JP2010524479A - タンパク質を安定化する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、閉鎖されたときに容器が実質的に気体ヘッドスペースを欠くように、その容器に該溶液を充填する工程を含む、外因性ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化するための方法に関する。タンパク質水溶液を安定化するための容器の使用もまた提供される。

Description

本発明は、外因性ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化する方法およびタンパク質水溶液を安定化するための容器の使用に関する。

外因性ストレス、例えば振盪などの機械的ストレスに対するタンパク質水溶液の安定化は、依然として製薬工業における技術的困難を意味する。タンパク質水溶液が機械的ストレスを受けて凝集する傾向を有することは、公知の事実である。このような機械的ストレスは、例えば医薬品バイアルなどの容器中で、タンパク質水溶液を輸送する時にほぼ常に生じる。

当技術分野で採用される一般的な解決法は、例えばポリソルベートなどの安定化剤を用いた物理化学的安定化であり、その中でもTween 20（商標）としても公知であるポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０（Tween 80（商標））、ポロキサマー１８８または他の界面活性剤が広く使用されている。

しかし、化学製品を使用しない安定化が大いに有利であろうと、容易に理解することができる。特に、ヒトの安全性に及ぼす化学安定化剤の影響が関係づけられるおそれがある。したがって、監督機関は普通、薬学的製剤に含まれる化学安定化剤の数および量を最小にすることを願っている。

健康上の関心事に比べると低い考慮は、タンパク質水溶液を安定化するために添加しなければならない化学安定化剤のコストである。

それ故に、化学安定化剤を使用せずに、機械的ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化する方法の必要性があることが明白である。

閉鎖されたときに容器が気体ヘッドスペースを実質的に欠くように、その容器にタンパク質水溶液を充填する工程を含む方法を使用して、外因性ストレス、例えば機械的ストレスに対して該タンパク質水溶液を驚くほど安定化することができること、そしてこれに安定化剤を用いないことを本出願人らが見出したのは、この目標を心に留めてのことである。

この発見は、一般に確立された技術的先入観を考慮すると、なおさらに驚くべきであるが、その先入観を克服した。実際に、本発明に記載の方法は、機械的ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化するために化学安定化剤を使用しなければならないという周知の技術的先入観を克服している。

本発明の方法により水溶液中で安定化することができるＡｂｅｔａ抗体のグリコシル化部位を示す図である。 様々な量のＰＳ２０（■０％；□０．００２５％；▲０．００５％；△０．０１％）を有する１０mg/ml抗体（Ｍａｂ Ａ）製剤を三つの充填容量（Ａ）２．５ml、（Ｂ）５．３ml、（Ｃ）９．０mlで６mlバイアルに入れたものに、５℃で振盪ストレスを与えて、可視粒子計数、濁度および可溶性凝集産物により分析したときの経時変化を示す図である。 様々な量のＰＳ２０（■０％；□０．００２５％；▲０．００５％；△０．０１％）を有する１０mg/ml抗体（Ｍａｂ Ａ）製剤を三つの充填容量（Ａ）２．５ml、（Ｂ）５．３ml、（Ｃ）９．０mlで６mlバイアルに入れたものに、２５℃で振盪ストレスを与えて、可視粒子計数、濁度および可溶性凝集産物により分析したときの経時変化を示す図である。 様々な量のＰＳ２０（■０％；□０．００２５％；▲０．００５％；△０．０１％）を有する１０mg/ml抗体（Ｍａｂ Ａ）製剤を三つの充填容量（Ａ）２．５ml、（Ｂ）５．３ml、（Ｃ）９．０mlで６mlバイアルに入れたものに、５℃で振盪ストレスを与えて、１mlあたりの、≧２μm、≧１０μmおよび≧２５μmでの視認できない粒子により分析したときの経時変化を示す図である。 ＰＳ２０量（■０％；□０．００２５％；▲０．００５％；△０．０１％）を有する１０mg/ml抗体（Ｍａｂ Ａ）製剤を三つの充填容量（Ａ）２．５ml、（Ｂ）５．３ml、（Ｃ）９．０mlで６mlバイアルに入れたものに、２５℃で振盪ストレスを与えて、１mlあたりの、≧２μm、≧１０μmおよび≧２５μmの視認できない粒子により分析したときの経時変化を示す図である。 様々な量のＰＳ２０（０％；０．００２５％；０．００５％）を有する二つの１０mg/ml抗体Ｍａｂ Ａ■およびＭａｂ Ｂ
の（Ａ）無ストレス条件での凝集形成、ならびにその抗体を三つの充填容量（Ｂ）２．５ml、(Ｃ)５．３ml、(Ｄ)９．０mlで６mlバイアルに入れたものに２５℃で７２時間の振盪ストレスを与えたときの凝集形成を、可視粒子計数、濁度および可溶性凝集産物により分析したものを示す図である。
様々な量のＰＳ２０（０％；０．００２５％；０．００５％）を有する二つの１０mg/ml抗体Ｍａｂ Ａ■およびＭａｂ Ｂ
の（Ａ）無ストレス条件での凝集形成、ならびにその抗体を三つの充填容量(Ｂ)２．５ml、(Ｃ)５．３ml、(Ｄ)９．０mlで６mlバイアルに入れたものに２５℃で７２時間の振盪ストレスを与えたときの凝集形成を、１mlあたりの、≧２μm、≧１０μmおよび≧２５μmでの視認できない粒子により分析したものを示す図である。
タンパク質水溶液を充填された容器（ここでは薬学的に許容されうるバイアル）に外因性ストレス（ここでは機械的ストレス）を与えた後の写真である。左側には、従来技術の場合と同様に、閉鎖されたときにタンパク質溶液と気体ヘッドスペースを内部に有する容器を示す。右側には、本発明に記載の方法により、閉鎖されたときに気体ヘッドスペースを実質的に欠くタンパク質溶液を内部に有する容器を示す。 タンパク質水溶液を充填された容器（ここでは薬学的に許容されうるバイアル）に外因性ストレス（ここでは機械的ストレス）を与えた後の写真である。左側には、従来技術の場合と同様に、閉鎖されたときにタンパク質溶液と気体ヘッドスペースを内部に有する容器を示す。右側には、本発明に記載の方法により、閉鎖されたときに気体ヘッドスペースを実質的に欠くタンパク質溶液を内部に有する容器を示す。

「安定化された」または「安定化」という用語は、タンパク質水溶液が、本明細書後記の実施例における対応する試験を用いて測定したときに、重大な量の凝集および／または濁度および／または視認できない粒子および／または可視粒子を実質的に含まないことを意味する。

「外因性ストレス」という表現は、外因性作用により誘導される、タンパク質水溶液に及ぼすストレスを表す。外因性作用は、容器およびタンパク質水溶液を含む系の外部からの作用を表す。外因性ストレスの例は機械的ストレスである。機械的ストレスの例は振盪である。製薬工業における振盪は、偶発的に、例えば輸送の間に、または随意的に、例えば溶液の均質化のために、のいずれかで起こりうる。

「容器」という用語は、薬学的に許容されうる容器を表す。適切な容器は、閉鎖手段および開口部に連結される受容部を含む。好ましくは、容器は、閉鎖キャップを装着される、標準的な薬学的に許容されうるバイアル、プレフィルドシリンジ、カプセルまたはアンプルなどの、閉鎖手段および開口部に連結される受容器からなる。なおさらに好ましくは、容器は、閉鎖キャップを装着される、標準的な薬学的に許容されうるバイアルであろう。容器は、バイアルを密封してタンパク質水溶液を周囲の外界雰囲気から保護するキャップなどの密封手段を装着しうる。

「タンパク質水溶液」という表現は、タンパク質を含有する水溶液を表す。タンパク質の濃度は、０．０１〜２８０mg/mLの範囲でありうる。

「閉鎖されたときに気体ヘッドスペースを実質的に欠く」という表現は、容器にタンパク質水溶液を充填している当業者が、容器の最大容量まで容器に充填することを意味し、該最大容量は、例えば目視的に決定されるか、または計算により予備決定される。これは、例えば容器の最大可能容量まで容器にタンパク質水溶液を充填することによって達成することができ、測定精度は、最大容量で該溶液により形成されるメニスカスにより実験室で目視的に、または容器の秤量により重量測定的に、または製薬工業において生産規模で通常見られるように、当技術分野で公知の標準的な装置を用いた容量測定的に、のいずれかで決定される。充填容量は、溢れさせずになお、容器を適切に閉鎖可能にすることが意図されている。

それ故に、「閉鎖されたときに気体ヘッドスペースを実質的に欠く」という表現に関連して使用される「実質的に」という用語は、目視的に決定する場合には充填を行う者の精度、または決定が重量測定的または容量測定的な場合には使用された装置の精度に応じた、最大容量の目視的、重量測定的もしくは容量測定的決定の精度および／または気体ヘッドスペースの欠如を表す。

「通常の薬学的に許容されうる賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物に投与するための市販製品または他の研究開発製品にすでに含有される賦形剤を表す。少数の例を挙げると、この用語は、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン（arginie）緩衝剤などの緩衝剤、アルギニン、グリシン、リシン、トリプトファン、メチオニンなどのアミノ酸、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖または糖アルコール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトンＸなどの界面活性剤、およびポリビニルピロリドン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコールなどの他の賦形剤の種類からの賦形剤を含む。

本明細書に使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を表す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を表す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生され、ハイブリドーマには、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を、不死化細胞と融合したものが挙げられる。

タンパク質医薬品群の一部としての抗体分子は、変性および凝集、脱アミド、酸化および加水分解などの物理および化学分解に非常に感受性である。タンパク質の安定性は、タンパク質自体の特徴、例えばアミノ酸配列により、そして温度、溶媒ｐＨ、賦形剤、界面、振盪または剪断速度などの外部影響により影響される。そこで、製造、保存および投与の間の分解反応からタンパク質を保護するために最適な製剤条件を定義することが重要である。

「抗ＩＧＦ−１Ｒヒトモノクローナル抗体」または「ｈｕＭＡｂ ＩＧＦ−ＩＲ」という用語は、内容、特にクレームが参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２００５／００５６３５に記載および請求されているような抗体を表す。

「Ａｂｅｔａ」は、アミロイド−βペプチドと特異的に結合することができるＡｂｅｔａ抗体（またはその混合物）を表す。Ａｂｅｔａと特異的に結合する抗体は、当技術分野において公知である。 本発明に記載の製剤に使用することができるＡｂｅｔａ抗体の特定の例は、内容が参照により本明細書に組み入れられる、公開されたＰＣＴ特許出願WO03/070760に、そして特にそのクレームに記載されている。

「アミロイドβ」、「Ａβ」、「Ａβ４」または「β−Ａ４」、そして特に本発明に関連して「Ａｂｅｔａ」とも名付けられる「アミロイド−βペプチド」は、アルツハイマー病などのアミロイド形成疾患に関連する細胞外老人斑の主成分である; Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Biol. 10, 373-403, Koo (1999), PNAS Vol. 96, pp. 9989-9990、米国特許第４，６６６，８２９号またはGlenner (1984), BBRC 12, 1131を参照されたい。このアミロイドβは、「アルツハイマー前駆タンパク質／β−アミロイド前駆タンパク質」（ＡＰＰ）に由来する。ＡＰＰは、なくてはならない膜糖タンパク質であり（Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, pp. 6075参照）、細胞膜プロテアーゼであるα−セクレターゼによりＡｂｅｔａ配列内でタンパク質内分解的に切断される（Sisodia (1992)、上記引用文中参照）。さらに、さらなるセクレターゼ活性、特にβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ活性は、３９個のアミノ酸（Ａβ３９）、４０個のアミノ酸（Ａβ４０）、４２個のアミノ酸（Ａβ４２）または４３個のアミノ酸（Ａβ４３）のいずれかを含むアミロイド−β（Ａβ）の細胞外放出を導く；Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053；Price (1998), Science 282, 1078 to 1083；ＷＯ００／７２８８０またはHardy (1997), TINS 20, 154を参照されたい。

Ａβは、いくつかの天然形態を有し、ヒト形態は上述のＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と呼ばれる。最も顕著な形態であるＡβ４２は、以下のアミノ酸配列（Ｎ末端から開始）を有する：

Ａβ４１、Ａβ４０、Ａβ３９では、それぞれＣ末端アミノ酸Ａ、ＩＡおよびＶＩＡが欠けている。Ａβ４３形態では、追加のトレオニン残基が上述の配列（配列番号３）のＣ末端に含まれる。

適切なＡｂｅｔａ抗体は、免疫グロブリン分子、例えばＩｇＧ分子である。ＩｇＧは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含むことを特徴とし（図１に図解）、これらの分子は、二つの抗原結合部位を含む。該抗原結合部位は、重鎖の部分（ＶＨ）および軽鎖の部分（ＶＬ）からなる「可変領域」を含む。抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬドメインの並列により形成される。抗体分子または免疫グロブリン分子に関する一般情報については、Abbas "Cellular and Molecular Immunology", W.B. Sounders Company (2003)のような一般的な教科書も参照されたい。

一態様では、本発明のタンパク質水溶液に存在するタンパク質は、該抗体の重鎖可変領域の少なくとも一つがＮ−グリコシル化を含むＡｂｅｔａ抗体（またはその抗体の混合物）である。重鎖可変領域（ＶＨ）でグリコシル化されたアスパラギン（Ａｓｎ）は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２領域）にありうるが、該グリコシル化されたアスパラギン（Ａｓｎ）は、配列番号１に示すような重鎖可変領域（ＶＨ）における５２位にありうる。

「モノグリコシル化抗体」という用語は、個別の抗体分子の一つの（Ｖ_Ｈ）領域にＮ−グリコシル化を含む抗体分子に関する；図１も参照されたい。「二重グリコシル化抗体」という用語は、両方の重鎖可変領域でＮ−グリコシル化された抗体を定義する（図１）。両方の重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインでＮ−グリコシル化を欠如する抗体分子は、「非グリコシル化抗体」と名付けられる（図１）。モノグリコシル化抗体、二重グリコシル化抗体および非グリコシル化抗体は、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を含みうる。

モノグリコシル化抗体および二重グリコシル化抗体は、本明細書において「グリコシル化抗体アイソフォーム」と呼ばれる。少なくとも一つの抗原結合部位が重鎖可変領域（ＶＨ）にグリコシル化を含むことを特徴とする精製抗体分子は、二重グリコシル化抗体および非グリコシル化抗体より選択されるアイソフォームを有さないか、またはそのアイソフォームを非常に低度に伴うモノグリコシル化抗体、すなわち「精製モノグリコシル化抗体」である。本発明に関連する二重グリコシル化抗体は、モノグリコシル化抗体および非グリコシル化抗体より選択されるアイソフォームを有さないか、またはそのアイソフォームを非常に低度に伴い、すなわち「精製二重グリコシル化抗体」である。

本発明の方法によるタンパク質水溶液中のタンパク質は、モノグリコシル化もしくは二重グリコシル化もしくは非グリコシル化抗体、または特異的に規定されたその混合物でありうる。本明細書に提供される抗体混合物または抗体プールは、本明細書において定義された、５０％のモノグリコシル化抗体および５０％の二重グリコシル化抗体を含みうる。しかし、３０／７０〜７０／３０の比もまた考えられている。なお、当業者は、本発明の抗体混合物における他の比もまた考えられていることを認識している。例えば、１０／９０または９０／１０、２０／８０または８０／２０、および４０／６０または６０／４０もまた本発明の状況で採用してもよい。本明細書上記と同義の二重グリコシル化抗体およびモノグリコシル化抗体を含む、本発明の方法に含まれる抗体混合物に特に有用な比は、４０／６０〜４５／５５の比である。

「有さないか、または非常に低度に」という用語は、それぞれ他の（グリコシル化）アイソフォームの完全な不在、または１０％以下、例えば５％以下、例えば４％以下、例えば３％以下、例えば２％以下、例えば１％以下、例えば０．５％以下、例えば０．３％以下、例えば０．２％以下の濃度の別の（グリコシル化）アイソフォームの存在を表す。

「抗体」という用語は、本明細書において「抗体分子」という用語と同義的に使用され、本発明の状況で、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧの完全免疫グロブリン分子のような抗体分子およびＦａｂ−フラグメント、Ｆａｂ’−フラグメント、Ｆ（ａｂ）２−フラグメント、キメラＦ（ａｂ）２もしくはキメラＦａｂ’フラグメント、キメラＦａｂ−フラグメントまたは単離されたＶＨ−もしくはＣＤＲ−領域などの、そのような免疫グロブリン分子の部分を含む（該単離されたＶＨ−またはＣＤＲ−領域は、例えば対応する「フレームワーク」に組み込みまたは操作することができる）。したがって、「抗体」という用語はまた、単鎖抗体または単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＡＢ／ｓｃＦｖ）または二重特異性抗体構築物などの免疫グロブリンの公知のアイソフォームおよび改変を含み、該アイソフォームおよび改変は、本明細書において同義の少なくとも一つのグリコシル化ＶＨ領域を含むことを特徴とする。そのようなアイソフォームまたは改変の特定の例は、ＶＨが本明細書に記載されるグリコシル化を含む、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの形式のｓｃ（単鎖）抗体でありうる。例えばＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの形式の二重特異性ｓｃＦｖもまた考えられている。ダイアボディー（diabody）、および少なくとも一つの抗原結合部分／ペプチドに結合したビヒクルとして抗体Ｆｃドメインを含む分子、例えばＷＯ００／２４７８２に記載されているようなペプチボディー（peptibody）もまた「抗体」という用語に含まれる。上記から、本発明の方法に使用されるタンパク質水溶液がまた、抗体／抗体分子の「混合物」などのＡｂｅｔａ抗体水溶液も含むことが明らかである。該抗体の特定の「混合物」は、上記、すなわちＡｂｅｔａに対する「モノ」および「二重」グリコシル化抗体の混合物である。

「抗体フラグメント」はまた、本質的にエフェクター機能（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ）を提供することができないが、適切な抗体定常ドメインと組み合わされた後で、本発明に記載の方法でこの機能を提供することができるフラグメントも含む。

本発明の方法においてタンパク質水溶液中のタンパク質として使用することができるＡｂｅｔａ抗体は、とりわけ組換え生産されたＡｂｅｔａ抗体である。これらは、哺乳動物細胞培養系、例えばＣＨＯ細胞で生産することができる。このような哺乳動物細胞培養系は、可変領域にＮ−グリコシル化を含む、本明細書に例示された特定のＡｂｅｔａ抗体などの、グリコシル化されたＡｂｅｔａ抗体またはＡｂｅｔａ抗体／抗体分子の調製に特に有用である。例えば、本明細書下記のような特定のグリコシル化抗体アイソフォームを精製するために、連続するクロマトグラフィーおよび濾過段階により、抗体分子をさらに精製することができる。

本明細書に使用されるような「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を表す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を表す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生され、ハイブリドーマには、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を不死化細胞に融合したものが挙げられる。

Ａｂｅｔａ抗体は、配列番号１：

に定義された可変領域を含むか、または有しうる。

この配列を本明細書下記にも示すが、ＣＤＲ、ＣＨ領域、重鎖領域および二つのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ５２およびＡｓｎ３０６）を表示する：

本明細書に記載される配列番号１を含む、例示されたＡｂｅｔａ抗体はまた、軽鎖を含みうるが、該軽鎖は、以下のアミノ酸配列を含むか、または有しうる：

本明細書に使用される「Ａｂｅｔａ抗体Ａ」という用語は、配列番号１と同義の重鎖および配列番号２と同義の軽鎖を含む、例示されたＡｂｅｔａ抗体に関する。

本明細書に使用される「モノグリコシル化抗体」という用語は、個別の抗体分子の、例えば免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、例えばＩｇＧ１の、一つの（ＶＨ）−領域にＮ−グリコシル化を含む抗体分子に関する。例えば、該「モノグリコシル化形態」は、一つの重鎖可変領域に、例えば本明細書に記載される「Ａｂｅｔａ抗体Ａ」のアスパラギン「Ａｓｎ５２」位に、グリコシル化を含む。この「モノグリコシル化ＩｇＧ１形態またはモノグリコシル化アイソフォーム」はまた、本明細書に例示するように、Ｆｃ部の十分に保存された部位に、例えば本明細書に例示された「Ａｂｅｔａ抗体Ａ」の非可変Ｆｃ部のアスパラギンＡｓｎ３０６にグリコシル化を含みうる。

本発明の意味における「二重グリコシル化抗体」という用語は、重鎖（ＶＨ）−領域の両方の可変領域に本明細書に定義されたグリコシル化を含む。また一方、この「二重グリコシル化形態」は、両方の重鎖の可変領域に、例えば本明細書に例示された「Ａｂｅｔａ抗体Ａ」のアスパラギンＡｓｎ５２位にグリコシル化を含む。この「二重グリコシル化ＩｇＧ１形態または二重グリコシル化アイソフォーム」はまた、本明細書に例示するように、非可変／定常Ｆｃ部の十分に保存されたグリコシル化部位に、特に、例示された「Ａｂｅｔａ抗体Ａ」の３０６位にグリコシル化を含みうる。添付の図１に、対応する抗体分子を示す。

可変領域、例えば重鎖の両方の可変領域（両方の（ＶＨ）−領域）にそのような翻訳後修飾を欠く抗体は、本発明の状況で、重鎖の可変領域にグリコシル化を含まない「非グリコシル化形態」とみなされる。それにもかかわらず、この「非グリコシル化形態」は、なお、抗体の定常領域（Ｃ−領域）に、例えば最も一般的にはＦｃ部の十分に保存されたグリコシル化部位に、特に本明細書において同義の非可変／定常Ｆｃ部におけるアスパラギン（Ａｓｎ）３０６に、グリコシル化を含みうる。配列番号１もまた参照されたい。

本発明の方法におけるタンパク質水溶液中のタンパク質は、本明細書において上記と同義の例示的な「Ａｂｅｔａ抗体Ａ］でありうる。したがって、該タンパク質は、上記と同義のモノグリコシル化Ａｂｅｔａ抗体Ａもしくは二重グリコシル化Ａｂｅｔａ抗体Ａもしくは非グリコシル化Ａｂｅｔａ抗体Ａまたはその混合物を含むＡｂｅｔａ抗体Ａでありうる。

組換え発現されたＡｂｅｔａ抗体分子のグリコシル化アイソフォームの精製は、以下の工程を含みうる：
（１）プロテインＡカラムの精製；
（２）イオン交換カラムの精製、例えば陽イオン交換クロマトグラフィー；および場合により、
（３）サイズ排除カラムの精製。

精製プロトコールは、さらなる濃縮工程、例えばダイアフィルトレーション、または分析工程、例えば分析カラムを含むものなどのさらなる工程を含みうる。特定のある工程を繰り返すこと（例えば２回のイオン交換クロマトグラフィー工程を実施してもよい）、またはある工程（例えばサイズ排除クロマトグラフィー）を省略してもよいこともまた考えられ、実行できる。

プロテインＡは、大部分のＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域に結合する群特異的なリガンドである。これは、いくつかのStaphylococcus aureus株により合成され、その株から単離してクロマトグラフィー用ビーズに結合させることができる。数種類のゲル製品が市販されている。使用することができるプロテインＡカラムの一例は、MabSelect（商標）カラムである。典型的には、カラムを２５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２５mM ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡで平衡化し、細胞培養上清をカラムにロードし、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄し、そして１００mM酢酸を使用してｐＨ３．２で抗体を溶出する。

陽イオン交換クロマトグラフィーは、固定相における正に荷電した基と移動相における試料の間の相互作用を活用する。弱陽イオン交換体（例えばCM Toyopearl 650（登録商標）)を使用する場合に、以下のクロマトグラフィー工程を行う：１００mM酢酸（ｐＨ４）を用いた予備平衡化、プロテインＡ溶出液のロードおよび１００mM酢酸（ｐＨ４）を用いた洗浄後に、２５０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ７．８〜８．５）および５００mM酢酸ナトリウム（ｐＨ７．８〜８．５）の工程を適用することにより抗体を溶出および分画する。第１工程で二重グリコシル化アイソフォーム画分およびモノグリコシル化アイソフォーム画分の混合物が通常は溶出し、第２工程を用いて、非グリコシル化アイソフォーム画分が通常は溶出する。

強陽イオン交換体（例えばSP Toyopearl 650）から、塩工程により抗体を溶出することができる：５０mM酢酸（ｐＨ５．０）を用いたカラムの平衡化、ｐＨ４を有するプロテインＡ溶出液のロード後に、５０mM酢酸および２１０mM塩化ナトリウムを用いた第１の溶出工程を行う。次に、５０mM酢酸および３５０mM塩化ナトリウムの第２の溶出工程を適用する。第１の塩工程により、二重グリコシル化アイソフォーム画分およびモノグリコシル化アイソフォーム画分の混合物が通常は溶出し、第２の塩工程により、非グリコシル化アイソフォームが通常は溶出する。

加えて、抗体はまた、塩勾配により強陽イオン交換カラム（例えばSP-Sepharose（登録商標））から溶出しうる。予備平衡化、ロードおよびｐＨ４．５でのカラムの洗浄後に、５０mM ＭＥＳ（ｐＨ５．８）から５０mM ＭＥＳ／１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．８）まで塩勾配を適用する。ここで、二重グリコシル化アイソフォーム、モノグリコシル化アイソフォームおよび非グリコシル化アイソフォーム画分が通常は別々に溶出する。以下において、二重グリコシル化アイソフォーム画分およびモノグリコシル化アイソフォーム画分をプールする結果として、生成物プールおよび／または所望の抗体混合物を生じさせてもよい。

二重グリコシル化およびモノグリコシル化抗体分子の混合物、例えば免疫グロブリンのさらなる精製は、サイズ排除クロマトグラフィーによって行ってもよい。有用なカラムの一例は、Superdex 200（登録商標）カラムである。流出緩衝液の例には、ヒスチジン／塩化ナトリウム、例えば１０mMヒスチジン／１２５mM塩化ナトリウム／ｐＨ６、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。

流出モードでの陰イオン交換クロマトグラフィーに続く濃縮／ダイアフィルトレーションは、代替的な精製工程である。Q Sepharose（登録商標）は、陰イオン交換工程のための樹脂の一例である。例えば、ＳＰクロマトグラフィーからの溶出液を、３７．５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．９）で３倍に希釈して、それに２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／８３mM酢酸ナトリウムで予備平衡化したQ-Sepharoseカラムを通過させてもよい。通過液を集め、ｐＨ５．５に調整し、例えばHydrosart 30kD（登録商標）膜を用いた限外濾過により濃縮する。以下において、例えば１０容の２０mMヒスチジン／ＨＣｌ（ｐＨ５．５）に対して濃縮液をダイアフィルトレーションしてもよい。

上に定義したように、抗体アイソフォームはまた、抗体分子の定常／非可変部に、例えばＩｇＧのＦｃ部に、例えばＩｇＧ１のＦｃ部に、さらなるグリコシル化を含みうる。Ｆｃ部における該グリコシル化は、例えば本明細書において定義された配列番号１によると重鎖のＡｓｎ３０６位に位置することを特徴とする、十分に保存されたグリコシル化に関する。

本発明の製剤に含まれる抗体のＩｇＧ−Ｆｃ領域は、鎖間ジスルフィド結合したヒンジ領域、ＣＨ２のアスパラギン３０６（Ａｓｎ−３０６）にＮ−結合型オリゴ糖を担持するグリコシル化ＣＨ２ドメインおよび非共有結合的に対形成したＣＨ３ドメインからなるホモ二量体でありうる。Ａｓｎ−３０６でのグリコシル化のオリゴ糖は、複合二分岐型であり、外側のアームの糖の多様な付加を有するコア七糖構造を含みうる。

オリゴ糖は、Ｆｃの構造と機能に影響するか、またはそれを決定する（Jefferis (1998) Immunol Rev. 163, 50-76）。特異的なＩｇＧ−Ｆｃ／エフェクターリガンド相互作用を数え入れているエフェクター機能が論じられている（Jefferis (2002) Immunol Lett. 82(1-2), 57-65 and Krapp (2003) J Mol Biol. 325(5), 979-89）。この保存されたＦｃ部のＡｓｎ−３０６位は、Kabatシステム（Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD.）における「Ａｓｎ−２９７」に対応する。

「安定化剤」という表現は、機械的ストレスに対してタンパク質水溶液を化学的に安定化することができる、薬学的に許容されうる安定化剤を表す。そのような安定化剤の例は、界面活性剤、例えばTween 20、Tween 80、Tween 40、Tween 60、ポロキサマー、ＳＤＳもしくはTriton Xもしくは任意の他の両親媒性分子、またはその混合物である。水溶液中の界面活性剤の作用は、当業者が熟知している当技術分野に広く記載されている。

「注射器具」という表現は、薬学的に許容されうる注射器具を表す。そのような器具の一例は、シリンジである。

本明細書上記に言及したように、本出願人らは、閉鎖されたときに容器が実質的に気体ヘッドスペースを欠くように、その容器に該タンパク質水溶液を充填する工程を含む、外因性ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化する方法を見出した。

本発明に記載の方法の任意の態様では、気体ヘッドスペースの欠如は、例えば目視的に、重量測定的にまたは容量測定的に予備決定することができる。

本発明に記載の方法の任意の態様では、容器は、容器の総容量の約９７％超まで充填することができる。

本発明に記載の方法の任意の態様では、気体ヘッドスペースは、容器の総容量の約３％未満、好ましくは２％、なおさらに好ましくは１％に相当しうる。

本発明に記載の方法の任意態様では、タンパク質は、抗体、特にモノクローナル抗体、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４からなる群より選択されるもの、好ましくは以下のターゲットの少なくとも一つに対して有用なモノクローナル抗体からなる群より選択されるものでありうる：ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ１９ ＣＣＲ５、アミロイド、ＯＸ４０、ＥＧＦレセプター、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ１３、ＩＬ６、ＩＬ１７またはＰ−セレクチン（P-selecting）。

抗体はまた、Actemra、AvastinまたはHerceptinの名前で当技術分野において公知であり、公開されているものからなる群より選択することができる。

本発明に記載の方法はまた、タンパク質水溶液が外因性ストレス、特に機械的ストレスに対する安定化剤を欠くという事実を特徴としうる。

本発明に記載の方法の任意の態様では、機械的ストレスは振盪でありうる。機械的ストレスは、一般に約０〜約４０℃の温度で生じる。

本発明に記載の方法で安定化されたタンパク質水溶液は、水、タンパク質および他の通常の薬学的に許容されうる賦形剤を含む。

タンパク質水溶液が、いったん安定化されたならば、振盪されたときに実質的に有意な濁度および／または凝集および／または可視粒子を欠くという事実を、本発明に記載の方法は特徴としうる。

本発明に記載の方法のある態様では、容器は注射器具ではなく、例えばシリンジではない。

容器は、閉鎖手段および開口部に連結される受容部を含みうる。ある態様では、容器は、閉鎖手段および開口部に連結される受容器、好ましくは密封手段および開口部に連結される受容器からなる。

本発明はまた、機械的ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化するための、閉鎖手段および開口部に連結される受容部を含む容器の使用に関する。該使用は、本明細書の上記のように、本発明の方法により行うことができる。

以下の実施例に、本発明を例示するつもりであるが、そこに開示された唯一の態様に本発明を限定するつもりはない。

実施例
以下の実施例において、二つのモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）の凝集挙動を、振盪ストレス下で、二つの異なる温度、様々な充填容量および異なる量のポリソルベートで検討した。大きさおよび数の点から見た凝集物形成の検出およびモニタリングは、以下の様々な分析技法を用いて実施した：目視検査、濁度、光遮蔽、サイズ排除クロマトグラフィーおよび動的光散乱。

容器の容量および表面積を決定するために寸法６mlφ２０mmのガラスバイアルを使用し、それを今度は、容量に対する表面積の比および容量に対するヘッドスペースの比により各充填容量についての気液界面の程度を計算するために使用した。実施例に示す全ての実験は、このようなバイアルで実施した。

本明細書後記の表１および表２から、充填容量が少ないほどヘッドスペースの容量は大きく、ヘッドスペースの容量は、振盪実験の間に気体容量が液体試料と相互作用するために重要な局面である。最大容量まで充填された試料は、ヘッドスペースを欠き、振盪の間のバイアル内の液体の物理的移動が限定される。充填容量に対する表面積の比は、充填容量の減少と共に増加し、このことは、撹拌時にガラス表面の、より大きい接触を可能にする（表２）。

ＰＳ２０を０％、０．００２５％、０．００５％および０．０１％（w/v）有するタンパク質製剤の経時変化を５℃および２５℃で１６８時間にわたる選択された時点で観察することにより、ゴム栓およびアルミシールで閉鎖された６ml公称容量バイアル中で様々な充填容量（２．５ml、５．３mlおよび９ml）での振盪実験を行った。タンパク質が曝露される気液または液ガラス界面が、試料バイアルに存在する気液の容量に基づくことから、浸透の間のタンパク質の安定性にヘッドスペースが及ぼす影響を評価するために、これを実施した。振盪の間にＰＳ２０がこれらの界面から、すなわち変性および凝集に対して、タンパク質を保護した程度もまた評定した。振盪ストレスの結果としての濁度、可視粒子計数、視認できない粒子および可溶性凝集産物の結果を図２〜９にまとめる。

上記結果（図２〜９）から、５℃および２５℃の両方の温度で振盪することによりストレスを与えた場合に、バイアル中のヘッドスペースの存在は、抗体製剤の安定性に大きな影響を与えた。

「最大」充填容量での全ての製剤（図２〜５、Ｃ欄および図６、７、Ｄ欄）および対照としてのプラセボ（データは示さず）は安定を維持し、ストレスを与えられた試料は、ストレスを与えられていない試料に匹敵する結果を示した。

最大容量まで充填された試料は、重大なヘッドスペース（３％未満のヘッドスペース容量）を欠くことから、バイアル内の液体の移動が抑制され、タンパク質への損傷は見られない。

市販の標準的な医薬品に採用される「標準的」なヘッドスペースを有する液体試料は、振盪の間にバイアル内で渦を巻き、はねを上げる能力を有し、これは、タンパク質の不安定性を導く気液相互作用を招く。

各製剤が１．１１５８±０．００２mPa.sの動粘度を有したことから、全ての試料の液体は同様に動いた。ヘッドスペースを有する振盪と有さない振盪の間のタンパク質の安定性の差は明らかであったが、２．５mlまたは５．３mlの容量でヘッドスペースを有して振盪された試料の間で有意な変動はみられなかった。

両方の温度で可視粒子計数、濁度および視認できない粒子計数に関して分析した場合に、わずか０．００２５％ ＰＳ２０の存在は、未填および名目量填でのタンパク質（図２〜５、ＡおよびＢ欄；図６、７、ＢおよびＣ欄）に、ＰＳを有さずに最大まで充填された試料（図２〜５、Ｃ欄；図６、７、Ｄ欄）と同様の保護を与えた。

しかし、ＳＥＣにより分析すると、０．００２５％ ＰＳ２０は、５℃でＭａｂ Ａについての可溶性凝集物形成を防止するために十分であった（図２、下列）が、２５℃の振盪条件では、凝集産物の阻害のために有意に多量（０．０１％ ＰＳ２０）が必要であった（図３、下列）。

故に、特にヘッドスペースを有する試料（２．５mlおよび５．３ml）について、可溶性凝集物形成に振盪ストレスが及ぼす負の作用は、５℃よりも２５℃での方がずっと明白である。

しかし、０％ ＰＳ２０で２．５mlの充填容量を有する試料の濁度は、実験全体にわたり２５℃よりも５℃でずっと高いＦＴＵ値を生じた。この濁度の結果は、Ｍａｂ Ａの同じ試料についての視認できない粒子計数および可溶性凝集物分析により得られたデータと対応しない。

濁度は、光を散乱および吸収して液体の光学的性質を与える、様々なサイズの視認できない個別の粒子により引き起こされる溶液の混濁または濁りとして説明される。

名目量填容量５．３mlを有するＭａｂ ＡおよびＢの試料（図３Ｂ、６Ｃおよび７Ｃ）は、Ｐ２０含量の増加と共に、予想通り可溶性凝集物および視認できない粒子の減少傾向を示した。Ｐ２０濃度への可溶性凝集物形成の強い依存性はまた、充填容量２．５mlのＭａｂ Ａ（図３、下列）にも見られたが、興味深いことに、充填容量５．３mlを有する試料とは対照的に、０％ ＰＳ２０よりも０．００２５％ ＰＳ２０製剤の方が多量の凝集物を生じた。

全体的に見て、標準的なヘッドスペースを有する試料がストレスを受けたならば、ＰＳが安定化剤として必要になるであろうが、製剤の開発中に「最大」まで充填された（すなわち最小のヘッドスペースを有する）振盪試料は粒子または凝集物の形成を阻害するためのＰＳを必要としないことを、データは示した（図２〜５、Ｃ欄、図６、７、Ｄ欄）。ガラスバイアルに入れて市販されているタンパク質液体製剤は、全てヘッドスペースを含む（プレフィルドシリンジを除く）。タンパク質溶液を内部に含むバイアルに必要な、義務的なヘッドスペース容量に、現在のところガイドラインも規格もない。市販品にとって、ヘッドスペースなしに、または最小のヘッドスペース（閉鎖充填容量の９７％として定義される）をとって充填することは、生物製剤製品の安定性に大きな利点であろうし、タンパク質溶液に必要な安定化剤を最小限にさせるであろう。ＰＳ２０の不在は、多数の視認できない粒子を生じるが、同じ製剤にヘッドスペースが存在しない場合に、これは完全に阻害される。

さらなる点は、凝集物を分析するときの直交法の重要性である。この場合のように、濁度分析のみに製剤の安定性を基づかせると、０．００２５％ Ｐ２０は２５℃で振盪時のタンパク質の保護に十分であったが、対照的に、ＳＥＣのデータを考慮すると０．００５％超のＰＳ２０が必要であるという指摘が与えられよう。

このデータは、振盪によりストレスを与えられた場合に、バイアルにおけるヘッドスペースの存在が、タンパク質製剤の安定性に大きな影響を及ぼすことを示した。

最大容量まで充填された試料は、重大なヘッドスペースを欠くことから、振盪時にバイアル内の液体の運動が抑制され、タンパク質への損傷は見られなかった。

ヘッドスペースの除去は、０．７０cm³/cm³および２．６１cm³/cm³の容量比までヘッドスペースを取って振盪されたときの、０．００２５％ ＰＳ２０を有する製剤と同様の保護性質（これら二つの容量の間に有意差は見られなかった）を、ＰＳ２０不在下の製剤に対して有した。

Claims (28)

1. 閉鎖された場合に容器が実質的に気体ヘッドスペースを欠くように、該容器にタンパク質水溶液を充填する工程を含む、外因性ストレスに対して該タンパク質水溶液を安定化するための方法。
2. 気体ヘッドスペースの欠如が、目視的または重量測定的または容量測定的のいずれかで予備決定される、請求項１記載の方法。
3. 容器が、該容器の総容量の約９７％よりも多く充填されている、請求項１または２のいずれか一項記載の方法。
4. 気体ヘッドスペースが、容器の総容量の約３％未満に相当する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. 気体ヘッドスペースが、容器の総容量の約２％未満に相当する、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
6. 気体ヘッドスペースが、容器の総容量の約１％未満に相当する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. タンパク質が、抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
8. タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
9. モノクローナル抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ４である、請求項８記載の方法。
10. モノクローナル抗体が、以下のターゲット：ＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ１９ ＣＣＲ５、アミロイド、ＯＸ４０、ＥＧＦレセプター、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ１３、ＩＬ６、ＩＬ１７またはＰ−セレクチンの少なくとも一つに対する、請求項９記載の方法。
11. モノクローナル抗体が、Actemra、AvastinまたはHerceptinからなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
12. タンパク質水溶液が、外因性ストレスに対する安定化剤を欠く、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
13. 外因性ストレスが、機械的ストレスである、請求項１２記載の方法。
14. 機械的ストレスが、振盪である、請求項１３記載の方法。
15. 外因性ストレスが、０〜４０℃の温度で生じる、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
16. タンパク質水溶液が、水およびタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
17. タンパク質水溶液が、薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
18. タンパク質水溶液が、振盪されたときに有意な濁度および／または凝集および／または可視粒子を実質的に欠く、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
19. 容器が、注射器具ではない、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
20. 容器が、シリンジではない、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
21. 容器が、閉鎖手段および開口部に連結される受容部を含む、請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法。
22. 容器が、閉鎖手段および開口部に連結される受容器からなる、請求項１〜２１のいずれか一項記載の方法。
23. 容器が、密封手段および開口部に連結される受容器からなる、請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法。
24. 外因性ストレスに対してタンパク質水溶液を安定化するための、閉鎖手段および開口部に連結される受容部を含む容器の使用。
25. 外因性ストレスが、機械的ストレスである、請求項２４記載の使用。
26. 機械的ストレスが、振盪である、請求項２５記載の使用。
27. 請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法における、請求項２４〜２６のいずれか一項記載の使用。
28. 本明細書において上記と同義の発明。