TWI615149B - 含抗Ａｎｇ－２抗體之安定化調配物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供包含特異結合血管生長素2(Ang-2)之抗體的醫藥調配物。除了抗-Ang-2抗體以外，該等調配物可含有至少一種胺基酸、至少一種糖或至少一種非離子性界面活性劑。本發明之醫藥調配物在儲存數個月之後以及在歷經熱壓力以及其他物理性壓力之後表現相當高的抗體安定性。
Description
本發明是有關於治療性抗體調配物的領域。更具體而言，本發明是有關於包含特異結合至血管生長素-2(Ang-2)之抗體的醫藥調配物。
依據37 C.F.R § 1.821(e)隨本說明書同時一起申請的是序列表的ST.25相容性電腦可讀取文字檔。文字檔的內容在此併入做為參考文件。序列表的紙本複印本係依據37 C.F.R § 1.821(f)與ST.25相容性電腦可讀取文字檔的內容完全相同，其包括作為本說明的一部分且在此併入做為參考文件。
血管新生是新血管形成的一個生物過程。異常的血管新生與數種疾病病況有關，該等疾病病況包括，例如增生性視網膜病變、類風濕性關節炎以及牛皮癬。此外，已證實血管新生對於腫瘤生長與維持至關重要。血管生長素-2(Ang-2)是Tie-2受體(Tie-2)的配位體且已顯示在血管新生中發揮作用。Ang-2在技藝中亦稱為Tie-2配位體(US 5,643,755；Yancopoulos et al.,2000,Nature 407：242-248)。
結合至Ang-2的抗體與其他肽抑制劑多少描述於例如US 6,166,185；7,521,053；7,205,275；2006/0018909及2006/0246071中。在技藝中需要能夠用來治療由血管新生所致或因為血管新生而惡化之疾病與病
況的新穎Ang-2調節劑(包括Ang-2抗體)。
治療性抗體必須以不僅使抗體適於投與給患者的方式，還要以在儲存以及後續使用期間維持其安定性的方式來調配。舉例而言，例如除非適當地調配溶液，否則液體溶液中的治療性抗體傾向於分解、團聚或非所欲的化學修飾。抗體在液體調配物中的安定性不僅取決於調配物中所使用的賦形劑種類，還有賦形劑相對於彼此的數量和比例。此外，除了安定性以外，在製備液體抗體調配物時必須納入其他考量。此等其他考量的實例包括液體的黏度與特定調配物所能包含的抗體濃度，以及調配物的視覺品質或訴求。因此，在調配治療性抗體時，必須非常小心以使得調配物維持安定、含有適當濃度的抗體，以及具有適當黏度與使調配物方便投與給患者的其他特性。
針對血管生長素-2蛋白質(Ang-2)的抗體是需要適當調配的治療相關大分子的一個實例。儘管已知一些抗-Ang-2抗體，但在技藝中對於含有足夠安定且適於投與給患者之抗-Ang-2抗體的新穎醫藥調配物仍存在有需要。
本發明藉由提供含有特異結合至人類血管生長素-2(Ang-2)之人類抗體的醫藥調配物來滿足上述需求。
在一個態樣中，提供一種液體醫藥調配物，其包含：(i)特異結合至血管生長素-2(Ang-2)的抗體；(ii)緩衝劑；(iii)有機共溶劑；以及(iv)安定劑。
在一個具體例中，以約5±0.75mg/mL至約150±22.5mg/mL的濃度提供抗體。在另一個具體例中，以約5mg/ml±0.75mg/mL的濃度提供抗體。在另一個具體例中，以約25mg/mL±3.75mg/mL的濃度提供抗體。在另一個具體例中，以約50mg/mL±7.5mg/mL的濃度提供抗體。
在一些具體例中，本發明的例示性抗-Ang-2抗體以及Ang-2抗原-結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3結構域，各自選自由下列組成之群：(i)SEQ ID NO：4、6、8、12、14及16(例如，H1H685)；(ii)SEQ ID NO：28、30、32、36、38及40(例如，H1H690)；(iii)SEQ ID NO：52、54、56、60、62及64(例如，H1H691)；(iv)SEQ ID NO：148、150、152、156、158及160(例如，H1H696)；(v)SEQ ID NO：196、198、200、204、206及208(例如，H1H706)；(vi)SEQ ID NO：268、270、272、276、278及280(例如，H1M724)；以及(vii)SEQ ID NO：436、438、440、444、446及448(例如，H2M744)。
在相關具體例中，本發明包含特異結合Ang-2的抗-Ang-2抗體或抗體之抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群的重鏈與輕鏈可變域序列中所含之重鏈與輕鏈CDR域(亦即CDR1、CDR2與CDR3)：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500，及502/504。在一個具體例中，該抗體或其片段包含選自由下列SEQ ID NO之群的胺基酸序列對的HCVR與LCVR中所含的CDR序列：18/20、42/44、66/68、162/164、210/212、266/274，及434/442。
在一個具體例中，液體調配物的pH為約pH 6.0±0.5、pH 6.0±0.4、pH 6.0±0.3、pH 6.0±0.2、pH 6.0±0.1、pH 6.0±0.05、pH 6.0±0.01或pH 6.0。在一個特定具體例中，液體調配物的pH為約pH 6.0±0.3。在一個具體例中，液體醫藥緩衝劑具有一或多種緩衝劑，其(等)具有約pH 5.5
至約pH 7.4的有效緩衝範圍，或pKa為約6.0。
在一個具體例中，緩衝劑為組胺酸。在一個具體例中，組胺酸濃度為5mM±0.75mM至50mM±7.5mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為5mM±0.75mM或約5mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為10mM±1.5mM或約10mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為15mM±2.25mM或約15mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為20mM±3mM或約20mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為25mM±3.75mM或約25mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為30mM±4.5mM或約30mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為35mM±5.25mM或約35mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為40mM±6mM或約40mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為45mM±6.75mM或約45mM。在一個具體例中，組胺酸濃度為50mM±7.5mM或約50mM。
在一個具體例中，有機共溶劑為含有聚氧乙烯部分的非離子性聚合物。在一些具體例中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20、帕洛沙姆188及聚乙二醇3350中的任一者或多者。在一個特定具體例中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20。
在一個具體例中，有機共溶劑濃度為約0.005%±0.00075%至約1%±0.15%「重量對體積」或「w/v」，其中，例如0.1g/ml=10%而0.01g/ml=1%。在一個具體例中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20，其濃度為約0.2%±0.03% w/v。在另一個具體例中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20，其濃度為0.01%±0.0015% w/v或約0.01% w/v。
在一個具體例中，安定劑為糖。在一個具體例中，糖是選自於由蔗糖、甘露醇以及海藻糖組成之群。在一個特定具體例中，安定劑為蔗糖。
在一個具體例中，安定劑濃度為1%±0.15% w/v至20%±3% w/v。在一個特定具體例中，安定劑為濃度5%±0.75% w/v或約5% w/v的蔗糖。在另一個特定具體例中，安定劑為濃度7.5%±1.125% w/v或約
7.5% w/v的蔗糖。在另一個特定具體例中，安定劑為濃度10%±1.5% w/v或約1.5% w/v的蔗糖。在另一個特定具體例中，安定劑為濃度12.5%±1.875% w/v或約12.5% w/v的蔗糖。在另一個特定具體例中，安定劑為濃度15%±2.25% w/v或約15% w/v的蔗糖。在另一個特定具體例中，安定劑為濃度20%±3% w/v或約20% w/v的蔗糖。
在一個具體例中，調配物的黏度為約1厘泊(cPoise)至約10厘泊。在一個具體例中，調配物的黏度為1.4厘泊±0.21厘泊，或約1.4厘泊。
在一個具體例中，調配物的滲透性在生理範圍內。在一個具體例中，調配物具有約300毫滲透性摩耳/kg(mOsm)至約400mOsm的滲透性。在一個具體例中，調配物的滲透性為363mOsm±54mOsm或約363mOsm。
在一個具體例中，至少96%於-80℃下儲存6個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少55%於-80℃下儲存6個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非鹼性及非酸性形式(亦即，主峰或主要電荷形式或「區2峰」)，如藉由離子交換層析所測定。
在一個具體例中，至少96%於-30℃下儲存6個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少55%於-30℃下儲存6個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是主要電荷形式，如藉由離子交換層析所測定。
在一個具體例中，至少96%於-20℃下儲存6個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少55%於-20℃下儲存6個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是主要電荷形式，如藉由離子交換層析所測定。
在一個具體例中，至少96%於5℃下儲存9個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的形式，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少56%於5℃下儲存9個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是主要電荷形式，如藉由離子交換層析所測定。
在一個具體例中，至少98%於25℃下儲存3個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的形式，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少54%於25℃下儲存3個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是主要電荷形式，如藉由離子交換層析所測定。
在一個具體例中，至少97%於37℃下儲存1個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的形式，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少47%於37℃下儲存1個月後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是主要電荷形式，如藉由離子交換層析所測定。
在一個具體例中，至少95%於45℃下儲存28天後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是非團聚且未分解的形式，如藉由尺寸排除層析所測定。在一個具體例中，至少32%於45℃下儲存28天後由該液體醫藥調配物還原而來的抗-Ang-2抗體是主要電荷形式，如藉由離子交換層析所測定。
在一個態樣中，提供一種液體醫藥調配物，其包含：(i)5±0.75mg/ml至150±22.5mg/ml特異結合至人類Ang-2之人類抗體；(ii)5mM±0.75mM至50mM±7.5mM組胺酸；(iii)0.005%±.000075%至1%±0.15%(w/v)聚山梨醇酯20；以及(iv)1%±0.15%至20%±3%(w/v)蔗糖，pH為約5.5至約6.5。此態樣的抗-Ang2抗體含有一重鏈可變區(HCVR)以及一輕鏈可變區(LCVR)，以使得HCVR/LCVR組合含有重鏈與輕鏈互補決定區(HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其分別具有SEQ ID
NO：4-6-8/SEQ ID NO：12-14-16的胺基酸序列。在一個特定具體例中，抗-Ang-2抗體含有一重鏈可變區(HCVR)以及輕鏈可變區(LCVR)，其分別具有SEQ ID NO：18與SEQ ID NO：20的胺基酸序列(美國公開專利案申請號：20110027286的抗體HIH685P，其特別以其整體併入本文做為參考文件)。
在另一個具體例中，液體調配物包含(i)50±7.5mg/mL的H1H685P；(ii)10±1.5mM組胺酸：(iii)0.2%±0.03%(w/v)聚山梨醇酯20；及(iv)10%±1.5%(w/v)蔗糖，pH為6.0±0.3。
在本態樣的一個具體例中，液體調配物含有(i)25±3.75mg/mL的H1N685P；(ii)10±1.5mM組胺酸；(iii)0.2%±0.03%(w/v)聚山梨醇酯20；及(iv)10%±1.5%(w/v)蔗糖，pH為6.0±0.3。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於45℃下儲存28天後，
95%的抗體為天然的且
32%的抗體為主要電荷形式。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於37℃下儲存1個月後，
97%的抗體為天然的且
47%的抗體為主要電荷形式。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於25℃下儲存3個月後，
98%的抗體為天然的且
54%的抗體為主要電荷形式。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於5℃下儲存9個月後，
96%的抗體為天然的且
56%的抗體為主要電荷形式。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於-20℃下儲存3個月後，
9%的抗體為天然的且
55%的抗體為主要電荷形式。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於-30℃下儲存6個月後，
96%的抗體為天然的且
55%的抗體為主要電荷形式。在此特定調配物的一個具體例中，調配物於-80℃下儲存6個月後，
96%的抗體為天然的且
55%的抗體為主要電荷形式。
在一個態樣中，在一容器中提供任一前述態樣的液體醫藥調配物。在一個具體例中，容器為聚碳酸酯小瓶。在另一個具體例中，容器為玻璃小瓶。在一個具體例中，玻璃小瓶為第1型硼矽酸玻璃小瓶，具有塗覆氟碳化物的丁基橡膠瓶塞。在另一個具體例中，容器為微輸注器。在
另一個具體例中，容器為注射器。在一個特定具體例中，注射器含有一個塗覆氟碳化物的塞蓋。在一個特定具體例中，注射器為1mL長玻璃注射器，含有少於約500ppb鎢的27-G針頭、塗覆氟碳化物的丁基橡膠瓶塞，以及無乳膠、非細胞毒性橡膠頂蓋。在一個更特定的具體例中，注射器為NUOVA OMPI 1mL長玻璃注射器，配有27-G薄壁針頭、塗覆FLUROTEC的4023/50橡膠瓶塞，以及FM 27橡膠頂蓋。在另一個更特定的具體例中，注射器為1mL或3mL塑膠注射器，裝有27-G針頭。在一個更特定的具體例中，塑膠注射器是由BECTON DICKINSON所分發。在一個具體例中，容器為聚氯乙烯IV袋。在另一個具體例中，容器為聚烯烴IV袋。
在一個態樣中，提供一種含有下列的醫藥調配物：(a)50mg/mL±7.5mg/mL的抗-Ang-2抗體、(b)10mM±1.5mM組胺酸，pH 6.0±0.3、(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，及(d)10% w/v±1.5%蔗糖，其中(a)該抗體含有SEQ ID NO：18的HCVD以及SEQ ID NO：20的LCVD、(b)調配物中超過96%的抗體具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)調配物中至少53%的抗體具有約8.13±0.01的等電點、(d)調配物中約90%至約92%的抗體經岩藻醣基化，及(e)約2.5%抗體的重鏈缺少C端離胺酸。
在一個具體例中，提供由下列組成的醫藥調配物：(a)50mg/mL±7.5mg/mL的抗-Ang-2抗體、(b)10mM±1.5mM組胺酸，pH 6±0.3、(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，及(d)10% w/v±1.5%蔗糖，其中(a)該抗體含有SEQ ID NO：18的HCVD以及SEQ ID NO：20的LCVD、(b)調配物中超過96%的抗體具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)調配物中至少53%的抗體具有約8.13±0.01的等電點、(d)調配物中約90%至約92%的抗體經岩藻醣基化，及(e)約2.5%抗體的重鏈缺少C端離胺酸。
在一個態樣中，提供一種含有下列的醫藥調配物：(a)25±3.75mg/mL的抗-Ang-2抗體、(b)10±1.5mM組胺酸，pH 6.0±0.3、(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，及(d)10% w/v±1.5%)蔗糖，其中(a)該抗體含有SEQ ID NO：18的HCVD以及SEQ ID NO：20的LCVD、(b)調配物中
超過96%的抗體具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)調配物中至少53%的抗體具有約8.13±0.01的等電點、(d)調配物中約90%至約92%的抗體經岩藻醣基化，及(e)約2.5%抗體的重鏈缺少C端離胺酸。
在一個具體例中，提供由下列組成的醫藥調配物：(a)25mg/mL±3.75mg/mL的抗-Ang-2抗體、(b)10mM±1.5mM組胺酸，pH 6±0.3、(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，及(d)10% w/v±1.5%蔗糖，其中(a)該抗體含有SEQ ID NO：18的HCVD以及SEQ ID NO：20的LCVD、(b)調配物中超過96%的抗體具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)調配物中至少53%的抗體具有約8.13±0.01的等電點、(d)調配物中約90%至約92%的抗體經岩藻醣基化，及(e)約2.5%抗體的重鏈缺少C端離胺酸。
在一個態樣中，提供一種套組，其含有前述態樣中任一者之醫藥組合物、容器以及使用說明。在一個具體例中，容器為預充填注射器。在一個特定具體例中，容器為硼矽酸小瓶，配有塗覆FLUROTEC的4023/50的橡膠瓶塞。
本發明的其他具體例將透過參閱之後的詳細說明而清楚明瞭。
在說明本發明前，應了解，本發明不受限於所述的特定方法及實驗條件，因為該等方法以及條件是可能改變的。亦應了解，本文所用術語僅是供說明特定具體例之用，而不意欲為限制性的，因為本發明的範圍將僅受到隨附申請專利範圍所囿限。
除非另有定義，否則本文所用全部技術與科學術語和本發明所屬技藝中具有通常技藝者一般所理解的意思相同。如本文所用，術語「約」，當提及特定引用的數值或數值範圍時，表示該數值可相對於引用的數值改變不超過2%。例如，如本文所用，詞句「約100」包括98與102，以及其間的所有數值(例如98.0、98.01、98.02、98.03、98.04...101.96、101.97、
101.98、101.99、102.00)。
儘管任何與本文所述方法和材料類似或等效者可用於實施或測試本發明，現將說明較佳方法與材料。本文提及的全部公開文獻以其全文併入本文做為參考文件來說明。
如本文所用，詞句「醫藥調配物」意指至少一種活性成分(例如，小分子、大分子、化合物等，其能夠在人類或非人類動物體內展現生物效用)以及至少一種非活性成分(其與活性成分或一或多種其他非活性成分組合時，適於治療性投藥給人類或非人類動物)的組合。除非另有指明，否則如本文所用之術語「調配物」表示「醫藥調配物」。本發明提供包含至少一種治療性多肽的醫藥調配物。依據本發明的某些具體例，該治療性多肽為抗體或其抗原-結合片段，其特異結合至人類血管生長素-2(Ang-2)蛋白質。更具體而言，本發明包括含有下列的醫藥調配物：(i)特異結合至人類Ang-2的人類抗體；(ii)組胺酸緩衝劑；(iii)為非離子性界面活性劑之有機共溶劑；以及(iv)為碳水化合物之熱安定劑。本發明所包括的特定例示性組分與調配物詳述於下文。
本發明醫藥調配物可包含人類抗體或其抗原-結合片段，其特異結合至人類Ang-2。如本文所用，術語「Ang-2」表示人類血管生長素-2，其為Tie2活化的自體分泌拮抗劑。Ang-2在技藝中通常已知會「啟動」血管內皮層接受細胞激素的作用。Ang-2在腫瘤血管中強烈表現，且通常被認為與其他細胞激素(亦即血管內皮生長因子)協同作用以促使血管新生和腫瘤進展。一個例示性人類Ang-2胺基酸序列描述於SEQ ID NO：518中。針對人類Ang-2的抗體描述於專利申請公開案US 2010/0166768、US 2011/0065902、WO 2010/077854及US 2011/0027286中，其併入本文做為參考文件。
術語「抗體」，如本文所用，通常欲意指免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈：藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈，及其多聚體(例如IgM)；然而，僅由單獨重鏈所構成的免疫球蛋白分子(亦即缺乏輕鏈)亦含括在術語「抗體」的定義內。各個重鏈含有1個重鏈可變區(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區。重鏈恆定區含有3個結構域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區含有1個結構域(CL1)。VH與VL區可進一步分為具有超變異性的區域(命名為互補決定區(complementarity determining regions,CDR))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由3個CDR以及4個FR所構成，以下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
除非另有特別指明，否則術語「抗體」，如本文所用，應理解為含括完整抗體分子以及其抗原-結合片段。術語抗體之「抗原-結合部分」或「抗原-結合片段」(或單單「抗體部分」或「抗體片段」)，如本文所用，意指抗體的一或多個片段，其保有特異結合至人類Ang-2或其抗原決定基的能力。
術語「經分離抗體」，如本文所用，欲意指基本上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，一個特異結合人類Ang-2的經分離抗體基本上不含特異結合人類Ang-2以外之抗原的抗體)。
術語「特異結合」或類似術語，意指抗體或其抗原-結合片段與抗原形成在生理條件下相對安定的複合物。特異結合的特徵在於解離常數為至少約1x10-6M或更高。用於測定兩個分子是否特異結合的方法為技藝中已知的，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。但是，特異結合人類Ang-2的經分離抗體與其他抗原(諸如其他物種的Ang-2分子(同源物))具有交叉反應性。在本發明的上下文中，結合至人類Ang-2以及一或多種其他抗原的多特異性(例如雙特異性)抗體被視為「特異結合」人類Ang-2。此外，經分離抗體可能基本上不含其他細胞物質或化學品。
可含括在本發明醫藥調配物中的例示性抗-人類Ang-2抗體述於專利申請公開案US 2010/0166768、US 2011/0065902、US 2011/0027286及WO 2010/077854中，其揭示內容以其整體併入本文做為參考文件。
依據本發明的某些具體例，抗-人類Ang-2H1H685P抗體為人類IgG1，其含有重鏈可變區(為IGHV3-13.01亞型)以及輕鏈可變區(為IGKV3-20.01亞型)(參見Barbie and Lefranc,The Human Immunoglobulin Kappa Variable(IGKV)Genes and Joining(IGKJ)Segments,Exp.Clin.Immunogenet.1998；15：171-183；與Scaviner,D.et al.,Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy,Kappa and Lambda Variable and Joining Regions,Exp.Clin.Immunogenet.,1999；16：234-240)。本文中出現的生殖系IGHV3-13與IGKV3-20序列，以及胺基酸位置分派數與國際免疫遺傳學(IMGT)資訊系統一致，如Lefranc,M.-P.,et al.,IMGT®,the international ImMunoGeneTics information system®,Nucl.Acids Res,37,D1006-D1012(2009)中所述。
在一些具體例中，抗-人類Ang-2H1H685P相對於正統重鏈可變區含有至少一個胺基酸置換，造成CDR中的肽鏈的旋轉角度改變，合理預期相對於生殖系IGHV3-13序列改變抗體的露出表面。在一些具體例中，胺基酸置換包含在IGHV3-13之CDR2中的位置39處脯胺酸置換異白胺酸。
在一些具體例中，抗-人類Ang-2H1H685P抗體含有至少一個胺基酸置換，其在生殖系IGKV3-20的第三個CDR中產生一個電荷改變。在一些具體例中，胺基酸置換(等)是選自由下列所組成之群：(a)在IGHV3-20之CDR3中(例如在位置106處)鹼性胺基酸置換無帶電極性胺基酸，及(b)在IGKV3-20之CDR3中(例如在位置108處)酸性胺基酸置換無帶電極性胺基酸。CDR表面的電荷表現變化預期會影響抗體與溶劑的交界處，且因而對於維持或增進抗體在溶液中的安定性來說產生不可預測的情況。
依據本發明的某些具體例，抗-人類Ang-2抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO：4的重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：6之HCDR2及SEQ ID NO：8之HCDR3。在某些具體例中，抗-人類Ang-2抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO：18的HCVD。
依據本發明的某些具體例，抗-人類Ang-2抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO：12的輕(κ)鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：14之LCDR2及SEQ ID NO：16之LCDR3。在某些具體例中，抗-人類Ang-2抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO：20的LCVD。
本文實施例中所用非限制性例示性抗體意指「H1H685P」，如在US 2011/0027286中。該抗體包含HCVR/LCVR胺基酸序列對，其具有SEQ ID NO：18/20，及由SEQ ID NO：4-6-8/SEQ ID NO：12-14-16所表示的HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3結構域。
本發明醫藥調配物中所包含的抗體或其抗原-結合片段之數量可隨著調配物所要的特定特性以及特定環境與要使用調配物之目的而改變。在某些具體例中，醫藥調配物為液體調配物，其可含有5±0.75mg/mL至150±22.5mg/mL抗體；7.5±1.125mg/mL至140±21mg/mL抗體；10±1.5mg/mL至130±19.5mg/mL抗體；12.5±1.875mg/mL至120±18mg/mL抗體；15±2.25mg/mL至110±16.5mg/mL抗體；17.5±2.625mg/mL至100±15mg/mL抗體；20±3mg/mL至90±13.5mg/mL抗體；22.5±3.375mg/mL至80±12mg/mL抗體；25±3.75mg/mL至70±10.5mg/mL抗體；27.5±4.125mg/mL至60±9mg/mL抗體；30±4.5mg/mL至50±7.5mg/mL抗體；25±3.75mg/mL抗體；或50±7.5mg/ml。例如，本發明調配物可含有約20mg/mL；約25mg/mL；約30mg/mL；約35mg/mL；約40mg/mL；約45mg/mL；約50mg/mL；約55mg/mL，或約60mg/mL抗體或其抗原-結合片段，其特異結合至人類Ang-2。
本發明醫藥調配物包含一或多種賦形劑。術語「賦形劑」，如本文所用，意指任一種被添加至調配物以提供所要稠度、黏度或安定效用的非治療性藥劑。
在某些具體例中，本發明醫藥調配物包含至少一種在粗略操作或振盪(諸如渦捲)的條件下呈安定人類Ang-2抗體之類型與數量的有機共溶劑。在一些具體例中，「安定」表示在粗略操作過程中預防抗體總數(以莫耳濃度為基準)超過4%團聚抗體形成。在一些具體例中，粗略操作為渦捲含有抗體及有機共溶劑的溶液歷時約60分鐘或約120分鐘。
在某些具體例中，有機共溶劑為非離子性界面活性劑，諸如烷基聚(氧化乙烯)。可包括在本發明調配物中的特定非離子性界面活性劑包括，例如聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81及聚山梨醇酯85；帕洛沙姆，諸如帕洛沙姆181、帕洛沙姆188、帕洛沙姆407；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20亦已知為TWEEN 20、山梨醇單月桂酸酯及聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酯。帕洛沙姆188亦已知為普朗尼克(PLURONIC)F68。
本發明醫藥調配物中所含之非離子性界面活性劑數量可隨調配物所需的特定特性，以及特定環境與要使用調配物之目的而改變。在某些具體例中，調配物可含有0.01%±0.0015%至1%±0.15%界面活性劑。例如，本發明調配物可含有約0.0085%；約0.01%；約0.02%；約0.03%；約0.04%；約0.05%；約0.06%；約0.07%；約0.08%；約0.09%；約0.1%；約0.11%；約0.12%；約0.13%；約0.14%；約0.15%；約0.16%；約0.17%；約0.18%；約0.19%；約0.20%；約0.21%；約0.22%；約0.23%；約0.24%；約0.25%；約0.3%；約0.4%；約0.5%；約0.6%；約0.7%；約0.8%；約0.9%、約1%；約1.1%；約1.15%：或約1.2%聚山梨醇酯20或帕洛沙姆188。
本發明之醫藥調配物亦可包含一或多種呈在熱壓力條件下安定人類Ang-2抗體之類型及數量的安定劑。在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及熱安定劑之溶液在約45℃下持續至高約28天時，超過約93%的抗體維持其天然構形。在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及熱安定劑之溶液在約45℃下持續至高約28天時，其中少於約4%的抗體團聚。在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及熱安定劑之溶液在約37℃下持續至高約28天時，超過約96%的抗體維持其天然構形。在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及熱安定劑之溶液在約37℃下持續至高約28天時，其中少於約2%的抗體團聚。如本文所用，「天然」表示依據尺寸排除的主要抗體形式，其通常為抗體的完整單體。
在某些具體例中，熱安定劑為糖或糖醇，選自於蔗糖、山梨醇、甘油、海藻糖及甘露醇或其任何組合，調配物中所含數量可隨著特定環境及要使用調配物之目的而改變。在某些具體例中，調配物可含有約3%至約20%糖或糖醇；約4%至約19%糖或糖醇；約5%至約18%糖或糖醇；約6%至約17%糖或糖醇；約7%至約16%糖或糖醇；約8%至約15%糖或糖醇；約9%至約16%糖或糖醇；約7%至約13%糖或糖醇；約8%至約12%糖或糖醇；約9%至約11%糖或糖醇；或約10%糖或糖醇。例如，本發明醫藥調配物可含有4%±0.6%；5%±0.75%；6%±0.9%；7%±1.05%；8%±1.2%；9%±1.35%；10%±1.5%；11%±1.65%；12%±1.8%；13%±1.95%；或約14%±2.1%糖或糖醇(例如，蔗糖、海藻糖或甘露醇)。
本發明之醫藥調配物亦可含有緩衝劑或緩衝系統，其作為維持穩定pH並有助於安定人類Ang-2抗體。在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及緩衝劑的溶液在45℃下維持多達約28天時，少於5%±0.5%或不超過4.3%抗體團聚。在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及緩衝劑的溶液在45℃下維持多達約28天時，至少92%±0.5%抗體呈其天然構形，如同藉由尺寸排除層析所測定。「天然」或「天然構形」表示未團聚或分解的抗體部分。這通常是藉由測量抗體實體的相對大小之分析(諸如尺寸
排除層析分析)來決定。非團聚及非分解抗體在與天然抗體相同的溶離份洗脫出來，且通常是主要溶離份。團聚抗體在表示尺寸大於天然抗體的溶離份洗脫出來。分解抗體在表示尺寸小於天然抗體的溶離份洗脫出來。
在一些具體例中，「安定」表示當含有抗體及緩衝劑的溶液在45℃下維持多達約28天時，至少52%±0.5%抗體呈其主要電荷形式，如同藉由陽離子交換層析所測定。「主要電荷」或「主要電荷形式」表示抗體在主峰中從離子交換樹脂洗脫出來的溶離份，其通常一側為更「鹼性」峰而另一側為更「酸性」峰。
本發明醫藥調配物可具有約5.5至約6.5的pH。例如，本發明調配物具有約5.5；約5.6；約5.7；約5.8；約5.9；約6.0；約6.1；約6.2；約6.3；約6.4；或約6.5的pH。在一些具體例中，pH為6.0±0.4；6.0±0.3；6.0±0.2；6.0±0.1；約6.0；或6.0。
在一些具體例中，緩衝劑或緩衝系統包含至少一種具有完全含括pH 5.5-7.4或pH 5.5-7.4之一部分的緩衝範圍。在一個具體例中，緩衝劑具有約6.0±0.5的pKa。在某些具體例中，緩衝劑具有組胺酸緩衝劑。在某些具體例中，組胺酸以5mM±0.75mM至15mM±2.25mM；6mM±0.9mM至14mM±2.1mM；7mM±1.05mM至13mM±1.95mM；8mM±1.2mM至12mM±1.8mM；9mM±1.35mM至11mM±1.65mM；10mM±1.5mM；或約10mM的濃度存在。在某些具體例中，緩衝系統包含10mM±1.5mM，pH為6.0±0.3的組胺酸。
依據本發明的一個態樣，醫藥調配物為低黏度(例如具有低於10厘泊或約1.4±0.21厘泊)，大體上生理等張(亦即介於300至400mOsm或約363±54mOsm)的液體調配物，其含有：(i)特異結合至人類Ang-2(例如H1H685P)的人類抗體，濃度為25mg/mL±3.75mg/mL，或50mg/mL±7.5mg/mL；(ii)緩衝系統，在pH 6.0±0.3下提供充分緩衝；(iii)糖，尤其做為熱安定劑；以及(iv)有機共溶劑，其保護結構完整性，若為抗體。
依據一個具體例，醫藥調配物包含：(i)人類IgG1抗體，特異結合至人類Ang-2，且其含有經取代IGHV3-13.01型重鏈可變區及經取代IGKV3-20.01型輕鏈可變區(例如，H1H685P)，濃度為20±3mg/mL至約60±9mg/mL；(ii)含有組胺酸之緩衝系統，其在約pH 6.0±0.3有效地緩衝；(iii)蔗糖；及(iv)非離子性清潔劑，諸如聚山梨醇酯。
依據一個具體例，醫藥調配物包含：(i)人類IgG1抗體，其特異結合至人類Ang-2，且其具有SEQ ID NO：4之HCDR1、SEQ ID NO：6之HCDR2、SEQ ID NO：8之HCDR3、SEQ ID NO：14之LCDR1、SEQ ID NO：14之LCDR2及SEQ ID NO：16之LCDR3，濃度為約25mg/ml±3.75mg/mL；(ii)10mM±1.5mM之組胺酸，其在pH 6.0±0.3下進行緩衝；(iii)10% w/v±1.5% w/v的蔗糖；及(iv)0.2% w/v±0.03% w/v聚山梨醇酯20。
依據一個具體例，醫藥調配物包含：(i)人類IgG1抗體，其特異結合至人類Ang-2，且其具有SEQ ID NO：4之HCDR1、SEQ ID NO：6之HCDR2、SEQ ID NO：8之HCDR3、SEQ ID NO：14之LCDR1、SEQ ID NO：14之LCDR2及SEQ ID NO：16之LCDR3，濃度為約50mg/ml±7.5mg/mL；(ii)10mM±1.5mM之組胺酸，其在pH 6.0±0.3下進行緩衝；(iii)10% w/v±1.5% w/v的蔗糖；及(iv)0.2% w/v±0.03% w/v聚山梨醇酯20。
依據一個具體例，醫藥調配物包含：(i)人類IgG1抗體，其特異結合至人類Ang-2，且其具有SEQ ID NO：18之重鏈可變域，以及SEQ ID NO：20之輕鏈可變域，濃度為50mg/ml±7.5mg/mL；(ii)10mM±1.5mM之組胺酸，其在pH 6.0±0.3下進行緩衝；(iii)10% w/v±1.5% w/v的蔗糖；及(iv)0.2% w/v±0.03% w/v聚山梨醇酯20。
依據一個具體例，醫藥調配物包含：(i)人類IgG1抗體，其特異結合至人類Ang-2，且其具有SEQ ID NO：18之重鏈可變域，以及SEQ ID NO：20之輕鏈可變域，濃度為約50mg/ml±7.5mg/mL；(ii)10mM±1.5mM之組胺酸，其在pH 6.0±0.3下進行緩衝；(iii)10% w/v±1.5% w/v的蔗糖；及(iv)0.2% w/v±0.03% w/v聚山梨醇酯20。
本發明所含括的醫藥調配物之其他非限制性實例在本文他處說明，包括工作例及如下所示。
本發明醫藥調配物通常表現出高度安定性。術語「安定」，如本文所用，在提及醫藥調配物時，表示醫藥調配物中的抗體在儲存於特定條件下之後保有可接受程度之化學結構或生物功能。調配物可以是安定的，儘管其中所含抗體在儲存特定時間總數之後並未100%維持其化學結構或生物功能。在某些情況下，在儲存特定時間總數之後維持約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的抗體結構或功能被認為是「安定」。
安定性尤其可於特定溫度下儲存特定時間量之後藉由測定調配物中維持之天然抗體百分比來決定。天然抗體的百分比尤其可以藉由尺寸排除層析(例如尺寸排除高效液相層析[SE-HPLC])來測定諸如天然平均非團聚者及非分解者。「可接受程度的安定性」，當這個片語用於本文中時，表示至少90%的天然形式抗體可於特定溫度下儲存特定時間量之後在調配物中偵測到。在某些具體例中，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的天然形式抗體可於特定溫度下儲存特定時間量之後在調配物中偵測到。在其後測量安定性之特定時間量可為至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。當評估安定性時，醫藥調配物儲存的特定溫度可為下列的任一溫度：約-80℃至約45℃，例如儲存於約-80℃下、約-30℃下、約-20℃下、約0℃下、約4℃-8℃下、約5℃下、約25℃下、約35℃下、約37℃下或約45℃下。例如，若在儲存於5℃下9個月之後，藉由SE-HPLC偵測到超過約96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則醫藥調配物可被視為是安定的。若在儲存於25℃下6個月之後，藉由SE-HPLC偵測
到超過約96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於37℃下28天之後，藉由SE-HPLC偵測到超過約96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於45℃下28天之後，藉由SE-HPLC偵測到超過約93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然抗體，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於-20℃下6個月之後，藉由SE-HPLC偵測到超過約96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於-30℃下6個月之後，藉由SE-HPLC偵測到超過約96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。在儲存於-80℃下6個月之後，藉由SE-HPLC偵測到超過約97%、97.5%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。
安定性尤其可藉由測定在特定溫度下儲存特定時間量之後，調配物中抗體形成團聚體的百分比來測量，其中安定性與形成團聚體的百分比呈反比。團聚抗體百分比尤其可藉由尺寸排除層析(例如，尺寸排除高效液相層析[SE-HPLC])來測定。「可接受程度的安定性」，當這個片語用於本文中時，表示至多6%的抗體於特定溫度下儲存特定時間量之後在調配物中偵測到為團聚體形式。在某些具體例中，可接受程度的安定性表示至多約6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體於特定溫度下儲存特定時間量之後在調配物中偵測到為團聚體形式。在其後測得安定性之特定時間量可為至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。當評估安定性時，醫藥調配物儲存的特定溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃下、約-30℃下、約-20℃下、約0℃下、約4℃-8℃下、約5℃下、約25℃下、約35℃下、約37℃下或約
45℃下。例如，若在儲存於5℃下9個月之後，偵測到少於約2%、1.75%、1.5%、1.25%、1%、0.75%、0.5%、0.25%或0.1%抗體呈團聚形式，則醫藥調配物可被視為是安定的。若在儲存於25℃下6個月之後，偵測到少於約2%、1.75%、1.5%、1.25%、1%、0.75%、0.5%、0.25%或0.1%抗體呈團聚形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於45℃下28天之後，偵測到少於約4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%或0.1%抗體呈團聚形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於-20℃、-30℃或-80℃下3個月之後，偵測到少於約2%、1.9%、1.8%、1.7%、1.6%、1.5%、1%、0.5%或0.1%抗體呈團聚形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。
安定性尤其可藉由測定抗體在離子交換(「酸性形式」)期間移至比抗體主要溶離份(「主要電荷部分」)更為酸性之溶離份的百分比來測量，其中安定性與呈酸性形式之抗體溶離份呈反比。儘管不希望受到理論所囿限，抗體之去醯胺化可使得抗體變為更加帶負電並因而相對於非去醯胺化抗體更為酸性(參見，例如Robinson,N.,Protein Deamidation,PNAS,April 16,2002,99(8)：5283-5288)。「酸化」抗體百分比尤其可藉由離子交換層析(例如，陽離子交換高效液相層析[CEX-HPLC])測定。「可接受程度的安定性」，當這個片語用於本文中時，表示於特定溫度下儲存特定時間量之後在調配物中至多52%抗體呈更為酸性的形式。在某些具體例中，可接受程度的安定性表示於特定溫度下儲存特定時間量之後在調配物中至多約52%、50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體呈酸性形式。其後測量安定性之特定時間量可為至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。當評估安定性時，儲存醫藥調配物的溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃下、約-30℃下、
約-20℃下、約0℃下、約4℃-8℃下、約5℃下、約25℃下或約45℃下。例如，若在儲存於-80℃、-30℃或-20℃下3個月之後，少於約29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體呈更為酸性的形式，則醫藥調配物可被視為是安定的。若在儲存於5℃下9個月之後，少於約28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體呈更為酸性的形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於25℃下28天後，少於約30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體呈更為酸性的形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於37℃下28天之後，偵測到少於約37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體呈更為酸性的形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。若在儲存於45℃下28天之後，偵測到少於約52%、51%、50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%抗體呈更為酸性的形式，則醫藥調配物亦可被視為是安定的。
測量抗體對其目標之結合親和力亦可用於評估安定性。例如，若在儲存於例如-80℃、-30℃、-20℃、5℃、25℃、37℃、45℃等溫度下特定時間量(例如14天至6個月)之後，調配物中所含抗-Ang-2抗體以儲存前該抗體結合親和力的至少84%、90%、95%或更高結合至Ang-2，本發
明調配物可被視為是安定的。結合親和力可藉由，例如ELISA或電漿共振來測定。生物活性可藉由Ang-2活性分析(諸如，例如使表現Ang-2的細胞與包含抗Ang-2抗體之調配物接觸)來測定。抗體結合至此一細胞可直接藉由諸如，例如經由FACS分析來測定。或者，Ang-2系統的下游活性可在抗體存在時測量，並且與抗體不存在時Ang-2系統之活性相比較。在一些具體例中，Ang-2對細胞來說是內生性的。在其他具體例中，Ang-2在細胞中異位地表現。
用於評估調配物中的抗體安定性的其他方法在下面所示實例中證實。
本發明醫藥調配物可包含在任一種適於儲存或投與藥品及其他治療性組成物的容器中。例如，醫藥調配物可包含在密封與滅菌之具有預定體積的塑膠或玻璃容器中，例如小瓶、安瓿、注射器、藥匣、瓶或IV袋中。不同類型的小瓶可用於容納本發明調配物，包括，例如透明與不透明(例如琥珀色)玻璃或塑膠小瓶。同樣地，任何類型的注射器可用於容納或投與本發明醫藥調配物。
本發明醫藥調配物可包含在「標準鎢」注射器或「低鎢」注射器中。如習於本技藝者所知，製造玻璃注射器的製程通常涉及使用高鎢桿(其作用為刺穿玻璃)，從而由其產生一個液體可被抽出並排出注射器的孔洞。此製程使微量鎢沉積在注射器的內表面。之後的洗滌與其他加工步驟可用於降低鎢在注射器中的數量。如本文所用，術語「標準鎢」表示注射器含有超過或等於500ppb的鎢。術語「低鎢」表示注射器含有少於500ppb的鎢。例如，依據本發明，低鎢注射器可含有少於約490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更低ppb的鎢。
注射器中所使用的橡膠塞蓋，以及用於密封小瓶開口的橡膠瓶蓋可經塗層以防止注射器或小瓶的醫藥內容物汙染，或維持其安定性。
因此，依據某些具體例，本發明醫藥調配物可包含在具有經塗覆塞蓋之注射器內，或在以經塗覆橡膠瓶蓋密封之小瓶內。例如，塞蓋或瓶蓋可塗覆有氟碳化物膜。適用於與含有本發明醫藥調配物之小瓶及注射器一起使用的經塗覆塞蓋或瓶蓋的實例述於，例如美國專利第4,997,423號；第5,908,686號；第6,286,699號；第6,645,635號及第7,226,554號，其內容以其整體併入本文做為參考文件。可用於本發明上下文內的特定例示性經塗覆橡膠瓶蓋與塞蓋可在商業上以商標名「FluroTec®」由West Pharmaceutical Services,Inc.(Lionville,PA)取得。FluroTec®是一種用於使藥品盡可能不附著於橡膠表面或防止藥品附著於橡膠表面的氟碳化物塗層。
依據本發明的某些具體例，醫藥調配物可包含於具有經氟碳化物塗覆之塞蓋之低鎢注射器內。
醫藥調配物可以藉由非經腸途徑投藥給患者，諸如注射(例如皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內等)，或經皮、黏膜、鼻、肺或口服投藥。許多可重複使用筆型或自動注射遞送裝置可用於皮下遞送本發明之醫藥調配物。實例包括，但不限於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。應用在皮下遞送本發明醫藥調配物之拋棄式筆型或自動注射遞送裝置的實例包括，但不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)與HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park,IL)。
在本文中亦預期使用微輸注器遞送本發明醫藥調配物。如本文所用，術語「微輸注器」表示被設計成在一段長時間內(例如約10、15、20、25、30或更多分鐘)緩慢地投與大量(例如多達約2.5mL或更多)治療調配物的皮下遞送裝置。參見，例如U.S.6,629,949；US 6,659,982以及Meehan et al.,J.Controlled Release 46：107-116(1996)。微輸注器尤其可用於遞送大劑量的治療性蛋白(具有高濃度)(例如，約100、125、150、175、200或更多mg/mL)或黏性溶液。
在一個具體例中，醫藥調配物是經IV滴注投與，使得調配物稀釋於含有生理學上可接受溶液中的IV袋中。在一個具體例中，醫藥調配物是靜脈內輸注袋的複合無菌製劑，使得單劑量藥品稀釋至100mL、250mL(或適於靜脈內滴注投遞的其他可行量)的生理緩衝液(例如0.9%食鹽水)中。在一些具體例中，輸注袋是由聚氯乙烯(例如VIAFLEX,Baxter,Deerfield,Illinois)製成。在一些具體例中，輸注袋是由聚烯烴(EXCEL IV Bags.Braun Medical Inc.,Bethlechem,Pennsylvania)製成。
本發明之醫藥調配物尤其可用於治療、預防或改善與Ang-2活性有關的任何疾病或病症，包括由Ang-2所媒介的疾病或病症。可經由投與本發明醫藥調配物而治療或預防的例示性、非限制性疾病與病症包括各種涉及血管新生的疾病，而血管新生為新血管形成的生物過程。異常血管新生與數種疾病病況有關，包括(例如)增生性視網膜病變、類風溼性關節炎與牛皮癬。另外，已證實血管新生對於腫瘤生長與維持至關重要。
提出下列實施例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及發明說明提供給技藝中具有通常技術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字的正確性(例如數
量、溫度等)，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份為以莫耳計的份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。
初始調配物發展行動涉及篩選抗-Ang-2抗體之液體與凍乾調配物中的有機共溶劑、熱安定劑與緩衝劑，以鑑別與蛋白質相容且增強其安定性，同時維持相近的生理滲透性與低黏度供靜脈內和皮下注射用的賦形劑。亦檢驗緩衝條件以測定最高蛋白質安定性的最佳pH。
調配物發展行動包括篩選抗-Ang-2抗體之液體調配物中的緩衝劑、有機共溶劑與熱安定劑，以鑑別會增強蛋白質安定性的賦形劑。亦檢驗緩衝條件以決定最高蛋白質安定性的最佳pH。由此等研究所產生的結果用於發展安定的臨床用液體調配物。抗Ang-2(例如H1H685P)被調配成25±3.75mg/ml與50±7.5mg/ml。在一個具體例中，抗-Ang-2抗體被調配於10±1.5mM組胺酸(pH 6.0±0.3)、0.2%±0.03%聚山梨醇酯20、10%±1.5%蔗糖中。
考量pH與緩衝劑類型對於抗-Ang-2安定性的影響。在45℃下將25mg/mL H1H685P培育於乙酸鹽(pH 5.0-5.5)、檸檬酸鹽(pH 5.5-6.0)、琥珀酸鹽(pH 6.0)、組胺酸(pH 5.5-6.5)、磷酸鹽(pH 6.0-8.0)或Tris(pH 8.0)緩衝劑中，以評估緩衝劑與pH對於蛋白質之熱安定性的影響(表1)。就H1H685P的調配物而言，依據尺寸排除層析(SE-HPLC)的蛋白質安定性分析揭示，乙酸鹽(pH 5.5)、磷酸鹽(pH 6.0)、組胺酸(pH 5.5-6.5)、與琥珀酸鹽表現得比其他緩衝系統更好。當H1H685P以pH 6.0調配於組胺酸緩衝劑中時，觀察最高蛋白質安定性，如同藉由陽離子交換層析(CEX HPLC)所測定。這些分析亦揭示，抗體分解主要形成團聚體、分解產物及電荷變體。H1H685P安定性的最佳pH在組胺酸緩衝劑中經觀察為6.0，儘管在5.5至6.5的pH範圍內觀察到良好安定性。根據這些結果，選定在pH 6.0下的
10mM組胺酸緩衝劑來調配抗體藥品(DP)。
就表1中所示的結果而言，在45下測試具有經FluroTec®塗覆之4432/50丁基橡膠檔塞之2mL第1型硼矽酸玻璃小瓶中於10mM測試緩衝劑中的0.35mL 25mg/mL H1H685P歷時28天。1濁度被報導為在405nm下相較於起始材料在OD上的相對變化。2SE-HPLC與CEX-HPLC起始材料結果為所有14種調配物的起始材料的平均值。OD=光學密度；RP-HPLC=逆相高效液相層析；SE-HPLC=尺寸排除高效液相層析；CEX-HPLC=陽離子交換高效液相層析。
當歷經振盪壓力時，H1H685P抗-Ang-2抗體(亦即藥品或「DS」)表現出的安定性有限。經振盪DS的濁度分析證明，當H1H685P振盪歷時120分鐘，在405nm下的光學密度(OD)增加(表2，參見無共溶劑數據)。這個在濁度上的增加指出，因為振盪壓力而明顯形成顆粒。在無共溶劑存在下振盪調配物也會造成團聚形成明顯增加。具有所評估的任一種共溶劑的調配物防止振盪依賴性濁度與H1H685P團聚體含量增加(表2)。但是，添加0.2%普朗尼克F68、20%PEG 300、10% PEG 300以及20%丙二醇至調配物明顯降低H1H685P的熱安定性，如藉由SE-HPLC以及CEX-HPLC所測定(表3)。含有聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80以及PEG 3350的調配物對於H1H685P的熱安定性沒有明顯效用，如藉由SE-HPLC以及CEX-HPLC所測定，使得這些共溶劑適用於H1H685P的調配物(表3)。就發展H1H685P調配物而言，因為聚山梨醇酯20相對於聚乙二醇安定蛋白質對抗振盪壓力，不影響其熱安定性，且需要低共溶劑濃度來安定蛋白質，故其被選作為有機共溶劑。
就表2中所示的抗體安定性結果，具有經FluroTec®塗覆之4432/50丁基橡膠檔塞之2mL第1型硼矽酸玻璃小瓶中於10mM組胺酸、pH 6.0至6.1中之0.8mL的5mg/mL H1H685P與有機共溶劑合併並進行120分鐘振盪。1濁度被報導為在405nm下相較於起始材料在OD上的相對變化。2SE-HPLC與CEX-HPLC起始材料結果為所有9種調配物的起始材料的平均值。OD=光學密度；RP-HPLC=逆相高效液相層析；SE-HPLC=尺寸排除高效液相層析。
就表3中所示的抗體安定性結果而言，具有經FluroTec®塗覆之4432/50丁基橡膠檔塞之2mL第1型硼矽酸玻璃小瓶中於10mM組胺酸、pH 6.0至6.1中之0.35mL的5mg/mL H1H685P與有機共溶劑合併並在45℃下28天。1濁度被報導為在405nm下相較於起始材料在OD上的相對變化。2SE-HPLC與CEX-HPLC起始材料結果為所有9種調配物的起始材料的平均值。OD=光學密度；RP-HPLC=逆相高效液相層析；SE=尺寸排除高效液相層析；CEX=陽離子交換高效液相層析。
檢驗安定劑(諸如糖、胺基酸及無機鹽)增加H1H685P之熱安定性的能力。所檢驗的熱安定劑的歸納結果呈現於表4中。含有20%蔗糖、10%甘露醇以及20%海藻糖的調配物具有最低的H1H685P分解量，如藉由SE-HPLC與CEX-HPLC分析在熱壓力後所測得。但是，含有甘露醇的調配物使得蛋白質對於多次冷凍與解凍循環去安定。當與蔗糖或海藻糖一起調配時，H1H685P對熱壓力具有類似的安定性。就發展液體H1H685P調配物來說，選定蔗糖作為熱安定劑。
當在組胺酸、聚山梨醇酯20以及蔗糖存在下於pH 6.0時，H1H685P表現最高安定性。就H1H685P DP調配物而言，選定10%蔗糖，其接近於等滲透莫耳濃度。在發展H1H685P液體調配物期間所鑑別出的主要分解途徑為形成團聚體、裂解產物，及電荷變體，其中當在45℃下培育蛋白質時，觀察到最高的分解速率(電荷變體增加)。
就表4中所示的抗體安定性結果，0.35mL的10mM組胺酸(pH 6.0至6.1)、0.2%聚山梨醇酯20與25mg/mL H1H685P加上指定熱安定劑在具有經FluroTec®塗覆之4432/50丁基橡膠檔塞之2mL第1型硼矽酸玻璃小瓶中45℃下28天。1濁度被報導為在405nm下相較於起始材料在OD上的相對變化。2SE-HPLC與CEX-HPLC起始材料結果表示所有10種調配物的起始材料於45℃下培育的平均值。OD=光學密度；RP=逆相高效液相層析；SE=尺寸排除高效液相層析；CEX=陽離子交換高效液相層析。
總結來說，H1H685P在含有10mM組胺酸(pH 6.0)、0.2%(w/v)聚山梨醇酯20、10%(w/v)蔗糖及25mg/mL H1H685P的經最佳化、水性緩衝調配物中被製造為液體。當歷經各種壓力條件，25mg/mL的H1H685P DP在物理上與化學上為安定的(表5)。當DP振盪、冷凍並解凍數次，或在25℃下培育14天時，對於pH、外觀、濁度或H1H685P還原量沒有影響。在37℃下培育28天後，DP相對於未遭受壓力樣品的對照多降
解0.6%(如藉由SE-HPLC分析所測定)，且多降解10.1%(主峰降低%)(如藉由CEX-HPLC分析所測定)。在45℃下培育28天後，DP相較於未遭受壓力的對照多降解3.6%(如藉由SE-HPLC分析所測定)以及多降解23.8%(主峰降低%)(如藉由CEX-HPLC分析所測定)。就遭受壓力的任一個樣品而言，沒有觀察到明顯喪失效力(如使用下面所述H1H685P結合分析所測定)。
經調配H1H685P的效力是經由競爭三明治ELISA(結合分析)藉由測量H1H685P阻斷人類血管生長素-2-His-標記融合蛋白(hAng2-His)結合至塗覆有人類Tie2-鼠科Fc-融合蛋白(hTie2-mFc)之盤上的能力。以不同數量的H1H685P滴定hAng2-His。假設單體分子量為50.1kDa來計算hAng2-His濃度。在轉移至塗覆有hTie2-mFc的微量盤之前，於25℃下培育配位體-抗體複合物1小時。在1小時培育後，洗滌孔並且使用HRP-綴合抗
-His標記單株抗體偵測結合的hAng2-His。所計算的IC50值(定義為阻斷50%His-標記hAng2結合至Tie2-mFc所需的抗體濃度)，用作為阻斷效力的指標。
就表5中所示的抗體安定性結果，在具有經FluroTec®塗覆之4432/50丁基橡膠檔塞之2mL第1型硼矽酸玻璃小瓶中0.35mL的10mM組胺酸(pH 6.0至6.1)、0.2%聚山梨醇酯20、10%蔗糖與25mg/mL H1H685P與有機共溶劑合併並歷經各種指定壓力。4051濁度被報導為在405nm下相較於起始材料在OD上的相對變化。2結合分析的可接受標準為50-150%參考標準品。OD=光學密度；RP=逆相高效液相層析；SE=尺寸排除高效液相層析；CEX=陽離子交換高效液相層析。
進行安定性研究以測定含有25mg/mL抗體、10mM組胺酸(pH 6.0±0.3)、0.2%聚山梨醇酯20及10%蔗糖的抗-Ang-2抗體調配物的儲存與壓力安定性。使用濁度與RP-HPLC分析來評估抗體的物理安定性。物理安定性定義為抗-Ang-2抗體在溶液中的可溶形式的還原率。蛋白質損失可能是因為蛋白質沉澱或表面吸附。在溶液中存在顆粒可藉由視覺審視或藉由光學密度(OD)在405nm下測量(濁度測量)來偵測。在光學密度分析中，OD增加表示濁度因為形成顆粒而增加。如藉由OD測量決定顆粒存在表示樣品無法維持安定性。抗體的還原率是藉由RP-HPLC來測量。在RP-HPLC分析中，抗-Ang-2抗體從逆相管柱中以單峰被洗脫出。各測試樣品的濃度是由洗脫抗體峰面積相較於使用限定蛋白質加載量之抗體標準品產生之校正曲線而測定。
化學安定性意指抗-Ang-2抗體在樣品中的化學結構完整性。大多數化學不安定性可能是因為形成蛋白質的共價修飾形式(例如，共價團聚物、切割產品或電荷變體)，以及抗體的非共價修飾形式(例如非共價團聚物)。迄今，H1H685P已被偵測到的唯一分解產物是一種分子量或電荷皆有所不同的形式。較高與較低分子量分解產物可藉由SE-HPLC從天然抗體被分離。天然物在尺寸排除層析法中的百分比是藉由天然峰面積相對於
所有抗-Ang-2抗體峰之總面積的比例來決定。
抗-Ang-2抗體的電荷變體形式是使用陽離子交換層析從天然抗體被解析。以比主峰的滯留時間更早從CEX-HPLC管柱洗脫出的峰被標記為「酸性峰」，而那些以比主峰的滯留時間更晚從CEX-HPLC管柱洗脫出者被標記為「鹼性峰」。在陽離子交換層析法中的分解抗-Ang-2抗體百分比是藉由主峰、酸性峰與鹼性峰面積與所有抗-Ang-2抗體峰的總面積相比對的相對百分比變化而測定。
在促進條件下藉由將抗體進行各種壓力測試來進行抗體的評估。此等測試表示調配藥品在藥品製造、儲存或運輸期間可能遭遇到的極端操作條件。經調配的抗-Ang-2抗體被充填至5mL聚碳酸酯小瓶用於振盪、冷凍/解凍循環，以及冷凍儲存條件。經調配抗體被充填至玻璃小瓶中以檢驗在高溫下的壓力安定性。
當在-80℃、-30℃、-20℃及5℃下儲存歷時6個月，以及在5℃下歷時9個月，在含有10mM組胺酸(pH 6.0±0.3)、0.2%聚山梨醇酯20及10%蔗糖的25mg/mL H1H685P抗體調配物的物理與化學安定性中觀察到沒有變化。在-80℃、-30℃及-20℃下6個月分別觀察到結合活性(上述的ELISA競爭分析)上些微減少(亦即基線的~86%、~84%與~91%)。參見表6。
在10mM組胺酸(pH 6.0±0.3)、0.2%聚山梨醇酯20、10%蔗糖中所調配的25mg/mL抗-Ang-2(H1H685P)調配物的壓力安定性是藉由將調配物進行振盪、熱壓力(45℃、37℃、25℃)，以及冷凍解凍壓力來進行識別。將0.35mL調配物充填至具有經FLUROTEC塗覆之4432/50丁基橡膠檔塞之2mL第1型硼矽酸玻璃小瓶。結果呈現於表7中。
使用一系列分析、生物化學與生物物理技術來鑑別經調配的H1H685P抗體。醣化與去醣化H1H685P抗體樣品的重鏈與輕鏈的分子量是依據毛細電泳-十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)分析在還原條件下測定。樣品在0.5% w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)以及40mM二硫蘇糖醇中於60℃下變性歷時10分鐘。在變性與還原之後，添加1 x G7緩衝液v/v(1% Nonidet 40以及50mM磷酸鈉pH 7.5)至樣品中。藉由添加1250單位的肽N-醣苷酶F(PNGase F)並在37℃下培育3小時而達到H1H685P的去醣化。除了在3小時培育時省略PNGase F酵素以外，以類似方法製備未經處理的對照樣品。在培育之後將樣品去鹽以移除可能干擾CE-SDS分析的反應緩衝劑成分。去鹽的樣品在1% w/v SDS與4.5% w/v β-巰基乙醇中完全變性並在80℃下培育10分鐘。對各樣品添加10kDa分子量標準品(Beckman Coulter)並用作為內部標準品以測定峰特性與計算蛋白質的可移動性。
在H1H685P未經處理對照樣品的電泳圖中觀察到三個主要峰。峰1表示具有計算分子量為約28kDa的還原輕鏈(34.0-34.1%總峰面積)。峰2與峰3分別表示非醣化重鏈(~51kDa；3.1-3.8%)與醣化重鏈(~56kDa；62.2-62.8%總峰面積)。重鏈與輕鏈(峰1、2及3)的總和代表≧99%針對H1H685P批次樣品藉由此方法所偵測到的總峰百分比。
在經PNGase F處理的樣品中，每一電泳圖中峰3強度的實質降低與峰2強度的同時增加結合在一起，表示從醣化重鏈移除糖鏈。在經PNGase F處理的H1H685P批次樣品的毛細電泳之後，由電泳圖產生之峰2之平均校正峰面積百分比(66%)相等於對照、非PNGase F處理樣品之毛細電泳後產生之峰2與3之平均峰面積百分比平均值的總和(66%)，表示重鏈在PNGase F培育之後完全去醣化。一如預期，輕鏈的分子量及相對移動時間沒有改變。
多角度雷射光散射(MALLS)是一種分析方法，提供蛋白質或糖蛋白分子量的估算值。藉由將光線散射偵測器的流動室連接至凝膠過濾管柱來進行各分離藥品成分之分子量分析，以分析天然H1H685P的莫耳質量(SEC-MALLS)。藉由差異性折射率與吸光度偵測器監測蛋白質濃度。經調配的H1H685P批次樣品被直接注入TSK Gel G3000SWxl(Tosoh Biosciences,cat 08541；管柱尺寸0.78cm x 30cm，5μm粒徑，與孔度為250Å)，在10mM磷酸鈉、500mM NC、pH 6.1緩衝液(SEC緩衝液)中預平衡。藉由Astra軟體(Wyatt Technology)使用比折射率增量分析數據，比折射率增量定義為折射率變化除以蛋白質濃度變化(dn/dc)，針對移動相緩衝劑的高離子強度進行校正。依據SEC-MALLS分析，H1H685P的主峰(峰4，洗脫體積為~7.9mL)對應於約151kDa的分子量。針對主峰(峰4)所鑑別的莫耳質量對應於完整抗-Ang-2抗體，其為存在於溶液中的主要形式(主蛋白質峰面積的96.1-96.9%)。在測試的所有經調配H1H685P樣品中偵測到非常小百分比的兩個高分子量形式(對應於峰2(洗脫體積為~6.2mL)以及峰3(洗脫體積為6.5mL))與兩個小分子量形式(對應於峰5(洗脫體積為~8.4mL)以及峰6(洗脫體積為~9.8mL))。由峰3(洗脫體積為~6.5mL)的計算莫耳質量約為300kDa，與H1H685P抗體的二聚體形式對應，且代表一小部分(1.5-1.9%)
的總抗體分子量形式存在於溶液中。峰5的計算分子量(洗脫體積為~8.4mL)約為66kDa，且代表≦1.5%的總分子量形式存在於樣品中。峰6代表~0.2-0.3%的總峰面積。H1H685P藥品的SEC-MALLS分析結果證實，大多數蛋白質以具有平均莫耳質量為約151kDa的完整抗體形式存在。
進一步分析獨立批次的經調配H1H685P以透過質量測定來確認完整蛋白質的分子量。將1.5μg的各蛋白質樣品注射至與Waters Synapt質譜儀偶接的1.7μm BEH130 C18管柱上以供進行質量測定。使用最大熵演算法以迭代反卷積完整蛋白質的ESI-TOF質譜。基於H1H685P的重鏈與輕鏈cDNA序列，預測完整抗體(其中重鏈C端Lys被移除)具有144604.4Da的分子量。完整H1H685P批次的反卷積質譜顯示類似的型態，其中各個含有多峰的譜在146道耳頓(岩藻醣)或162道耳頓(半乳糖)有所不同，暗示存在與微-不均勻性相關的醣化。這些醣團是藉由將所觀察到的完整質量扣除預測分子量144604.4而獲得。舉例而言，第二個ESI/MS峰具有m/z 147493Da，在144604.4Da的完整MAb MW較少，在2889Da處留下醣團。因為醣被添加至Fc的兩側，醣團應為1445Da。
這些醣團被用來分派主要H1H685P醣結構形式。分析顯示，這些醣主要由岩藻醣基化複合雙觸結構所組成，其在醣鏈末端具有0、1與2個半乳糖。蛋白質胺基酸序列的預測與觀察質量的質量差(4道耳頓)在Synapt MS的質量正確性規定範圍內。這些結果確認，在一級序列層次鑑別H1H685P。
藉由一維等電聚焦(IEF)在自然條件下分析H1H685P以測定完整抗體的等電點(pI)。研究中包括一系列的pI標準品，其具有能被Colloidal blue staining所看到的蛋白質帶。H1H685P的所有樣品製品表現總計8個強度不一的帶，其在pI為7.9至8.4之間移動，主要形式的pI為8.2。移動至pI約8.2處的帶表現出比完整抗體的預期pI 8.6略低的pI。主要帶最可能代表缺少C端離胺酸的完全醣化完整抗體(預測pI為8.54)。這個解
釋與在蛋白質水解消化與逆相分離後的重鏈質譜分析一致。在質譜分析中，H1H685P重鏈的主要C端肽被觀察到缺少末端離胺酸殘基，其被預測由cDNA序列所呈現。觀察到三個次要鹼性變體(對應於pI範圍為8.3-8.4)。在不希望受到理論所囿限的情況下，這些次要形式可能代表抗體的部分形式，諸如僅具有重鏈二聚體的抗體形式(預測pI為8.9)，或缺少一或兩個C端離胺酸的重鏈二聚體。或者，這些形式可能與少量的完整抗體之帶電變體形式(含有一或兩個C端離胺酸)相符。這個解釋與重鏈在胰蛋白酶消化與藉由逆相層析分離肽之後的質譜分析一致。約2.5%的H1H685P重鏈經質譜儀鑑定含有C端離胺酸。
H1H685P的κ輕鏈的天然單體形式之pI預測為6.4。在所用條件下沒有偵測到對應於pI為6.4的帶，暗示最低(若有的話)量的游離輕鏈存在於經調配的H1H685P製品中。儘管目前尚未被鑑定，但是四個相對於主要帶(對應於pI範圍為7.9-8.1)移動至更為酸性pH的額外次要帶存在於所有測試樣品中，且被推測表示具有去醯胺化形式的完整、醣化抗體、不正確形成的分子間雙硫鍵，或少量的抗體截斷形式。
經調配H1H685P的電荷不均勻性亦藉由等電聚焦使用以毛細電泳(cIEF)為基礎的方法來進行定量評估。關於這個研究，各H1H685P樣品在cIEF凝膠(Beckman Coulter,cat 477497)(含有39mM精胺酸、2.3mM亞胺基二乙酸與3-10 Pharmalytes(GE Healthcare；12μl))中被稀釋至0.4mg/mL(100μg)。在7.77至8.48的範圍內觀察到總共7個強度不一的峰。因為毛細解析度增加，由cIEF所觀察到的產物相關峰的pI範圍略大於以凝膠為基礎之等電聚焦法所觀察到的pI範圍(pI範圍為7.9-8.4)。從各測試的DS批次的電泳圖觀察到高度相似的定量峰型態。有總共4個主要峰(峰4-7)表示約92-93%的總峰面積。在不希望受到理論囿限的情況下，這些峰可能代表缺少C端離胺酸的完整抗體、抗體的截斷或局部形式、抗體的非共價完整形式，或具有不正確形成之雙硫鍵的形式。這些峰中的一些可能在樣品製備期間或在所用電泳條件下產生。峰4代表具有pI為約8.1的主要電
荷變體形式，且所測試的兩種經調配H1H685P樣品批次的平均峰面積百分比為57.5%與53.4%。
為進一步檢驗H1H685P調配抗體的電荷不均勻性，藉由二維凝膠電泳分析數個樣品。關於2-D凝膠方法，將蛋白質還原並接著依據電荷在第一維使用等電聚焦予以分離。之後，在第二維中依據分子量使用在還原條件下進行的SDS-PAGE進一步解析經分離的帶電形式。各個還原H1H685P樣品(2μg)，於Bio-Rad 2-D pI標準品存在或不存在下，被加載至pH 3-10固定式pH梯度(IPG)條以供在第一維中分析。在等電聚焦之後，IPG條被加載至4-20% Novex Tris甘胺酸凝膠上以供在第二維中分析。第二維於分子量標準品存在下進行。另外，等電聚焦分析中包括一系列具有已知pI的內部標準品。所有蛋白質是藉由考瑪斯藍染色來觀察。在2-D凝膠電泳與蛋白質點分析之後，所有H1H685P批次樣品表現彼此相當的點型態，具有類似的電荷變體形式存在，可能是因為重鏈的相同不均勻性。在凝膠中總共觀察到3個H1H685P-相關點，對應於約55kDa的質量，其中一個高度豐富的形式表現對應於約8.2的pI。這個點(pI為~8.2)與藉由質譜分析所偵測之缺少C端離胺酸的還原、醣化重鏈多肽一致。兩個未經鑑定的次要點(在2-D凝膠中偵測到)表現出介於約pH 7.5-8.0的等電點。在一個理論說法中，這些點包括重鏈的分析依賴性去醯胺化蛋白質形式或截斷形式。或者，樣品處理或凝膠加工品可能造成點擴散，使得不同等電點的其他次要點出現。
一如預期，H1H685P輕鏈在2D凝膠中移動如同單一主要點，對應於約6.0的pI，具有約25kDa的分子量。亦觀察到未經鑑定的次要點(pI為~5.8)具有約25kDa的分子量。這個點可能代表小百分比的去醯胺化輕鏈，其亦在質譜分析中被偵測到。
與大多數IgG1抗體相同，H1H685P重鏈末端為預期胺基酸序列Pro-Gly-Lys，其中C端Lys殘基傾向藉由未經鑑定的鹼性羧肽酶在蛋
白質表現期間被移除。末端Lys的局部移除可能造成抗體藥品內的電荷不均勻性。由還原H1H685P的肽測繪分析，確認胰蛋白酶肽中的大多數C端Lys452殘基從重鏈被移除，使得C端肽具有445SLSLSPG451(SEQ ID NO：532)的序列。僅有非常少百分比的胰蛋白酶肽(含有C端Lys殘基(445SLSLSPGK452；SEQ ID NO：533))在胰蛋白酶測繪中被觀察到。基於各批次H1H685P的兩個胰蛋白酶C端重鏈肽的積分峰面積，約1.0%與1.5%的H1H685P抗體重鏈在毒理學與臨床批次中分別含有C端Lys452。
天冬醯胺酸的非酶促去醯胺化是另一種經常在抗體中觀察到的常見修飾。經由形成琥珀醯亞胺中間體，接著水解而發生的去醯胺化產生異天冬胺酸與天冬胺酸形成。每一次去醯胺化結果引入一個額外的負電荷至抗體並產生電荷不均勻性。在一級胺基酸序列中天冬醯胺酸殘基接著甘胺酸或絲胺酸就蛋白質內的去醯胺化來說是到目前為止最容易受到影響的位點。在H1H685P中，重鏈中的兩個天冬醯胺酸殘基(Asn320與Asn389)的後面直接為甘胺酸殘基，且因此是去醯胺化的候選位點。質譜分析指出，在任一H1H685P樣品批次中於Asn320發生少許去醯胺化。聚焦質量分析揭示，在如峰53被洗脫出的肽中鑑定出Asn389。含有Asn389去醯胺化形式的肽在峰52中被洗脫出來。因為在峰52中被共洗脫的其他肽，無法依據UV訊號得到去醯胺化之相對量的定量分析。但是，從質譜使用離子強度，去醯胺化Asn389在H1H685P的批次中的相對百分比經測定為低於2%。在H1H685P的還原肽測繪中，質譜分析亦鑑定峰49為一個輕鏈胰蛋白酶肽，其含有天冬醯胺酸94接著是絲胺酸的一個天然形式。亦鑑定出等效肽(相對於輕鏈含有去醯胺化形式的Asn94)(峰48)。這兩個峰的積分揭示，這個天冬醯胺酸總量的約4.2%在毒理學與臨床批次中以去醯胺化的形式存在。輕鏈天冬醯胺酸94被鑑定為僅含有Asn-Ser的肽，其在H1H685P中表現去醯胺化終產物。輕鏈Asn94位在第三互補決定區(CDR)中。因為用來製備肽測繪樣品之結構上分裂的條件，無法排除在Asn94處所觀察到的去醯胺化於胰蛋白酶消化程序期間即已產生。在任何其他天冬醯胺酸殘基處沒有觀察到任
何可偵測程度的去醯胺化。結果暗示，天冬醯胺酸的去醯胺化在H1H685P製造期間不預期會發生至任何可估算程度。
亦檢驗表面甲硫胺酸殘基氧化的可能性(其可能影響H1H685P安定性與活性)。H1H685P在重鏈中含有三個甲硫胺酸殘基。一些甲硫胺酸殘基預期位在抗體表面上，使得它們容易遭受氧化。甲硫胺酸側鏈氧化成硫化物形式增加側鏈質量達16道耳頓，且使得側鏈更為具有極性。針對含有甲硫胺酸的肽的大量質量數據分析，揭示於H1H685P所測試的任一批次裡在三個甲硫胺酸殘基的任一者處無氧化，暗示表現與純化方法以及藥品儲存條件不會造成蛋白質的化學變化。
醣化是一種主要的轉譯後修飾，可造成抗體的分子質量不均勻性。人類IgG1同型抗體含有單一典型天冬醯胺酸-連結(N-連結)醣化位點於重鏈恆定區(Fc域)中。還原H1H685P胰蛋白酶肽測繪分析鑑定出兩個醣肽，對應於Fc域的兩個胰蛋白酶肽(胺基酸序列為298EEQFNSTYR306(SEQ ID NO：534)與294TKPREEQFNSTYR306(SEQ ID NO：535))。這些醣肽上的主要醣型是依據MS分析來說明，且歸納於表8中。醣肽質量分析揭示，H1H685P N-連結糖主要由複合、雙觸結構所組成，具有一個核心岩藻醣以及零、一或二個半乳糖殘基在醣鏈末端。這些結構與由哺乳動物細胞表現之重組型抗體上所發現的典型醣型一致。LC/MS分析亦揭示含有Fc醣化位點(Asn302)但缺少醣佔據(峰18與峰23)的肽。在UV層析圖中的峰面積積分顯示，在Fc處分別有4.8%與5.2%的N-連結位點於毒理學與臨床批次中不表現醣佔據。這些結果與毛細電泳分析一致。由胰蛋白酶測繪所產生的各個肽的MS分析揭示，H1H685P在H1H685P抗體分子中沒有其他N-連結或O連結醣化位點。
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<120> 含抗Ang-2抗體之安定化調配物
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Claims (33)
- 一種醫藥調配物，其包含：(i)濃度為20±3mg/ml至60±9mg/ml之特異結合至人類血管生長素2(人類Ang-2)的抗體，其中該抗體包含胺基酸序列SEQ ID NO：18之重鏈可變區(HCVR)及胺基酸序列SEQ ID NO：20之輕鏈可變區(LCVR)；(ii)濃度10mM±1.5mM之組胺酸；(iii)濃度0.2% w/v±0.03%之聚山梨醇酯；以及(iv)濃度10%±1.5% w/v之蔗糖，其中該調配物具有pH 6±0.3。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥調配物，其中(a)超過96%的抗體具有151kDa±1kDa的分子量；(b)至少53%的抗體具有8.13±0.01的等電點；以及(c)90%至92%的抗體經岩藻醣基化。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中抗體濃度為25mg/ml±3.75mg/ml。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中該其中抗體濃度為50mg/ml±7.5mg/ml。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中該聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少93%的抗體在45℃下28天後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少32%的抗體在45℃下28天後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少97%的抗體在25℃下28天後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少53%的抗體在25 ℃下28天後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少96%的抗體在37℃下28天後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少45%的抗體在37℃下28天後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少97%的抗體在5℃下6個月後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少55%的抗體在5℃下6個月後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中在5℃下6個月後抗體的相對效力百分比為儲存前抗體效力的至少100%。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少97%的抗體在-80℃下6個月後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少55%的抗體在-80℃下6個月後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中在-80℃下6個月後抗體的相對效力百分比為儲存前抗體效力的至少85%。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少96%的抗體在-30℃下6個月後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少55%的抗體在-30℃下6個月後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中在-30℃下6個月後抗體的相對效力百分比為儲存前抗體效力的至少84%。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少96%的抗體在-20℃下6個月後具有天然構形。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中至少55%的抗體在-20℃下6個月後為抗體的主要電荷變體。
- 如申請專利範圍第1或2項之醫藥調配物，其中在-20℃下6個月後抗體的相對效力百分比為儲存前抗體效力的至少90%。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥調配物，其由下列所組成：(a)25mg/ml± 3.75mg/ml的抗體、(b)10mM±1.5mM組胺酸，pH 6.0±0.3、(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，及(d)含10% w/v±1.5%蔗糖之水。
- 如申請專利範圍第1項之醫藥調配物，其由下列所組成：(a)50mg/ml±7.5mg/ml的抗體、(b)10mM±1.5mM組胺酸，pH 6.0±0.3、(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，及(d)含10% w/v±1.5%蔗糖之水。
- 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1、24或25項中任一項之醫藥調配物，其中該組成物包含在一容器中。
- 如申請專利範圍第26項之醫藥組成物，其中該容器為小瓶。
- 如申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該小瓶為玻璃。
- 如申請專利範圍第26項之醫藥組成物，其中該容器為IV滴注袋。
- 如申請專利範圍第29項之醫藥組成物，其中該袋是由聚氯乙烯製成。
- 如申請專利範圍第29項之醫藥組成物，其中該袋是由聚烯烴製成。
- 一種套組，其包含如申請專利範圍第1、24或25項中任一項之醫藥組成物、容器以及使用說明。
- 如申請專利範圍第32項之套組，其中該容器為玻璃小瓶，配有塗覆氟碳化物的的橡膠瓶塞。
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