 이용하여 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, CAR의 CD3ζ 세포내 신호영역 부위는 pLVX-BTLA-28가 형질감염된 세포에서 강하게 발현되었으나, pLVX-CD160-28z가 형질감염된 세포에서는 약하게 발현되었다.
실시예 3. HVEM을 과발현하는 골수성 백혈병 세포(K562 cell)의 제조
본 발명의 CAR가 도입된 T세포 및 NKT세포의 세포 독성 활성을 확인하기 위해 HVEM을 과발현하는 골수성 백혈병 세포를 제조하였다.
구체적으로, K562 세포주에 1350 V, 10 ms 조건에서 전기천공법을 4번 수행하여, myc tag이 달린 HVEM 발현 벡터(Origene, Cat.# RC201167)를 일시적으로 형질감염시켰다. 감염된 세포의 용해물을 SDS-PAGE gel에 로딩하고, 1시간 후 PVDF 막으로 단백질을 트렌스퍼한 뒤 항-myc 항체를 항체(Origene, Cat.# TA150121)를 이용하여 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HVEM 발현 벡터가 감염된 세포에서 HVEM이 발현됨을 알 수 있었다.
실험예 1. IL2 농도 변화 확인
실시예 2-1에서 제조한 T 세포 및 실시예 3에서 제조한 K562 세포를 공동배양(co-culture)한 후, IL2 농도 변화를 확인하였다.
먼저, 실시예 2-1에서 제조한, BTLA를 포함하는 CAR을 발현하는 Jurkat 세포, CD160을 포함하는 CAR을 발현하는 Jurkat 세포와, 실시예 3에서 제조한 HVEM을 발현하는 K562 세포를 준비하고, 대조군으로는 pLVX 벡터가 형질감염된 Jurkat 세포 및 K562 세포를 준비하였다. 96 웰 플레이트에 각각의 Jurkat 세포 및 K562 세포를 다양한 조합으로 1x105개 및 1x104개씩 분주하여 공동배양한 뒤, 24시간 후 상층 배지를 분리하여 IL2 분석 키트(Biolegend)로 IL2 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, BTLA를 포함하는 CAR을 발현하는 Jurkat 세포 또는 CD160을 포함하는 CAR을 발현하는 Jurkat 세포와, HVEM을 발현하는 K562 세포를 공동배양했을 때 IL2의 농도가 유의적으로 증가하였다.
실험예 2. 세포 용해 확인
실시예 2-2에서 제조한 NKT 세포 및 K562 세포를 공동배양한 후, K562 세포의 용해 정도를 확인하였다.
먼저, HVEM 발현 벡터 및 루시퍼라제(luciferase) 발현벡터를 형질감염시킨 K562 세포를 준비하고, 대조군으로는 HVEM 발현 벡터 대신 pCMV5 플라스미드를 감염시킨 K562 세포를 준비하였다. 구체적으로, K562 세포주에 1350 V, 10 ms 조건에서 전기천공법을 4번 수행하여, myc tag이 달린 HVEM 발현 벡터(Origene, Cat.# RC201167)를 일시적으로 형질감염시켰다. BTLA를 포함하는 CAR을 발현하거나, CD160을 포함하는 CAR을 발현하는 KHYG-1 세포를, 상기 K562와 2:1, 5:1, 또는 10:1의 비율로 공동배양한 뒤, 4시간 후 루시퍼라제 분석(luciferase assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, BTLA를 포함하는 CAR을 발현하는 KHYG-1 세포 또는 CD160을 포함하는 CAR을 발현하는 KHYG-1 세포와, HVEM을 발현하는 K562 세포를 5:1 이상의 비율로 공동배양했을 때, K562 세포의 용해 정도가 유의적으로 증가하였다. 상기 결과로부터, BTLA 또는 CD160을 포함하는 CAR을 발현하는 KHYG-1 세포는 HVEM을 발현하는 K562 세포를 선택적으로 용해시키는 것을 알 수 있었다.
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Sequence <220> <223> CD160 <400> 2 Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser 20 25 30 Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His 35 40 45 Lys Lys Glu Glu Ala Glu Gly Phe Val Val Phe Leu Cys Lys Asp Arg 50 55 60 Ser Gly Asp Cys Ser Pro Glu Thr Ser Leu Lys Gln Leu Arg Leu Lys 65 70 75 80 Arg Asp Pro Gly Ile Asp Gly Val Gly Glu Ile Ser Ser Gln Leu Met 85 90 95 Phe Thr Ile Ser Gln Val Thr Pro Leu His Ser Gly Thr Tyr Gln Cys 100 105 110 Cys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Gly Ile Arg Leu Gln Gly His Phe Phe 115 120 125 Ser Ile Leu Phe Thr Glu Thr Gly Asn Tyr Thr Val Thr Gly Leu Lys 130 135 140 Gln Arg Gln His Leu Glu Phe Ser His Asn Glu Gly Thr Leu Ser Ser 145 150 155 160 Gly Phe <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 <400> 3 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 65 70 75 80 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 85 90 95 Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 100 105 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta <400> 4 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 5 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTLA <400> 5 atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60 ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120 aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180 aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240 aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300 cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360 tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420 gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag t 471 <210> 6 <211> 464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD160 <400> 6 gctgctgtgc cctggccatc ctgctggcaa ttgtggacat ccagtctggt ggatgcatta 60 acatcaccag ctcagcttcc caggaaggaa cgcgactaaa cttaatctgt actgtatggc 120 ataagaaaga agaggctgag gggtttgtag tgtttttgtg caaggacagg tctggagact 180 gttctcctga gaccagttta aaacagctga gacttaaaag ggatcctggg atagatggtg 240 ttggtgaaat atcatctcag ttgatgttca ccataagcca agtcacaccg ttgcacagtg 300 ggacctacca gtgttgtgcc agaagccaga agtcaggtat ccgccttcag ggccattttt 360 tctccattct attcacagag acagggaact acacagtgac gggattgaaa caaagacaac 420 accttgagtt cagccataat gaaggcactc tcagttcagg cttc 464 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 <400> 7 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120 tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180 tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240 atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300 gacttcgcag cctatcgctc c 321 <210> 8 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta <400> 8 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTLA-F_XhoI <400> 9 atcgtcctcg agatgaagac attgcctgcc 30 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTLA-CD28Z-R <400> 10 aggaggagga tacataactt caatactata caggagccag ggtctgct 48 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTLA-CD28Z-F <400> 11 agcagaccct ggctcctgta tagtattgaa gttatgtatc ctcctcct 48 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMC63-28Z-R_EcoRI <400> 12 atcgtcgaat tcttagcgag ggggcagggc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD160-F_XhoI <400> 13 atcgtcctcg agatgctgtt ggaacccggc 30 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD160-CD28Z-R <400> 14 aggaggagga tacataactt caatgaagcc tgaactgaga gtgccttc 48 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD160-CD28Z-F <400> 15 gaaggcactc tcagttcagg cttcattgaa gttatgtatc ctcctcct 48

Claims (11)

  1. 세포외 결합영역(ectodomain)으로 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 BTLA(B and T lymphocyte attenuator) 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인 CD160(cluster of differentiation 160), 막관통 영역(transmembrane domain), 및 세포내 신호영역(endodomain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)로서, 상기 세포외 결합영역은 HVEM(Herpesvirus entry mediator)에 특이적으로 결합하는 영역인 키메라 항원 수용체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 막관통 영역은 CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막통과 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28, CD137, 및 CD134로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포내 신호영역을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  7. 제 1항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 유전자.
  8. 제 7항의 유전자를 포함하는 벡터.
  9. 제 8항의 벡터로 형질전환된 분리된 세포.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 세포는 T 세포(T cell) 또는 NKT 세포(natural killer T cell)인 분리된 세포.
  11. 제 10항의 분리된 세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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