KR100510234B1 - 세포소멸을 유도하는 시토킨 - Google Patents

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Abstract

트레일로 명명된 신규한 시토킨은 암세포 및 바이러스 감염 세포를 포함하는 표적 세포의 세포소멸을 유도한다. 트레일을 코딩하는 단리된 DNA 서열은 발현 벡터 및 트레일 폴리펩티드의 생산에 유용한 형질전환된 숙주 세포와 함께 개시되어 있다. 트레일에 특이적으로 결합되는 항체 또한 제공된다.

Description

세포소멸을 유도하는 시토킨 {Cytokine that Induces Apoptosis}
세포소멸(apoptosis) 이라고 알려진 프로그램된 세포 사멸은 괴사(necrosis)로 인한 세포 사멸과는 상이하다. 세포소멸은 배형성, 변태, 내분비 의존성 조직 위축, 정상 조직 교체 및 면역 흉선 세포의 사멸 (항원-수용체 복합체를 통해 유도되거나 또는 글루코코르티코이드에 의해 유도됨)(이또(Itoh) 등, Cell 66:233, 1991)에서 발생한다. 흉선에서 T-세포가 성숙되는 동안, 자기 항원을 인지하는 T-세포는 세포소멸 과정을 통해 파괴되지만, 다른 것들은 양성적으로 선택된다. 특정한 자기 에피토프(예: 비효율적으로 처리되고 제공되는 소정의 자기 단백질 항원성 결정물질)를 인지하는 일부 T-세포가 이 제거 과정에서 탈피하여서 자가면역 질병에서 중요한 역할을 담당한다는 가능성이 제시되어 왔다 (게몬(Gammon) 등, Immunology Today 12:193, 1991).
파스(Fas)라고 알려진 세포 표면 항원은 세포소멸을 매개하는 것으로 보고되어 왔고, 자가반응성 T-세포의 클론 결실에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 믿어진다 (이또 등, Cell 66:233, 1991; 와따나베-후꾸나게(Watanabe-Fukunage) 등, Nature 356:314, 1992). 단일클론 항체를 파스에 특이적으로 가교결합시키는 것은 다양한 세포주를 세포소멸로 유도한다고 보고되었다 (요네하라(Yonehara) 등, J. Exp. Med., 169:1747, 1989; 트라우쓰(Trauth) 등, Science, 245:301, 1989). 그러나, 특정 조건에서는 단일클론 항체의 파스에 대한 특이적 결합은 신선하게 단리된 T 세포에 대해 공동 자극 효과를 가질 수 있다 (앨더슨(Alderson) 등, J. Exp. Med. 178:2231, 1993).
쥐의 파스 리간드를 코딩하는 DNA (수다 등, Cell, 75:1169, 1993) 및 인간의 파스 리간드 (다까하시 등, International Immunology 6:1567, 1994)가 단리되어 있다. 파스 항원을 발현시키는 세포에 대한 파스 리간드의 결합은 세포소멸을 유도하는 것으로 입증되었다 (수다 등의 상기문헌 및 다까하시 등의 상기 문헌).
세포소멸에서 역할을 담당하는 다른 분자들의 존재 및 식별을 위한 조사가 바람직하다. 이러한 분자를 식별하는 것은 세포소멸을 조절하는 다른 수단을 제공하고, 면역계에 의한 자가 내성의 증진 및 자가면역 질병의 병인학을 조사하는 것을 추가로 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 신규한 시토킨 단백질, 및 시토킨을 코팅하는 단리된 DNA, 및 단리된 DNA를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 리간드의 종양 괴사 인자 (TNF)계통의 구성원인 신규한 시토킨의 특성은 특정 유형의 표적 세포의 세포소멸을 유도하는 능력을 포함한다. 따라서, 이 단백질은 TNF 관련 세포소멸 유도 리간드(TRAIL)로 명명한다. 트레일(TRAIL)과 접촉하여 살생되는 세포 유형 중에는 백혈병, 림프종 및 흑색종 세포와 같은 암 세포, 및 바이러스에 감염된 세포가 있다.
트레일 폴리펩티드의 생산 방법은 트레일 코팅 DNA를 함유하는 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 트레일을 발현시키기에 적절한 조건 하에서 배양한 후, 발현된 트레일 폴리펩티드를 배양액으로부터 회수하는 것을 포함한다. 트레일 폴리펩티드에 대한 항체도 또한 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 8에 기재된 분석법의 결과를 나타낸다. 가용성 인간 트레일 폴리펩티드가 백혈병 세포주인 저캣(Jurkat) 세포의 사멸을 유도함을 입증하였다.
도 2는 실시예 11에 기재된 분석법의 결과를 나타낸다. 가용성 인간 트레일 폴리펩티드와의 접촉은 시토메갈로바이러스 감염된 인간 섬유아세포의 사멸을 유도하는 반면, 바이러스에 감염되지 않은 섬유아 세포는 살생되지 않았다.
트레일로 명명된 신규한 단백질은 본 명세서에서 트레일을 코딩하는 DNA 및 트레일 DNA를 함유하는 재조합 발현 벡터와 함께 제공된다. 재조합 트레일 폴리펩티드의 생산 방법은 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 트레일을 발현시키기에 적절한 조건 하에서 배양하고, 발현된 트레일을 회수하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 트레일 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 하나의 실시 태양에서, 항체는 단일클론성 항체이다.
트레일 단백질은 특정 유형의 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 및 바이러스 감염된 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 형질 전환된 세포의 세포 소멸을 유도한다. 하기의 실시예 5, 8, 9 및 10에 입증된 바와 같이, 트레일은 인간 백혈병, 림프종 및 흑색종 세포주의 세포소멸을 유도하였다. 트레일의 용도 중에서, 암 세포를 살생하는 용도가 있다. 또한, 트레일은 바이러스 감염의 치료에 사용된다. 시토메갈로바이러스 (CMV)에 의한 감염은 인간의 섬유아 세포가 트레일과 접촉할 경우에 세포소멸되게 하는 반면, 비감염된 섬유아세포는 트레일과 접촉하여도 살생되지 않았다 (실시예 1 참조).
인간 트레일을 코딩하는 DNA의 단리는 하기 실시예 1에 기재되어 있다. 실시예 1에서 단리된 인간 트레일 DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 1에 나타내었고, 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 2에 나타내었다. 이 인간 트레일 단백질은 N-말단 세포질 도메인 (아미노산 1-18), 트랜스막 영역 (아미노산 19-38), 및 세포외 도메인 (아미노산 39-281)을 포함한다. 세포외 도메인은 수용체 결합 영역을 포함한다.
상기 인간 트레일 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 형질전환된 이. 콜리(E. Coli) 균주 DH10B를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 1995년 6월 14일에 기탁 번호 제69849호로 기탁하였다. 기탁은 부다페스트 조약 하에 이루어졌다. 기탁된 균주 중 재조합 벡터는 발현 벡터 pDC409이다 (실시예 5에 기재됨). 벡터를 SalI 및 NotI로 소화 분해시키고, 서열 1에 나타난 전체 코딩 영역을 포함하는 인간 트레일 DNA를 벡터 내로 라이게이션하였다.
제2 인간 트레일 단백질을 코딩하는 DNA를 실시예 2에 기재된 바와 같이 단리하였다. DNA의 뉴클레오티드 서열을 서열 3에 나타내고, 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 4에 나타내었다. 코딩된 단백질은 N-말단 세포질 도메인 (아미노산 1-18), 트랜스막 영역 (아미노산 19-38), 및 세포외 도메인 (아미노산 39-101)을 포함한다.
서열 3의 DNA는 서열 1의 DNA의 영역이 결핍되고, 따라서, 인간 트레일 결실 변형체 (hu트레일dv) 클론으로 명명된다. 서열 1의 뉴클레오티드 18 내지 358은 서열 3의 hu트레일dv DNA의 뉴클레오티드 8 내지 348과 동일하다. 서열 1의 뉴클레오티드 359 내지 506은 서열 3의 클로닝된 DNA로부터 손실된다. 결실은 리딩 프레임에서 이동(shift)이 일어나 결과적으로 서열 4의 아미노산 101 뒤가 프래임 내 정지 코돈이 된다. 따라서, 서열 3의 DNA는 끝이 절단된 단백질을 코딩한다. 서열 2의 아미노산 1 내지 90은 서열 4의 아미노산 1 내지 90과 동일하다. 그러나, 결실로 인하여, hu트레일dv 단밸질의 C-말단 영역 (서열 4의 아미노산 91 내지 101)은 서열 2의 상응 위치의 잔사와 상이하다. 전체 길이의 hu트레일dv 단백질과 대조적으로, 끝이 절단된 hu트레일dv 단백질은 저캣 세포주의 T 세포 백혈병 세포의 세포소멸을 유도하는 능력을 보이지 않는다.
또한, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 생쥐의 트레일 단백질을 코딩하는 DNA를 단리하였다. DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 5에 나타내었고, 이들에 의해 코딩되는 아미노산은 서열 6에 나타내었다. 코딩된 단백질은 N-말단 세포질 도메인 (아미노산 1-17), 트랜스막 영역 (아미노산 18-38), 및 세포외 도메인 (아미노산 39-291)을 포함한다. 이 생쥐 트레일은 아미노산 수준에서 서열 2의 인간 트레일과 64% 동일하다. 생쥐의 트레일 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역은 서열 1의 인간 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 75% 동일하다.
본 발명의 하나의 실시 태양은 N-말단 아미노산 서열 MetAlaMetMetGluValGlnGlyGlyProSerLeuGlyGlnThr (서열 2 및 4의 아미노산 1-15)에 의해 특성화되는 인간 트레일 단백질에 관한 것이다. N-말단 아미노산 서열 MetProSerSerGlyAlaLeuLysAspLeuSerPheSerGlnHis (서열 6의 아미노산 1-15)가 특징인 생쥐의 트레일 단백질도 또한 제공된다.
본 발명의 트레일 단백질은 파스 리간드로 공지된 단백질과 상이하다 (수다 등, Cell, 75:1169, 1993; 다까하시 등, International Immunology 6:1567, 1994). 파스 리간드는 파스로 공지된 수용체를 경유하여 특정 유형의 세포의 세포소멸을 유도한다. 실시예 5에서 입증된 바와 같이, 표적 세포의 트레일 유도된 세포소멸은 파스를 통해 매개되지 않는다. 서열 2의 인간 트레일 아미노산 서열은 다까하시 등의 상기문헌에 존재하는 인간 파스 리간드 아미노산 서열과 약 20% 동일하다. 인간 트레일의 세포외 도메인은 인간 파스 리간드의 세포외 도메인과 약 28.4% 동일하다.
본 명세서에 개시된 아미노산 서열은 TNF 계통 리간드의 구성원임이 밝혀졌다(스미스 등, Cell, 73:1349, 1993; 수다 등, Cell, 75:1169, 1993; 스미스 등, Cell 76:959, 1994). 인간 트레일 세포외 도메인 아미노산 서열과 이 계통의 다른 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열간의 동일성 비율은 파스 리간드의 경우 28.4%, 림프독소-β의 경우 22.4%, TNF-α의 경우 22.9%, TNF-β의 경우 23.1%, CD30 리간드의 경우 22.1%, 및 CD40 리간드의 경우 23.4%이다.
수용체의 TNF-R 계통 수용체에 결합하는 트레일의 능력에 대해 시험하였다. 결합 분석은 기어링(Gearing) 등의 슬라이드 오토라디오그라피(slide autography) 방법을 사용하여 수행하였다 (EMBO J. 8:3667, 1989). 분석에 의해 인간 트레일의 인간 CD30, CD40, 4-1BB, OX40, TNF-R (p80 형태), CD27 또는 LTβR(또는 TNF-RP로 공지됨)에 대한 검출 가능한 결합은 없다는 것이 밝혀졌다. 실시예 5의 결과는 인간 트레일은 인간 파스에 결합하지 않는 것으로 나타났다.
본 발명의 트레일 폴리펩티드에는 서열 2 및 6에 존재하는 것과 상이하나, 매우 동질적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 예로는 다른 포유동물 종으로부터 유도된 상동체, 변형체 (천연 발생 변형체 및 재조합 DNA 기술에 의해 발생된 변형체 모두), 및 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 트레일 단편을 예로 들수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 폴리펩티드는 서열 2 및 6의 트레일 단백질의 생물학적 활성을 보이고, 서열 2 또는 서열 6에 존재하는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상 동일한(가장 바람직하게는 90% 이상 동일함) 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 이 실시 태양은 하기에 더욱 상세히 설명된다.
TNF 계통 단백질의 C-말단 영역에 위치하는 보존성 서열은 스미스 등의 문헌[Cell, 73:1349, 1993, page 1353 및 도 6 참조], 수다 등의 문헌 [Cell, 75:1169, 1993, 도 7 참조, p2638-39], 스미스 등의 문헌 [Cell, 76:959, 1994, 도 3 참조] 및 굿윈(Goodwin) 등의 문헌 [Eur. J. Immunol., 23:2631, 1993, 도 7 참조]에 의해 밝혀지고, 이들은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 인간 트레일 단백질의 아미노산 중에서 보존성인(적어도 다수의 TNF 계통 구성원에서) 아미노산은 서열 2의 124-125(AH), 136(L), 154(W), 169(L), 174(L), 180(G), 182(Y), 187(Q), 190(F), 193(Q) 및 275-276(FG) 위치에 있는 것들이다. 트레일의 다른 구조적 특징은 생물학적 활성에 가장 중요하다고 믿어지는 세포외 도메인의 영역과 트랜스막 영역의 C-말단 간의 스페이서(spacer) 영역이다. 세포외 도메인의 N-말단에 위치하는 이 스페이서 영역은 서열 2의 아미노산 39 내지 94로 이루어진다. 스페이서 유사체는 다른 계통의 구성원, 예를 들어 CD40 리간드에서 발견된다. 아미노산 138 내지 153은 폴딩된(3차) 인간 트레일 단백질의 β 시트 간의 루프에 상응한다.
막 결합된 트레일 단백질 (세포질 도메인, 트랜스막 영역, 및 세포외 도메인을 포함), 및 전체 길이의 트레일 단백질의 목적하는 생물학적 특성을 보유하는 트레일 단편은 본 명세서에 제공된다. 하나의 실시 태양에서, 트레일 단편은 세포외 도메인 모두 또는 일부를 포함하는 가용성 트레일 폴리펩티드이나, 세포막 상에서 폴리펩티드를 보유하게 하는 트랜스막 영역이 결핍되어 있다. 가용성 트레일 단백질은 이들이 발현되는 세포로부터 분비될 수 있다. 유리하게는, 이형 신호 펩티드는 가용성 트레일이 발현시에 분비되도록 N-말단에 융합된다.
가용성 트레일은 배양 배지로부터 목적하는 단백질을 발현시키는 무상 세포를 예를 들어, 원심분리에 의해 분리시키고, 목적하는 단백질의 존재를 확인하기 위해 배지(상등액)을 분석함으로써 확인할 수 있다. 배지 중 트레일의 존재는 단백질이 세포로부터 분비되었고, 따라서 트레일 단백질의 가용성 형태임을 나타내었다. 트레일의 천연 발생적 가용성 형태는 본 발명에 포함된다.
트레일의 가용성 형태의 사용은 특정 활용에 유리하다. 가용성 단백질은 세포로부터 분비되기 때문에, 재조합 숙주 세포로부터 단백질을 정제하기에 용이하다. 또한 가용성 단백질은 일반적으로 정맥내 투여에 더욱 적합하다.
가용성 트레일 폴리펩티드의 예로는 전체 세포외 도메인을 함유하는 것이다(예를 들어, 서열 2의 아미노산 39 내지 281, 또는 서열 6의 아미노산 39 내지 291). 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 세포외 도메인의 단편도 또한 제공된다. 이러한 단편은 상기된 바와 같이 리간드의 TNF 계통의 단백질에서 보존되는 트레일의 영역을 포함하는 것이 유리하다.
가용성 트레일 폴리펩티드의 또 다른 예로는 세포질 도메인 및 트랜스막 영역이 결핍된 것뿐만 아니라, 상기된 스페이서 영역 모두 또는 일부가 결핍된 것이다. 따라서, 가용성 인간 트레일 폴리펩티드는 아미노산 x 내지 281(여기서, x는 서열 2의 39 내지 95 위치의 임의의 아미노산임)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 잔사 95가 N-말단 아미노산인 이 실시 태양에서, 전체 스페이서 영역은 결실되어 있다.
가용성 폴리펩티드를 포함하는 트레일 단편은 임의의 통상의 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적하는 트레일 단편을 코딩하는 DNA 서열을 트레일 단편의 생산을 위해 발현 벡터내로 서브클로닝할 수 있다. 트레일 코딩 DNA 서열은 적절한 리더 또는 신호 펩티드를 코딩하는 서열에 융합되는 것이 유리하다. 목적하는 트레일 코딩 DNA 단편은 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 단편은 또한 전체 길이 클로닝된 DNA 서열의 제한 엔도뉴클레아제 소화 분해에 의해 생산되고, 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 단리될 수 있다. 필요하다면, 5' 또는 3' 말단을 목적하는 위치에 재제작하는 올리고뉴클레오티드를 제한 효소 소화 분해에 의해 발생되는 DNA 단편에 라이게이션할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 또한 목적하는 코딩 서열의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 업스트림을 포함하고, 코딩 서열의 N-말단에 개시 코돈 (ATG)를 위치시킬 수 있다.
공지된 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)은 또한 목적하는 단백질 단편을 코딩하는 DNA 서열을 단리하고 증폭하기 위하여 사용할 수 있다. DNA 단편의 목적하는 말단을 한정하는 올리고뉴클레오티드를 5' 및 3' 프라이머로 사용한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위를 포함하여서 증폭된 DNA 단편을 발현 벡터 내로 삽입하는 것을 용이하게 한다. PCR 기술은 사이키(Saiki) 등의 문헌[Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methology, Wu(우) 등 eds., Academic Press, Inc., 샌디에고 소재 (1988), pp 189-196; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis(인니스) 등 eds., Academic Press, Inc.(1990)]에 기재되어 있다.
당업계의 숙련가에게 주지되어 있는 바와 같이, 상기 논의된 각 트레일 단백질의 트랜스막 영역을 소수성 도메인 유형을 식별하기 위한 통상의 기준에 따라 확인한다. 트랜스막 영역의 정확한 경계는 상기에 제시된 것들로부터 약간 변형될 수 있다(각 말단 상에서 5개 이하의 아미노산). 단백질에서 이러한 소수성 영역을 식별하는데 유용한 컴퓨터 프로그램을 사용한다.
본 발명의 트레일 DNA에는 cDNA, 화학적 합성된 DNA, PCR에 의해 단리된 DNA, 게놈 DNA 및 그의 배합물이 포함된다. 게놈 트레일 DNA는 표준 기술을 사용하여 본 명세서에 개시된 트레일 cDNA에 대한 혼성화에 의해 단리될 수 있다. 트레일 DNA로부터 전사된 RNA는 또한 본 발명에 포함된다.
NCBI 데이터뱅크를 조사한 결과 트레일 DNA와 동일한 영역을 지니는 5개의 발현된 서열 태그 (ESTs)를 확인하였다. 이 ESTs (NCBI 기탁 번호 제T90422, T82085, T10524, R31020 및 Z36726)는 모두 인간 cDNA 단편이다. NCBI 기록은 ESTs에 의해 코딩되는 임의의 폴리펩티드를 개시하지 않고, 존재한다고 하더라도 리딩 프레임이 무엇인가를 나타내지 않는다. 그러나, 본 명세서에 완전한 트레일 코딩영역의 개시로 인해 밝혀진 리딩 프레임에 대한 정보가 ESTs를 발현시키는데 사용된다고 하더라도, 코딩된 폴리펩티드 중의 어느 것도 현재 청구된 트레일 폴리펩티드의 세포소멸 유도 특성을 갖지 않는다. 다르게 말하면, 본 명세서에서 밝혀진 리딩 프레임 내에서, 각 5개의 ESTs를 발현 벡터의 개시 메티오닌 코돈으로부터 다운스트림에 삽입하는 경우, 발현된 폴리펩티드는 저캣 세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한 트레일의 세포외 도메인 영역을 함유하지 않게 된다.
본 발명의 특정 실시 태양은 서열 1의 뉴클레오티드 88 내지 933 (인간 트레일 코딩 영역), 서열 1의 뉴클레오티드 202 내지 933 (인간 트레일 세포외 도메인을 코딩), 서열 5의 뉴클레오티드 47 내지 922 (생쥐의 트레일 코딩 영역) 및 서열 5의 뉴클레오티드 261 내지 922 (생쥐의 트레일 세포외 도메인을 코딩)으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA를 제공한다. 서열 2 및 6의 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 DNA도 또한 제공된다. 또한 실시태양은, 실시예 7에 기재된 바와 같이, 특히 인간 및 쥐의 가용성 트레일 폴리펩티드를 각각 코딩하는 서열 1의 뉴클레오티드 370 내지 930, 및 서열 5의 뉴클레오티드 341 내지 919를 포함하는 서열을 포함한다.
유전 코드의 퇴화에 의해, 2개의 DNA 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하나 상이할 수 있다. 따라서, 본 발명은 생물학적으로 활성인 트레일을 코딩하고, 천연 인간 또는 쥐의 트레일 cDNA의 코딩 영역, 또는 그의 단편, 및 천연 트레일 DNA 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 퇴화된 DNA를 포함하는 DNA로부터 선택된 단리된 DNA서열을 제공한다.
또한, 본 명세서에서 재조합 및 재조합되지 않은 정제된 트레일 폴리펩티드가 제공된다. 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 천연 트레일 단백질의 변형체 및 유도체는 또한 본 발명의 영역에 속한다. 하나의 실시 태양에서, 트레일 변형체의 생물학적 활성은 천연 트레일 단백질의 생물학적 활성과 본질적으로 동일하다. 트레일의 하나의 목적하는 생물학적 활성은 저캣 세포의 사멸을 유도하는 능력이다. 표적 세포의 세포소멸을 검출하기 위한 분석법은 공지되어 있다. DNA 래더링(laddering)은 세포소멸을 경유하는 세포 사멸의 특징 중 하나이고, 괴사성 세포 사멸로부터 세포소멸성 세포 사멸을 구분짓는 관찰가능한 현상 중 하나로 인지된다. 표적 세포의 사멸 또는 세포소멸을 검출하기에 적절한 분석 기술의 예들은 실시예 5 및 8 내지 11에 기재된 것들이 포함된다. 트레일의 다른 특징은 저캣 세포에 결합하는 능력이다.
트레일 변형체는 예를 들어, 천연 트레일 뉴클레오티드 서열의 변이에 의해 얻을 수 있다. 본 명세서에 명명된 바와 같이, 트레일 변형체는 천연 트레일과 실질적으로 동질적인 폴리펩티드이나, 이는 하나 또는 다수의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 트레일의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 트레일 코딩 DNA 서열에는 천연 트레일 DNA와 비교하여 뉴클레오티드의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하나, 천연 트레일 단백질과 본질적으로 생물학적으로 동일한 트레일 단백질을 코딩하는 서열이 포함된다.
변형 아미노산 또는 DNA 서열은 천연 트레일 서열과 바람직하게는 80% 이상 동일하고, 가장 바람직하게는 90% 이상 동일하다. 천연 서열과 변이체 서열 간의 동질성의 정도 (동일성 비율)은 예를 들어 이 목적을 위하여 통상적으로 사용되는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 서열을비교함으로써 측정할 수 있다. 하나의 적절한 프로그램은 데베룩스(Devereux) 등의 문헌[Nucl. Acids Res. 12:387, 1984]에 기재된 바와 같이 버전 6.0의 GAP 컴퓨터 프로그램이고, 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹 (UWGCG)로부터 구입가능하다. GAP 프로그램은, 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)에 의해 개정된 바와 같이[Adv. Appl. Math 2:482, 1981], 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch)의 정렬 방법[J. Mol. Biol. 48:443, 1970]를 이용한다. 간단히, GAP 프로그램은 2개의 서열 중 더 짧은 것에서 기호의 총 수로 나뉘어진 동일한 정렬된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수로서 동일성을 정의한다. GAP 프로그램에 대한 바람직한 디폴트 매개변수에는 (1) 슈와르츠(Schwartz) 및 데이호프(Dayhoff)의 문헌[Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biochemical Research Foundation, pp 353-358, 1979]에 기재된 바와 같이, 그립스코브(Gribskov) 및 벌게스(Burgess)[Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986]의 칭량된 비교 매트릭스 및 뉴클레오티드에 대한 단일 비교 매트릭스 (동일성에 대해서는 1, 비동일성에 대해서는 0을 포함), (2) 각 갭에 대해서는 3.0의 페널티 및 각 갭의 각 기호에 대해서는 추가의 0.10 페널티, 및 (3) 말단 갭에 대해서는 페널티가 없음이 포함된다.
천연 아미노산 서열의 변형은 수많은 임의의 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 변이는 특히 제한 부위에 인접하는 변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 천연 서열의 단편에 라이게이션하여서 특정 영위(loci)에 도입될 수 있다. 라이게이션한 후, 생성된 재제작된 서열은 목적하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 지니는 유사체를 코딩한다.
또한, 올리고뉴클레오티드 지배성 부위 특이적 변이 작용은 목적하는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변형된 특정 코돈을 지니는 변형된 유전자를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 변형을 일으키는 기술에는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 왈더(Walder) 등의 문헌 [Gene 42:133, 1986], 바우어(Bauer) 등의 문헌 [Gene 37:73, 1985], 크래익(Craik) 등의 문헌 [BioTechniques, 1985년 1월, 12-19], 스미스(Smith) 등의 문헌 [Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981] 및 미국 특허 제4,518,584호 및 제4,737,462호에 개시된 것들이 포함된다.
변형체는 보존적으로 치환된 서열을 포함하고, 이는 천연 트레일 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔사가 상이한 잔사로 치환되나, 보존적으로 치환된 트레일 폴리펩티드는 천연 트레일 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 목적하는 생물학적 활성을 보유한다는 의미이다. 보존성 치환의 예로는 2차 및(또는) 3차 구조의 트레일을 변형시키지 않는 아미노산의 치환이 포함된다. 다른 예로는 목적하는 생물학적 활성이 표적 세포 상에서 수용체에 결합할 수 있고 표적 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 경우, 수용체 결합 도메인의 외부 아미노산의 치환이다. 소정의 아미노산은 예를 들어 다른 것(예: Ile, Val, Leu 또는 Ala) 대신 하나의 지방족 잔사의 치환, 또는 다른 것 (예: Lys과 Arg, Glu과 Asp, 또는 Gln과 Asn 간에) 대신 하나의 극성 잔사의 치환과 같이 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔사에 의해 치환될 수 있다. 다른 보존성 치환은 예를 들어, 유사한 소수성을 갖는 전체 영역의 치환이 공지되어 있다. 보존성 아미노산 치환을 포함하는 트레일 폴리펩티드를 본 명세서에 기재된 분석법 중 하나에 의해 시험하여서 천연 트레일의 목적하는 생물학적 활성이 보유됨을 확인한다. 보존성 아미노산 치환을 함유하는 트레일 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 본 발명에 포함된다.
TNF 계통 단백질의 C-말단부에 위치하고 생물학적 활성에 중요하다고 믿어지는 보존성 아미노산을 확인하였다. 이 보존성 서열은 스미스 등의 문헌[Cell 73:1349, 1993, p 1353, 도 6 참조], 수다 등의 문헌[Cell 75:1169, 1993, 도 7 참조], 스미스 등의 문헌[Cell 76:959, 1994, 도 3 참조] 및 굿윈의 문헌[Eur. J. Immunol., 23:2631, 1993, 도 7 및 p2638-39 참조]에 논의되어 있다. 보존적으로 치환된 서열을 생성하는 경우에는 보존성 아미노산은 변형되지 않는 것이 유리하다. 변형되는 경우에는 TNF 계통의 다른 구성원에서 동일한 위치에서 발견되는 아미노산에서 발견되는 아미노산은 치환된다.
또한, 트레일은 글리코실기, 지질, 인산기, 아세틸기 등과 같은 다른 화학적 잔기와 공유적 또는 응집적으로 컨쥬게이트를 형성함으로써 트레일 유도체를 생성하도록 개질될 수 있다. 트레일의 공유적 유도체는 화학적 잔기를 트레일 아미노산 측쇄 상의 관능기, 또는 트레일 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단, 또는 그의 세포외 도메인에 연결되어서 제조될 수 있다. 본 발명에서의 트레일의 다른 유도체에는 N-말단 또는 C-말단 융합물로서 재조합 배양액에서 합성된 것과 트레일의 공유적 또는 응집적 컨쥬게이트 또는 그의 단편을 포함한다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 트레일 폴리펩티드의 N-말단에서 단일 또는 리더 폴리펩티드 서열 (예: 사카로마이세스의 α-인자 리더)을 포함할 수 있다. 단일 또는 리더 펩티드는 동시 번역적 또는 후 번역적으로 합성 부위로부터 세포막 또는 세포벽의 내부 또는 외부 부위로 컨쥬게이트의 이동을 지휘한다.
트레일 폴리펩티드 융합물은 추가의 펩티드를 함유하여서 트레일의 정제 및 확인을 용이하게 한다. 이러한 펩티드에는 예를 들어 미국 특허 제5,011,912호 및 호프(Hopp) 등의 문헌[Bio/Technology 6:1204, 1988]에 기재된 바와 같이 폴리-His 또는 항원적 식별 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 플래그(FLAG) (등록상표) 펩티드, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDK)(서열 7)이고, 항원성이 높고, 특이적 단일클론 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여서 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 한다. 또한, 이 서열은 소의 점막 엔테로키나제에 의해 Asp-Lys쌍 뒤에 인접한 잔사에서 특이적으로 절단된다. 이 펩티드를 사용하여 캡핑된 융합 단백질은 또한 이. 콜리에서 세포내 분해에 내성을 지닐 수 있다.
4E11로 명명된 생쥐의 히브리도마는 특정 2가 금속 양이온의 존재 하에 펩티드 DYKDDDDK (서열 7)에 결합하는 단일클론성 항체를 생산하고(미국 특허 제5,011,912호에 기재됨), HB 9295의 기탁 번호로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있다. 플래그 (등록상표) 펩티드에 융합된 재조합 단백질을 생산하기에 유용한 발현계, 및 펩티드에 결합되고 재조합 단백질을 정제하는데 유용한 단일클론성 항체는 이스트만 코닥사(Eastman Kodak Company, 코넥티컷트주 뉴헤븐 소재)로부터 사이언티픽 이매징 시스템(Scientific Imaging System)으로 구입할 수 있다.
또한, 본 발명은 결합된 원래 형태의 글리코실화의 존재 또는 부재 하의 트레일 폴리펩티드를 포함한다. 효모 또는 포유 동물 발현계에서 발현된 트레일은 분자량 및 글리코실화 유형에 있어서 천연 트레일 폴리펩티드와 유사하거나 또는 상당히 상이할 수 있다. 이. 콜리과 같은 세균 발현계에서 트레일 폴리펩티드의 발현은 비글리코실화된 분자를 제공한다.
트레일 세포외 도메인에서 글리코실화 부위는 효모 또는 포유동물 발현계를 사용하여 동질적이고 환원된 탄수화물 유사체의 발현을 가능하게 하면서 글리코실화를 방해하도록 개질될 수 있다. 진핵 폴리펩티드에서 N-글리코실화 부위는 아미노산 3중체 Asn-X-Y (여기서, X는 Pro를 제외한 아미노산이고, Y는 Ser 또는 Thr임)에 의해 특성화된다. 이 3중체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 개질은 Asn 측쇄에서 탄수화물 잔사의 결합을 방지하는 치환, 부가 또는 결실을 초래할 것이다. 단백질에서 N-글리코실화 부위를 불활성화하는 공지된 방법은 미국 특허 제5,071,972호 및 유럽 특허 제276,846호에 기재된 것들이 포함된다. 단백질 N-글리코실화 부위는 서열 2의 인간 단백질에서 위치 109-111 및 서열 6의 쥐의 단백질에서 위치 52-54에서 발견된다.
다른 실시예에서, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 Cys 잔사를 코딩하는 서열은 재복귀(renaturation) 시에 부정확한 분자내 디술피드 브릿지의 형성을 막기 위하여, Cys 잔사를 결실시키거나 또는 다른 아미노산으로 치환되도록 변형될 수 있다. 다른 변형체는 인접한 2염기성 아미노산 잔사를 KEX2 프로테아제 활성이 존재하는 효모계에서 발현이 증진되도록 개질시켜서 제조한다. 유럽 특허 제212,914호에는 단백질에서 KEX2 프로테아제 프로세싱 부위를 불활성화하기 위한 부위 특이적 변이작용이 사용이 개시되어 있다. KEX2 프로테아제 프로세싱 부위는 인접한 염기성 잔사의 발생을 제거하기 위한 Arg-Arg, Arg-Lys 또는 Lys-Arg쌍을 변경하기 위하여 잔사를 결실, 부가 또는 치환하여서 불활성화된다. Lys-Lys쌍은 KEX2 절단에 상당히 덜 민감하고, Arg-Lys 또는 Lys-Arg쌍을 Lys-Lys쌍으로 전환시키는 것은 KEX2 부위를 불활성화하는데 보존성이고 바람직한 방법이다. 잠재적 KEX2 프로테아제 프로세싱 부위는 서열 2의 단백질에서 위치 89-90 및 149-150, 및 서열 6의 단백질에서 위치 85-86, 135-136, 및 162-163에서 발견된다.
천연 발생 트레일 변형체는 또한 본 발명에 속한다. 이러한 변형체의 예로는 별볍의 mRNA 스프라이싱으로부터 기인하거나(트레일은 다중 엑손 유전자에 의해 코딩되므로) 또는 트레일 단백질의 단백질분해적 절단으로부터 기인한 단백질이고, 여기서 목적하는 생물학적 활성은 보유된다. mRNA의 별법의 스프라이싱은 끝이 절단되었으나 생물학적으로 활성인 트레일 단백질, 예를 들어 단백질의 천연 발생 가용성 형태를 생성할 수 있다. 단백질분해로 인한 변형체에는 예를 들어, 상이한 유형의 숙주 세포에서 발현시에 트레일 단백질로부터 하나 이상의 말단 아미노산의 단백질분해적 제거로 인하여 N- 또는 C-말단이 상이한 것이 포함된다. 또한, 단백질분해적 절단은 단백질의 막결합된 형태로부터 트레일의 가용성 형태를 방출할 수 있다. 대립형질 변형체는 또한 본 발명에 포함된다.
올리고머
본 발명은 예를 들어 이량체, 삼량체 또는 그 이상의 올리고머와 같은 올리고머 형태의 트레일 폴리펩티드를 포함한다. 올리고머는 상이한 트레일 폴리펩티드 상에서 시스테인 잔사 간의 디술피드 결합에 의해 형성되거나, 또는 에를 들어 트레일 폴리펩티드 사슬 간의 비공유 작용에 의해 형성될 수 있다. 다른 실시 태양에서, 올리고머는 트레일 폴리펩티드에 융합된 펩티드 잔기 간에 공유적 또는 비공유적 작용을 통해 2개 내지 4개의 트레일 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 링커(스페이서) 또는 올리고머화를 증진시키는 특성을 지닌 펩티드일 수 있다. 로이신 지퍼 및 항체로부터 유도된 특정 폴리펩티드는, 하기에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 이에 결합된 트레일 폴리펩티드의 올리고머화를 증진시킬 수 있는 펩티드 중에 있다. 트레일 폴리펩티드는 가용성인 것이 바람직하다.
다양한 부위의 항체 유도된 폴리펩티드(Fc 도메인 포함)에 융합된 이질성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 아쉬케나지(Ashkenazi) 등의 문헌 [PNAS USA 88:10535, 1991], 비른(Byrn) 등의 문헌 [Nature 344:667, 1990] 및 홀렌바우(Hollenbaugh) 및 아루포(Aruffo)의 문헌["Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", Current Protocols in Immunology, Supplement 4, pp 10.19.1-10.19.11, 1992]에 기재되어 있다. 본 발명의 하나의 실시 태양에서, 트레일 이량체는 트레일을 항체로부터 유도된 Fc 영역 폴리펩티드에 융합시킴으로써 생성된다. 용어 "Fc 폴리펩티드"에는 이량화를 증진시키는 힌지 영역을 포함하는 천연 및 뮤테인 형태, 및 끝이 절단된 Fc 폴리펩티드가 포함된다. Fc 폴리펩티드는 가용성 트레일(예: 세포외 도메인만을 함유함)에 융합되는 것이 바람직하다.
트레일/Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합물을 적절한 발현 벡터 내로 삽입한다. 트레일/Fc 융합 단백질은 항체 분자와 같이 응집되면서, Fc 폴리펩티드 간에 내부 사슬 디술피드 결합을 형성하여서 2가 트레일을 생성한다. 다른 실시 태양에서, 트레일은 중사슬 또는 경사슬의 가변 영역에 대해 치환될 수 있다. 융합 단백질은 항체의 중사슬 및 경사슬을 사용하여 제조되는 경우, 4개의 트레일 세포외 영역을 사용하여 트레일 올리고머를 형성할 수 있다.
하나의 적절한 Fc 폴리펩티드는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 PCT 출원 제WO 93/10151호 기재된, 인간 IgG1에서 유래된 천연 Fc 영역 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 제5,457,035호에 기재된 Fc 뮤테인이다. 뮤테인의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu에서 Ala으로, 아미노산 20이 Leu에서 Glu으로, 아미노산 22가 Gly에서 Ala으로 변경된 것을 제외하고는, 제WO 93/10151호 기재된 천연 Fc 서열의 아미노산 서열과 동일하다. 이 뮤테인 Fc는 면역글로불린 수용체에 대해 감소된 친화성을 보인다.
또한, 올리고머 트레일은 펩티드 링커를 통해 2개 이상의 가용성 트레일 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 예로는 미국 특허 제5,073,627호 (본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)에 기재된 펩티드 링커가 포함된다. 펩티드 링커에 의해 분리되는 다중 트레일 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산할 수 있다.
올리고머 트레일 폴리펩티드를 제조하는 다른 방법에는 로이신 지퍼를 사용하는 것이다. 로이신 지퍼 도메인은 이들이 발견되는 단백질의 올리고머화를 증진시키는 펩티드이다. 로이신 지퍼는 수개의 DNA 결합 단백질에서 최초로 발견되었고(랜드슐즈(Landschulz) 등, Science 240:1759, 1988), 이후 많은 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지된 로이신 지퍼 중에서 천연 발생 펩티드 및 이량화 또는 삼량화된 그의 유도체가 있다. 가용성 올리고머 트레일 단백질을 생산하기에 적합한 로이신 지퍼 도메인의 예로는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 PCT 출원 제WO 94/10308호 기재된 것들이 있다. 용액에서 이량화 또는 삼량화된 펩티드에 융합되는 가용성 트레일 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 발현되고, 생성된 가용성 올리고머 트레일은 배양 상등액으로부터 회수된다.
TNF 계통의 단백질 구성원은 삼량화 형태로 존재한다고 믿어진다 (보이틀러(Beutler) 및 후펠(Huffel), Science 264:667, 1994; 배너(Banner) 등, Cell 73:431, 1993). 따라서, 삼량화된 트레일은 생물학적 활성을 증진시키는 잇점을 제공할 수 있다. 바람직한 로이신 지퍼 잔기는 바람직하게는 삼량체를 형성하는 것이다. 하나의 예로는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 호프(Hoppe) 등의 문헌 [FEBS Letters 344:19] 및 미국 특허 출원 제08/446,922호에 기재된 바와 같이, 폐의 계면활성 단백질 D(SPD)로부터 유래된 로이신 지퍼이다. 천연 발생 삼량체 단백질로부터 유래된 다른 펩티드는 삼량체 트레일을 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 7에 기재된 바와 같이, CV-1/EBNA 세포에서 발현되는 가용성 플래그(등록상표)-트레일 폴리펩티드는 이량체 및 삼량체로 여겨지는 올리고머를 자발적으로 형성하였다. 실시예 8의 분석법에서 이 가용성 플래그(등록상표)-트레일의 세포독성 효과는 항-플래그(등록상표) 항체를 포함함으로써 증진되는데, 이는 항체가 트레일/수용체 복합체의 가교결합을 용이하게 하기 때문이다. 본 발명의 하나의 실시 태양에서, 트레일의 생물학적 활성은 트레일을 가교결합시킬 수 있는 항체와 컨쥬게이션하여 트레일을 사용함으로써 증진된다. 살생될 수 있는 세포는 가용성 트레일 폴리펩티드 및 이와 같은 항체와 접촉될 수 있다.
하나의 실시예로서, 암 또는 바이러스 감염된 세포는 항-플래그(등록상표) 항체 및 가용성 플래그(등록상표) 트레일 폴리펩티드와 접촉한다. Fc 영역이 결핍된 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 이량체 또는 삼량체 형태로 발견되는 2가 형태의 항체는 2개의 가용성 플래그(등록상표) 트레일 폴리펩티드의 플래그(등록상표) 잔기에 결합될 수 있다. 항체는 생체 내에 투여되기 전에 플래그(등록상표)-트레일 폴리펩티드와 함께 혼합되거나 또는 인큐베이션될 수 있다.
발현계
본 발명은 트레일의 발현을 위한 재조합 발현 벡터, 및 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 임의의 적절한 발현계를 사용할 수 있다. 벡터에는 적절한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 트레일 폴리펩티드 (예: 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 것)을 코딩하는 DNA가 포함된다. 조절 서열의 예에는 전사 프로모터, 오퍼레이터, 또는 증진제, mRNA 리보좀 결합 부위 및, 전사 및 번역 개시 및 종말을 조절하는 적절한 서열이 포함된다. 조절 서열이 트레일 DNA 서열에 기능적으로 연결되는 경우, 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열이 트레일 DNA 서열의 전사를 조절하는 경우, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 트레일 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 목적하는 숙주 세포에서 복제할 수 있는 능력을 부여하는 복제 오리진, 형질전환체가 확인되는 선별 유전자들은 일반적으로 발현 벡터 내로 혼입된다.
또한, 적절한 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 신호 펩티드 (분비성 리더)를 위한 DNA 서열을 프레임 내에서 트레일 서열에 융합시켜서 트레일은 신호 펩티드를 함유하는 융합 단백질로서 초기에 번역될 수 있다. 목적하는 숙주 세포 내에서 관능적인 신호 펩티드는 트레일 폴리펩티드의 세포외 분비를 증진시킨다. 신호 펩티드는 세포로부터 트레일의 분비 시에 트레일 폴리펩티드로부터 절단된다.
트레일 폴리펩티드의 발현을 위한 적절한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵 세포가 포함된다. 세균, 진균, 효모 및 포유동물 세포의 숙주에 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들어 포우웰(Pouwel) 등의 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 뉴욕 엘스비어 소재, (1985)]에 기재되어 있다. 세포가 없는 번역계는 또한 본 명세서에 개시된 DNA 제작물로부터 유래된 RNA를 사용하여 트레일 폴리펩티드를 생산하는데 사용할 수 있다.
원핵세포에는 그람 음성 또는 그람 양상 미생물, 예를 들어, 이. 콜리 또는 바실리(Bacilli)가 포함된다. 형질전환을 위한 적절한 원핵 숙주 세포에는 예를 들어, 이. 콜리, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salminella typhimurium), 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스태필로코커스(Staphylococcus) 종에 속하는 다른 종들이 포함된다. 이. 콜리와 같은 진핵 숙주 세포에서, 트레일 폴리펩티드는 진핵 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하기 위하여 N-말단 메티오닌 잔사를 포함할 수 있다. N-말단 Met은 발현된 재조합 트레일 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다.
원핵 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 표현형 선택적 마커 유전자를 포함할 수 있다. 표현형 선택적 마커 유전자는 예를 들어, 항체 내성을 부여하거나 또는 자가 영양적 필요물을 공급하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 원핵 숙주 세포를 위한 유용한 발현 백터의 예에는 시판되는 플라스미드, 예를 들어 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)로부터 유래된 것이다. pBR322는 암피실린 및 테트라시클린 내성에 대한 유전자를 함유하고, 다라서, 형질전환된 세포를 식별하기 위한 간단한 수단을 제공한다. 적절한 프로모터 및 트레일 DNA 서열을 pBR322 벡터 내로 삽입한다. 다른 시판되는 벡터에는 예를 들어, pKK223-3 (파르마시아 파인 케밀칼스, 스웨덴 웁살라 소재) 및 pGEM1(프로메가 바이오텍, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)가 포함된다.
재조합 원핵 숙주 세포 발현 벡터에 통상적으로 사용되는 프로모터 서열은 β-락타마제 (페니실리나제), 락토즈 프로모터계 (창(Chang) 등, Nature 275:615, 1978; 고에델(Goeddel), Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980 및 융럽 특허 공개 제36776호) 및 tac 프로모터 (마니아티스(Maniatis), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, p. 412, 1982)를 포함한다. 특히 유용한 원핵 숙주 세포 발현계는 파아지 λPL 프로모터 및 cI857 열감수성 리프레서 서열을 사용한다. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 구입할 수 있는 λPL 프로모터의 유도체를 혼입하는 플라스미드 벡터는 pHUB2 (이. 콜리 균주 JMB9에 존재, ATCC 37092) 및 pPLc28 (이. 콜리 RR1, ATCC53082에 존재)를 포함한다.
또한 트레일을 효모 숙주 세포에서, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 (예: 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae))에서 발현될 수 있다. 피키아 또는 클루이베로마이세스와 같은 다른 효모 속들도 사용할 수 있다. 효모 벡터는 종종 2μ 효모 플라스미드, 자발적 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종말을 위한 서열, 및 선택적 마터 유전자로부터 복제 서열의 오리진을 함유할 것이다. 효모 벡터를 위한 적절한 프로모터 서열은 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 (히체만 (Hitzeman), J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 엔돌아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포트럭토키나제, 글로코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 티오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제 등과 같은 다른 글루코스 분해 효소 (헤스 (Hess) 등, J. Adv. Enzymes Reg. 7:149, 1968; 홀랜드(Holland) 등, Biochem. 17, 4900)를 위한 프로모터를 포함한다. 효모 발현에서 사용하기 위한 다른 적절한 벡터 및 프로모터는 또한 힛제만의 유럽 특허 공개 제73,657호에 기재되어 있다. 또 다른 것들은 러셀(Russel) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 258:2674, 1982]에 기재된 글루코스 억압적 ADH2 프로모터이다. 효모 및 이. 콜리에서 모두 복제될 수 있는 적절한 벡터는 이. 콜리에서 선별 및 복제를 위한 pBR322로부터 DNA 서열(Ampr 유전자 및 복제 오리진)을 상기의 효모 벡터 내로 삽입하여서 제작할 수 있다.
효모 α-인자 리더 서열은 트레일 폴리펩티드의 분비를 조절하는데 사용할 수 있다. α-인자 리더 서열은 종종 프로모터 서열과 구조적 유전자 서열 간에 삽입된다(쿠르잔(Kurjan) 등, Cell 30:933, 1982 및 비터(Bitter) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984). 효모 숙주로부터 재조합 폴리펩티드의 분비를 용이하게 하는데 적절한 다른 리더 서열은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 리더 서열은 그의 3' 말단 근처가 하나 이상의 제한 부위를 함유하도록 개질될 수 있다. 이는 리더 서열이 구조적 유전자에 융합되는 것을 용이하게 할 것이다.
효모 형질전환 방법은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 방법 중 하나는 힌넨(Hinnen) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978]에 기재되어 있다. 힌넨 등의 방법은 Trp+ 형질전환체를 선별하고, 여기서 선택적 배지는 효모 질소 염기 0.67%, 카사미노산 0.5%, 글루코스 2%, 아데닌 10 ㎍/㎖ 및 우라실 20 ㎍/㎖을 포함한다.
ADH2 프로모터 서열을 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 효모 숙주 세포는 "리치" 배지에서 발현을 유도하기 위해 증식할 수 있다. 리치 배치의 예는 아데닌 80 ㎍/㎖ 및 우라실 80 ㎍/㎖로 보충된 효모 추출물 1%, 펩톤 2%및 글루코스 1%를 포함한 것이다. ADH2 프로모터의 억제는 글루코스가 배지로부터 고갈될 때 발생한다.
포유동물 또는 곤충 숙주 세포 배양 시스템은 재조합 트레일 폴리펩티드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생산하기 위한 바큘로바이러스 시스템은 루코우(Luckow) 및 섬머스(Summers)에 의해 재검토된다(Bio/Technology 6:47 (1988)). 포유동물 오리진의 성립된 세포주 또한 사용할 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장 세포의 COS-7(ATCC CRL 1651)(글루즈만(Gluzman), Cell 23:175, 1981), L 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포 및 BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 및 맥마한(McMahan) 등의 문헌[EMBO J. 10:2821, 1991]에 기재된 바와 같이, 아프리카산 초록 원숭이 신장 세포주 CV1 (ATCC CCL 70)에서 유래된 CV1/EBNA 세포주가 있다.
포유동물 숙주 세포 발현 벡터를 위한 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 게놈으로부터 절단될 수 있다. 통상적으로 사용된 프로모터 서열 및 인헨서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40 (SV40) 및 인간 시토메갈로바이러스로부터 유래된다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들어 SV40 오리진, 초기 및 후기 프로모터, 인헨서, 스프라이스, 및 폴리아데닐화 부위는 포유 동물 숙주 세포에서 구조 유전자 서열의 발현을 위한 유전 인자를 제공하는데 사용될 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터는 바이러스 게놈으로부터 복제의 바이러스 오리진을 함유할 수 있는 단편으로서 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 특히 유용하다. 복제 부위의 SV40 바이러스 오리진에 위치하는 HindIII 부위로부터 BglI 부위로 연장된 약 250bp 서열이 포함되는 경우에 한하여, 더 작은 또는 더 큰 SV40 단편을 또한 사용할 수 있다.
포유 동물 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 예를 들어, 오까야마(Okayama) 및 베르그(Berg)의 문헌[Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983]에 개시된 바와 같이 제작될 수 있다. 안정한 높은 수준의 발현을 위한 유용한 시스템을 코스만(Cosman) 등의 문헌[Mol. Immunol. 23:935, 1986]에 기재된 바와 같이 실질적으로 제작할 수 있다. 코스만 등의 문헌[Nature 312:768, 1984]에 기재된 고발현 벡터, PMLSV N1/N4은 ATCC 39890으로 기탁되었다. 또한 포유동물 발현 벡터는 유럽 특허 공개 제0367566호 및 제WO91/18982호에 기재되어 있다. 하나의 별법으로, 벡터는 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다. 또한 적절한 발현계는 하기 실시예에 기재된다.
하나의 바람직한 발현계는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 PG5.7로 명명된 발현 벡터를 사용한다. 이 발현 벡터는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 1996년 1월 11일에 출원된 미국 특허 출원 제08/586,509호에 기재되어 있다. PG5.7 성분은 CMV 유래된 프로모터가 수반되는 CHO 세포 게놈 DNA의 단편을 포함하고, 이는 아데노바이러스 3부 리더 코딩 서열이 수반되어서 디히드로폴레이트 환원효소 코딩 서열 (DHFR)이 수반된다. 이 성분들을 플라스미드 벡터 pGEM1 (프로메가사 위스콘신주 매디슨 소재) 내로 삽입하였다. 트레일 폴리펩티드 (또는 트레일을 포함하는 융합 단백질) 코딩 DNA를 3부 리더와 DHFR을 코딩하는 서열 간에 삽입할 수 있다. 당 분야에서 인지된 바와 같이, 메토트렉세이트를 배양 배지에 가하여서 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
벡터 PG5.7에서 CHO 세포 게놈 DNA의 단편은 트레일의 발현을 증진시킨다. CHO 세포로부터 단리된 게놈 DNA의 단편을 함유하는 파아지 라이세이트를 아메리칸 컬쳐 타입 콜렉션에 1996년 1월 4일에 기탁하고, 기탁 번호 ATCC 97411로 기탁하였다. 벡터 PG5.7은 기탁 번호 ATCC 97411의 균주에서 CHO 게놈 DNA 삽입물의 뉴클레오티드 8671 내지 14507을 함유한다.
트레일의 발현을 위해, 천연 신호 서열이 결핍된 유형 II 단백질, 이형 신호 서열 또는 관능적 리더를 포유 동물의 숙주 세포에 가할 수 있다. 예로는 미국 특허 제4,965,195호이 기재된 인터로이킨-7(IL-7)의 신호 서열, 코스만 등의 문헌[Nature 312:768 (1984)]에 기재된 인터로이킨-2 수용체의 신호 서열, 유럽특허 제367,566호에 기재된 인터로이킨-4-수용체 신호 펩티드, 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 유형 I 인터로이킨-1- 수용체 신호 펩티드 및 유럽 특허 제460,846호에 기재된 유형 II 인터로이킨-1 수용체 신호 펩티드가 포함된다.
바람직한 발현계는 시토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된 리더 서열을 사용한다. 실시예 7은 이러한 리더의 용도를 설명한다. 실시예 7에서, 포유 동물의 숙주 세포를 펩티드 MetAlaArgArgLeuTrpIleLeuSerLeuLeuAlaValThrLeuThrVal AlaLeuAlaAlaProSerGlnLysSerGlnLysSerLysArgArgThrSerSer (서열 9)를 코딩하는 발현 벡터를 사용하여 플래그 (등록상표) (서열 7)로 명명된 옥타펩티드의 N-말단에 융합시키고, 이어서 가용성 트레일 폴리펩티드의 N-말단에 융합시켜서 형질전환시켰다. 서열 9의 잔사 1 내지 29는 CMV 유래의 리더 서열을 포함하고, 여기서 잔사 30 내지 32는 실시예 7에 기재된 발현 벡터를 제작하는데 사용된 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 하나의 실시 태양에서, 폴리 His 펩티드(예: 6개의 히스티딘 잔사를 함유하는 펩티드)를 코딩하는 DNA를 CMV 리더와 플래그 (등록상표) 펩티드를 코딩하는 서열 간에 위치시킨다.
이러한 CMV 유래의 리더 펩티드를 사용하는 발현 시스템은 트레일을 제외한 단백질을 발현시키는데 유용한다. 서열 9의 아미노산 1 내지 29를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터은 본 명세서에 제공된다. 다른 실시 태양에서, 서열 9의 아미노산 1 내지 28을 코딩하는 서열을 포함한다. 목적하는 이형 단백질을 코딩하는 DNA를, 동일한 리딩 프레임 내에서, 리더를 코딩하는 DNA의 다운스트림에 위치시킨다. 또 다른 잔사 (예: 링커 또는 프라이머에 의해 코딩되는 것)은 실시예 7에 기재된 벡터에 의해 설명되는 바와 같이, 리더 및 목적하는 이형 단백질을 코딩하는 서열 간에 위치된 DNA에 의해 코딩될 수 있다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 발현 벡터는 프로모터 및 리더, 및 이형 단백질을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결된 다른 목적하는 조절 서열을 포함한다.
서열 9에 존재하는 리더 펩티드는 위치 29에서 아르기닌 잔사 뒤에서 절단되어서 이에 융합된 단백질의 성숙한 분비 형태를 생성할 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 절단은 서열 9의 아미노산 20과 21, 또는 아미노산 29과 29 간에 일어날 수 있다.
당업계의 숙련가달은 신호 펩티드가 절단되는 위치가 사용된 숙주 세포의 유형(쥐 또는 인간 트레일이 벡터에 의해 발현되든 간에)과 같은 인자에 따라 변화될 수 있다는 것을 인지하고 있을 것이다. 컴퓨터 프로그램에 의한 분석은 1차 절단 부위가 서열 9의 잔사 20과 21 사이일 수 있다는 것을 나타낸다. 잔사 22와 23 및 잔사 27과 28 간의 절단은 물론 예견가능한 것이다. 가용성 쥐의 트레일 폴리펩티드의 발현 및 분비은 다중 위치에서 CMV 유래의 신호 펩티드의 절단을 초래하였다. 분비된 단백질의 3가지 가장 현저한 종(감소하는 순서로)은 서열 9의 아미노산 20과 21 간의 절단, 아미노산 22와 23 간의 절단 및 아미노산 27과 28 간의 절단으로부터 유래된다.
이형 재조합 단백질의 생산 방법은 이러한 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 포유동물의 숙주 세포를 이형 단백질의 발현 및 분비를 증진시키는 조건 하에서 배양하고, 배양 배지로부터 단백질을 회수하는 것을 포함한다. CMV 리더를 사용하는 발현계는 콜로니 증진 인자, 인터페론, 인터로이킨, 다른 시토킨 및 시토킨 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 목적 단백질을 생산하는데 사용할 수 있다.
정제된 트레일 단백질
본 발명은 상기된 바와 같이 재조합 발현계에 의해 생산되거나 또는 천연 발생 세포로부터 정제될 수 있는 정제된 트레일 단백질을 제공한다. 목적하는 정제도는 단백질의 사용 용도에 따라 달라질 수 있다. 비교적 높은 순도는 단백질을 생체 내에 투여하는 경우에 요구된다. 유리하게는, 트레일 폴리펩티드는 다른 단백질에 상응하는 단백질 밴드가 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 검출될 수 없도록 정제한다. 당업계의 숙련가들은 상이한 글리코실화, 후번역 과정에서의 변형 등으로 인하여, 트레일 단백질에 상응하는 다중 밴드가 SDS-PAGE에 의해 검출될 수 있다는 것을 인지하고 있을 것이다. 트레일 단백질의 제조는 상이한 (비-트레일) 단백질에 상응하는 밴드가 가시화되지 않는 한 정제된 것으로 간주된다. 가장 바람직하게는 트레일은, SDS-PAGE의 분석 시에 단일 단백질 밴드에 의해 나타난 바와 같이, 실질적으로 상동체로 정제되는 것이다. 단백질 밴드는 은 염색, 쿠마시 블루 염색 또는 (단백질이 방사표지되는 경우) 오토라디오그라피에 의해 가시화될 수 있다.
트레일 단백질을 생산하는 한가지 방법은 트레일을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 트레일이 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 이어서, 트레일 단백질을 배양물 (배양 배지 또는 세포 추출물)로부터 회수한다. 당업계의 숙련가에게 주지된 바와 같이, 재조합 트레일을 정제하는 방법은 트레일이 배양 배지로 분비되거나 또는 분비되지 않거나, 사용된 숙주 세포의 유형과 같은 인자에 따라 변화될 것이다.
예를 들어, 재조합 단백질을 분비하는 발현계를 사용하는 경우, 먼저 배양 배지를 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 울트라필트레이션 장치를 사용하여 농축할 수 있다. 농축 단계 후, 농축물을 여과 매체와 같은 정제 매트릭스에 가할 수 있다. 또한, 디에틸아미노에틸이 결합된 매트릭스 또는 기질과 같은 음이온 교환수지를 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란. 셀룰로오스 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 유형일 수 있다. 적절한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 술포프로필기가 바람직하다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매체 (예: 메틸 또는 다른 지방족기가 달린 실리카)를 사용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 추가로 트레일을 정제하는데 사용할 수 있다. 일부 또는 모든 다음 정제 단계는, 다양하게 배합하여서, 정제된 트레일 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다.
세균 배양에서 생산된 재조합 단백질을 숙주 세포의 초기 파괴, 원심분리, 불용성 폴리펩티드인 경우 세포 펠릿으로부터의 추출, 또는 가용성 폴리펩티드인 경우 상등액, 이어서 1회 이상의 농축, 솔팅-아웃(saltin out), 이온 교환, 친화 정체 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 마지막으로 RP-HPLC를 최후 정제 단계에 사용할 수 있다. 미생물 세포를 동결-해빙 반복, 초음파, 기계적 파괴를 포함하는 임의의 편리한 방법 또는 세포 용해제에 의해 파괴될 수 있다.
형질전환된 효모 숙주 세포는 분비된 폴리펩티드로서 트레일을 발현시키는데 사용하기에 바람직하다. 이는 정제를 단순화한다. 효모 숙주 세포 발효로부터 분비된 재조합 폴리펩티드는 우르달(Urdal) 등의 문헌[J. Chromatog. 296:171, 1984]에 개시된 방법과 유사한 방법에 의해 정제할 수 있다. 우르달 등은 예비적 HPLC 컬럼 상에서 재조합 인간 IL-2의 정제를 위한 2개의 연속적 역상 HPLC 단계를 기재하고 있다.
또한, 트레일 폴리펩티드는 면역친화적 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 트레일에 결합하는 항체를 함유하는 친화 칼럼을 통상의 방법에 의해 제조하고, 트레일을 정제하는데 사용할 수 있다. 실시예 4는 트레일에 대한 단일클론성 항체를 생성하기 위한 방법을 기재하고 있다.
트레일의 특성 및 용도
프로그램된 세포 사멸 (세포소멸)은 배형성, 변태, 내분비 의존성 조직 위축, 정상 조직 교체 및 면역 흉선 세포의 사멸하는 동안 일어난다. 프로그램된 세포 사멸의 조절은 면역계의 정상 기능에 대해 극히 중요하다. 자기 항원을 인지하는 T 세포는 흉선에서 T-세포가 변이되는 동안 세포소멸 과정을 통해 파괴되는 반면, 다른 T 세포는 양성적으로 선택된다. 특정 자기 에피토프(예: 비효율적으로 처리되고 제공되는 소정의 자기 단백질 항원성 결정물질)를 인지하는 일부 T-세포가 이 제거 과정에서 탈피하여서 자가면역 질병에서 중요한 역할을 담당한다는 가능성이 제시되어 왔다 (게몬(Gammon) 등, Immunology Today 12:193, 1991).
불충분한 세포소멸은 특정 조건에 연루되어 있는 반면, 세포 소멸성 세포 사멸의 상승된 수준은 다른 질병과 연관되어 있다. 이러한 질병에서 세포소멸을 조절하는 작용제를 밝혀내고 사용하는 것은 인지되어 있다(크로머(Kromer), Advances in immunology, 58:211, 1995; 그룩스(Groux), J. Exp. Med. 175:331, 1992; 사크(Sachs) 및 로템 (Lotem), Blood 82:15, 1993).
세포소멸 중인 T 세포의 비정상적 내성은 림포사이토시스, 림프아데노퍼스, 스플레노메갈리, 자기 반응성 T 세포의 축적, 자가면역 질병, 백혈병의 진척 및 림프증의 진척 (크로마의 상기 문헌, 특히 페이지 214-215 참조). 역으로, T 세포의 과잉의 세포소멸은 림포페니아, 전신적 면역결핍증 및 특이적 면역결핍증에서 중요한 역학을 하는 것으로 제시되어 왔고, 그 예로 감염적 모노누클레오시스 및 시토메갈로바이러스 감염 및 종양 매개된 면역억제와 관련된 바이러스 감염된 면역결핍 상태를 들 수 있다(크로머의 상기 문헌, 특히 페이지 214). HIV 감염된 개체에서 CD4+T 세포 고갈은 세포소멸에 의한 부적절한 활성 유도된 세포 사멸(AICD)에 기인할 수 있다(그룩스 등, J. Exp. Med. 175:331, 1992).
실시예 5 및 8에서 입증된 바와 같이, 트레일은 저캣 클론 E6-1로 명명된 급성 T 세포 백혈병 세포주의 세포소멸을 유도한다. 따라서, 트레일은 프로그램된 세포 사멸의 조절을 포함하는 세포소멸의 연구에 유용한 연구 시약이다. 저캣 세포가 T 세포로부터 발생된 백혈구 세포주이기 때문에, 본 발명의 트레일은 T 세포로부터 발생된 다른 악성 세포 유형과 같은 다른 형질전환된 T 세포의 세포소멸에서의 트레일의 역할의 연구에서의 용도가 있다.
트레일은 저캣 세포에 결합하고, 그의 세포소멸을 유도한다. 트레일은 신선하게 단리된 쥐의 흉선 세포, 또는 건강한 인간 공여체로부터 추출된 말초 혈액 T 세포 (PBTS)의 사멸을 일으키지 않았다. 트레일의 이러한 특성으로부터 수많은 용도가 발생된다.
트레일 폴리펩티드를 백혈병 세포, 또는 트레일이 결합된 임의의 다른 세포 유형을 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 백혈병 세포를 환자의 혈액으로부터 단리할 수 있다. 하나의 실시 태양에서, 세포는 그에 결합된 트레일을 갖는 크로마토그라피 매트릭스를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 크로마토그래피 매트릭스에 결합된 트레일은 전체 길이의 단백질일 수 있고, 세포외 도메인, 트레일 함유 융합 단백질, 또는 본 명세서에 기재된 다른 적절한 트레일 폴리펩티드를 포함하는 트레일 단편일 수 있다. 하나의 실시 태양에서, 가용성 트레일/Fc 융합 단백질은 Fc 잔기와 단백질 A 또는 단백질 G 간의 작용을 통해 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼에 결합된다. 또한, 트레일은 유동 세포측정법에 의해 백혈병 세포를 단리하는데 사용할 수 있다.
이렇게 정제된 백혈병 세포는 트레일의 결합 후에 사멸할 것으로 기대되나, 사멸 세포는 여전히 세포 표면 항원을 함유하고, 항백혈병 항체를 유도하는 이뮤노겐으로 사용될 수 있다. 백혈병 세포 또는 이로부터 단리된 바람직한 세포 표면 항원은 백신 발전에 있어서 추가의 용도로 발견된다.
트레일은 백혈병 세포(저캣 세포주)에 결합하여서 살생하기 때문에, 트레일은 또한 백혈병 치료에 유용할 수 있다. 치료 방법은 트레일의 유효량을 백혈병 세포와 접촉하는 것을 포함한다. 하나의 실시 태양에서, 백혈병 환자 혈액을 생체 외에서 트레일 폴리펩티드가 접촉시킨다. 트레일은 백혈병 세포에 결합하고, 이어서 혈액을 환자에게 재수혈하기 전에 환자의 혈액으로부터 이를 제거한다.
별법으로 또는 추가적으로 백혈병 환자로부터 추출된 골수는 골수에서 백혈병 세포를 사멸시키는데 유효한 양의 트레일을 접촉시킬 수 있다. 골수는 흉골 또는 장골 융선으로부터 흡입할 수 있고, 트레일과 접촉하여서 백혈병 세포를 퍼쥐시킬 수 있다. 이렇게 처리된 골수을 환자에게 복귀시킨다.
또한, 트레일은 림프종 및 흑색종 세포에 결합하여서 세포소멸을 유도한다(실시예 5, 9 및 10). 따라서, 백혈병 세포에 대해 기재된 것들과 유사체인 트레일의 사용은 림프종 및 흑색종 세포에 사용할 수 있다. 트레일 폴리펩티드를 백혈병, 림프종 및 흑색종을 포함하나 이에 한정되지 않는 암의 치료에 사용할 수 있다. 하나의 실시 태양에서, 림츠종은 벌키트(Burkitt)의 림프종이다. 실시예 9의 표 I은 트레일은 수가지 벌키트의 림프종 세포주에 대해 세포독성적 효과를 지녔음을 보여준다. 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스는 벌키트 림프종의 병인학 작용제이다. 또한, 트레일 폴리펩티드는 바이러스 감염을 치료하는데 사용된다. 트레일과의 접촉은 실시예 11에 기재된 바와 같이, 시토메갈로바이러스에 감염된 세포의 사멸을 초래하였으나, 감염되지 않은 동일한 세포에서는 일어나지 않았다. 트레일이 다른 바이러스에 감염된 세포를 살생하는 능력은 실시예 11에 기재된 분석법을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 바이러스에는 뇌심근염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 소포성 스토마티티스 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 아데노바이러스-1, 소의 바이러스성 설사 바이러스, HIV 및 엡스테인-바르 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
유효량의 트레일을 바이러스에 감염된 인간을 포함하는 포유동물에게 투여한다. 하나의 실시 태양에서, 트레일은 인터페론과 함께 바이러스 감염을 치료하는데 사용된다. 실시예 11에 기재된 실험에서, γ-인터페론으로 CMV 감염된 세포의 예비치료는 트레일에 의해 매개된 감염된 세포의 살생 수준을 증진시켰다.
다른 실시 태양에서, 트레일은 이식된 세포 제제물, 조직 또는 기관에서 바이러스에 감염된 세포를 살생하는데 사용된다. 설명을 위하여, 골수가 수용체에 이식되기 전에 골수를 트레일과 접촉시켜서 본 명세서에 존재할 수 있는 바이러스에 감염된 세포를 살생할 수 있다.
본 발명의 트레일은 결핍된 또는 불충분한 양의 트레일에 의해 (직접 또는 간접적으로) 매개된 임의의 질병을 치료를 진척시키는데 사용할 수 있다. 정제된 트레일의 치료적 유효량을 이러한 질병에 감염된 환자에게 투여한다. 또한, 트레일 DNA 서열을 이러한 질병을 치료하기 위한 유전자 치료 접근법을 진척시키는데 사용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 천연 트레일 뉴클레오티드 서열은 결핍성 트레일 유전자의 결실 및 정상적 트레일 코딩 유전자를 사용한 치환을 가능하게 한다. 결핍성 유전자는 시험관 내의 진단적 분석법에서 본 명세서에 개시된 천연 트레일 뉴클레오티드 서열을 이 유전자가 결핍된 것으로 의심되는 사람에서 유래된 트레일 유전자의 뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 검출될 수 있다.
본 발명은 정제된 트레일 및 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 적절한 담체, 희석제 및 부형제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에 독성적이지 않다. 이러한 조성물은 완충액, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자 (10개 미만의 잔사), 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란을 포함하는 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이팅제, 글루타치온 및 다른 안정화제, 및 제약 조성물에 통상적으로 사용되는 부형제를 포함할 수 있다. 중성 완충 염수 또는 같은 종류의 혈청 알부민과 혼합된 염수는 적절한 희석제 중 하나이다. 조성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액 (예: 수크로스)를 사용하는 동결체로서 제조할 수 있다.
치료를 위하여, 본 발명의 정제된 단백질을, 징후에 대해 적절한 방법으로 치료하기 위하여, 환자, 바람직하게는 인간에게 투여한다. 따라서, 예를 들어 제약 조성물은 정맥내 주사, 연속 주입, 서방형 이식 또는 다른 적절한 기술에 의해 국부적으로 투여할 수 있다. 적절한 투여량 및 투여 빈도는 치료될 징후의 특성 및 심도, 목적하는 반응도, 환자의 상태 등에 따라 변할 것이다.
제약 조성물에서 사용된 트레일 단백질은 바람직하게는 트레일 단백질이 실질적으로 천연 또는 내인성 기원의 다른 단백질이 없고 바람직하게는 단백질의 질량이 약 1% 미만으로 함유되도록 정제되는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 조성물은 안정화제, 담체, 부형제 또는 공동 치료제로서 가해진 다른 단백질을 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 트레일 코딩 DNA는, 논의된 바와 같이, 트레일 폴리펩티드의 생산에 사용된다. 트레일 뉴클레오티드 서열의 단편 또한 유용하다. 하나의 실시 태양에서, 이러한 단편은 본 명세서에 개시된 인간 또는 쥐의 트레일 DNA의 약 17개 이상의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 30개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 단편의 DNA 및 RNA 보완물은 서열 1, 3 및 5의 트레일 DNA의 단일 가닥 및 이중 가닥 형태와 함께 본 명세서에 제공된다.
이러한 트레일 헥산 단편의 용도 중에서 폴리러마제 연쇄 반응법 (PCR)에서 프로브 또는 프라이머로서의 용도가 있다. 예를 들어, 트레일의 세포외 도메인에 상응하는 프로브를 사용할 수 있다. 프로브는 시험관 내 분석에서 트레일 헥산의 존재를 검출하는 용도 및 노던 및 서던 블롯과 같은 방법에서의 용도가 있다. 트레일을 발현시키는 세포 유형은 또한 확인될 수 있다. 이러한 방법은 공지되어 있고, 당업계의 숙련가들은 사용하는 목적에 따라 적절한 길이의 프로브를 선택할 수 있다. PCR에서, 목적하는 트레일 DNA 서열의 말단에 상응하는 5' 및 3' 프라이머는 통상의 기술을 사용하여 서열을 단리 및 증폭시키는데 사용될 수 있다.
트레일 헥산의 다른 유용한 단편은 표적 트레일 mRNA (센스) 또는 트레일 DNA(안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일 가닥 헥산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 소정의 단백질에 대한 cDNA 서열을 기준으로, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 생성하는 능력은 예를 들어 스테인(Stein) 및 코헨(Cohen)의 문헌[Cancer Res. 48:2659, 1998] 및 반 데르 크롤(van der Krol) 등의 문헌[Bio Techniques 6:958, 1988]에 기재되어 있다.
표적 헥산 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합은 이중체의 증진된 분해, 전사 또는 번역의 미성숙 종말 또는 다른 수단을 포함하는 수가지 방법 중의 하나에 의해 번역(RNA) 또는 전사 (DNA)를 봉쇄하는 이중체의 형성을 초래한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 트레일 단백질의 발현을 봉쇄하는데 사용할 수 있다.
또한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 개질된 당-포스포디에스테르 골격 (또는 다른 당결합, 제WO91/06629에 기재된 것)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 당결합은 내인성 뉴클레아제에 대해 내성을 지닌다. 내성적 당 결합을 지닌 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 안정하나(즉, 효소 분해를 막을 수 있음), 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합될 수 있다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예에는 유기 잔기에 공유적으로 결합된 올리고뉴클레오티드 (제WO90/10448에 기재된 것) 및 폴리-(L-리신)과 같은 표적 헥산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증진시키는 다른 잔기에 대해 공유적으로 결합된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 엘리프티신(ellipticine)과 같은 인터킬레이팅제, 알킬화제 또는 금속 복합체는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 결합되어서 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 개질시킬 수 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 유전자 이동 방법, 예를 들어 CaPO4-매개된 DNA 트랜스펙션, 일렉트로포레이션 또는 엡스테인-바르 바이러스와 같은 다른 유전자 이동 벡터에 의해 표적 헥산 서열을 포함하는 세포로 도입될 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적절한 레트로바이러스 벡터로 삽입한 후, 레트로바이러스 벡터와 세포를 접촉시킴으로써 표적 헥산 서열을 함유하는 세포로 생체 내 또는 생체 외에서 혼입하는 것이 바람직하다. 적절한 레트로바이러스 벡터에는 쥐의 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV 유래의 레트로바이러스) 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C(PCT 출원 제WO90/1364호 참조)로 명명된 이중 복제 벡터를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 다른 프로모터 서열은 올리고뉴클레오티드를 발현시키는데 사용할 수 있다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 제WO91/04753호에 기재된 바와같이, 리간드 결합 분자와 함께 컨쥬게이트를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포로 혼입될 수 있다. 적절한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 시토킨 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 리간드 결합 분자의 컨쥬게이션은 실질적으로 리간드 결합 분자의 그의 상응하는 분자 또는 수용체, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 블록 엔트리, 또는 그의 세포 내로의 컨쥬게이션된 형태에 결합하는 능력을 방해하지 않는다.
또한, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 제WO90/10448호에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성하여서 표적 헥산 서열을 함유하는 세포 내로 혼입될 수 있다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 내인성 리파제에 의해 세포 내에서 해리된다.
트레일과 면역반응성인 항체
본 발명의 트레일 단백질 또는 그의 이뮤노겐 단편을 항체를 생산하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 트레일에 특이적으로 결합하는, 즉 항체의 항원 결합 부위를 통해 트레일과 결합하는 항체(비특이적 결합과 대조적)를 제공한다.
다클론 및 단일클론 항체는 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new Dimension in Biological Analysis, Kennet(eds.), Plenum Press, 뉴욕 (1980) 및 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 뉴욕 (1988)을 참조한다. 트레일과 면역반응성인 단일클론성 항체의 생산은 하기 실시예 4에서 추가로 설명된다.
통상의 기술로 생산될 수 있는 이러한 항체의 항원 결합 단편은 또한 본 발명에 속한다. 이러한 단편의 예에는 Fab, F(ab') F(ab')2 단편이 속하나 이에 한정되지 않는다. 항체 단편 및 유전공학 기술에 의해 생산된 유도체 또한 제공된다.
본 발명의 단일클론 항체에는 키메릭 항체, 예를 들어 인간화된 쥐의 단일크로론 항체가 있다. 이러한 인간화된 항체는 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 항체가 인간에게 투여되는 경우 감소된 면역성의 잇점을 제공한다. 하나의 실시 태양에서, 인간화된 단일클론 항체는 쥐의 항체의 가변 영역 (또는 그의 항원 결합 부위) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 영역 단편 (항원 결합 부위가 결핍됨)을 포함할 수 있다. 키메릭 및 엔지니어링된 단일클론 항체의 생산 방법에는 리에취만(Riechmann) 등의 문헌[Nature 332:323, 1988], 리우(Liu) 등의 문헌[PNAS 84:3439, 1987], 래릭(Larrick) 등의 문헌[Bio/Technology 7:934, 1989], 및 윈터(winter) 및 해리스(Harris)의 문헌[TIPS 14: 139, 1993년 5월]에 기재된 것들이 포함된다.
항체의 용도 중에서 시험관 내 또는 생체 내에서 트레일 폴리펩티드의 존재를 검출하는 분석에서의 용도가 있다. 항체는 친화 크로마토그래피에 의해 트레일을 정제하는데 사용된다.
추가적으로 표적 세포에 대해 트레일의 결합을 봉쇄할 수 있는 항체들은 트레일의 생물학적 활성을 억제하는데 사용할 수 있다. 치료 방법은 생체 내에서 트레일 매개된 생물학적 활성을 억제하는데 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 트레일에 의해 매개되거나 또는 악화된 질병은 직접 또는 간접적으로 치료된다. 단일클론 항체는 일반적으로 이러한 치료 방법에 사용되기에 바람직하다.
트레일에 대한 항체들은 혈전성 미소혈관증을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질병중 하나는 혈전구감소증 자반(TTP)이다(콴(Kwan, H.C.), Semin, Hematol, 24:71, 1987; 톤슨(Thompson) 등, Blood, 80:1890, 1992). TTP 연관된 사망률의 증가는 미국 질병 조절을 위한 센터에 의해 보고되었다(토록(Torok) 등, Am. J. Hematol. 50:84, 1995).
TTP에 감염된 환자(HIV+ 및 HIV- 환자)로부터의 혈장은 큰 혈관 기원이 아닌 피부의 미세혈관 기원의 인간 내피 세포의 세포소멸을 유도한다(로렌스() 등, Blood, 87:3245, 1996년 4월 15일). TTP 환자의의 혈장은 세포소멸을 직접 또는 간접적으로 유도하는 인자를 하나 이상 함유하는 것으로 생각된다. 실시예 13에 기재된 분석법에서, 트레일에 대해 생성된 다클론 항체는 피부 미세혈관 내피 세포의 TTP 플라즈마 유도된 세포소멸을 억제하였다. 실시예 13에 제시된 자료는 트레일은 TTP 환자의 혈청에 존재하고, 미세혈관 내피 세포의 세포소멸을 유도하는데 역할을 담당할 수 있는 것으로 제안하였다.
다른 혈전성 미소혈관증은 혈전분해 요독증(HUS)이다(모악(Make), Lancet, 343:393, 1994; 멜닉(Melnyk) (Arch. Intern. med., 155:2077, 1995; 톰슨 등의 상기 문헌). 본 발명의 하나의 실시 태양은 항-트레일 항체를 종종 "성인 HUS"(심지어 어린이들에게도 치명적)로 명명되는 질병을 치료하는에 사용하는 것에 관한 것이다. 유아/설사 관련 HUS로 공지된 질병은 성인 HUS와는 병인학적으로 상이하다.
작은 혈관을 응고시키는 것을 특징으로하는 다른 질병은 항-트레일 항체를 사용하여 치료할 수 있다. 이러한 질병에는 하기의 질병들이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 약 5 내지 10%의 소아 AIDS 환자에서 나타나는 심장 문제는 소혈관의 응고에 관여하는 것으로 믿어진다. 심장에서 미세혈관의 붕괴는 다중 경화증 환자에서 보고되었다. 전신적 낭창 홍반증(SLE)의 치료가 고려된다.
하나의 실시 태양에서, 환자의 혈액 또는 혈장은 생체 외의 항-트레일 항체와 접촉한다. 항체(바람직하게는 단일클론 항체)는 통상의 방법에 의해 적절한 크로마토그래피 매트릭스에 결합할 수 있다. 환자의 혈액 또는 혈장은 환자에게 재투여하기 전에 매트릭스에 결합된 항체를 함유하는 크로마토그래피 칼럼을 통과한다. 고정화된 항체는 트레일과 결합하여서 환자의 혈액으로부터 트레일을 제거한다.
또 다른 실시 태양에서, 봉쇄 항체가 사용되는 것이 바람직한 경우, 항체를 생체 내로 투여한다. 이러한 항체는 트레일이 표적 세포에 결합되는 것을 억제하는 능력에 대해 항체를 시험하는 것과 같은 임의의 적절한 분석 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 실시예 12는 봉쇄 항체를 식별하는 하나의 적절한 방법을 설명하고, 여기서 항체는 저캣 세포의 트레일 매개된 용해를 억제하는 능력에 대해 분석한다.
따라서, 본 발명은 트레일 대한 항체의 유효량을 사용하는 것을 포함하는, 혈전성 미세혈관증을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 생체 내 또는 생체 외 방법에서 미세혈관의 내피 세포에 대한 트레일 매개된 손상(예: 세포소멸)을 억제하는데 사용할 수 있다.
항-트레일 항체는 환자의 질병을 치료하는데 유용한 다른 작용제와 함께 사용할 수 있다. 로렌스(Laurence) 등에 의해 보고된 시험관 내 연구에서(Blood 87:3245, 1996), 미세혈관 내피 세포의 TTP 플라즈마 매개된 세포소멸의 일부 감소가 항-파스 봉쇄 항체, 오린트리카르복실산 또는 저온침전물이 고갈된 정상적 혈장을 사용하여 획득되었다.
따라서, 환자는 트레일 매개된 세포소멸을 억제하는 작용제와 함께 배합하여서 내피 세포의 파스-리간드 매개된 세포소멸을 억제하는 작용를 사용하여 치료할 수 있다. 하나의 실시 태양에서, 항-트레일 봉쇄 항체 및 항-파스 봉쇄 항체는 모두 혈전 미세혈관증에 감염된 환자에 투여한다. 파스 항원 (CD95)에 대한 단일클론 항체를 봉쇄하는 예로는 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 PCT 출원 제WO 95/10540호에 기재된 것이다.
트레일과 면역반응성인 항체, 적절한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물은 본 명세서에 제공된다. 이러한 조성물의 적절한 성분은 트레일 단백질을 함유하는 조성물에 대해 기재된 바와 같다.
하기의 실시예는 본 발명의 특정 실시 태양을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 영역을 한정하기 위해 제작된 것은 아니다.
실시예 1: 인간 트레일 DNA의 단리
본 발명의 인간 트레일 단백질을 코딩하는 DNA를 하기의 방법에 의해 단리하였다. 생물학적 정보 국립 센터(NCBI)에서 dbEST 데이터 베이스의 TBLASTIN 조사를 쿼리 서열 LVVXXXGLYYVYXQVXF (서열 8)을 사용하여 수행하였다. 이 서열은 TNF 리간드 계통의 가장 보존성인 영역을 기준으로 하였다(스미스 등, Cell, 72:1349, 1993). 발현된 서열 tag(EST) 파일, 젠뱅크 기탁 번호 Z36726을 조사 매개변수를 사용하여 확인하였다. 젠뱅크 파일은 EST가 인간 심장의 심방 cDNA 라이브러리로부터 얻었음을 나타내었다.γ
이 EST 파일의 3' 및 5'으로부터의 서열을 기준으로 2개의 30-bp 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 3'으로부터의 올리고뉴클레오티드는 서열 TGAAATCGAAAGTATGTTTGGGAATAGATG(서열 1의 뉴클레오티드 636 내지 665의 보완물)을 지녔고, 5' 올리고뉴클레오티드는 TGACGAAGAGAGTATGAAC AGCCCCTGCTG (서열 1의 뉴클레오티드 291 내지 320)였다. 올리고뉴클레오티드는 32Pγ-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나제로 5' 말단이 표지되었다. 2개의 λgt10 cDNA 라이브러리를 상기 표지된 올리고뉴클레오티드와의 동량 혼합물을 프로브로 사용하여 통상의 방법에 의해 스크리닝하였다. 하나의 라이브러리는 인간 심장의 5' 스트레치 cDNA 라이브러리(스트라타겐 클로닝 시스템(Stratagen Cloning System), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)였다. 다른 것은 하기와 같이 제조된 말단 혈액 림프세포 (PBL) 라이브러리였다. PBL을 정상적인 인간 자원자로부터 얻고, OKT3(항-CD3 항체) 10 ng/㎖ 및 인간 IL-2 10 ng/㎖를 사용하여 6일간 처리하였다. PBL 세포를 세척하고, 이오노마이신 500 ng/㎖(칼비오켐사) 및 PMA 10 ng/㎖을 사용하여 4일간 자극시켰다. 전령 RNA를 자극된 PBL 세포로부터 단리하였다. mRNA 주형 상에서 합성된 cDNA를 λgt10 파아지 벡터 내로 채워넣었다(Gigapak(등록 상표), 스트라타겐 클로닝 시스템, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재).
재조합 파아지를 이. 콜리 균주 C600-HFL 상에서 플레이팅하고, 표준 플라크 혼성화 기술을 사용하여 스크리닝하였다. 니트로셀룰로오스 필터를 이 플레이트로부터 들어 올리고, 32P-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 67℃에서 600 mM 트리스 pH 8.0, 0.2 mM EDTA, 5x 덴하르트(Denhardt)의 용액, 6x SSC, n-라우로일 사르코신 1 ㎎/㎖, 0.5% NP40 및 SS 연어 정자 DNA 4 ㎍/㎖의 용액에서 밤새 혼성화하였다.
심장 5' 스트레치 cDNA 라이브러리로부터, 하나의 양성 플라크를 약 백만 플라크 중에서 얻었다. 이 클론은 유전자의 3' 말단을 포함하지 않았다. PBL 라이브러리를 사용하여, 약 50개의 양성 플라크를 500,000개의 플라크 중에서 얻었다. 이 제1 원형 양성 플라크 중 15개를 뽑아 냈고, 파아지 삽입물을 증폭시키기 위하여, 리칭된 풀로부터의 삽입물을 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 생성된 생성물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오스 상에서 블롯팅하고, 32P-표지된 30-중량체 올리고뉴클레오티드를 프로브로 사용하는 표준 서던 블롯 기술에 의해 분석하였다. 서던 분석에 의해 가장 큰 밴드를 생산하는 2개의 플라크를 제2 스크리닝에 의해 정제하고, 단리된 파아지 플라크를 상기와 동일한 방법을 사용하여 얻었다.
플레이트 용해 방법을 사용하여 단리된 파아지로부터 DNA를 제조하고, cDNA 삽입물을 EcoRI을 사용하여 절단하고, 트리스-보레이트-EDTA 완충액에서 1.5% 아가로스를 사용하여 전기영동으로 정제하고, pBluescript(등록상표)SK(+) 플라스미드 내로 라이게이션하였다. 이어서, 이 삽입물을 통상의 방법에 의해 서열화하고, 생성된 서열을 정렬하였다.
인간 트레일 DNA의 뉴클레오티드 서열을 서열 1에 나타내고, 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 2에 나타내었다. 이 인간 트레일 단백질은 N-말단 세포질 도메인(아미노산 1-18), 트랜스막 영역(아미노산 19-38) 및 세포외 도메인 (아미노산 39-281)을 포함한다. 이 단백질의 계산된 분자량은 32,508 달톤이었다.
트레일 DNA를 함유하는 재조합 벡터를 사용하여 형질전환된 이. 콜리 균주 DH10B 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 제69849호로 1995년 6월 14일에 기탁하였다. 이 기탁은 부다페스트 조약 하에 이루어졌다. 기탁된 균주에서 재조합 벡터는 발현 벡터 pDC409(실시예 5에 기재됨)였다. 벡터를 SalI 및 NotI를 사용하여 소화 분해시키고, 서열 1에 나타난 전체 코딩 영역을 포함하는 인간 트레일 DNA를 소화 분해된 벡터 내로 라이게이션하였다.
실시예 2: 끝이 절단된 트레일을 코딩하는 DNA의 단리
제2 인간 트레일 단백질을 코딩하는 DNA을 하기와 같이 단리하였다. 이 끝이 절단된 트레일은 저캣 세포의 세포소멸을 유도하는 능력을 보이지 않았다.
5' 및 3' 프라이머로서 실시예 1에 기재된 30-중량체를 사용한 PCR 분석은 실시예 1에서 제1 원형 플라크 14개 중 3개가 더 짧은 형태의 트레일 DNA를 함유하고 있음을 나타내었다. 더 짧은 형태의 유전자 중 하나를 단리하고, pBluescript(등록상표)SK(+) 클로닝 벡터(스트라타겐 클로닝 시스템, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 내로 라이게이션하고, 서열화하였다.
이 DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 3에 나타내었다. 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 4에 나타내었다. 코딩된 단백질은 N-말단 세포질 도메인(아미노산 1-18), 트랜스막 영역 (아미노산 19-38), 세포외 도메인 (아미노산 39-101)을 포함하였다.
서열 3의 DNA는 서열 1의 DNA의 뉴클레오티드 359 내지 506이 결핍되고, 따라서 인간 트레일 결실 변형체(hu트레일dv) 클론으로 명명된다. 결실로 인하여 리딩 프레임 내에서 이동이 일어나 결과적으로 프레임 내 서열 4의 아미노산 1010 뒤에 정지 코돈이 위치하게 된다. 따라서, 서열 3의 DNA는 끝이 절단된 단백질을 코딩한다. 서열 2의 아미노산 1 내지 90은 서열 4의 아미노산 1 내지 90과 동일하다. 그러나, 결실로 인하여, hu트레일dv 단백질의 C-말단 영역(서열 4의 아미노산 91 내지 101)은 서열 2의 상응하는 위치에서의 잔사와 상이하다.
hu트레일dv 단백질은 TNF 계통 단백질의 구성원의 C-말단에서 발견되는 상기 보존성 영역이 결핍된다. 저캣 세포의 세포소멸성 사멸을 일으키지 못하는 이 hu트레일dv 단백질은 생물학적 활성에 대한 보존성 영역의 중요성을 확인시켰다.
실시예 3: 쥐의 트레일을 코딩하는 DNA
쥐의 트레일을 코딩하는 DNA는 하기와 같은 방법에 의해 단리하였다. 벡터 λZAP에서 쥐의 T 세포주 7B9로부터 유래된 cDNA를 함유하는 cDNA 라이브러리를 모슬리(Mosley) 등의 문헌[Cell 59:335, 1989]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 라이브러리로 부터의 DNA를 통상의 기술에 의해 니트로셀룰로오스 필터 상으로 옮겼다.
인간 트레일 DNA 프로브를 사용하여 필터 상에서 혼성화되는 쥐의 cDNA를 확인하였다. 2회의 스크리닝 과정에서 2개의 분리된 프로브를 사용하였다. 인간 트레일 DNA를 주형으로 사용하여 단리되고 증폭된, 길이가 약 400bp인 PCR 반응 생성물을 제1회 스크리닝에서 프로브로 사용하였다. 이 PCR 생성물은 인간 트레일 코딩 영역의 단편을 함유하였다. 제2회 스크리닝에서 사용된 프로브는 서열 1의 인간 트레일 DNA의 전체 코딩 영역을 포함하였다. 랜덤하게 프라이밍된 DNA 표지 장치 (스트라타겐사, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 프로브를 방사능 표지하였다.
혼성화를 37℃에서 50%의 포름아미드에서 수행하고, 50℃에서 1x SSC, 0.1% SDS를 사용하여 세척하였다. 2회의 스크리닝에서 모두 양성인 쥐의 cDNA를 단리하였다.
이 DNA의 뉴클레오티드 서열을 서열 5에 나타내고, 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 6에 나타내었다. 코딩된 단백질은 N-말단 세포질 도메인 (아미노산 1-17), 트랜스막 영역(아미노산 18-38) 및 세포외 도메인 (아미노산 39-291)을 포함하였다. 이 쥐의 트레일은 서열 2의 인간 트레일과 아미노산 수준에서 64% 동일하다. 쥐의 트레일 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역은 서열 1의 인간 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역와 75% 동일하다.
실시예 4: 트레일에 결합하는 항체
본 실시예는 트레일과 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체의 제조를 설명한다. 이러한 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 적절한 이뮤노겐은 정제된 트레일 단백질 또는 그의 이뮤노겐 단편(예: 세포외 도메인), 트레일 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질(예: 가용성 트레일/Fc 융합 단백질) 및 세포 표면 상에서 재조합 트레일을 발현시키는 세포를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
단일클론성 항체를 생산하기 위한 공지된 기술에는 미국 특허 제4,411,993호에 기재된 것들이 포함된다. 간단히, 쥐를 트레일을 보완적 프룬드의 보조물에서 유화된 이뮤노겐으로 사용하여 면역화하고, 10-100 ㎍ 범위의 양으로 피하적으로 또는 복막내로 주사하였다. 10일 내지 12일 후에, 면역화된 동물을 보완적 프룬드의 보조물에서 추가의 트레일을 사용하여 추가면역시켰다. 쥐를 주기적으로 1 주마다 내지 2주 마다 면역 계획표에 따라 추가면역시켰다. 주기적인 도트 블롯 분석 또는 ELISA (효소 결합의 면역 흡착 분석법)에 의한 시험을 위하여 혈청 시료를 안구 뒤 출혈 또는 꼬리 말단의 절단에 의해 취하였다.
적절한 항체 역가의 결실 후에, 양성 동물을 염수 중 트레일을 마지막으로 정맥내 주입하였다. 3일 내지 4일 후에, 동물을 살생하고, 비장 세포를 수확하고, 비장 세포를 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어, NSI, 바람직하게는 P3x63A 8.653 (ATCC CRL 1580)에 융합시켰다. 융합은 히브리도마 세포를 생성하고, 이를 다중 마이크로티터 플레이트에서 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 선택 배지에서 비융합된 세포, 골수종 히브리드 및 비장 세포 히브리드의 증식을 억제하기 위하여 플레이팅하였다.
히브리도마 세포를 정제된 트레일에 대해 반응성인 ELISA에 의해 엥베일(Engvail) 등의 문헌[Immunochem. 8:871, 1971] 및 미국 특허 제4,703,004호에 개시된 방법을 적용시켜서 스크리닝하였다. 양성 히브리도마 세포를 공통유전자의 BALB/c생쥐의 복막 내로 주사하여서 고농도의 항-트레일 단일클론성 항체를 함유하는 복수를 생성할 수 있다. 또한, 히브리도마 세포를 시험관 내에서 플라스크 또는 롤러 병에서 다양한 기술에 의해 증식시킬 수 있다. 쥐의 복수에서 생성된 단일클론성 항체를 황산암모늄 침전법, 이어서 겔 배제적 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 또한, 항체가 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하는 기초로하는 친화 크로마토그래피를 트레일과 결합하는 것을 기초로하는 친화 크로마토그래피로서 사용할 수 있다.
실시예 5: DNA 래더링 세포소멸 분석법
인간 트레일을 발현시키고 세포소멸을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 말단에서 혼입된 SalI 및 NotI 제한 부위를 사용하여 인간 트레일 유전자의 코딩 영역의 3' 및 5'에 상응하도록 합성하였다. 인간 트레일의 코딩 영역을 표준 PCR 기술을 사용하여 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 SalI 및 NotI을 사용하여 소화 분해시키고, SalI/NotI 소화 분해된 벡터 pDC409 내로 삽입하였다. pDC409는 포유 동물 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터이나, 이. 콜리 세포에서 복제가능하다.
pDC409는 pDC406으로 명명되는 발현 벡터로부터 유래된다(본 명세서에 참고문헌으로 인용된 맥마한(McMahan), EMBO J. 10:2821, 1991 및 PCT 출원 제WO91/19882호에 기재됨). pDC406은 SV40, 엡스테인-바르 바이러스 및 pBR322으로부터 유래된 복제 오리진을 함유하고, 다우어(Dower) 등의 문헌[J. Immunol. 142:4314(1989)]에 기재된 HAV-EQ의 유도체이다. pDC406은 HAV-EO에서 아데노바이러스 3 삼중체 리더 서열에 존재하는 인트론의 결실에 의해 HAV-EO와는 상이하다. 다중 클로닝 부위 내로 삽입된 DNA (다수의 제한 엔도뉴클레어제 절단 부위를 함유)를 HIV 및 아데노바이러스로부터 유래된 조절 인자를 사용하여 전사 및 번역시켰다. 또한 벡터는 암피실린 내성을 부여하는 유전자를 함유한다.
pDC409는 쥐의 외부 Bgl II 부위가 결실되어서 쥐의 Bgl II 부위가 유일해진 점에 있어서 pDC406과 상이하다. 2개의 Pme 1 부위 및 1개의 Srf 1 부위를 mcs에 가하고, 3개의 정지 코돈 (TAG)를 3개의 리딩 프레임 내에서 기능하도록 쥐의 다운스트림에 위치시켰다. T7 프라이머/프로모터를 가하여 DNA 서열화를 도왔다.
원숭이 신장 세포주 CV-1/EBNA-1(ATCC CRL 10478)는 맥마한 등의 상기문헌에 기재된 바와 같이, 인간 CMV 중간체 초기 증진제/프로모터로부터 구동된 EBNA-1을 연속적으로 발현시키는 엡스테인-바르 바이러스 핵 항원-1(EBNA-1)을 코딩하는 유전자를 사용하여 CV-1 세포주(ATCC CCL 70)의 트랜스펙션에 의해 유래하였다. EBNA-1 유전자는 복제의 EBV 오리진을 함유하는 pDC409와 같은 발현 벡터의 에피좀 복제를 가능하게 한다.
팔콘 T175 플라스크에서 증식된 CV1/EBNA 세포를 "빈" pDC409 또는 인간 트레일 코딩 영역을 함유하는 pDC409 15 ㎍을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙트된 세포를 3일 동안 37℃에서 10% CO2에서 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 37℃에서 50 mM EDTA에서 20분 동안 인큐베이션하고, 세포 스크래퍼를 사용하여 긁어내고, PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 1% 파라포름알데히드 PBS에서 10분 동안 4℃에서 고정시키고, 3xPBS에서 세척하였다.
저캣 세포를 이 분석법에서 표적 세포로 사용하여서 트레일 발현 세포가 그의 세포소멸을 유도할 수 있는지 여부를 측정하였다. 저캣 세포주, 클론 E6-1은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 기탁 번호 제ATCC TIB 152호로 시판되고, 웨이스(Weiss) 등의 문헌[J. Immunol. 133:123-128, 1984]에 기재된 인간 급성 T 세포 백혈병 세포주이다. 저캣 세포를 10% 소의 태아 혈청 및 스트렙토마이신 및 페니실린 10 ㎍/㎖로 보충된 RPMI 배지에서 ㎖ 당 200,000 내지 500,000 세포의 밀도로 배양하였다. 웰 당 4백만의 세포를 6개의 웰 플레이트에서 고정된 세포, 파스 리간드로 트랜스펜션된 세포로부터의 상등액 및 다양한 항체의 다양한 배합물과 함께 배지 2.5 ㎖을 사용하여 6개의 웰 플레이트에서 공동 배양하였다.
4시간 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 1200RPM에서 5분 동안 데스크탑 원심분리기에서 펠릿화하였다. 펠릿을 재현탁하고, 4℃에서 10 mM 트리스-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 완충액 500 ㎕에서 4℃에서 10분 동안 인큐베이션시시키고, 세포를 용해하였으나. 핵은 상해되지 않게 하였다. 이어서, 용해물을 4℃에서 10분 동안 마이크로 원심분리기에서 14,00 RPM으로 스피닝하였다. 상등액을 제거하고, 25:24:1 페놀-클로로포름-이소아밀알코올을 사용하여 3회 세척하고, 이어서 글리코겐 담체 (시그마사) 1 ㎍의 존재 하에 NaOAc 및 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
생성된 펠릿을 10 mM 트리스-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5에 현탁시키고, 37℃에서 20분 동안 RNase 10 ㎍/㎖를 사용하여 인큐베이션하였다. 이어서, DNA 용액을 트리스-보레이트 EDTA 완충액에서 1.5% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분해하고, 브롬화에티듐을 사용하여 염색하고, UV 광을 사용하여 트랜스 조사하면서 사진화하였다.
결과는 다음과 같다. pDC409 또는 pDC409-트레일로 트랜스펙션된 고정된 CV1/EBNA 세포는 검출되지 않는 DNA 래더링을 생성하였다. 저캣 세포와 함께 공동 배양된 pDC409-트레일 고정된 세포는 DNA 래더링을 생산하였으나, 저캣 세포와 함께 공동 배양된 pDC409 고정된 세포는 생성하지 않았다.
또한, DNA 래더링은 저캣 세포가 pDC409에서 DNA 코딩 인간 파스 리간드를 사용하여 트랜스펙션된 COS 세포로부터의 농축된 상등액과 공동 배양되는 경웨 관찰되었다. 상등액은 세포 표면으로부터 단백질 분해적으로 방출된 가용성 파스 리간드를 함유하는 것으로 믿어진다. 파스 리간드 유도된 DNA 래더링은 파스에 대한 가용성 봉쇄 단일클론성 항체 10 ㎍/㎖을 가하여서 봉쇄될 수 있다. 동일한 항체는 pDC409-트레일 세포에 의한 저캣 DNA의 래더링을 억제할 수 없었고, 이는 트레일이 파스를 통해 세포소멸을 유도하지 않음을 나타낸다.
동일한 분석 방법에서, pDC409-트레일을 사용하여 트랜스펙션된 고정된 CV1/EBNA 세포는 U937 세포에서 DNA 래더링을 유도하였다. U937 (ATCC CRL 1593)은 인간 조직구 림프종 세포주이다. 이펙터 대 표적 세포의 비율은 1:4였다(저캣 표적 세포 상의 분석에서와 동일함).
DNA 래더링으로 공지된 패턴 내의 세포 DNA의 단편은 세포소멸의 보증이다. 상기 분석법에서, 트레일은 백혈병 세포주 및 림프종 세포주의 세포소멸을 유도하였다.
실시예 6: 노던 블롯 분석법
수많은 상이한 조직 유형에서 트레일의 발현을 통사의 노던 블롯 방법에 의해 분석하였다. 성인 인간 조직의 변종(자중 조직 노던 블롯 I 및 II)으로부터 폴리 A+ RNA를 함유하는 노던 블롯을 크론테크사(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 얻었다. 다른 블롯을 1.1% 아가로스-포름알데히드 셀 상에서 RNA 시료를 해리하고, Hy 결합-N 사에서 제조사(아머샴사)의 지침에 따라 블롯팅하고, 메틸렌블루로 염색하여서 RNA의 농도를 모니터링하였다. 블롯을 인간 트레일의 전체 코딩 영역에 상응하는 안티센스 RNA 리보프로브를 사용하여 프로브화하였다.
인간 트레일 mRNA를 말단 혈액 림프세포, 콜론, 소장, 난소, 전립선, 흉선, 비장, 태반, 폐, 신장, 심장, 췌장 및 골격 근육에서 검출하였다. 트레일 형질전환체를 더 큰 세포 퇴화성 림프종 세포주 Karpas 299(피셔(Fischer) 등, Blood, 72:234, 1988) 및 편도선 T 세포에서 풍부한 것으로 발견되었다. 트레일 전령은 라지로 명명된 버키트 림프종 세포주에서 낮은 정도로 존재하였다.
트레일 mRNA는 고환, 뇌 또는 간 또는 수가지의 T 세포주에서 검출되지 않았다. 트레일 형질전환체는 PMA 및 칼슘 이오노포어를 사용하여 20시간 동안 자극되지 않거나 또는 자극된 신선하게 단리된 말단 혈액 T 세포 (PBT)에서 거의 또는 전혀 검출되지 않았다.
실시예 7: 가용성 트레일 폴리펩티드의 생산
서열 2의 아미노산 95 내지 281을 함유하는 가용성 인간 트레일 폴리펩티드를 하기와 같이 제조하였다. 이 폴리펩티드는 세포외 도메인의 단편이고, 상기 논의된 스페이서 영역이 결핍되어 있다.
가용성 인간 트레일을 코딩하는 발현 벡터를 프레임 내에서 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단), 인간 시토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된 리더 서열, 플래그(등록상표)로 명명된 합성 에피토프 및 인간 트레일의 아미노산 95-281을 코딩하는 DNA를 융합시켜서 제작하였다. 플래그(등록상표) 옥타펩티드 (서열 7)은 호프 등의 문헌[Biotechnology 6:1204-1210, 1988]에 기재된 바와 같이, 그의 융합된 단백질의 정제를 용이하게 하였다.
트레일 코딩 DNA 단편을 단리하고, 서열 2의 아미노산 95-281을 코딩하는 DNA 단편의 말단을 한정하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응법 (PCR)에 의해 증폭시켰다. 3' 프라이머는 트레일 코딩 서열의 NotI 부위 다운스트림이 부가적으로 첨가된 31-머였다. SpeI 부위 및 트레일 코딩 서열의 업스트림 서열을 코딩하는 플래그(등록상표) 에피토프를 가하였다. 상기된 인간 트레일 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 통상의 방법으로 수행하였다.
반응 생성물을 SpeI 및 NotI으로 소화 분해시키고, SalI 및 NotI으로 절단된 발현 벡터 pDC409 내로 삽입하였다(실시예 5에 기재됨). CMV 오픈 리딩 프레임 리더를 코딩하는 SalI-SpeI 단편을 형성하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 또한 벡터 내로 라이게이션하였다. CMV-유도된 리더의 아미노산 서열을 서열 9에 나타내었다. 서열 9의 아미노산 1 내지 29는 CMV DNA에 의해 코딩되는 반면, 아미노산 30 내지 32는 벡터 이. 콜라를 제작하는데 사용된 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 이. 콜리 세포를 라이게이션 혼합물을 사용하여 라이게이션시키고, 그로부터 목적하는 재조합 발현 벡터를 단리하였다.
CV1-EBNA 세포(ATCC CRL 10478, 실시예 5에 기재됨)를 재조합 벡터를 사용하여 트랜스펙션시키고, pDC409-플래그-sh트레일로 명명하고, 배양하여서 가용성 플래그(등록상표) 트레일 폴리펩티드의 발현 및 분비를 가능하게 하였다. 배양 상등액을 트랜스펙션시킨지 3일 후에 수확하고, 고체 지지체 상에서 고정화된 M2로 명명된 항-플래그(등록상표) 항체를 함유하는 칼럼에 가하였다. 단일클론 항체 M2는 호프 등의 상기문헌에 기재되어 있고, 코닥 사이언티픽 이매징 시스템 사(미국 코넥티커트주 뉴헤븐 소재)에서 시판된다. 800 ㎕ 분획을 50 mM 시트레이트를 사용하여 컬럼으로부터 용출하고, 1M 트리스(pH 8) 0.45 ㎖에서 즉시 중화하였다. 분획을 10% 글리세롤을 사용하여 -20℃에서 필요할때까지 저장하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하는 경우, CV1/EBNA 세포에서 발현된 이 가용성 재조합 플래그(등록상표)/인간 트레일은 28 kD의 겉보기 분자량을 지녔다. 플래그(등록상표) 잔기는 추정된 880 달톤이 총 분자량으로 기여하게 한다. 정제된 가용성 플래그(등록상표)/트레일의 겔 필트레이션 분석은 분자는 용액에서 80 kD의 크기를 지닌 다중체라는 것을 제안하였다. 이론적에 구애됨이 없이, 겔 필트레이션 분석은 가용성 재조합 플래그(등록상표)/인간 트레일은 삼중체가 지배적인 이중체 및 삼중체의 배합물을 형성한다는 것을 제안하였다.
CMV 리더-플래그(등록상표) 가용성 쥐의 트레일 단백질을 코딩하는 pDC409-플래그-sm트레일로 명명된 발현 벡터를 유사한 방법으로 제작하였다. 가용성 쥐의 트레일 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 단리하고, PCR에 의해 증폭시켰다. 서열 6의 쥐의 트레일 서열의 아미노산 99 내지 291을 코딩하는 DNA의 말단을 한정하는 올리고뉴클레오티드를 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용하였다.
실시예 8: 가용성 트레일에 의한 백혈병 세포의 용해
실시예 5에서, 인간 트레일을 발현시키는 세포는 저캣 세포(백혈병 세포주)의 세포소멸을 유도하였다. 하기 연구에서, 가용성 인간 트레일 폴리펩티드는 저캣 세포를 살생하였다.
저캣 세포를 10% 소의 태아 혈청, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 ㎍/㎖의 페니실린으로 보충된 RPMI 배지에서 ㎖ 당 200,000 내지 500,000의 세포 밀도가 되도록 배양하였다. 세포(96개의 웰 플레이트에서 100 ㎕의 부피 중 웰 당 50,000 세포)를 도 1에 나타난 시약을 사용하여 20시간 동안 인큐베이션하였다. "트레일 수퍼"란 pDC409-플래그-sh트레일(실시예 7 참조)을 사용하여 트랜스펙션된 CV1/EBNA 세포로부터의 조건화된 상등액 (웰당 10 ㎕)을 말한다. "대조구 수퍼"란 빈 벡터로 트랜스펙션된 CV1/EBNA 세포로부터의 상등액을 말한다. 고정화된 항-플래그(등록상표) 항체 M2("고정화된 M2")를 웰 당 100 ㎕의 부피에서 10 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4℃ 밤새 또는 37℃에서 2시간 동안 부착되도록 한 후, 웰을 흡인하고 PBS로 2회 세척하여서 결합된 항체를 제거하였다. 저캣 세포를 파스 리간드 또는 M3으로 처리하고, 파스에 대한 봉쇄 단일클론성 항체(앨더슨(Alderson) 등, J. Exp. Exp. Med. 181:71, 1995 및 PCT 출원 제WO95/10540호)를 분석법에 포함시켰다.
이렇게 처리된 세포의 대하 활성을 알라마 블루 염색의 대사 전환에 의해 분석하였다. 알라마 블루 전환을 웰 당 알라마 블루 염색 10 ㎕을 가하고, 이때 550-600 nm에서 광학 밀도 (OD)를 제외하고 염료를 4시간 후 OD 550-600 nm로부터 가하였다. 염색의 비전환을 생존도 0으로 플롯하고, 트레일의 부재 하의 염료 전환의 수준을 생존도 100으로 플롯하였다. 생존도를 실험적 염색 대 대조 배양의 비율을 100으로 제곱하여서 계산하였다.
결과는 도 1에 나타내었다. 오차 막대는 4개의 독립적 웰로부터의 측정치의 표준 편차를 나타내고, 값은 이 측정치의 평균이다.
트레일 함유 상등액은 저캣 세포의 생존도의 상당한 감소를 일으켰다. 세포 생존도의 큰 감소는 트레일 함유 상등액 및 항-플래그(등록상표) 항체 M2의 배합물과 접촉하는데서 기인한다. 하나의 가능성있는 설명은 M2는 플래그(등록상표)/트레일 수용체 복합체의 가교결합을 용이하게하여서, 신호의 강도를 증가시켰다.
파스 리간드는 저캣 세포를 살생하는 능력을 입증하였다. 항-파스 항체 M3은 파스 리간드의 활성을 억제하나, 트레일의 활성은 억제하지 않는다.
알라마 블루 분석법에서 염료 전환의 변화는 세포 살생으로 인한것임을 확증하기 위하여, 트레일에 의해 유도되는 세포 생존도의 감소는 트립판 블루를 사용한 세포의 염색에 의해 확인되었다.
실시예 9: 백혈병 및 림프종 세포의 용해
실시예 5 및 8에서, 트레일은 백혈병 세포주 (저캣) 및 림프종 세포주(U937)의 세포소멸을 유도하였다. 하기의 연구는 또한 트레일의 백혈병 세포 및 림프종 세포의 살생 능력을 입증하였다.
표 1에 나타난 인간 세포주를 10% 소의 태아 혈청, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 ㎍/㎖의 페니실린으로 보충된 RPMI 배지에서 ㎖ 당 200,000 내지 500,000의 세포 밀도가 되도록 배양하였다. 세포(96개의 웰 플레이트에서 100 ㎕의 부피 중 웰 당 50,000 세포)를 pDC409-플래그-sh트레일을 사용하여 트랜스펙션된 CV1/EBNA 세포로부터의 조건화된 상등액 (웰당 10 ㎕)을 사용하여 20시간 동안 인큐베이션하였다.
대사 활성을 실시예 8에 기재된 분석 방법에서 알라마르 블루 염색의 전환에 의해 분석하였다.
알라마 블루 분석에서 염색 전환 변화가 세포 사멸로 인한 것임을 확증하기 위하여, 트레일에 의해 유도된 세포 생존도의 감소를 트리판 블루를 사용하여 세포를 염색하여 확인하였다. 플릭 및 기포드의 문헌[J. Immunol. Methods 68:167-175, 1984]에 기재된 바와 같이 수행된 크리스탈 바이올렛 염색은 또한 알라마르 블루 염색에서 보여진 결과를 확증하였다. 세포 사멸의 특성을 니판 블루 염색에 의해 확인하고 현미경으로 단편을 가시화하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 많은 암 세포주는 트레일 매개된 살생에 민감하였다. 다른 세포 유형의 트레일 매개된 세포소멸에 대한 감수성을 이 실시예에 기재된 분석 방법을 사용하여 측정하였다.
트레일은 세포주 THP-1, K562, Karapas 299 및 MP-1, K299에 대한 중요한 세포독성 효과를 보이지 않았고, 또한 Karapas 299(DSM-ACC 31)로 공지된 것을 높은 등급의 큰 세포 퇴화성 림프종을 사용하여 진단된 숫컷의 말단 혈액으로부터 성립되었다(피셔 등, Blood, 72:234, 1988). MP-1은 자발적으로 유래된 EBV 형질전환된 B 세포주이다(굿윈 등, Cell 73:447, 1993). 이론적으로는 바라지 않지만, 이 4개의 세포주는 트레일에 대한 수용체를 발현시키지 않거나 또는 세포소멸을 억제하는 유전자의 증진조절에 의해 특징화된다.
세포주 설명 생존도a
Bjab 버키트 림프종 0.5 ㅁ 3.8
Ramos 버키트 림프종 12.0 ㅁ 2.1
U937 조직구 림프종 25.2 ㅁ 8.2
HL60 백혈병 59.5 ㅁ 3.2
Raji 버키트 림프종 64.9 ㅁ 4.5
Daudi 버키트 림프종 70.2 ㅁ 4.2
THP-1 단세포 세포주 92.3 ㅁ 6.8
K562 만성 골수 백혈병 97.1 ㅁ 4.8
K299 큰 세포 퇴화성 림프종 99.0 ㅁ 4.3
MP-1 자방적 B 세포 104.9 ㅁ11.7
a결과는 각 자료점에 대해 4개의 웰의 평균 ㅁSEM
실시예 10: 트레일의 교차종 활성
인간 및 쥐의 트레일의 종간 교차반응을 하기와 같이 시험하였다. 쥐 및 인간의 트레일을 인간 흑색종 세포주 A375(ATCC DRL 1619)와 인큐베이션하였다. 이는 세포주에 결합하기 때문에, 알라마르 블루보다는 크리스탈 바이올렛 분석법을 생존도 측정에 사용하였다. A375 세포를 10% 소의 태아 혈청, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 ㎍/㎖의 페니실린으로 보충된 DMEM 배지에서 ㎖ 당 200,000 내지 500,000의 세포 밀도가 되도록 배양하였다. 세포(96개의 웰 플레이트에서 100 ㎕의 부피 중 웰 당 10,000 세포)를 여 트랜스펙션된 CV1/EBNA 세포로부터의 조건화된 상등액 (웰당 10 ㎕)을 사용하여 20시간 동안 인큐베이션하였다. 크리스탈 바이올렛 염색을 프릭(Flick) 및 기포드(Gifford)의 문헌[J. Immunol. Methods 68:167-175, 1984]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 인간 및 쥐의 트레인이 모두 인간 세포에 대해 활성적이고, 즉 쥐 및 인간 트레일은 A375 세포를 살생한다는 것을 입증하였다.
인간 트레일이 쥐의 세포에 작용하는 능력을 영구적 쥐의 섬유아세포주 L929를 사용하여 시험하였다. L929세포를 인간 또는 쥐의 트레인과 함께 인큐베이션하여서 크리스탈 바이올렛 염색을 감소시켜서 인간 및 쥐의 트레일이 쥐 세포에서 활성적임(세포소멸을 유도함)을 입증하였다. 크리스탈 바이올렛 외에, 세포 사멸을 트립판-블루 염색에 의해 수행하였다.
실시예 11: CMV 감염된 세포의 용해
하기 실험은 실시에 7에서 제조된 가용성 플래그(등록상표)-인간 트레일 단백질은 바이러스 감염된 세포에서 세포독성 효과를 지님을 입증한다.
정상 인간 섬유아를 10% CO2 및 10% 소의 태아 혈청, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 ㎍/㎖의 페니실린으로 보충된 DMEM 배지에서 24개의 웰 플레이트 상에서 집합적으로 증식시켰다. 섬유아의 시료를 도 2에 나타난 바와 같이 시험하였다. 시토킨의 농도는 γ-인터페론 및 가용성 플래그(등록상표)-인간 트레일 30 ng/㎖에 대해 10 ng/㎖이었다. 트레일을 함유하는 모든 시료는 또한 트레일 활성을 증진시키는(가교결합에 의함) 항-플래그(등록상표) 항체 M2(상기됨)의 2배 중량을 함유하였다.
지칭된 시토킨으로 세포를 20시간 동안 예비처리하였다. 시토메갈로바이러스(CMV)로 세포를 감염시키기 위하여, 배양 배지를 흡인하고, 세포를 MOI(감염 다중도)가 거의 5인 DMEM에서 CMV를 사용하여 감염시켰다. 2시간 후, 바이러스 함유 배지를 DMEM 가해진 시토킨으로 대체하였다. 24시간 후, 플릭 및 기포드의 상기문헌(1984)에 기재된 바와 같이, 세포를 크리스탈바이올렛 염료로 염색하였다. 염색된 세포를 물로 2회 세척하고, 2% 소듐데옥시콜레이트 200 ㎕에서 파괴하고, 물 5배로 희석하고, 570 nm에서 OD를 측정하였다. 최대 염색도를 가장 많이 염색을 보이는 시료에 대한 OD를 표준화하여 계산하였다. 유사한 결과를 수가지 독립적 실험으로부터 얻었다.
도 2에 제시된 결과는 트레일이 CMV 감염된 섬유아세포를 특이적으로 살생하는 것을 입증하였다. 이 세포 사멸은 γ-인터페론을 사용한 세포의 예비처리에 의해 증진되었다. 바이러스에 감염되지 않은 섬유아세포는 트레일과 접촉시에 상당량의 사멸이 초래되지 않았다.
실시예 12: 봉쇄 항체를 식별하는 분석법
트레일에 대한 봉쇄 항체를 트레일의 특정 생물학적 활성을 억제하는 능력에 대해 항체를 시험하여 확인할 수 있다. 하기 분석에서, 저캣 세포의 트레일 매개된 세포소멸을 억제하는 능력에 대해 단일클론성 항체를 시험하였다. 저캣 세포주는 실시예 5에 기재되어 있다.
플래그(등록상표)/가용성 인간 트레일 융합 단백질에 대한 단일클론성 항체를 생산하는 히브리도마 세포주를 분석에 사용하였다. 히브리도마 배양액으로부터의 상등액을 96개의 웰 마이크로티터 플레이트에서 RPMI 보충 배지에서 항-플래그(등록상표) 단일클론성 항체 M2와 가교결합된 플래그(등록상표)/가용성 인간 트레일 20 ng/㎖와 함께 배양하였다. 플래그(등록상표)/가용성 인간 트레일 융합 단백질 및 M2로 명명된 단일클론성 항체는 실시예 7에 기재되어 있다.
히브리도마 상등액을 1:50(v/v) 희석물(출발 농도) 및 그의 2배 연속 희석물로 사용하였다. 37℃에서 인큐베이션한 후, 10% CO2, 50,000 저캣 세포를 30분 동안 웰 당 가하고, 인큐베이션을 20분 동안 수행하였다.
이어서, 세포 생존도를 알라마르 블루 염료의 전환을 측정하여 평가하였다. 알라마르 블루 전환 분석법은 실시예 8에 기재되어 있다. 단일클론성 항체는 플래그(등록상표)/가용성 인간 트레일에 의해 유도된 저캣 세포의 세포소멸을 억제하는 것으로 발견되었다.
실시예 13: 트레일 봉쇄 연구
피부 오리진의 인간 미세혈관 내피 세포를 환자의 혈장으로부터 혈전성 혈소판감소증(TTP) 또는 대조구 혈장 단독으로 또는 항-트레일 다클론성 항혈청의 존재 하에 16-18시간 동안 처리하였다. 항혈청의 1:2000 희석물을 사용하였다. 혈장은 2명의 TTP 환자에서 기원한것이고, #1 및 #2로 명명한다. 분석에 사용된 세포는 MVEC-1(HMVEC 2753, 크로네틱스사에서 구입, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 MVEC-2(DHMVEC 30282, 셀 시스템사로부터 구입, 미국 워싱턴주 커크랜드 소재)였다. 이 세포의 배양을 로렌스 등의 문헌[Blood, 87:3245, 1996]에 기재된 바와 같이 유지할 수 있다.
결과는 다음과 같다. 아래 자료는 요오드화프로피듐으로 염색된 세포의 DNA 막대 그래프로부터 유래한 것이고, "A 피크"란 세포소멸 피크이다(오야이주 ()등, Blood, 82:3392, 1993; 니콜레티 등 J. Immunol. Methods, 139; 271, 1991, 및 로렌스 등, Blood, 75:696, 1990).
미세 혈관 EC 혈장(1%) 항체 Ao 피크 (%)
실험 1
피부 MVEC-1 대조구 - 0
피부 MVEC-1 TTP(#1) - 19.5
피부 MVEC-1 TTP(#1) + 0.3
실험 2
피부 MVEC-2 대조구 - 0
피부 MVEC-2 TTP(#2) - 20.0
피부 MVEC-2 TTP(#2) 대조구 Ab 13.1
피부 MVEC-2 TTP(#2) + 0.2
실험 3
피부 MVEC-1 TTP(#1) - 50.1
피부 MVEC-1 TTP(#1) + 10.6
실험 4
피부 MVEC-2 대조구 - 0
피부 MVEC-2 TTP(#1) - 13.9
피부 MVEC-2 TTP(#1) 대조구 Ab 14.1
피부 MVEC-2 TTP(#1) + 0.6
자료는 TTP 환자 유래의 혈장은 피부 오리진의 미세혈관 내피 세포의 세포소멸을 유도하는 것으로 나타났다. 이 세포소멸은 트레일에 대한 다클론성 항체에 의해 억제되었다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 임뮤넥스 코포레이션
(ii) 발명의 명칭: 세포소멸을 유도하는 시토킨
(iii) 서열수: 9
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 캐쓰린 에이. 앤더슨, 임뮤넥스 코포레이션
(B) 거리: 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 98101
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: 애플 매킨토시
(C) 작동 시스템: 애플 7. 5. 2
(D) 소프트웨어: 마이크로소프트 버전 6. 0. 1
(vi) 현 출원 자료:
(A) 출원 번호: 양도될 것임
(B) 출원일: 1996년 6월 25일
(C) 분류:
(vii) 우선권 자료:
(A) 출원 번호: US 08/496,632
(B) 출원일: 1995년 6월 29일
(C) 분류:
(vii) 우선권 자료:
(A) 출원 번호: US 08/548,368
(B) 출원일: 1995년 11월 1일
(C) 분류:
(viii) 변호사/대리인 정보:
(A) 이름: 앤더슨, 캐쓰린 에이.
(B) 등록 번호: 32,172
(C) 참고/사건 번호: 2835-WO
(ix) 전신 정보
(A) 전화: (206) 587-0430
(B) 팩스: (206) 233-0644
(C) 텔렉스: 756822
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1751 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 공급원
(B) 클론: huAIC
(ix) 특징
(A) 명칭/키: COS
(B) 위치: 88 . . 933
(xi) 서열 설명:
<서열 1a>
<서열 1b>
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 281 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
<서열 2a>
<서열 2b>
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1521 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 공급원
(B) 클론: huAIC-dv
(ix) 특징
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 78 . . 383
(xi) 서열 설명:
<서열 3a>
<서열 3b>
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 101 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
<서열 4>
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1366 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 공급원
(B) 클론: MuAIC
(ix) 특징
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 47 . . 919
(xi) 서열 설명:
<서열 5a>
<서열 5b>
<서열 5c>
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 291 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
<서열 6a>
<서열 6b>
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 8 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 상관 없음
(D) 토폴로지: 상관 없음
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 공급원
(B) 클론: 플래그(FLAG) 펩티드
(xi) 서열 설명:
<서열 7>
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 17 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 상관 없음
(D) 토폴로지: 상관 없음
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 공급원
(B) 클론: 보존성 펩티드
(xi) 서열 설명:
<서열 8>
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥수: 상관 없음
(D) 토폴로지: 상관 없음
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 공급원
(B) 클론: CMV 리더
(xi) 서열 설명:
<서열 9>

Claims (34)

  1. 서열 2의 아미노산 1 내지 281 및 서열 6의 아미노산 1 내지 291로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 트레일(TRAIL) 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA.
  2. 인간 트레일의 세포외 도메인 (서열 2의 아미노산 39 내지 281)의 아미노산 서열을 가지며, 저켓 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 가용성 트레일 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA.
  3. 서열 2의 아미노산 x 내지 281의 아미노산 서열(여기서, x는 39 내지 95의 정수임)을 가지며, 저캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 가용성 트레일 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 상기 가용성 트레일 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 95 내지 281의 서열을 갖는 것인 DNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
  6. 제5항의 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 트레일의 발현을 증진시키는 조건 하에서 배양하고, 트레일 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 트레일 폴리펩티드의 제조 방법.
  7. 서열 2의 아미노산 1 내지 281 및 서열 6의 아미노산 1 내지 291로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 정제된 트레일 폴리펩티드.
  8. 균주 ATCC 69849로 기탁된 재조합 벡터의 cDNA 삽입에 의해 코딩된 인간 트레일 폴리펩티드.
  9. 인간 트레일의 세포외 도메인 (서열 2의 아미노산 39 내지 281) 의 아미노산 서열을 가지며, 저캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 정제된 가용성 트레일 폴리펩티드.
  10. 서열 2의 아미노산 x 내지 281의 서열(여기서, x는 39 내지 95의 정수임)을 갖고, 저캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 정제된 가용성 트레일 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 서열 2의 아미노산 95 내지 281 서열을 갖는 것인 트레일 폴리펩티드.
  12. 제10항의 가용성 트레일 폴리펩티드 2개 내지 3개를 갖는 올리고머.
  13. 제11항의 가용성 트레일 폴리펩티드 3개를 갖는 트레일 삼량체.
  14. 제7항 또는 제10항의 트레일 단백질과 특이적으로 결합하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항체는 단일클론성 항체인 것인 항체.
  16. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이. 콜리 세포인 방법.
  17. 서열 2의 아미노산 124 내지 276을 가지며, 저캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 가용성 트레일 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA.
  18. 서열 2의 아미노산 x 내지 y (여기서 x는 39 내지 124 이고 y는 276 내지 281의 정수임)을 가지며, 저캣세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 가용성 트레일 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA.
  19. 제17항 또는 제18항에 따른 DNA를 포함하는 발현 벡터
  20. 제19항의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이. 콜리 세포인 형질 전환된 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 발현 벡터가 상기 트레일 폴리펩티드의 N-말단에 융합되는 메티오닌 잔기를 코딩하는 핵산을 추가적으로 갖는 것인, 형질 전환된 숙주 세포.
  23. 제20항에 따른 형질 전환 세포를 트레일의 발현을 증진시키는 조건 하에서 배양하고, 트레일 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 트레일 폴리펩티드의 제조 방법.
  24. 서열 6의 마우스 트레일 단백질의 세포외 도메인 (서열 6의 아미노산 39 내지 291)의 아미노산 서열을 갖는, 암 세포를 살생할 수 있는 정제된 가용성 트레일 폴리펩티드.
  25. 서열 2의 아미노산 124 내지 276을 가지며, 저켓 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 정제된 폴리펩티드.
  26. 서열 2의 아미노산 x 내지 y (여기서 x는 39 내지 124, y는 276 내지 281의 정수임)를 가지며, 저캣 세포의 세포소멸을 유도할 수 있는 정제된 가용성 트레일 폴리펩티드.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 2개 내지 3개를 갖는 올리고머.
  28. 제27항에 있어서, 상기 올리고머는 세 개의 트레일 폴리펩티드를 함유하는 것인 올리고머.
  29. 제7항 내지 제13항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 올리고머 또는 삼량체 및 생리적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 인간의 암 치료용 제약 조성물.
  30. 제7항 내지 제13항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 올리고머 또는 삼량체를 인간을 제외한 포유동물의 암 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 살생방법.
  31. 제5항의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  32. 제22항에 따른 형질 전환 세포를 트레일의 발현을 증진시키는 조건 하에서 배양하고, 트레일 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 트레일 폴리펩티드의 제조 방법.
  33. 제27항에 따른 올리고머 및 생리적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 인간의 암 치료용 제약 조성물.
  34. 제27항에 따른 올리고머를 인간을 제외한 포유 동물의 암 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 살생 방법.
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