TR201809678T4

TR201809678T4 - Opgl ye karşi antikorlar.

Info

Publication number: TR201809678T4
Application number: TR2018/09678T
Authority: TR
Inventors: J Boyle William; H Martin Francis; R Corvalan Jose; C Davis Geoffrey
Original assignee: Amgen Fremont Inc; Amgen Inc
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2018-07-23
Also published as: CY1120658T1; KR101038585B1; EP2295081B1; CY1110196T1; ES2675735T3; JP2020073518A; WO2003002713A3; FR10C0050I1; JP5065529B2; ES2907826T3; US7364736B2; EP2270052A3; EP1409016B1; EP2270052B8; AU2002320157B2; KR20100041797A; CY2010016I2; NZ547695A; PT2087908T; PL222211B1

Abstract

Osteoprotegerin ligandı (OPGL) ile etkileşime geçen antikorlar açıklanmaktadır. Farmasötik olarak etkili bir antikor miktarının, OPGL'ye uygulanması vasıtasıyla osteopenik rahatsızlıkların tedavi edilmesine yönelik yöntemler açıklanmaktadır. OPGL'ye karşı antikorlar kullanarak bir numunede OPGL miktarının tespit edilmesine yönelik yöntemler açıklanmaktadır.

Description

TEKNIK ALAN Mevcut bulus, osteoprotegerin ligand I(OPGL) baglayan antikorlarla ilgilidir. Osteoporoz, artrit, kemik hastallgîkaybîl Paget hastal'gFlve 0steopeni gibi kemik hatallklarlîlül tedavisine yönelik bilesimler ve yöntemler de aç Elanmaktad m. ÖNCEKI TEKNIK Kemik dokusu, vücuda destek saglamaktadE ve mineral (kalsiyum ve fosfor), bir kolajen ve kolajen olmayan protein matrisi ve hücreleri içermektedir. CanlEkemik dokusu, birikme olarak adlandijllan kemik olusumu ve erime olarak adlandiillan kemik yLkLmJaras Lnda dinamik bir denge sergilemektedir. Kemik, osteositler, 0ste0blastlar ve osteoklastlarda bulunan üç hücre türü, bu dengede yer almaktadlr. Osteoblastlar, kemik doku olusumunu artt'n riken, osteoklastlar, rezorpsiyon ile iliskilendirilmektedir. Kemik matrisinin ve mineralin rezorpsiyonu ve çözünmesi, kemik olusumuna kßl'asla hlîlEve etkili bir süreçtir ve kemikten büyük miktarda mineral salabilmektedir. Osteoklastlar, iskelet dokusunun normal yeniden modellenmesinin ve hormonlarla indüklenen rezorpsiyonun regülasyonunda yer almaktadß. Örnegin rezorpsiyon, hücre dßjsîmarda kalsiyum iyonun azalan konsantrasyonlarlîna yani] olarak paratiroid hormonun salgEanmasD ile uyarlmaktadî. Buna kars 51, rezorpsiyonun inhibisyonu, bir kalsitonin islevidir. Ek olarak, D vitamininin metabolitleri, paratiroid hormona ve kalsitonine kars Lkemik tepkisini degistirmektedir.

Rekombinant çözülebilir OPGLanin (“sODF” olarak adlandlnllmaktadlr) bir konsantrasyondan bagînsî sekilde kemik rezorpsiyonunu temin ettigi deneylerden, Tsukii ve meslektaslarlIl OPGUnin (“ODF” olarak adlandEÜlnaktad m), kemik mikroçevresinde kemik rezorpsiyonunda kritik bir rol oynamasjile sonuçlanmßtî Deneyler, OPGL aktivitesinin, osteoprotegerin (“OPGQ “OCIF, olarak adlandEEûnaktadß) veya bir poliklonal anti-ODF antikoru ile inhibe edilebildigini ve OClF ve poliklonal anti-ODF antikorunun, herhangi bir loc, 25- dihidroksivitamin D3, paratiroid hormonu veya prostaglandin Ez ile indüklenen kemik rezorpsiyonunu bloke edebildigini göstermistir (Tsukii, K., ve ark., (1998) Biochem. Biophys.

Res. Comm., 246 : 337-341).

Nagai ve meslektaslard ana malignan dokularn, siddetli humoral hiperkalsemiye yol açtgdüç skuamöz hücreli karsinom hücre dizisinden OPGL,nin (“sODF/TRANCE' olarak adlandnlmaktad 11) bir salgllanm s, C-terminal formunu kodlayan bir yeni CDNA,y| lizole etmistir. Bu kanser hücreleri ile kosullandl'rllmls ortam, insan ODF/TRANCE`lîi hücre dsri alangna özgü tavsan poliklonal antikorla reaksiyona giren proteini içermistir ve bu kosullandîlllnls ortamda kültürlendiginde, HL60 hücreleri (insan promiyeloblastik lösemi hücreleri), osteokast benzeri hücrelere farkUhsmEtE Bu farklüasma, tavsan poliklonal antikoru ile inhibe edilmistir, bu da sODF/TRANCEiß, malignitenin humoral hiperkalsemisinde gelismis kemik rezorpsiyonda önemli bir rol oynadgijgöstermektedir.

Sitokinlerin TNF ailesinin bir eleman Eblan osteoprotegerin ligand (OPGL), NF-KBSHIH reseptör aktivatörüne (RANK, ayn|_| zamanda osteoklast farkllasLiinJ ve aktivasyon reseptörü veya ODAR olarak adlandlrllmaktadlr.) baglanmas | vas tas yla osteoklastlarln olusumunu arttiimaktad n. Öte yandan, osteoprotegerin (OPG), OPGLlyi ay rlarak ve OPGLSnin ODAR ile birlesiinini önleyerek osteoklastlarm olusumunu inhibe etmektedir. Bu sebepten ötürü, ODAR ile birlesik OPGL miktarjkemik birikimi ve rezorpsiyonu aras Eidaki denge ile iliskilidir.

Iskeletin olgunlasmas Eidan sonra, iskelette bulunan kemik miktarü kemik olusumunu ve kemik rezorpsiyonunun dengesini (veya dengesizligini) yans ImaktadE. Zirve kemik kütlesi, kmkßcE yJIlan önce iskelet olgunlasmasîldan sonra olusmaktadî KEkEicDve ellinci yü] arasßda, denge degismektedir ve kemik rezorpsiyonu baskîl gelmektedir. Ilerleyen y]1arda kemik kütlesindeki kaçLijLlmaz azalma, kad nlarda, erkeklerden daha önce baslamaktadij ve bazL kad nlarda (prensip olarak Açlk tenli ve Asya neslinden gelenler) menapozdan sonra belirgin Osteopeni, genellikle kemik kütlesinde, normal seviyelerin alt îia herhangi bir azalma ile iliskili bir kosuldur. Bu tarz bir kosul, kemik sentezi oranEIda bir azalmadan veya kemik yItBiEl oran Eda bir art @tan veya her ikisinden kaynaklanabilmektedir. Yaygîl bir osteopeni formu, postmenopozal ve seni] osteoporoz olarak da adlandiIan birincil osteoporozdur. Bu osteoporoz formu, yasla iliskili evrensel kemik kaybßß bir sonucudur ve genellikle kemik olusumunun normal bir oranüile kemik rezorpsiyonunda artIslîl bir sonucudur. Amerika Birlesik Devletleri°nde birçok beyaz kadlîl, semptomatik osteoporoz gelistirmektedir. 45 yasîlda ve daha yaslükadmlarda osteoporoz ve kalça, femoral, boyun ve intertrokanterik kntljna vakas Laras Lnda dogrudan bir iliski mevcuttur. YaslLJerkekler, 50 ve 70 yaslarLaras nda semptomatik osteoporoz gelistirebilmektedir. Osteoporoz, belirli durumlarda, artan OPGL seviyelerinden veya aktivitesinden sonuçlanabilmektedir. Bu sebepten ötürü, osteoklastogenezde OPGL aktivitesini regüle edebilen moleküllere sahip olmak faydalFl olacaktgn.

Postinenopozal ve senil osteoporoza katkEia bulunabilen bir kaç faktör taniilanmßti.

Yaslanma ile beraber gelen hormon seviyelerinde degisimi ve kalsiyumun ve diger minerallerin azalmg bagEsak emilimine atfedilen yetersiz kalsiyum tüketimini içermektedir. Belirli tedaviler, süreci geciktirmek amacglla hormon tedavisini veya diyet takviyelerini içermistir.

Son zamanlarda, bifosfonatlar ve seçici östrojen reseptörü modifiye edicileri (SERM°ler) gibi anti-rezorptif maddeleri, azaltühiß kemik kütlesinin önlenmesi ve tedavisi için ortaya çRm Et 3.

Bu sebepten ötürü, belirli osteopenik rahatsttlLklaan tedavisinde OPGL aktivitesini regüle edebilen moleküllerle bu tedavilerin birlestirilmesi için kullanlsl. blabilmektedir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulus, istemlere göre tanürilanmaktad ß.

Bulusun belirli yönleri, bir ag& zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadß, burada agi zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2”de belirlenen bir amino asit sekansEiE veya bunlarß bir fragmanEiEiçermektedir ve hafif zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4”te belirlenen bir amino asit sekansnLt/eya bunlarn bir fragmanLnLiçermektedir.

Bulusun belirli yönleri, bir aglr zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadlr, burada agri zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3”te belirlenen bir amino asit sekansml' veya bunun bir fragmanîljiçeren bir degisken bölgeyi içermektedir ve burada hafif zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l4ate belirlenen bir amino asit sekansmüveya bunun bir fragman 3 :Içeren bir degisken bölgeyi içermektedir.

Bulusun belirli yönleri, bir ag& zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadlî, burada agi zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2°de belirlenen bir amino asit sekansElE veya bunun bir fragmannjçermektedir.

Bulusun belirli yönleri, bir aglr zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadlr, burada agîl zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3”te belirlenen bir amino asit sekansml' veya bunun bir fragman n' içeren bir degisken bölgeyi içermektedir.

Bulusun belirli yönleri, bir aglI zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadE, burada hafif zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4,te belirlenen bir amino asit sekansEIE veya bunun bir fragmanijçermektedir.

Bulusun belirli yönleri, bir ag& zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadE, burada hafif zincir, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14”te belirlenen bir amino asit sekanslIiE veya bunun bir fragmanndçeren bir degisken bölgeyi içermektedir.

Bulusun belirli yönleri, bir agln zinciri ve bir hafif zinciri içeren bir antikoru saglamaktadln, (a) burada agT zincir, bir birinci degisken bölgeyi içermektedir ve burada birinci degisken bölgeyi, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13,te belirlenen amino asit sekansßa en az %90 benzerlige sahip olan bir sekansjiçermektedir ve (b) burada hafif zincir, bir ikinci degisken bölgeyi içermektedir ve burada ikinci degisken bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l4”te belirlenen amino asit sekans Ba en az %90 benzerlige sahip olan bir sekans Eiçerrnektedir ve (c) antikor, bir osteoprotegerin ligand (OPGL) ile etkilesime geçmektedir.

Bu tarz belirli yönlere göre, birinci degisken bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13”te belirlenen amino asit sekanslna en az %95 özdeslige sahip olan bir sekansl liçermektedir ve ikinci degisken bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l4”te belirlenen amino asit sekansna en az %95 özdeslige sahip olan bir sekans-Içermektedir.

Bu tarz belirli yönlere göre, birinci degisken bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3”te belirlenen amino asit sekansEla en az %99 özdeslige sahip olan bir sekansDiçermektedir ve ikinci degisken bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14,te belirlenen amino asit sekans Ea en az %99 özdeslige sahip olan bir sekans içermektedir.

Bulusun belirli yönleri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2”de belirlenen bir amino asit sekansîljveya bunun bir fragmanEiEiçeren bir ag& zinciri saglamaktadß. Bulusun belirli yönleri, bir degisken bölgeyi ve bir sabit bölgeyi içeren bir agu zinciri saglamaktadii, burada degisken bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13ite belirlenen bir amino asit sekanslnl | veya bunun bir fragman n içermektedir.

Bulusun belirli yönleri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2”de belirlenen bir amino asit sekansîlîveya bunun bir fragmanîlîiçeren bir hafif zinciri saglamaktadlî. Bulusun belirli yönleri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l4,te belirlenen bir amino asit sekansEiEveya bunun bir fragman 3 :içeren bir hafif zinciri saglamaktad E.

Bulusun belirli yönlerinde, tek zincirli antikorlarüsaglanmaktad B. Bulusun belirli yönlerinde, tek zincirli FV antikorlarü saglanmaktadm Bulusun belirli yönlerinde, Fab antikorlarü saglanmaktadi Bulusun belirli yönlerinde, Fab” antikorlarjsaglanmaktadlî. Bulusun belirli yönlerinde, (Fab , )2 antikorlar _Baglanmaktad Lt.

Bulusun belirli yönlerinde, bulusun bir antikoru içeren farmasötik bir bilesim saglanmaktadln.

Bulusun belirli yönlerinde, bulusun OPGL”ye karsl`bir antikorunu içeren bir farmasötik bilesim saglanmaktad i.

Bulusun belirli yönlerinde, bir farmasötik bilesim, OPGLSye kars Jbir antikoru ve bir kemik morfojenik faktöründen, dönüstürücü büyüme faktörü-ß*dan (TGF-ß), bir interlökin-l (IL-1) inhibitöründen, lL-lra KineretTWden, bir TNFOL inhibitöründen, bir çözülebilir TNFOL reseptöründen, EnbrelTM, bir anti-TNFa antikorundan, RemicadeTM, D2E7 antikorundan, bir paratiroid hormonundan, bir paratiroid hormonunun bir analogundan, bir paratiroid hormonu ile iliskili proteinden, bir paratiroid hormonu ile iliskili bir proteinin bir analogundan, bir prostaglandinden, bir bifosfonattan, bir alendronattan, florürden, kalsiyumdan, bir steroidal olmayan anti-inflamatuvar ilaçtan (NSAID), bir COX-Z inhibitöründen CelebrexTM, VioxxTM; bir immünosüpresandan, metotreksattan, leIlumidden, bir serin proteaz inhibitöründen, bir salgmayßjlökosit proteaz inhibitöründen (SLPI), bir lL-6 inhibitöründen, IL-6,ya kars jbir antikordan, bir IL-8 inhibitöründen, lL-8°e karsîlbir antikordan, bir IL-18 inhibitöründen, bir modülatöründen, bir fibroblast büyüme faktöründen (FGF), bir FGF modülatöründen, bir PAF antagonistinden, bir keratinosit büyüme faktöründen (KGF), bir KGF ile iliskili bir molekülden, bir KGF modülatöründen; bir matris metaloproteinaz (MMP) modülatöründen, bir nitrik oksit sintaz (NOS) modülatöründen, glukokortikoid reseptörünün bir modülatöründen, glutamat reseptörünün bir modülatöründen, bir lipopolisakkarit (LPS) seviyelerinin bir modülatöründen, bir nöradrenalinden, bir nöradrenalin mimetiginden ve bir nöroadrenalin modülatöründen seçilen en az bir terapötik maddeyi içermektedir.

Bulusun belirli yönlerinde, bir osteopenik rahatslZllgln tedavisine yönelik olan, bir antikorun farmasötik olarak etkili bir miktariilîi uygulanmasîiîl içeren bir yöntem saglanmaktadlî'.

Bulusun belirli yönlerinde, bir 0ste0penik rahats @Egil tedavisine yönelik olan, bir farmasötik bilesimin uygulanmaslîlîiçeren bir yöntem saglanmaktad E.

Bulusun belirli yönlerinde, bir hastada kemik kaybßa eslik eden bir inflamatuvar kosulun tedavisine yönelik olan, bir farmasötik bilesimin uygulanmasEiE içeren bir yöntem saglanmaktad E.

Bulusun belirli yönlerinde, bir hastada kemik kayb da eslik eden bir otoimmün kosulun tedavisine yönelik olan, bir farmasötik bilesimin uygulanmasln liçeren bir yöntem saglanmaktad TL Bulusun belirli yönlerinde, bir hastada romatoid artrit tedavisine yönelik olan, bulusun bir farmasötik bilesiminin uygulanmasß :içeren bir yöntem saglanmaktad ß.

Bulusun belirli yönlerinde, bir biyolojik numunede OPGL seviyesinin tespit edilmesine yönelik olan, bir antikorla numunenin temasa geçirilmesini içeren bir yöntem saglanmaktad E.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, dOPGL-l antikor agLij zincirini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1) kodlayan bir cDNA sekans i göstermektedir.

Sekil 2, &OPGL-l antikor aglri zincirinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) amino asit sekansmEgöstermektedir.

Sekil 3, OtOPGL-l antikor hafif zincirini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) kodlayan bir cDNA sekans Il jgöstermektedir.

Sekil 4, &OPGL-1 antikor hafif zincirinin (SEKANS KIMLIK NUMARASl: 4) amino asit sekans ß [göstermektedir Sekil 5, uOPGL-l kappa hafif zincir ekspresyon plazmidinin (aOPGL-l-Kappa/pDSRa19) bir sematik diyagram ri göstermektedir.

Sekil 6, ocOPGL-l IgG2 agn zincir ekspresyon plazmidinin (ocOPGL-l-IgGZ/pDSRa19) bir sematik diyagramEi :göstermektedir Sekil 7, OPGL-kapll EIA plakalarlna &OPGL-1 ,in doza baglml. baglantlsllnl l göstermektedir.

Sekil 8, membrana baglü OPGL”ye &OPGL-Pin spesifik baglantgij göstermektedir.

Sekil 9, çözülebilir OPGL ile OPGL-kaplE EIA plakalarEia baglanan orOPGL-l ,in inhibisyonunu göstermektedir.

Sekil 10, OPGL-kaplJEIA plakalaana &OPGL-I`m spesifik baglantleLnLl göstermektedir.

Sekil 11, OLOPGL-l ile osteoklast olusumunun doza baglml linhibisyonunu göstermektedir.

Sekil 12, OtOPGL-l ile ODAR”a OPGL baglantßiß doza bagEnlJ inhibisyonunu göstermektedir.

Sekil 13, Sinomolgus Maymunlara &OPGL-Fin tek bir dozunun uygulanmas ndan sonra ortalama serum konsantrasyon süresi profillerini göstermektedir.

Sekil 14, Sinomolgus Maymunlara &OPGL-Fin tek bir dozunun uygulanmas ndan sonra serum N-Tx konsantrasyonunda ortalama yüzde degisimini göstermektedir.

Sekil 15, Sinomolgus Maymunlara &OPGL-1,111 tek bir dozunun uygulanmas ndan sonra ürin N-Tx konsantrasyonunda ortalama yüzde degisimini göstermektedir.

Sekil 16, Sinoinolgus Maymunlara &OPGL-Pin tek bir dozunun uygulanmas ndan sonra antikor pozitif ve negatif serum-konsantrasyon süre profillerini göstermektedir.

Sekil 17, OtOPGL-l antikor ag& Zincirli degisken bölgenin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13) amino asit sekans ri göstermektedir.

Sekil 18, ocOPGL-l antikor hafif Zincirli degisken bölgenin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14) amino asit sekansîiîgöstermektedir.

Sekil 19, OLOPGL-l ,in üretimine yönelik bir hücre kültürü sürecini göstermektedir.

Sekil 20, Sinomolgus Maymunlara (xOPGL-liin tek bir dozunun uygulanmas Iidan sonra ürin serum kalsiyumun yüzde degisimini göstermektedir.

Sekil 21, Sinoinolgus Maymunlara OLOPGL-liin tek bir dozunun uygulanmas îldan sonra ortalama serum Alkalin Fosfataz yüzde degisimini göstermektedir.

AYRINTILI AÇIKLAMA Burada kullanilan bölüm basliklarl sadece düzenleyici amaçlarl teskil etmektedir ve tarif edilen ana konuyu k E [Illay B Eblarak olusturulmayacakt E.

Tan Ellar Standart teknikler, rekombinant DNA, oligonükleotid sentezi ve doku kültürü ve transformasyonu (ör. elektroporasyon, lipofeksiyon) için kullanlhbilmektedir. Enzimatik reaksiyonlar ve satlastîma teknikleri, teknikte ortak bir sekilde tamamlandfgüveya burada tariI` edildigi üzere imalatçlnln tarifnamelerine göre uygulanabilmektedir. Teknikler ve prosedürler genellikle teknikte bilinen geleneksel yöntemlere göre ve mevcut tarifname boyunca allntl ` yapilan ve açlklanan çesitli genel ve daha spesifik referanslarda aç'ltlandlg | gibi uygulanabilmektedir. Bkz. Örn. Sambrook ve ark. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Spesifik tan Bilar saglanmadüîça, analitik kimya, sentetik organik kimya ve tBbi ve farmasötik kimya ile baglantmE olarak kullanman numaralandmma ve laboratuvar prosedürleri ve teknikleri, teknikte uzman kisiler tarafEidan iyi bilinenler ve teknikte yaygîl olarak kullanEIanlardm Kimyasal sentezler, kimyasal analizler, farmasötik preparasyon, formülasyon ve iletim ve hastalarîl tedavisi için standart teknikler kullan Jhbilmektedir.

Mevcut bulusla uyumlu bir sekilde kullanlldlg tüzere, asagidaki terimler, aksi belirtilmedikçe, asag daki anlamlara gelecek sekilde anlasllacaktlr: Burada kullan 1d g lüzere, “izole polinükleotid” terimi, “izole polinükleotidin” kaynagl yardiigtla (1) “izole polinükleotidinin” dogada bulundugu bir polinükleotidin tümü veya bir bölümü ile iliskilendirilmeyen, (2) dogada bagljolmayan bir polinükleotide islevsel olarak bagljolan veya (3) daha genis bir sekansi bir bölümü olarak dogada olusmayan genomik, cDNA veya sentetik kaynag :lveya bunlari baz jçombinasyonlar :anlam îla gelecektir.

Burada ifade edilen “izole protein” terimi, cDNA, rekombinant RNA veya sentetik kaynak veya bunlarîl belirli bir kombinasyonu ile kodlanan, (1) normalde bulunacak olan en azEidan bazJproteinleri içermeyen, (2) esasen, örnegin aynLtürde aynldkaynaktan gelen diger proteini içermeyen, (3) farkli bir türden gelen bir hücre ile eksprese edilen veya (4) dogada olmayan bir protein anlamlna gelmektedir. asidin delesyonuna, eklentisine ve/veya ikamesine sahip olan sekanslarFifade edecek sekilde jenerik bir terim olarak kullanilmaktad ri. “Polipeptit” terimi aynl zamanda, orOPGL-l'i (asaglzla açEklandEgE üzere, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4) veya dOPGL-Hn bir veya birden fazla amino asidinin delesyonuna, eklentisine ve/veya ikamesine sahip olan sekanslarjkapsamaktadm. Bulusun belirli yönleri, Sekil 2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) ile temsil edilen insan aglî Zincirli immünoglobulin molekülü ve Sekil 4 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4) ile temsil edilen insan hafif zincirli immünoglobulin molekülü veya bunlarln fragmanlarlnl veya analoglarlnl içermektedir.

Burada bir nesneye uygulandgjgibi kullanlIan “dogal yollarla olusan” terimi, bir nesnenin, dogada bulunabildigi gerçegini ifade etmektedir. Örnegin, dogadaki bir kaynaktan izole edilebilen ve laboratuvarda veya baska bir yerde bir kisi tarafidan kasmlü olarak degistirilmemis olan bir organizmada (virüsleri içermektedir) mevcut olan bir polipeptit veya polinükleotid sekans ü dogal yollarla olusmaktad 3.

Burada kullanLIan “islevsel olarak baglj terimi, amaçlanan sekilde bunlarn islev göstermelerine izin verilen bir iliskide olan bilesenleri ifade etmektedir. Örnegin, bir kodlama sekans na “islevsel olarak bagl bir kontrol sekans ,l kodlama sekanslnln ekspresyonuna, kontrol sekanslarîle uyumlu olan kosullar altîida ulasfld `gl-Sekilde baglanmaktad lî'.

Burada kullan Jan “kontrol sekansE' terimi, bagland [klar [kodlama sekanslarlIiEi ekspresyonunu ve islenmesini etkileyebilen polinükleotid sekanslarßEifade etmektedir. Bu tarz kontrol sekanslariîl yapE] konak organizmaya baglj olarak farklEEk gösterebilmektedir.

Prokaryotlarîl kontrol sekanslargl promoteri, ribozomal baglantjbölgesini ve transkripsiyon sonlandßma sekansElE içerebilmektedir; ökaryotlarß kontrol sekanslarj promoterleri ve transkripsiyon sonlandîma sekansEiüiçerebilmektedir; “kontrol sekanslarEl, öncü sekanslarE ve/veya füzyon ortak sekanslarîl :içerebilmektedir.

Burada ifade edilen “polinükleotid” terimi, en az 10 baz uzunlugunda olan nükleotidlerin bir polimerik formu anlamlna gelmektedir; bazlar, ribonükleotidler veya deoksiribonükleotidler olabilmektedir veya her iki türde nükleotidin modifiye edilmis bir formu olabilmektedir. Terim, DNA”n|n tek ve çift sarmalll formlarln` içermektedir.

Burada ifade edilen “oligonükleotid terimi”, dogal yollarla olusan ve dogal yollarla olusan ve dogal yollarla olusmayan oligonükleotid baglantührüile birlikte baglanan modifiye edilmis nükleotidleri içermektedir. Oligonükleotidler, genellikle 200 baz veya daha az bir uzunlugu içeren bir polinükleotid alt kümesidir. Bu bulusun belirli yönlerinde, oligonükleotidler, 10 ila uzunlugundadi Oligonükleotidler, örnegin bir gen mutantmß yaplIslIida kullanEh için tek sarmal veya çift sarmal olabilmektedir. Burada tarif edilen oligonükleotidler, yolcu veya rehber oligonükleotidleri olabilmektedir. içermektedir. Burada ifade edilen “modifiye edilmis nükleotidler” terimi, modifiye edilmis veya ikame edilmis seker gruplarEia ve benzerine sahip nükleotidleri içermektedir. fosrodiselenoat, fosforoanilotiyoat, fosfoiladadat, fosforoamElat ve benzerleri gibi oligonükleotidlerin baglantEarElDiçermektedir. Bkz. örn. LaPlanche ve ark. Nucl. Acids Res.

Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Bir oligonükleotid, tespite yönelik bir isareti içerebilmektedir.

Iliskili polipeptitlerin özdesligi ve benzerligi hali hazBda bilinen yöntemlerle hesaplanabilmektedir. Bu yöntemler, kßmayßüolmayacak eskilde Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York ( referanslnda açlklananlarl içermektedir. Özdesligin belirlenmesi için tercih edilen yöntemler, test edilen iki sekans aras ridaki en büyük eslesmenin saglanmasFliçin tasarlanmaktadlîl. Özdesligin belirlenmesine yönelik yöntemler, kamusal olarak mevcut bilgisayar programlarßda açiklanmaktadi. Iki sekans arasEidaki özdesligin belirlenmesi için tercih edilen bilgisayar programDyöntemleri, kEIllayßjolmayacak sekilde GAP (Devereux ve ark., Nucl. Acid. Res., 12387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN ve FASTA (Altschul ve ark., J. program] Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezinden (NCBI) ve diger kaynaklardan (BLAST Manual, Altschul ve ark. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul ve ark., supra (1990)) kamusal olarak elde edilebilmektedir. Iyi bilinen Smith Waterman algoritmasl ayril . zamanda özdesligi belirlemek için kullanllabilmektedir.

Iki amino asit sekansEiEl hizalanmasßa yönelik belirli hizalama semalar] iki sekansEi sadece kßa bir bölgesinin eslestirilmesi ile sonuçlanabilmektedir ve bu küçük hizalübölge, iki tam uzunluga sahip sekans aras &da önemli bir fark olmamas ßa ragmen, oldukça yüksek bir sekans benzerligine sahip olabilmektedir. DolayßS/la, seçilen hizalama yöntemi (GAP programijl, hedef polipeptidinin en az 50 bitisik amino asidini kapsayan bir hizalama ile sonuçlanabilecektir. Örnegin, bilgisayar algoritmasl |(GAP) (Genetics Computer Group, Wisconsin Üniversitesi, Madison, WI) kullanllarak, sekans yüzdesi özdesliginin belirlenecegi iki polipeptit, ilgili amino asitlerin optimal eslesmesi (algoritma ile belirlendigi üzere, “eslesmis aç 1111195) için hizalanmaktad E. Burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yapIandlImalarda, bir bosluk açma cezas 3(3X ortalama kösegen olarak hesaplanmaktadi; “ortalama kösegen”, kullanühn kSlaslama matrisinin kösegeninin ortalamasii; “kösegen”, özel kßlaslama matrisi ile eslesen her bir mükemmel amino aside atanan skor veya sayüi) ve bir bosluk uzatma cezasü (genellikle bosluk açma cezaslîiß 1/10 katElE) ve aynüzamanda PAM 250 veya BLOSUM 62 gibi bir kSlaslama matrisi, algoritma ile baglantJJD olarak kullanElabilmektedir. Belirli yap landimalarda, burada tarif edilen ve/veya talep edilen standart bir kßjaslama matrisi (bkz.

PAM 250 kglaslama matrisine yönelik Dayhoff ve ark., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978); BLOSUM 62 kyaslama matrisine yönelik Henikoff ve ark., Proc. Natl.

Bir polipeptit sekans kýaslamas ila yönelik parametreler, asaglîlakileri içerebilmektedir: Kßlaslama matrisi: Henikoff ve ark., supra (1992) referans Eidan BLOSUM 62; Bosluk Cezasü 12 Bosluk Uzunlugu Cezasü4 Benzerlik Esigi: O GAP programü yukarmaki parametrelerle kullanßlEolabilmektedir. Belirli yap Ühndîlmalarda, yukarLda bahsi geçen parametreler, GAP algoritmasLlkullanLlarak polipeptit kyaslamalartna (bitis bosluklarl için herhangi bir ceza olmadan) yönelik varsayllan parametrelerdir.

Burada kullanTldg'îüzere, yirmi geleneksel amino asit ve bunlarlîi szaltmalarlI geleneksel kullaniiütakip etmektedir. Bkz. lmmunology--A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D.

R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Yirmi geleneksel amino asidin stereo izomerleri (ör. D-amino asitleri), u-, a-ikame edilmemis amino asitler, N-alkil amino asitler, laktik asit gibi dogal olmayan amino asitler ve diger geleneksel olmayan amino asitler de burada tarif edilen ve/veya talep edilen polipeptitlerin uygun bilesenleri olabilmektedir.

Geleneksel olmayan amino asitlerin örnekleri, asagElakileri içennektedir: 4-hidr0ksiprolin, y- karboksiglütamat, s-N, N, N-trimetillizin, s-N-asetillisin, O-fosfoserin, N-asetilserin, N- formilmetiyonin, 3-metilhistidin, 5-hidr0ksilisin, a-N-inetilarginin ve diger benzer amino asitler ve imino asitler (örn. 4-hidr0ksiprolin). Burada kullanilan polipeptit notasyonunda, standart kullanimla ve düzenekle uyumlu bir sekilde sol yön, amino terminal yönüdür ve sag yön, karboksil-terminal yönüdür.

Benzer bir sekilde, aksi belirtilmedikçe, tek sarmal polinükleotid sekanslarîi sol ucu, 5”- uçtur; çift sarmal polinükleotid sekanslarßß sol tarafta bulunan yönü, 5° yönü olarak ifade edilmektedir. Yeni RNA transkriptlerinin 5” ila 3, eklentisinin dogrultusu, transkripsiyon yönü olarak ifade edilmektedir; RNA ile ayn Esekansa sahip olan ve RNA transkriptinin 57 ila 5' ucu10 olan DNA sarmal Jüzerinde bulunan sekans bölgeleri, “yukarüyönde sekanslar” olarak ifade edilmektedir; RNA ile aynEsekansa sahip olan ve RNA transkriptinin 3, ila 3” ucu olan DNA sarmal Jjzerinde bulunan sekans bölgeleri, “asagLyönde sekanslar” olarak ifade edilmektedir.

Koruyucu amino asit ikameleri, tipik olarak biyolojik sistemlerde sentezle vasltaslyla olmasîidan ziyade kimyasal peptit sentezi vaslfaslýla dahil edilen dogal yollarla olusmayan amino asit kallntllarlnl l kapsayabilmektedir. Bunlar, peptidomimetikleri ve amino asit parçalarîi îl diger tersine çevrilmis veya slîlas _degistirilmis formlarlîilîçermektedir.

Dogal yollarla olusan kalmtîar, yaygEi yan zincir özelliklerine baglj olarak sEiEflara bölünebilmektedir: 1)hidr0f0bik: nörlösin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2)nötr hidroIilik: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3)asidik: Asp, Glu; 4)bazik: His, Lys, Arg; )zincir yönlendirmesini etkileyen kal ßtüar: Gly, Pro; and 6)aromatik: Trp, Tyr, Phe. Örnegin, tutucu olmayan ikameler, bir diger süîßtan bir elemanEi bu sEiEflarEidan bir tanesinin bir elemanijLn dönüsümünü içerebilmektedir. Bu tarz ikame edilmis kal LntLlar, insan olmayan antikorlarla homolog olan insan antikorunun bölgelerine veya molekülün homolog olmayan bölgelerine dahil edilebilmektedir.

Bu tarz degisikliklerin yapîhîlda, amino asitlerin hidropatik endeksi göz önünde bulundurulabilmektedir. Her bir amino aside, hidrofobisite ve yük özelliklerinin temelindeki bir hidropatik endeks atanmßitîl Bunlar: Izolösin (+4.5); Valin (+4.2); Lösin (+38); Fenilalanin Bir proteinde interaktif biyolojik isleve danlSllmaslnda hidropatik amino asit endeksinin önemli amino asitlerin, benzer bir hidropatik endekse veya skora sahip olan diger amino asitler için ikame edilebildigi ve hala, benzer bir biyolojik aktiviteyi tutabildigi bilinmektedir. Hidropatik endeksin esas nda degisikliklerin olusturulmasiida, burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yap land limalarda, hidropatik endekslerin 62 içerisinde oldugu amino asitlerin ikamesi dahil edilmektedir. Burada tarif edilen ve/Veya talep edilen belirli yapllandlrmalarda, ±l içerisinde bulunanlar dahil edilebilmektedir ve burada tarif edilen ve/Veya talep edilen belirli yapilandînmalarda, ±0.5 içerisinde bulunanlar dahil edilebilmektedir.

Bunun yanElsEa, benzer amino asitlerin ikamesinin, özellikle biyolojik olarak islevsel proteinin veya bu sekilde olusturulan peptidin, mevcut durumda oldugu gibi immünolojik yap land Emalarda kullanEnD için amaçlandEgE hidrofilisite emelinde etkili bir sekilde olusturulabilmektedir. Belirli yönlere göre, bitisik amino asitlerinin hidrofilisitesi ile kapsandgj gibi bir proteinin en büyük lokal ortalama hidrofilisitesi, immunojenesite ve antigenisit ile, bir baska ifadeyle proteinin bir biyolojik özelligi ile ilgilidir.

Asag daki hidrofilisite degerleri, bu amino asit kallntllarlna atanm Stlrl: arjinin (+30); lisin 3.4). Benzer hidrofilisite degerlerinin esasEida degisikliklerin olusturulmasßda, burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yapüandmmalarda, hidrofilisite degerlerinin ±2 içerisinde oldugu amino asitlerin ikamesi dahil edilebilmektedir, ±1 içerisinde olanlar dahil edilebilmektedir veya, ±0.5 içerisinde olanlar dahil edilebilmektedir. Bir kisi, hidrofilisite temelinde birincil amino asit sekanslartndan epitoplarL tanLmlayabilmektedir. Bu bölgeler ayr da “epitopik çekirdek bölgeler” olarak da ifade edilmektedir. Örnek teskil eden koruyucu amino asit ikameleri, Tablo llde belirlenmektedir.

Tablo 1: Amino Asit Orijinal Örnek Teskil Eden Tercih Edilen Ala Val, Leu, Ile Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Cys Ser, Ala Ser Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg Leu Norlösin, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, 1,4 Diamino-butirik Asit, Arg Met Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu Ser Thr, Ala, Cys Thr Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norlösin Leu Teknikte uzman bir kisi, burada iyi bilinen teknikler kullanilarak belirlendigi gibi polipeptidin uygun varyantlarini lbelirleyebilecektir. Teknikte uzman kisi, aktivite için öneinli olduguna inan lrnayan bölgelerin hedef haline getirilmesi ile aktivite yok edilmeden degistirilebilen molekülün uygun alanlari]Hbelirleyebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, bir kisi, benzer polipeptitlerin arasEida korunan moleküllerin kalEitEIarEiE ve bölümlerini belirleyebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, biyolojik aktivite veya yapjiçin Önemli olabilen alanlar bile, biyolojik aktiviteyi yok etmeksizin veya polipeptit yapßiîblumsuz olarak etkilemeksizin koruyucu amino asit ikamelerine tabi olabilmektedir.

Ek olarak, teknikte uzman bir kisi, aktivite veya yapEiçin önemli olan benzer polipeptitlerde bulunan kalintilari `belirleyen yap-ifonksiyon çalismalarini inceleyebilmektedir. Bu tarz bir k yaslamanin isiginda, bir kisi, benzer proteinlerde aktivite veya yap iaçisindan önemli olan amino asit kalintilarina tekabül eden bir proteinde amino asit kalintilarn n önemini tahmin edebilmektedir. Teknikte uzman kisi, bu tarz tahmin edilen önemli amino asit kalmtilarmm kimyasal olarak benzer amino asit kal îit JhriEtercih edebilmektedir.

Teknikte uzman bir kisi, benzer polipeptitlerde bulunan yapiSIla ilgili üç boyutlu yapSijve amino asit sekansßüanaliz edebilmektedir. Bu tarz bilgilerin @gidau teknikte uzman bir kisi, üç boyutlu yapßia göre bir antikorun amino asit kalßtilarßß hizalanmasßE tahmin edebilmektedir. Teknikte uzman kisi, bu tarz kal Et Jhr diger moleküllerle önemli etkilesimlerin içerisine dahil edilebildikleri için, proteinin yüzeyinde tahmin edilecek olan amino asit kal ntlarlna radikal degisikliklerin olusturulmamasLrldseçebilmektedir. Dahasdteknikte uzman kisi, her bir istenilen amino asit kalntsnda tek bir amino asit ikamesini içeren test varyantlar 11 l olusturabilmektedir. Varyantlar, teknikte uzman kisilerce bilinen aktivite deneyleri kullanilarak görüntülenebilmektedir. Bu tarz varyantlar, uygun varyantlar hakk ilda olan bilgilerin bir araya getirilmesi için kullanllabilmektedir. Örnegin, birisinin, belirli bir amino asit kal lîithlîia yapFIan bir degisimin, yok edilmis, arzu edilmeyecek sekilde azaltütns uygun olmayan aktivite ile sonuçlanmasjhalinde, bu tarz bir degisimi kapsayan varyantlar önlenebilmektedir. Bir baska ifadeyle, bu tarz rutin deneylerden bir araya getirilen bilgilerin esasida, teknikte uzman kisi hali hazEda diger ikamelerin tek baslarüia veya diger mutasyonlarla kombinasyon halinde engellenmesi gerektigi amino asitleri belirleyebilmektedir.

Belirli sayßa bilimsel yay îhlar, ikincil yapîllîl tahminine adanmßtß. Bkz. Moult J., Curr. Op. yardiicjolmasjiçin bilgisayar programlarütemin edilebilmektedir. Ikinci] yapüllîl tahmin edilmesine dair bir yöntem, homoloji modellemesine dayanmaktadlî. Örnegin, %30”dan daha büyük bir sekans özdesligine veya %40,dan daha büyük bir benzerlige sahip olan iki polipeptit veya protein, benzer yapEsal topolojilere sahiptir. Protein yapßal veri tabanßß (PDB) son zamanlarda olan büyümesi, polipeptit veya protein yapßüiçerisinde potansiyel kat sayßEsahil olmak üzere, ikincil yapßi gelismis tahmin edilebilirligini saglamßtî Bkz. Holm ve ark., bir kN'rlm n mevcut olmasl lve önemli saylda yap lar çözüldügünde, yap slal öngörünün çarpldl l olarak daha dogru hale gelecegi önerilmistir (Brenner ve ark., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369- 376 (1997)).

Ikincil yaptim öngöiülmesine dair ek yöntemler, “baglantlýî (Jones, D., Curr. Opin. Struct. baglantStZl (bkz. Holm, supra (1999) ve Brenner, supra (1997)) içermektedir.

Burada tarif belirli yönlerde, antikor varyantlarj glikosilasyon alanEiEi sayßîlî ve/veya türünün, ana bir polipeptitin amino asit sekanslartna klyasla degistirildigi glikosilasyon varyantlar n liçermektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, protein varyantlarl,| natif proteinden daha fazla veya daha az saylda N-bagll glikosilasyon alanlar ni içermektedir. Bir N- baglîglikosilasyon bölgesi, asagîlaki sekansla karakterize edilmektedir: Asn-X-Ser veya Asn- X-Thr, burada X olarak tasarlanan amino asit kallntlsuprolin haricinde herhangi bir amino asit kal îitî`blabilmektedir. Bu sekansîl olusturulmasma yönelik amino asit kal mtttarmiri ikamesi, bir N-baglükarbonhidrat zincirinin eklentisi için potansiyel yeni bir bölgesini saglamaktadm Alternatif olarak, bu sekansE elimine eden ikameler, N-baglE karbonhidrat zincirinin var olmasijortadan kaldEacaktE. Bunun yan DsEa, bir veya birden fazla N-bagljglikosilasyon alanii (tipik olarak dogal yollarla olusanlar) elimine edildigi ve bir veya birden fazla yeni N- baglj alanEl olusturuldugu N-baglE karbonhidrat zincirlerinin tekrardan bir düzenlenmesi saglanmaktadi Ek tercih edilen antikor varyantlar] bir veya birden fazla sistein kal Eltâlîllîl, ana amino asit kal ntslna klyasla bir diger amino asitten (ör. serin) silindigi veya bir diger amino asit için ikame edildigi sistein varyantlarn. liçermektedir. Antikorlar, çözülmeyen inlüzyon korlar n n izolasyonundan sonraslnda oldugu gibi, biyolojik olarak aktif bir uygunluga tekrardan katlanmak durumunda oldugunda, sistein varyantlafkullan lêll'blabilmektedir. Sistein varyantlarj genellikle natif proteinden daha az sistein kal EitlîsEia sahiptir ve genellikle eslesmemis sisteinlerden ortaya clan etkilesimleri minimize etmesi için esit bir say [Sa sahiptir.

Amino asit ikameleri: (1) proteolize olan duyarlmlgüazaltan, (2) oksidasyona olan duyarlmlgü azaltan, (3) protein komplekslerinin olusturulmasEiçin baglayßüaff'initeyi degistiren, (4) baglayîljaffiniteleri degistiren ve/veya (4) bu tarz polipeptitlerde diger fizyokimyasal veya islevsel özellikleri sunan veya degistiren ikameler olabilmektedirler. Tek veya çok sayda amino asit ikamesi (koruyucu amino asit ikameleri içerebilmektedir), dogal yollarla olusan sekansta (moleküller arasl temaslarl olusturan alanlarln dlslnda bulunan polipeptit bölümü dahil) olusturulabilmektedir. Bir koruyucu amino asit ikamesi terimi, tipik olarak ana sekanslîi yap Ea] özelliklerini büyük ölçüde degistirmemelidir (Ör. bir yedek amino asidin, ana sekansta olusan bir sarmal :koparmaya veya ana sekans :karakterize edilen ikincil yapmß diger türlerini bozmaya meyilli olmalîli). Teknikte bilinen polipeptit ikincil ve üçüncül yap Itir& örnekleri, Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland tarif edilmektedir.

Burada kullanilan “polipeptit fragman”, bir amino terminal ve/Veya karboksi terminal delesyona sahip olan bir polipeptidi ifade etmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlere göre, fragmanlar, en az 5 ila 467 amino asit uzunlugundadlîl, burada tarif edilen belirli yönlere göre, amino asit uzunlugundad TL Peptit analoglar genellikle sablon peptidinkilere analog olan özelliklere sahip peptit olmayan ilaçlar olarak farmasötik endüstrisinde kullanEünaktadE. Bu peptit olmayan bilesik türleri, Drug Res. ; ve Evans ve ark. J. Med. yardmyla gelistirilmektedir. YapLsal olarak terapötik olarak kullanLSlUpeptitlere benzer olan peptit mimetikleri, benzer bir terapötik veya profilaktik etkinin üretilmesi için kullan labilmektedir. Genellikle peptidomimetikler, insan antikoru gibi bir paradigma polipeptidine (ör. biyo kimyasal bir özellige veya farmakolojik aktiviteye sahip olan bir polipeptit) yapßal olarak benzerdir, fakat teknikte iyi bilinen yöntemler ile --CHzNH--, -- CHZS--, --CHz-CH2--, --CH=CH-(cis ve trans), --COCH2 --, --CH(OH)CH2-- ve --CH280--'dan olusan gruptan seçilen bir baglantlile tercihe baglEolarak degistirilen bir veya birden fazla peptit baglantßßa sahiptir. Aynjtürde bir D amino asit (ör. L-lizin yerine D-lizin) ile bir konsensüs sekansîlEl bir veya birden fazla amino asidinin sistematik ikamesi, daha stabil proteinlerin üretilmesi için belirli yönlerde kullanIabilmektedir. Ek olarak, bir konsensüs sekans Jveya büyük ölçüde benzer konsensüs sekans varyantLnLiçeren stnlrleeptitler, örnegin peptidi siklize eden intramoleküler disülfit köprülerini olusturabilen dahili sistein kal nt lar 11 l ekleyerek, teknikte (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)) bilinen yöntemler ile üretilebilmektedir. bozulmamß antikorla mücadele eden bir baglantüfragmanEiEifade etmektedir. Belirli yönlerde, baglant Jfragmanlarjrekombinant DNA teknikleri ile üretilmektedir. Belirli yönlerde, baglantü fragmanlar] bozulmamg antikorlarß enzimatik veya kimyasal bölünme ile üretilmektedir.

Baglantüfragmanlarü kßlîlaylîiüolmayacak sekilde Fab, Fab,, F(ab')2, Fv ve tek zincirli antikorlar jçermektedir. sahip herhangi bir polipeptidi içermektedir. “Hafif zincir” terimi, bir OPGLSye özgüllük kazand Tlmak için yeterli degisken bölge sekanslîia sahip herhangi bir polipeptidi içermektedir.

Tam uzunlukta ag rl bir zincir, degisken bir bölge alanlnl [VH) ve üç sabit bölge alanlnl KCHI, CH2 ve CH3) içermektedir. VH alanîlpolipeptidin ainino terininaldedir ve CH3alanlarIlkarboksi terminaldedir. Burada kullanman “Agî zincir” terimi, tam uzunlukta bir ag& zinciri ve bunun fragmanlariJkapsamaktadß. Tam uzunlukta bir hafif zinciri, bir degisken bölge alan13(VL) ve bir sabit bölge alanßHCL) içermektedir. Agß zincire benzer olarak, hafif zincirin degisken bölge alan: polipeptidin amino terminalindedir. Burada kullanEan “hafif zincir” terimi, tam uzunlukta bir hafif zinciri ve bunun fragmanlarîljkapsamaktad 3. Bir Fab fragmanÇ bir hafif zincirden ve CH17den ve bir agE zincirin degisken bölgelerinden olusmaktadlî. Bir Fab molekülünün ag ij zinciri, bir diger agbi Zincirli molekül ile bir disülfit bag _olusturamamaktadbi Bir Fab' fragmanl,lCH1 ve CHZ alanlarl aras nda birden fazla sabit bölgeyi içeren bir hafif zinciri ve bir ag 11 zinciri içermektedir, bu sekilde bir zincir aras` ldisülf'it bag, bir F(ab°)2 molekülü olusturmak için iki agir zincir arasîida olusturulabilmektedir. FV bölgesi, aglî ve hafif zincirlerden degisken bölgeleri içermektedir, fakat sabit bölgelerden yoksundur. Tek Zincirli antikorlar, ag& ve hafif Zincirli degisken bölgelerin, bir antijen baglayßjbölgeyi olusturan tek bir polipeptit zincirini olusturmasjiçin esnek bir baglayölile baglandîg'JFv Patent DokümanlarElda kapsamlEbir sekilde aç Elanmaktad m.

Bir “multispesifik” veya “multi islevsel” antikordan baska bir bivalent antikorun, belirli yap land nnalarda genellikle benzer baglantl bölgelerinin hepsine sahip oldugu anlasllmaktadlr.

Bir antikor fazla] Fgljlkarsff reseptöre baglanan reseptör miktarlîil'(bir In vitro rekabetçi baglama azalttgîida bir antikor, bir reseptöre bir ligand i yap Emasßîbüyük ölçüde inhibe etmektedir. herhangi bir polipeptit determinantlarj içermektedir. Belirli yönlere göre, epitop determinantlarj amino asitler, seker taraf: zincirler, fosforil veya sülfonil gruplar gibi moleküllerin kimyasal olarak aktif yüzey gruplariJiçerebilmektedir ve spesifik üç boyutlu yap Ela] özelliklere ve/veya spesifik yükleme özelliklerine sahip olabilmektedir. Bir epitop, bir antikor ile baglanan bir antijen bölgesidir. Belirli yönlere göre, bir antikorun, tercihe baglLl olarak proteinlerin ve/veya makromoleküllerin bir kompleks karlSlmlnda hedef antijenini tan d g nda bir antijeni spesifik olarak bagland g lsöylenmektedir. Belirli yönlere göre, bir antikorun, ayrßma sabiti Sl pM oldugunda, burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yapilandinmalarda, ayrlsma sabiti 5100 nM oldugunda ve belirli yönlere göre, ayrlSma sabiti 510 nM oldugunda bir antijeni spesifik olarak bagland FSöylenmektedir.

Burada kullanEdEgEüzere, “madde” terimi, kimyasal bir bilesigi, kimyasal bilesiklerin bir kargîhßj biyolojik bir makromolekülü veya biyolojik maddelerden olusturulan bir ekstraktü belirtmektedir.

Burada kullanEdEgEüzere, “isaret” veya “isaretli” terimleri, isaretlenmis avidin ile (ör. optik veya kalorimetrik yöntemler ile tespit edilebilen floresan bir isaretleyiciyi veya enzimatik aktiviteyi içeren streptavidin) tespit edilebilen biyotinil parçalarln bir polipeptidine radyo isaretli amino asidin dahil edilmesi veya baglants` l sayesinde tespit edilebilir bir isaretleyicisinin dahil edilmesini ifade etmektedir. Bulusun belirli yönlerinde, isaret veya isaretleyici de terapötik olabilmektedir. Isaretleyici polipeptitlerin ve glikoproteinlerin çesitli yöntemleri teknikte bilinmektedir ve kullanEabilmektedir. Polipeptitlerin isaretlerinin örnekleri, kIslHayZilolmayacak sekilde asagBakileri içermektedin radyoizotoplar veya radyonüklidler rodamin, lantanid fosforlarî), enzimatik isaretler (ör. yaban turbu peroksidazü ß-galaktosidaz, lusiferaz, alkalin fosfataz), kemilüminesan, biyotinil gruplar veya ikincil bir haberci (ör. lösin fermuar çifti sekanslaru ikincil antikorlaan baglachLbölgeleri, metal baglayLdLlalanlar, epitop etiketleri) ile tan mlanan önceden belirlenmis polipeptit epitoplar .l Belirli yapiland limalarda, isaretler, potansiyel sterik engelin azaltllmas liçin çesitli uzunluklarda aralaydl lkollar ile baglanmaktad TL Burada kullanüan “biyolojik numune” terimi, kßüîlayßüolmayacak sekilde, bir canlDvarlUîtan veya önceden canlEbir varlltan alman herhangi bir madde miktarßüiçermektedir. Bu canli] varlklar, kßmlayEEblmayacak sekilde insanlar, fareler, maymunlar, sKlanlar, tavsanlar ve diger hayvanlarjiçermektedir. Bu maddeler, kan, serum, idrar, hücreler, organlar, dokular, kemik, kemik iligi, lenf dügümleri ve cildi içennektedir. hastalgbl litik kemik metastazlarl, periodontitis, romatoid artrit ve immobilizasyona baglLl kemik kayblnl içermektedir. Bu kemik rahatslzllklarlna ek olarak, belirli kanserlerin, osteoklast aktivitesini artt rid gl lve meme, prostat ve multipl miyelom gibi kemik rezorpsiyonunu indükledigi bilinmektedir. Bu kanserler, kemikte OPGUnin asi-ekspresyonu ile sonuçlanan ve osteoklast say slria ve aktivitesine yol açan faktörleri ürettigi bilinmektedir.

Burada kullanÜJdEgElüzere, “farmasötik madde” veya “ilaç”, bir hastaya uygun bir sekilde uygulandgîlda, istenilen bir terapötik etkiyi harekete geçirebilen bir kimyasal bilesigi veya bilesimi ifade etmektedir.

Burada kullanEldEgEüzere, “modülatör” terimi, bir molekül aktivitesini veya islevini degistiren bir bilesiktir. Örnegin, bir modülatör, modülatör yoklugunda gözlemlenen aktivite veya islev büyüklügüne kiyasla bir molekülün belirli bir aktivitesinin veya islevinin büyüklügünde bir art Sa veya azalmaya yol açabilmektedir. Belirli yönlerde, bir modülatör, bir molekülün en az bir aktivitesinin veya islevinin büyüklügünü azaltan bir inhibitördür. Bir molekülün belirli örnek teskil eden aktiviteleri ve islevleri, kîîlayöîolmayacak sekilde baglantl'aftînitesini, enzimatik aktiviteyi ve sinyal iletimini içermektedir. Belirli örnek teskil eden inhibitörler, kEIllayßjolmayacak sekilde proteinler, peptitler, antikorlar, peptit antikorlarÇ karbonhidratlar veya küçük organik molekülleri içermektedir. Peptikorlar, örnegin WOOl/83525 Say ]]:lPatent Doküman Eda aç Elanmaktad 3.

Burada kullanÜJdEgEüzere, “büyük ölçüde saf” terimi, mevcut baskEi türlerdir (örn. bir baska ifadeyle, bir molar bazda, bilesimde herhangi bir diger bireysel türden daha boldur). Belirli yönlere göre, büyük ölçüde saf bir molekül, nesne türlerinin, mevcut olan tüm makromoleküler türlerin en az %50”sini (molar bir bazda) içerdigi bir bilesimdir. Belirli yönlere göre, büyük ölçüde saf olan bir bilesim genellikle bilesimde mevcut olan tüm makromoleküler türlerin nesne türleri, bilesimin esasen tek makromoleküler türlerden olustugu esas homojenlige arîdilnaktadî (kontaminant türleri, geleneksel tespit yöntemleri sayesinde bilesimde tespit edilememektedir).

Hasta terimi, insan ve hayvan denekleri içermektedir.

Mevcut basvuruda, tekil kullanEhÇ aksi aç [Eca belirtilmedikçe çogulu içermektedir. Mevcut basvuruda, aksi belirtilmedikçe “veya” kullanLmL,J “ve/veya” anlamna gelmektedir. Dahasl,l degildir. Aynl zamanda, “eleman” veya “bilesen” gibi terimler, elemanlarl ve bir birimi ve elemanlarTiçeren bilesenleri ve aksi açkça belirtilmedikçe, bir alt birimden daha fazlasil'l içeren bilesenleri kapsamaktadlr.

Sitokinlerin tümör nekroz faktörü (TNF) ailesinin bir elemanüolan Osteoprotegerin Ligand (OPGL), osteoklastlarß olusumunda yer almaktadE. Artan osteoklast aktivitesi, menopoz sonrasüosteoporoz, Paget hastalEgÇ litik kemik metastazjve romatoid artrit dahil bir dizi osteopenik rahats Ellla iliskilidir. Bu sekilde, OPGL aktivitesinde olan bir azalma, osteoklast aktivitesinde bir azalmaya yol açabilmektedir ve osteopenik rahatsülüglarîl siddetini azaltabilmektedir. Bulusun belirli yönlerine göre, OPGLlye yönlendirilen antikorlar, kEElayIiEl olmayacak sekilde yukarLda bahsi geçenleri içeren osteopenik rahatsttllklarLiiJi tedavi edilmesinde kullan labilmektedirler.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, insan osteoprotegerin liganda (OPGL) kars Ftamamen insan olan bir monoklonal antikor saglanmaktadî. Burada, aglî ve hafif Zincirli immünoglobulin molekülleri kodlayan sekanslar ve bu inolekülleri içeren amino asit sekanslarü özellikle degisken bölgelere tekabül eden sekanslar tarif edilmektedir Burada açklanan belirli yönler, spesifik olarak CDRl ila CDR3 arasEidan tamamlayZlJJEE belirleyici bölgelere (CDRileri) tekabül eden sekanslarZiçermektedir. Belirli yap Jhnd Ernalara göre, bu tarz bir immünoglobulin molekülü ve monoklonal antikoru eksprese eden bir hibridom hücre dizisi saglanmaktadi Bulusun belirli yönlerine göre, insan OPGL7ye karsdsailastLrllmLs insan monoklonal antikor saglanmaktad 11.

Yapay maya kromozomlarlîlda (YAC°ler) megabaz boyutlu insan lokuslarlîi`klonlayabilme ve yeniden olusturabiline ve bunlarü fare germ hattia dahil edebilme kabiliyeti, oldukça büyük veya kabaca eslestirilmis lokuslarEi islevsel bilesenlerini aç [klEga kavusturma ve insan hastanß kullanîslljmodellerinin üretilmesi yaklasEnîlîsaglamaktadß. DahasÇinsan esdegerleri ile fare lokuslariîl ikamesine yönelik bu teknolojinin kullanEnIl gelisimleri, diger sistemlerle iletisimleri ve hastalEgB indüksiyonunda ve ilerlemesinde dahil olmalarEesnasßda insan gen ürünlerinin ekspresyonuna ve regülasyonuna benzersiz bilgiler saglayabilmektedir.

Bu tarz bir stratejinin önemli bir pratik uygulamasj fare humoral immün sisteminin hale getirildigi farelere verilmesi, antikorlarln programlanmls ekspresyonunun altlnda yatan mekanizmalar lve antikorlar It tertibatlnl ve ayri Zamanda B hücresi gelisiminde olan rollerini inceleme fiisatl_ suninaktad î!. Dahaslî bu tarz bir strateji, tainainen insan monoklonal antikorlarîn (MAbller) üretimi için bir kaynak saglayabilmektedir. Burada açlklanan belirli yönlere göre, tamamen insan antikorlardan, fare veya fare türevi Mabdere özgü immünojenik ve alerjik yanElarüninimize etmesi ve bu sekilde, uygulandEgEida antikorlar& verimliligini ve güvenligini arttminasEbeklenmektedir. Burada açklanan belirli yönlere göre, tekrar eden antikor uygulamalarEiEiçerebilen, osteoporoz, inflamasyon, otoimmünite ve kanser gibi kronik ve nükseden insan hastalüglarßß tedavisinde kullanEha yönelik tamamen insan antikorlar kullan Iabilmektedir.

Bir kisi, bu farelerin, fare antikorlarnn yoklugunda insan antikorlarJüretmesi beklentisinde insan Ig lokuslarlnn büyük fragmanlarl ile fare antikoru üretiminde eksik fare suslarnll tasarlayabilmektedir. Büyük insan Ig fragmanlar ,l büyük degisken gen çesitliligini ve ayni l zamanda antikor üretiminin ve ekspresyonunun uygun regülasyonunu koruyabilmektedir.

Antikor çesitlendirmesi ve seçimi için fare makinesinden ve insan proteinlere immünolojik toleransi yoksunlugunu kullanarak, bu fare suslarEida yeniden üretilmis insan antikor repertuvarjinsan antij enleri dahil olmak üzere herhangi bir ilgili antijene kars :yüksek affiniteli antikorlar:sunabilmektedir. Hibridom teknolojisi kullanEDarak, arzu edilen özgüllügü içeren antijene özgü insan MAb'ler üretilebilmekte ve seçilebilmektedir.

Belirli yönlere göre, bir kisi, insan degisken bölgeleri ile birlikte insan baska türlerden gelen sabit bölgeleri kullanabilmektedir.

Dogal Yollarla Olusan Antikor Yap ED Dogal yollarla olusan antikor yapßal birimler tipik olarak bit tetrameri içermektedir. Her bir tetramer tipik olarak polipeptit zincirlerin iki özdes çiftten olusmaktadi, her bir çift, tam uzunlukta bir “hafif” (belirli yapEandEmalarda, 25 kDa) ve tam uzunlukta bir “agE” zincire (belirli yapEandlîrnalarda, yaklasIt sahiptir. Her bir zincirin amino-terminal bölümü, yaklaslgt olarak 100 ila 110 degisken bir bölgeye veya antijen tanEnlanmasîldan birincil derecede sorumlu olan daha fazla amino asidi içermektedir. Her bir zincirin karboksi- terminal bölümü, tipik olarak efektör islevinden sorumlu olabilen bir sabit bölgeyi belirlemektedir. Insan hafif zincirleri, tipik olarak kappa ve lambda hafif zincirleri olarak n Illand nllrnaktadlii. Agin zincirler, mu, delta, gama, alfa veya epsilon olarak n flland nllmakta ve s Iiaslyla lgM, lgD, IgG, IgA ve IgE olarak antikor izotopunu belirleinektedir. lgG, klsfflayîcrolmayacak sekilde IgGl, lgG2, lgG3 ve lgG4 içeren çesitli alt sîngfllara sahiptir. lgM, kISItlaylcl 'olmayacak sekilde IgMl ve lgM2`yi içeren alt slnlflara sahiptir. lgA, ksfflaylörlolmayacak sekilde lgAl ve lgA2°yi içeren alt slîlffllara benzer bir sekilde bölünmektedir. Tam uzunlukta hafif ve ag& zincirler içerisinde, tipik olarak degisken ve sabit bölgeler, yaklaslk olarak 10 daha fazla amino asidin bir “D” bölgesini içeren agm zincir ile yaklaslll olarak 12 veya daha fazla amino asidin bir “J” bölgesi ile birlestirilmektedir. Bkz. örn. Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) Her bir hafif/agi zincir çiftinin degisken bölgeleri, tipik olarak antijen baglama bölgesini Olustunnaktad B.

Degisken bölgeler tipik olarak, üç hiper degisken bölge ile birlestirilen, ayn lzamanda tamamlay d lik belirleyici bölgeler veya CDR”ler olarak adlandln lan nispeten tutulmus çerçeve bölgelerinin (FR) ayn Fgenel yapßlîiFSergilemektedir. Her bir çiftin iki zincirinden CDRller, bir spesifik epitopa baglanmaya izin verebilen çerçeve bölgeleri ile hizalanmaktad E. N- terminalinden C terininaline, hafif ve agî Zincirli degisken bölgeler, tipik olarak FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 ve FR4 alanlari] içermektedir. Her bir alana amino asitlerin atanmasj tipik olarak Ilgili Immünolojik Proteinlerin Kabat Dizilerinin TanlînlarE ile uyumludur (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia & Lesk Bispesifik veya Çift Islevli Antikorlar Bispesifik veya çift islevli antikor, iki farklHagFrl/hafif zincir çiftlerine ve iki farlelbaglaylöl' bölgeye sahip olan yapay bir hibrit antikordur. Bispesifik antikorlar, kßfflayßüolmayacak sekilde hibridomlari füzyonu veya Fab, fraginanlarEiEi baglantßjdahil olmak üzere çesitli yöntemlerle üretilebilmektedir. Bkz. örn. Songsivilai & Lachmann Clin, Exp. Immunol. 79: Antikorlarln Preparasyonu Spesifik olarak OPGL°ye baglanan belirli antikorlar, bulus tarafEidan saglanmaktadß. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, antikorlar, tam uzunlukta OPGL, OPGL7nin çözülebilir forrnlarLl veya bunlarin bir fragmann liçeren immünizasyon ile üretilebilmektedir. Bulusun belirli yönlerinde, antikorlar, poliklonal veya monoklonal olabilmektedir ve/veya rekombinant antikorlar olabilmektedir. Antikorlar, örnegin insan antikorlarîiretebilen transjenik hayvanlarîi immünizasyonu ile haz Illanan insan antikorlar olabilir (bkz. örnegin, PCT Yaylnlanmls WO 93/ l 2227 Say 11|_Basvuru).

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OLOPGL-VII'] hafif ve aglr Zincirli degisken bölgelerin tamamlayBJJE belirleyici bölgeleri (CDR”ler), aynEveya bir diger türden çerçeve bölgelerine (FRaler) aslhnabilmektedir. Belirli yönlerde, or OPGL-lain hafif ve ag& Zincirli degisken bölgelerin CDR,leri, konsensüs insan FR,lere asflanabilmektedir. Konsensüs FR,lerin olusturulmasJiçin, belirli yönlerde,, çesitli insan agLr Zincirli veya hafif Zincirli amino asit sekanslarndan FR”ler, bir konsensüs amino asit sekansln | tanlmlanmak için hizalanabilmektedir. Belirli yönlerde,, aOPGL-l ag& zincirin veya hafif zincirin FR'leri, farkli] agi bir zincirden veya hafif bir zincirden FRalerle degistirilmektedir. Belirli yönlerde,, OLOPGL-liln aglr ve hafif zincirlerinin FRilerinde nadir amino asitler degistirilmezken, FR amino asitlerin geri kalanü degistirilmektedir. Nadir amino asitler, genellikle FR,lerde bulunmadfklarjkonumlarda bulunan spesifik amino asitlerdir. Belirli yönlerde,, ocOPGL-l ”den aSJhnmS degisken bölgeler, OLOPGL-Vin sabit bölgesinden farkljolan bir sabit bölge ile kullanlabilmektedir. Belirli yönlerde, aslllLdegisken bölgeler, tek zincirli bir Fv antikorunun ,530,101 Say 1| Patent Dokümanlnda aç klanmaktad Il.

Mevcut bulusun antikorlarüburada tarif edilen ve/veya talep edilen antikorlar, eklenen genomu içeren insan antikorunun önemli bir bölümüne sahip olan, endojen, mürin, antikorlarß üretiminde yetersiz kalan bir transjenik farenin kullaniiEvasEaslS/la hazmlanmaktadi Daha sonrasßda, bu fareler, insan immünoglobulin molekülleri ve antikorlarDüretebilmektedir ve mürin immünoglobulin moleküllerin ve antikorlari üretiminde yetersizdir. Bu sonuca ulasmnas Jiçin kullanJhn teknolojiler, patentlerde, basvurularda ve burada tarifnamede tarif edilen referanslarda tarif edilmektedir. Bir kisi, PCT YayLmlanmLS WO 98/24893 SayLll_ Basvuruda tarif edilenler gibi yöntemleri kullanabilmektedir. Bkz. Mendez ve ark. Nature Bu dogrultuda, OPGLSye özgü tamamen insan monoklonal antikorlar, asagldaki gibi üretilebilmektedir. Insan immünoglobulin genleri içeren transjenik fareler, ilgili antijen ile iminünize edilmektedir. Antikorlarîeksprese eden farelerden lenfatik hücreler (örnegin B- hücreleri) elde edilmektedir. Bu geri kazanllmls hücreler, ölümsüz hibridom hücre dizilerini hazîllamak için bir miyeloin hücre dizisi ile kaynaslk olabilmektedir ve bu hibridom hücre dizileri, ilgili antijene özgü antikorlarl üreten hibridom hücre dizilerini belirlemek için görüntülenmekte ve seçilmektedir. Belirli yönlerde, OPGUye özgü antikorlarl üreten bir hibridom hücre dizisinin üretimi saglanmaktad ß.

Burada açEklanan belirli antikorlar, hibridom dizileri (AMG 6.1, AMG 6.4, AMG 6.5, AMG ile üretilmektedir. Burada açüîlanan belirli antikorlar, hibridom dizileri (AMG ile üretilmektedir. Belirli yönlere göre, antikorlar, yaklaslk olarak 0.23 ve ile OPGL”ye baglanmaktadln. Belirli yönlerde, antikorlar, 0.23 nMsden daha az bir Kd ile OPGL9ye baglanmaktadln.

Belirli yönlerde, antikorlar, lgG2 izotipinden olusinaktadi. Belirli yönlerde, antikorlar, bir insan kappa hafif zinciri ve bir insan lgG2 agm zinciri içermektedir. Belirli yönlerde, antikorlar, memeli hücrelerde ekspresyon için klonlanmßti Belirli yönlerde, antikorlarß degisken bölgeleri, IgG2 izotipi için sabit bölgeden baska bir sabit bölgeye baglanmaktad E.

Belirli yönlerde,, OLOPGL-1`in agm ve hafif zincirlerine tutucu modifikasyonlar (ve belirli yathndimalarda kodlayEEnükleotidlere ilgili modifikasyonlar), orOPGL-l'inkilere benzer islevse ve kimyasal özelliklere sahip olan OPGL°ye antikorlarl lüretecektir. Buna karsln, 0LOPGL-1”in islevsel ve/veya kimyasal özelliklerindeki bu tarz büyük modifikasyonlar, (a) Örnegin bir tabaka veya sarmal konformasyon olarak ikame alanEidaki moleküler temelin yapimi, (b) hedef alanda molekülün yükünün veya hidrofobisitesinin veya (c) yan zincirin kütlesinin sürdürülinesinde etkilerini önemli ölçüde degistiren agm ve hafif zincirlerin amino asit sekans îidaki ikamelerin olusturulmas Esayesinde tamamlanabilmektedir. Örnegin bir “koruyucu amino asit ikamesi” terimi, ayrEia polaritede ufak bir etkiye sahip oldugu veya herhangi bir etkiye sahip olmadgüsekilde ve bu konumda amino asit kal Iltîîii yükünde ufak bir etkiye sahip oldugu veya herhangi bir etkiye sahip olmadLgLlsekilde natif olmayan bir kal nt lile natif bir amino asit kal nt s 11 ri bir ikamesini içerebilmektedir. Dahas|,| polipeptitte herhangi bir natif kallnt laynl lzamanda alanin tarama mutagenezi için öncesinde aç kland g _gibi alaninle de ikame edilebilmektedir.

Istenilen amino asit kallîitllarlî(k0ruyucu veya koruyucu olmayan), bu tarz ikamelerin arzu edildigi sürede teknikte uzman kisiler tarafßdan belirlenebilir. Belirli yönlerde, amino asit ikameleri, aOPGL-l ,in önemli kallnlar nl belirlemek için ve burada tarif edilen OPGL°ye karsi antikorlarîl affinitesini arttimak veya azaltmak için kullan Elhbilmektedir.

Burada açüglanan antikorlar, hibridom hücre dizilerinden baska hücre dizilerinde eksprese edilebilmektedir. Belirli yönlerde, özel antikorlarl kodlayan sekanslar, bir uygun memeli konak hücresinin dönüsümü için kullanilabilmektedir. Belirli yönlere göre, dönüsüm, örnegin bir virüste (veya bir viral vektöre) polinükleotidin paketlenmesi ve virüs (veya vektör) ile bir konak hücrenin iletilmesi dahil bir konak hücreye polinükleotidlerin dahil edilmesine yönelik Say JlüPatent DokümanEile örneklendirildigi üzere teknikte bilinen transfeksiyon prosedürleri vas îasSlla gerçeklestirilebilmektedir. Belirli yönlerde, kullanIan dönüsüm prosedürü, dönüstürülecek olan konaga baglE olabilmektedir. Memeli hücrelere heterolog polinükleotidlerin dahil edilmesine yönelik yöntemler, teknikte iyi bilinmektedir ve kßmlaylîlü olmayacak sekilde, dekstran arac JDtransfeksiyon, kalsiyum fosfat çökeltmesi, polibren arac [DE] transfeksiyon, protoplast füzyonu, elektroporasyon, lipozomlarda polinükleotidlerin enkapsülasyonu ve çekirdeklere DNA mikroenjeksiyonunun dogrudan yönlendirilmesini içermektedir.

Ekspresyona yönelik konaklar olarak mevcut olan memeli hücre dizileri, teknikte iyi bilinmektedir ve kEE'tllayElüolmayacak sekilde, Çin hamster yumurtallklarE(CHO) hücreleri, HeLa hücreleri, bebek hamster böbrek (BHK) hücreleri, maymun böbrek hücreleri (COS), insan hepatoselüler karsinoma hücreleri (ör. Hep G2) ve bir dizi diger hücre dizilerini içeren Amerikan Tip Kültür Koleksiyonusndan (ATCC) mevcut olan ölümsüz hücre dizilerini kEIlayBIJolmayacak sekilde içermektedir. Belirli yönlerde, hücre dizileri, hücre dizilerinin, yüksek ekspresyon seviyelerine sahip olup olmadEglîilîn ve temel OPGL baglama özellikleri ile antikorlariüretip üretemediginin belirlenmesi vasEas Ella seçilebilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, mevcut bulusun antikorlar|,l biyolojik numunelerde OPGLSnin tespit edilmesi için kullan S] dit. Mevcut bulusun belirli yönlerinde bu, proteini üreten hücrelerin veya dokularîl tan înlanmasîla olanak saglamaktad TL Burada tarif edilen belirli yönlerde, OPGL”ye baglanan ve diger baglayldl bilesiklerle etkilesimi bloke eden antikorlar, osteoklast farkll'laslîhîll'rl ve kemik rezorpsiyonunun modüle edilmesinde terapötik kullan Ela sahip olabilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, OGPUye kars :antikorlan ODARia baglanan OPGL”yi bloke edebilmektedir, bu da sinyal iletim kaskad &da bir blokla ve NF-kB aracEEtranskripsiyon aktivasyon kaybüile sonuçlanabilmektedir. Örnegin bir lusiferaz haberci deney kullanIarak NF-kB arac ljtranskripsiyon aktivasyonunun ölçülmesine yönelik deneyler, teknikte uzman kisiler tarafßdan bilinmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGL”ye bir antikorun terapötik olarak etkili bir miktar nin uygulanmas n liçeren, bir kemik rahatslztllglnln tedavisinde kullanima yönelik yöntemler açklanmaktad Il.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGLsye antikorun terapötik olarak etkili bir miktarlîlîl ve diger bir terapötik maddenin uygulanmas 33 içeren, bir kemik rahats ßltgmß tedavisinde kullan Bia yönelik yöntemler aç Elanmaktadî.

Mevcut bulusun bu tür belirli yönlerinde, ilave terapötik madde terapötik olarak etkili bir miktarda uygulanmaktadm. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, kemik rahatsElEgÇ kßmlayEEl olmayacak sekilde osteopeni ve 0steolizi içeren bir net kemik kaybEile karakterize edilen bir rahatsîlkti. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGL”nin bir antikor ile tedavisi, kemik rezorpsiyonunun oranlnl bastitmak için kullanilmaktadlr. Dolaylsllyla mevcut bulusun belirli yönlerinde, tedavi kemik rezorpsiyonunun oranlnln normalim üstünde oldugu oranl lazaltmak veya kemik formasyonunun normalin altlndaki seviyey düsmesini kompanse etmek için normalin altlIidaki seviyelere kemik rezorpsiyonunun indirilmesi için kullanIlabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, antikorlar OPG”nin varlgßda veya yoklugunda baglanma için test edilebilirler ve OPGL,nin arac :bldugu osteklastojenez ve/veya kemik rezorpsiyonunu engelleme kabiliyetleri aç E idan incelenebilmektedirler.

Mevcut bulusun belirli yönlerine göre tedavi edilebilecek olan rahatsâlüglar kßmayßE olmayacak sekilde asag Zlakileri içermektedir: Kslltllayldl lolmayacak sekilde birincil osteoporoz, endokrin osteoporoz (Örn. klsütllayldll olmayacak sekilde hipertiroidizm, hiperparatiroidizm, Cushing sendromu ve akromegali dahil), kalffsal ve konjenital osteoporoz formlar`| (öm. kiftllaylîiFl olmayacak sekilde osteogenezis imperfecta, homosistinüri, Menkes sendromu, Riley-Day sendromu) ve ekstremitelerin immobilizasyonuna bagl|`loste0p0rozu içeren osteporoz; yetiskinlerde ve eriskinlerde Paget kemik hastalfgjwsteitis deformans); Osteomyelit, bir baska ifadeyle kemik kayb Ba yol açan, kemikte enfeksiyöz bir lezyon; Kîslülayßüolmayacak sekilde katEtümörlerden (Örn. gögüs, akciger ve böbrek dahil) ve hematolojik maliniteler (kßEElayEEolmayacak sekilde, multipl miyelom, lenfoma ve lösemi dahil), idiyopatik hiperkalsemi ve hipertiroidizm ve renal islev rahatsilEklarEile iliskili hiperkalsemiyi içeren hiperkalsemi.

KsulayLdU011nayacak sekilde cerrahi sonrasdosteopeni, steroid uygulama ile indüklenen osteopeni, ince ve kal Il baglrsak rahatslztllklarl lile iliskili osteopeni ve kronik hepatik ve renal hastaliklarla iliskili osteopeniyi içeren osteopeni; Ksftlaylölî olmayacak sekilde travmatik yaralanma ile iliskili osteonekroz, Gaucher hastalfgüile iliskili osteonekroz, orak hücre anemisi ile iliskili osteonekroz, sistemik lupus eritematozus ile iliskili osteonekroz, romatoid artrit ile iliskili osteonekroz, periodontal hastalfllla iliskili osteonekroz, osteolitik metastaz ile iliskili osteonekroz ve diger kosulla iliskili osteonekrozu içeren osteonekroz, bir baska ifadeyle kemik hücresi ölümü; ve Romatoid artrit ile iliskili küîmdak ve eklem erozyonu kaybj Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGL kemik rahatslzlLklaran tedavisi için en az bir ek terapötik madde ile birlikte veya tek bas na kullan labilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGLiye karsl .bir antikor, bir ek terapötik maddenin terapötik olarak etkili bir miktar-yla birlikte kullanillnaktadlîi OPGLsye karsFlbir antikorla uygulanabilen, örnek teskil eden terapötik maddeleri, kEIlayBIlmayacak sekilde BMP-l ila BMP-12 aras Eda belirlenen kemik morfojenik faktörleri; dönüstürücü büyüme faktörü-ß (TGF-ß) ve TGF-ß aile elemanlarü kililayijolmayacak sekilde, IL-la ve bunlari türevleri ve KineretTM dahil interlökin-l (IL-l) inhibitörlerini; çözülebilir TNFOL reseptörleri, EnbrelTM, anti-TNFu antikorlarÇ RemicadeTM ve D2E7 antikorlarEdahil TNFOL inhibitörleri; paratiroid homon ve bunlar& analoglarE paratiroid ile iliskili protein ve analoglar; E serisi prostaglandinler; bifosfonatlarL(örnegin alendronat ve digerleri); florür ve kalsiyum gibi kemik gelistirici mineralleri; kßilayßjolmayacak sekilde CelebrexTM ve VioxxTM gibi COX-Z inhibitörleri dahil steroidal olmayan anti-inflamatuvar ilaçlari (NSAID”ler); metotreksat veya leflunomid gibi immünosüpresanlar; ksilaydd olmayacak sekilde, salgilaylcl lökosit proteaz inhibitörü (SLPI) dahil serin proteaz inhibitörleri; lL-6 inhibitörleri (klslltlay (ll | olmayacak sekilde lL-6,ya karsi . antikorlar dahil), IL-8 inhibitörleri (klslflaylîfolmayacak sekilde, lL-8,e karsîantikorlar dahil); lL-lS inhibitörleri (k sltllay d !olmayacak sekilde lL-18 baglama proteini ve lL-18 antikorlarl `dahil); Interlökin-l dönüstürücü enzim (ICE) modülatörleri; FGF-l ila FGF-IO arasîlda fibroblast büyüme faktörleri ve FGF modülatörleri; PAF antagonistleri; keratinosit büyüme faktörü (KGF), KGF ile iliskili moleküller ve KGF modülatörleri; matris metaloproteinaz (MMP) modülatörleri; kIslIlayBJolmayacak sekilde indüklenebilir NOS modülatörleri dahil Nitrik oksit sintaz (NOS) modülatörleri; glukokortikoid reseptörün modülatörleri; glutamat reseptörünün modülatörleri; lipopolisakkarit (LPS) seviyelerinin modülatörleri; ve noradrenalin ve modülatörler ve bunlarEl mimetikleri.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGLiye karsl bir antikor, çesitli inflamatuvar kosullarln, otoimmün kosullarln veya kemik kaybînln eslik ettigi diger kosullarn tedavisi için özel terapötik maddelerle kullanllnaktadîl. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, hastalik ve arzu edilen tedavi seviyesi açßßdan, iki, üç veya bundan fazla maddeler uygulanabilmektedir.

Burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yaptlandmmalarda, bu maddeler, aynZI formülasyonda dahil edilerek birlikte saglanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde bu tür maddeler aynÜformülasyona dahil edilerek birlikte saglanabilmektedirler. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bu tür maddeler, ve OPGL°ye karsEbir antikor aynJformülasyon içerisine dahil edilebilir birlikte saglanabilmektedirler. Mevcut bulusun belirli yönlerinde bu tür maddeler bir tedavi kiti dahil edilerek birlikte saglanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGLlye karsl bu maddeler ve bir antikor, bir tedavi kitinde dahil edilerek birlikte saglanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bu maddeler ayr | sekilde saglanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, gen tedavisi ile uygulandlllarîida, protein maddelerini kodlayan genler ve/veya OPGLE*ye karsü bir antikor, aynE vektör içerisinde yer alabilmektedir. Belirli uygulamalarda, protein maddelerini kodlayan genler ve/veya OPGL”ye karsîlbir antikor, ayn Epromoter bölgenin kontrolü altîda olabilmektedir.

Belirli yönlerde, protein maddelerini kodlayan genler ve/veya OPGLaye kars [bir antikor, ayrE] vektörlerde olabilmektedir.

Belirli yönlerde, mevcut bulus OPGL`ye karsEbir antikor, ve en az bir interlökin-l (IL-1) inhibitör içeren tedavilere ve bu tür tedavilerin kullanEdEgEyöntemlere yöneliktir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir tedavi, OPGL7ye kars Lbir antikoru ve bir IL-l inhibitörünü ve burada aç klanan en az bir ek molekülü içermektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, IL-l inhibitörleri ve/veya TNF-a inhibitörleri ile baglantÜJE olan tedavide kullanEna yönelik OPGLiye karsl bir antikor aç klanmaktadn. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGUye karsl | bir antikor IL-l inhibitörleri ve/veya TNF-Ot inhibitörleri ile kombinasyon halinde, ast m, romatoid artrit ve multipl skleroz gibi kosullarîi tedavisinde kullan Iabilmektedir.

Interlökin-l (IL-l), bir anti-inflamatuvar sitokindir. Belirli durumlarda, IL- 'l, birçok hastalÜgta ve medikal rahatsglkta kullanman bir aracElE. Belirli durumlarda, IL-l, makrofaj/monosit lineajîl hücreleri ile üretilmektedir. Belirli durumlarda, IL-l, iki formda üretilmektedir: IL-l alfa (IL- lOL) ve IL-l beta (IL-lß).

Spontane veya deneysel hastallgln veya tlbbi kosulun, vücut 5 v lar'nda veya dokusunda IL- l”in yüksek seviyeleri ile iliskili olmasühalinde ve/veya vücuttan alman hücrelerin veya dokulari, kültürde yükselmis lL-l seviyelerini üretmesi halinde, bir hastalEk veya tBbi kosulun, bir “interlökin-l arac JDhastalk” olarak düsünülmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bu interlökin-l arac JJEhastalRlar da asag Elaki ek iki kosul ile tan milanmaktad E: (1) hastalkla veya tEbbi kosulla iliskili patolojik bulgular, IL-l'in uygulanmasE veya IL-l7in ekspresyonunun yukarE regülasyonu vas lîas Sila hayvanlarda deneysel olarak taklit edilebilmektedir; ve (2) hastalE veya tlßbi kosulun deneysel hayvan modellerinde indüklenen bir patoloji, IL-1,in eylemini inhibe eden maddelerle tedavi vasltaslyla inhibe edilebilmekte veya engellenmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde yukarldaki bir veya birden fazla kosul, bir lL-l aracllll lhastallkta kars lanmaktadlr. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, tüm üç kosul, bir lL-l arac ]l:hastal Eta kars Ellanmaktad [î Akut ve kronik interlökin-l (IL- l) arac [[üiastalüglar, kßîlayßEolmayacak sekilde asag Bakileri içermektedir: pankreas iltihabi amiyotrofik lateral skleroz (ALS veya Lou Gehrig hastalEgEi; Alzheimer hastalgj AIDS ile indüklenen kaseksiyi dahil kaseksi/anoreksi; astEn ve diger akciger hastalklarj ateroskleroz; otoimmün vaskülit; kronik yorgunluk sendromu; kIlelayBEl olmayacak sekilde Klostridyum ile iliskili diyare dahil Klostridyum ile iliskili hastalRlar; kâilayîi] olmayacak sekilde konjestif kalp yetmezligi, koroner restenoz, miyokardiyal enfarktüs, miyokart disfonksiyonu (örn., sepsis ile iliskili) ve koroner arter baypas grefti dahil koroner kosullar ve endikasyonlar; kßîlayßEolmayaeak sekilde multipl miyelom lösemi ve miyelojenöz (öm. AML ve CML) dahil ksllayndolmayacak sekilde lösemiler ve tümör metastaz ldahil kanser; diyabet (klsitlayldl lolmayacak sekilde insüline baglmll Idiyabet dahil); endometriyoz; ates; tibromiyalji; glomerulonefrit; graft versus host hastallgl !ve/veya transplant reddi; hemohorrajik sok; hiperaljezi; inflamatuvar barsak hastalfglîl klîfflaylîf olmayacak sekilde 0ste0artrit, psoriatik artrit ve romatoid artrit dahil bir eklemin inflamatuvar kosullarl;l kîîlayöîolmayacak sekilde örnegin, kornea transplantFile iliskili olanlar dahil inflamatuvar göz hastalEgE kßmlayßüolmayacak sekilde serebral iskemi (kiîlayîljolmayacak sekilde, travma, epilepsi, hemoraj veya inmenin bir sonucu olarak beyin hasarEldahil, bunlari her birisi nörodejenerasyona yol açabilmektedir) dahil iskemi; Kawasaki hastalEgE ögrenme bozuklugu; akciger hastaltklarE(kEîlayBJolmayacak sekilde, akut respiratuvar distres sendromu veya ARDS dahil); multipl skleroz; miyopati (örn. kgmlayîlj olmayacak sekilde, sepsiste kas proteini metabolizmas 3dahil); nörotoksisite (kßilayßjolmayacak sekilde, HIV ile indüklenen bu kosul dahil); 0ste0p0roz; kletlayLdLlolmayacak sekilde kanser ile iliskili agrlyLliçeren agri Parkinson hastallgl;l periodontal hastalik; erken dogum; sedef hastallgl;l Repertîizyon hasar|;l septik sok; radyasyon tedavisinden yan etkiler; temporal mandibular eklem hastallgl;l uyku bozuklugu; üveit; ve örnegin zorlanma, burkulma, kl'lîtîdak hasarlîl travma, ortopedik cerrahi, enfeksiyon veya diger hastal E süreçlerden kaynaklanan bir intlamatuvar kosul.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir IL-l inhibitörü, IL-l,e hücresel reseptörlerin aktivasyonunu spesifik olarak önleyebilen herhangi bir protein veya molekül olabilmektedir, bu da herhangi bir sayma mekanizmadan kaynaklanabilmektedir. Örnek teskil eden yap Jhndimalar, kEIlayIljolmayacak sekilde IL-l üretiminin asag :tregüle edilmesini, serbest kompleksinin olusumuna (öm. IL-l reseptör aksesuarl proteini ile IKL-l reseptörünün birlestirilmesine) müdahale edilmesini ve reseptörüne baglanmaslrtdan sonra lL-l sinyalinin modülasyonuna müdahale edilmesini içermektedir.

Belirli interlökin-l inhibitörleri, kßElayßE olinayacak sekilde kolektif olarak “IL-l ra proteinleri” olarak adlandîlan KineretTM, IL-l ra, IL-l ra varyantlar ve IL-l ra türevleri dahil kEHayBJolmayacak sekilde çözülebilir IL-l reseptörler (bkz. öm. US 5,492,888 SayEEPatent US dahil IL-l Say 1|| Patent Doküinanlar )|; IL-l reseptör aksesuar proteinleri ve buraya kars antikorlar (bkz. salglsîminhibe etmesi için kullan Tabilen interlökin-l beta dönüstürücü enzimin (ICE) veya Dokümanlarjl; interlökin-l beta proteaz inhibitörleri; ve in ViVO sentezi veya lL-l ,in hücre dISFI sal E 31 Il :bloke eden diger bilesikleri ve proteinleri k 3 Illay Il :blinayacak sekilde içermektedir.

Basvurusunda tarif edilmektedir.

Interlökin-l reseptör antagonisti (IL-l ra), interlökin-1”in bir dogal inhibitörü olarak hareket eden bir insan proteindir ve lL-loc ve lL-l,i içeren IL-l ailesinin bir elemanld ri. lL-l ra ve varyantlarjiçeren belirli reseptör antagonistleri ve bunlari türevleri ve bunlari olusturulmasü Doküman nda açlklanmaktad ri. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir lL-l reseptör antagonisti, glikosile edilebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir IL-l reseptör antagonisti, glikosile edilmeyebilmektedir. aç klanmaktad B. “222 patentte “IL-l i” olarak adlandEElan birinci form, pH 7.6 Tris tamponu içerisinde yaklasEk 52 mM NaCl civarmda bir Mono Q FPLC klonundan ayrßan 4.8 bir uygun izoelektrik noktas Eile SDS-PAGE'de bir 22-23 kD molekülü olarak karakterize edilmektedir. 23 kD proteini olarak karakterize edilmektedir. IL-lraoc ve IL-lraß glikosile edilmektedir. IL- lrax olarak adlandEHan üçüncü form, 48 nM NaCllde bir Mono Q kolonundan ayrßan ve glikosile olmayan bir 20 kD proteini olarak karakterize edilmektedir. “222 patent ayn Dzamanda inhibitörleri kodlayan genlerin izole edilmesine, bu genlerin uygun vektörlerde klonlanmasldbu genlerin belirli hücre türlerine dönüstürülmesi ve transfekte edilmesi ve inhibitörleri üretmek üzere bu genlerin eksprese edilmesine yönelik belirli yönteinleri açlklamaktadlrt Mevcut bulusun belirli yönlerinde, delesyonlar, eklemeler ve/veya ikameler (bireysel olarak veya kolektif olarak “varyantlar” olarak ifade edilmektedir), IL-l ralnlîi amino asit sekanslarl_ içerisinde olusturulmaktad E. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir lL-lra varyantÇ biyolojik olarak aktiftir (örn. lL-1”i inhibe edebilme kabiliyetine sahiptir).

Mevcut bulusun belirli yönlerinde en az bir TNFOL inhibitörü ile kombinasyon halinde tedavide kullan îha yönelik OPGL`ye kars Ebir antikor ve bu tür tedavilerde kullanEha yönelik yöntemler saglanmaktadi. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir tedavi, OPGL ve bir TNch inhibitöre kars bir antikoru ve burada aç klanan en az bir ek molekülü içermektedir.

Belirli hasta] iklar ve tlbbi kosullar, TNF ile yönlendirilmektedir ve inflamatuvar kosullar olarak kategorize edilebilmektedir. Burada kullanlldEgEüzere, bir “TNF-aracülühastalk”, kßüîlayßE olmayacak sekilde vücut slîtEIarßda veya dokuda yüksek TNF seviyeleri ile iliskili olan ve/veya vücuttan alian hücrelerin veya dokulari, kültürde yüksek TNF seviyelerini ürettigi bir hastalgjveya tßbi kosulu içermektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde bir hastalüg, (1) hastalItla veya tßbi kosulla iliskili patolojik bulgularîi, IL-l°in uygulanmasEveya IL-lsin ekspresyonunun yukarEregülasyonu vas Ilas Sila hayvanlarda deneysel olarak taklit edilebilmesi halinde; ve/veya (2) hastalLk veya tLbbi kosulun deneysel hayvan modellerinde indüklenen bir patoloji, IL-llin eylemini inhibe eden maddelerle tedavi vasitaslyla inhibe edilebilmesi veya engellenebilmesi halinde bir TNF araclll hastaliktlr.

Belirli akut ve kronik TNF aracllj hastalEklar, kßüîlayßü olmayacak sekilde: kaseksi ve anoreksi; lösemi dahil kanser; kronik yorgunluk sendromu; kßEtllayEü olmayacak sekilde konjestif kalp yetmezligi, koroner restenoz, miyokard infarktüsü, miyokart disfonksiyonu (kîsllîlayîljolmayacak sekilde, sepsis ile iliskili bu kosul dahil) ve koroner arter baypas grefti dahil koroner kosullar ve/veya endikasyonlar; depresyon; eriskin baslangßl Tip 1 diyabet, diabetes mellitus ve insülin direnci dahil (kßttlayßüolmayacak sekilde, obezite ile iliskili insülin direnci dahil) diyabet; endometriozis, endometrit ve ilgili durumlar; Iibromiyalji ve analjezi; greft ve host reddi; hiperaljezi; kßülayßüolmayacak sekilde Crohn hastalEgDve Klostridyum difisil iliskili diyare dahil inflamatuvar bag Isak hastalEklarE kßîlayßEblmayacak sekilde serebral iskemi dahil, kleLtlachLlolmayacak sekilde travma, epilepsi, hemoraji ve/veya inmenin bir sonucu olarak beyin hasar n içeren iskemi; k slltllayldl blmayacak sekilde, yetiskin respiratuar distres sendromu, astlm ve pulmoner tîbroz dahil akciger kanseri; multipl skleroz; nöroinflamatuar hastalklar; klsrtlaylöl_ olmayacak sekilde korneal transplant, oküler dejenerasyon ve üveit dahil oküler hastallklar ve kosullar; klSltlayICl blmayacak sekilde, kanser ile iliskili agrFdahil agrlîl pankreas iltihabîl periodontal hastallklar; Pityriasis rubra pilaris (PRP); bakteriyel ve bakteriyel olmayan prostatit ve iliskili kosullar dahil prostatit; sedef hastalgüve iliskili kosullar; pulmoner Iibroz; Reperfüzyon hasarükiîlayß :blmayacak sekilde romatoid artrit, osteoartrit, eriskin artrit (kßîlayEEolmayacak sekilde, eriskin romatoid artrit dahil), seronegatif poliartrit, ankilozan spondilit, Reiter sendromu ve reaktif artrit, Still hastalgüpsoriatik artrit, enteropatik artrit, polimiyozit, dermatomiyozit, skleroderma, sistemik skleroz, vaskülit (öm. Kawasaki hastalgü, serebral vaskülit, Lyme hastalEgü statilokok kaynakli(“septik”) “) artrit, Sjögren sendromu, romatizmal ates, polikondrit ve poliiniyalji romatika ve dev hücreli arterit) dahil römatik hastallklar; septik sok; radyasyon terapisinden yan etkiler; sistemik lupus eritematozus (SLE); temporal mandibular eklem hastallgl; tiroiditi; ve örnegin, incinme burkulma, klklîdak hasarlî travma, ortopedik cerrahi, enfeksiyon (örn., HIV, Klostridyum difisil ve ilgili türler) veya diger hastalk sürecinden ortaya çtkan doku transplantasyonu ve/veya bir intlamatuvar kosul.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, TNF inhibitörleri, TNF üretiminin asagEregüle edilmesi veya inhibe edilmesi, serbest TNF°nin baglanmasü reseptörüne baglanan TNF°ye müdahale edilmesi ve reseptörüne baglanmas îldan sonra TNF sinyalinin modülasyonuna müdahale edilmesi aras Lndan en az birisi ile hareket edebilmektedir. “TNF inhibitörü” terimi, kleLtlayldL olmayacak sekilde çözülebilir tümör nekroz faktörü reseptör tip I (sTNF-RI; p55 reseptörü olarak da adlandlrllmaktadlr), çözülebilir tümör nekroz faktör reseptörü tip II (p75 reseptörü olarak da adlandmfllnaktadl'rl) ve EnbrelTM dahil çözülmüs TNF reseptörlerini; klîftlaylöl' Doküman] dahil TNF”ye kars :antikorlarg TNF reseptörüne kars Eantikorlar; TNF-R1 (bkz. örn. inhibitörleri; ve TNF aktivitesini etkileyen diger molekülleri içermektedir.

TNF reseptörü tip I (aynEZamanda sTNFR-l veya 30kDa TNF inhibitörü olarak bilinmektedir) ve bir çözülebilir TNF reseptörü tip Il'nin (sTNFR-II veya 40kDa TNF inhibitörü olarak da bilinmektedir) amino asidini ve nükleik asit sekanslarßîaç [klamaktadm EP 393 438 ve EP 422 339 ayn Dzamanda, kßmayîiüolmayacak sekilde fragmanlar, islevsel türevler ve varyantlar dahil modifiye edilmis sTNFR-I ve sTNFR-H formlarElEaçklamaktadi Dahasj EP 393 438 ve EP 422 339, inhibitörleri kodlayan genlerin izole edilmesi, genlerin uygun vektörlere klonlanmasgl genlerin belirli hücre türlerine dönüstürülmesi veya transfekte edilmesi ve inhibitörleri üretmek üzere genlerin eksprese edilmesine yönelik yöntemleri aç [klamaktad E. sTNFR-I ve sTNFR-H, sinir büyüme faktörü reseptörünü (NGF), B hücresi antijenini (CD40, içeren reseptörlerin sinir büyüme faktörü/TNF reseptörü süper ailesinin elemanlarîlîl (Smith ve özelligi, iyi korunan konumlarda 4-6 sistein kalîltlsl'rllîiçeren yaklasik klîik amino asidin dört yinelenen motifine bölünebilen bir sistein açEîldan zengin hücre dlISÜligand baglama alanmm EP 393 438 Saym] Patent Doküman: tam uzunlukta rekombinant 40kDa TNF inhibitör proteininin tepesi kesik versiyonlar :blan bir 40kDa TNF inhibitörünü (A5 1) ve bir 40kDa TNF inhibitörünü (A53) ögretmektedir. A51 ve A53, olgun proteinin karboksil terrninalinden silinmis olan siias ;ila 51 veya 53 amino aside sahiptir.

Yay nlanm S PCT WO 98/01555 Sayîlll lPatent Basvurusu, dördüncü alanl içermeyen (sTNFR- lain amino asit kallîitflarl'(Thr127-Asn161) ve sTNFR-lPnin amino asit kallîitl'larFl(Prol41- Thrl79)); üçüncü alanlîlß bir bölümünü (sTNFR-liin amino asit kalitJhrj(Asnm-Cys'26) ve sTNFR-ll”nin amino asit kalßtÜhrÜ(Pr0123-Lysi40)); ve tercihe baglüolarak, birinci alan& bir bölümünü (amino asit kal it IarZKAspl-Cysigof sTNFR-I) ve amino asit kal it IEirlLeul-Cys32 of sTNFR-II)) içermeyen sTNFR-I ve sTNFR-Hinin tepesi kesik formlarmüaçüglamaktadi Mevcut bulusun belirli yönlerinde tepesi kesik sTNFR,ler, formül (Ri-[Cysig-Cys103]-R2 ve R4- ve sTNFR-II”nin tepesi kesik formlardn.

Burada kullanildlgl üzere, “Ri-[Cysl9-Cysw3]-R2”, bir veya birden fazla proteini temsil Patent DokümanEiEi Sekil lsinde saglanmaktadm; burada R1, Cysmun bir inetiyonile veya metiyonile olinayan amine grubu veya Cys18 ila Aspl ,den seçilen bir veya birden fazla amino- terminal amino asit kal mtßiüemsil etmektedir; ve burada R2, Cys nin bir karboksi grubunu 104 110 veya Phe ila Leu arasßdan seçilen bir veya birden fazla karboksi-terminal amino asit Mevcut bulusun örnek teskil eden tepesi kesik sTNFR-Iiler, kgîlayßjolmayacak sekilde varyantlarn lve türevlerini içermektedir. Belirli örnek teskil eden tepesi kesik sTNFR-Ner, yay nlanm s PCT WO 98/01555 Say 1|| Patent Doküman nda açlklanmaktad Il.

Burada kullanlldlgl üzere, “R3-[Cy532-Cysl15]-R4”, bir veya birden fazla proteini temsil etmektedir, burada [Cys32-Cys'l5], sTNFR-Il”nin Cys32 ila Cys115 kal HitlTarFdlî, bunun sekanslII bir metiyonile veya inetiyonile olmayan amine grubu veya Cys31 ila Leui ,den seçilen bir veya birden fazla amino-terminal amino asit kal ßtßßüemsil etmektedir; ve burada R4, Cysl 'Siin bir karboksi grubunu veya Ala ila Arg12 arasmdan seçilen bir veya birden fazla karboksi- terminal amino asit kal îlt 3] Il :temsil etmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde tedaviler OPGLlye kars Lien az bir antikoru, ve en az bir serin protez inhibitörü ve burada açlltlandlgl sekilde tedavilerin kullanlldlgl yöntemleri içermektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir tedavi OPGUye karsl [bir antikoru, ve bir serin protez inhibitörünü ve en az bir ilave molekül aç klanmaktad î.

Endojen proteolitik enzimler, isgalci organizmalar] antijen-antikor komplekslerini ve adli& gerekli veya kullangljolmayan belirli doku proteinlerini bozabilmektedir. Enfektif maddeler, organizmaya ek proteolitik enzimleri ekleyebilmektedir. Proteaz inhibitörleri, endojen ve isgalci proteolitik enzimleri regüle edebilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, dogal yollarla olusan proteaz inhibitörleri, reaksiyonlaanLl lokal olarak ve geçici olarak klslltlayarak endojen proteazlarln kontrol edilmesine hizmet etmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, proteaz inhibitörleri, enfektif maddelerle vücuda dahil edilen proteazlarînhibe edebilmektedir. Belirli durumlarda, kîlîlayößlmayacak sekilde solunum yoluna ait olanlarüiçeren, özellikle proteolitik saldîßla ve enfeksiyona meyilli olan dokular, proteaz inhibitörleri aç :st idan zengindir.

Proteaz inhibitörleri, insan plazma proteinlerinin yaklasR olarak %10,unu içermektedir. Bu kaynaktan en az sekiz inhibitör izole edilmistir ve bunlar, literatürde karakterize edilmektedir.

Bunlar, kâîlayîlîblmayacak sekilde alfa-Z-makroglobulin (alfa ZM), alfa l-proteaz inhibitörü (alfa lPI), alfa l-antikimotripsin (alfa lAchy), alfa 1 antikolagenaz (alfa lAC) ve inter-alfa- tripsin inhibitörü (I-alfa-I) içermektedir.

Belirli durumlarda, proteaz/proteaz inhibitörü dengesinin bozulmas,| klslltlayldl lolmayacak sekilde amtîzem, artrit, glomerülonefrit, periodontitis, musküler distrofi, tümör invazyonu ve diger çesitli patolojik durumlarlîçeren proteaz-arac [ll-doku ylklînlîia yol açabilmektedir. Belirli durumlarda, örnegin sepsis veya akut lösemi gibi çesitli patolojik süreçlerde, mevcut serbest proteolitik enzim miktar] salg Tayîl `hücrelerden enzim sal ?i înlîidan dolayl'ârtabilmektedir.

Dahas] belirli durumlarda, organizmanlîi bozulmus regüle edici inhibitör kapasitesi aynEl zamanda, proteaz/proteaz inhibitörü dengesinde degisimlere yol açabilmektedir. Bu tarz bozulmus bir regüle edici inhibitör kapasitesinin kEEflayßüolmayan bir örnegi, pulmoner anfizem gelisimi ile iliskili bir alfa l-proteaz inhibitörü eksikligidir.

Belirli durumlarda, proteolitik enzimlerin kontrol edilmesi için önlemler aanmadeça bu tarz anormal kosullarlri mevcut oldugu durumlarda organizmaya ciddi hasar gelebilmektedir. Bu sekilde, proteolitik enzimlerin kontrol edilmesi için bir organizmaya uygulanabilen proteaz inhibitörleri aranm lst i.

Lökosit elastaz, tripsin, katepsin G ve pankreatik elastaz, serin proteazlarüolarak bilinen proteazlar Il bir s 3 Ilîl i k 3 Illay B :olmayan örnekleridir.

Belirli durumlarda, lökosit elastaz, hücre dßüolarak sal îldEgEida, bag dokuyu ve diger degerli proteinleri bozmaktadE. Normal olarak islev gösteren bir organizma, belirli miktarda bag dokuyu ve diger proteinleri bozarken, asLiiLlmiktarda lökosit elastaz mevcudiyeti, kleLtllayLdLl olmayacak sekilde amfizem ve romatoid artrit dahil çesitli patolojik kosullarla iliskilendirilebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde normalden daha büyük iniktarlarda mevcut oldugunda lökosit elastazm etkilerini yok etmek için, lökosit elastaza özgü bir proteaz inhibitör aranmgtm. Bu tarz bir proteaz inhibitörü, saüastmllns bir formda ve farmasötik olarak kullanßlüolan yeterli iniktarlarda izole edilebilmeleri veya hazîlanabilmeleri halinde kullan 31 llabilmektedir.

Belirli lökosit elastaz inhibitörleri, Schiessler ve ark., Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes'de “Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function” aç klanmaktad i Havemann ve ark. (eds), Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978), ve Travis Belirli durumlarda, tripsin, klsltlaylcl olmayacak sekilde pankreatiti içeren çesitli akut kosullar esnasîlda pankreatik doku gibi belirli yumusak organ dokusunun bozulmasîrlbaslatmaktadîrl.

Bir tripsin inhibitörü, saflastinltnlsl bir formda ve farmasötik olarak kullanlsll lolan yeterli miktarlarda izole edilebilmesi ve haz _rllanabilmesi halinde kullan `sll _blabilmektedin Katepsin G, lökositlerde mevcut bir diger proteazdß. Belirli yathndîlmalarda, katepsin G, kompleman yoluna ait olanlar dahil çesitli proteinleri In vitro olarak bozabilmektedir.

Pankreatik elastaz, pankreatitte bir role sahip olabilen bir diger proteazdß. Bu sebepten ötürü, bu proteazlarîl inhibitörleri, farmasötik degere de sahip olabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde serin proteazlarn farklLlinhibitörlerine sübstrat özgü'llügü ve hassasiyetinin, sadece bir kaç amino asit kallntlslnda degisimlerden meydana geldigine inan Imaktad'n. Klsas yoluyla, nispeten bir kaç amino asitte olan degisimin, farkli proteazlarln inhibisyonu ile sonuçlanacagHserin proteaz inhibitörlerin bir slîiFflîilîi tasarlanmasFmümkün olabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bu SEiEfEi bir eleman: her bir serin Bir örnek teskil eden serin proteaz inhibitörü, salgEayEElökosit proteaz inhibitörü (SLPI) ve bunlarîl fragmanlarü ve analoglarElE. Örnek teskil eden serin proteaz inhibitörleri aynü zamanda, kßîlayEE olmayacak sekilde anti-lökoroteaz (ALP), mukoza proteaz inhibitörü (MP1), insan seminal plazma inhibitörü-I (HUSI-I), bronsiyal mukus inhibitörü (BMI) ve servikal mukus inhibitörü (CUSI) içermektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir serin proteaz inhibitörü ayn Zamanda LPS modülatörü olabilmektedir. Bkz. öm. Jin ve ark. (1997), Cell 88(3): 417-26. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bu moleküller, tercihe bagl`lolarak kkidaga yönlendirildikleri için kemik kayb îta yol açan kosullarda kullanßi için uygundur. ,633,227 SayJDPatent Dokümanlarmda açEklanmaktadm YukarEiaki referanslarda ve ayni] zamanda, bunlari herhangi bir varyant îlda veya analogunda tarif edilen moleküller, kolektif olarak “serin proteaz inhibitörleri” olarak adlandmhnaktad E. gama olarak adlandmllan bir pro-inflamatuvar sitokindir. Belirli durumlarda, IL-l'in, IL-18 üretimini yukar lregüle ettigi gösterilmistir ve IL-18, IL-6 ve MMP-l dahil bir dizi proinflamatuvar sitokinlerin üretimini indüklemektedir. Bkz. örn. Dinarello ve ark. (1998), J.

Leukocyte Biol. 63: 658-64. Belirli durumlarda, kaspaz l, IL-18 üretimi için de önemlidir.

Deneyler aynl lzamanda, TNF-oUn n, IL-18 üretimini regüle ettigini ve TNF-oc ve IL-l8'in es zamanljinhibisyonunun, karaciger toksisitesine karsEkoruma yaptEgEiEgöstermektedir. Bkz. etmektedir. IL-18, bir aksesuar proteini (IL-18RAcP) ile etkilesime geçen bir hücre yüzeyi reseptörü (IL-18R) ile etkilesime geçmektedir. IL-lS-aracEEsinyallesme, IL-18, IL-18R ve IL- 18RAcPlnin kompleksinin olusumuna baglLblarak ilerlemektedir. IL-18”in bir dogal inhibitörü, 18R etkilesimini önleyecek sekilde bir “sahte reseptör” olarak hareket etmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, tedaviler OPGLlye karsübir antikor, ve en az bir lL-18 inhibitön'inü ve bu tür tedavilerde kullanEIan tedavi yöntemlerini içermektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir tedavi bir OPGL”ye karsüantikor ve bir IL-18 inhibitörü ve burada aç klanan en az bir ek molekülü içerrnektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerine göre tedavi edilebilecek olan örnekleyici rahatsîlklar kßEflayElD olmayacak sekilde inflamasyon, otoimmün hastalklar, IL-l aracEIJE hastallklarü ve TNF-aracElE hastalEklarE içermektedir.

OPGL,ye kars |_bir antikorla ve mevcut bulusun belirli yönlerine göre en az bir IL-18 inhibitörü ile tedavi edilebilen örnek teskil eden kosullar, klsltlaylcl olmayacak sekilde romatoid artrit; sistemik lupus eritematozus (SLE); graft versus host hastallg. |(GvHD); hepatit; sepsis; ve bu hastal klara eslik eden kemik ve kldeak kayb _dahil artriti içermektedir. Örnek teskil eden lL-18 inhibitörleri, kßîllayßîl olmayacak sekilde lL-l8”e baglanan antikorlarî IL-18R7ye baglanan antikorlarü IL-18RACP°ye baglanan antikorlarE IL-18bp; IL- 18R fragmanlar E(örn. IL-l8 reseptörünün bir çözülmüs hücre dßEalanEiD; IL-l83e baglanan ve 18RACP ile etkilesimi azaltan veya önleyen peptitleri; IL-18RAcPsye baglanan ve IL-18R ile etkilesimi azaltan veya önleyen peptitler; ve IL-l8 üretimini veya herhangi IL-18, IL-18R ve aç klanmaktad 3.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGLSye karsl lbir antikor enflamasyon için en az bir terapötik madde ile birlikte kullanllabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde OPGL”ye karsT bir antikor immün rahatsl'zlllk için en az bir terapötik madde ile birlikte kullan Jhbilmektedir. lntlamasyona ve immün rahats Ilklara yönelik örnek teskil eden terapötik maddeler, kßmayEEolmayacak sekilde prednisolon dahil kortikosterodileri; siklooksijenaz tip 1 (COX-l) ve siklooksijenaz tip 2 (COX-Z) inhibitörleri dahil steroidal anti-inflamatuvar ilaçlar3(NSAID,1er); metotreksat, hidroksiklorokin, klorokin, siklosporin, altß bilesikleri (örnegin auranofin, aurotiomalat ve aurotiyoglukoz) ve leflunomid dahil hastalEgDmodifiye edici antirömatik ilaçlar (DMARD7lar); kßmlayElEblmayacak sekilde Rolipram ve Pentoksifilin dahil tip IV fosfodiesteraz inhibitörleri; Tacrolimus (FK-506); Sirolimus (rapamisin); mikofenolik asit; klslltlaylcl olmayacak sekilde Zileuton dahil 5-lipoksigenaz inhibitörleri; interlökin-öin n (IL-6) modülatörleri; 38 kDa mitojeni aktif halde protein kinazln (p38-MAPK) küçük molekül modülatörleri; inflamasyon yollarTida yer alan hücre içi moleküllerin küçük molekül modülatörlerini içermektedir, burada bu hücre içi moleküller, kßmlayßüolmayacak sekilde jnk, [KK, NF-KB, ZAP7O ve lck7yi içermektedir. Inflamasyona yönelik belirli Örnek teskil eden terapötik maddeler, C.A. Dinarello and L.L. Moldawer ProinIlammatory and Anti- Amgen Inc. Thousand Oaks, CA referansida açüglanmaktadm. Inflamasyona ve otoimmün hastalklara yönelik belirli örnek teskil eden terapötik maddeler, kßîlayEEolmayacak sekilde interferon gama (lFN-y) modülatörleri; OX40/OX40L modülatörleri (OX40°E çözünebilir formlarjdahil); 4-1 BB/4-1 BB ligandßîi modülatörleri (4-1 BB,nin çözünebilir formlarEl dahil); ve kIsJîlayIljolmayacak sekilde reseptör ligand çiftlerinin (CD28/B7, CD40/CD4OL, reseptörlerine baglanmaktad'ii) B hücresi-T hücresi yardlihcl luyaran yollar ri modülatörlerini içermektedir. B hücresi-T hücresi es uyaran yollarlrl belirli örnek teskil eden örnekleri, kîîllayîijolmayacak sekilde CD28, B7.] ve B7.2 inhibitörleri (B7.] veya B7.2”nin çözülebilir formlarjve CTLA4”ün çözülebilir formlarjdahil, her ikisi de bozulmay Dazaltan veya önleyen ve/veya yarjömrü arttman, toksisiteyi azaltan, immünogenisiteyi azaltan veya çözülebilirlik veya dolaslîh yarEömrünü arttlîlarak bir terapötik proteinin biyolojik aktivitesini arttßan bir heterolog peptide veya proteine kaynasfk olabilmektedir); CD40 ve CD4OL inhibitörleri (bir heterolog peptide veya proteine kaynasß olabilen CD40' 51 çözülebilir formlarîdahil); ICOS ve B7RP1 inhibitörleri (bir heterolog peptide veya proteine kaynask olabilen ICOS”un çözülebilir formlar ldahil); ve AGP-3, TACI ve BAFFR inhibitörlerini (TACI ve BAFFR°nin çözülebilir formlar ldahil) içermektedir. ICOS, B7RP1 ve bunlarln inhibitörleri, örnegin WOOO/46240.

AGP-3, TACI ve BAFFR,de açlklanmaktadlr ve bunlarln inhibitörleri, WOOO/47740, 140 referans Eda aç Elanmaktad m.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, kßElayEEolmayacak sekilde malignani veya metastatik tümörlerin yol açtfgükemigin osteolitik yEkEnEidan ortaya çEkan kemik kaybEdahil kemik kaybîlîl tedavi edilmesinde kullanEha yönelik OPGL'ye karslîbir antikor kullanirnaktadm Mevcut bulusun belirli yönlerinde, kanserle iliskili olan kemik kaybEiEi tedavi edilmesi için OPGL,ye kars lbir antikor kullanilabilmektedir. Örnek teskil eden kanserler, meme, prostat, tiroid, böbrek, akciger, özofagus, rektal, mesane, servikal, yumurta] Ik ve karaciger kanserleri ve ayni hamamda gastrointestinal yolu içennektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, k slitlay de | olmayacak sekilde Hodgkin Hasta] g ldahi] multipl miyelom ve lenfomay liçeren belirli heinatolojik maligniteler ile iliskili kemik kaybn n tedavi edilmesi için OPGL”ye kars [bir antikor kullan Iabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGUye kars Ebir antikor tek bas Ela uygulanmaktad E.

(LHRH) antagonist. ln certain aspects of the present disclosure, a LHRH antagonist is a peptide antagonist Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGL'ye kars bir antikor, k 9 tlay d blmayacak sekilde en az bir diger kanser tedavi maddesi dahil en az bir diger terapötik madde ile uygulanmaktad 11. Örnek teskil eden kanser tedavi maddeleri, ksîlayöîolmayacak sekilde radyasyon tedavisini ve kemoterapiyi içermektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, kemoterapi, asagldakilerden bir veya birden fazlasFl ile tedaviyi içerebilmektedir: antrasiklinler, taksol, tamoksifen, doksorubisin, 5-tlorourasi1 ve teknikte bilinen diger ilaçlar. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir kanser tedavisi maddesi, bir lüteinizan hormon salglatßühormon (LHRH) antagonistidir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir LHRH antagonisti, bir peptit antagonistidir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde,, bir LHRH antagonisti, peptidi içermektedir: Ac-D-Nal-4- Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pr0-D-Ala-NH2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 20), burada Nal, 3-(2-naftil)alanvinil; 4-Cl-Phe(4”-klorofeni1)alanini1dir; Pal, 3- (3,-piridil)alaninildir; ve Lys(iPr), N-epsilon-Z-propil-lisinildir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir LHRH antagonisti, bir LHRH antagonisti dekapeptittir. Örnek teskil eden belirli dekapeptitler, örnegin US 5,843,901 SaymDPatent Dokümanîida aç Elanmaktad 3.

Mevcut bulusun belirli yönlerine göre örnek teskil eden terapötik antikorlar, kßmlaylîiü olmayacak sekilde antikor kütüphanelerinin görüntülenmesi sayesinde seçilenler dahil fare, fare-insan kimerik, CDR-asjljinsanlastEEmS ve tamamen insan antikorlariüve sentetik antikorlardiçennektedir. Örnek teskil eden antikorlar, kLSLtlayujUolmayacak sekilde tümör hücrelerde mevcut hücre yüzey proteinlerine (Her2, CDCZO, CDC33), müsin benzeri glikoproteine ve tümör hücrelerde epidermal büyüme faktörü reseptörüne (EGFR) baglananlarl l içermektedir ve tercihe baglFolarak, bu proteinleri gösteren tümör hücrelerde bir sitostatik ve/veya sitotoksik etkiyi indüklemektedir. Örnek teskil eden antikorlar aynDzamanda meme kanserinin ve diger kanser formlarii tedavi edilmesi için kullanIabilen HERCEPTINTM (trastuzumab) ve non-Hodgkin lenfomanß ve diger kanser formlarßîi tedavi edilmesi için kullan Jhbilen RITUXANTM (rituksimab), ZEVALINTM (ibritumomab tiuksetan) ve LYMPHOCIDETM (epratuzumab) içermektedir. Belirli örnek teskil eden antikorlar aynü zamanda, ERBITUXTM (IMC-C ve Campathlj içermektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde,, kanser tedavi maddeleri, k slltlay dl olmayacak sekilde TNF ile iliskili polipeptit TRAIL içeren tümör hücrelerde apoptozu seçici bir sekilde indükleyen polipeptitlerdir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGLlye kars Fbir antikor, bir kanser tedavi maddesi ile tedaviden öncesinde, kanser tedavisi ile birlikte ve sonraslrtda uygulanabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, tedavide kullanîha yönelik OPGL/ye karsHbir antikor, metastatik kanser ile kemik kaybülm baslangîiîtîlprofilaktik olarak önlemek veya gidermek için uygulanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, metastazdan dolayü kemik kaybîii mevcut bir kosulunun tedavisi için OPGL, ye kars Joir antikor uygulanabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, çoklu miyelom ile iliskili kemik kaybîljönlemek ve/veya tedavi etmek için ve/veya hastalgß kendisini önlemek ve/veya tedavi etmek için OPGL7ye karsi bir antikor kullanLlabilmektedir. Multipl miyelom, önemli morbiditeyle ve/veya mortaliteyle sonuçlanabilen bir B hücresi türevi bir tümördür. Belirli durumlarda, multipl miyelomun bir klinik manifestasyonu, lokalize bölgelerde artan osteoklast aktivasyonundan kaynaklanabilen fokal kemik kaybldlî. Birçok miyelom hastasü radyolojik analiz ile görülebilen kemik kaybijyasamaktadß ve iskelet agrEEldan muzdarip olmaktadE. Belirli durumlarda, miyelom hastalarÇ spontane bir sekilde veya yaralanmadan dolayEolusabilen ilgili kemigin patolojik kERlara karsEhassasti Belirli durumlarda, miyelom esnasßda olusan iskelet lezyonlar] sadece kemik kEERlarlîia degil, ayn: zamanda özellikle omurgada deformiteye ve bazen sinir sügßmasßa yol açmaktadî BazEhastalarda, serum kalsiyumda (hiperkalsemi) bir patolojik artß olusmaktadE ve hastalEk tedavisi esnasEida önemli problemlere yol açabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, kemik rezorpsiyonunun azaltlmas lveya bloke edilmesi ve kalsiyumunun sal nmasl için OPGL”ye karsl, klnlk ve omurga deformite riskini azaltabilen bir antikor saglanmaktadlr.

Belirli durumlarda, miyelom hücreleri, kemik yülihia dogrudan katElEn göstermemektedir, bunun yerine osteoklast farklülaslîhia ve aktivasyona yol açan hücre dßj sinyalleri üretmektedir. Belirli durumlarda, osteoklastlar, özellikle aktif hale getirildiklerinde yüksek sitokin IL-6 seviyelerini üretmektedir. IL-6, bir B-hücresi büyüme faktörüdür ve In vitro mürin ve insan miyelom hücrelerinin büyümesine katkü göstermektedir. Miyelom hücreleri ayni zamanda OPGL7yi dogrudan veya dolaylü olarak üretebilmektedir, bu da kemik iligi bosluklarida gömülü miyelom hücrelerini çevreleyen lokal kemik lizisi ile sonuçlanabilmektedir. Belirli durumlarda, miyelom hücresine bitisik normal osteoklastlar bu sekilde IL-67yLJ üretmektedir, bu da tümör hücrelerinin lokal olarak genislemesine yol açabilmektedir. Miyelom hücreleri, bir klonal modelde genislemektedir ve uygun olmayan bir kemik rezoprisyonu ile olusturulan kemik aral klar It isgal edebilmektedir.

Kemirgenlerde OPG uygulamaslnln, osteoklast popülasyonunun hlzll ölümünü indükledigi sayîsllîldaki bir azalma, bu hücrelerle artan IL-6 üretiminin etkisini yok edebilmektedir ve bu sekilde, trabeküler kemik içerisindeki miyelom hücrelerinin büyümesini ve sagkalîhEiEl etkileyebilmektedir. Bu sebepten ötürü, mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir miyelom hastas ia, OPGL,ye kars :bir antikorun uygulanmasüsadece hiper kemik rezorpsiyonunu degil, ayn Ilzamanda tümörün kendi genislemesini ve sagkal iiüiEletkileyebilmektedir.

B-hücreleri, OPGL, ODAR”a yönelik reseptörü eksprese etmektedir. Miyelom hücreleri aynLl zamanda ODARW l eksprese etmektedir ve ek olarak, OPGUyi üretebilmektedir. Belirli durumlarda, aynl hücre popülasyonunda OPGL ve ODAR, n ekspresyonu, miyelom hücresinin sagkalîhlîlîetkileyen bir otokrin uyari-CFslîirolusturabilmektedir. Bu sebepten ötürü, mevcut bulusun belirli yönlerinde, OPGUye karsEbir antikorun uygulanmasÇ miyelom hastalarîlda görülen tümör yükünün azaltüldfgjveya elimine edildigi sekilde tümör hücresi sagkalBiîlZl azaltabilmektedir.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, farmasötik olarak kabul edilebilir bir seyreltici, tasglîîj çözündürücü, emülsifiye edici, koruyucu ve/veya yardîncîile birlikte OPGL'ye kars Eterapötik olarak etkili bir antikor miktarn içeren farmasötik bilesimler saglanmaktad Lr.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, OPGUye karsl bir antikorun terapötik olarak etkili bir miktarîlîve farmasötik olarak kabul edilebilir bir seyreltici, taslýölîçözündürücü, emülsifîye edici, koruyucu ve/veya yard inc Eile birlikte en az bir ek terapötik maddenin terapötik olarak etkili bir miktarßjiçeren farmasötik bilesimler saglanmaktadi. Burada tarif edilen belirli yönlerde,, en az bir ek terapötik madde, kßElayleolmayacak sekilde BMP-1 ila BMP-12 arasüida belirlenen kemik morfojenik faktörleri; dönüstürücü büyüme faktörü-ß (TGF-ß) ve TGF-B aile elemanlarî kßülayEEolmayacak sekilde, lL-l ra ve bunlar& türevleri ve KineretTM dahil interlökin-l (IL-l) inhibitörleri; çözülebilir bir TNFO( reseptörü, EnbrelTM, anti-TNFa antikorlar] RemicadeTM ve D2E7 antikoru dahil TNFOL inhibitörleri; paratiroid horinon ve bunlarn analoglar,| paratiroid ile iliskili protein ve analoglarl; E serisi prostaglandinler; bifosfonatlar |(ömegin alendronat ve digerleri); florür ve kalsiyum gibi kemik gelistirici mineraller; klêftllaylörblmayacak sekilde CelebrexTM ve VioxxTM gibi COX-Z inhibitörleri dahil steroidal olmayan anti-inflamatuvar ilaçlar (NSAlD°ler); metotreksat veya leflunomid gibi immünosüpresanlar; kEHayQZblmayacak sekilde, salgüayßülökosit proteaz inhibitörü (SLPI) dahil serin proteaz inhibitörler; IL-6 inhibitörleri (kßßlayEEolmayacak sekilde IL-6,ya karsîl antikorlar dahil), IL-8 inhibitörleri (kßîlayEEolmayacak sekilde, IL-8,e kars :antikorlar dahil); dahil); Interlökin-l dönüstürücü enzim (ICE) modülatörleri; FGF-'l ila FGF-10 arasßda fibroblast büyüme faktörleri ve FGF modülatörleri; PAF antagonistleri; keratinosit büyüme faktörü (KGF), KGF ile iliskili moleküller veya KGF modülatörleri; matris metaloproteinaz (MMP) modülatörleri; kLsLtlachLolmayacak sekilde indüklenebilir NOS modülatörleri dahil Nitrik oksit sintaz (NOS) modülatörleri; glukokortikoid reseptörün modülatörleri; glutamat reseptörünün modülatörleri; lipopolisakkarit (LPS) seviyelerinin modülatörleri; ve noradrenalin ve modülatörler ve bunlari mimetikleri aras lîidan seçilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, kabul edilebilir formülasyon malzemeleri tercihen, kullan Ian dozajlarda ve konsantrasyonlarda al 3 Iara toksik degildir.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, farmasötik bilesim, örnegin pH, ozmolalite, viskozite, berraklk, renk, izotonisite, koku, sterillik, kararlEEEk, çözünme hgüveya bilesimin salîiiiü sogurumu veya penetrasyonunun degistirilmesi, sürdürülmesi veya engellenmesi için formülasyon malzemelerini içerebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde,, uygun formülasyon malzemeleri, klsltlaylcl olmayacak sekilde amino asitler (örnegin glisin, glutamin, asparagin, arjinin veya lisin_); antimikrobiyaller; antioksidanlar (örnegin askorbik asit, sodyum sülfit veya sodyum hidrojen-sülfit); tamponlar (örnegin borat, bikarbonat, Tris-HCI, sitratlar, fosfatlar veya diger organik asitler); hacim arttBBÜmaddeler (örnegin mannitol veya glisin); kenetleme maddeleri (örnegin etilendiamin tetraasetik asit (EDTA)); komplekslestirici maddeler (örnegin kafein, polivinilpirrolidon, beta-siklodekstrin veya hidroksipropil-beta- siklodekstrin); dolgu maddeleri; monosakkaritler; disakkaritler; ve diger karbonhidratlar (örnegin glukoz, mannoz veya dekstrinler); proteinler (örnegin serum albümini, jelatin veya immünoglobulinler); renklendiririci, lezzet verici ve seyreltici maddeler; emülsifiye edici maddeler; hidrofilik polimerler (örnegin polivinilpirrolidon); düsük molekül agmlüglü polipeptitler; tuz olusturan karsE iyonlar (örnegin sodyum); koruyucular (örnegin henzalkonyum klorür, benzoik asit, salisilik asit, timerosal, fenetil alkol, metilparaben, propilparaben, klorheksidin, sorbik asit veya hidrojen peroksit); çözücüler (örnegin gliserin, propilen glikol veya polietilen glikol); seker alkolleri (örnegin mannitol veya sorbitol); ask ya alma maddeleri; yüzey aktif maddeler veya lêlatlîzl'tnaddeler (örnegin pluroniks, PEG, sorbitan esterleri, polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lesitin, kolesterol, tiloksapal gibi polisorbatlar), stabilite arttlîlîlîl maddeler (örnegin sukroz veya sorbitol); tonisite arttlîllölî maddeler (örnegin alkali metal halitler, tercihen sodyum veya potasyum klorür, mannitol sorbitol); teslimat araçlarî seyrelticiler; eksipiyanlar ve/veya farmasötik yardlîncEmaddeleri içermektedir. (Remingtonls Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990).

Burada tarif edilen belirli yönlerde, OPGL"ye karsjbir antikor ve/Veya bir terapötik molekül, teknikte bilinen bir yarL ömrü uzatdJvehiküle baglanmaktast. Bu vehiküller, kslLtlaydLl olmayacak sekilde Fc alanlnl, polietilen glikolü ve dekstranl liçermektedir. Bu vehiküller, Patent Basvurusunda aç klanmaktad m.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, optimal farmasötik bilesim, örnegin uygulamanß arzu edilen rotasîla, iletim formatlia ve istenilen dozaj Ela baglE olarak teknikte uzman kisi tarafidan belirlenecektir. Bkz. örnegin Remington”s Pharmaceutical Sciences, supra. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bu tarz bilesimler, mevcut bulusun antikorlarEiEi fiziksel durumunu, stabilitesini, in VIVO salîlii oranîlîlve in VIVO klerens oraniktkileyebilmektedir.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, farmasötik bir bilesim üzerinde birincil vehikül veya taslydl yaplsal olarak sulu olabilmekte veya susuz olabilmektedir. Örnegin, burada tarif edilen belirli yönlerde, uygun bir vehikül veya tasýölîl parenteral uygulamaya yönelik bilesimlerde yaygi diger malzemeler ile desteklenmesi muhtemel olan enjeksiyona yönelik bir su, fizyolojik salin çözeltisi veya yapay beyin omurilik sîlîljolabilmektedir; nötr tamponlu salin veya serum albumin ile karßtEEünß salin ayn Ezamanda örnek teskil eden vehiküllerdir. Burada tarif edilen belirli yönlerde,, farmasötik bilesimler, yaklask 7.0-8.5 pH Tris tamponunu veya yaklask 4.0-5.5 pH asetat tamponunu içerrnektedir ve ayrEa sorbitolü veya bunlarEi uygun bir ikamesini içerebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL`ye kars Ebir antikoru içeren bir bilesim, bir liyofilize kek veya bir sulu çözelti formunda tercihe baglîformülasyon maddeleri (Remingtonss Pharmaceutical Sciences, supra) ile arzu edilen saflk derecesine sahip olan seçilmis bilesim karLStLiitlarak depolama için haz lilanabilmektedir. Dahas ,l burada tarif edilen belirli yönlerde,, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGLaye karsl lbir antikoru içeren bir bilesim, sakaroz gibi uygun eksipiyanlar kullan Harak bir liyofilizat olarak formüle edilebilmektedir.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, burada tarif edilen ve/veya talep edilen farmasötik bilesimler, parenteral iletim için seçilebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, bilesimler, oral yolla oldugu gibi sindirim yolu vasîasßila solunum veya iletim için seçilebilmektedir. Bu tarz farmasötik olarak kabul edilebilir bilesimlerin preparasyonu, teknikte uzman kisiler tarafmdan bilinmektedir.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, fonnülasyon bilesenleri tercihen uygulama alanîla için kabul edilebilir olan konsantrasyonlarda mevcuttur. Burada tarif edilen belirli yönlerde, tamponlar, tipik olarak yaklas k 5 ila yaklaslk 8 aralg'nda bir pH arallgl içerisinde olmak üzere fizyolojik olarak pH”da veya hafifçe düsük olan bir pl-l7da bilesimin sürdürülmesi için kullan llnaktad îi.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, parenteral uygulama tasarlandgida, bir terapötik bilesim, farmasötik olarak kabul edilebilir bir vehikülde ek terapötik maddelerle veya bu maddeler olmadan OPGLaye karsEarzu edilen bir antikoru içeren pirojensiz, parenteral olarak kabul edilebilir sulu çözeltinin formunda olabilmektedir. B Burada tarif edilen belirli yönlerde, parenteral enjeksiyonuna yönelik bir vehikül, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL”ye kars Uantikorun, uygun olarak korunmus bir steril, izotonik çözelti olarak formüle edildigi steril distile sudur. Burada tarif edilen belirli yönlerde, preparasyon, bir depot enjeksiyon sayesinde iletilebilen ürünün kontrollü veya sürdürülen sal n min lsaglayabilen enjekte edilebilir mikrosferler, biyo-asîidîlTabilir tanecikler, polimerik bilesikler (örnegin, polilaktik asit ya da poliglikolik asit), tanecikler veya lipozomlar gibi bir madde ile istenilen molekülün formülasyonunu içerebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, hiyalüronik asit de kullanüabilmektedir ve dolas Bida sürdürülen sürecin arttlîflmas ßa yönelik etkiye sahip olabilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, implante edilebilir ilaç iletim cihazlarü istenilen moleküle dahil edilmesi için kullan Iabilmektedir.

Burada tarif edilen belirli yönlerde, solunuma yönelik farmasötik bir bilesim formüle edilebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL”ye karsUbir antikor, solunuma yönelik bir kuru toz olarak formüle edilebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGUye kars lbir antikoru içeren bir solunum çözeltisi, aerosol iletimine yönelik bir püskürtücü ile formüle edilebilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, çözeltiler nebulizc edilebilmektedir. Pulmoner uygulama, kimyasal olarak modifiye edilmis proteinlerin pulmoner iletimi açlklayan WO 94/20069 Al olarak yayinlanan Uluslar ArasFI Patent Basvurusunda aç Elanmaktadß.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, formülasyonlarlîi oral olarak uygulanabildigi tasarlanmaktad 3. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL`ye karsübir antikor, tabletler ve kapsüller gibi katjdozaj formlarElEl bilesik hale getirilmesinde geleneksel olarak kullan [Ibn bu tasßllîiülarla veya tasßißüar olmadan formüle edilebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde biyoyararlanLm maksimuma çakar 1d g nda ve pre-sistemik bozulma minimize edildiginde, bir kapsül, gastrointestinal yolda bulunan noktada formülasyonun aktif bölümünün sallnmasl liçin tasarlanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, en az bir ek madde, OPGL°ye karsFantikorun ve/Veya herhangi bir ek terapötik maddenin absorpsiyonuna olanak saglayacak sekilde dahil edilebilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, seyrelticiler, aromalar, düsük erime noktaljvakslar, bitkisel yaglar, yaglaylZlEIar, süspanse edici maddeler, tablet parçalayBJmaddeler ve baglayBIlar da kullan Jhbilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir farmasötik bilesim, tabletlerin üretimi için uygun olan, toksik olmayan eksipiyanlarla bir kartsmda en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL”ye karsi letkili miktarda antikorlarl içerebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, steril suda veya bir diger uygun vehikülde tabletler çözünerek, çözeltiler, birim doz formunda hazîllanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde uygun eksipiyanlar, kEIlayBjolmayacak sekilde kalsiyum karbonat, sodyum karbonat veya bikarbonat, laktoz veya kalsiyum fosfat gibi inert seyrelticileri; veya nisasta, jelatin veya akasya gibi baglayßü maddeleri; veya magnezyum stearat, stearik asit veya talk gibi yaglayZi] maddeleri içermektedir.

Ek farmasötik bilesimler, sürekli veya kontrollü iletim formülasyonlarida en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGLiye kars EantikorlarEiçeren formülasyonlarEl dahil edilmesi, teknikte uzman kisiler taraandan anlasLllacaktlr. Mevcut bulusun belirli yönlerinde lipozom taslyldllar, biyolojik olarak as nabilir mikropartiküller veya gözenekli tanecikler ve depot enjeksiyonlarl gibi diger çesitli sürekli veya kontrollü iletim araçlar nin formüle edilmesine yönelik teknikler de teknikte uzman kisiler taraflîldan bilinmektedir. Bkz. örnegin, WO 93/ 1 5722 A1 olarak yay nlanan PCT basvurusu, farmasötik bilesimlerin iletimleri için gözenekli polimerik mikro partiküllerin kontrollü sallîilînl'rll'açlklamaktadrrl. Mevcut bulusun belirli yönlerinde yavas salEiEnlEpreparasyonlar, örnegin filmler veya mikro kapsüller gibi sekilli maddelerin formunda yarjgeçirgen polimer matrisleri içerebilmektedir. Sürekli glutamik asidin ve gama etil-L-glutamatEi kopolimerleri (Sidman ve ark., Biopolymers, ark., supra) veya poli-D(-)-3-hidroksibutirik asidi (EP 133,988) içerebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, Sürekli salln mi | bilesimler ayrda teknikte bilinen çesitli yöntemlerin herhangi birisi ile hazlrlanabilen lipozomlarl liçerebilmektedir. Bkz. örn. Eppstein 143,949. edilen belirli yönlerde, bu, steril filtrasyon membranlarü boyunca filtrasyon vaslîasßlla tamamlanabilmektedir. Burada tarif edilen belirli yönlerde, bilesimin liyofilize oldugu yerde, liyofilizasyon ve sulandEma öncesi veya sonrasîlda bu yöntem kullanilarak sterilizasyon uygulanabilmektedir. Burada tarif` edilen belirli yönlerde, parenteral uygulamaya yönelik bilesimler, liyofilize formda veya bir çözeltide depolanabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir intravenöz çözelti poseti gibi bir steril erisim yuvas na sahip olan bir kaba veya bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile delinebilen bir stopere sahip olan ilaç sisesine konulabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde farmasötik bilesim formüle edildiginde, bir çözelti, süspansiyon, jel, emülsiyon, katjolarak veya dehidre veya liyofilize toz olarak steril siselerde depolanabilmektedir; bu formülasyonlar, bir kullanlîha hazm formda veya uygulamadan önce yeniden olusturulan bir formda (örn. liyofilize) depolanabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir tek dozlu uygulama biriminin üretilmesine yönelik kitler saglanmaktadn; her bir kit, bir kurutulmus proteine sahip olan bir birinci kabive bir sulu formülasyona sahip olan bir ikinci kabl içerebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde tek ve çok hazneli önceden doldurulmus slrlngalarl v içeren kitler (örn., slvl l sliingalar ve liyos lilîlgalar) saglanmaktad TL Mevcut bulusun belirli yönlerinde, en az bir ek terapötik madde ile veya madde olmadan, OPGL7ye karsEbir antikoiu içeren, terapötik olarak kullanEIacak olan etkili bir farmasötik bilesim miktarü örnegin terapötik baglama ve amaçlara baglEolacaktE Teknikte uzman kisi, tedavi için uygun olan dozaj seviyelerinin, iletilen moleküle, en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL°ye kars [antikorun kullanEdEgEendikasyona, uygulama yoluna ve hastanEi boyutuna (vücut agElgü vücut yüzeyi veya organ boyutu) ve/veya kosuluna (yas ve genel saglllêt) baglEblarak degiskenlik gösterecek olmas ütakdir edilecektir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, klinisyen, dozajLltitre edebilmektedir ve optimal terapötik etkinin elde edilmesi için uygulama yolunu degistirebilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, tipik bir dozaj, yukarida bahsi geçen faktörlere bagl! `olarak, yaklas'k 0.1 ug/kg ila yaklas lt 100 mg/kg veya daha fazla bir arallkta olabilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, dozaj, tig/kg ila yaklasÜî 100 mg/kg aralEgEida olabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, dozaj SEIîIEgü OPGL,ye karsjantikorun farmakokinetik parametrelerini ve/veya kullanjhn formülasyonda herhangi bir ek terapötik maddeyi hesaba katacakti Mevcut bulusun belirli yönlerinde bir klinisyen, arzu edilen etkiye ulasan bir dozaj elde edilene kadar, bilesimi uygulayacaktu. Mevcut bulusun belirli yönlerinde bilesim bu sekilde tek bir doz olarak veya zamanla iki veya daha fazla doz olarak (istenilen molekülün ayn' lmiktarln liçerebilen veya içermeyebilen) veya bir implantasyon cihazl lveya kateter sayesinde bir devamlFinlîizyon olarak uygulanabilmektedir. Uygun dozajlîl bir diger gelisimi, teknikte uzman kisi tarafEidan rutin bir sekilde olusturulmasEve bunlar taraflîidan rutin bir sekilde uygulanan görevlerin alanüiçerisinde olmasßm. Mevcut bulusun belirli yönlerinde uygun dozajlar, uygun doz-yanîverisinin kullanEhEsayesinde dogrulanabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, farmasötik bilesimin uygulama yolu, intravenöz, intraperitoneal, intraserebral (intra-parankimal), intraserebroventriküler, intramüsküler, intra- oküler, intraarteriyel, intraportal veya intralezyonel yollar vaslîas Sila; sürekli aslîlßi sistmeleri veya implantasyon cihazlarj vas Ias Sila oral yollarla bilinen yöntemlere göre gerçeklestirilmektedir. Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bilesimler, bolus enjeksiyonu veya ara] ks Zi olarak infüzyon veya implantasyon cihazl sayesinde uygulanabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bilesim ayrlîla istenilen molekülün, absorbe edildigi veya enkapsüle edildigi bir membranîn, süngerin veya bir diger uygun malzemenin implantasyonu vas Tas-yla lokal olarak uygulanabilmektedir. Burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yathndiinalarda, bir implantasyon cihazEiEi kullanElldEgüyerde cihaz, herhangi bir uygun dokuya veya organa implante edilebilmektedir ve istenilen inolekülün iletimi, difüzyon, zaman salmlilibolus veya araltlisî uygulama olabilmektedir.

Mevcut bulusun belirli yönlerinde, bir in vitro sekilde en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGL7ye karsDbir antikoru içeren bir farmasötik bilesimin kullanîhjarzu edilebilmektedir. Bu tarz durumlarda, hastadan çLkardian hücreler, dokular veya organlar, hücrelerin, dokularlii ve/veya organlarln daha sonraslnda hastaya geri implante edilmesinden sonra en az bir ek terapötik madde ile veya bu madde olmadan OPGLiye kars lbir antikoru içeren bir farmasötik bilesime maruz blîlakilmaktad IT!.

OPGL7ye kars Jbir antikor ve/veya herhangi bir ek terapötik madde, polipeptitleri eksprese etmek ve salgElamak üzere burada aç Elananlar gibi yöntemler kullanElarak genetik olarak tasarlanmg belirli hücreler implante edilerek iletilebilmektedir. Bu tür hücreler, hayvan veya insan hücreler olabilmektedir ve otolog, heterolog ve ksenogenik olabilmektedir. Hücreler ölümsüzlestirilebilmektedir. Burada tarif edilen ve/veya talep edilen belirli yaplIlandEmalarda, bir immünolojik yanLt sans LnLn azalttllnas Jiçin, hücreler, çevreleyen dokularm infiltrasyonunu önlemek için kapsüllenebilmektedir. Enkapsülasyon malzemeleri genellikle biyolojik olarak uyumlu, protein ürünlerinin sal nlmlna olanak saglayan, fakat hastanln iininün sistemi sayesinde veya çevreleyen dokulardan kademeli diger faktörler sayesinde hücre yltîhîiî önleyen yar :geçirgen polimerik muhafazalar veya membranlard E. ÖRNEKLER Yürütülen deneyler ve ulastlan sonuçlar dahil olmak üzere asagElaki örnekler, sadece görsel amaçlar için saglanmaktad i ve mevcut bulusu k Is] Illay Il :olarak yorumlanmamaktad E.

OLOPGL-l Ag& ve Hafif Zincirlerin Klonlamasü Tam uzunlukta insan OPGL cDNASyl leksprese eden CHO hücreleri, insan iininünoglobulin genleri içeren transjenik farelerini immünize edecek sekilde kullanllmaktadlr. lmmünize farelerden alman lenf bezleri, hibridomlarü üretmek için mürin miyelom hücrelerine birlestirilmektedir. Hibridom dizilerinden gelen süpernatantlar, insan OPGL ile reaksiyona giren antikorlara yönelik bir ELISA deneyinde test edilmektedir. Hibridoin hatlarmlAMG 6.5, AMG eksprese eden Anti-OPGUnin, OPGL,ye yönelik yüksek affiniteli antikorlarîs mas @la eksprese ettigi bulunmaktadm ve AMG 6.5, klonlama için seçilmektedir. AMG 6.5 ve AMG 6.4”den agm ve hafif CDNA klonlarîl özdestir ve AMG 6.5, &OPGL-l hafif Zincirli cDNAsyjklonlayacak sekilde kullanlliken, AMG 6.4, OLOPGL-l ag& Zincirli cDNA,yü<10nlayacak sekilde kullanü'maktad li OLOPGL-l hafif zincirin klonlanmasl sarmal cDNA”dan PCR amplifikasyon yöntemleri kullanEarak elde edilmektedir. Birinci sarmal cDNA, bir genisletilmis 5'-adaptör (5”-GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3° (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 15)) ile bir rastgele primer ve Birinci Sarmal cDNA Sentez kitine (kat. no. 18089-011) yönelik Gibco SuperScript II TM Preamplifikasyon Sistemi ile saglanan malzemeler ve yöntemler kullan larak AMG 6.5 toplam RNA7dan hazlrlanmaktad 11.

Asag da bulunan oligonükleotidler, PCR için kullan .lmaktadvnz , kappa RACE primeri: ”-GAT GAC CCA GTC TCC AGC CAC CCT G - 3` (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) 3a kappa RACE primeri: ”- AAG GGT CAG AGG CCA AAG GAT GG - 3, (SEKANS KIMLIK NUMARASI: Güçlendirilmis DNA,lar, pCRII-TOPÜya (Invitrogen) klonlanmaktadm ve elde edilen plazmidler sekanslanmaktadlî. Kappa zincirli konsensüs sekansj tam uzunlukta OtOPGL-l kappa zincirinin PCR amplifikasyonuna yönelik primerleri tasarlayacak sekilde kullanJInaktadE. 5”0LOPGL-1 kappa primeri, klonlamaya yönelik bir XbaI bölgesini (TCTAGA) ve baslatîFlMet kodonundan önce bir “CCACC” Kozak sekanslîiîiçermektedir. 3”0LOPGL-1 kappa primeri, klonlamaya yönelik stop kodonundan sonra bir SaII bölgesini (GTCGAC) içermektedir. 5,0tOPGL-1 kappa primeri: °-CAA CTC TAG ACC ACC ATG GAA ACC CCA GCG-3” (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) XbaI Bölgesi Kozak M E T P A (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 16) 3”0t0PGL-l kappa primeri: KIMLIK NUMARASI: 8) Sa" Bölgesi * * C B G R N F (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 17) Tam uzunlukta aOPGL-l kappa zincirli cDNA klonu, 53 ve 3,0tOPGL-l kappa primerleri ile amplifikasyon vas &as Sila, yukarlîla aç Elanan AMG 6.5 birinci sarmal CDNA kullanflarak elde edilmektedir. PCR reaksiyonu, OtOPGL-l kappa zincirinin (Sekil 4, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4) kodlayan bir 738 hp fragman Eiüüretmektedir. Bir QIAquick PCR Saflastîma kiti (Qiagen kat. no. 28104) kullan Iarak yap [Ibn saflastßmadan sonra, bu fragman, kappa hafif zincirli ekspresyon vektörünü olusturacak sekilde kullan Ülnaktad E.

Yukar da üretilen 738 hp tam uzunlukta kappa fragman ,iXbaI ve SaII ile kesilmekte, Promega Wizard DNA Temizleme Sistemi (Promega kat. no. A7100) kullanllarak saflastlrlllmakta ve plazmid ocOPGL-l-kappa/pDSRoclC) üretmek üzere pDSR0i199a klonlanmaktadLn (Sekil 5). pDSROL19 öncesinde açlklanmlstlr (bkz. burada herhangi bir amaca yönelik olarak referansla pDSROL2, asag maki yöntemlerle modifiye edilmektedir: F SH polyA, yaklasfk olarak 1400 baz çifti ile 885 baz çiftine kßaltülnaktadî ve simdi Ndel bölgesinde sona etmektedir; dihidrofolat redüktazJ(DHFR), yaklask olarak 1 kilobaz ile 5, ucundan kaaltlms olan 209 baz çiftini içermektedir; ve DHFR polyA sekans ndan yaklas li olarak 550 baz çift BgIII silinmektedir.

OLOPGL-l kappa hafif zincirli ekspresyon klonu, AMG 6.5 hibridomda tan îhlanan aynDpeptit için kodlandgiüdogrulayacak sekilde sekanslanmaktad B. Nihai ekspresyon vektörü (ocOPGL- l-kappa/pDSROL19), 5476 bp,dir ve Tablo 2`de gösterilen 7 islevsel bölgeyi içermektedir.

Tablo 2: OLOPGL-l-kappa/pDSROLIWun özellikleri Plazmid Baz Çifti 2 ila 881 bovin hipofiz glikoprotein hormonunun (Ot-F SH) OL-alt biriminden bir transkripsiyon sonlandEma/poliadenilasyon sinyali (Goodwin, ve ark, Nucleic 882 ila 2027 Endojen fare DHFR promoterini, cDNA kodlama sekanslaanL ve DHFR transkripsiyon sonland mna/poliadenilasyon sinyallerini içeren bir fare dihidrofolat redüktaz (DHFR) minigeni (Gasser ve ark, Proc Natl Acad Sci U S 2031 ila 3947 Amfisilin direnç isaretleyici genini ve E.coli°de plazmid replikasyonun kaynaglîljçeren pBR322 sekanslarüGenbank Erisim Numaras E101749) 4299 ila 4565 HTLV-l LTR alanüda bir dönüsümsel gelistirici eleman (Seiki ve ark, Proc 4750 ila 5476 XbaI ve SalI bölgeleri aras lida OLOPGL-l Kappa hafif Zincirli cDNA Vektörün bir dairesel plazmid haritas 3 Sekil Site gösterilmektedir.

OLOPGL-l hafif zincirin klonlanmasl OtOPGL-l lgG2 ag] zincir, Clontech MarathonTM cDNA Amplifikasyon kiti (kat. no. Kl802-1) ile üretilen AMG 6.4 hibridom çift sarmal cDNA9dan klonlanmaktadß. AMG 6.4 agm Zincirli cDNA°ni amplifikasyonu, insan germ hattJIgGZ ag] Zincirli sabit bölgeye özgü primerler (asag Ea gösterilmektedir) ve MarathonTM cDNA amplifikasyon kitinde saglanan diger malzemeler ve yöntemler ile uygulanan cDNA uçlarnln (RACE) 5” ve 3, hLzlLamplifikasyon teknikleri ile tamamlanmaktad n.

, IgG2 RACE primeri ,- GGC ACG GTC ACC ACG CTG CTG AG -3, (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9) 3” IgG2 RACE primeri ”- CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TCT -3” (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) klonlanmaktadß ve sekanslanmaktad B. Bu sekans bilgisi, tam uzunlukta sekans& klonlanmas Diçin OLOPGL-l agi zincire özgü primerleri tasarlayacak sekilde kullan Jinaktad 3. Ag& zincirli 5' primeri (, yolcu sarmal ßa kars :yönlendirilmektedir ve bir HindIII bölgesine ve dogal baslanglçl bölgesinden önce konsensüs Kozak sekans na sahiptir. Agiii Zincirli 3, primeri (3”OLOPGL-l IgG2 Primeri), ag 11 Zincirli IgG2 sekanslnln son amino asidinden sonra bir Sall bölgesini ve stop kodonunu içeren bir rehber primeridir. ° aOPGL-l IgG2 Primeri: (SEKANS KIMLIK NUMARASI: ll) HIndIII Kozak M E F G L S W L F L V A (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 18) 3”0.0PGL-l IgG2 Primeri: KIMLIK NUMARASI: 12) Sal] * * K G P s L 5 L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 19) Yukarîla açüîlanan çift sarmal cDNA, 5”- ve 3,- OLOPGL-l IgG2 primerlerle PCR amplifikasyonu vasiasgila tam uzunlukta agm Zincirli cDNA°yJ üretecek sekilde kullanJInaktadE. PCR, (xOPGL-l IgG2 agm Zincirli proteinin 467 amino asit kalmtßmE(l9 amino asit IgG sinyal sekansEdahil) kodlayan bir 1433 bp fragmanüiüüretmektedir (Sekil 2, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2). Bir QIAquick PCR Satlastima kiti (Qiagen kat. no. 28104) kullan lJarak yapllan saflastlrmadan sonra, bu fragman, asagldaki gibi aglil Zincirli ekspresyon vektörünü olusturacak sekilde kullanllmaktadlr.

Yukaera üretilen tam uzunlukta lgGZ ag& fragmanjkodlayan DNA, Hindlll ve Sall ile kesilmektedir, QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti (Qiagen kat. n0.28704) kullanElarak saflast nîlmaktadîn ve bu fragman, pDSROLl9,a klonlanmaktadln. Elde edilen ekspresyon plazmidi, aOPGL-l-IgGZ/pDSRocl9 olarak adlandmüînaktadî (Sekil 6). Tüm vektör bilesenleri, OtOPGL-l IgGZ agi Zincirli cDNA,ni, XbaI ve SaII bölgeleri arasmda ocOPGL-l kappa hafif Zincirli cDNA7yE degistirmesinin haricinde yukarßla açItlanan ocOPGL-l- kappa/pDSRa19 vektörüne özdestir. OLOPGL-l IgG2 agm Zincirli ekspresyon klonu, AMG 6.4 hibridomda tanEhlanan aynE polipeptit için kodlandEgiD dogrulayacak sekilde sekanslanmaktad 3.

CHO hücrelerinde OLOPGL-l ekspresyonu ocOPGL-l antikorunun stabil ekspresyonuna, dihidrofolat redüktaz :eksik (DHFR') Çin hamster yumurtaltk hücrelerine (CHO AM-l/D, US 6,210,924 SayLlLlPatent DokümanL) OLOPGL-l- kappa/pDSROL19 ve OLOPGL-l-IgGZ/pDSROLl9 plazmidlerinin birlikte transfeksiyonu ile ulas [Ilnaktad 3, bunu da bireysel klonlari izolasyonu ve test edilmesi takip etmistir.

Bir 100 mm doku kültürü kabÇ CHO d`ortamßda (DME yüksek glikoz, %10 fetan bovin serumu, %1 penisilin/streptomisin/glutamin, lX NaPiruvat, %1 esas olmayan amino asitler (NEAA))(Gibco®) ve %1 ht takviyesi (Gibco®)) transkfesiyondan önceki gün (0. Gün) büyütülen 1.5x106 AM-l/D hücrelerle plakalanmaktadlî. Birinci günde, 400 pl serumsuz RPMI 1640 ortam (Gibco®), bir 12x75mm polipropilen tüpe bölünmektedir. Yirmi dört mikrolitre TransIT®-LT1 reaktif (Mirus Corporation), ortama damlat larak eklenmektedir ve karlSlmn, oda slcakllglnda 10 dakika inkube edilmesine olanak saglanmaktad I1. Daha sonras nda toplam ug linearize plazmid DNA (Pvul ile sindirilmis, 7.5 üg ocOPGL-l-kappa/pDSRocl9 ve dakikal Ig' îia inkube edilmektedir.

CHO d-ortaml,l 10 ml Dulbecco fosfat tamponlu salinle (Gibco®) ylkanan hücrelerden çkar lh'iaktadlii. Alt' lmililitre serum içermeyen, HT, L-glu, NEAA ve Na piruvat ile takviye edilen (Gibco®) MEM ortaml,1 hücrelere eklenmektedir. DNA/LT] kompleksi, DNA,y| hücreler üzerine esit olarak dagEtlnak için nazikçe geriye ve ileriye sallanan plakalara dainlat larak eklenmektedir. Bir doku kültürü inkubatöründe 6 saat kaldEktan sonra, ortam, yeni CHO d-ortamEile degistirilmektedir. Kmk sekiz saat sonra, hücreler, CHO seçim ortamEida (DMEM yüksek glikoz, %10 diyalize fetal bovin serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin/glutamin, %1 esas olmayan amino asitler ve IX Na piruvat) (Gibco®) on 100 mm kültür kabEla bölünmektedir. Ortam, koloniler görülene kadar haftada iki defa degistirilmektedir. lsllatllan 5 mm klonlama diskleri (Labcore®) kullan'larak toplanmaktadlii ve CHO seçim ortaml lile 24 hazneli doku kültürü plakalarida kültürlenmektedir. Hücreler birbirine karßî hale geldiginde, serum içermeyen ortamlar (CHO seçim ortam Jeksi FBS) eklenmektedir ve 48 saat sonra toplanmaktadüi. Bu kosullandîrilmls ortamlar, OtOPGL-l ag'n zinciri tespit etmek için yabanturpu peroksidaz (HRP)-k0njüge keçi anti-insan IgG Fc antikoru (Pierce, Rockford, IL) ve keçi anti-insan kappa zincir antikoru (Pierce, Rockford, IL), bundan sonra OtOPGL-l hafif zinciri tespit etmek için HRP konjüge tavsan anti-keçi IgG (H+L) antikoru (Pierce, Rockford, IL) ile Western blotu vastlasyla antikor ekspresyonu için analiz edilmektedir. En yüksek eksprese edici klonlar genisletilmekte ve sivi hitrojende depolanmaktad 11.

OLOPGL-l üretimi Hücre Dizisi 12505nun Preparasyonu ve Olusumu orOPGL-lsi üreten CHO hücreleri, serum içermeyen kosullar altEida 96 hazneli plakada seyreltiyi iki tur klSltlayarak klonlanmaktadln. Klonlar, çesitli süspansiyon haznelerinde üretim ve büyüme özelliklerine baglüolarak seçilmektedir. ElA'lar, en yüksek (xOPGL-l seviyesini üreten klonu seçmek için uygulanmaktadE. Iki kat ßa çRma sürelerini ve yogunluklarßüçeren zamanda 3 L Aplikon biyoreaktörlerinde klonlarl büyüterek ölçülmektedir. Kültürde en yüksek yogunluga ulasan en hlzlll liki katlna çlkma süresine sahip klon seçilmektedir ve Hücre Dizisi 125Q olarak adlandlnllmaktadln. Klon, yaklaslk olarak lXlO7 hücre/mL miktarda 360 ampulü dondurmak üzere yeterince hücre sunacak sekilde genisletildiginde, hücreler, bir kriyo koruyucu, serum içermeyen ortamda (10 ml/L esas olmayan amino asitle ve 10 ml/L L- Glutamin (Gib-co/LTI/Invitrogen) ve %10 dimetil sülfoksit (JT Baker) ile takviye edilen %90 VM-soy Batch OrtamE (Detaylar için bkz. Tablo 3) yeniden askßla al limakta ve dondurulmaktad E. Ampuller, kßîlüerisim saglanan bir tesiste depolanmaktadE ve slSlEnitrojen temaslarda 5 El :nitroj ene dald îhaktad 3.

Küçük ölçekli çeviricilerde ve büyük ölçüde biyoreaktörlerde büyümeye ve üretime bagl l olarak, Hücre Dizisi 125Q, (iOPGL-l üretimine yönelik hücre dizisi olarak seçilmektedir.

Hücre Kültürü OLOPGL-l, plazmidlerden (ocOPGL-l-kappa/pDSROLl9 ve (iOPGL-l-IgGZ/pDSROt19) aOPGL-lî eksprese eden CHO hücrelerinin bir klonal dizisi olan Hücre Dizisi 125Q°da ekspresyonla üretilmektedir. OtOPGL-PIn hücre kültür süreci, Sekil l9°da gösterilmektedir.

Her bir üretim çallsmasl için, Hücre Dizisi 125Q9nun bir ilaç sisesinden gelen hücreler, ilk olarak 125 ml erlenmeyer çalkalayldllarlnda 5 günlügüne 100 rpmlde 10 ml/L önemsiz amino asitler ve 10 ml/L L-glutamin (Gibco/LTl/lnvitrogen) (VM-Soy Supp) ile desteklenen 50 mL VM-Soy Batch OrtamEida (bilesim için bkz. Tablo 3) büyütülmektedir. Tüm kültür daha sonrasßda, VM-Soy Supp`yi 500 m1 bir döner kapta, 3xlO5 canlEhücrelere/ml (3E5 vc/ml) as Iayacak sekilde kullan JInaktadi 3-4 günlügüne 70 rpm döndürme ile gösterilmektedir. 500 ml döner siseden tüm kültür, bir 3L döner kapta VM-Soy Supp°yi 3E5 vc/mliye asEIayacak sekilde kullan Dnaktadi ve 3-4 günlügüne 70 rpm ile döndürülerek büyütülmektedir. 3L döner kaptan gelen kültür, fenol kîlmîîjolmadan VM-Soy Supplde 3E5 vc/mFde iki 3 L döner kaba bölünmektedir ve aynl .kosullar altinda büyütülmektedir. Bu döner kaptan gelen kültürler, fenol k nm zs lolmadan VM-Soy Suppade 3E5 vc/ml,de dört döner kaba asllanacak sekilde kullan Bnaktadi ve aynüçosullar altmda büyütülmektedir. Dört 3 L döner kaptan dört litre kültür, bir 20 L biyoreaktörde fenol kEmBEEolmadan 10 L VM-Soy Supp”yi as [[ayacak sekilde kullanllmaktadLr ve biyoreaktör, 7-10 günlügüne beslemeli modda çalLstLrllmaktadLii.

Beslemeli modda, konsantre ortam bilesenlerini içeren bir besin maddesi (asaglda Tablo 3”te belirlenen “besleme maddesi” terimi), hücre büyümesini ve kültür canllllglnl sürdürmek için eklenmektedir. 20L biyoreaktörden allîlan tüm kültür, bir 150L biyoreaktörde fenol klîömßlsl'olmadan 70 L VM-Soy Supp”yi as [[ayacak sekilde kullan [[maktadî ve biyoreaktör, 9-10 günlügüne beslemeli modda çalßmaktadß. Son olarak, 150 L biyoreaktörden al [Ilan tüm kültür, bir 2000L biyoreaktörde yaklas& olarak 880L VM-Soy (takviye veya fenol kmmîîslj içermeyen) as Iayacak sekilde kullanüînaktadî ve biyoreaktör, beslemeli modda çalßtîümaktadß.

Beslemeli mod esnas Eda besleme oran: kültürde bulunan glikoz seviyesinin, her bir biyoreaktör için 0.6 g/L miktarda sürdürüldügü sekilde belirlenmektedir. Hücre yogunlugu ve glikoz konsantrasyonu günlük olarak ölçülmektedir ve besleme oran Lbu sekilde ayarlanm LStLr. 2000L biyoreaktörde üretim, aOPGL-l ,in, temel olarak hücreler tarafßdan üretildigi ve hücre kültürü ortam Ela salg Jhndgisüre esnas Eda yaklas 11 olarak iki hafta sürmektedir. Üretim reaktörü, pH, sßaklü'ç ve çözülmüs oksijen seviyesinin ayarlanmas &da kontrol edilmektedir: pH, 7.0,dm ve karbon dioksit gazüve sodyum karbonat eklentisi ile kontrol edilmektedir; çözülmüs oksijen, 120 mmHg”dir ve hava, nitrojen ve oksijen gaz akßlarEile kontrol edilmektedir. Hücreler, süreç boyunca 37°C`de sürdürülmektedir. Tüm gazlar, 0.22 um veya daha az gözenek boyutuna sahip membran Iiltreleri üzerinden geçirilmektedir. Üretimin sonunda, hücre suyu, bir disk y gn lsantrüfüjüne besleninektedir ve kültür süpernatant.,| hücrelerden ayr lmaktadlr. Sentrat, bir Cuno 9OSP derinliginde filtre ve bundan sonra bir 0.2 um Posidyne filtresi (Pall Co.) üzerinden daha fazla saflastlnllmaktadn Saflastnllarak kosulland iiilms ortamlar, 50kD NMWL membranlar (Millipore Biomax 50) kullanJhrak tegetse akgljultrafiltrasyon (UF) ile konsantre edilmektedir. KosullandEÜmß ortam, 15- ila 30- kat konsantre edilmektedir. Elde edilen konsantre kosullandilnß ortam (CCM), sailastîma vasEfasßlla islenmekte veya sonraki bir tarihte satlastEma için dondurulmaktad E. Üretim süreci, Sekil l9°da özetlenmektedir.

Hücre Kültürü Ortamü Tüm hücre kültür süreci boyunca kullanEna yönelik hücre kültürü ortam: Dulbeceo1nun Modifiye Edilmis Eagle OrtamLZll-Iamhi Besini F12'ye (DMEM/F12, 121) baglldln ve amino asitlerin, ek besinlerin ve tuzlarln takviye seviyelerini, bir soya hidrolisat lve rekombinant insan insülini (Nucellin®Zn, Eli Lilly) içermektedir. Bilesenler, Tablo 3ate listelenmektedir. Bu ortam, VM-Soy olarak ifade edilmektedir. Ortam çözeltileri, kullanîn öncesinde 0.2 um gözenek boyutunun membran filtreleri vasltaslyla filtrelenmektedir.

Tablo 3. Hücre Kültürü Ortam Bilesenleri BAZAL Ortam ve BESLEME MADDELERINE YÖNELIK BILESEN VMSoy Ylgln Ortami BESLEME (mg/L) MADDESI DMEM/FIZ .

Inorganik Tuzlar Diger Bilesenler Na Hipoksantin 5.40 10.8 Linoleik asit 0.090 0.18 Lipoik asit 0.2060 0.412 Fenol Kimâßj 8.10 16.2 Sodyum Piruvat 110.00 220 Amino asitler L-Alanin 26.70 53.4 L-Arjinin HCl 295.00 590 L-AsparajinH20 45.00 90 L-Aspartik asit 39.90 79.8 Inorganik Tuzlar L-Glutamik asit 44.10 88.2 L-Glutamin 657.00 1314 L-Lisin HCl 182.50 365 L-Metiyonin 34.480 68.96 L-Prolin 57.50 115 L-Serin 73.50 147 L-Treonin 106.90 213.8 L-Triptofan 18.040 36.08 L-Valin 105.70 211.4 Vitaminler D-Ca Pantotenat 4.480 8.96 Kolin Klorür 17.960 35.92 Folik Asit 5.30 10.6 i-Inositol 25.20 50.4 Niasinamid 4.040 8.08 Piridoksal HCl 4.00 8 Piridoksin HCl 0.0620 0.124 RiboIlavin 0.4380 0.876 Tiamin HCl 4.340 8.68 B12 Vitamini 1.360 2.72 EK BILESENLER Nuselin Zn, (rhu insulin) 5.00 15 Sclcnoz Asit 0.0050 0.015 Hidrokortizon 0.020 0.06 Safl astima Süreci CHO hücrelerinde eksprese edilen (xOPGL-l, hücre dlsl l ortama salgllanmaktadlr. Saf malzemeyi üretecek sekilde bir dizi adil kullan Iabilmektedir. Süreç, bir düsük pH adiiüve viral filtre ile birlikte hidrofobik yük indüksiyonunu, katyon degisimini ve hidrofobik etkilesim kromatografisini kullanmaktad E. Asag Ela bu prosedürler aç [klanmaktad E.

A. Hidrofobik Yük Indüksiyon Kromatografisi (HCIC)10 Bu kromatografi, konak hücresi proteinlerinin ve DNA7nîi çogunlugunu çEIlarmaktadi Konsantre kosullandLnLlmLs ortam (CCM), bir Cuno 3OSP filtresi vas las yla ve daha sonras nda bir Cuno VR07 yüklü selüloz bazll filtre vasltaslyla filtrelenmektedir ve daha sonraslnda bir MEP HyperCel reçinesine yüklenmektedir. Yüklemeden sonra, kolon, denge tamponu (20 mM Tris pH 7.2) ile yFltanmaktad lî'l. Antikor, bir düsük pH tamponu kullan [Tarak reçineden ayr Stillmaktadil (20 mM Sodyum Asetat, pH 5.0). Kolondan ayristlrlldlgl lüzere, 280 nm kolon ak îitîla absorbansa dayal _ürün toplanmaktad B.

B. Viral Inaktivasyon MEP havuzu, pH 3.7”ye titre edilmektedir ve potansiyel olarak kontamine edici retrovirüsü etkisiz hale getirecek sekilde yaklastk olarak 60 dakikalEgEia tutulmaktadm. Tutma süresinden sonra, pH, yaklasIR olarak 6.07a ayarlanmaktad E.

C. Viral Filtrasyon pH” `l ayarlanmis hav 2, bir Millipore Viresolve NFR filtre veya esdegeri vas Tas Sila filtrelenmektedir. Antikor, filtre vaslîas Sila akarken, potansiyel olarak kontamine edici virüsler Z 50 nm, tutulmaktad E.

D. Katyon Degisim Kromatografisi (CEX) Antikor, SP Sepharose HP (Amersham Pharmacia) veya esdegeri kullan Jhrak katyon degisim kromatografîsi ile daha fazla saflastLnlJmaktadLr. Katyon degisim kromatografisi adLmL,Jek CHO hücre proteinleri, DNA, düsük moleküler agilkta proteinler ve onOPGL-lain kümelenmis formlar n lçlkarmaktadlr. Katyon degisim reçinesine, Viral filtrelenmis havuz yüklenmektedir.

Yüklemeden sonra, kolon, denge tamponu (20 mM NaMES pH 6.2) ile ylkanmaktadln. Daha sonrasßda, antikor, artan tuzun (20 mM NaMES pH 6.2, 0 M NaCl ila 20 mM NaMES pH 6.2, 0.3 M NaCl) bir lineer gradyanjile ayrßtîüînaktadî Kolondan ayrßtmüklfgüüzere, 280 nm kolon ak it Zla absorbansa dayalîürün toplanmaktad E.

E. Hidrofobik Etkilesim Kromatografisi (HIC) Antikor, Phenyl Toyopearl veya esdegeri kullanüarak hidrofobik etkilesim kromatografisi ile daha fazla saflastEEünaktadE. Katyon degisim kromatografisi admL,J ek cilalama admdolarak kullanLllnaktadle ve ek CHO hücre proteinleri, DNA, düsük moleküler agßlü& proteinleri ve OLOPGL-1°in kümelenmis formlarEiEçüîarmaktadm. Katyon degisim havuzu, 15-25°C,de >105 mS/cm bir iletkenlige amonyum sülfat eklentisi ile kolona yüklenmeden önce kosullandlnllmaktadln. Yükleme sonraslnda, kolon, denge tamponu (IM Potasyum Fosfat pH 8) ile yEkanmaktad E. Daha sonrasida, antikor, artan tuz konsantrasyonuun bir lineer gradyanjle ayrßt Emnaktadm (lM Potasyum Fosfat, OmM Tris pH 8 ila OM Potasyum Fosfat, 20 mM Tris pH 8). Kolondan ayrIsltEJJdgjüzere, 280 nm kolon ak îlt Zla absorbansa dayaljirün toplanmaktad 3.

F. Konsantrasyon ve Diafiltrasyon HIC kolon havuzu, 50kD NMWL membranlar (Millipore Bioinax 50) kullanilarak tegetsel ak si ultrafîltrasyon ile formülasyon tamponuna konsantre edilmekte ve diafîltrelenmektedir.

Formülasyon tamponu, 10 mM Asetat, %5 Sorbitol, pH 5.2,yi içermektedir ve 30 mg/mL OLOPGL-l ”i içermektedir.

Son F iltrasyon ve Depolama Satlastijlng ygi, bir üzerinden geçirilmekte, ömeklenmekte ve sabitlenmis bir dondurucuda yaklasü'g olarak -30°C'de depolanmaktad 3. Örnek 1 ve 2°de aç [ElandEgEüzere iki ekspresyon vektörü ile transfekte olan CHO hücrelerinde üretilen antikorlar, asag Ilaki örnekler 4, 5 ve 6°da kullan Habilmektedir.

Inasn OPG, sßianlarda, farelerde ve sinomolgus maymunlarda ve aynjzamanda insanlarda OPGL7yi baglamakta ve nötrlestirmektedir. aOPGL-l, insan yüksek affiniteli insan OPGL”ye baglanmaktad E, fakat mürin OPGL°sine önemli ölçüde baglanmamaktadE (Tablo 4).

Tablo 4: Insan, Sinomolgus, Maymun veya Fare Sekanslnln Hücre Membranl Eksprese Edilen OPGUve (xOPGL-l ,in Affînitesi OPGL Türleri dOPGL-l EDso (ng/ml) Sinomolgus 19 Fare Herhangi Spesifik Baglant JYok Bu türlerin OPGL°si, tam uzunlukta, membrana bagllîprotein olarak CHO hücrelerinde eksprese edilmektedir. Hücre yüzeyi eksprese OPGL”ye &OPGL-Fin baglanmas ,locOPGL-l ile inkube edilen hücrelerin FACS analizi ve insan lgG23ye bir FlTC-isaretli ikincil antikoru ile degerlendirilmektedir. ocOPGL-l, insan ve sinomolgus OPGL'sini baglamaktadE, fakat fare OPGLlsine herhangi bir spesifik baglantüyoktur.

Ek olarak, insan OPG,sinin, TNF ailesinin ilgili bir elemanEolan, DNA'yEve OPGLlye amino asit sekans homolojisini sergileyen tümör nekroz faktörü ile iliskili apoptoz indükleyici liganda Fakat OPG, TNFOL, TNFB veya CD40 ligandügibi TNF ile iliskili diger proteinlere tespit edilebilir sekilde baglanmamaktad Fri.

OLOPGL-l, spesifik olarak EIA plakalarlnda OPGL,ye baglanmaktadlr (Sekil 7). Rekombinant çözülebilir OPGL (2 ug/ml), 16 ila 24 saatligine oda sßaklEgEida 96 hazneli EIA plakalarEia kaplanmaktadlî. PBS,de %1 BSA ile bloklama sonras Eda, %1 BSA/PBS”de seyreltilen çesitli ve plakalar, oda sßaklgîlda yaklask 2 saatligine inkube edilmektedir. TMB-H202 (tetrametilbenzidin ve hidrojen peroksit) Sübstrat kokteyli kullanLlarak keçi anti-Insan IgG (Fab”)-HRP ile bagll l antikor tespit edilmektedir. Absorbans, 450 nm ve 650nmlde okunmaktadlr. baglanmaktadlî. FACS tamponunda (PES, %0.] BSA, %001 Sodyum Azid) seyreltilen (xOPGL-l (100 ng/ml), OPGL, TNF a, TNFb, TRAlL veya CD40 ligandîi (yaklasJî olarak 0.1 ng/ml ila 1000 ng/ml) çesitli konsantrasyonlarla Önceden inkube edilmektedir ve daha sonrasEida, hücre yüzeyinde membrana baglDOPGUyi stabil olarak eksprese eden CHO saat sonra, baglanmamlsl antikor, santrifüjleme ve yîkama ile çlkarllmaktadlr. Daha sonrasinda hücreler, FITC-isaretli F(ab,)2 Keçi anti-Insan IgG (Fcy fragmani& özgü) ile 2-8°C`de 30 dakikalEglIia inkube edilmektedir. Santifüjleme ve yEkama sonras lida, hücre yüzeyi Iloresanü akLg sitometrisi kullanüarak ölçülmektedir. Sekil 8, aOPGL-l ,in, CHO REN 218-9 hücrelerine baglantEiEi spesifik oldugunu ve çözülebilir OPGL eklentisi ile, fakat TNFa, TNFb, TRAIL veya CD40 ligandLn eklentisi olmadan, rekabetçi bir sekilde azaltJtlglüJgöstei-mektedir.

Rekabet deneylerinde, EIA plakalarüida OPGL°ye baglanan OtOPGL-l, eksojen OPGL eklentisi ile (Sekil 9), fakat TNFOL, TNFB, TRAIL veya CD40 ligand eklentisi olmadan (Sekil ), inhibe edilmektedir. Bu prosedür, &OPGL-Pin bir sabit konsantrasyonunun (100ng/mL), OPGL kaplüplakalara eklenmeden önce çözülebilir OPGL veya diger ligandlarß çesitli edilmesinin haricinde EIA plakalarEida (xOPGL-liin OPGUye baglanmas Diçin büyük ölçüde yukar Lda oldugu gibi ayn Llsekilde uygulanmaktad Lii (iOPGL-l Nötrlestirme Aktivitesi Osteoklast Olusumunun Inhibisvonu RAW , bir Abelson mürin lösemi Virüs ile indüklenmis tümörden türevlendirilmis bir mürin makrofaj hücre dizisidir. RAW 264.7 hücreleri, OPGL mevcudiyetinde 0ste0klast benzeri hücrelere aersacaktLii OPGL mevcudiyetinde RAW hücrelerinden kültürde osteoklastlarln olusumuna yönelik temel deney, kapsamll bir sekilde açlklanmlstlr.

RAW hücreleri, osteoklast benzeri hücrelere farklüasinak üzere ligand tarafütdan uyarütnaktadlî ve farklElaslIh, osteoklastlarm bir özelligi olan TRAP aktivitesi ile ölçülmektedir. Bu sebepten ötürü, osteoklastogenezde oiOPGL-l etkisi ölçülebilmektedir.

RAW hücreleri, hücre kültürü ortamîlda (DMEM, %10 F BS, 0.292 mg/ml L-Glut, 100 birim/ml Penisilin G, ve çesitli ocOPGL-l miktarlarîlEl (6.3 ng/ml ila 200 ng/ml) mevcudiyetinde 4 günlügüne inkube edilmektedir. 4. günün sonunda, hücreler, geçirimli hale getirme ve asitlestirme vastaslyla ve bundan sonra, 5 dakikalEglîla para-nitrofenilfosfat ile tedavi vasiasglla tartrata dirençli asit fosfataz (TRAP) aktivitesi için boyanmaktad E. KßacasÇ ortamlar, hücrelerden emilmektedir ve X-100), her bir hazneye eklenmektedir ve plakalar, oda s dakl g nda 3 ila 5 dakikallglna inkube edilmektedir. Daha sonraslnda, PNPP çözeltisinin yüz mikrolitre eklenmektedir (157.8 mg asit sitrat tamponu) ve plakalar, oda sidaklglnda 3 ila 5 dakikallglna inkube edilmektedir.

Reaksiyon, 50 ul 0.5 M NaOH çözeltisinin eklentisi sonlandlîlllnaktadlîl.

TRAP, 405 nm”de optik yogunluk ölçümü ile ölçülebilen para-nitofenilfosfatDpara-nitrofenole dönüstürecektir. Osteoklast gelisimine yönelik bir vekil isaretleyici olan TRAP aktivitesi, 405 nm'de optik yogunlukla iliskilidir. Optik yogunluga karsDocOPGL-l konsantrasyonun bir çizimi, Sekil llsde gösterilmektedir ve ocOPGL-lain, bu deneyde osteoklast olusumunu inhibe ettigini göstermektedir.

Reseptöre OPGL Baglantlslnln Inhibisvonu OLOPGL-l potansiyeli, ayni ltürden reseptöre, osteoklast farklllaslmlna ve aktif hale getirici reseptöre (ODAR, RANK olarak da bilinmektedir) OPG ligandßß baglantîsliîbloke edebilme kabiliyeti vaslîasglla gösterilmektedir. Bu deney, Evropiyum-konjüge osteoprotegerin liganda (Bu-OPGL) onOPGL-l baglantßmE tespit etmek için homojen zamanla çözülen floresan rezonans HHTRF) kullanmaktad E. AOPGL-17in, ODAR7a Eu-OPGL baglantßßünhibe etmesi halinde, floresan çkgjazaltacakti ve mevcut 0tOPGL-l miktarü floresan miktarjile tersten iliskili olacaktln.

OPGL, 337 nm @Bila uyarÜJdEgEida 620 nm”de Egjyayan evropiyum ile isaretlenmektedir.

ODAR, FLAG*ye ve Fcsye birlestirilmektedir ve Fc-ODAR-FLAG füzyon proteini, 620 nm”de anti-FLAG antikoru ile isaretlenmektedir. Bu sekilde, Eu isaretli OPG ligand] Fc-ODAR- FLAG/anti-FLAG-APC kompleksine baglandEgElda, üçlü kompleks, 337 nm°de Islllla uyarEIIdEgida 665 nm SEgEyayacaktm. oda sIlaklgîlda Tween 20) dOPGL-Fin çesitli konsantrasyonlarglla (01 ila 150 ng/ml) önceden inkube edilmektedir. Bir Fo-ODAR-FLAG (1 ug/ml) ve anti-FLAG-APC (2.5 tig/ml) karlSlm, layn, l zamanda deney tamponunda hazlrlanmaktadln ve bir saatligine (Florokrom karls'lml)| oda sldakll g nda inkube edilmektedir. Ön inkubasyon karisimlnln ve Florokrom karslm n n esit hacimleri daha sonras [Iida birlestirilmekte ve 3 saatligine oda sEaklEgEida inkube edilmektedir.

Floresan, 337 nin bir uyarii dalga uzunlugu ve 665 nm bir emisyon dalga uzunlugu kullanmarak Packard Discovery HTRF mikroplaka analiz cihazElda plakalarü okuyarak ölçülmektedir.

OLOPGL-l, OPG ligandüile önceden inkube edildiginde ve daha sonrasida Fc-ODAR- FLAG/anti-FLAG-APC ile kargtilhglîlda, 665 nm floresan yogunlugu, Sekil 127de gösterildigi gibi bir doza bagünlEsekilde azalabilmektedir, bu da aOPGL162”nin, ODAR”a OPGL baglantlslnl etkili bir sekilde inhibe edebildigini göstermektedir.

Sinomolgus Maymunlarda F armakokinetikler 4.5 yas îldan büyük olmayan ve 2 ila 4 kg agilglîlda olan altEerkek ve altEdisi sinomolgus maymunu, 4 doz grubuna atanmaktadß. 1. Grup, 3 erkekten ve 3 disiden olusmaktadß. 2, 3 ve 4. gruplar, 1 erkek ve 1 disiden olusmaktadln. 1. grupta bulunan hayvanlara, tek bir 1 mg/kg aOPGL-l SC dozu uygulanßken, 2, 3 ve 4. Gruplarda bulunan hayvanlara, sEasS/la 01, 1.0 veya 10.0 mg/kg omOPGL-l ,nin tek IV dozlar Euygulanmaktad E.

Hayvanlar, transfekte Çin hamster yumurtallk (CHO) hücrelerinden eksprese edilen aOPGL-l ile dozlanmaktadlîl Serum numuneleri, OtOPGL-l seviyelerinin, antikor analizinin ve kemik döngüsü belirteç serumu N-telopeptidin (serum N-Tx), alkalin fosfatazlîl (ALP) ve serum kalsiyumun (serum Ca) analizini saptamasEl için alümaktadi Ürin aynE zamanda, N- telopeptidin (ürin N-Tx) ve kreatinin analizi için toplanmaktadlr. karakterize edilmektedir (Sekil 13). Ilk olarak, bir hElEdagJEi asamasümevcut olmaktad 3, bunu konsantrasyona bag mljlarak görülen, önemli ölçüde yavas plato asamas Ltakip etmistir. Üçüncü gözlemlenen asama, hizli bir eliminasyon asamasldlr.

WinNonlin Professional (v1.5) kullan Harak tam serum konsantrasyon süresi profillerinin bölümlü olmayan analizi ve test maddesinin uygulanmaslndan sonra 14 güne kadar ve SAAM ll (v1.1.2) kullanFlarak 10,000 ng/mL miktarm üzerinde üstel veri analizi, maymunlarda OLOPGL-l”in farmakokinetiklerini inceleyecek sekilde kullanllmaktadlr. Tüin IV dozlar ndan ilk dagEDEh hacmi, plazma hacmine benzer olarak 28.9 ml/kg°dir. DagmlIhEi hazm kosulda hacmi (Vss), tüm IV dozlarEboyunca 39 ml/kg”dir. Üstel analiz. oiOPGL-liin, 6.02 saatlik bir ortalama dagmlîn yarjömrüne (ti/m), 0.1 mg/kg bir dozda 86.0 saat ila 10.0 mg/kg bir dozda maksimum 444 saat aralEgElda dozla art& gösteren bir yarEömürle (tyzß) genisletilmis bir ikinci asamaya sahip oldugunu göstermektedir. Terminal eliminasyon yarîömrü (ti/,2), tüm IV doz gruplarüboyunca bölümlü olmayan 31 saatlik ortalamalarütahmin etmistir. OLOPGL-l (CL, CL/F) klerensinin, 0.1 mg/kg (0.401 ml/saat/kg) alanlardan 3.3 kat daha düsük olan bir ortalama klerense (0.120 ml/saat/kg) sahip olan 10 mg/kg IV dozlarßEalan hayvanlarla lineer olmadEgEkesfedilmistir.

Subkütanöz olarak uyguland Rtan sonra, 132 saatte 11,600 ng/ml ortalama zirve konsantrasyonlarla absorpsiyon yavastm SC uygulamas Eidan sonra maruziyet aralgîlda 80.1 saatlik bir ortalama süreye (Cmax) neden olmaktad ri. Ortalama biyoyararlanlm, %89”dur. Önceki veriler, Tablo 5`te özetlenmektedir.

Tablo 5: otOPGL-l IV ve SC”nin Tek Bir Dolu Uyguland ktan Sonra Sinomologus Maymunlarda Ortalama (± SD)Bölümlü Olmayan Farmakokinetik Parametrelera Bölümlü Olmayan Parametre Tahminleri Parametre Birim SC (n=6) lV (n=2) lV (n=2`) lV (n=2) Tmax saat 1 32 60.2 0 0 O MRT saat i'Degerleri` 3 önemli sekle bildirilmektedir bBelirlenmemis, plato (ß) asamasîlbu sekilde terminal asamas _esnas _nda sona eren PK numuneleri gözlemlenmemcktedir CUygulanabilir degil OLOPGL-l, dozdan sonra 24 saat içerisinde serum N-Tx seviyelerinde hîlîbir azalmaya yol açmaktadiî. IV dozlarü 0.] ila `10 mg/kg aras Erda artß gösterirken, dozdan sonra 12 saat ve 7 gün arasîlda ve 1.0 mg/kg bir SC dozunu alan hayvanlarda 12 saat ve 11 gün arasßda maksimum etkili ortalama sürenin olustugu gözlemlenmektedir. Maksimum etki, 0.1 ila 1 mg/kg doz aralgüüzerinde yaklasfk olarak %80 ila 91 aralEglîlda dozla artß göstermektedir.

Fakat, daha yüksek dozlarda, maksimum %91 inhibisyonla herhangi bir diger süpresyon gözlemlenmemektedir. Ortalama serum N-TX seviyeleri, 0.1 mg/kg IV uyguland ktan sonra 28. gün itibariyle ve 1 mg/kg SC uygulandlktan sonra 70. gün itibariyle referans degerine geri dönmektedir. Ürin N-Tx, tüm gruplarlîi, 105 gün itibariyle referans degerlerine geri dönmesinin haricinde serum N-TX,inkilere benzer egilimler sergilemektedir (Sekil 15).

Serum (Ca) süpresyonu, 10.0 mg/kg IV uygulamasßdan ortalama yedi gün sonra referans degerinin altEida bir ortalama %31.6 dozla artß göstermektedir. Tüm diger doz gruplarü serumda (Ca), referans degeri ortalamalarEidan %26.47den daha az ortalama azalmalara sahiptir. 17. gün itibariyle, tedavi edilen hayvanlarda tüm serum (Ca) seviyeleri, referans degeri ortalamalarlnln %10`u içerisine geri dönmektedir (Sekil 20).

Kemik rezorpsiyonu ve olusumu yaklndan baglan riken, kemik olusuinu belirteçlerinde (ALP) olan degisimler de ALP seviyelerinde, olusum belirtecinden (N-TX) çok daha yavas düsüle ve çok daha uzatllmß süpresyonla gözlemlenmektedir (Sekil 21). AOPGL-l ile dozlamayjtakip eden kemik olusum belirteçlerinden (ALP) önce kemik rezorpsiyon belirteçlerindeki düsüsün gözlemlenmesi, OLOPGL-l ,in, bir kemik anti-rezorptif madde oldugunu onaylamaktad E.

Hayvanlar& büyük çogunlugu (12,den 9'u), OLOPGL-PG antikorlar:gelistirmektedir ocOPGL- 1°e karsi antikorlarln insidans `,l doza veya uygulama yoluna bagl' ldegildir. Herhangi bir doz grubu, antikoru negatif ve pozitif hayvanlara sahip olmad g nda, 0.1 mg/kg üzerinde dOPGL-l farmakokinetiklerindeocOPGL-1”e antikorlariîi etkisini ölçmek mümkün degildir. 0.1 mg/kg sekilde, orOPGL-l birikimine dair etkiler gözlemlenmemektedir (Sekil 16).

Yukaridaki bulusun yönleri, asagldaki özel maddeye referans açlklanacaktlr: 1.Bir agE zinciri ve bir hafif zinciri içeren, agi zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2”de belirlenen bir amino asit sekansmüveya bunun bir fragmanmüçerdigi ve hafif zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4,te belirlenen bir amino asit sekansßEveya bunun bir fragmanßüçerdigi bir antikor. 2.Bir ag& zinciri ve bir hafif zinciri içeren, ag& zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3ste belirlenen bir amino asit sekansßEveya bunun bir fragmanßEiçeren bir degisken bölgeyi ve hafif zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14”te belirlenen bir amino asit sekansîljveya bunun bir fragmanlIiEiçeren bir degisken bölgeyi içerdigi bir antikor. 3.AgLn zincirin ve hafif zincirin, tek zincirli bir antikoru olusturmak üzere esnek bir baglayd ile bagland gl lTek zincirli bir PC antikoru olan madde 3”e göre antikor. 4. Bir tek zincirli Fv antikoru olan madde 3°e göre antikor.

. Bir Fab antikoru olan madde 2,ye göre antikor. 6. Bir F ab” antikoru olan madde ?ye göre antikor. 7.Bir (F ab,)2 antikoru olan madde 2°ye göre antikor. 8. Tamamen insan olan madde Z'ye göre antikor. 9.Antik0run, OPGLinin bir osteoklast farkIJhsii ve aktivasyon reseptörüne (ODAR) baglantîslîljnhibe ettigi madde 27ye göre antikor.

.SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2”de belirlenen bir amino asit sekansEiEveya bunun bir fragmanLnLiçeren bir agLr zincir. ll.SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3ite belirlenen bir amino asit sekanslnl veya bunun bir fragmanlnl içeren bir aglr zincir. 12.SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4,te belirlenen bir amino asit sekansîilîveya bunun bir fragmanßüçeren bir hafif zincir. 13.SEKANS KIMLIK NUMARASI: l4”te belirlenen bir amino asit sekanslIiEveya bunun bir fragmanüüçeren bir hafif zincir. l4.Bir ag& zinciri ve bir hafif zinciri içeren, bir agB zincirin ve bir hafif zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: Zide belirlenen bir amino asit sekansßüveya bunun bir fragmaniîl içerdigi bir antikor.

.Bir agin zinciri ve bir hafif zinciri içeren, agbi zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:10 l3ite belirlenen bir amino asit sekanslîiEveya bunun bir fragmanßEiçeren bir degisken bölgeyi içerdigi bir antikor. 16.Bir agir zinciri ve bir hafif zinciri içeren, bir hafif zincirin SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4,te belirlenen bir amino asit sekans ni iveya bunun bir fragman ni içerdigi bir antikor. 17.Bir aglî zinciri ve bir hafif zinciri içeren, hafif zincirin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 147te belirlenen bir amino asit sekans nl iveya bunun bir fragmanlnl içeren bir degisken bölgeyi içerdigi bir antikor. 18.Bir agE zinciri ve bir hafif zinciri içeren, (a)agE zincirin, bir birinci degisken bölgeyi içerdigi ve birinci degisken bölgenin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13,te belirlenen amino asit sekansßa en az %90 özdeslige sahip olan bir sekans Eiçerdigi ve (b)hafif zincirin, bir ikinci degisken bölgeyi içerdigi ve ikinci degisken bölgenin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14°te belirlenen amino asit sekansLna en az %90 özdeslige sahip olan bir sekansl içerdigi bir antikor ve (c)burada antikor, bir osteoprotegerin li gandl (OPGL) ile etkilesime geçinektedir. 19.Birinci degisken bölgenin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3”te belirlenen amino asit sekans Ela en az %95 özdeslige sahip olan bir sekans Jiçerdigi ve ikinci degisken bölgenin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14,te belirlenen amino asit sekansEia en az %95 özdeslige sahip olan bir sekans Üçerdigi madde 18,e göre antikor.

.Birinci degisken bölgenin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: l3°te belirlenen amino asit sekans ßa en az %99 özdeslige sahip olan bir sekans Jiçerdigi ve ikinci degisken bölgenin, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 147te belirlenen amino asit sekansLna en az %99 özdeslige sahip olan bir sekansl içerdigi madde 18”e göre antikor. 21.Madde 1 ila 9 veya 14 ila 20 aras ndan herhangi birine göre bir antikoru içeren bir farmasötik bilesim. 22.Bir kemik morfojenik faktöründen, dönüstürücü büyüme faktörü-ß“dan (TGF-ß), bir interlökin-l (IL-l) inhibitöründen, lL-lra KineretTMsden, bir T'NFor inhibitöründen, bir çözülebilir TNFoc reseptöründen, EnbrelTM, bir anti-TNFOL antikorundan, RemicadeTM, D2E7 antikorundan, bir paratiroid hormonundan, bir paratiroid hormonunun bir analogundan, bir paratiroid hormonu ile iliskili proteinden, bir paratiroid hormonu ile iliskili bir proteinin bir analogundan, bir prostaglandinden, bir bifosfonattan, bir alendronattan, Ilorürden, kalsiyumdan, bir steroidal olmayan antiinflamatuvar ilaçtan (NSAID), bir COX-2 inhibitöründen CelebrexTM, VioxxTM; bir immünosüpresandan, metotreksattan, leIlumidden, bir serin proteaz inhibitöründen, bir salgilayldl lökosit proteaz inhibitöründen (SLPI), bir IL- 6 inhibitöründen, lL-6'ya karsl bir antikordan, bir IL-8 inhibitöründen, lL-8,e karsi lbir antikordan, bir IL-18 inhibitöründen, bir lL-18 baglayFcFproteinden, bir lL-18 antikorundan, bir Interlökin-l dönüstürücü enzim (IC) modülatöründen, bir fibroblast büyüme faktöründen (FGF), bir FGF modülatöründen, bir PAF antagonistinden, bir keratinosit büyüme faktöründen (KGF), bir KGF ile iliskili bir molekülden, bir KGF modülatöiünden; bir matris metaloproteinaz (MMP) modülatöründen, bir nitrik oksit sintaz (NOS) modülatöründen, glukokortikoid reseptörünün bir modülatöründen, glutamat reseptörünün bir modülatöründen, bir lipopolisakkarit (LPS) seviyelerinin bir modülatöründen, bir nöradrenalinden, bir nöradrenalin mimetiginden ve bir nöroadrenalin modülatöründen seçilen en az bir terapötik maddeyi içeren madde 21,e göre farmasötik bilesim. 23.En az bir terapötik maddenin, KineretTM, EnbrelTM, RemicadeTM, D7E7 antikor ve metotreksattan seçildigi madde 22'ye göre farmasötik bilesim. 24.Madde 2,ye göre antikorla numunenin temasa geçirilmesini içeren, bir biyolojik numunede OPGL seviyesinin tespit edilmesine yönelik bir yöntem.

.Madde 21°e göre farmasötik bilesimin uygulanmasîiüiçeren, bir hastada bir osteopenik rahats âlgß tedavi edilmesine yönelik bir yöntem. 26.Madde 22,ye göre farmasötik bilesimin uygulanmasEiEtiçeren, bir hastada bir osteopenik rahats Elfgß tedavi edilmesine yönelik bir yöntem. 27.Madde 22”ye göre farmasötik bilesimin uygulanmasEiÜ içeren, bir hastada kemik kayb Sila sonuçlanan bir inIlamatuvar kosulun tedavi edilmesine yönelik bir yöntem. 28.Madde 227ye göre farmasötik bilesimin uygulanmasLnLl içeren, bir hastada kemik kayblyla sonuçlanan bir otoimmün kosulun tedavi edilmesine yönelik bir yöntem. 29.Madde 22iye göre farmasötik bilesimin uygulanmasn. liçeren, bir hastada bir romatoid artritin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem.

SEKANS LISTESI Boyle, William J Martin, Francis H Corvalan, Jose R Davis, C. Geoffrey <120>()PGIfyeka$ anükodar <160> 20 <170>Patentln sürüm 3.1 <210> 1 <211>1426 <212> DNA <213> Mus muskulus <400> l .anca L ggagt acugqtqacg <210>2 <211»467 <212> PRT qacqgcçtgg <213> Mus muskulus <400>2 Glu Phe›GLy Lcu ccttcccagc GOC cacctgtggc ?BC Gly Leu Val Gln_ 1." al 013:' 120 1.1 29 .to A1 '51 <210> 3 <211> 728 <212> DNA <213> Mus muskulus A311› 1.813 4.1.5 <400> 3 qqacgîtcgg gcaqcausct <210>4 <211>›235 <212> PRT <213> Mus muskulus <400> 4 q `3-El Arq 47`i& Pro uly Gln: 11.. '3 9 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> 1.0 {D .“31 a <223> 5, kappa RACE primer <400> 5 <210> 6 <21 1> 23 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 3, kappa RACE primer <400> 6 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 5, anti-OPGL-l kappa primer <400> 7 <210> 8 <21 1> 37 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 3, anti-OPGL-l kappa primer <400>8 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 5, IgG2 RACE primer <400> 9 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 3, IgG2 RACE primer <400> 10 <210> ll <211> 51 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 5, anti-OPGL-l IgG2 Primer <400> 11 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> 3, anti-OPGL-l IgG2 Primer <400> 12 <210> 13 <2`l`l> 122 <212> PRT <213> Mus muskulus <400> 13 Giu Vai Gln Let: Sor Giy .Ile 'L'hr b-_V Gln Gly Thr <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Mus muskulus (5.:.y <400> 14 (5,.L1 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213>Yapay Sekans <220> <223> rastgele primer <220> <221> di ger_öze11ik <222> (18)..(23) <223> N; A, C, G, veya T'dir <400> 15 (:1 :7' (3111 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213>Yapay Sekans <220> <223> 5” anti-OPGL-l kappa primerin bölümününkal EokumasE <400> 16 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213>Yapay Sekans <220> <223> 3” anti-OPGL-l kappa primerin bölümünün kalIJ okumasE <400> 17 Cys (5.1.11 Cly Arg Asn !She <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213>Yapay Sekans <220> <223> 5° anti-OPGL-l IgG2 Primerin bölümünün kaliokumasü <400> 18 1 4 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213>Yapay Sekans <220> <223> translation of portion of 3, anti-OPGL-l lgG2 Primerin bölümünün kalÜE okumasj <400> 19 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213>Yapay Sekans <220> <223> LHRH antagonist peptid <220> <221>DIGER_ÖZELLIK <222> (1)..(1) <223>Xaa,Ac-D-Nal,dir, Nal, 3-(2-nafti1)a]anini1dir <220> <221>DIGER_ÖZELLIK <222> (2)..(2) <223>Xaa (4a-klorofenul)alanini1dir <220> <221>DIGER_ÖZELLIK <222> (3)..(3) <223>Xaa, D-Pal”dir, Pal, 3-(3,-piridi1)alanini1dir <220> <221>DIGER_ÖZELLIK <222> (5)..(5) <223>Xaa, N-metil tirosindir <220> <221>DIGER_ÖZELLIK <222> (6)..(6) <223>Xaa, D-asparajindir <220> <221>DIGER_ÖZELLIK <222> (8)..(8) <223>Xaa, N-epsilon-Z-propil-lisinildir <220> <22 1 >DIGER_ÖZELLIK <222> (10)..(10) <223>Xaa, D-alanin-NH2°dir <400> 20 aOPGL-i AglEZincirli cDNA SaII bölgesi boyunca HindIII bölesinde baslayan aglEzincirli ekspresyon plazmidinin DNA sekanslîl Baslanglglkodonu, nt 14'te baslamaktadlü stop kodonu nt 1415'te baslamaktadlrîl C7CCAAAACC GI'TGYGICGA (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1) SEKILZ aOPGL-i AgElZincirli Amino Asit SekansEl çizilmemektedir ve sabit bölge, küçük harfle yazllîhaktadlü MEFGLSWLFL VAIgKGVQCE GKG LEWVSGI TTVIMSWFDP swnsgaîth rkccvecppc gvevhnaktk gqprepqvyt dgsfflyskl WGQGTLVTVS vhtfpavlqs preeqfnstf lppsreemtk tvdksrwqqg VQLLESGGGL DSVKGRFTIS Sastkgpsvf flfppkpkdt rvvsvltvvh nqultclvk nvfscsvmhe VQPGGSLRLS RDNSKNTLYL plapcsrsts tvpssnfgtq lmisrtpevt qdwîngkeyk gfypsdlave alhnhytqks CAASGFTFSS YAMSWVRQAP QMNSLRAEDT AVYYCAKDPG estaalgcîv kdyfpepvtv tytcnvdhkp sntkvdktve cvvvdvshed pevqfnwyvd ckvsnkglpa piektisktk wesngqpenn ykttppmlds 1515pgk SEMNsnMUKNUMmma:n aOPGL-i kappa Hafif Zincirli cDNA SaII bölgesi boyunca Xbal bölgesinden kappa zincirli ekspresyon plazmid sekansII DNA sekansüBaslangIÇlkodonu, nt 12'de baslamaktadB stop kodonu nt 717'de baslamaktadlEl CGGOT MU C GAGCAOTIG& MGTCGAC (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) WCI'CTTCCT' CCTGCTACI'C AGACI'TCAÜ' CAMGI' CT AC aOPGL-i kappa Hafif Zincirli Amino Asit SekansEl Kappa sinyal peptidinîn altüjizilmektedir, degisken bölge büyük harfle yazIJB1aktad lElve altlgizilmemektedir ve sabit bölge, küçük harfle yaz [lÜiaktadlEI 1 MEFPAQLLFL LLLWLPDTI'G EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVR 51 GRYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFI'LTISRLE 101 PEDFAVFYCQ QYGSSPRTFG QGTKVEIKr't vaapsvfifp psdeqiksgt 151 asvvcllnnf ypreakvqwk vdnaîqsgns qesvteqdsk dstyslsstl 201 tiskadyekh kvyacevthq gisspvtksf nrgec (SEK/WS KIMLIKNUMARASI=4> aOPGL-l-kappa/pDSR019'un Dairesel Plazmid HaritasE] aOPGL-l Kappa.

SV4OIVS :FSM nami SV40165,19s DHFR Donörü ~ '1 Promoteri SV4Ü pro/ori aOPGL-PKW” R 3“ “u”- z DHFR deA ocOPGL-IgGZ/pDSRoi19'un Dairesel Plazmid HaritasEl Sal (eiss'i _EeiRIßSIJ iiOPGL-1 W -iFBH bu» Hunt!! 14743) Promoteri SV4Ü 155 Alli-:EU` svio ws :aaa ii 1957 sv40 165, _+4._ 195 Donörü ' SVCD WM PolvA EadilUM) `“- ”MHWJ' * i ,qu 31104335-: i aOPGL-i Doza BagüilEBir Sekilde EIA PlakasIda Kaplanan Çözülebilir OPG Ligand Ia BaglanmaktadIE 450-650“ 1 su 100 1000 ; 96 hazneli EIA plakalarÇlrekombinant çözülebilir OPGL ile kaplanmaktadlEl aOPGL-l'in çesitli konsantrasyonlarIIIhaznelere eklenmektedir ve oda slîlakliglüba 2 saatligine inkube edilmektedir. Keçi anti-Insan IgG (Fab')-Yaban Turpu Peroksidaz Absorbans, 450 nm ve 650 nm'de okunmaktadlEl SEKIL s (iOPGL-i Membrana BaglEDPGL'ye Belirgin Bir Sekilde Baglanmaktadiîi 8 25~ i:-*\-TNF-beta g 20. *TRAIL H L; 15 › I __i-com_ ' I“ 5- c. - 5 0--+-<› l OPGL ligandEIng/ml] J orOPGL-l bir doza bagIiIEisekiIde transfeke CHO REN 218-9 hücrelerin bir hücre yüzeyinde eksprese edilen OPGL'ye baglanmaktadlü Bu baglantüeksojen olarak eklenen insan OPGL ile tamamlanmaktadB fakat TNF-a, TNF-ß, TRAIL veya CD40 ile tamamlanmamaktadE aOPGL- 1 (100 ng/ml), çözülebilir OPGL'nin veya diger Iigandlarnn çesitli konsantrasyonlarlîla önceden inkube edilmektedir ve daha sonrasma, yüzeyde OPGL'yi eksprese eden CHO REN Keçi anti- Insan IgG ile 2- 8°C'de 30 dakikallgih inkube edilmektedir. Santrifüjleme ve yliZiama sonrasiElda, hücre yüzeyi floresanüakgsitometrisi kullan iiârak ölçülmektedir. aOPGL-i Çözülebilir OPGL'ye BaglanmaktadlE Bir EIA plakasIda OPGL'ye baglanan aOPGL-l, eksojen olarak eklenen çözülebilir OPGL. /21 aOPGL-i, TNF aile elemanlai-Ia (TNF-a, TNF-ß, TRAIL veya CD40 Iigand [E A 'IRAIL' :OPGLI O cowixaovcL-i bir EIA plakasIa OPGL'ye baglanan ocOPGL-l, eksojen olarak eklenen TNF-a, TNF-[3, TRAIL veya CD40 Iigand [Ile azaltllihamaktadlE] 11/21 RAW 264.7 Hücrelerinde OPG LigandEile ind_üklenen TRAP Aktivitesinin aOPGL-i ile Doza Bagü'ilEInhibisyon 8 1.2?" ; 33 1-- . g 08; . k 06& I aOPGL-T, ng/mL 12/21 ODAR-FLAG/anti-FLAG-APC'ye Baglanan Evroigiyum-isaretli OPG LigandII ocOPGL-i'i ile Doza BaglIhIEInhibisyon 1000 x Kanal ,4/8 Ora/75 “30 l '100 aOPGL-T, ng/ml. 13/21 ciOPGL-i'in, 0.1, 1 ve 10.0 mg/kg IV (n=2/doz) ve 1.0 mg/kg SC (n=6/ doz) Dozlarda Sinomolgus Maymunlara Tek Dozlu Uygulamadan Sonra Ortalama (± SD) Serum-Konsantrasyon Süre Profilleri -4- limon' + wo-aiûiw i c 1. n i: se ?IJ N !I !1: ne Süre (Gün) 14/21 aOPGL-i'in tek bir dozunun IV (n=2/doz) veya SC (n=6), 0.1,1 ve .0 mg/ kg Dozlarda Sinomolgus Maymunlara uygulanmasIdan sonra serum N-Tx Konsantrasyonunda Ortalama (± SD) Yüzde Degisimi.

Referans Degerinden - «_SNTx %'si Degisimi Süre (Gün) /21 qOPGL-i'in tek bir dozunun IV (n=2/doz) veya SC (n=6), 0.1,1 ve .0 mg/__kg Dozlarda Sinomolgus Maymunlara uygulanmasIdan sonra Urin N-Tx Konsantrasyonunda Ortalama (± SD) Yüzde Degisimi.

Referans Degerinden UNTx % Degisimi Süre (Gün) 16/21 aOPGL-i IV'ün tek bir dozunun, 0.1, 1 ve 10.0 mg/kg Dozlarda Sinomolgus Maymunlara UygulanmasIdan Sonra Antikor pozitif (açI siyah semboller) ve Negatif (kapalEkIImEBemboller) Hayvan Serum- Konsantrasyon Süre Profilleri l -0- Hayvan 99115 (22) Serum Konsantrasyonu (ng/mL) _- CîISCSHYIÜIO"Y:1311î51IC7 Süre (Gün) 17/21 aOPGL-i AgEIZincirli Degisken Bölge Amino Asit 1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA 41 PGKGLEWVSG ITGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY 81 LQMNSLRAED TAVYYCAKDP GTTVIMSWFD PWGQGTLVTV 18/21 aOPGL-i Hafif Zincirli Degisken Bölge Amino Asit Sekansü 1 EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVR GRYLAWYQQK 41 PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE 81 PEDFAVFYCQ QYGSSPRTFG QGTKVEIK (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14› 19/21 Hücre Kültürü Süreci Akmi SemasEl 1250 Cözünür Ilac Sisesi Ilaç Sisesi Çalkalaylmir, Döndürücüler Hücre Genislemesi L Bivoreaktör Hücre Genislemesi ° '- Bivoreaktör Hücre Genislemesi 2000 L Bivoreaktör Disk YEg IIISantrifüjü Filtre UF Çapraz AklSl Filtrasyonu Kosulland EIBnISI ortamEkonsantre ArIdlIhiaya veya -30 ± 10 °C'de CCM dondurulmus olarak saklamaya devam edin Üretim Reaktörü Ürün: Hücreleri, kosullandlîllinß ortamdan çIEarI SentratEtemizlevin /21 (xOPGL-i'in tek bir dozunun, Sinomolgus Maymunlara UygulanmasIdan Sonra Referans Degerinden Ortalama Serum Kalsiyum Yüzde Degisimi I I l+OJWFJ i Referans Degerinden Kalsiyum %'si Degisimi l-o- ini-uyuya:: l Süre (Gün) 21/21 aOPGL-i'in tek bir dozunun, Sinomolgus Maymunlara UygulanmasIdan Sonra Referans Degerinden Ortalama Serum Alkalin Fosfataz Yüzde Degisimi -O-GJmohoN 5 -o- iOmMigSL Referans Degerinden ALKP %'si Degisimi Süre (Gün)

Claims

ISTEMLER

1. Bir birinci polinükleotit ve bir ikinci polinükleotidi içeren bir bilesim olup, burada birinci polinükleotit bir agln zinciri kodlamakta ve ikinci polinükleotit bir hafif zinciri kodlamaktad 11, a) aglii zincir tam uzunluklu bir agîri zincirden ve OPGL için spesifiklik saglayabilecek kadar yeterli ölçüde degisken bölge sekanslîia sahip olan, bunlarEi polipeptit fragmentlerinden seçilmektedir ve agm zincir SEK KIM NO:13°te belirtilen amino asit sekansEia en az %90 oranmda idantiteye sahip olan bir sekans Diçeren bir birinci degisken bölgeyi içermektedir; ve b) hafif zincir tam uzunluklu hafif zincirden ve OPGL”ye spesifiklik saglayabilecek ölçüde yeterli degisken bölge sekanslîia sahip bunlarEl polipeptit fragmentlerinden seçilmektedir, ve hafif zincir SEK KIM NO:14”te belirtilen amino asit sekans na en az %90 oranlnda idantiteye sahip olan bir sekansl liçeren bir ikinci degisken bölgeyi içermektedir; ve burada agm zincir ve hafif zinciri içeren bir antikor bir osteoprotegerin ligandia (OPGL) baglanmaktadî ve OPGLSnin bir osteoklast farklüasmas Ela ve aktivasyon reseptörüne (ODAR) baglanmas i lngellemektedir, burada in vitro kompetitif baglanma deneyinde ölçüldügü üzere, antikorun fazlaljlgîiîl baglanmay :bn az %20 oran îlda azalttg Ilçesfedilmistir.

2. Birinci polinükleotit ile kodlanan ag 11 zincirin SEK KIM NO:13”te ileri sürülen amino asit sekansna en az %95 idantiteye sahip bir sekans içeren bir birinci degisken bölgeyi içerdigi ve burada ikinci polinükleotit tarafîidan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:14,te ileri sürülen ainino asit sekans Iia en az %95 idantiteye sahip bir sekans [içeren bir ikinci degisken bölgeyi içerdigi Istem l”e göre bilesim.

3. Birinci polinükleotit ile kodlanan agi zincirin SEK KIM NO:13,te ileri sürülen amino asit sekans Ba en az %99 idantiteye sahip bir sekans :içeren bir birinci degisken bölgeyi içerdigi ve burada ikinci polinükleotit tarafEidan kodalanan hafif zincirin SEK KIM NO:14'te ileri sürülen amino asit sekans îla en az %99 idantiteye sahip bir sekans Diceren bir ikinci degisken bölgeyi içerdigi Istem 17e göre bilesim.

4. Birinci polinükleotit taraf ndan kodlanan agin zincirin SEK KIM NO:13”teki üç CDRsyi içerdigi ve burada ikinci polinükleotit tarafindan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:149teki üç CDR,yi içerdigi Istemler 1 ila 3”fen herhangi birine göre bilesim.

5. Birinci polinükleotit taraflîldan kodlanan aglî zincirin SEK KIM NO:13°fe ileri sürülen amino asit sekanslîlüiçerdigi ve burada ikinci polinükleotit tarafîldan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:14”te ileri sürülen amino asit sekansmüiçerdigi Istemler 1 ila 4,ten herhangi birine göre bilesim.

6. Birinci polinükleotit tarafEidan kodlanan agm zincirin bir amino asit delesyonu, eklemesi veya ikamesine sahip SEK KIM NO:27nin amino asit sekansßßi sabit bölgesi ve degisken bölgesini içerdigi, ve burada ikinci polinükleotit taraandan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:4”ün amino asit sekanslnln sabit bölgesi ve degisken bölgesini içerdigi Istemler 1 ila 5,ten herhangi birine göre bilesim.

7. SEK KIM NO:2”nin amino asit sekansEidaki bir amino asit delesyonu, eklemesi veya ikamesinin bir karboksi terminal ainino asit delesyonu oldugu Istem 6”ya göre bilesim.

8. Birinci polinükleotit tarafßdan kodlanan agm zincirin SEK KIM NO:2`nin amino asit sekansîlîi sabit bölgesi ve degisken bölgesini içerdigi ve burada ikinci polinükleotit taraf Eidan kodlanan hafif` zincirin SEK KIM NO:4,ün amino asit sekansîlîl degisken bölgesi ve sabit bölgesini içerdigi Istemler 1 ila 5”ten herhangi birine göre bilesim.

9. Birinci polinükleotit tarafindan kodlanan aglr zincirin SEK KIM NO: 2Snin amino asit sekansîiîi sabit bölgesi ve degisken bölgesinden meydana geldigi ve burada ikinci polinükleotit tarafEidan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:4*ün amino asit sekansEiEi degisken bölgesi ve sabit bölgesinden meydana geldigi Istemler 1 ila 5”ten herhangi birine göre bilesim.

10. Birinci polinükleotit tarafmdan kodlanan agm zincirin SEK KIM NO:2”de ileri sürüldügü biçimde bir amino asit sekansEiEiçerdigi ve ikinci polinükleotit tarafEidan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:4°te ileri sürülen amino asit sekansEiEiçerdigi Istemler 1 ila 5°ten herhangi birine göre bilesim.

11. Birinci polinükleotit tarafindan kodlanan aglri zincirin SEK KIM NO:2,de ileri sürüldügü biçimde bir amino asit sekanslndan meydana geldigi ve ikinci polinükleotit tarafi ndan kodlanan hafif zincirin SEK KIM NO:4,te ileri sürüldügü biçimde amino asit sekanslîidan meydana geldigi Istem 8”e göre bilesim.

12.Agi zincirin ve hafif zincirin bir Fab antikorunu ineydana getirdigi Istemler 1 ila 5”ten herhangi birine göre bilesim.

13. Agm zincirin ve hafif zincirin bir Fab° antikorunu meydana getirdigi Istemler 1 ila Siten herhangi birine göre bilesim.

14. Agm zincirin ve hafif zincirin bir F(ab,)2 antikorunu meydana getirdigi Istemler 1 ila Siten herhangi birine göre bilesim.

15. Aglî zincirin ve hafif zincirin bir tek zincirli antikoru meydana getirdigi Istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre bilesim.

16. Tek zincirli antikorun bir tek zincirli Fv antikoru oldugu Istem 153e göre bilesim.

17. Agm zincir ve hafif zincirin tamamen insan olan bir insan antikorunu olusturdugu Istemler 1 ila l4°ten herhangi birine göre bir bilesim.

18. Istemler 1 ila 17,den herhangi birinin bilesimini içeren bir konak hücre.

19.Bir memeli konak hücresi olan Istem 18°e göre konak hücre.

20. Bir Çin hamster yumurta hücresinden, bir HeLa hücresinden, bir bebek hamster böbrek hücresinden, bir maymun böbrek hücresinden ve bir insan hepatoselüler karsinom hücresinden seçilen Istem 19,a göre konak hücre.

21. Istemler 18 ila 20,den herhangi birine göre bir konak hücrenin kültürlenmesini içeren bir osteoprotegerin ligand Sila (OPGL) etkilesime giren bir antikorun üretilmesine yönelik yöntem.