NO321707B1 - Isolert DNA som koder for et TRAIL-polypeptid og et opploselig TRAIL-polypeptid, ekspresjonsvektor, fremgangsmate for fremstilling av et TRAIL-polypeptid, isolert DNA som koder for et fusjonsprotein, fremgangsmate for fremstilling av en TRAIL-oligomer, antistoff som binder et TRAIL-polypeptid, renset TRAIL-polypeptid og opploselig TRAIL-polypeptid, oligomer, farmasoytisk preparat, farmasoytisk preparat for bruk som et medikament, farmasoytisk preparat for anvendelse ved indusering av apoptose hos malceller samt anvendelse av et TRAIL-polypeptid ved fremstilling av et medikament. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert DNA som koder for et TRAIL-polypeptid og et oppløselig TRAIL-polypeptid, ekspresjonsvektor, fremgangsmåte for fremstilling av et TRAIL-polypeptid, isolert DNA som koder for et fusjonsprotein, fremgangsmåte for fremstilling av en TRAIL-oligomer, antistoff som binder et TRAIL-polypeptid, renset TRAIL-polypeptid og oppløselig TRAIL-polypeptid, oligomer, farmasøytisk preparat, farmasøytisk preparat for bruk som et medikament, farmasøytisk preparat for anvendelse ved indusering av apoptose hos målceller samt anvendelse av et TRAIL-polypeptid ved fremstilling av et medikament.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Programmert celledød i form av apoptosis er forskjellig fra celledød som følge av nekrose. Apoptosis skjer ved embryogenese, metamorfose, endokrinavhengig vevsatrofi, normalvevomsetning og immunthymocyttdød (indikert ved deres antigenreseptorkompleks eller ved glukokortikoider) Itoh et al., cell 66:233,1991). Under modning av T-celler i thymus underlegges T-celler som gjenkjenner selv-antigener ved den apoptotiske prosess, mens andre er positivt utvalgt. Muligheten av at enkelte T-celler gjenkjenner visse selv-epitoper (f.eks. utilstrekkelig prosesserte og presenterte antigendeterminanter til et gitt selv-protein) unnslipper denne elimineringsprosess og senere spiller en rolle ved autoimmun sykdom er foreslått (Gammon et al., Immunology Today 12:193, 1991).

Et celleoverflateantigen kjent som Fas er rapportert å mediere apoptosis

og er antatt å spille en rolle ved klonal påvisning av sel-reaktive T-celler (Itoh et al.,

Cell 66:233,1991; Watanabe-Fukunage et al., Nature 356:314,1992). Kryssbinding

av et spesifikt monoklonalt antistoff mot Fas er rapportert å føre til induksjon av ulike cellelinjer slik at de går inn i apoptosis (Yonehara et al., J. Exp., Med., 169:1747,1989; Trauth et al., Science, 245:301,1989. Under visse betingelser kan imidlertid binding

av et spesifikt antistoff til Fas ha en kostimulerende effekt på nylig isolerte T-celler (Alderson et al., J. Exp. Med. 178:2231,1993).

DNA som koder for en Fas-ligand i rotte (Suda et al., Cell, 75:1169;

1993) og en human Fas-ligand (Takahashi et al., International Immunology 5:1567, 1994) er isolert. Binding av Fas-liganden til celler som uttrykker Fas-antigen er vist å indusere apoptosis (Suda et al., supra, og Takahashi et al., supra.

H-J. Gruss et al., Blood, vol. 85, nr. 12, 1995, s. 3378-3404 beskriver strukturelle trekk ved tumor necrosis faktorliganden og reseptorfamiliene, og de fysiologiske og patologiske aktiviteter formidlet av disse proteiner.

Undersøkelser med hensyn til tilstedeværelse og identiteten til andre molekyl(er) som spiller en rolle ved apoptosis er ønskelig. Identifisering av slike molekyler vil tilveiebringe en ytterligere metode for regulering av apoptosis, i tillegg til å tilveiebringe ytterligere innsikt med hensyn til utvikling av selv-toleranse hos immunsystemet og etiologien ved autoimmunsykdommer.

O ppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert DNA som koder for et TRAIL-polypeptid, kjennetegnet ved at TRAIL-polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens som er utvalgt fra: (a) aminosyrene 1 til 281 ifølge SEKV. ID NR. 2., (b) aminosyrene 1 til 291 ifølge SEKV. ID NR. 6, eller (c) et fragment av (a) eller (b) der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler, der nevnte TRAIL-polypeptid er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

Videre omfatter oppfinnelsen isolert DNA som koder for et oppløselig TRAIL-polypeptid, kjennetegnet ved at det oppløselige TRAIL-polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens utvalgt fra: a) det ekstracellulære domenet til det humane TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 2; b) det ekstracellulære domenet til det murine TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 6;

eller c) et fragment av det ekstracellulære domenet til (a) eller (b); der nevnte fragment

er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler, hvori det oppløselige TRAIL-. polypeptid har evnen til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

Også omfattet av oppfinnelsen er en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av et TRAIL-polypeptid, kjennetegnet ved at fremgangsmåten er kjennetegnet ved dyrkning av en vertscelle inneholdende en vektor ifølge oppfinnelsen under betingelser som fremmer ekspresjon av TRAIL, og utvinning av TRAIL-polypeptidet.

Også omfanget av oppfinnelsen er isolert DNA som koder for et fusjonsprotein som er kjennetegnet ved at det omfatter et TRAIL-DNA ifølge oppfinnelsen som er fusjonert DNA som koder for et heterologt popypeptid.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av en TRAIL-oligomer, kjennetegnet ved at fremgangsmåten er kjennetegnet ved dyrkning av en vertscelle inneholdende en ekspresjonsvektor som omfatter et DNA ifølge krav 11, under betingelser som fremmer ekspresjon av fusjonsproteinet og oligomerisering derav og utvinning av TRAIL-oligomeren.

Også omfattet av oppfinnelsen er antistoff som binder et TRAIL-polypeptid utvalgt fra det humane TRAIL-polypeptid i følge SEKV. ID NR. 2 eller det murine TRAIL-polypeptid i følge SEKV. ID NR. 6; eller et antigen-bindende fragment av nevnte antistoff.

Oppfinnelsen omfatter også renset TRAIL-polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens som er utvalgt fra: (a) aminosyrene 1 til 281 ifølge SEKV. ID NR. 2; (b) aminosyrene 1 til 291 ifølge SEKV. ID NR. 6; eller (c) et fragment av (a) eller (b) der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler, der nevnte TRAIL-polypeptid er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

Videre omfatter oppfinnelsen renset oppløselig TRAIL-polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens som er utvalgt fra: (a) det ekstracellulære domenet til det humane TRAIL-proteinet ifølge SEKV. ID NR. 2; (b) det ekstracellulære domenet til det murine TRAIL-proteinet ifølge SEKV. ID NR. 6; eller (c) et fragment av det ekstracellulære domenet av (a) eller (b) der nevnte fragment er i stand til å induserapoptose hos Jurkat-celler; der nevnte oppløselige TRAIL-protein er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

Oppfinnelsen omfatter videre oligomer, kjennetegnet ved at den omfatter fra to til tre oppløselige TRAIL-polypeptider ifølge oppfinnelsen.

Også omfattet av oppfinnelsen er et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter et TRAIL-polypeptid eller oligomer ifølge oppfinnelsen og en fysiologisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipiens.

Videre omfattet av oppfinnelsen er et farmasøytisk preparat for bruk som et medikament, kjennetegnet ved at det omfatter et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også farmasøytisk preparat for anvendelse ved indusering av apoptose hos målceller, kjennetegnet ved at de omfatter et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge oppfinnelsen.

Videre omfattes oppfinnelsen av anvendelse av et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge oppfinnelsen ved fremstillingen av et medikament for behandling av cancer.

Oppfinnelsen omfattes også av anvendelse av et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge oppfinnelsen ved fremstillingen av et medikament for behandling av virusinfeksjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et nytt cytokinprotein i tillegg til isolert DNA som koder for cytokinet og ekspresjonsvektorer, omfattende det isolerte DNA. Egenskapene til det nye cytokin, som er medlem av tumornekrosefaktor (TNF)-ligand familien, omfatter evnen til å indusere apoptosis i visse typer målceller. Proteinet er således kalt TNF-relatert apoptosis induserende ligand (TRAIL). Blant celletypene som drepes i kontakt med TRAIL er cancerceller slik som leukemi-, lymfom- og melanomceller og celler infisert med et virus.

En fremgangsmåte for fremstilling av TRAIL-polypeptider omfatter dyrkning av vertsceller transformert med en rekombinant ekspresjonsvektor som inneholder TRAIL-kodene DNA under betingelser som er egnet for uttrykk av TRAIL, det uttrykte TRAIL-polypeptidet utvinnes så fra kulturen. Antistoffer rettet mot TRAIL-polypeptider er også tilveiebrakt.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 presenterer resultater av en analyse beskrevet i eksempel 8. Analysen viste at et oppløselig humant TRAIL-polypeptid induserte død i Jurkat-celler som er en leukemicellelinje. Figur 2 presenterer resultatene av en analyse beskrevet i eksempel 11. Kontakt med et oppløselig humant TRAIL-polypeptid induserte død i cytomegalo-infiserte humane fibroblaster, hvorved ikke viralt infiserte fibroblaster ikke ble drept.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Et nytt protein kalt TRAIL er tilveiebrakt heri, sammen med DNA som koder for TRAIL og rekombinante ekspresjonsvektorer omfattende TRAIL-DNA. En fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante TRAIL-polypeptider omfatter dyrkning av vertsceller transformert med de rekombinante ekspresjonsvektorene under betingelser som er egnet for uttrykk av TRAIL og utvinning av uttrykt TRAIL.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffer som spesifikt binder TRAIL-proteiner. I en utførelsesform er antistoffene monoklonale antistoffer.

TRAIL-proteinet induserer apoptosis i visse typer målceller, slik som transformerte celler som omfatter, men er ikke begrenset til cancerceller og virusinfiserte celler. Som vist i eksemplene 5,8,9 og 10 under induserte TRAIL apoptosis i humane leukemi-, lymfom- og melanomcellelinjer. Blant anvendelsene av TRAIL omfattes anvendelse ved dreping av cancerceller. TRAIL kan dessuten anvendes ved behandling av virusinfeksjoner. Infeksjon med cytomegalovirus (CMV) gjorde humane fibroblaster mottakelige for apoptosis når de var i kontakt med TRAIL, mens uinfiserte fibroblaster ikke ble drept ved kontakt med TRAIL (se eksempel 11).

Isolering av et DNA som koder for human TRAIL er beskrevet i eksempel 1 nedenfor. Nukleotidsekvensen til det humane TRAIL-DNA isolert i eksempel l er vist i SEKV. ID NR. 1 og aminosyresekvensen som kodes derav er vist i SEKV. ID NR. 2. Dette humane TRAIL-protein omfatter et N-terminalt cytoplasmatisk domene (aminosyrene 1-18), et transmembranområde (aminosyrene 19-38) og et ekstracellulært domene (aminosyrer 39-281). Det ekstracellulære domene inneholder et reseptorbindende område.

Celler fra E. coli- stamme DH10B transformert med en rekombinant vektor omfattende dette humane TRAIL DNA ble deponert i American Type Culture Collection 14. juni 1995 med aksesjonsnr. 69849. Deponeringen ble utført ifølge Budapesttraktaten. Den rekombinante vektor i den deponerte stamme er ekspresjonsvektoren pDC409 (beskrevet i eksempel 5). Vektoren ble spaltet med Sali og Noti og humant TRAIL-DNA som omfatter hele det kodede område vist i SEKV. ID NR. 1 ble legert inn i vektoren.

DNA som koder for et annet humant TRAIL-protein ble isolert som beskrevet i eksempel 2. Nukleotidsekvensen til dette DNA er vist i SEKV. ID NR. 3 og aminosyresekvensen som kodes derav er presentert i SEKV. ID NR. 4. Det kodede protein omfatter et N-terminalt cytopatisk domene (aminosyrene 1-18), et transmembrant område (aminosyrene 19-38) og et ekstracellulært domene (aminosyrene 39-101).

DNA<*>et ifølge SEKV. ID NR. 3 mangler en del av DNAet i følge SEKV. ID NR, 1 og er således kalt den humane TRAIL-avkortede variant (huTRAILdv)-klon. Nukleotidene 18 til 358 i følge SEKV. ID NR. 1 er identisk med nukleotidene 8 tit 348 i huTRAILdv-DNA i følge SEKV. ID NR. 3. Nukleotidene 359 til 506 i følge SEKV. ID NR. 1 mangler i forhold til det klonede DNA i følge SEKV. ID NR. 3. Avkortningen forårsaker en skiftning i leserammen, noe som resulterer i et stoppkodon i leseramme etter aminosyre 101 av SEKV. ID NR. 4. DNA'et i følge SEKV. ID NR. 3 koder således for avkortet protein. Aminosyrene 1-90 i følge SEKV. ID NR. 2 er identiske med aminosyrene 1-90 i følge SEKV. ID NR. 4. Som følge av avkortningen avviker imidlertid den C-terminale delen av huTRAILdv-proteinet (aminosyrene 91-101 av SEKV. ID NR. 4) fra restene i de tilsvarende posisjoner i følge SEKV. ID NR. 2.1 motsetning til fullengde huTRAIL-proteinet viser ikke det avkortede huTRAILdv-proteinet evnen til å indusere apoptosis i T-celleleukemicellene fra Jurkat-cellelinjen. ;DNA som koder for et TRAIL-protein fra mus er også isolert, som beskrevet i eksempel 3. Nukleotidsekvensen til dette DNA er vist i SEKV. ID NR. 5 og aminosyresekvensen kodet derav er vist i SEKV. ID NR. 6. Det kodede protein omfatter et N-terminalt cytoplasmatisk domene (aminosyrene 1-17) et transmembranområde (aminosyrene 18-38) og et ekstracellulært domene (aminosyrene 39-291). Dette TRAIL fra mus er 64 % identisk med det humane TRAIL med SEKV. ID NR. 2 på aminosyrenivå. Det kodede område av TRAIL-nukleotidsekvensen fra mus er 75 % identisk med det kodende område i den humane nukleotidsekvensen i følge SEKV. ID NR. 1. ;TRAIL ifølge foreliggende oppfinnelse er forskjellig fra proteiner kjent som Fas-ligand (Suda et al., Cell, 75:1169, 1993; Takahashi et al., International Immunology 6:1567,1994). Fas-ligand induserer apoptosis i visse celletyper, via reseptoren kjent som Fas. Som vist i eksempel 5 formidles ikke TRAIL-indusert apoptosis i målceller gjennom Fas. Den humane TRAIL-aminosyresekvensen i følge SEKV. ID NR. 2 er ca. 20 % identisk med den humane Fas-ligandaminosyresekvensen presentert i Takahashi et al., supra. Det ekstracellulære domene i humant TRAIL er ca. 28,4 % identisk med det ekstracellulære domene i human Fas-ligand. ;Aminosyresekvensene beskrevet heri avdekker at TRAIL er et medlem av TNF-ligandfamilien (Smith et al. Cell, 73:1349,1993; Suda et al., Cell, 75-1169, 1993; Smith et al., Cell, 76:959, 1994). Den prosentvise likhet mellom aminosyresekvensen til humant TRAIL-ekstracellulært domene og aminosyresekvensen i det ekstracellulære domene til andre proteiner i denne familie er som følger: 28,4 % når det gjelder Fas-ligand, 22,4 % når det gjelder lymfotoksin-å, 22,9 % når det gjelder TNF-å, 23,1 % når det gjelder TNF-å, 22,1 % når det gjelder CD30-ligand og 23,4 % når det gjelder CD40-ligand. ;TRAIL ble undersøkt i forhold til dets evne til å binde reseptorer fra TNF-R-reseptorfamilien. Bindingsanalysen ble utført ved anvendelse av sideautoradiografiprosedyren til Gearing et al. ( EMBOJ. 8:3667, 1989). Analysen avdekket ingen påviselig binding av humane TRAIL til human CD30, CD40,4-1BB, OX40, TNF-R (p80 form), CD27 eller LTåR (også kjent som TNFR-RP). Resultatene i eksempel 5 viser at human TRAIL ikke binder human Fas. ;TRAIL-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptider med aminosyresekvenser som avviker fra, men er meget homologe til de presentert i SEKV. ID NR. 2 og 6. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til homologer avledet fra andre pattedyrarter, varianter (både naturlig forekommende varianter og de fremkommet ved rekombinant DNA-teknologi) og TRAIL-fragmenter med en ønsket biologisk aktivitet. Slike polypeptider viser en biologisk aktivitet til TRAIL-proteinet i følge SEKV. ID NR. 2 og 6 og omfatter fortrinnsvis en aminosyresekvens som i det minste er 80 % identisk (fortrinnsvis minst 90 % identisk) med aminosyresekvensen presentert i SEKV. ID NR. 2 eller SEKV. ID NR. 6. Disse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er beskrevet i mer detalj nedenfor. ;Konserverte sekvenser lokalisert i den C-terminale delen av proteinene i TNF-familien er identifisert i Smith et al. ( Cell, 73:1349, side 1353 og figur 6); Suda et al. ( Cell, 75:1169, 1993, se figur 7); Smith et al. ( Cell, 76:959, 1994, se figur 3); og Goodwin et al. ( Eur. J. Immunol., 23:2631, se figur 7 og sidene 2638-39). Blant aminosyrene i det humane TRAIL-proteinet som er konservert (i det minste hoveddelen av TNF-familiemedlemmene) er de i posisjonene 124-125(AH), 136(L),154(W),169(L), 174(L), 180(G), 182(Y), 187(Q), 190(F), 193(Q) og 275-276(FG) av SEKV. ID NR. 2. Et annet strukturelt trekk ved TRAIL er et avstandsområde mellom C-terminalende i transmembranområdet og delen av det ekstracellulære domene som er antatt å være mest viktig for biologisk aktivitet. Dette avstandsområde, lokalisert i N-terminalende av det ekstracellulære domene, består av aminosyrene 39-94 i følge SEKV. ID NR. 2. Analoge avstandsfrekvenser er funnet i andre familiemedlemmer, f.eks. CE40-ligand. Aminosyrene 138-153 tilsvarende en løkke mellom å-flakene i det foldede (tredimensjonale) humane TRAIL-protein. ;Tilveiebrakt er også membranbundet TRAIL-proteiner (omfattende et cytoplasmatisk domene, et transmembranområde og et ekstracellulært domene), i tillegg til TRAIL-fragmenter som har bevart en ønsket biologisk egenskap til fullengde TRAIL-proteinet. I en utførelsesform er TRAIL-fragmenter oppløselige TRAIL-polypeptider omfattende hele eller deler av det ekstracellulære domene, men som mangler transmembranområdet som ville forårsaket tilbakeholdelse av polypeptidet og en cellemembran. Oppløselige TRAIL-proteiner har evnen til å bli utskilt fra cellene hvorved de uttrykkes. Et heterologt signalpeptid kan med fordel fusjoneres til den N-terminale ende slik at det oppløselige TRAIL utskilles etter ekspresjon. ;Oppløselig TRAIL kan identifiseres (og atskilles fra dets ikke-oppløselige membranbundet gjenparter) ved separering av intakte celler som uttrykker det ønskede protein fra kulturmediet, f.eks. ved sentrifugering, og analysering av mediet (supernatanten) med hensyn til nærvær av det ønskede protein. Tilstedeværelsen av TRAIL i mediet tyder på at proteinet ble utskilt fra cellene og er således en oppløselig form av TRAIL-proteinet. Naturlig forekommende oppløselige former av TRAIL er omfattet av foreliggende oppfinnelse. ;Anvendelse av oppløselige former av TRAIL er fordelaktig ved visse anvendelser. Rensing av proteinene fra rekombinante vertsceller er foretrukket, ettersom de oppløselige proteinene utskilles fra cellene. Dessuten er oppløselige proteiner generelt mer egnet for intravenøs administrering. ;Eksempler på oppløselige TRAIL-polypeptider er de inneholdende hele det ekstracellulære domene (f.eks. aminosyrer 39-281 i følge SEKV. ID NR. 2 eller aminosyren 39-291 i følge SEKV. ID NR. 6). Fragmenter av det ekstracellulære domene der en ønsket biologisk aktivitet er bevart er også tilveiebrakt. Slike fragmenter omfatter fordelaktige TRAIL-områder som er konservert i proteiner i TNF-ligandfamilien, som beskrevet ovenfor. ;Ytterligere eksempler på oppløselige TRAIL-polypeptider er de som ikke bare mangler det cytoplasmatiske domene og transmembranområde, men også hele eller deler av det ovenfor beskrevne avstandsområde. Oppløselige humane TRAIL-polypeptider omfatter således, men er ikke begrenset til polypeptider omfattende aminosyrene x til 281, hvori x representerer enhver av aminosyrene i posisjonene 39-95 i følge SEKV. ID NR. 2. Ved utførelsesformen der 95-resten er den N-terminale aminosyren er hele avstandsområdet avkortet. ;TRAIL-fragmenter, deriblant oppløselige polypeptider, kan fremstilles ved hjelp av enhver av flere vanlige teknikker. En DNA-sekvens som koder for et ønsket TRAIL-fragment kan subklones inn i en ekspresjonsvektor for produksjon av TRAIL-fragmenter. Den TRAIL-kodende DNA-sekvens er med fordel fusjonert til en sekvens som koder for et egnet leder- eller signalpeptid. Det ønskelige TRAIL-kodede DNA-fragmentet kan syntetiseres kjemisk ved anvendelse av kjente teknikker. DNA-fragmenter kan også produseres ved hjelp av restriksjonsendonukleasekløyving av en fullengdeklonet DNA-sekvens og isoleres ved hjelp av elektroforese på agarosegeler. OHgonukleotider som rekonstruerer 5'- eller 3'-ende i et ønsket punkt kan, dersom det er nødvendig, ombindes til et DNA-fragment generert ved hjelp av restriksjonsenzymkløyving. Slike oligonukleotider kan dessuten inneholde et restriksjonsendonukleasekløyvingssete oppstrøms for den ønskede kodende sekvens og posisjonere et initieringskodon (ATG) i den terminale ende til den kodende sekvens. ;Den velkjente polymerasekjedereaksjon (PCR)-prosedyren kan også anvendes for å isolere og amplifisere en DNA-sekvens som koder for et ønsket proteinfragment. Oligonukleotider som definerer den ønskede slutt til DNA-fragmentet er anvendt som 5'- og 3-primere. Oligonukleotidene kan dessuten inneholde gjenkjennelsesseter for restriksjonsendonukleaser, slik at innskudd av det amplifiserte DNA-fragment inn i en ekspresjonsvektor gjøres lettere. PCR-teknikker er beskrevet i (Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recinbubabt DNA Methodology, Wu et al., red. Academic Press, Inc., San Diego (1989) sidene 189-196 og PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., red., Academic Press, Inc. (1990). ;Det vil forstås av en fagperson på området at transmembranområdet til hvert TRAIL-protein, som beskrevet ovenfor, er identifisert i overensstemmelse med vanlige kriterier for identifisering av den slags type hydrofobt domene. De eksakte bindingene av et transmembranområde kan variere noe (mest sannsynlig med ikke mer enn fem aminosyrer i hver ende) fra de som er presentert ovenfor. Dataprogrammer som er anvendbare for identifisering av slike hydrofobe områder i proteiner er tilgjengelige. ;TRAIL-DNA'et ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter cDNA, kjemisk syntetisert DNA, DNA isolert ved hjelp av PCR, genomisk DNA og kombinasjoner derav. Genomisk TRAIL-DNA kan isoleres ved hjelp av hybridisering til TRAIL-cDNA beskrevet heri ved anvendelse av vanlige teknikker. ;Et søk i NCBI-databanken identifiserte fem uttrykte sekvensidenti-fikasjoner (ESTer) som hadde områder lignende TRAIL-DNA. Disse ESTer (NCBI-aksesjonsnummer T90422,T82085,T10524,R31020 og Z36726) var alle humane cDNA-fragmenter. NCBI-arkivene viste ikke noe polypeptid som var kodet av ESTer og indikerte ikke hva leserammen, dersom det var noen, kunne være. Selv om kunnskapen om leserammen angitt heri ved beskrivelse av fullstendige TRAIL-kodende områder er anvendt for å uttrykke EST'er, hadde imidlertid ingen av de kodede polypeptidene av den apoptosis-induserende egenskap til TRAIL-polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Med andre ord, dersom hver av de fem EXT'er ble innsatt i ekspresjonsvektorer nedstrøms for et initiatormetioninkodon i leserammen beskrevet heri, ville ingen av de resulterende uttrykte polypeptider inneholde en tilstrekkelig del av det ekstracellulære domene til TRAIL for å indusere apoptosis i Jurkat-celler. ;Visse utførelsesformer tilveiebringes isolert DNA omfattende en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen bestående av nukleotidene 88 til 933 i følge SEKV. ID NR. 1 (humant TRAIL-kodende område); nukleotidene 202 til 933 i følge SEKV. ID NR. 1 (som koder for det humane TRAIL-ekstracellulære domene); nukleotidene 47 til 922 i følge SEKV. ID NR. 5 (TRAIL-kodende område i mus); og nukleotidene 261 til 922 i følge SEKV. ID NR. 5 (som koder for TRAIL-ekstracellulært domene i mus). DNA som koder for biologisk aktive fragmenter av proteinene i følge SEKV. ID NR. 2 og 6 er det også tilveiebrakt. Ytterligere utførelsesformer omfatter sekvenser omfattende nukleotidene 370 til 930 i følge SEKV. ID NR. 1 og nukleotidene 341 til 919 i følge SEKV. ID NR. 5, som koder for henholdsvis de særskilte humane og murine oppløselige TRAIL-polypeptidene, som beskrevet i eksempel 7. ;Som følge av degenerering av den genetiske kode kan to DNA-sekvenser være forskjellige og fortsatt kode for samme aminosyresekvens. Oppfinnelsen tilveiebringer således isolerte DNA-sekvenser som koder biologisk aktivt TRAIL, utvalgt fra DNA omfattende det kodede område til et nativt humant eller murint TRAIL-cDNA eller fragmenter derav, og DNA som er degenerert som følge av den genetiske kode til den native TRAIL-DNA-sekvens. ;Rensede TRAIL-polypeptider er også tilveiebrakt, både rekombinante og ikke-rekombinante. Varianter og derivater av native TRAIL-proteiner der en ønsket biologisk aktivitet er bevart er også innen rammen av oppfinnelsen. I en utførelsesform er den biologiske aktivitet til en TRAIL-variant i det vesentlige lik den biologiske aktivitet til et nativt TRAIL-protein. En ønsket biologisk aktivitet til et TRAIL er evnen til å indusere død i Jurkat-celler. Analyseprosedyrer for påvisning av apoptosis i målceller er godt kjent. Dannelse av DNA-stige er blant karakteristikaene ved celledød via apoptosis og er gjenkjent som en av de observerbare fenomen som atskiller apoptotisk celledød fra nekrotisk celledød. Eksempler på analyseteknikker egnet for påvisning av død eller apoptosis i målceller omfatter de beskrevet i eksemplene 5 og 8-11. En annen egenskap ved TRAIL er dets evne til å bindes til Jurkat-celler. ;TRAIL-varianter kan f.eks. dannes ved mutasjoner av native TRAIL-nukleotidsekvenser. En TRAIL-variant er et polypeptid som i det vesentlige er homolog til et nativt TRAIL, men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra den til native TRAIL på grunn av en eller flere delesjoner, innskudd eller substitusjoner. TRAIL-kodende DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen består av sekvenser som omfatter en eller flere addisjoner, delesjoner eller substitusjoner av nukleotider ved sammenligning med en nativ TRAIL-DNA-sekvens, men som koder for et TRAIL-protein som i det vesentlige er biologisk ekvivalent med et nativt TRAIL-protein. ;Det er ønskelig at den varierende aminosyre eller DNA-sekvens er minst 80 % identisk til en nativ TRAIL-sekvens, mest foretrukket minst 90 % identisk. Graden av homologi (prosentvis identitet) mellom en nativ og en mutert sekvens kan f.eks. påvises ved sammenligning av de to sekvensene ved anvendelse av dataprogrammer som er vanlig anvendt for dette formål. Et egnet program er GAP-dataprogrammet, versjon 6.0, beskrevet av Devereux et al. ( Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) og tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-programmet gjør anvendelse av linjeoppstillingsmetoden til Needleman and Wunsch ( J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revidert av Smith and Waterman ( Adv. Appl. Math 2:482, 1981). I korte trekk viser GAP-programmet likhet i form av antallet identiske linjeoppstilte symboler (dvs. nukleotider eller aminosyrer) dividert med totalt antall symboler i den korteste av de to sekvensene. De foretrukne standardparametere for GAP-programmet omfatter: (1) en enhetlig sammenligningsmatriks (inneholdende en verdi på 1 for identitet og 0 for ikke identitet) for nukleotider og den avveide sammenligningsmatriks Gribskov og Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986 som beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, sidene 353-358, 1979; (2) en straff på 3,0 for hvert gap og en ytterligere straff på 0,1 for hvert symbol i hvert gap; og (3) ingen straff for gap i endene. ;Forandringer i den native aminosyresekvens kan gjennomføres ved hjelp av flere kjente teknikker. Mutasjoner kan introduseres i spesielle loci ved syntetisering av oligonukleotider inneholdende en mutert sekvens, flankert av restriksjonsseter som muliggjør ombinding til fragmenter fra den native sekvens. Etter ombinding koder den rekonstruerte sekvens for en analog med ønsket aminosyreinnskudd, substitusjon eller delesjon. ;Alternativt kan oligonukleotiddirigerte setespesifikke mutageneseprose-dyrer anvendes for å tilveiebringe et forandret gen med forandringer i spesifikke kodoner med hensyn til krevet substitusjon, delesjon eller innskudd. Teknikker for utførelse av slike forandringer omfatter de beskrevet av Walder et al. ( Gene 42:133, 1986); Bauer et al. ( Gene 37:73, 1985); Craik ( BioTechniques, januar 1985,12-19); Smith et al. ( Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); og U.S. patent nr. 4,518,584 og 4,737,462. ;Varianter kan omfatte konservativt substituerte sekvenser, noe som innebærer at en eller flere aminosyrerester i et nativt TRAIL-polypeptid er byttet ut med andre rester, men at det konservativt substituerte TRAIL-polypeptid har bevart en ønsket biologisk aktivitet som i det vesentlige er lik den til nativt TRAIL-polypeptid. Eksempler på konservative substitusjoner omfatter substitusjon av aminosyrer som ikke forandrer den sekundære og/eller tertiære struktur til TRAIL. Andre eksempler omfatter substitusjon av aminosyrer utenfor det reseptorbindende domene, når den ønskede biologiske aktivitet er evnen til å binde en reseptor på målceller og indusere apoptosis i målcellene. En gitt aminosyre kan byttes ut med en rest med lignende fysiokjemiske karakteristika, f.eks. substitusjon av en alifatisk rest med en annen (slik som Ile,Val,Leu eller Ala med en annen), eller substitusjon av en polar rest med en annen (slik som mellom Lys og Arg; Glu og Asp; eller Gin og Asn). Andre slike konservative substitusjoner, f.eks. substitusjoner av hele områder med lignende hydrofobisitetskarakteristika er godt kjent. TRAIL-polypeptider omfattende konservative aminosyresubstitusjoner kan testes i en av analysene beskrevet heri for å bekrefte at en ønsket biologisk aktivitet til et nativt TRAIL er bevart. DNA-sekvenser som koder for TRAIL-polypeptider inneholdende slike konservative aminosyresubstitusjoner er omfattet av foreliggende oppfinnelse. ;Konserverte aminosyrer lokalisert i den C-terminale del av proteinene i TNF-familien, og antatt å være viktige for biologisk aktivitet, er identifisert. Disse konserverte sekvenser er beskrevet i Smith et al. ( Cell, 73:1349, 1993, se side 1353 og figur 6; Suda et al. ( Cell, 75:1169, 1993, se figur 7); Smith et al. ( Cell, 76:959, 1994, se figur 3); og Goodwin et al. ( Eur. J. Immunol, 23:2631,1993, se figur 7 og sidene 2638-39). De konserverte aminosyrer forandres ikke ved generering av konservativt substituerte sekvenser, noe som er en fordel. Aminosyrer funnet i samme posisjoner hos andre medlemmer av TNF-familien substitueres dersom de forandres. ;TRAIL kan også modifiseres for å danne TRAIL-derivater ved dannelse av kovalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske rester, slik som glykosylgrupper, lipider, fosfat, acetylgrupper og lignende. Kovalente TRAIL-derivater kan fremstilles ved binding av de kjemiske restene til funksjonelle grupper på TRAIL-aminosyresidekjeder eller i N-terminal eller C-terminalende av et TRAIL-polypeptid eller det ekstracellulære domene derav. Andre TRAIL-derivater innen rammen av oppfinnelsen omfatter kovalente eller aggregatkonjugater til TRAIL eller dets fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, slik som ved syntese i rekombinant kultur, i form av N-terminale eller C-terminale fusjoner. Konjugatet kan f.eks. omfatte en signal- eller lederpolypeptidsekvens (f.eks. å-faktorlederen i Saccharomyces) i N-terminalende av et TRAIL-polypeptid. Signal- eller lederpeptidet dirigerer kotranslasjonelt eller posttranslasjonelt overføring av konjugatet fra dets syntesesete til et sete inni eller utenfor cellemembranen eller celleveggen. ;TRAIL-polypeptidfusjoner kan omfatte peptider tilsatt for å fremme ;rensing og identifisering av TRAIL. Slike polypeptider omfatter, f.eks. poly-His eller antigenidentifikasjonspeptidene beskrevet i U.S. patent nr. 5,011,912 og i Hopp et al., Bio/ Technology 6:1204, 1988. Et slikt peptid er <M>FLAG"-peptidet, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEKV. ID NR. 7), som er meget antigenisk og tilveiebringer et epitope reversibelt bundet ved hjelp av et spesifikt monoklonalt antistoff, som således muliggjør rask analyse og fremmer rensing av uttrykt rekombinant protein. Denne sekvensen kløyves også spesifikt av bovin mukosal enterokinase i restene umiddelbart etter Asp-Lys-paret. Fusjonsproteiner dekket med dette peptid kan også være motstandsdyktig mot intracellulær degradering i E. Coli. ;Et murint hybridom kalt 4E11 produserer et monoklonalt antistoff som binder peptidet DYKDDDDK (SEKV. ID NR. 7) i nærvær av visse divalente metallkationer (som beskrevet i U.S. patent 5,011,912) og som er deponert i American Type Culture Collection ved aksesjonsnr. HB 9259. Ekspresjonssystemer som er anvendbare for produksjon av rekombinante proteiner fusjonert til "FLAG"-peptidet, i tillegg til monoklonale antistoffer som binder peptidet og som er anvendbare ved rensing av de rekombinante proteiner er tilgjengelig fra Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut. ;Dessuten er TRAIL-polypeptider med eller uten tilknyttet nativ glykosyleringsmønster beskrevet. TRAIL uttrykt i gjær eller pattedyrekspresjonssystemer kan være lik eller signifikant forskjellig fra et nativt TRAIL-polypeptid i molekylvekt og glykosyleringsmønster, avhengig av valgt ekspresjonssystem. Ekspresjon av TRAIL-peptider i bakterielle ekspresjonssystemer, slik som E. Coli tilveiebringer ikke-glykosylerte molekyler. ;Glykosyleringsseter i det ekstracellulære TRAIL-domene kan modifiseres til å utelukke glykosylering mens ekspresjon av en homogen redusert karbohydratanalog ved anvendelse av gjær- eller pattedyrekspresjonssystemer tillates. N-glykosyleringsseter i eukaryotepolypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-X-Y, hvori X er enhver aminosyre bortsett fra Pro og Y er Ser eller Thr. Formålstjenlige modifikasjoner i nukleotidsekvensen som koder for denne triplett vil resultere i substitusjoner, addisjoner eller delesjoner som forebygger binding av karbohydratrester i Asn-sidekjeden. Kjente prosedyrer for inaktivering av N-glykosyleringsseter i proteiner omfatter de beskrevet i U.S. patent 5,071,972 og EP 276,846. Et potensielt N-glykosyleringssete er funnet i posisjonene 109-111 i det humane protein i følge SEKV. ID NR. 2 og i posisjonene 52-54 i det murine proteinet ;SEKV. ID NR. 6. ;Ved et annet eksempel kan sekvenser som koder for Cys-rester som ikke er essensielle for biologisk aktivitet forandres til å forårsake at Cys-restene fjernes eller byttes ut med andre aminosyrer, noe som forebygger dannelse av uriktige intramolekylære disulfidbroer etter renaturering. Andre varianter er fremstilt ved modifisering av lignende dibasiske aminosyrerester til å fremme ekspresjon i gjærsystemer hvorved KEX2-proteaseaktivitet er til stede. EP 212,914 beskriver anvendelse av setespesifikk mutagenese for å inaktivere KEX2-proteaseprosesserende seter i et protein. KEX2-proteaseprosesserende seter vil aktiveres ved fjerning, tilføring eller substitusjon av rester for å forandre Arg-Arg,Arg-Lys og Lys-Arg-par slik at forekomsten av disse lignende basiske restene elimineres. Lys-Lys-par er betydelig mindre mottakelige for KEX2-kløyving og omstilling av Arg-Lys eller Lys-Arg til Lys-Lys representerer en konservativ og foretrukket tilnærming for inaktivering av KEX2-seter. Potensielle KEX2-proteaseprosesseringsseter er funnet i posisjonene 89-90 og 149-150 i proteinene i følge SEKV. ID NR. 2 og i posisjonene 85-86, 135-136 og 162-163 i proteinet i følge SEKV. ID NR. 6. ;Naturlig forekommende TRAIL-varianter er også omfattet av oppfinnelsen. Eksempler på slike varianter er proteiner som er resultat av alternative mRNA-spleisingshendelser (ettersom TRAIL er kodet av et gen med mange exon eller av proteolytisk kløyving av TRAIL-proteinet, hvori en ønsket biologisk aktivitet er beholdt. Alternativ spleising av mRNA kan gi et forandret, men biologisk aktivt TRAIL-protein, slik som f.eks. en naturlig forekommende oppløselig form av proteinet. Varianter som skyldes proteolyse omfatter f.eks. forandringer i N- eller C-terminale ender etter ekspresjon i ulike vertscelletyper, som følge av proteolytisk fjerning av en eller flere terminalaminosyrer fra TRAIL-proteinet. Dessuten kan proteolytisk kløyving frigjøre en oppløselig form av TRAIL fra en membranbundet form av proteinet. Allelvarianter er også omfattet av oppfinnelsen. ;Oligomerer ;Foreliggende oppfinnelse omfatter TRAIL-polypeptider i form av oligomerer, slik som dimerer, trimerer eller høyere oligomerer. Oligomerer kan dannes ved disulfidbindinger mellom cysteinrester i ulike TRAIL-polypeptider eller, f.eks. ved ikke-kovalente interaksjoner mellom TRAIL-polypeptidkjeder. Ved andre utførelsesformer omfatter oligomerer fra to til fire TRAIL-polypeptider forent via kovalente eller ikke kovalente interaksjoner mellom peptidrester fusjonert med TRAIL-peptider. Slike peptider kan være peptidkoblinger (spacere) eller peptider som har evnen til å fremme oligomerisering. Leucin zipper og visse polypeptider avledet fra antistoffer er blant peptidene som kan fremme oligomerisering av TRAIL-polypeptider bundet der til, som beskrevet i mer detalj nedenfor. TRAIL-polypeptidene er fortrinnsvis oppløselige. ;Fremstilling av fusjonsproteiner omfattende heterologe polypeptider fusjonert til ulike deler av antistoffavledede polypeptider (deriblant Fc-domene) er f.eks. beskrevet av Ashkenazi et al. ( PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et & L( Nature 344:667,1990); og Hollenbaugh and Aruffo ("Construction of Immunglobulin Fusion Proteins"", Current Protocols in Immunology, Supplement 4, sider 10,19,1-10,19,11, 1992). I en utførelsesform av oppfinnelsen er en TRAIL-dimer dannet ved fusjon av TRAIL til et Fc-område polypeptid avledet fra et antistoff. Med begrepet "Fc-polypeptid" omfattes native og muterte former, i tillegg til trunkerte Fc-polypeptider inneholdende et hengselområde som fremmer dimerisering. Fc-polypeptidet fusjoneres fortrinnsvis til et oppløselig TRAIL (f.eks. kun omfattende de ekstracellulære domene). ;En genfusjon inneholdende TRAIL/Fc-fusjonsprotein er innsatt i en egnet ekspresjonsvektor. TRAIL/Fc-fusjonsproteinene tillates å sammensettes på en måte som ligner antistoffmolekyler, hvoretter interkjededisulfidbindinger dannes mellom Fc-polypeptidene, noe som gir divalent TRAIL. Ved andre utførelsesformer kan TRAIL substitueres i den variable del med en antistoff tung- eller lett-kjede. Dersom fusjonsproteinet lages med både tunge og lette kjeder fra et antistoff er det mulig å danne en TRAIL-oligomer med så mange som fire ekstracellulære TRAIL-områder. ;Et egnet Fc-polypeptid er det native Fc-områdepolypeptidet avledet fra et humant IgGl, som er beskrevet i PCT-søknad WO 93/10151. Et annet anvendbart Fc-polypeptid er Fc-muteinet beskrevet i U.S. patent 5,457,035. Aminosyresekvensen til muteinet er identisk med den til den native Fc-sekvens presentert i WO 93/10151, bortsett fra at aminosyre 19 er forandret fra Leu til Ala, aminosyre 20 er forandret fra Leu til Glu og aminosyre 22 er forandret fra Gly til Ala. Denne muterte Fc viser redusert affinitet til immunglobulinreseptorer. ;Alternativt kan oligomere TRAIL omfatte to eller flere oppløselige TRAIL-polypeptider sammenkoblet ved peptidlinkere. Eksempler omfatter de peptidlinkerne som er beskrevet i U.S. patent 5,973,627. Fusjonsproteiner omfattende multiple TRAIL-polypeptider separert ved peptidlinkere kan fremstilles ved anvendelse av vanlig rekombinant DNA-teknologi. ;En annen fremgangsmåte for fremstilling av oligomere TRAIL-peptider omfatter anvendelse av en leucin zipper. Leucin zipper-domener er peptider som fremmer oligomerisering av proteinene der disse er funnet. Ulike leucin zippere ble opprinnelig identifisert i flere DNA-bindende proteiner (Landschulz et al., Science 240:1759,1988 og er etter dette blitt funnet i flere ulike proteiner. Blant kjente leucin zippere er naturlig forekommende peptider og derivater derav som dimeriserer eller trimeriserer. Eksempler på leucin zipper domener som er egnet for fremstilling av oppløselige oligomere TRAIL-proteiner er de beskrevet i PCT-søknad WO 94/10308. Rekombinante fusjonsproteiner omfattende et oppløselig TRAIL-polypeptid fusjonert til et peptid som dimeriserer eller trimeriserer i oppløsning er uttrykt i egnede vertsceller, og resulterende oppløselige oligomer TRAIL utvinnes fra kultursupernatanten. ;Ulike medlemmer av TNF-familien av proteiner er antatt å eksistere i trimere former (Beutler and Huffel, Sience 264:667, 1994; Banner et al., Cell 73:431, 1993). Timere TRAIL kan således gi fordelen av forsterket biologisk aktivitet. Foretrukne leucin zipper-rester er de som fortrinnsvis danner trimerer. Et eksempel er en leucin zipper avledet fra lungesulfaktantprotein D (SPD), som beskrevet i Hoppe et al. ( FEBSLetters 344:191, 1994) og i U.S. patentsøknad nr. 08/446,922. Andre peptider avledet fra naturlig forekommende trimere proteiner kan anvendes ved fremstilling av trimer TRAIL. ;Som beskrevet i eksempel 7 danner et oppløselig "Flag"-TRAIL-polypeptid uttrykt i CV-l/EBNA-celler, spontant oligomerer som er antatt å være en blanding av dimerer og trimerer. Den cytotoksiske virkning av disse oppløselige "Flag"-TRAIL ved analysen i eksempel 8 ble forsterket ved innføring av et anti-"Flag"-antistoff, muligens på grunn av antistofformidl|et kryssbinding av TRAIL/reseptorkomplekser. I en utførelsesform av oppfinnelsen er biologisk aktivitet til TRAIL forsterket ved anvendelse av TRAIL sammen med et antistoff som har evnen til å kryssbinde TRAIL. Celler som skal drepes kan bringes i kontakt med både et oppløselig TRAIL-polypeptid og et slikt antistoff. ;Som et eksempel bringes cancer eller viralt infiserte celler i kontakt med et anti-"Flag"-antistoff og et oppløselig Flag-TRAIL-polypeptid. Fortrinnsvis anvendes et antistoffragment som mangler Fc-området. Bivalente former av antistoffer kan binde "Flag"-rester fra to oppløselige "Flag"-TRAIL-polypeptider som er funnet i separate dimerer eller trimerer. Antistoffet kan blandes eller inkuberes med et "Flag"-TRAIL-polypeptid før administrering in v/vo. ;Ekspresjonss<y>stemer ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante ekspresjonsvektorer for uttrykk av TRAIL og vertsceller transformert med ekspresjonsvektorene. Ethvert egnet ekspresjonssystem kan anvendes. Vektorene omfatter et DNA som koder for et TRAIL-polypeptid,operativt bundet til egnede transkripsjonelle og translatoriske regulatoriske nukleotidsekvenser, slik som de avledet fra et pattedyr-mikrobe- viralt- eller insektgen. Eksempler på regulatoriske sekvenser som omfatter transkripsjonelle promotorer, operatører eller enhancere og mRNA ribosomalt bindingssete og egnede sekvenser som kontrollerer transkripsjon-og translasjonsinitiering og -terminering. Nukleotidsekvenser er operativt bundet når den regulatoriske sekvens forholder seg funksjonelt til TRAIL-DNA-sekvensen. Dette innebærer at en promoternukleotidsekvens er operativt bundet til en TRAIL-DNA-sekvens dersom promoternukleotidsekvensen kontrollerer transkripsjonen av TRAIL-DNA-sekvensen. Et replikasjonsorigo som overfører evnen til å replikere de ønskede vertscellene og et seleksjonsgen hvorved transformanter er identifisert, er generelt innført i ekspresjonsvektoren. ;En sekvens som koder for et egnet signalpeptid kan dessuten innføres inn i ekspresjonsvektorer. En DNA-sekvens for et signalpeptid (sekretorisk leder) kan fusjoneres i leseramme til TRAIL-sekvensen slik at TRAIL translateres initielt i form av et fusjonsprotein omfattende signalpeptidet. Signalpeptid som er funksjonelt i de ønskede vertsceller fremmer ekstracellulær sekresjon av TRAIL-polypeptidet. Signalpeptidet kløyves fra TRAIL-polypeptidet etter sekresjon av TRAIL fra cellen. ;Egnede vertsceller for ekspresjon av TRAIL-polypeptider omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler. Egnede klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse i bakterielle, sopp, gjær og pattedyrcelleverter er f.eks. beskrevet i Pouwels et al. doning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Cellefrie translasjonssystemer kan også anvendes for å produsere TRAIL-polypeptider ved anvendelse av RNA avledet fra DNA-konstruksjoner beskrevet heri. ;Prokaryoter omfatter gram negative eller gram positive organismer, f.eks. E. coli eller Bacilli. Egnede prokaryote vertsceller for transformasjon omfatter f.eks. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium og forskjellige andre arter innen slektene Pseudomonas, Streptomyces, og Staphylococcus. I en prokaryot vertscelle, slik som E. coli kan et TRAIL-polypeptid omfatte en N-terminal metioninrest slik at ekspresjon av det rekombinante polypeptid fremmes i den prokaryote vertscelle. Den N-terminale Met kan kløyves fra det uttrykte rekombinante TRAIL-polypeptidet. ;Ekspresjonsvektorer for anvendelse i prokaryote vertsceller omfatter generelt en eller flere fenotypisk selekterbare markørgener. Et fenotypisk selekterbart markørgen er f.eks. et gen som koder for et protein som gir antibiotikaresistens eller som supplerer et autotroft behov. Eksempler på anvendbare ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter de som er avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider, slik som kloningsvektoren pBR322(ATCC 37017). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresistens og tilveiebringer således enkle fremgangsmåter for identifisering av transformerte celler. En egnet promoter og en TRAIL-DNA-sekvens er innsatt inn i pBR322-vektoren. Andre kommersielt tilgjengelige vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). ;Promotorsekvenser som vanligvis er anvendt for rekombinante prokaryote vertscelleekspresjonsvektorer omfatter å-laktamase (penicillinase), laktosepromotersystem (Chang et al., Nature 275:615,1978; og Goeddel et al., Nature 257:544, 1979), tryptofan (trp) promotersystem (Goeddel et al., Nucl. acids Res. 5:4057, 1980; og EP-A-36776) og tacpromoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, side 412, 1982). Et særlig anvendbart prokaryot vertscelleekspresjonssystem gjør anvendelse av en fag ePL-promoter og en cI857ts termolabil repressorsekvens. Plasmidvektorer tilgjengelige fra the American Type Culture Collection som har innført derivater av ePL-promoteren omfatter plasmid pHUB2 (tilstede i £.co//-stamme JMB9, ATCC 37092) og pPLc28 (tilstede i E. coli RR1, ATCC 53082). ;TRAIL kan alternativt uttrykkes i gjærvertsceller, fortrinnsvis fra slekten Saccharomyces genus (f.eks. S. cerevisiae). Andre gjærfamilier, slik som Pichia eller Kluyveromyces, kan anvendes. Gjærvektorer inneholder ofte en ;replikasjonsorigosekvens fra et 2i gjærpiasmid, en autonomt replikerende sekvens (ARS), et promoterområde, sekvenser for polyadenylering, sekvenser for transkripsjonsterminering og et selekterbart markørgen. Egnede promotersekvenser for gjærvektorer omfatter blant annet promotere for metallotionein, 3-fosfoglyseratkinase . ;(Hitzeman et al., J. Biol. Chem 255:2073,1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; og Holland et al., Biochem. 77:4900, 1978) slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, heksokinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvat kinase, triosefosfatisomerase fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promotere for anvendelse ved gjærekspresjon er dessuten beskrevet i Hitzeman, EPA-73,657. Et annet alternativ er den glukoserepreserende ADH2-promoteren beskrevet av Russel et al. ( J. Biol. Chem. 255:2674) og Beier et al ( Nature 300:724, 1982). Skyttelvektorer som kan replikeres i både gjær og E. coli kan konstrueres ved innsetting av DNA-sekvenser fra pBR322 for seleksjon og replikasjon i E. coli (Amp<r->gen og replikasjonsorigo) i de ovenfor beskrevne gjærvektorer. ;å-faktorledersekvensen fra gjær kan anvendes for å dirigere sekresjon av TRAIL-polypeptidet. å-faktorledersekvensen er ofte innsatt mellom promotersekvensen og den strukturelle gensekvens. se f.eks., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 og Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sci. USA 57:5330, 1984. Andre ;ledersekvenser egnet for forenkling av sekresjon av rekombinante polypeptider fra gjærverter er kjent for fagfolk på området. En ledersekvens kan modifiseres nær dets 3' ende slik at den inneholder en eller flere restriksjonsseter. Dette vil forenkle fusjon av ledersekvensen til det strukturelle gen. ;Gjærtransformeirngsprosedyrer er kjent for fagfolk på området. En slik fremgangsmåte er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978. Hinnen et al.-fremgangsmåten selekterer for Trp<+->transformanter i et selektivt medium hvori det selektive medium består av 0,67 % gjærnitrogenbase, 0,5 % kasaminosyrer 2 % glukose, 10 ig/ml adenin og 20 ig/ml uracil. ;Gjærvertsceller transformert med vektorer inneholdende en ADH2-promotersekvens kan dyrkes for induksjon av ekspresjon i et "rikt" medium. Et eksempel på et rikt medium er medium inneholdende 1 % gjærekstrakt, 2 % pepton og 1 % glukose tilsatt 80 ig/ml adenin og 80 ig/ml uracil. Derepresjon av ADH2-promoteren skjer når glukose er oppbrukt i mediet. ;Pattedyr- eller insektsvertscellekultursystemer kan også anvendes for å uttrykke rekombinante TRAIL-polypeptider. Baculovirussystemer for produksjon av heterologe proteiner i insektceller er beskrevet av Luckow og Summers, Bio/ Technology 6' A1 (1988). Etablerte cellelinjer med pattedyropprinnelse kan også anvendes. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter COS-7-linjen fra apenyreceller (ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., Cell 25:175, 1981), L-celler C127-celler, 3T3-celler (ATCC CCL 163), kinesisk hamsterovarier (CHO)-celler, HeLa-celler og BHK(ATCC CRL 10)-cellelinjer og CVI/EBNA-cellelinjen avledet fra den afrikanske grønnapenyrecellelinjen CVI(ATCC CCL 70) som beskrevet av McMahan stal ( EMBOJ. 70:2821, 1981). ;Transkripsjonelle og translasjonelle kontrollsekvenser for pattedyrvertscelleekspresjonsvektorer kan hentes fra virale genomer. Vanlig anvendte promotersekvenser og enhancersekvenser er avledet fra polyomavirus, adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og humancytomegalovirus. DNA-sekvenser avledet fra SV40 viralt genom, f.eks. SV40 replikasjonsorigo, tidlig og sen promoter, enhancer, spleise-og polyadenyleringsseter kan anvendes for å tilveiebringe andre kinetiske elementer for uttrykk av en strukturell gensekvens i en pattedyrvertscelle. Virale tidlige og sene promotere er særlig anvendbare ettersom begge med letthet kan skaffes fra et viralt genom i form av et fragment som også kan inneholde et viralt replikasjonsorigo Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, der sekvensen på ca. 250 bp, som strekker seg fra Hind III setet til Bgl I-setet lokalisert i SV40 viralt replikasjonsorigosete er inkludert. ;Ekspresjonsvektorer for anvendelse i pattedyrvertsceller kan f.eks. konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg ( Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983. Et anvendbart system for stabil høynivåekspresjon av pattedyr cDNA i Cl27 murine pattedyrepitelceller kan konstrueres i det vesentlige som beskrevet av Cosman et al. ;{ Mol. Immunol. 23:935,1986). En høyekspresjonsvektor, PMLSVN1/N4 beskrevet av Cosman et al., Nature 372:768, 1984, er deponert som ATCC 39890. Ytterligere pattedyrekspresjonsvektorer er beskrevet i EP-A-0367566 og i WO 91/18982. Som et alternativ kan vektoren avledes fra en retrovirus. Ytterligere stabile ekspresjonssystemer er beskrevet i eksemplene nedenfor. ;Ett foretrukket ekspresjonssystem gjør anvendelse av kinesiske hamsterovarie (CHO)-celler og en ekspresjonsvektor kalt PG5.7. Denne ekspresjonsvektor er beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 08/586,509, innlevert 11. januar 1996. PG5.7-komponenter omfatter et fragment av CHO-cellegenomisk DNA. etterfulgt av en CMV-avledet promoter, som er etterfulgt av en sekvens som koder for den tredelte lederen og (DHFR). Disse komponentene ble insatt i plasmidvektoren pGEMl (Promega, Madison, WI). DNA som koder for et TRAIL-polypeptid (eller fusjonsprotein inneholdende TRAIL) kan insettes mellom sekvensen som koder for den tredelte lederen og DHFR. Metotrexat kan tilsettes kulturmediet for å øke ekspresjonsnivåer, noe som er kjent innen fagfeltet. ;Fragmentet med CHO-cellegenomisk DNA i vektor PG5.7 forsterker ekspresjon av TRAIL. Et faglysat inneholdende et fragment av genomisk DNA isolert fra CHO-celler ble deponert i the American Type Culture Collection 4. januar 1996 med aksesjonsnummer ATCC 97411. Vektor PG5.7 inneholder nukleotidene 8671 til 14507 fra det CHO-genomiske DNA innsatt i stamme som er deponert med ATCC 97411. ;For ekspresjon av TRAIL kan en type II-protein som mangler en nativ signalsekvens, en heterolog signalsekvens eller leder som er funksjonell i pattedyrvertsceller tilføres. Eksempler omfatter signalsekvensen for interleukin-7 (IL-7) beskrevet i U.S. patent 4,965,195, signalsekvensen for interleukin-2-reseptor er beskrevet i Cosman et al., Nature 372:768; interleukin-4-reseptorsignalpeptidet beskrevet i EP 367,566; type I-interleukin-l-reseptorsignalpeptidet beskrevet i U.S. patent 4,968,607; og type II-interleukin-1-reseptorsignalpeptidet beskrevet i EP 460,846. ;Et foretrukket ekspresjonssystem gjør anvendelse av en ledersekvens avledet fra cytomegalovirus (CMV). Eksempel 7 illustrerer anvendelse av en slik ;leder. I eksempel 7 ble pattedyrvertsceller transformert med en ekspresjonsvektor som koder for peptidet Met Ala Arg Arg Leu Trp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gin Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser (SEKV. ID NR. 9) fusjonert til den N-terminale ende av et oktapeptid kalt "FLAG" (SEKV. ID NR. 7, ;beskrevet ovenfor), som så er fusjonert til N-terminalende av et oppløselig TRAIL- ;peptid. Restene 1 til 29 i følge SEKV. ID NR. 9 består av en CMV-avledet ledersekvens, der restene 30 til 32 er kodet av oligonukleotidene anvendt ved konstruksjon av ekspresjonsvektoren beskrevet i eksempel 7.1 en utførelsesform er DNA som koder for et poly-His-peptid (f.eks. et peptid inneholdende seks histidinrester). Posisjonert mellom sekvensene som koder for CMV-lederen og "FLAG"-peptidet. ;Ekspresjonssystemer som gjør anvendelse av slike CMV-avledede lederpeptider er anvendbare for uttrykk av andre proteiner enn TRAIL. Ekspresjonsvektorer omfattende en DNA-sekvens som koder for aminosyrene 1 til 29 i følge SEKV. ID NR. 9 er tilveiebrakt heri. I en annen utførelsesform omfatter vektoren en sekvens som koder for aminosyrene 1 til 28 i følge SEKV. ID NR. 9. DNA som koder for et ønsket heterologt protein er posisjonert nedstrøms for, og i samme leseramme som DNA som koder for lederen. Ytterligere rester (f.eks. de omfattet av linkere eller primere) kan kodes av DNA posisjonert mellom sekvensene som koder for lederen og det ønskede heterologe protein, som vist i vektoren beskrevet i eksempel 7. Som det forstås innen fagområdet omfatter ekspresjonsvektorer promotere og enhver annen ønsket regulatorisk sekvens som er operativt bundet til sekvensene som koder for lederen og heterologt protein. ;Lederpeptidet presentert i SEKV. ID NR. 9 kan kløyves etter argininresten i posisjon 29 for å oppnå rent sekrert form av et protein fusjonert dertil. Alternativet eller i tillegg kan kløyving skje mellom aminosyrene 20 og 21 eller mellom aminosyrene 20 og 21 eller mellom aminosyrene 28 og 29 i følge SEKV. ID NR. 9. ;En fagmann på området vil vite at posisjonen(ene) hvorved signalpeptidet kløyves kan variere i henhold til slike faktorer som anvendt rype vertsceller, hvorvidt murin eller human TRAIL er uttrykt av vektoren o.l. Analyser ved hjelp av dataprogram viser at det primære kløyvingssete kan være mellom restene 20 og 21 i følge SEKV. ID NR: 9. Kløyving mellom restene 22 og 23 og mellom restene 27 og 28 er også antatt å være mulig. ;F.eks. resulterte ekspresjon og sekresjon av et oppløselig murint TRAIL-polypeptid i kløyving av et CMV-avledet signalpeptid i flere posisjoner. De tre mest dominerende utgaver av sekrert protein (i nedadgående rekkefølge) resulterte i kløyving mellom aminosyrene 20 og 21 i følge SEKV. ID NR: 9, kløyving mellom aminosyrene 22 og 23 og kløyving mellom aminosyrene 22 og 23 og kløyving mellom aminosyrene 27 og 28. ;En fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt rekombinant protein omfatter dyrking av pattedyrvertsceller transformert med en slik ekspresjonsvektor under betingelser som fremmer ekspresjon og sekresjon av det heterologe protein og utvinning av proteinet fra kulturmediet. Ekspresjonssystemer som gjør anvendelse av CMV-ledere kan anvendes for å produsere ethvert ønskelig protein, eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, kolonistimulerende faktorer, interferoner, interleukiner, andre cytokiner og cytokinreseptorer. ;Renset TRAIL- protein ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rensede TRAIL-proteiner som kan produseres ved hjelp av rekombinante ekspresjonssystemer som beskrevet ovenfor eller renses fra naturlig forekommende celler. Den ønskede grad av renhet kan avhenge av anvendelsesformen til proteinet. En relativ høy grad av renhet er ønskelig når proteinet f.eks. skal administreres in vivo. Det er fordelaktig at TRAIL-polypeptider renses slik at ingen proteinbånd tilsvarende andre proteiner detekteres ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). En fagmann på området vil vite at flere bånd tilsvarende TRAIL-proteinet kan påvises ved SDS-PAGE, som følge av forskjellig glykosylering, variasjoner i posttransjonelle prosessering og lignende, som beskrevet ovenfor. Et TRAIL-proteinpreparat er antatt å være renset så lenge ingen bånd tilsvarende ulike (ikke-TRAIL)-proteiner er synlige. Det er mest foretrukket at TRAIL renses til i det vesentlige homogenisitet, som indikert av ett synlig proteinbånd etter analyse ved hjelp av SDS-PAGE. Proteinbåndet kan synliggjøres ved hjelp av sølvfarging, coomassieblåfarging eller (dersom proteinet er radiomerket) ved hjelp av autoradiografi. ;En fremgangsmåte for fremstilling av TRAIL-proteinet omfatter dyrking av en vertscelle som er transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens som koder for TRAIL under betingelser der TRAIL uttrykkes. TRAIL-proteinet utvinnes så fra kulturen (fra kulturmediet eller celleekstrakter). En fagmann på området vil vite at fremgangsmåter for rensing av rekombinant TRAIL vil variere i hennhold til faktorer som, hvilken type vertsceller som anvendes og hvorvidt TRAIL sekreres i mediet eller ikke. ;Når ekspresjonssystemer som sekrerer det rekombinante protein er anvendt kan kulturmediet først konsentreres for anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, f.eks. et Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltreringsenhet. Etter konsentrasjonstrinnet kan konsentratet overføres til en renselsesmatriks, slik som et gelfiltreringsmedium. Alternativt kan et anionbytterresin anvendes, f.eks. en matriks eller substrat med anhengte dietylaminoetyl (DEAE)-grupper. Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis anvendes ved proteinrensing. Alternativt kan et kationbyttertrinn anvendes. Egnede kationbyttere omfatter ulike uløselige matrikser omfattende sulfopropyl- eller karboksymetylgrupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket. Til slutt kan ett eller flere reversfasehøypresisjonvæskekromatografi (PvP-HPLC)-trinn ved anvendelse av hydrofobt RP-HPLC-medium, (f.eks. silikagel med anhengte metyl eller andre alifatiske grupper) anvendes for ytterligere rensing av TRAIL. Enkelte eller alle de foregående rensingstrinn kan anvendes i ulike kombinasjoner for å tilveiebringe et renset TRAIL-protein. ;Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur kan isoleres ved hjelp av en innledningsvis ødeleggelse av vertscellene, sentrifugering, ekstraksjon fra cellepelleter ettersom det er uoppløselig polypeptid eller fra supernatantvæsken dersom det er et oppløselig polypeptid, etterfulgt av en eller flere konsentrasjoner, utsalting, ionebytte, affinitetsrensing eller størrelseseksklusjonskromatografitrinn. Til slutt kan RP-HPLC anvendes ved det endelige rensingstrinn. Mikrobeceller kan ødelegges ved hjelp av enhver vanlig fremgangsmåte, deriblant fryse- tinesyklus, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller anvendelse av cellelyseringsmidler. ;Transformerte gjærvertsceller anvendes fortrinnsvis for å uttrykke TRAIL i form av et sekrert polypeptid. Noe som forenkler rensingen. Sekrert rekombinant polypeptid fra en gjærvertscellefermentering kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge til de beskrevet av Urdal et al. ( J. Chromatog. 296:111, 1984). Urdal et al. beskriver to sekvensielle, reversfase-HPLC-trinn for rensing av rekombinant human IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne. ;Alternativt kan TRAIL-polypeptider renses ved hjelp av immunaffinitetskromatografi. En affinitetskolonne inneholdende et antistoff som binder TRAIL kan fremstilles ved hjelp av vanlige prosedyrer og anvendes ved rensing av TRAIL. Eksempel 4 beskriver en prosedyre for generering av monoklonale antistoffer rettet mot TRAIL. ;Egenskaper til og anvendelser av TRAIL ;Programmert celledød (apoptosis) skjer under embryogenese, metamorfose, endokrinavhengig vevsatropi, normal vevs"turnover" og ;immuntymocyttdød. Regulering av programmert celledød er viktig for normalfunksjon av immunsystemet. F.eks. ødelegges T-celler som gjenkjenner celle-antigener ved den apoptotiske prosess i løpet av modningen av T-celler i thymus, mens andre T-celler er positivt selektert. Muligheten av at enkelte T-celler gjenkjenner visse selv-epitoper (f.eks. utilstrekkelig prosesserte og presenterte antigendeterminanter til et gitt selv-protein) unnslipper denne elimenineringsprosessen og etter dette spiller en rolle ved autoimmune sykdommer er foreslått (Gammon et al., Immunology Today 72:193, 1991). ;Ufullstendig apoptosis er trukket inn ved visse tilstander, mens forhøyede apoptotiske nivåer av celledød er forbundet med andre sykdommer. Det er ønskelig å identifisere og anvende stoffer som regulerer apoptosis ved behandling av slike sykdommer (Kromer, advances in Immunology, 58:211, 1995; Groux el al., J. Exp. Med. 175:331, 1992; Sachs og Lotem, Blood 82:15, 1993). ;T-celler med unormal resistens mot å gjennomgå apoptosis er knyttet til lymfocytose, lymfadenopati, splenomegali, akkumulering av selv-reaktive T-celler, autoimmun sykdom, utvikling av leukemi og utvikling av lymfom (Kromer, supra; se særlig sidene 214-215). I motsetning er omfattende apoptosis av T-celler antydet å spille en rolle ved lymfopeni, systemisk immunsvikt og spesifikk immunsvikt, med spesifikke eksempler som at virus-indusert immunsvikttilstander er forbundet med infeksiøs mononukleose og cytomegalovirusinfeksjon, og tumormediert immunsuppresjon ;Kromer, supra; se særlig side 214). Reduksjon i CD4+-T-celler hos HIV-infiserte individer kan skyldes utilstrekkelig aktivering av indusert celledød (AICD) ved apoptosis (Groux et al., J. Exp. Med. 175:331,1992). ;Som vist i eksemplene 5 og 8 induserer TRAIL apoptosis i den akutte T-celle-leukemicellelinjen kalt Jurkat klon E6-1. TRAIL er således et forskningsreagens som er anvendbar ved studier av apoptose, deriblant regulering av programmert celledød. Ettersom Jurkat-celler er en leukemicellelinje som stammer fra T-celler kan TRAIL ifølge oppfinnelsen anvendes ved undersøkelser av hvilken rolle TRAIL kan spille ved apoptosis i andre transformerte T-celler, slik som andre maligne celletyper som stammer fra T-celler. ;TRAIL binder Jurkat-celler, i tillegg til induksjon av apoptosis i disse. TRAIL forårsaket ikke død hos nyisolerte murine tymocytter eller perifere blod-T-celler (PBTs) som etter kort tid var ekstrahert fra en frisk human donor. Flere anvendelser kommer fra disse egenskapene til TRAIL. ;TRAIL-polypeptider kan anvendes for å rense leukemiceller eller enhver annen celletype hvorved TRAIL binder. Leukemiceller kan f.eks. isoleres fra blodet til en pasient. I en utførelsesform renses cellene ved hjelp av affinitetskromatografi ved anvendelse av en kromatografimatriks med TRAIL bundet dertil. TRAIL bundet til kromatografimatriksen kan være et fullengdeprotein, et TRAIL-fragment omfattende det ekstracellulære domene, et TRAIL-inneholdende fusjonsprotein eller andre egnede TRAIL-polypeptider beskrevet heri. I en utførelsesform bindes et oppløselig TRAIL/Fc-fusjonsprotein til en Protein A- eller Protein G-kolonne ved interaksjon mellom Fc-resten og Protein A eller Protein G. Alternativt kan TRAIL anvendes ved isolering av leukemiceller ved hjelp av strømningscytometri. ;De således rensede leukemiceller er antatt å dø etter binding av TRAIL, men de døde cellene vil fortsatt bære celleoverflateantigener og kan anvendes som immunogener ved dannelse av anti-leukemi-antistoffer. Leukemicellene eller et ønsket celleoverflateantigen isolert der fra kan dessuten anvendes ved vaksineutvikling. ;Ettersom TRAIL binder og dreper leukemiceller (Jurkat-cellelinjen) kan TRAIL også anvendes ved behandling av leukemi. En terapeutisk fremgangsmåte omfatter at leukemiceller bringes i kontakt med en effektiv mengde TRAIL. I en utførelsesform bringes blodet til en leukemipasient i kontakt ex vivo med et TRAIL-polypeptid. TRAIL kan så immobiliseres på en matriks. TRAIL binder så leukemicellene slik at disse fjernes fra pasientens blod før blodet returneres til pasienten. ;Alternativt eller dessuten kan benmarg ekstrahert fra en leukemipasient bringes i kontakt med en mengde av TRAIL som er effektiv til å indusere død til leukemicellene i benmargen. Benmarg kan f.eks. suges opp fra sternum eller iliac-kammer og bringes i kontakt med TRAIL for å rense leukemiceller. Den således behandlede margen returneres så til pasienten. ;TRAIL binder også til å indusere apoptosis i lymfom- og melanomceller (se eksemplene 5, 9 og 10). Anvendelser av TRAIL som er lignende til de beskrevet ovenfor for leukemiceller er således anvendelige mot lymfom- og melanomceller. TRAIL-polypeptider kan anvendes ved behandling av cancer, deriblant, men ikke begrenset til, leukemi, lymfom og melanom. Ved en utførelsesform er lymfomet Burkitts lymfom. Tabell I i eksempel 9 viser at TRAIL hadde en cytotoksisk virkning på flere Burkitts lymfomcellelinjer. Epstein-Barr-virus er et etiologt middel mot Burkitts lymfom. ;TRAIL-polypeptider kan også anvendes ved behandling av virusinfeksjoner. Kontakt med TRAIL forårsaker død hos celler infisert med cytomegalovirus, men ikke hos samme celletype når den ikke var infisert, som beskrevet i eksempel 11. Evnen TRAIL har til å drepe celler infisert med andre virus kan bekreftes ved anvendelse av analysen beskrevet i eksempel 11. Slike virus omfatter, men er ikke begrenset til encefalomyokardittvirus, Newcastle sykdomsvirus, vesikulær stomatittvirus, herpessimpleksvirus, adenovirus-2, bovine viraldiarevirus, HIV og Epstein-Barr-virus. ;En effektiv mengde av TRAIL administreres til et pattedyr, deriblant et menneske, som er hardt rammet av en viral infeksjon. I en utførelsesform anvendes TRAIL ved konjugering med interferon for å behandle en virusinfeksjon. Ved forsøket beskrevet i eksempel 11 forsterket forbehandling av CMV-infiserte celler med a-interferon nivået av dreping av de infiserte cellene som var formidlet av TRAIL. TRAIL kan administreres sammen med andre midler som gir en cytotoksisk virkning på cancerceller eller virusinfiserte celler. ;I en annen utførelsesform er TRAIL anvendt for å drepe virusinfiserte celler i cellepreparater, vev eller organismer som skal transplanteres. F.eks. kan benmarg bringes i kontakt med TRAIL for å drepe virusinfiserte celler som kan være til stede deri, før benmargen transplanteres til resipienten ;TRAIL-ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved utvikling av behandlinger av enhver sykdom som er formidlet (direkte eller indirekte) av manglende eller utilstrekkelige mengder TRAIL. En terapeutisk effektiv mengde av renset TRAIL-protein administreres til en pasient som er rammet av en slik forstyrrelse. Alternativt kan TRAIL-DNA-sekvenser anvendes ved utvikling av en genterapitilnærming for behandling av slike forstyrrelser. Det er her redegjort for native TRAIL-nukleotidsekvenser som tillater påvisning av manglende TRAIL-gener og utbytting av disse med gener som koder for normal TRAIL. Manglende gener kan påvises ved in v/fro-diagnostiske analyser og ved sammenligning av den native TRAIL-nukleotidsekvens, angitt heri, med den til et TRAIL-gen avledet fra en person der det er mistanke om feil i dette gen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer farmasøytiske preparater omfattende renset TRAIL og en fysiologisk akseptabel bærer, fortynner eller eksipiens. Egnede bærere, fortynnere og eksipienser er ikke-toksiske for resipienten i de anvendte doser og konsentrasjoner. Slike preparater kan omfatte buffere, antioksidanter, slik som askorbinsyre, polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, karbohydrater, deriblant glukose, sukrose eller dekstriner, chelaterende midler, slik som EDTA, glutation og andre stabilisatorer og eksipienser som er vanlige å bruke i farmasøytiske preparater. Nøytralt bufret saltløsning eller saltløsning blandet med konspesifikt serum albumin er blant de egnede fortynnere. Preparatet kan formuleres i form av et lyofilisat ved anvendelse av egnede eksipiensoppløsninger (f.eks. sukrose) som fortynnere. ;For terapeutisk anvendelse administreres rensede proteiner ifølge oppfinnelsen til pasienten, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en måte som er egnet ut fra indikasjonen. F.eks. kan således de farmasøytiske preparater administreres lokalt, ved hjelp av intravenøs injeksjon, kontinuerlig infusjon, vedvarende frigjøring fra implantater eller andre egnede teknikker. Egnede doser og administreringssekvensen vil selvfølgelig avhenge av slike faktorer som karakteren og alvorligheten av indikasjonen som behandles, ønsket respons, pasientens tilstand osv. ;TRAIL-proteinet anvendt i de farmasøytiske preparatene renses fortrinnsvis slik at TRAIL-proteinet i det vesentlige er fritt for andre proteiner av naturlig eller endogen opprinnelse, i det vesentlige inneholdende mindre enn ca. 1 % av massen til proteinkonminantrester fra produksjonsprosessen. Slike preparater kan imidlertid inneholde andre proteiner tilført i form av stabilisatorer, bærere, eksipienser eller samvirkende terapeutiske midler. ;De TRAIL-kodende DNA'er beskrevet heri, kan anvendes ved produksjon av TRAIL-polypeptider, som beskrevet ovenfor. Fragmenter av TRAIL-nukleotidsekvenser er også anvendbare. I en utførelsesform omfatter slike fragmenter minst ca. 17 etterfølgende nukleotider, mer foretrukket minst 30 etterfølgende nukleotider av det humane eller murine TRAIL-DNA beskrevet heri. DNA- og RNA-komplementer av nevnte fragmenter er tilveiebrakt heri, sammen med både enkelttrådede og dobbelttrådete former av TRAIL-DNA'et i følge SEKV. ID Nr.l, 3 og 5. ;Blant anvendelsene av slike TRAIL-nukleinsyrefragmenter er anvendelse i form av en probe eller i form av primere ved en polymerasekjedereaksjon (PCR). Som et eksempel kan en probe tilsvarende det ekstracellulære domene til TRAIL anvendes. Probene kan anvendes ved påvisning av tilstedeværelse av TRAIL-nukleinsyrer ved in v#rø-analyser og ved slike prosedyrer som Northern og Southern blot. Celletyper som uttrykker TRAIL kan også identifiseres. Slike fremgangsmåter er godt kjent og fagfolk på området kan velge en probe med egnet lengde, avhengig av den spesifikt ønskede anvendelse. For PCR ble 5' og 3' primere tilsvarende enden av en ønsket TRAIL-DNA-sekvens anvendt for å isolere og amplifisere sekvensen, ved anvendelse av vanlige teknikker. ;Andre anvendbare fragmenter av TRAIL-nukleinsyrene er antisense-eller sensoligonukleotider omfattende en enkelttrådet nukleinsyresekvens (enten RNA eller DNA) som har evnen til å binde mål-TRAIL-mRNA-(sense) eller TRAIL-DNA-(antisense)-sekvenser. Et slikt fragment omfatter generelt minst ca. 14 nukleotider, fortrinnsvis fra ca. 14 til ca. 30 nukleotider. Evnen til å danne et antisense- eller sensoligonukleotid basert på en cDNA-sekvens til et gitt protein er f.eks. beskrevet i Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 og van der Krol et al., Biotechniques 5:958, 1988. ;Binding av antisense- eller senseoligonukeotider til målnukleinsyresekvenser resulterer i dannelse av duplekser som blokkerer translasjon (RNA) eller transkripsjon (DNA) på en av flere måter, deriblant forsterket degradering av duplekser, prematur terminering av transkripsjon eller translasjon eller på andre måter. Antisensoligonukleotidene kan således anvendes for å blokkere ekspresjon av TRAIL-proteiner. ;Antisense- eller senseoligonukleotider omfatter dessuten oligonukleotider med modifiserte sukker-fosfodiesterryggrader (eller andre sukkerbindinger, slik som de beskrevet i WO 91/06629) og hvori slike sukkerbindinger er motstandsdyktige mot endogene nukleaser. Slike oligonukleotider med motstandsdyktige sukkerbindinger er stabil in vivo (dvs. ha evnen til å motstå enzymatisk degradering), men bevare sekvensspesifisitet for å ha evnen til å binde til målnukleotidsekvenser. Andre eksempler på sense- eller antisensoligonukleotider omfatter de oligonukleotidene som er kovalent bundet til organiske rester, slik som de beskrevet i WO 90/10448 og andre rester som øker oligonukleotidets affinitet til en målnukleinsyresekvens, slik som poly-(L-lysin). Dessuten kan interkalerende midler, slik som elliptisin og alkylerende midler eller metallkomplekser bindes til sense- eller antisensoligonukleotider for å modifisere antisense- eller senseoligonukleotidets bindingsspesifisitet til målnukleotidsekvensen. ;Antisense- eller sensololigonukleotider kan introduseres inn i en celle inneholdende målnukleinsyresekvensen ved hjelp av enhver genoverføringsmetode, f.eks. deriblant CaP04-formidlet DNA-transfeksjon, elektroporering eller andre genoverføringsvektorer, slik som Epstein-Barr-virus. Antisense- eller sensoligonukleotider introduseres fortrinnsvis inn i en celle inneholdende målnukleinsyresekvensen ved innskudd av antisense- eller sensoligonukleotidet inn i en egnet retrovirusvektor som binder cellen med retrovirusvektoren inneholdende den innsatte sekvens, enten in vivo eller ex vivo. Egnede retrovirusvektorer omfatter, men er ikke begrenset til, murin retrovirus M-MuLV, N2(en retrovirus avledet fra M-MuLV) eller dobbel kopivektorer kalt DCT5A, DCT5B og DCT5C (se PCT søknad WO 90/13641). Alternativt kan andre promotorsekvenser anvendes for å uttrykke oligonukleotidet. ;Sense- eller antisensoligonukleotider kan også introduseres inn i en celle inneholdende målnukleotidsekvensen ved dannelse av et konjugat med en ligandbindende molekyl, som beskrevet i WO 91/04753. Egnede ligandbindende molekyler omfatter, men er ikke begrenset til, celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, andre cytokiner eller andre ligander som binder til celleoverflatereseptorer. Konjugering av det ligandbindende molekyl bør ikke det vesentlige interferere med det ligandbindende molekylets evne til å binde til dets korresponderende molekyl eller reseptor, eller blokkere tilgangen på sense- eller antisensoligonukleotidet eller dets konjugerte utgave inn i cellen. ;Alternativt kan et sense- eller antisensoligonukleotid introduseres inn i en celle inneholdende målnukleinsyresekvensen ved dannelse av et oligonukleotid-lipidkompleks, som beskrevet i WO 90/10448. Sense- eller antisensoligonukleotid-lipidkomplekset assosieres fortrinnsvis inne i cellen ved hjelp av en endogen lipase. ;Antistoffer som er immunreaktive med TRAIL ;TRAIL-proteiner ifølge oppfinnelsen eller immunogene fragmenter derav kan anvendes for å generere antistoffer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således antistoffer som spesifikt binder TRAIL, dvs. antistoffer som binder til TRAIL via antigenbindende seter på antistoffet (i motsetning til ikke-spesifikk binding). ;Polyklonale og monoklonale antistoffer kan fremstilles ved hjelp av vanlige teknikker. Se f.eks. Monoklonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al.(red.), Plenum Press, New York (1980); og Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Land (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Produksjon av monoklonale antistoffer som er immunreaktive med TRAIL er dessuten vist i eksempel 4 under. ;Antigenbindende fragmenter til slike antistoffer, som kan fremstilles ved hjelp av vanlige teknikker er også omfattet av oppfinnelsen. Eksempler på slike fragmenter omfatter, men er ikke begrenset til, Fab, F(ab') og F(ab')2 fragmenter. Antistoffragmenter og derivater produsert ved hjelp av genetiske konstruksjonsteknikker er også tilveiebrakt. ;De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter kimære antistoffer, f.eks. humaniserte versjoner av murine monoklonale antistoffer. Slike humaniserte antistoffer kan fremstilles ved hjelp av kjente teknikker, og gir en fordel i form av redusert immunogenisitet når antistoffene administreres til mennesker. I en utførelsesform omfatter et humanisert monoklonalt antistoff det variable område til et murint antistoff (eller bare det antigenbindende sete derav) og et konstant område avledet fra et humant antistoff. Alternativt kan et humanisert antistoffragment omfattende det antigenbindende sete til et murint monoklonalt antistoff og et fragment med et variabelt område (som mangler det antigenbindende sete) avledet fra et humant antistoff. Fremgangsmåter for fremstilling av kimære og ytterligere behandlede monoklonale antistoffer de beskrevet i Riechmann et al. ( Nature 332:323, 1988), Liu et al. ( PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. ( Bio/ Technology 7:934, 1989), og Winter og Harris { TIPS 14:139, mai 1993. ;Blant anvendelsesformene av antistoffene er anvendelse ved analyser for påvisning av tilstedeværelse av TRAIL-polypeptider, enten ( in vitro eller in vivo). Antistoffene kan dessuten anvendes ved rensing av TRAIL ved hjelp av affinitetskromatografi. ;De antistoffene som dessuten kan blokkere binding av TRAIL til målceller kan anvendes for å hemme en biologisk aktivitet til TRAIL. En terapeutisk fremgangsmåte omfatter in vivo administrering et slikt antistoff i en mengde som er effektiv til å hemme en TRAIL-formidlet biologisk aktivitet. Forstyrrelser formidlet eller forverret av TRAIL, direkte eller indirekte, behandles således. Monoklonale antistoffer er generelt foretrukket anvendt ved slike terapeutiske metoder. ;Antistoffer rettet mot TRAIL kan være anvendbare ved behandling av trombocyttiske mikroangiopatier. En slik forstyrrelse er trombocyttisk trombocytopenisk purpura (TTP) (Kwaan, H.C., Semin. Hematol, 24:11, 1987; Thompson et al., Blood, 50:1890,1992). Økning i TTP-forbundne mortalitetsgrader er rapportert av U.S. Centers for Disease Control (Torok et al., Am. J. Hematol. 50:84, 1995). ;Plasma fra pasienter rammet av TTP (deriblant HIV<*> og HIV pasienter) induserer apoptosis i humane endotelceller av dermal mikrovaskulær opprinnelse, men ikke med opprinnelse fra stor kar (Laurence et al., Blood, 87:3245, 15. april 1996). Plasma fra TTP-pasienter er derved antatt å inneholde en eller flere faktorer som direkte eller indirekte induserer apoptosis. Ved analysen beskrevet i eksempel 13 nedenfor der polyklonale antistoff rettet mot TRAIL hemmet TTP-plasma-indusert apoptose av dermale mikrovaskulære endotelceller. Dataene vist i eksempel 13 tyder på at TRAIL er til stede i serumet hos TTP-pasienter og kan spille en rolle ved induksjon av apoptosis i mikrovaskulære endotelceller.

En annen trombocyttisk mikroangiopati er hemolytisk uremisk syndrom (HUS) (Moake, J.L., Lancet, 343:393, 1994; Melnyk et al., ( Arch. Intern. Med., 755:2077, 1995; Thompson et al., supra). En utførelsesform av oppfinnelsen er rettet mot anvendelse av et anti-TRAIL-antistoff for behandling av tilstanden som ofte er kalt "voksen-HUS" (selv om det også kan ramme barn). En sykdom kjent som barndoms/diareforbundet HUS skiller seg etiologisk fra voksen-HUS.

Andre tilstander kjennetegnet ved koagulering i små blodkar kan behandles ved anvendelse av anti-TRAIL-antistoffer. Slike tilstander omfatter, men er ikke begrenset til følgende. Hjerteproblemer, oppdaget hos ca. 5-10 % pediatriske AIDS-pasienter ble antatt å omfatte koagulering av små blodkar. Nedbryting av . mikrovaskulaturen i hjertet er rapportert hos pasienter med multippel sklerose. Som et ytterligere eksempel er behandling av systemisk lupus erythematosus (SLE) vurdert.

I en utførelsesform bringes en pasients blod eller plasma i kontakt med et anti-TRAIL-antistoff ex vivo. Antistoffet (fortrinnsvis monoklonalt antistoff) kan bindes til en egnet kromatografiskmatriks ved hjelp av vanlige fremgangsmåter. Pasientens blod eller plasma strømmer gjennom en kromatografikolonne inneholdende antistoffet bundet til matriksen, før det returneres til pasienten. Det immobiliserte antistoffet binder TRAIL og fjerner således TRAIL-protein fra pasientens blod.

I en alternativ utførelsesform administreres antistoffene in vivo, hvorved det er ønskelig å anvende blokkerende antistoffer. Slike antistoffer kan identifiseres ved anvendelse av enhver egnet analyseprosedyre, slik som ved tetting av antistoffer med hensyn til evnen til å hemme binding av TRAIL til målceller. Alternativt kan blokkerende antistoffer identifiseres ved analyser med hensyn til evnen til å hemme en biologisk effekt av bindingen av TRAIL til målceller. Eksempel 12 viser en egnet fremgangsmåte for identifisering av blokkerende antistoffer, hvori antistoffene analyseres med hensyn til evnen til å hemme TRAIL-formidlet lysering av Jurkat-celler.

Oppfinnelsen beskriver således en fremgangsmåte for behandling av en trombocyttisk mikroangiopati, omfattende anvendelse av en effektiv mengde av et antistoff rettet mot TRAIL. Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved in vivo eller ex vivo prosedyrer for å hemme TRAIL-formidlet skade på (f.eks. apoptosis av) mikrovaskulære endotelceller.

Anti-TRAIL-antistoffer kan anvendes sammen med andre midler som er anvendbare ved behandling av ulike forstyrrelser. Ved en in vi/rø-studie rapportert av Laurence et al. ( Blood 87:3245,1996) ble noe reduksjon av TTP-plasmaformidlet apoptosis av mikrovaskulære endotelceller oppnådd ved anvendelse av et anti-fast-blokkerende antistoff, aurintrikarboksylsyre eller normalt plasma der kryptopresipitat var oppbrukt.

En pasient kan således behandles med et middel som hemmer fast-ligand-formidlet apoptose av endotelceller i kombinasjon med et middel som hemmer TRAIL-formidlet apoptosis av endotelceller. Ved en utførelsesform administrer både et anti-TRAIL-blokkerende antistoff og et anti-fast-blokkerende antistoff til en pasient rammet av en sykdom kjennetegnet ved trombocyttisk mikroangiopati, slik som TTP eller HUS. Eksempler på blokkerende monoklonale antistoffer rettet mot fast-antigen (CD95) er beskrevet i PCT-søknad med publikasjonsnr. WO 95/10540.

Farmasøytiske preparater omfattende et antistoff som er immunreaktivt med TRAIL og en egnet fortynner, eksipiens eller bærer er tilveiebrakt heri. Egnede komponenter i slike preparater er beskrevet ovenfor for preparater inneholdende TRAIL-proteiner.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere særlige utførelsesformer av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1: Isolering av et humant TRAIL DNA

DNA som koder for et humant TRAIL-protein ifølge oppfinnelsen ble isolert ved hjelp av følgende prosedyre. Et TBLASTN-søk i dbEST-databasen ved National Center for Biological Information (NCBI) ble utført ved anvendelse av søkesekvensen LVVXXXGLYYVYXQVXF (SEKV. ID Nr.8). Denne sekvensen er basert på det mest konserverte område av TNF-ligandfamilien (Smith et al., Cell, 73:1349,1993). En uttrykt sekvensidentifikasjon (EST)-fil, genbank-aksesjonsnr. Z36726, ble identifisert ved anvendelse av disse søkeparametere. Genbank-filen viste at viste at denne EST stammet fra et humant hjerteatrium-cDNA-bibliotek.

To oligonukleotider på 30-bp basert på sekvenser fra den 3' og 5' ende til denne EST ble syntetisert. Oligonukleotidet fra 3' ende hadde sekvensen TGAAATCGAAAGTATGTTTGGGAATAGATG (komplementært til nukleotidene 636 til 665 i følge SEKV. ID Nr.l) og 5' oligonukleotid var TGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTG (nukleotidene 291 til 320 i følge SEKV. ID Nr.l). Oligonukleotidene var merket i 5' ende med 32P å-ATP og polynukleotidkinase. To egtlO-cDNA-biblioteket ble screenet ved hjelp av vanlige fremgangsmåter med ekvimolar blanding av disse merkede oligonukleotider som probe. Et bibliotek var et humant hjerte-cDNA-bibliotek i 5' område (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Det andre var et perifert blodlymfocytt (PBL)-bibliotek fremstilt som følger: PBL ble erholdt fra normale frivillige mennesker og behandlet med 10 ng/ml OKT3 (et anti-CD3-antistoff) og 10 ng/ml humant IL-2 i seks dager. PBBL-cellene ble vasket og stimulert med 500 ng/ml ionomycin (Calbiochem) og 10 ng/ml PMA i fire timer. Messenger RNA ble isolert fra de stimulerte PBL-cellene. cDNA som var syntetisert på mRNA-templatet ble pakket i égtlO-fagvektorer ("Gigapak", Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

Rekombinante fag ble platet ut på E. co//-stamme C600-HFL og screenet ved anvendelse av vanlige plakkhybridiseringsteknikker. Nitrocellulosefiltere ble løftet fra disse platene to ganger og hybridisert med <32>P-merkede oligonukleotider over natten ved 67 °C i en oppløsning av 60 mM Tris pH 8,0,2mM EDTA, 5 x Denhardfs oppløsning, 6 x SSC, 1 mg/ml n-laurylsarkosin, 0,5 % NP40 og 4 ig/ml SS-laksesperma-DNA. Filtrene ble så vasket i 3 x SSC ved 67 °C i 30 minutter.

Fra hjerte-5' område-cDNA-biblioteket ble en positiv plakk erholdt fra omtrent en million plakk. Denne klonen omfattet ikke 3' ende av genet. Ved anvendelse av PBL-biblioteket ble det erholdt ca. 50 positive plakk fra 500,000 plakk. Femten av disse ble i første runde plukket og innskudd fra anrikede forråd ble amplifisert ved anvendelse av oligonukleotidprimere laget for å amplifisere faginnskudd. De resulterende produktene ble oppløst ved 1,5 % aragorosegel-elektroforese, blottet på nitrocellulose og analysert ved anvendelse av vanlig Southern blot-teknikk ved anvendelse av de <32->merkede 30-merologonukeotidprobene. De to plukkede plakkene som vist de største båndene ved Southern analyse ble renset ved sekundærscreening og isolerte fagplakk ble erholdt ved anvendelse av samme prosedyrer som beskrevet ovenfor.

DNA fra de isolerte fagene ble fremstilt ved hjelp av platelyseringsmetoden og cDNA-innskuddene ble tatt ut med EcoRI, renset ved hjelp av elektroforese ved anvendelse av 1,5 agarose i Tris-Borat-EDTA-buffer og ligert inn i "pBluescript" SK(+)-plasmidet. Disse innskuddene ble så sekvensert ved hjelp av vanlige metoder og de resulterende sekvenser stilt opp mot hverandre.

Nukleotidsekvensen i et humant TRAIL-DNA er vist i SEKV. ID Nr. 1 og aminosyresekvensen som er kodet derav er vist i SEKV. ID Nr.2. Dette humane TRAIL-protein omfatter et N-terminalt cytoplasmatisk domene (aminosyrene 1-18), et transmembranområde (aminosyrene 19-38) og et ekstracellulært domene (aminosyrene 39-281). Den beregnede molekylvekt til dette protein er 32.508 dalton.

E. co/z-stamme-DHlOB-celler transformert med en rekombinant vektor inneholdende TRAIL-DNA'et ble deponert i American Type Culture Collection, 14. juni 1995 med aksesjonsnr. 69849. Deponeringen ble gjort i henhold til Budapesttraktaten. Den rekombinante vektor i den deponerte stamme er ekspresjonsvektoren pDC409 (beskrevet i eksempel 5). Vektoren ble kløyvet med Sali og Noti og humant TRAIL-DNA omfattende hele det kodende område vist i SEKV. ID Nr.l ble ligert inn i den kløyvde vektor.

EKSEMPEL 2: Isolering av DNA som koder for et avkortet TRAIL

DNA som koder for et annet humant TRAIL-protein ble isolert som følger. Dette avkortede TRAIL viste ingen evne til å indusere apoptosis i Jurkat-celler.

PCR-analyse ved anvendelse av 30-meren beskrevet i eksempel 1 som 5' og 3' primere viste at 3 av 14 av plakkene som ble plukket i første runde i eksempel 1 inneholdt kortere utgaver av TRAIL-DNA'et. En av de avkortede formene av genet ble isolert, ligert inn i "pBluescript" SK(+)-kloningsvektor (Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA) og sekvensert.

Nukleotidsekvensen til dette DNA er vist i SEKV. ID Nr.3. Aminosyresekvensen som er kodet derav er vist i SEKV. ID Nr.4. Det kodede protein omfatter en N-terminalt cytoplasmatisk domene (aminosyrene 1-18), et transmembranområdet (aminosyrene 19-38) og et ekstracellulært domene (aminosyrene 39-101).

DNAet i følge SEKV. ID Nr. 3 mangler nukleotidene 359 til 506 av DNA'et i følge SEKV. ID Nr. 1 og er således kalt humant TRAIL-deleskjonsvariant (huTRAILdv)-klon. Delesjonen forårsaker et skift i leserammen som resulterer i et stoppkodon i leserammen etter aminosyre 101 i følge SEKV. ID Nr. 4. DNA'et i følge SEKV. ID Nr. 3 koder således for et avkortet protein. Aminosyrene 1 til 90 i følge SEKV. ID Nr. 2 er identiske med aminosyrene 1 til 90 i følge SEKV. ID Nr. 4. Den C-terminale delen av huTRAILdv-proteinet (aminosyrene 91 til 101 i følge SEKV. ID Nr. 4) skiller seg imidlertid fra restene i de tilsvarende posisjoner i følge SEKV. ID Nr. 2 som følge av delesjonen.

huTRAILdv-proteinet mangler de ovenfor beskrevne konserverte områder funnet i de C-terminale ender til medlemmene av TNF-proteinfamiliene. Den manglende evne til dette huTRAILdv-protein med hensyn til å forårsake apoptosisdød hos Jurkat-celler bekrefter dessuten viktigheten av disse konserverte områder for biologisk aktivitet.

EKSEMPEL 3: DNA som koder for et murint TRAIL

DNA som koder for et murint TRAIL ble isolert ved følgende prosedyre. Et cDNA-bibliotek omfattende cDNA avledet fra muse-T-cellelinjen 7B9 i vektoren eZAP ble laget som beskrevet i Mosley et al. ( Cell 59:335, 1989). DNA fra biblioteket ble overført til nitrocellulosefiltre ved hjelp av vanlige teknikker.

Humane TRAIL-DNA-prober ble anvendt for å identifisere hybridiserende muse-cDNA på filtrene. To separate prober ble anvendt i to screeningsrunder. PCR-reaksjonsprodukter, med en lengde på ca. 400bp, isolert og amplifisert ved anvendelse av humant TRAIL-DNA som templat, ble anvendt som probe i den første screeningsrunden. Disse PCR-produkter bestod av et fragment av det humane TRAIL-kodende område. Proben som ble anvendt i den andre screeningsrunden bestod av hele det kodende område til det humane TRAIL-DNA i følge SEKV. ID Nr. 1. Et tilfeldig primet DNA-merkingssett (Stratagene, La Jolla, CA) ble anvendt for radiomerking av probene.

Hybridisering ble utført ved 37 °C i 50 % formamid, etterfulgt av vasking med 1 x SSC, 0,1 % SDS ved 50 °C, et muse-cDNA som var positivt ved begge screeningsrundene ble isolert.

Nukleotidsekvensen til dette DNA er vist i SEKV. ID Nr. 5 og aminosyren kodet derav er vist i SEKV. ID Nr. 6. Det kodede protein omfatter et N-terminalt cytoplasmatisk domene (aminosyrene 1-17), et transmembrant område (aminosyrene 18-38) og et ekstracellulært domene (aminosyrene 39-291). Dette muse-TRAIL er 64 % identisk med det humane TRAIL i følge SEKV. ID Nr. 2, på aminosyrenivået. Det kodende område av muse-TRAIL-nukleotidsekvensen er 75 % identisk med det kodende område i den humane nukleotidsekvens i følge SEKV. ID Nr.l.

EKSEMPEL 4: Antistoffer som binder TRAIL

Foreliggende eksempel viser fremstilling av monoklonale antistoffer som spesifikt binder TRAIL. Egnede immunogener som kan anvendes for fremstilling av slike antistoffer omfatter, men er ikke begrenset til, renset TRAIL-protein eller et immunogent fragment derav (f.eks. det ekstracellulære domene), fusjonsproteiner inneholdende TRAIL-polypeptider (f.eks. oppløselige TRAIL/Fc-fusjonsproteiner) og celler som uttrykker rekombinant TRAIL på celleoverflaten.

Kjente teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer omfatter de beskrevet i U.S. patent 4 441 993, i korte trekk ble mus immunisert med TRAIL i form av et immunogen emulgert i fullstendig Freud's adjuvans og injisert i mengder varierende fra 10-100 ig subkutant eller intraperitonealt. Etter ti til tolv dager fikk de immuniserte dyrene en innsprøytning med ytterligere TRAIL emulgert i ufullstendig Freud's adjuvans. Mus ble deretter periodevis innsprøytet etter en ukentlig eller to-ukentlig immuniseringsplan. Serumprøver ble tatt periodevis ved hjelp av retroorbital blødning eller haletuppeksisjon for testing ved hjelp av dot blot analyse eller ELISA

(Enzyme-Linked Immun-sorbent-analyse) med hensyn til TRAIL-antistoffer.

Etter påvisning av en passende antistofftiter ble positive dyr tilført en siste intravenøs injeksjon av TRAIL i saltløsning. Tre til fire dager senere ble dyrene avlivet, miltceller høstet og miltceller ble fusjonert til en murin myelomcellelinje, slik som NS1 eller fortrinnsvis P3x63Ag 8.653(ATCC CRL 1580). Fusjonene genererte hybridomceller som ble platet ut i flere mikrotiterplater i et HAT(hypoxantin, aminopterin og tymidin)-selektivt medium for å hemme proliferasjon av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider.

Hybridomcellene ble screenet ved hjelp av ELISA med hensyn til reaktivitet mot renset TRAIL ved hjelp av tilpasninger av teknikkene beskrevet i Engvall et al. ( Immunochem. 8:871, 1971 og i U.S. patent 4 703 004. Positive hybridomceller kan injiseres intraperitonealt inn i syngene BALB/c-mus for produksjon av ascitesinneholdende konsentrasjoner av anti-TRAIL-monoklonale antistoffer. Alternativt kan hybridomceller dyrkes in vitro i kolber eller rulleflasker ved hjelp av ulike teknikker. Monoklonale antistoffer som er produsert i museascites kan renses ved hjelp av ammoniumsulfatutfelling, etterfulgt av geleksklusjonskromatografi. Alternativt kan affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A eller protein G anvendes, affinitetskromatografi basert på binding til TRAIL kan også anvendes.

EKSEMPEL 5; DNA- stigeapoptosisanalyse

Humant TRAIL ble uttrykt og testet med hensyn til evne til å indusere apoptosis. Oligonukleotider tilsvarende 3' og 5' ende av det kodende område til det humane TRAIL-gen ble syntetisert med Sali og Noti restriksjonsseter innført i endene til oligonukleotidene. Det kodende område av det humane TRAIL-gen ble amplifisert ved hjelp av vanlige PCR-teknikker ved anvendelse av disse oligonukleotider som primere. PCR-reaksjonsproduktene ble kløyvd med restriksjonsendonukleasene Sali og Noti, for så bli satt inn i Sall/Notl-kløyvd pDC409-vektor. pDC409 er en ekspresjonsvektor for anvendelse i pattedyrceller, men kan også replikeres i E. coli-celler.

pDC409 er avledet fra en ekspresjonsvektor kalt pDC406 (beskrevet i McMahan et al., EMBOJ. 70:2821, 1991 og i PCT søknad WO 91/18982). pDC406 inneholder flere replikasjonsorigo avledet fra SV40, Epstein-Barr-virus og pBR322 og er et derivat av HAV-EO, beskrevet av Dower et al., J. Immunol. 142:4314 (1989). pDC406 avviker fra HAV-EO ved at et intron til stede i den tredelte adenovirus 2-ledersekvensen er fjernet i HAV-EO. DNA innsatt i et multippel kloningssete (inneholdende flere restriksjonsendonukleasekløyvingsseter) ble transkribert og translatert ved anvendelse av regulatoriske elementer avledet fra HIV og adenovirus.

Vektoren inneholder også et gen som gir ampicillinresistens.

pDC409 avviker fra pDC406 ved at et Bgl II-sete utenfor mcs er fjernet slik at mcs-Bgl II-setet er unikt. To Pme 1-seter og et Srf 1-sete er tilført til mcs og tre stoppkodoner (TAG) er posisjonert nedstrøms for mcs slik at det er funksjonelt i alle tre leserammer. En T7-primer/promoter er tilført for å binde denne DNA-sekvenseringsprosessen.

Apenyrecellelinjen CV-l/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) ble avledet ved transfeksjon av CV-1-cellelinje (ATCC CCL 70) med et gen som kodet for Epstein-Barr-viruskjerneantigen-1 (EBNA-1) som konstitutivt uttrykker EBNA-1 avledet fra den humane CMV-intermediære-tidlige enhanceren/promoteren, som beskrevet av McMahan et al., ovenfor. EBNA-1-genet tillater episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC409 som inneholder EBV-replikasjonsorigo.

CVl/EBNA-celler dyrket i Falcon T175-kolber ble transfektert med 15 ig av enten "tom" pDC409 eller pDC409 inneholdende det humane TRAIL-kodende område. De transformerte celler ble dyrket i tre dager ved 37 °C og 10 % C02. Cellen ble så vasket med PBS, inkubert i 20 minutter ved 37 °C i 50 mM EDTA, skrapet av kolbene med en celleskraper og vasket en gang i PBS. Deretter ble cellene fiksert i 1 % paraformaldehyd PBS i 10 minutter ved 4 °C og vasket 3 ganger i PBS.

Jurkat-celler ble anvendt som målceller ved denne analyse for å bestemme hvorvidt de TRAIL-uttrykkene cellene kunne indusere apoptosis deri. Jurkat-cellelinjen, klon E6-1, er en human akutt T-celleleukemicellelinje tilgjengelig fra American Type Culture Collection med aksesjonsnr. ATCC TIB 152, og beskrevet i Weiss et al., ( J. Immunol. 735:123-128, 1984). Jurkat-cellene ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10 % føtalt bovint serum og 10 ig/ml streptomycin og penicillin til en tetthet på 200,000 til 500,000 celler per ml. Fire millioner av cellene per brønn ble dyrket samtidig i en 6 brønners plate med 2,5 ml medium med ulike kombinasjoner av fikserte celler, supernatanter fra celler transfektert med Fas-ligand og ulike antistoffer som angitt nedenfor.

Etter fire timer ble cellene vasket en gang i PBS og pelletert ved 1200 RPM i 5 minutter i en bordsentrifuge. Pelletene ble resuspendert og inkubert i ti minutter ved 4 °C i 500 il buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,5 og 0,2 % Triton X-100, som lyserer cellene, men holder kjernene intakte. Lysatet ble så spunnet ved 4 °C i 10 minutter i mikrosentrifuge ved 14,000 RPM. Supernatanter ble fjernet og ekstrahert tre ganger med 1 ml 25:24:1 fenol-kloroform-isoamylalkohol, etterfulgt av utfelling med NaOAC og etanol i nærvær av 1 ig glykogenbærer (Sigma).

De resulterende pelleter ble resuspendert i 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,5 og inkubert med 10 ig/ml RNase A ved 37 °C i 20 minutter. DNA-oppløsningene ble så dekomponert ved hjelp av 1,5 % agarosegelelektroforese i Tris-Borat-EDTA-buffer, farget med etidiumbromid og fotografert med gjennomlysning av UV-lys.

Resultatene ble som følger. Fikserte CVl/EBNA-celler transfektert med enten pDC409 eller pDC409-TRAIL viste ingen påviselig DNA-stige. pDC409-TRAIL-fikserte celler som var dyrket sammen ed Jurkat-celler viste DNA-stige, men pDC409-fikserte celler dyrket sammen med Jurkat-celler gjorde ikke det.

DNA-stige ble også sett når Jurkat-celler ble dyrket sammen med konsentrerte supernatanter fra COS-celler transfektert med DNA som kodet for human Fas-ligand i pDC409. Supernatantene ble antatt å inneholde oppløselig Fas-ligand som frigjøres proteolytisk fra celleoverflaten. Fas-ligand-indusert DNA-stige kunne blokkeres ved tilsetning av 10 lg/ml av et oppløselig, blokkerende monoklonalt antistoff rettet mot Fas. Det samme antistoff kunne ikke inhibere dannelse av stige med Jurkat-DNA av pDC409-TRAIL-celler, noe som viser at TRAIL ikke induserer apoptosis ved hjelp av Fas.

I den samme analyseprosedyre induserte fikserte CVl/EBNA-celler transfektert med pDC409-TRAIL DNA stige i U937-celler. U937 (ATCC CRL 1593) er en histiocyttisk-lymfomcellelinje. Graden av effektor-celler sammenlignet med målceller var 1:4 (det samme som ved analysen av Jurkat-målceller).

Fragmenteringen av cellulært DNA inn i et mønster kjent som DNA stige er et kjennetegn ved apoptosis. I den følgende analyse induserte TRAIL apoptosis i en leukemicellelinje og en lymfomcellelinje.

EKSEMPEL 6; Northern Blot Analvsis

Ekspresjon av TRAIL i flere ulike vevstyper ble analysert ved en vanlig Northern blot prosedyre. Northern blot inneholdende poly A+RNA fra flere vev fra voksne mennesker (multiple vev northern blot I og II) ble erholdt fra Clonetech (Palo Alto, CA). Andre blot ble fremstilt ved oppløsning av RNA-prøver på en 1,1 % agaroseformaldehydgel, blotting på Hybond-N som anbefalt av produsenten (Amersham Corporation) og farging med metylenblått for å vise RNA-konsentrasjoner. Blottene ble hybridisert med en antisense-RNA-riboprobe tilsvarende hele det kodende område til humant TRAIL.

Humant TRAIL-mRNA ble påvist i perifere blodlymfocytter, tykktarm, tynntarm, ovarie, prostata, thymus, milt, morkake, lunge, nyre, hjerte, bukspyttkjertel og skjelettmuskulatur. TRAIL-transkripter ble funnet i store mengder i den store celle-anaplastiske lymfomcellelinje Karpas 299 (Fischer et al., Blood, 72:234,1988 og i T-celler fra mandler. TRAIL-bærer var til stede i mindre grad i Burkitt-lymfomcellelinjen kalt Raji.

TRAIL-mRNA ble ikke påvist i testis, hjerne eller lever eller i flere T-cellelinjer. Få eller ingen TRAIL-transkripter ble påvist i nylig isolerte perifere blod-T-celler (PBT), enten ustimulert eller stimulert med PMA og kalsiumisofor i 20 timer.

EKSEMPEL 7: Produksjon av et oppløselig TRAIL- polypeptid

Et oppløselig humant TRAIL-polypeptid omfattende aminosyrene 95 til 181 i følge SEKV. ID NR. 2 ble fremstilt som følger. Polypeptidet er et fragment av det ekstracellulære domene som mangler avstandsområdet beskrevet ovenfor.

En ekspresjonsvektor som koder for oppløselig, humant TRAIL ble konstruert ved fusjon i leseramme av DNA som kodet for følgende aminosyresekvenser fra N- til C-terminalende): en ledersekvens avledet fra humant cytomegalovirus (CMV), en syntetisk epitope kalt "Flag" og aminosyrene 95-281 i humant TRAIL. "Flag"-oktapeptidet (SEKV. ID NR. 7) letter rensing av proteiner fusjonert dertil, som beskrevet ovenfor av Hopp et al. ( Biotechnology 5:1204-1210, 1988).

Det TRAIL-kodende DNA-fragment ble isolert og amplifisert ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av oligonukleotidprimere som definerte enden til et DNA-fragment som kodet for aminosyrene 95-281 i følge SEKV. ID NR. 2. Den 3' primeren var en 31-mer som i tillegg tilførte et Notl-sete nedstrøms for en TRAIL-kodende sekvens. Den 5' primeren tilførte et Spel-sete og en "Flag"-epitope som koder for sekvensen oppstrøms for den TRAIL-kodende sekvens. PCR ble utført ved hjelp av vanlige prosedyrer ved anvendelse av det ovenfor beskrevne humane TRAIL-cDNA som templat.

Reaksjonsproduktene ble kløyvet med Spel og Noti og innsatt inn i ekspresjonsvektoren pDC409 (beskrevet i eksempel 5), som var kløyvet med Sali og Noti. Annealte oligonukleotider som dannet et Sall-Spel-fragment som kodet for en CMV-åpen leserammeleder ble også legert inn i vektoren. Aminosyresekvensen til den CMV-avledede lederen er vist i SEKV. ID NR. 9. Aminosyrene 1 til 29 i følge SEKV. ID NR. 9 er kodet av CMV DNA, der aminosyrene 30 til 32 var kodet av oligonukleotidene anvendt ved konstruksjon av vektoren E. co/z-celler ble transfektert med legeringsblandingen og den ønskede rekombinante ekspresjonvektor ble isolert derfra.

CVl-EBNA-celler (ATCC CRL 10478; beskrevet i eksempel 5) ble transfektert med den rekombinante vektoren, som ble kalt pDC409-"Flag"-shTRAIL, og dyrket for å tillate ekspresjon og sekresjon av det oppløselige "Flag"-TRAIL-polypeptid. Kultursupernatanter ble høstet 3 dager etter transfeksjon og tilført til en kolonne inneholdende et anti-"Flag"-antitoff kalt M2, som var immobilisert på en fast bærer. Kolonnen ble så vasket med PBS. Det monoklonale antistoff, M2 er beskrevet i Hopp et al., ovenfor, og er tilgjengelig fra Kodak Scientific Imaging System, New Haven, Connecticut. Fraksjoner på 800 il ble eleuert fra kolonnen med 50 mM citrat og nøytralisert umiddelbart i 0,45 ml IM Tris (pH 8). Fraksjoner ble justert til 10 % glyserol og lagret ved -20 °C inntil det var behov for dem.

Dette oppløselige rekombinante "Flag"/humane TRAIL, uttrykt i CVl/EBNA-celler hadde en tilsynelatende molekylvekt på 28 kD etter analyse ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). "Flag"-resten ble estimert til å omfatte 880 dalton av den totale molekylvekt. Gelfiltreringsanalyser viser at molekylet er en multimer i oppløsning med en størrelse på ~80 kD. Uten å være bundet av teorien tyder gelfiltreringsanalyser på at det oppløselige rekombinante "Flag"/humane TRAIL naturlig dannet en kombinasjon av dimerer og trimerer, der trimerer var dominerende.

En ekspresjonsvektor kalt pDC409-"Flag"-smTRAIL, som koder for et CMV-leder-"Flag"-oppløselig murint TRAIL-protein ble konstruert ved hjelp av analoge fremgangsmåter. Et DNA-fragment som kodet for et oppløselig, murint TRAIL-polypeptid ble isolert og amplifisert ved hjelp av PCR. Oligonukleotidene som definerte endene til DNAet som kodet for aminosyrene 99 til 291 i den murine TRAIL-sekvensen i følge SEKV. ID NR. 6 ble anvendt som 5' og 3' primere i PCRen.

EKSEMPEL 8: Lvsering av leukemiceller ved hjelp av oppløselig TRAIL

I eksempel 5 induserte celler som uttrykket humant TRAIL apoptosis hos Juurkat-celler (en leukemicellelinje). I det følgende studie drepte den fettoppløselige humant xTRAIL-polypeptid Jurkat-celler.

Jurkat-celler ble dyrket til en tetthet på 200,000 til 500,000 celler per ml i RPMI-medium supplert med 10 % føtalt bovint serum, 100 ig/ml streptomycin og 100 ig/ml pernicillin. Cellene (i 96-brønners plater med 50.000 celler per brønn i et volum på 100 il) ble inkubert i tyve timer med reagensene vist i figur 1. "TRAIL-supe" refererer seg til kondisjonert supernatant (10 il per brønn) fra CVl/EBNA-celler transfektert med pDC409-"Flag"-shTRAIL (se eksempel 7). "Kontrollsupe" refererer seg til supernatant fra CVl/EBNA-celler transfektert med tom vektor. Hvor dette er vist ble immmobilisert anti-"Flag"-antistoff M2 ("Imm. M2") tilført i en konsentrasjon på 10 ig/ml i et volum på 100 il per brønn og tillatt å koble seg til, enten over natten ved 4 °C eller i 2 timer ved 37 °C, hvoretter brønner ble aspirert og vasket to ganger med PBS for å fjerne ubundet antistoff. Jurkat-celler behandlet med Fas-ligand eller M3, et blokkerende monoklonalt antistoff rettet mot Fas, Alderson et al., J. Exp. Med. 181:11, 1995; og PCT søknad WO 95/10540 ble inkubert i analysen som vist.

Metabolsk aktivitet til de således behandlede celler ble analysert ved hjelp av metabolsk forandring av Alamar-blå farge ved følgende prosedyrer. Alamar-blå omdanning ble målt ved tilsetning av 10 il alamar-blå farge (Biosource International, Camarillo, CA) per brønn der den optiske tetthet (OD) ved 550-600 nm på tidspunktet for tilføring av farge ble trukket fra OD 550-600 nm etter fire timer. Ingen omdanning av farge er plottet som 0 % levedyktighet og nivået av fargeforandring i fravær av TRAIL er plottet som 100 % levedyktighet. Prosentvis levedyktighet ble beregnet ved multiplisering av fargende grad ved forsøket versus kontrollkulturer på 100.

Resultatene er vist i figur 1. Feilsøyler utgjør et standadawiket ved målingene fra fire uavhengige brønner og verdiene er gjennomsnittet av disse målingene.

Den TRAIL-innholdende supernatant forårsaket en signifikant reduksjon i overlevelse hos Jurkat-celler. En større reduksjon i celleoverlevelse skyldtes kontakt med en kombinasjon av TRAIL-inneholdende supernatant og immobilisert anti-"Flag"-antistoff M2. En mulig forklaring er at M2 fremmer kryssbinding av "Flag"/reseptorkomplekser, noe som derved øker signalstyrken.

Fas-ligang viste evne til å drepe Jurkat-celler. Anti-Fas-antistoffet, M3 hemmet aktiviteten til Fas-liganden, men ikke aktiviteten til TRAIL.

For å bekrefte at forandringene i fargeomdanning ved alamar-blå-analysen skyldtes celledød ble reduksjon i celleoverlevelse indusert av TRAIL bekreftet ved farging av cellene med trypan-blått.

EKSEMPEL 9: Lvsering av leukemi- og lymfomceller

I eksemplene 5 og 8 induserte TRAIL apoptosis i en leukemi-cellelinje (Jurkat) og en lymfomcellelinje (U937). Følgende undersøkelse viste dessuten evnen TRAIL har til å drepe leukemi- og lymfomceller.

De humane cellelinjene vist i tabell I ble dyrket til en tetthet på 200.000 til 500.000 celler per ml i RPMI-medium supplert med 10 % føtalt bovint serum, 100 ig/ml streptomycin og 100 ig/ml penicillin. Cellene (i 96 brønners plater med 50.000 celler per brønn i et volum på 100 il) ble inkubert i tyve timer med kontisjonerte supernatanter (10 il per brønn) fra pDC409-"Fla"-shTRAIL-transfekterte CVl/EBNA-celler.

Metabolsk aktivitet ble analysert ved omdanning av alamar-blå farge, i analyseprosedyren beskrevet i eksempel 8. Resultatene er vist i tabell I.

For å bekrefte at forandringene i fargeomdanning ved alamar-blå-analysen skyldtes celledød ble reduksjonen i celleoverlevelse indusert av TRAIL bekreftet ved farging av cellene med trypan-blått. Krystallfiolett farging, utført som beskrevet av Flick and Gifford ( J. Immunol. Methods 58:167-175,1984) bekreftet også resultatene observert ved alamar-blå-analysen. Apoptosiske egenskaper ved celledøden ble bekreftet med trypan-blått-farging og visualisering av apoptotisk fragmentering ved hjelp av mikroskopi.

Som vist i tabell I var mange cancercellelinjer sensitive for TRAIL-formidlet dreping. Andre celletypers mottagelighet for TRAIL-formidlet apoptosis kan bestemmes ved anvendelse av analyseprosedyrene beskrevet i disse eksempler.

TRAIL viste ingen signifikant cytotoksisk virkning på cellelinjene THP-1, K562, Karpas 299 og MP-1. K299 også kjent som Karpas 299 (DSM-ACC31) ble dannet fra perifert blod fra en mann diagnostisert til å ha stor grad av storcellet ana-plastisk lymfom (Fischer et al., Blood, 72:234,1988). MP-1 er en spontant avledet EBV-transformert B-cellelinje (Goodwin et al., Cell 73A41,1993) uten å være bundet av teorien er det mulig at disse fire cellelinjer ikke uttrykker en reseptor for TRAIL eller kjennetegnet ved oppregulering av et gen som hemmer apoptosis.

EKSEMPEL 10: aktivitet til TRAIL på tvers av arter Reaktiviteten til humant og murint TRAIL på tvers av arter ble testet som følger. Murint og humant TRAIL ble inkubert med den humane melanomcellelinjen A375 (ATCC CRL 1619). Ettersom dette er en forbundet cellelinje ble en krystallfiolett analyse, fremfor alamar-blått anvendt for å bestemme celleoverlevelse. A375-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10 % føtalt, bovint serum, 100 ig/ml streptomycin og 100 ig/ml penicillin. Cellene (i 96-brønners plater med 10.000 celler per brønn i et volum på 100 il) ble inkubert i 72 timer med det oppløselige, murine TRAIL, beskrevet i eksempel 7. Krystallfiolett farging ble utført som beskrevet av (Flick and Gifford ( J. Immunol. Methods 58:167-175, 1984). Disse resultater viste at både humant og murint TRAIL er aktive på disse humane celler ved at murint og humant TRAIL drepte A375-celler.

Humant TRAIL's evne til å virke på murine celler ble testet ved anvendelse av den udødeliggjorte murine fibroblastcellelinjen, L929. Inkubering av L929-celler med enten humant eller murint TRAIL resulterte i en reduksjon i krystallfiolett farging, noe som viste at humant og murint TRAIL er aktivt hos (induserte apoptosis hos) murine celler. I tillegg til krystallfiolett ble celledød bekreftet ved hjelp av trypan-blått farging.

EKSEMPEL 11: lvsering av CMV- infiserte celler

Følgende forsøk viste at det oppløselige "Flag"-humane TRAIL-protein fremstilt i eksempel 7 har en cytotoksisk virkning på virusinfiserte celler.

Normale humane fibroblaster fra tannkjøtt ble dyrket til konfluens i 24 brønners plater i 10 % C02 og DMEM-medium supplert med 10 % føtalt bovint serum, 100 ig/ml streptomycin og 100 ig/ml penicillin. Prøver fra fibroblastene ble behandlet som angitt i figur 2. Konsentrasjoner av cytokiner var 10 ng/ml med hensyn til å-interferon og 30 ng/ml med hensyn til oppløselig "Flag"-humant TRAIL. Alle prøver som fikk TRAIL fikk også to ganger vektoverskudd av anti-"Flag"-antistoff, M2 (beskrevet ovenfor), som fremmer TRAIL-aktivitet (fortrinnsvis ved kryssbinding).

Forbehandling av celler med de indikerte cytokiner ble gjort i 20 timer. For å infisere celler med cytomegalovirus (CMV) ble kulturmedium aspirert og cellene ble infisert med CMV i DMEM med en omtrentlig MOI (infeksjonsmultisitet) på 5. Etter to timer ble virusinneholdende medium byttet ut med DMEM og cytokinet tilført som vist. Etter 24 timer ble cellene farget med krystallfiolett farge som beskrevet (Flick og Gifford, 1984 ovenfor). Fargede celler ble vasket to ganger med vann, ødelagt i 200 il 2 % natriumdeoksycholat, fortynnet 5 ganger i vann og OD ble målt ved 570 nm. Prosentvis maksimal farging ble beregnet ved normalisering av ODs til prøven som viste størst grad av farging. Lignende resultater ble erholdt ved flere uavhengige forsøk.

Resultatene vist i figur 2 viser at TRAIL-spesifikt drepte CMV-infiserte fibroblaster. Celledøden ble forsterket ved forbehadling av cellene med å-interferon. Ingen signifikant død hos ikke-virusinfiserte fibroblaster var resultat av kontakt med

TRAIL.

EKSEMPEL 12: Analyse for identifisering av blokkerende antistoffer

Blokkerende antistoffer rettet mot TRAIL kan identifiseres ved testing av antistoffer med hensyn til evne til å inhibere en spesiell biologisk aktivitet til TRAIL. I den følgende analyse ble et monoklonalt antistoff testet med hensyn til evnen til å hemme TRAIL-formidlet apoptosis hos Jurkat-celler. Jurkat-cellelinjen er beskrevet i eksempel 5.

En hybridomcellelinje som produserte et monoklonalt antistoff rettet mot et "Flag"/oppløselig, humant TRAIL-fusjonsprotein ble anvendt i denne analyse. Supernatanter fra hybridomakulturene ble inkubert med 20 ng/ml "Flag"/ oppløselig, humant TRAIL kryssbundet med 40 ng/ml anti-"Flag"-monoklonale antistoff M2, i RPMI-fullstendig medium i en 96-brønners mikrotiterplate. En ekvivalent mengde med ferskt hybridomkulturmedium ble tilsatt kontrollkulturene. "Flag"/oppløselig, humant TRAIL-fusjonsprotein og det monoklonale antistoff kalt M2 er besrkevet i eksempel 7.

Hybridomasuperaatanten ble anvendt i en fortynning på 1:50 (volum/volum) (fargingskonsentrasjon) og med to ganger serielle fortynninger derav. Etter inkubering ved 37 °C, 10 % C02 i 30 minutter ble 50.000 Jurkat-celler tilført per brønn og inkubering ble fortsatt i 20 timer.

Celleoverlevelse ble så analysert ved måling av metaolsk omdanning av alamar-blå-farge. En alamar-blå omdanningsanalyseprosedyre er beskrevet i eksempel 8. Det monoklonale antistoff ble funnet å hemme apoptosis hos Jurkat-celler indusert med "Flag"/oppløst humant TRAIL.

EKSEMPEL 13: TRAIL- blokkerende studie

Humane mikrovaskulære endotelceller av dermal opprinnelse ble behandlet i 16-18 timer med plasma fra pasienter med trombocyttisk trombocytopenisk purpura (TTP) eller med kontrollplasma, enten alene eller i nærvær av anti- TRAIL-polyklonalt antiserum. En fortynning på 1:2000 av antiserum ble anvendt. Plasmaet var fra to TTP pasienter, kalt #1 og #2 nedenfor. Cellene som ble anvendt i analysene var MVEC-1 (HMVED 2753, anskaffet fra Clonetics, San Diego, CA) og MVEC-2 (DHMVED 30282, anskaffet fra Cell Systems, Kirkland, WA). Kulturer av disse celler kan opprettholdes som beskrevet i Laurence et al. ( Blood, 87:3245, 1996.

Resultatene var som følger. De viste dataer er fra DNA-histogrammer til celler farget med propidiumiodid og "A0-topp" representerer den apoptotiske topp(se Oyaizu et al., Blood, 75:696, 1990).

Dataene viser at plasma avledet fra TTP-pasienter indduserer apoptosis hos mikrovaskulære endotelceller med dermal opprinnelse. Denne apoptosis ble hemmet av polyklonale antistoffer rettet mot TRAIL.

Claims (29)

1. Isolert DNA som koder for et TRAIL-polypeptid, karakterisert ved at TRAIL-polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens som er utvalgt fra: (a) aminosyrene 1 til 281 ifølge SEKV. ID NR. 2. (b) aminosyrene 1 til 291 ifølge SEKV. ID NR. 6, eller (c) et fragment av (a) eller (b) der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler, der nevnte TRAIL-polypeptid er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

2. Isolert DNA ifølge krav 1, karakterisert ved at TRAIL-polypeptidet omfatter en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1 til 281 i følge SEKV. ID NR. 2 og aminosyrene 1 til 291 i følge SEKV. ID NR. 6.

3. Isolert DNA ifølge krav 1, karakterisert ved at TRAIL-polypeptidet er et fragment av det humane TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 2 eller et fragment av det murine TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 6, hvori fragmentet har evnen til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

4. Isolert DNA som koder for et oppløselig TRAIL-polypeptid, karakterisert ved at det oppløselige TRAIL-polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens utvalgt fra : a) det ekstracellulære domenet til det humane TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 2; b) det ekstracellulære domenet til det murine TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 6; eller c) et fragment av det ekstracellulære domenet til (a) eller (b); der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler, hvori det oppløselige TRAIL-polypeptid har evnen til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

5. DNA ifølge krav 4, karakterisert ved at det oppløselige TRAIL-polypeptid omfatter en aminosyresekvens utvalgt fra: a) det ekstracellulære domenet til det humane TRAIL-protein i følge SEKV. ID NR. 2; eller b) et fragment av nevnte ekstracellulære domene, hvori fragmentet har evnen til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

6. Isolert DNA ifølge krav 5, karakterisert ved at det oppløselige TRAIL-polypeptid omfatter aminosyresekvensen x til 281 i følge SEKV. ID NR. 2, hvori x representerer et helt tall fra 39 til 95.

7. Isolert DNA ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte oppløselige TRAIL-polypeptid omfatter aminosyrene 124 til 276 ifølge SEKV. ID NR. 2.

8. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA ifølge ethvert av kravene 1 til 7.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et TRAIL-polypeptid, karakterisert ved at fremgangsmåten er kjennetegnet ved dyrkning av en vertscelle inneholdende en vektor ifølge krav 8 under betingelser som fremmer ekspresjon av TRAIL, og utvinning av TRAIL-polypeptidet.

10. Isolert DNA som koder for et fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter et TRAIL-DNA ifølge et hvert av kravene 1 til 7, fusjonert til DNA som koder for et heterologt polypeptid.

11. Isolert DNA ifølge krav 10, karakterisert ved at det heterologe polypeptid fremmer oligomerisering.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en TRAIL-oligomer, karakterisert ved at fremgangsmåten er kjennetegnet ved dyrkning av en vertscelle inneholdende en ekspresjonsvektor som omfatter et DNA ifølge krav 11, under betingelser som fremmer ekspresjon av fusjonsproteinet og oligomerisering derav og utvinning av TRAIL-oligomeren.

13. Antistoff som binder et TRAIL-polypeptid utvalgt fra det humane TRAIL-polypeptid i følge SEKV. ID NR. 2 eller det murine TRAIL-polypeptid i følge SEKV. ID NR. 6; eller et antigen-bindende fragment av nevnte antistoff.

14. Antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff.

15. Renset TRAIL-polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens som er utvalgt fra: (a) aminosyrene 1 til 281 ifølge SEKV. ID NR. 2; (b) aminosyrene 1 til 291 ifølge SEKV. ID NR. 6; eller (c) et fragment av (a) eller (b) der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler; der nevnte TRAIL-polypeptid er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

16. Renset oppløselig TRAIL-polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som er minst 80 % identisk med en sekvens som er utvalgt fra: (a) det ekstracellulære domenet til det humane TRAIL-proteinet ifølge SEKV. ID NR.

2; (b) det ekstracellulære domenet til det murine TRAIL-proteinet ifølge SEKV. ID NR.

6; eller (c) et fragment av det ekstracellulære domenet av (a) eller (b) der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler; der nevnte oppløselige TRAIL-protein er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

17. Oppløselig TRAIL-polypeptid ifølge krav 16, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som er utvalgt fra: (a) det ekstracellulære domenet til det humane TRAIL-proteinet ifølge SEKV. ID NR.

2; eller (b) et fragment av nevnte ekstracellulære domene, der nevnte fragment er i stand til å indusere apoptose hos Jurkat-celler.

18. Oppløselig TRAIL-polypeptid ifølge krav 17, karakterisert ved at det omfatter sekvensen til aminosyrene x til 281 ifølge SEKV. ID NR. 2, der x representerer et helt tall fra 39 til 95.

19. Oppløselig TRAIL-polypeptid ifølge krav 17, karakterisert ved at det omfatter aminosyrene 124-276 ifølge SEKV. ID NR. 2.

20. Oligomer, karakterisert ved at den omfatter fra to til tre oppløselige TRAIL-polypeptider ifølge krav 16.

21. Isolert DNA ifølge krav 5, karakterisert ved at den N-terminale aminosyre av det oppløselige TRAIL-polypeptid er utvalgt fra restene 39 til 124 av SEK. ID. NR.: 2, og den C-teminale aminosyre av det oppløselige TRAIL-polypeptid er utvalgt fra restene 276 til 281 av SEK. ID. NR.: 2.

22. Oppløselig TRAIL-polypeptid ifølge krav 17, karakterisert ved at den N-terminale aminosyre av polypeptidet er utvalgt fra restene 39 til 124 av SEK. ID. NR.: 2, og den C-terminale aminosyre av polypeptidet er utvalgt fra restene 276 til 281 av SEK. ID. NR.: 2.

23. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et TRAIL-polypeptid eller oligomer ifølge ethvert av kravene 15-20 eller 22 og en fysiologisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipiens.

24. Farmasøytisk preparat for bruk som et medikament, karakterisert ved at det omfatter et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge ethvert av kravene 15-20, 22 eller 23.

25. Farmasøytisk preparat for anvendelse ved indusering av apoptose hos målceller, karakterisert ved at de omfatter et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge ethvert av kravene 15-20,22 eller 23.

26. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert ved at målcellene er cancerceller.

27. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert ved at målcellene er viralt infiserte celler.

28. Anvendelse av et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge ethvert av kravene 15-20, 22 eller 23 ved fremstillingen av et medikament for behandling av cancer.

29. Anvendelse av et TRAIL-polypeptid, oligomer eller preparat ifølge ethvert av kravene 15-20,22 eller 23 ved fremstillingen av et medikament for behandling av virusinfeksjon.