ES2558303T3 - Método de purificación de proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para eliminar virus en una muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa, que comprende las etapas de: 1) convertir la muestra que contiene una proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa, donde la solución acuosa resultante tiene una molaridad de 50 mM o menor, una conductividad de 300 mS/m o menor y un pH de 4,0 al punto isoeléctrico de la proteína fisiológicamente activa, donde la etapa 1) se realiza convirtiendo la muestra que contiene la proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa ácida o alcalina y ajustando la muestra resultante con un tampón a un pH de 4,0 al punto isoeléctrico de la proteína fisiológicamente activa, donde la solución acuosa ácida o alcalina tiene una molaridad de 50 mM o menor y una conductividad de 300 mS/m o menor; y 2) eliminar las partículas resultantes.

Description

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En el método de la presente invención, después de convertir una muestra que contiene proteína fisiológicamente activa en una solución acuosa ácida o alcalina de baja conductividad, la muestra resultante se ajusta con un tampón hasta un pH igual o inferior al punto isoeléctrico de la proteína fisiológicamente activa. Los ejemplos de un tampón incluyen Tris-HCl, fosfato, Tris, Na2HPO4 y NaOH.

Además, en la presente invención, en determinados casos tales como cuando una proteína fisiológicamente activa es un anticuerpo, una muestra que contiene anticuerpo normalmente se puede someter a cromatografía de afinidad en la proteína A o G y luir con una solución acuosa ácida de baja conductividad, seguido de ajustar la fracción eluida resultante con un tampón hasta un pH deseado en el intervalo de igual o inferior al punto isoeléctrico de la proteína fisiológicamente activa. Por tanto, en todavía otra realización preferida de la presente invención se eliminan las impurezas en una muestra que contiene proteína fisiológicamente activa mediante un método que comprende las etapas de:

1) someter una muestra que contiene anticuerpo a cromatografía de afinidad en la proteína A o G y eluir la muestra con una solución acuosa ácida de baja conductividad; 2) ajustar la fracción eluida resultante con un tampón a un pH igual o inferior al punto isoeléctrico de la proteína fisiológicamente activa; y 3) eliminar las partículas resultantes como se define en las reivindicaciones. Las impurezas eliminadas mediante el método de la presente invención son virus, como se ha descrito anteriormente.

La solución acuosa ácida de baja conductividad usada en este método puede ser cualquiera de las indicadas anteriormente. Los ejemplos de un tampón incluyen Tris-HCl, fosfato, Tris, Na2HPO4 y NaOH.

En el método de la presente invención, la solución ajustada a un pH igual o inferior al punto isoeléctrico de la proteína fisiológicamente activa en la etapa anterior, a su vez, produce partículas (es decir, se enturbia). Estas partículas se pueden eliminar mediante filtración a través de un filtro para garantizar una eliminación suficiente de las impurezas tales como los contaminantes de ADN. Ejemplos de un filtro disponible para filtración incluyen, entre otros, un sistema de filtro de acetato de celulosa de 1,0 -0,2 µm (Corning) o TFF.

Como alternativa, estas partículas también se pueden eliminar mediante centrifugación o cualquier otra técnica para una eliminación eficiente de partículas; los procedimientos para la eliminación no están limitados a la filtración a través de un filtro.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores de la presente invención estiman que cuando las impurezas son moléculas de ADN, cada una de estas partículas es un conjugado formado entre la proteína activa fisiológicamente y el ADN. También estiman que cuando el Ph se ajusta por debajo del punto isoeléctrico de una proteína, la proteína está cargada positivamente y las moléculas de ADN están cargadas negativamente, lo que tiene como resultado una conjugación entre ADN y proteína. Además, la conversión en una solución acuosa de baja conductividad potenciará adicionalmente la conjugación. La eliminación de las partículas mediante filtración tiene como resultado una pérdida pequeña de proteína fisiológicamente activa porque se elimina en forma de conjugados de ADN-proteína fisiológicamente activa. No obstante, dicha pequeña pérdida constituye solo un pequeño porcentaje de la cantidad total de la proteína fisiológicamente activa; aproximadamente el 90 % de la proteína fisiológicamente activa se puede recuperar, como se describirá en la sección Ejemplo más adelante.

Los inventores de la presente invención también estiman que la cromatografía en columna de proteína A/G sola puede no ser suficiente para asegurar la separación eficaz entre el contaminante de ADN y la proteína fisiológicamente activa porque se forman conjugados de ADN-proteína en la resina de la columna. La proteína fisiológicamente activa purificada de este modo está disponible para su uso como formulación farmacéutica tras la posterior purificación mediante cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de hidroxiapatita o combinaciones de las mismas.

El ensayo de ADN cuantitativo se puede conseguir, sin limitaciones, el ensayo de ADN total umbral junto con extracción de ADN antes del ensayo.

El ensayo cuantitativo de virus se puede realizar mediante, sin limitaciones, ensayo de DICT50 (dosis infecciosa de cultivo tisular (50 %)), que se mide mediante la infectividad vital en las células de detección en combinación con RT/Q-PCR y Q-PCR que permiten la determinación de la cantidad de virus en fracciones.

A continuación, la presente invención se describirá adicionalmente en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Investigación de la composición tampón para la cromatografía de afinidad de proteína A en la purificación de hPM-1 (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado)

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1.1. Procedimientos de la prueba

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Material de prueba (muestra que contiene anticuerpo)

Una muestra que contiene el medio de cultivo (en lo sucesivo en el presente documento abreviado a MC) de células CHO productoras del anticuerpo hPM-1 (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado), que se ha centrifugado para eliminar las células y almacenarlas a -80 ºC, se filtró a través de un sistema de filtro de acetato de celulosa (abreviado a AC) de 0,22 µm (CORNING) y se usó como muestra de prueba para investigación de purificación. El anticuerpo hPM-1 se preparó como se describe en el ejemplo de referencia 2 del documento JP KOKAI 08-99902 usando el promotor Iα del factor de elongación humano mostrado en el Ejemplo 10 de la publicación internacional n.º WO92/19759 (punto isoeléctrico: pH 9,0).

(2)

Instrumento usado para el examen

Para el eluato de HCl

HPLC:

L-6200 Intelligent Pump (HITACHI)

Detector L-4200 UV-VIS (HITACHI)

D-2500 Chromato-Integrator (HITACHI)

Columna:

HR5/2 (Pharmacia), DI de 5 mm × 20 mm de A

Medios:

POROS 50A (PerSeptive), Lote de 0,4 ml; A250-039, Code; SPECIAL

Para las partículas

HPLC:

Waters PrepLC4000 System (Waters)

Waters2000 System Controller (Waters)

Waters486 Tunable Absorbance Detector (Waters)

Waters741 Data Module (Waters)

Espectrofotómetro:

U-2000 (HITACHI)

Columna:

HR5/2 (Pharmacia), DI de 26 mm × 100 mm de A

Medios:

POROS 50A (PerSeptive), Lote de 53 ml; A250-039, Code; SPECIAL

(3) Análisis y ensayo

Ensayo hPM-1:

hPM-1 se analiza mediante HPLC de fase inversa en una columna PLRP-S (Polymer Laboratories) with a con un gradiente lineal. Ensayo de ADN:

El ADN se mide mediante el ensayo de ADN total del umbral. Antes del ensayo se realiza extracción de ADN (por ejemplo, usando un kit de extracción de ADN, Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.). Asimismo, para la medición se usa un kit de ensayo de ADN total del umbral (Molecular Devices).

Turbidimetría:

Cada muestra de ensayo se monitoriza para determinar la formación de partículas midiendo su absorbancia a 660 nm en un espectrofotómetro U-2000 (HITACHI).

1.2. Investigación y condiciones de elución

Las condiciones de la elución se investigaron a varias composiciones tampón para determinar la elución en la cromatografía de afinidad de proteína A midiendo el % de recuperación de hPM-1 y la eliminación del ADN mediante elución. La muestra que contiene anticuerpo anterior se sometió a la columna en las condiciones indicadas en la Tabla 1 siguiente. La resina de la proteína A se equilibró con el tampón de equilibrado indicado en la Tabla 1 y después se cargó con la muestra que contiene el anticuerpo anterior, seguido de lavado 1, lavado 2 y elución. El perfil de elución se monitorizó a A280 para aislar un pico de proteína. En la tabla, el tampón C-P indica tampón citrato-fosfato.

Tabla 1

Método de elución 1

Método de elución 2 Método de elución 3

Equilibrado

NaCl 1M/Tampón C-P 100mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampón C-P 10 mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampón C-P 100mM pH 7,5

Lavado 1

NaCl 1M/Tampón C-P 100mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampón C-P 10 mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampón C-P 100 mM pH 7,5

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Lavado 2

Tampón C-P 100 mM pH 7,5 Tampón C-P 10 mM pH 7,5 Tampón C-P 100 mM pH 7,5

Elución

Tampón C-P 100 mM pH 2,6 HCl 2,5 mM pH 2,6 HCl 2,5 mM pH 2,6

No se observaron diferencias cromatográficas entre los métodos de elución 1, 2 y 3.

Cada fracción de elución se ajustó a pH 7,0 con solución Tris 300 mM, lo que indica que las partículas se generaban 5 en las fracciones eluidas con HCl (métodos de elución 2 y 3). Se realizó investigación adicional para determinar la correlación entre la formación de partículas y el % de recuperación de hPM-1 o la cantidad de ADN residual.

Para analizar la correlación de las partículas, la fracción eluida de HCl del método de elución 2 se suplementó con NaCl y se analizó la correlación entre concentraciones de NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM) y varios factores. En el

10 análisis de la correlación entre las concentraciones de NaCl y varios factores, las muestras filtradas y sin filtrar se prepararon del siguiente modo: cada fracción de elución de proteína A suplementada con NaCl se ajustó a pH 7,0 con una solución Tris 300 mM y después se filtró o no a través de un filtro CA de 0,22 µm. Las muestras filtradas y no filtradas se midieron para el % de recuperación de hPM-1 (solo muestras filtradas) y la cantidad de ADN residual.

15 1.3. % de Recuperación

El % de recuperación de hPM-1 se midió para los métodos de elución individuales. Como resultado, el % de recuperación fue tan elevado como de 98,6 % en el método de elución 1. Por el contrario, el % de recuperación varió de 83,8 % a 97,1 % en el método de elución 2 y de 83,5 % a 93,7 % en el método de elución 3, se estimó que estas

20 variaciones se debían a lo pequeño de la escala de análisis (volumen de la resina: 0,4 ml). Cuando la escala de purificación se aumentó, se confirmó que el % de recuperación de hPM-1 se estabilizó a 90 % o más (método de elución 2). Por tanto, también se descubrió que el % de recuperación de hPM-1 seguía siendo alto, incluso en la elución de HCl.

25 1.4. Correlación entre las concentraciones de NaCl en la fracción eluida de HCl y varios factores

La Tabla 2 resume los análisis de la correlación entre las concentraciones de NaCl en la fracción eluida de HCl y varios factores.

30 Tabla 2

Concentración de NaCl

0 mM 50 mM 100 mM

Turbidez (pH no ajustado)

0,004 0,007 0,011

Turbidez (pH ajustado)

0,252 0,049 0,020

% de recuperación de hPM-1 (filtrado) (%)

81 86 88

Cantidad de ADN (sin filtrar) (pg de ADN/mg de hPM-1)

98 220 241

Cantidad de ADN (filtrado) (pg de ADN/mg de hPM-1)

11 30 250

Para las muestras filtradas, el % de recuperación de hPM-1 fue del 88 % a NaCl 100 mM, 86 % a NaCl 50 mM y 81 % a NaCl 0 mM. La cantidad de ADN residual fue baja a NaCl 0 mM en las muestras filtradas y no filtradas. En particular, la muestra filtrada suplementada con NaCl 0 mM tenía un contenido de ADN muy bajo de 11 pg de

35 ADN/mg de hPM-1.

Las muestras con pH ajustado con una turbidez más alta tienden a proporcionar un % de recuperación hPM-1 menor y una cantidad menor de ADN residual tras la filtración. Este resultado sugiere una elevada posibilidad de que tanto hPM-1 como el ADN contribuyen a la formación de partículas. Se ha estimado que hPM-1 y ADN probablemente

40 interaccionen entre sí para formar partículas ajustando el pH a 7,0. Con objeto de conseguir un % de recuperación de hPM-1 más alto, es preferible incrementar la concentración de NaCl en la fracción eluida de HCl. Para disminuir una cantidad de ADN residual, por otro lado, es deseable eliminar la suplementación de NaCl en fracción eluida de HCl.

45 Ejemplo 2: Purificación del anticuerpo anti-PTHrP humanizado

Una muestra que contiene un anticuerpo anti-PTHrP humanizado (un medio de cultivo del cultivo de células CHO), filtrado a través de filtros CA SARTOBRAN P de 0,45 y 0,2 µm (sartorius)) se purificó mediante cromatografía en columna de afinidad de proteína A en las condiciones indicadas más adelante. El anticuerpo anti-PTHrP se preparó

50 como se describe en la publicación internacional n.º WO98/13388 (punto isoeléctrico: pH 8,3).

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Tabla 7

Eliminación del ADN residual (unidad: pg/ml)

pH para la filtración

pH 6,6 pH 4,3

Sin filtrar

4,3 × 105 4,3 × 105

Filtrado

2,8 × 104 < 90

Esta investigación confirma la reducción eficiente del ADN en la muestra que contiene G-CSF rica en ADN cuando la muestra se filtró a pH 4,3; es decir, la cantidad de ADN residual estaba por debajo del límite de detección del 5 ensayo.

Ejemplo 5: Efectos de la eliminación de virus sobre la purificación de hPM-1 (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado)

10 5.1 Material de prueba (muestra que contiene anticuerpo)

Las muestras que contienen el medio de cultivo (MC) de las células CHO que producen el anticuerpo hPM-1 (anticuerpo frente al receptor de IL-6 humanizado), que se habían centrifugado para eliminar las células y almacenado a -80 ºC, se suplementaron con X-MuLV, Reo3 y MVM, respectivamente, seguido de filtración a través

15 de un filtro de 0,45 µm (Bottle Top Filter, CORNING) para su uso como muestras de prueba para purificación o investigación. El anticuerpo hPM-1 se preparó como se describe en el ejemplo 1. Los virus usados para el análisis se obtuvieron cada uno de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo).

5.2 Purificación mediante cromatografía en columna de rProteína

20 Las muestras suplementadas con virus preparadas en 5.1 se purificaron mediante cromatografía en columna de rProteína. Las condiciones detalladas son como se muestra a continuación.

Resina: rProteina Sepharose Fast Flow

25 Instrumento: AKTA explorer100, AKTApurifier Columna: XK16/20, XK16/40 Altura de la resina: 11,5 cm Condiciones de elución Equilibrado: NaCl 1 mol/l, tampón C-P 20 mmol/l,

30 pH 7,5 ± 0,2, Conductividad 8,5 ± 0,5 S/m Lavado 1. NaCl 1 mol/l, tampón C-P 20 mmol/l, pH 7,5 ± 0,2, Conductividad 8,5 ± 0,5 S/m Lavado 2. Tampón C-P 10 mmol/l, pH 7,7 ± 0,2, Conductividad 165 ± 20 mS/m

35 Elución: HCl 2,5 mmol/l, pH 2,7 ± 0,2, Conductividad 107 ± 10 mS/m

5.3 Tratamiento a pH bajo

40 Las fracciones de elución obtenidas en 5.2 se ajustaron a pH 3,2 ± 0,1 con 1 mol/l de ácido clorhídrico y se mantuvieron a temperatura ambiente de 15 ± 5 °C durante 30 minutos o más. Después, cada fracción de elución se ajustó a pH 7,2 ± 0,1 con una solución Tris 300 mmol/l, 40,0 ml de los cuales se filtró a continuación a presión de 0,03 ± 0,01 MPa usando una unidad de filtración equipada con un filtro de fibra de vidrio (Millipore) (0,2 µm, PALL) conectado al lado primario y un BioInert (0,2 µm, PALL) (un soporte de filtro PALL equipado con un ajustador de φ15

45 mm) conectado al lado secundario.

5.4 Detección de virus

Todas las muestras recogidas se midieron mediante el ensayo de la DICT50. En la prueba de capacidad de

50 aclaramiento para X-MuLV y MVM, estos virus se detectaron no solo mediante el ensayo de DICT50 que se midió mediante infectividad viral en las células de detección, sino también mediante RT/Q-PCR y Q-PCR que permitió la determinación de la cantidad de virus en fracciones.

5.5 Resultados

55 Los resultados de la detección en 5.4 se muestran en las tablas siguientes.

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Claims (1)

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