JP2023551446A - 非水膜乳化を使用した持続放出製剤 - Google Patents

Abstract

ポリマー及びポリマーコーティングされた微粒子を製造するための非水膜エマルジョン方法が提供される。いくつかの実施形態は、微粉化されたタンパク質粉末及びポリマーを炭化水素溶媒中で合わせて第１の非水溶液を形成し、第１の非水溶液を撹拌して懸濁液を形成し、懸濁液を分散ポンプ内に供給することによって、持続放出又は制御放出微粒子を製造する方法であって、懸濁液を、フルオロカーボン液体及びフッ素系界面活性剤を含む連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する、方法を提供する。炭化水素溶媒、フルオロカーボン液体、及びフッ素系界面活性剤を除去し、微粒子を収集する。【選択図】図５

Description

本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国出願第６３／１１８，２６４号の優先権を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の態様は、一般に、薬物マイクロスフェア製剤及び膜乳化方法によって生成される非水エマルジョンシステムを使用してそれらを作製する方法に関する。

生物学的に関連する標的に対する治療用タンパク質の徐放送達は、がん、心血管疾患、血管病態、整形外科的障害、歯牙障害、創傷、自己免疫疾患、胃腸障害、及び眼疾患などの医学的病態の治療に望ましい。薬物の制御及び延長送達（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のための生体適合性及び生分解性ポリマー並びに他の移植可能な送達デバイスが、数十年にわたって使用されてきた。例えば、いくつかのポリマーベースの送達デバイスでは、ポリマーが経時的に分解するにつれて、治療薬がゆっくりと放出される。

徐放は、患者コンプライアンスのために望ましい場合がある。特に、注射回数を減らすことは有益であり得、特に、眼内治療薬の場合など、医師が注射を行う必要がある場合に有用である場合がある。できるだけ少ない注射で経時的に薬物を効果的に送達するための徐放製剤に対する医学的必要性は満たされていない。他の疾患、例えば、がん及び炎症疾患の場合、安定かつ効果的なタンパク質治療薬を含有する移植可能な徐放製剤の改善が必要である。

抗体、受容体Ｆｃ融合タンパク質、トラップタンパク質及びミニトラップタンパク質などの治療用巨大分子は、分子を患者への投与に適したものとするだけでなく、保管中及び投与部位でそれらの安定性を維持するように製剤化されなければならない。例えば、水溶液中の治療用タンパク質（例えば、抗体及び融合タンパク質）は、溶液が適切に製剤化されていない限り、分解、凝集及び／又は望ましくない化学修飾を受けやすい。液体製剤中のタンパク質治療薬の安定性は、製剤中で使用される賦形剤の種類、並びにそれら賦形剤の量及び互いに対するそれら賦形剤の割合だけでなく、可溶性タンパク質の濃度にも依存する。治療用タンパク質製剤を調製する際には、安定性以外の考慮事項も考慮する必要がある。そのような追加の考慮事項の例としては、溶液の粘度、及び所与の製剤によって調節され得る治療用タンパク質の濃度が挙げられる。徐放のための治療用タンパク質を製剤化する場合、経時に保管及び生理学的温度で安定した状態を維持し、適切な濃度の抗体を含有し、かつ製剤が便利に患者に投与されることを可能にする他の特性を有する製剤に到達するために細心の注意を払わなければならない。

いくつかの徐放製剤は、内部相分離、界面重合、多重エマルジョンの形成、高分子電解質の層ごとの吸着、及び軟質テンプレート技術を含む様々な封入方法を使用して製造される。水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）の多重エマルジョンは、最も一般的な種類の多重エマルジョンであり、水性／親水性コアを水性懸濁液中に直接封入することを可能にする。残念なことに、水性エマルジョンシステムは、生物学的活性剤を徐放製剤内に封入するために使用される場合に特定の問題を有する。例えば、タンパク質の沈殿は、水性有機界面で生じ、それと同時にそれらの免疫反応性が低下する（Ｒａｇｈｕｖａｎｓｈｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ，３（２）：２６９－７６（１９９８））。一部の水性エマルジョンシステムでは、水が有機相内に拡散し、タンパク質を加水分解することができる。加水分解後、タンパク質液滴が融合し始め、水性環境内へと脱出し、凝集又は沈殿する。硬化後、空隙及び水チャネルは、タンパク質が水性環境内へと脱出すると、微粒子中に出現する。

水の存在が望ましくない場合には、通常の水性エマルジョンの代わりに非水エマルジョンを使用することができる。しかしながら、文献又は従来技術において非水エマルジョンに関する報告はほとんどない。２種類の炭化水素系非水エマルジョンシステムが知られている：（１）コポリマー（例えば、ヘキサン／ジメチルホルムアミド）をブロックすることによって安定化される２つの不混和性有機溶媒、及び（２）既存の界面活性剤を使用して水の代わりに使用される油不混和性極性溶媒（例えば、ホルムアミド、アセトニトリル）。これまで、パーフルオロ化油中水（Ｗ／Ｆ）エマルジョンは、広く研究され、単一細胞又は単一分子生体アッセイのための液滴ベースのマイクロ流体に適用されてきた。これらの研究において、ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥは、フルオロカーボン溶媒中の水滴を安定化させるためのフッ素系界面活性剤（ＦＳ）として使用されてきた。

多くの非混和性溶媒対（通常は１つの極性溶媒と１つの非極性溶媒との対）が利用可能であるが、課題は、ポリマーマイクロスフェアの合成に好適な対を見つけることである。典型的な生分解性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（オルトエステル）（ＰＯＥ）は、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルなどの中極性の溶媒にほとんど可溶性である。これにより、連続相の選択が制限される。加えて、プロセスとの適合性、毒性、安全性、及び残留溶媒は、それらの有機溶媒を使用することの懸念事項であり、医薬品として使用するためには考慮する必要がある。

フルオロカーボンは、以下の一般的な特性のために、非水エマルジョンシステムにおける連続相として使用することができる。
１．フルオロカーボンは、「疎水性」でも「親水性」でもなく、ほとんどの有機（炭化水素）溶媒と混和性がなく、炭化水素液滴エマルジョンのための連続相として理想的である。
２．フルオロカーボンは、タンパク質及び他の親水性分子、炭化水素系ポリマー、及び有機賦形剤の非溶媒であり、すなわち、これらの種類の分子は、フルオロカーボンに可溶性ではない。
３．フルオロカーボンは、粘度が低い。
４．フルオロカーボンは、化学的に不活性であり、一般的に使用される炭化水素溶媒と比較して比較的毒性又は腐食性が低い場合がある。
５．フルオロカーボンは、揮発性でリサイクル可能である。

以前の文献では、フルオロカーボンを含有する様々な種類のエマルジョンシステムが、マイクロ流体力学法によって作製されていることが報告されており、例えば、フルオロカーボン中水（Ｗ／Ｆ）、水中フルオロカーボン中水（Ｗ／Ｆ／Ｗ）二重エマルジョン、水／フルオロカーボン／油／水（Ｗ／Ｆ／Ｏ／Ｗ）三重エマルジョン、フルオロカーボン／炭化水素／水（Ｆ／Ｈ／Ｗ）二重エマルジョン、及び炭化水素／フルオロカーボン／水（Ｈ／Ｆ／Ｗ）二重エマルジョンである。これらのエマルジョンのうちのいくつかは、ポリマーマイクロスフェアの合成に使用されている。しかしながら、それらの全ては、分散相又は連続相として水を使用する水性ベースのエマルジョンシステムである。

使用されるエマルジョンの種類にかかわらず、マイクロスフェア又は微粒子のサイズ分布は通常広く、広範なプロセス最適化及び制御戦略なしに、サイズを容易に制御して標的を満たすことはできない。したがって、広範なプロセス最適化及び制御戦略なしに、マイクロスフェアサイズ又は微粒子サイズを制御して、標的を満たす新たな方法を開発する必要性が依然として残っている。

したがって、本発明の目的は、薬物製剤を製造するための非水膜エマルジョンシステム及び方法、並びにそれらの使用方法を提供することである。

本発明の別の目的は、改善されたタンパク質の安定性、及び安定した徐放、及び制御されたサイズ分布を有する徐放製剤を提供することである。

ポリマー及びポリマーコーティングされた微粒子を製造するための非水膜エマルジョン方法が提供される。いくつかの実施形態は、微粉化タンパク質粉末及びポリマーを炭化水素溶媒中で合わせて第１の非水溶液を形成し、第１の非水溶液を撹拌して懸濁液を形成し、懸濁液を分散セル内に供給することによって、持続放出又は制御放出微粒子を製造する方法であって、懸濁液を、フルオロカーボン液体及びフッ素系界面活性剤を含む連続相の接流の下で、当該連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する（膜乳化）、方法を提供する。本方法は、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンにヒドロフルオロエステルを添加するステップと、炭化水素相から炭化水素溶媒を除去して、硬化微粒子を提供するステップと、を更に含む。いくつかの実施形態では、炭化水素の除去を支援するために、ヒドロフルオロエステルとフルオロカーボンとの混合物をエマルジョンに添加する。いくつかの実施形態では、本方法は、続いて、追加の純粋なハイドロフルオロエステルをエマルジョンに添加することを含む。本方法は、フルオロカーボン液体を除去して、微粒子を単離することを更に含み、微粒子は、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む。本方法は、任意選択的に、フルオロカーボン液体中の微粒子を洗浄して残留フッ素系界面活性剤を除去することと、フルオロカーボン液体を除去することと、例えば、真空濾過によって微粒子を採取することと、を含む。いくつかの実施形態では、真空濾過は、ポリエーテルスルホン膜フィルターを使用する。いくつかの実施形態では、タンパク質粉末は、抗体又はその抗原結合断片、融合タンパク質、又は組換えタンパク質から製造される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質、例えばアフリベルセプトである。いくつかの実施形態では、エマルジョンは、バルク乳化によって形成される。

いくつかの実施形態では、炭化水素溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、フルオロカーボン溶液は、１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミンを含む。

いくつかの実施形態では、フッ素系界面活性剤は、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルである。いくつかの実施形態は、０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤、典型的には約０．５％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を有する。

いくつかの実施形態では、ヒドロフルオロエステルは、２－（トリフルオロメチル）－３－エトキシドデカフルオロヘキサンである。

いくつかの実施形態では、タンパク質粉末対ポリマー比は、０％～３０％である。

いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ステンレス鋼膜であり、任意選択的に、親フッ素性コーティングされたステンレス鋼膜である。

フルオロカーボン及び炭化水素液体は、周囲大気圧下又は真空下でフルオロカーボン及び炭化水素液体を蒸発させることによって除去することができる。いくつかの実施形態では、フルオロカーボン液体は、ヒドロフルオロエーテル（ＨＦＥ）を含有する。いくつかの実施形態では、ＨＦＥを、非水エマルジョンに添加して、炭化水素をフルオロカーボン液体中に急速に抽出して、マイクロスフェア硬化を加速する。いくつかの実施形態では、タンパク質粉末は、微粉化タンパク質粉末である。いくつかの実施形態では、微粒子を洗浄して、微粒子上に残留しているあらゆる残留炭化水素溶媒、フルオロカーボン液体、フッ素系界面活性剤、又はこれらの組み合わせを除去する。例示的なフルオロカーボン液体としては、ペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物が挙げられ、１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミンが挙げられるが、これに限定されない。例示的な炭化水素溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なフッ素系界面活性剤は、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ）トリブロックコポリマーである。例示的な生体侵食性ポリマーは、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、融合タンパク質、又は組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、噴霧乾燥ＶＥＧＦトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、微粒子は、１．０～１００μｍ、１．０～２００μｍ、又は３０～６０μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、開示される非水エマルジョン方法によって形成される微粒子は、流動性微粒子組成物である。開示される流動性微粒子組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ｐＨ緩衝生理食塩水中に懸濁するか、又は中鎖トリグリセリドなどの油性ビヒクル中に懸濁することができる。流動性微粒子組成物は、例えば、２７Ｇ針を有するシリンジを使用して、非経口的に投与することができる。いくつかの実施形態では、マイクロスフェア又は微粒子サイズ分布は１０ＣＶ％未満である。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアサイズ分布は１０～２０ＣＶ％である。

別の実施形態は、炭化水素溶液中で１．０～３０％ｗ／ｗの全固体噴霧乾燥タンパク質を合わせて、第１の非水溶液を形成することと、第１の非水溶液を撹拌して、懸濁液を形成することと、懸濁液を分散セルに供給することであって、当該懸濁液を、フルオロカーボン液体及び０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含む連続相の接流の下で、当該連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する、供給することと、炭化水素溶媒を除去して、硬化ポリマー又はポリマーコーティングされたマイクロスフェアを提供することと、フルオロカーボン液体を除去して、微粒子を単離することであって、微粒子が、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む、除去することと、によって、ポリマー又はポリマーコーティングされた微粒子を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、懸濁液の供給は、０．１～１．０ｍｌ／分の速度である。いくつかの実施形態では、本方法は、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンのフルオロカーボン液体中に共溶媒としてヒドロフルオロエステルを添加して、炭化水素溶媒を分散相から連続相に抽出し、微粒子の硬化を加速するのを支援するステップを更に含む。

いくつかの実施形態では、膜エマルジョンによって製造される微粒子は、微粒子のポリマー表面又は内部マトリックスにおいて、ほとんど又はまったく細孔又はチャネルを有しない。

更に別の実施形態は、本明細書に開示される非水膜エマルジョン方法を使用して製造された、ポリマーコーティングされた微粒子を含有する薬学的組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、微粒子のサイズは、製剤組成及びプロセスパラメータを変化させることによって、所望の直径又はサイズに調整することができる。

図１Ａは、Ｈ／Ｆベースのバルクエマルジョンを介したブランクＰＯＥマイクロスフェア製造のプロセスを示す図である（スキーム１）。 図１Ｂは、ＦＣ－４０の化学構造を示す。 図１Ｃは、ペルフルオロポリエーテル／ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマーであるフッ素系界面活性剤ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ（Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１）の化学構造を示す。Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１は、例えば、ＦＣ－４０中５％（ｗ／ｗ）として市販されている。 図２Ａは、Ｈ／Ｆエマルジョンを介して形成されたブランクＰＯＥマイクロスフェアの顕微鏡写真である。図２Ｂは、低ＦＳ含有量で見出されるＰＯＥ凝集を示す顕微鏡写真である。 図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、低、中、及び高均質化速度を有するＨ／Ｆエマルジョンを介して形成されるブランクＰＯＥマイクロスフェアの顕微鏡写真である。 図４（スキーム２）は、Ｓ／Ｈ／Ｆベースのバルクエマルジョンを介したＰＯＥマイクロスフェアにおけるＳＤＰ封入のプロセスを示す図である。 図５（スキーム３）は、タンパク質ＳＤＰの封入のためのフルオロカーボン中炭化水素エマルジョンシステムを示す図である。 図６Ａ及び図６Ｂは、ＦＣ－４０中に分散したＰＯＥ及び蛍光標識噴霧乾燥タンパク質（Ｆ－ＳＤＰ）を含有する酢酸エチル液滴の蛍光画像である。Ｆ－ＳＤＰは、液滴内で元のサイズ及び形態を保持していることに注意されたい。緑色の蛍光画像は、グレースケールで表される。 図７Ａは、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入マイクロスフェアの明視野顕微鏡写真である。図７Ｂは、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入マイクロスフェアの蛍光画像である（バー＝２０μｍ）。図７Ｃは、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入マイクロスフェアの蛍光画像である（バー＝１０μｍ）。緑色蛍光画像は、図７Ｂ及び７Ｃにおいてグレースケールで表される。 図８Ａ～図８Ｄは、水性環境に配置されたＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入ＰＯＥマイクロスフェアの蛍光画像である。Ｆ－ＳＤＰは、液滴内で元のサイズ及び形態を保持していることに注意されたい。緑色の蛍光画像は、グレースケールで表される。 図９は、非水エマルジョン方法におけるジクロロメタン（ＤＣＭ）又は酢酸エチル（ＥｔＡｃ）を使用して製造される微粒子の体積密度（％）対サイズ（μｍ）の線グラフである。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ１０％及び３０％ｗ／ｗのＶＥＧＦトラップＳＤＰが充填された微粒子の顕微鏡写真である。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれ１０％及び３０％ｗ／ｗのＳＤＰが充填されたＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入ＰＯＥマイクロスフェアの代表的な蛍光画像である。Ｆ－ＳＤＰは、液滴内で元のサイズ及び形態を保持していることに注意されたい。緑色の蛍光画像は、グレースケールで表される。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、５％ｗ／ｗのＳＤＰ及び１０％ｗ／ｗのＳＤＰが充填された微粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、Ｄｖ５０が２．１８μｍ及び５．６３μｍである噴霧乾燥タンパク質のＳＥＭ画像である。 図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃは、ＰＬＡマイクロスフェア中に封入されたＶＥＧＦ－トラップＦ－ＳＤＰの明視野、蛍光、及びＳＥＭ画像である。緑色蛍光画像は、図１４Ｂにおいてグレースケールで表される。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入されたＶＥＧＦ－トラップＦ－ＳＤＰの明視野及び蛍光画像である。緑色蛍光画像は、図１５Ｂにおいてグレースケールで表される。 図１６は、多孔質膜を介して炭化水素連続相に懸濁液が注入されたときのＳＤＰ懸濁液エマルジョン液滴の形成を示す図である。 図１７は、膜エマルジョンを使用して微粒子を製造するための例示的な方法の図である。微粒子生成物のフロキュレーション及び凝集を防止するステップを示す、星でマークされたステップ。 図１８は、水性及び非水エマルジョン方法を使用して製造されたマイクロスフェアのＳＥＭ画像を含み、マイクロスフェアが、非水方法を使用して滑らかな表面を有する一方で、水性方法を使用してマイクロスフェアが細孔及び水チャネルを有することを示す。 図１９は、水性及び非水エマルジョン方法を使用して製造されたタンパク質封入マイクロスフェアのＳＥＭ画像を含む。 図１９は、水性及び非水エマルジョン方法を使用して製造されたタンパク質封入マイクロスフェアのＳＥＭ画像を含む。 図２０は、水性及び非水エマルジョン方法を使用して製造されたタンパク質封入マイクロスフェアの蛍光顕微鏡画像を含み、非水エマルジョン方法を使用して元のレーズン形状を保持しながら、水性エマルジョン方法を使用してＳＤＰが再構成され、より大きな液滴に融合されることを示す。緑色の蛍光画像は、グレースケールで表される。

Ｉ．定義
本明細書に記載の組成物及び方法、並びに記載される実験条件は変化し得るので、本開示は、これらに限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。なお、本明細書に記載されるものと類似又は同等のあらゆる組成物、方法、及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができる。言及されている全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本特許請求の範囲に記載の発明を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び同様の指示対象の使用は、本明細書で別段の指示がなされるか、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するように解釈されるべきである。

本明細書に示される全ての数値的限界及び範囲は、当該範囲又は限界の数値の周辺又はその間の全ての数値又は値を含む。本明細書に記載の範囲及び限界は、範囲又は限界によって定義され、包含される全ての整数、小数、及び分数値を明示的に表し、記載する。したがって、本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各別々の値を個別に参照する簡略法としての役割を果たすことを意図しているにすぎず、各別々の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

用語「約」の使用は、記載された値を約＋／－１０％の範囲で上回る又は下回る値を表すように意図され、他の実施形態では、値は、記載された値を約＋／－５％の範囲で上回る又は下回る値の範囲であってもよく、他の実施形態では、値は、記載された値を約＋／－２％の範囲で上回る又は下回る値の範囲であってもよく、他の実施形態では、値は、記載された値を約＋／－１％の範囲で上回る又は下回る値の範囲であってもよい。前述の範囲は、文脈によって明確にされることが意図され、更なる限定は示唆されない。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において別段示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、請求項に別段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる文言も、請求項に記載されていない任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示していると解釈されるべきではない。

「配合すること」は、圧縮せん断力及びキャビテーションを含む配合力を提供する。技術及び方法としては、均質化、ボルテックス、超音波処理、かき混ぜ、チャーニング、ウィスキング、振盪、乳化、撹拌及び／又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。配合力の適用は、一定又は定期的であり得る。

「マイクロスフェア」及び「微粒子」という用語は、互換的に使用される。

「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに接合される２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質は、ポリペプチド及びペプチドを含み、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰ－リボシル化などの修飾も含み得る。タンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含む、科学的又は商業的に関心のあるものである可能性があり、タンパク質としては、とりわけ、酵素、リガンド、受容体、抗体、及びキメラ又は融合タンパク質が挙げられる。タンパク質は、周知の細胞培養方法を使用して様々な種類の組換え細胞によって製造され、一般に、それがエピソームとして存在してもよいか、又は細胞のゲノムに組み込まれてもよい遺伝子操作技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、又はコドン最適化配列、イントロンレス配列など）によって細胞に導入される。

「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ又はサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、米国特許第８，５８６，７１３号（参照により本出願に組み込まれる）に記載されている。

「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質（そのうちの１つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、それ以外の場合、自然界では一緒に見られない）の一部又は全部を含む。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製については、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に連結した受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含み、これは、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域、続いて免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ－１トラップ又はＶＥＧＦトラップなどのトラップである。

組換え的に製造される酵素及びミニトラップなどのＦｃ部分を欠くタンパク質も、本発明に従って作製することができる。ミニトラップは、Ｆｃ部分の代わりに多量体化成分（ＭＣ）を使用するトラップタンパク質であり、米国特許第７，２７９，１５９号及び第７，０８７，４１１号に開示されている。

「微粉化タンパク質粒子」又は「タンパク質粒子」は、低、非常に低、又はゼロに近い量の水（例えば、３重量％未満の水）を有するタンパク質の複数の分子を含有する粒子を意味する。本明細書で使用される場合、微粉化タンパク質粒子は、概して球形であり、２ミクロン～約３５ミクロンの範囲のＥＣＤを有する。微粉化タンパク質粒子は、任意の特定のタンパク質実体に限定されず、治療用タンパク質の調製及び送達に適している。一般的な治療用タンパク質としては、とりわけ、可溶性受容体断片、抗体（ＩｇＧを含む）及び抗体の誘導体又は断片、Ｆｃ融合タンパク質を含む他のＦｃ含有タンパク質、並びにＶＥＧＦトラップなどのトラップ型タンパク質（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６９２－９９（２００９））を含む受容体－Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。

ＩＩ．炭化水素－フルオロカーボン膜エマルジョンを用いた微粒子製剤の製造
無水又は非水膜エマルジョンシステムを使用して薬学的組成物を製剤化するためのシステム及び方法が提供される。開示された無水膜エマルジョン方法は、親水性薬物分子を封入するときに、既存の水性エマルジョンシステムのいくつかの問題を克服する。例えば、本明細書に提供される、開示される無水エマルジョンシステムと既存の水性エマルジョンシステムとの比較研究は、水性エマルジョンシステムを使用して製造される製剤が、製造中に、エマルジョン液滴から水性連続相に薬物、例えば、タンパク質薬物を漏出させることを示す。エマルジョン液滴からの薬物のこの漏出により、低い封入有効性が得られる。本明細書に記載の開示される非水ベースの膜エマルジョン方法は、水性エマルジョンシステムと比較して封入有効性が増加した、タンパク質などの親水性薬物を含むがこれに限定されない薬物分子を封入し、元のタンパク質粒子構造、又はこれらの組み合わせを保持する。開示される無水膜エマルジョンシステム及び方法は、バルク方法（例えば、撹拌、均質化、超音波処理）及び他の従来の方法によって封入された薬物製剤を製造することができる。システム及び方法はまた、幅広いポリマー材料、固体ペイロード、及び乳化方法に適用することができる。以下の概要は、異なるエマルジョンテイクの比較の結果を示し、これらの結果は、非水エマルジョンシステムが水性エマルジョンシステムと比較して微粒子封入における有意な改善であることを実証している。

Ａ．フルオロカーボン中炭化水素中固体（Ｓ／Ｈ／Ｆ）膜エマルジョン
膜乳化（ＭＥ）は、一般に、良好なサイズ制御及び狭いサイズ分布を可能にする粒子の高度に制御された製造のための比較的新しい技術である（Ｇ．Ｔ．Ｖｌａｄｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａｄｖ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１１３（１）：１－２０，（２００５））。これまでに、シラス多孔質ガラス（Ｓｈｉｒａｓｕ Ｐｏｒｏｕｓ Ｇｌａｓｓ、ＳＰＧ）、酢酸セルロース、ポリマー、陽極酸化アルミナ（ａｎｏｄｉｃ ｐｏｒｏｕｓ ａｌｕｍｉｎａ）、及びシリコンマイクロチャネルなど、ＭＥ用に多くの種類の膜が開発されてきた。開示されたＭＥ法については、レーザードリルで開けた細孔を有するステンレス鋼膜が良好に機能し、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｅｄｃａｒ、ＵＫ）による市販の装置は、実験室研究プロセスを可能にし、またＧＭＰ製造へのスケールアップも可能にした。他の実施形態では、膜は、シラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）、酢酸セルロース、ポリマー、陽極酸化アルミナ、及びシリコンマイクロチャネルからなる群から選択される。ステンレス鋼の膜の厳しく制御された膜の細孔のサイズにより、限界を下回る全てのＳＤＰ粒子が膜を通過するようになる。曲がりくねった経路を有しない直管状チャネルは、ＳＤＰによるチャネル遮断の傾向を低減する。いくつかの実施形態では、膜は、フルオロカーボン中炭化水素（Ｈ／Ｆ）エマルジョンの製造との良好な適合性を提供する親フッ素性コーティングを有する。更に、ステンレス膜は、堅牢で、清掃が容易で、滅菌可能である。いくつかの実施形態では、細孔の直径は、３μｍ～３００μｍである。いくつかの実施形態では、細孔の直径は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０μｍである。

いくつかの実施形態は、微粉化されたタンパク質粉末及びポリマーを炭化水素溶媒中で合わせて第１の非水溶液を形成し、第１の非水溶液を撹拌して懸濁液を形成し、懸濁液を分散ポンプ内に供給することによって、持続放出又は制御放出微粒子を製造する方法であって、懸濁液を、フルオロカーボン液体及びフッ素系界面活性剤を含む連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、懸濁液の供給は、０．１～１．０ｍｌ／分の速度である。本方法は、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンにヒドロフルオロエステルを添加するステップと、炭化水素溶媒を除去して、硬化微粒子を提供するステップと、を更に含む。いくつかの実施形態では、ヒドロフルオロエステルとフルオロカーボンとの混合物をエマルジョンに添加する。いくつかの実施形態では、本方法は、追加の純粋なハイドロフルオロエステルをエマルジョンに添加することを含む。本方法は、フルオロカーボン液体を除去して、微粒子を単離することを更に含み、当該微粒子は、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む。本方法は、任意選択的に、フルオロカーボン液体中の微粒子を洗浄して残留フッ素系界面活性剤を除去することと、フルオロカーボン液体を除去することと、例えば、真空濾過によって微粒子を採取することと、を含む。いくつかの実施形態では、真空濾過は、ポリエーテルスルホン膜フィルターを使用する。いくつかの実施形態では、タンパク質粉末は、抗体又はその抗原結合断片、融合タンパク質、又は組換えタンパク質から製造される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質、例えばアフリベルセプトである。いくつかの実施形態では、エマルジョンは、バルクエマルジョンによって形成される。いくつかの実施形態では、微粒子は、２４時間後に１５％未満のバースト、続いて薬物の直線的な持続放出を有する。

いくつかの実施形態では、タンパク質粉末対ポリマー比は、０％～３０％である。

いくつかの実施形態では、炭化水素溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、フルオロカーボン溶液は、１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミンを含む。

いくつかの実施形態では、フッ素系界面活性剤は、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルである。

いくつかの実施形態では、ヒドロフルオロエステルは、２－（トリフルオロメチル）－３－エトキシドデカフルオロヘキサンである。

いくつかの実施形態では、多孔質膜は、ステンレス鋼膜であり、任意選択的に、親フッ素性コーティングされたステンレス鋼膜である。

フルオロカーボン及び炭化水素液体は、周囲大気圧下又は真空下でフルオロカーボン及び炭化水素液体を蒸発させることによって除去することができる。いくつかの実施形態では、フルオロカーボン液体は、ヒドロフルオロエーテル（ＨＦＥ）を含有する。いくつかの実施形態では、ＨＦＥを、非水エマルジョンに添加して、炭化水素をフルオロカーボン液体中に急速に抽出して、マイクロスフェア硬化を加速する。いくつかの実施形態では、タンパク質粉末は、微粉化タンパク質粉末である。いくつかの実施形態では、微粒子を洗浄して、微粒子上に残留しているあらゆる残留炭化水素溶媒、フルオロカーボン液体、フッ素系界面活性剤、又はこれらの組み合わせを除去する。例示的なフルオロカーボン液体としては、ペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物が挙げられ、１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミンが挙げられるが、限定されない。例示的な炭化水素溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なフッ素系界面活性剤は、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ）トリブロックコポリマーである。例示的な生体侵食性ポリマーは、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、融合タンパク質、又は組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、噴霧乾燥ＶＥＧＦトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、微粒子は、１．０～１００μｍ、１．０～２００μｍ、又は３０～６０μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、開示される非水エマルジョン方法によって形成される微粒子は、流動性微粒子組成物である。開示される流動性微粒子組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ｐＨ緩衝生理食塩水中に懸濁するか、又は中鎖トリグリセリドなどの油性ビヒクル中に懸濁することができる。流動性微粒子組成物は、例えば、２７Ｇ針を有するシリンジを使用して、非経口的に投与することができる。いくつかの実施形態では、マイクロスフェア又は微粒子サイズ分布は、１０ＣＶ％％未満である。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアサイズ分布は、１０～２０ＣＶ％である。

別の実施形態は、炭化水素溶液中で１～３０％ｗ／ｗの全固体噴霧乾燥タンパク質を合わせて、第１の非水溶液を形成することと、第１の非水溶液を撹拌して、懸濁液を形成することと、懸濁液を分散ポンプに供給することであって、当該懸濁液を、フルオロカーボン液体及び０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含む連続相の接流の下で、当該連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する、供給することと、炭化水素溶媒を除去して、硬化ポリマー又はポリマーコーティングされたマイクロスフェアを提供することと、フルオロカーボン液体を除去して、微粒子を単離することであって、微粒子が、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む、除去することと、によって、ポリマー又はポリマーコーティングされた微粒子を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、炭化水素溶媒の除去を支援するために炭化水素溶媒を除去する前に、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンのフルオロカーボン液体にヒドロフルオロエステルを添加するステップを更に含む。

いくつかの実施形態では、膜エマルジョンによって製造される微粒子は、微粒子のポリマー表面又は内部マトリックスにおいて、ほとんど又はまったく細孔又はチャネルを有しない。

更に別の実施形態は、本明細書に開示される非水膜エマルジョン方法を使用して製造された、ポリマーコーティングされた微粒子を含有する薬学的組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、微粒子のサイズは、製剤組成及びプロセスパラメータを変化させることによって、所望の直径又はサイズに調整することができる。

炭化水素及びタンパク質溶液は、圧縮せん断力及びキャビテーションなどの配合力を加えることによって形成され得る。技術としては、均質化、ボルテックス、超音波処理、かき混ぜ、チャーニング、ウィスキング、振盪、乳化、撹拌及び／又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本方法は、エマルジョンをかき混ぜながら炭化水素溶媒及びフルオロカーボン液体を除去するステップを更に含む。炭化水素及びフルオロカーボン液体は、任意選択的に真空下での蒸発によって除去され得る。他の実施形態では、微粒子は、濾過によって採取され得る。炭化水素及びフルオロカーボン液体を除去することにより微粒子が硬化され、次いで、それらの微粒子を採取することができる。いくつかの実施形態では、ＨＦＥをフルオロカーボンに添加して、分散相からフルオロカーボン連続相に炭化水素を抽出して、より速い硬化プロセスを得ることを支援することができる。ＨＦＥは、フルオロカーボン及び炭化水素の両方と混和性であり、したがって、フルオロカーボン相における炭化水素の溶解度を高めるための共溶媒として機能することができる。非水エマルジョン方法によって製造される持続放出微粒子は、生分解性又は生体侵食性ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、微粒子は、単一コアシェル構造を有する。他の実施形態では、微粒子は、ポリマー内に分散された複数のコアを有する。更に他の実施形態では、微粒子の集団は、ポリマー表層によって封入された単一コア構造を有する微粒子と、ポリマー表層内にマルチコア構造を有する微粒子と、を含む。フルオロカーボン液体は、ＦＣ－４０を含むがこれらに限定されないペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物であり得、炭化水素溶液は、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、及びジクロロメタン又はこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、フッ素系界面活性剤は、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１として市販されているペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルである。いくつかの実施形態では、生体侵食性ポリマーは、ＰＯＥである。他の実施形態では、ポリマーは、ポリ乳酸及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）からなる群から選択される。一般に、タンパク質は、抗体若しくはその抗原結合断片、融合タンパク質、組換えタンパク質、又はその断片若しくは切断バージョンである。典型的には、タンパク質は、例えば、噴霧乾燥、エレクトロスプレー乾燥、可逆沈殿、噴霧凍結、マイクロテンプレート、又はこれらの組み合わせによって微粉化される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質又はその切断形態である。開示される方法で使用され得る他のタンパク質を以下に記載する。開示される方法によって製造される微粒子は、細孔又はチャネルをほとんど欠いているポリマー表層を有する。ポリマー表層は、穿孔されていない。いくつかの実施形態では、微粒子は、１～２００μｍの直径を有する。

１．炭化水素溶媒
いくつかの実施形態では、炭化水素溶媒（炭化水素液体とも呼ばれる）は、ポリマー材料、例えば、生分解性又は生体侵食性ポリマーが炭化水素に可溶性であるように選択される。いくつかの実施形態では、炭化水素溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、炭化水素溶媒は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、エタノール、メタノール、ペンタン、プロパノール、ヘキサン、又はこれらの組み合わせを含有することができる。

２．フッ素系液体
例示的なフッ素系液体は、Ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ－４０（平均ＭＷ＝６５０ｇ／ｍｏｌ）である１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミン（図１Ｂ）、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ－７０（平均ＭＷ＝８２１ｇ／ｍｏｌ）、又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないフルオロカーボン液体である。いくつかの実施形態では、フルオロカーボン液体は、ヒドロフルオロエーテル（ＨＦＥ）であるか、又はそれを含有する。例示的なＨＦＥとしては、ＮＯＶＥＣ（商標）７０００（１－メトキシヘプタフルオロプロパン）、ＮＯＶＥＣ（商標）７１００（メトキシ－ノナフルオロブタン）、ＮＯＶＥＣ（商標）７２００（エトキシ－ノナフルオロブタン）、ＮＯＶＥＣ（商標）７５００（２－（トリフルオロメチル）－３－エトキシドデカフルオロヘキサンが挙げられるが、これらに限定されない。更に他の実施形態では、フルオロカーボン液体は、ＦＣ－４０、ＦＣ－７０、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００、Ｎｏｖｅｃ（商標）７１００、Ｎｏｖｅｃ（商標）７０００、又はこれらの組み合わせを含有する。ある特定の実施形態では、第２の溶液は、フッ素系液体に加えて、フッ素系界面活性剤（ＦＳ）を含有する。例示的なＦＳは、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１として市販されているペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ）トリブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、フルオロカーボン液体又は第２の溶液は、ＦＣ－４０及びＰｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１を含有する。

いくつかの実施形態では、ＦＳは、
式中、ｎ：約３７、ｘ＋ｚ：約６．０、ｙ：約１２．５、又はｎ＝３．７、ｘ＋ｚ：約３．６、ｙ：約９．０である（Ｌｅｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．，７：１４（３）：５０９－１３（２０１４））。

いくつかの実施形態では、ＨＦＥは、以下の化学構造を有する：

プロセスでの使用に好適な他のＨＦＥは、全ての水素原子がフッ素置換を伴わずに炭素上に存在し、エーテル酸素、すなわちＲｆＯＲｈによってフッ素化炭素から分離される分子のクラスである。ＨＦＥは、直鎖状、分岐状、若しくは環状、又はこれらの組み合わせ（アルキル環状脂肪族など）であり得、好ましくはエチレン系不飽和を含まず、合計で約４～約２０個の炭素原子を有する分子構造を有する。かかるＨＦＥは、本質的に純粋な化合物として、又は混合物として、知られており、容易に入手可能である。ＨＦＥの親油性及び親フッ素性のために、それらは、フルオロカーボン及び炭化水素の両方と混和性である。炭化水素／フルオロカーボンエマルジョンに添加すると、炭化水素をフルオロカーボン相に抽出し、硬化プロセスを加速するための共溶媒として作用することができる。

いくつかの実施形態では、炭化水素溶媒、フルオロカーボン、又はその両方は、任意選択的にエマルジョンをかき混ぜている間に、任意選択的に真空下で蒸発によって除去される。いくつかの実施形態では、微粒子は、濾過することによって、任意選択的に真空下で濾過することによって、採取される。

フルオロカーボン相におけるＨＦＥのパーセンテージは、０～２０％ｖ／ｖであり得るが、一方、ＨＦＥパーセンテージを増加させると、炭化水素抽出率が増加する。しかしながら、ＨＦＥのパーセンテージは、マイクロスフェアのサイズ及び形態を制御することがより困難になる可能性があるため、高すぎてはならない。

３．侵食性又は生分解性ポリマー
いくつかの実施形態では、ポリマーは、生分解性又は生体侵食性ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、分岐又は直鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ－ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ－エチレンオキシドフマレート、ポリエチレングリコール１０００にエステル化されたＰＬＧＡ－アルファ－トコフェリルスクシネート（ＰＬＧＡ－ＴＧＰＳ）、ポリ無水物ポリ［１，６－ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン］（ｐＣＰＨ）、ポリ（ヒドロキシ酪酸－コヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢ－ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール－ポリ（乳酸）コポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（エチル）シアノアクリレート（ＰＥＣ）、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ））、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－β－Ｒ－リンゴ酸、リン脂質－コレステロールポリマー、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＣ／ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）／コレステロール、多糖類、セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、アルギネート、デキストラン及びデキストランヒドロゲルポリマー、アミロース、イヌリン、ペクチン及びグアーガム、キトサン、キチン、ヘパリン、ヒアルロン酸、シクロデキストリン（ＣＤ）ベースのポリロタキサン及びポリ擬ロタキサン、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、ポリルシン、ロイシン－グルタメートコポリマー、ポリブチレンスクシネート、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブロイン、ポリオルトエステル、ポリオルトエステル－ポリアミジンコポリマー、ポリオルトエステル－ジアミンコポリマー、潜在酸を組み込んだポリオルトエステル、ポリ（エチレングリコール）／ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマー、並びにこれらの組み合わせ及びコポリマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）又はその誘導体若しくはコポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＰＬＧＡ又はその誘導体若しくはコポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、エチルセルロース又はその誘導体若しくはコポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリオルトエステル又はその誘導体若しくはコポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーはポリエステルアミドである。

本明細書で使用される場合、「ポリマー」という用語は、共有結合化学結合によって接続された繰り返しモノマーを含む巨大分子を指す。ポリマーは、生体適合性であり、生分解性侵食性である。生体適合性及び生分解性ポリマーは、天然又は合成であり得る。天然ポリマーとしては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、例えば、天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブロイン、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、ポリリジン、ロイシン－グルタメートコポリマー、並びに多糖類、例えば、セルロースアルギネート、デキストラン及びデキストランヒドロゲルポリマー、アミロース、イヌリン、ペクチン及びグアーガム、キトサン、キチン、ヘパリン、及びヒアルロン酸が挙げられる。合成の生体適合性又は生分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ－ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ－エチレンオキサイドフマレート、ポリエチレングリコール１０００にエステル化されたＰＬＧＡ－アルファ－トコフェリルスクシネート（ＰＬＧＡ－ＴＧＰＳ）、ポリ無水物ポリ［１，６－ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン］（ｐＣＰＨ）、ポリ（ヒドロキシ酪酸－コヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢ－ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール－ポリ（乳酸）コポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（エチル）シアノアクリレート（ＰＥＣ）、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ））、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－β－Ｒ－リンゴ酸、リン脂質－コレステロールポリマー、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＣ／ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）／コレステロール、エチルセルロース、シクロデキストリン（ＣＤ）ベースのポリロタキサン及びポリ擬ロタキサン、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリオルトエステル、ポリオルトエステル－ポリアミジンコポリマー、ポリオルトエステル－ジアミンコポリマー、分解速度を制御する（ｔｏｍ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）潜在酸を組み込んだポリオルトエステル、並びに、とりわけポリ（エチレングリコール）／ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーが挙げられる。

エチルセルロース（ＥＣ）は、薬学及び食品科学で使用される、よく知られており、容易に入手可能な生体材料である。これは、一部のグルコースヒドロキシル基をエチルエーテルに置き換えたセルロース誘導体である。マイクロスフェアの製造における生体適合性ポリマーとしてエチルセルロースを使用する方法を記載するＭａｒｔｉｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，２２（５）：５４９－５６１（２００５）及びその中の参考文献を参照されたい。また、エチルセルロース及びエチルセルロースの誘導体を作製する方法の詳細な説明については、米国特許第４，２１０，５２９号（１９８０）及びその中の参考文献も参照されたい。

ポリーｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）はまた、組織工学及び医薬品送達システムにおいて使用される、よく知られている食品医薬品局（ＦＤＡ）承認の生体適合性及び生分解性ポリマーである。ＰＬＧＡは、グリコール酸及び乳酸モノマーを含むポリエステルである。ＰＬＧＡの合成及びＰＬＧＡナノ粒子の製造の説明については、Ａｓｔｅｔｅ ａｎｄ Ｓａｂｌｉｏｖ，Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．，１７（３）：２４７－８９（２００６）及びその中の参考文献を参照されたい。

ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）は、薬物送達デバイスとしてヒトにおける使用についてＦＤＡが承認した別の生体適合性及び生分解性ポリマーである。ＰＣＬは、体内で急速に加水分解して、無毒又は低毒性のヒドロキシカルボン酸を形成する、ε－カプロラクトンのポリエステルである。ＰＣＬの製造の説明については、Ｌａｂｅｔ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３８：３４８４－３５０４（２００９）及びその中の参考文献を参照されたい。送達システムとしてのＰＣＬベースのマイクロスフェア及びナノスフェアの製造及び使用の説明については、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２７８（１）：１－２３（２００４）及びその中の参考文献を参照されたい。

ポリオルトエステル（ＰＯＥ）は、薬物送達用に設計された生体侵食性ポリマーである。一般に、ケテンアセタール、好ましくは環状ジケテンアセタール、例えば、３，９－ジメチレン－２，４，８，１０－テトラオキサスピロ［５．５］－ウンデカンのポリマーであり、これは、グリコール縮合により重合してオルトエステル結合を形成する。ポリオルトエステル合成及び種々な種類の説明は、例えば、米国特許第４，３０４，７６７号に見出すことができる。ポリオルトエステルは、例えば、ヘキサントリオールをデカントリオールに置き換えるなど、様々な疎水性ジオール及びポリオールを入れ替えることによって、並びに、例えば、グリコリド、オクタン二酸などの潜在酸を骨格に添加して、ｐＨ感受性を増加させることによって、それらの薬物放出プロファイル及び分解速度を制御するように修飾することができる。ＰＯＥのカスタム形態は、質量損失及び薬物放出を調整するために、ＰＯＥ骨格中にグリコール酸を含むことができる。ポリオルトエステルに対する他の修飾としては、官能性を増加させるためのアミンの組み込みが挙げられる。ポリオルトエステルの形成、説明、及び使用は、米国特許第５，９６８，５４３号、米国特許第４，７６４，３６４号、Ｈｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，５（５）：１６２５－３２（２００４）、及びＨｅｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７：２０５３－６２（２００５）に記載されている。

４．タンパク質薬物
いくつかの実施形態では、開示される無水エマルジョン方法及びシステムによって製造される微粒子製剤は、薬物を含む。例示的な薬物としては、タンパク質、融合タンパク質及びそれらの断片、抗体及びそれらの抗原結合断片、並びにリガンド結合ドメイン及びタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質（例えば、アフリベルセプトであり、これは、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号及び第７，２７９，１５９号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦトラップタンパク質は、米国特許第７，３９６，６６４号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されるようなＶＥＧＦトラップの切断形態である。

いくつかの実施形態では、微粒子製剤中のタンパク質は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ若しくはテトラボディ、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－ＩＧ）と称される二重特異性四価免疫グロブリンＧ様分子、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラヒンジを含む。更に他の実施形態では、抗体は、キメラＦｃを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許第９，９８７，５００号に記載されるような抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許第９，９３８，３４５号に記載されるような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載されるような抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載の抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されるような抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載されるような抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許第９，７９５，１２１号に記載されるような抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されるような抗ＥＧＦＲ抗体又は第９，４７５，８７５号に記載されるような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質コンバーターゼズブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号又は米国特許第９，５４０，４４９号に記載されるような抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長及び分化因子－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号又は第９，２６０，５１５号に記載されるような抗ミオスタチン抗体としても知られる抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許第９，５８７，０２９号又は第９，６５７，０９９号に記載されるような抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１Ａ１号、米国特許第８，７３５，０９５号又は第８，９４５，５５９号に記載されるような抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号又は第９，１７３，８８０号に記載されるような抗ＩＬ６Ｒ抗体）、ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号又は第９，６３７，５３５号に記載されるような抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号及び第１０，１２５，１８８号並びに米国特許Ａｐｐｌ．公開第２０１９／００３１７４１Ａ１号に記載されるような抗ＲＳＶ抗体）、抗分化クラスター３（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号に記載されるような抗ＣＤ３抗体）、抗分化クラスター２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号及びＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１並びに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されるような抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化クラスター４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載されるような抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許第９，７１８，８７２号に記載されるような抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許第９，７７１，４１４号に記載）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体又は抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号（放棄）並びに米国特許第８，３０９，０８８及び第９，３５３，１７６号に記載されるような抗ＮＧＦ抗体）、並びに抗タンパク質Ｙ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許第９，６５７，１０２号及びＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、及び抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－アット、アド－トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトキシマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、カナキヌマブ、カプロマブ ペンデチド、セルトリズマブ ペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エムタンシネアリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブ チウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－アブダ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラクシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、複合体中のタンパク質は、Ｆｃ部分及び別のドメイン、（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）を含有する組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分に連結された受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含有する受容体Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域、続いてＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンド又は複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩｌ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト、米国特許第６，９２７，０４４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、又はＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１０のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト若しくはｚｉｖ－アフリベルセプト）などのトラップタンパク質である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分に連結した抗体の可変重鎖断片及び可変軽鎖断片などの１つ以上の抗原結合ドメインのうちの１つ以上を含有するＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分を欠くタンパク質、例えば、組換え的に製造される酵素及びミニトラップもまた、本発明に従って作製され得る。ミニトラップは、Ｆｃ部分の代わりに多量体化成分（ＭＣ）を使用するトラップタンパク質であり、米国特許第７，２７９，１５９号及び７，０８７，４１１号に開示されている。

いくつかの実施形態では、初期タンパク質は、乾燥粉末、例えば、微粉化された乾燥粉末の形態である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、噴霧乾燥粉末（ＳＤＰ）である。タンパク質溶液の代わりに噴霧乾燥タンパク質を使用することは、微粒子中のより高いタンパク質充填及び封入プロセス中のより良好なタンパク質安定性という利点を有する。いくつかの実施形態では、乾燥タンパク質分子は、封入プロセス及び保管条件全体の間、固体状態にとどまり、安定剤によって包囲されている。いくつかの実施形態では、封入噴霧乾燥タンパク質は、表面タンパク質の小さな部分のみが界面に曝露されるので、表面相互作用が最小限に抑えられている可能性があるため、高い回収率及び低い凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、封入の前に微粉化される。

Ｂ．微粒子
いくつかの実施形態は、開示される非水膜エマルジョンシステムを使用して製造される薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ポリマー表層及び微粉化タンパク質コアを有する微粒子を含有する。いくつかの実施形態では、微粒子は、概ね球状である。微粒子及びタンパク質コアは、球状に近づくものもあれば、より不規則な形状になるものもあるであろう。したがって、本明細書で使用される場合、用語「直径」は、以下の各々及びいずれかを意味する：（ａ）微粒子若しくはタンパク質コアに外接する球体の直径、（ｂ）微粒子若しくはタンパク質コアの境界内に収まる最大の球体の直径、（ｃ）（ａ）の外接球体と（ｂ）の限定球体との間の任意の測定値（２つの間の平均値を含む）、（ｄ）微粒子若しくはタンパク質コアの最長軸の長さ、（ｅ）微粒子若しくはタンパク質コアの最短軸の長さ、（ｆ）長軸（ｄ）の長さと短軸（ｅ）の長さとの間の任意の測定値（２つの間の平均値を含む）、及び／又は（ｇ）マイクロフロー撮像（ＭＦＩ）、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）によって決定されるような、又は静的光散乱法（ＳＬＳ）、動的散乱法（ＤＬＳ）、若しくはレーザー回折分析などの光散乱法による体積若しくは数平均直径としての、円相当径（「ＥＣＤ」）。直径は、一般にマイクロメートル（μｍ又はミクロン）で表される。直径は、光学測定又は走査電子顕微鏡測定によって決定することができる。

本開示の非水エマルジョン方法によって製造される微粒子は、低、非常に低、又はゼロに近い量の水（例えば、３重量％以下の水）を有するタンパク質の複数の分子である。本明細書で使用される場合、微粉化タンパク質粒子は、２ミクロン～約３５ミクロン、又は２．０～５０μｍ、又は５．０～１５．０μｍ、３０～６０μｍ、又は約１０μｍの範囲のＥＣＤを有する。微粉化タンパク質粒子は、任意の特定のタンパク質実体に限定されず、上記のタンパク質を含む治療用タンパク質の調製及び送達に適している。

例えば、タンパク質粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥及び粉砕、ジェット粉砕、非溶媒中の可逆沈殿、造粒、漸進的沈殿（ＵＳ７，９９８，４７７（２０１１））、超臨界流体沈殿（ＵＳ６，０６３，９１０（２０００））、又は高圧二酸化炭素誘導粒子形成（Ｂｕｓｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１７：１３６０－６６（２０００））によって微粉化されてもよい。本明細書で使用される場合、「噴霧乾燥」という用語は、噴霧乾燥機を使用することによって、スラリー又は懸濁液からミクロンサイズの粒子を含む乾燥粉末を製造する方法を意味する。噴霧乾燥機は、噴霧器又はスプレーノズルを使用して、懸濁液又はスラリーを制御されたドロップサイズのスプレーに分散させる。噴霧乾燥により、１０～５００μｍのドロップサイズを生成することができる。溶媒（水又は有機溶媒）が乾燥すると、タンパク質物質は、ミクロンサイズの粒子に乾燥し、粉末状の物質を形成する。又は、タンパク質－ポリマー懸濁液の場合、乾燥中に、ポリマーは、タンパク質充填の周りのシェルを硬化させた。

いくつかの実施形態では、微粉化タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質である。微粉化ＶＥＧＦトラップタンパク質粒子の形成のための薬学的製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦトラップタンパク質、約１．０～約５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦトラップタンパク質を含有してもよい。

いくつかの実施形態では、開示された非水膜エマルジョンシステムを使用して製造された微粒子は、ポリマー表層内にタンパク質粒子コアを含有し、約２μｍ～約７０μｍ、約５μｍ～約６５μｍ、約１０μｍ～約６０μｍ、約１５μｍ～約５５μｍ、約１０μｍ～約５０μｍ、約１．０μｍ～１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、又は約３０μｍの範囲の直径を有する。サイズ変動は、大部分では、ポリマー表層の厚さを反映するが、タンパク質コアの直径は、ある程度サイズ変動に寄与し得る。

いくつかの実施形態では、開示される非水エマルジョン方法によって形成される微粒子は、流動性微粒子組成物である。開示される流動性微粒子組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ｐＨ緩衝生理食塩水中に懸濁することができる。流動性微粒子組成物は、例えば、２７Ｇ針を有するシリンジなどのシリンジを使用して、非経口的に投与することができる。

いくつかの実施形態では、微粒子は、タンパク質治療薬の逐次継続放出（ｔｉｍｅ－ｒｅｌｅａｓｅ）又は徐放に有用である。いくつかの実施形態では、マイクロスフェア製剤は、硝子体内に、脈絡膜上に、又は皮下に注入される。例えば、ＶＥＧＦトラップ微粒子は、例えば、血管性眼障害の治療のための硝子体又は脈絡膜上腔におけるＶＥＧＦトラップ治療用タンパク質の徐放、又は他の障害を治療するためのＶＥＧＦトラップの徐放のための皮下移植に有用であることが想定される。

本発明の微粒子は、約３７℃の生理学的水性環境において、少なくとも６０、９０、１２０、又は１５０日までの長期間にわたって、比較的一定の速度でタンパク質を放出する。いくつかの実施形態では、微粒子は、２４時間後に１５％未満のバースト、続いて薬物の直線的な持続放出を有する。

いくつかの実施形態は、本明細書に開示される非水膜エマルジョン方法を使用して製造されるマイクロスフェアの組成物を提供し、当該組成物は、１００ｍｇ超の噴霧乾燥タンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、非水膜エマルジョン方法は、収率が９０％超であり、９９％超の純度を有し、かつ１０％超のｗ／ｗの充填及び１０％未満のバーストを有する微粒子を製造する。

実施例１：Ｈ／Ｆベースのバルクエマルジョンによるブランクマイクロスフェアの合成
材料及び方法
油及び水性ベースのエマルジョンシステムは、ポリマー微粒子又はナノ粒子の合成に頻繁に使用され、疎水性ポリマー材料は有機相に溶解され、水性連続相に分散される。しかしながら、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、及び水の存在下で容易に加水分解するポリマーには、ポリ無水物、ポリ乳酸のような短い中間ブロックを有する脂肪族ポリエステル、及びポリ（グルタミン酸）のような特定のポリ（アミノ酸）が含まれるが、従来の水性ベースのエマルジョンシステムは、理想的ではない。以下の実施例は、上述の加水分解性又は水分解性ポリマー微粒子を製造するための開示されるＨ／Ｆエマルジョンシステムの有用性を実証する。いくつかの実施形態では、これらのポリマーは、最初に、極性溶媒（例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン）及び極性の低い溶媒（例えば、ＤＣＭ、クロロホルム）を含む炭化水素溶媒に溶解される。次いで、このポリマー溶液を、連続相、フルオロカーボン液体、例えば、ＦＳを含むＦＣ－４０（例えば、Ｐｉｃｏｓｕｒｆ １）に添加する。エマルジョンは、撹拌、ボルテックス又は他の配合方法によって作製される。エマルジョン液滴は、最終的に、炭化水素溶媒を蒸発又は抽出することによってポリマー球体に硬化される。

特定の実施形態では、スキーム１（図１Ａ）に例示されるように、Ｈ／Ｆバルクエマルジョンを介したブランクＰＯＥマイクロスフェアの合成のために、ＤＣＭ中の約１０％、２０％、３０％及び４０％ｗ／ｖのＰＯＥ（２００μＬ）を、０．５％ｗ／ｗのＦＳ Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１（Ｓｐｈｅｒｅ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）を含有するＦＣ－４０（２ｍＬ）に添加した。乳化は、ボルテックスによって達成した。エマルジョン液滴は、ＦＣ－４０よりも軽く、溶液の上に浮遊した。アリコートを採取し、顕微鏡撮像のためにガラススライド上に落とした。マイクロスフェアを、真空下で３時間かき混ぜながら硬化させた。ＦＣ－４０中の硬化ポリマー球体を、最初に０．２２ミクロンのＰＥＳ膜を通して真空濾過した。ＦＣ－４０はフィルターを通過し、マイクロスフェアは保持された。次いで、マイクロスフェアを追加のＦＣ－４０で洗浄し、真空下で完全に乾燥させた。同じプロセスを用いた別の実施例では、ＤＣＭ中の約３０％ｗ／ｖのＰＯＥを炭化水素相において使用し、ＦＣ４０中の約０．０１％、０．１％、及び０．５％のＦＳをフルオロカーボン相において使用して、ＦＳ濃度の効果を評価した。

結果
ＦＳの存在により、炭化水素とフルオロカーボンとの混合物は、Ｈ／Ｆエマルジョンを形成することができた。一例では、ＤＣＭをＨ／ＦエマルジョンとしてＦＣ－４０（図１ＢのＦＣ－４０の構造を参照されたい）中に分散させ、ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥをＦＳ（図１ＣのＦＳの構造を参照されたい）として使用した。ＦＣ－４０フルオロカーボン相に、増加濃度のＦＳを添加した。試験により、ＤＣＭ液滴の合体（ｃｏａｌｅｓｃｉｎｇ）を防止するために、０．１～５％ｗ／ｗのＦＳが必要であることが示された（図２Ａ）。ＳＦを０．１％ｗ／ｗ未満添加した場合、より広いサイズ分布が観察された。ＳＦを使用しない場合、ＤＣＭ液滴は安定しなかった。分散したＤＣＭ液滴はすぐに融合し、２つの相はすぐに分離するであろう。結果は、安定したＨ／Ｆエマルジョンを製造するために十分な量のＦＳを使用し、硬化プロセス中に連続的にかき混ぜて、ポリマーマイクロスフェアを成功裏に製造する必要があることを示した。（図２Ｂ）。

ＤＣＭ中にＰＯＥを添加し、ＦＣ－４０中でボルテックスすると、ＰＯＥを含有する液滴が形成された。開放容器内又は真空下での周囲条件でのＤＣＭの蒸発は、ＰＯＥマイクロスフェアに硬化した液滴をもたらした（図２Ａ及び２Ｂ）。マイクロスフェアのサイズは、有機相における液滴サイズ及びＰＯＥ含有量と関連していた。より高いＰＯＥ濃度は、より大きなマイクロスフェアサイズをもたらす（表１）。

実施例２：均質化速度の影響
材料及び方法
ＤＣＭ中の３０％又は４０％ｗ／ｖのＰＯＥ（１ｍＬ）を、０．５％（ｗ／ｗ）のＦＳ ＦＣ－４０を含むＦＣ－４０（９ｍＬ）に添加し、ＶＷＲ ７ｍｍ×９５ｍｍの鋸波発生器プローブを有するＶＷＲハンドヘルドホモジナイザー２００で乳化し、３つの均質化速度、低（フルパワーの約５０％）、中（フルパワーの約６０％）、及び高（フルパワーの約７０％）のうちの１つで乳化した。形成されたエマルジョンを真空下でかき混ぜた。形成されたマイクロスフェアを洗浄し、真空下で乾燥させた。

結果
図３Ａ～Ｃに示されるように、３０％ ＰＯＥについて、低均質化速度は、より大きいマイクロスフェアサイズをもたらし、一方、高均質化速度は、より小さいサイズをもたらした（表２）。４０％のＰＯＥも、同じ傾向を示した。これらの結果は、均質化速度を調整することにより、マイクロスフェアサイズを制御できることを示している。

実施例３：Ｓ／Ｈ／Ｆベースのバルクエマルジョン方法によるＰＯＥマイクロスフェア中のタンパク質ＳＤＰ封入の一般的手順
材料及び方法
図４に示すように、バルクエマルジョン合成は、配合、乳化、硬化の３つのステップに分けることができる。生成物の特性はこれらの３つのステップで使用される異なったパラメータとして異なっているであろう。一般的な手順は、以下のように説明される。

配合のために、１０～３５％ｗ／ｖのＰＯＥを含有する５００μＬの酢酸エチル中に、１０％～３０％ｗ／ｗの総固体重量ＶＥＧＦトラップＳＤＰ（又は蛍光撮像のための蛍光標識ＳＤＰ（Ｆ－ＳＤＰ））を、ボルテックス及びその後の５分間の超音波処理によって分散させた。次いで、これらの懸濁液を、０．１～０．５％ｗ／ｗのＦＳを含む９．５ｍＬのＦＣ－４０中に添加した。乳化は、ベンチトップホモジナイザーを使用した撹拌、ボルテックス、又は均質化によって達成することができる。エマルジョンの構造を図５に示す。乳化直後に、プロセス内アリコートを採取し、顕微鏡撮像のためにガラススライド上に落とした。周囲条件下での蒸発によりスライド上で液滴を硬化させた。マイクロスフェアを硬化させるために、以下の３つの方法のうちの１つを適用した：（ａ）開放容器内で溶液を周囲条件で一晩かき混ぜ、酢酸エチルの蒸発を可能にすることと、（ｂ）溶液をより速い溶媒蒸発のために少なくとも２時間真空下でかき混ぜることと、（ｃ）かき混ぜつつ、ＮＯＶＥＣ７５００、又はＦＣ－４０とＮＯＶＥＣ７５００との混合物をエマルジョンに添加すること。ＨＦＥは、炭化水素相からフルオロカーボン相への酢酸エチルの抽出を支援し、急速な硬化プロセス（通常は数分以内）を可能にする共溶媒として作用する。

最終的に、ＦＣ－４０中の硬化ポリマー球体を、最初に０．２２μｍのＰＥＳ膜を通して真空濾過した。ＦＣ－４０はフィルターを通過し、マイクロスフェアは保持された。次いで、マイクロスフェアを追加のＦＣ－４０で洗浄し、真空下で完全に乾燥させた。

生成物粉末を０．０１％ｗ／ｖのＰＶＡ溶液中に分散させることにより、液体サンプリングを伴うＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ３０００を使用したレーザー回折分析によって、マイクロスフェアのサイズを測定した。生成物の形態を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して測定した。

マイクロスフェアのタンパク質含有量を測定するために、所定量のマイクロスフェアを最初に２００μＬの酢酸エチルに溶解させ、次いで１つの純水で抽出し、水相を収集し、遠心分離して、濁り懸濁液を除去した。タンパク質の純度及び濃度を、ＳＥＣ－ＵＰＬＣにより測定した。

バースト放出を測定するために、所定量のマイクロスフェアを１ｍＬのＰＢＳ中で３７℃で１時間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上清をＳＥＣ－ＵＰＬＣに供して、タンパク質濃縮を行った。

結果
上記の結果は、十分なＳＦの存在により安定したＨ／Ｆエマルジョンである場合に形成を示した。この非水エマルジョンは、ブランクＰＯＥ球体を正常に生成することができる。この無水方法を再び使用して、ＳＤＰをＰＯＥマイクロスフェアに組み込んだ。一例では、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ １０％ｗ／ｗの総固体重量を、懸濁液として酢酸エチル（２０％ｗ／ｖのＰＯＥを含む）中に導入し、ＦＣ－４０中のこの懸濁液（０．５％ｗ／ｗのＦＳを含有する）を、撹拌及びボルテックスによって配合した。乳化直後に、アリコートをガラススライド上に移して、顕微鏡撮像を行った。図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、ＦＣ－４０中で酢酸エチルは液滴に分散し、ＳＤＰ粒子は酢酸エチル液滴内に明確に閉じ込められていた。Ｓ／Ｏ／Ｗシステム（データは示さない）とは対照的に、タンパク質がフルオロカーボン連続相に漏出する兆候はなかった。このＨ／Ｆシステムにおいて重要なことは、液滴中のＳＤＰ粒子が、粉末状態において元の窪んだ形状を保持したことである。ＳＤＰを再構成するためのＨ／Ｆシステムには水がなかったため、ＳＤＰは元の固体粒子形態のままであった。硬化後、明るいファイルされた顕微鏡画像及び蛍光顕微鏡画像を通して、単一又は複数のＳＤＰ粒子を含有するＰＯＥマイクロスフェアを明確に観察することができる（図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃ）。ガラススライド上の炭化水素及びフルオロカーボン溶媒の蒸発後、水を添加して、バースト放出及び封入品質を試験した。図８Ａ～Ｄに示されるように、マイクロスフェア生成物を水中に配置した後、ＳＤＰ封入ＰＯＥマイクロスフェアは、完全性を保持した。タンパク質の即時放出は観察されず、ＳＤＰ粒子の形状は同じままであり、これは、ＳＤＰ粒子がポリマーマトリックスによって十分に保護され、水性環境から遮蔽されていることを示した。これらの結果は、Ｈ／Ｆエマルジョンが、タンパク質及び他の親水性薬物をポリマーマトリックス内に封入するための有効な解決策であり、バースト放出を最小限に抑えながら、高い封入効率、高収率を達成する可能性を有することを示す。これらは全て、水性ベースのＷ／Ｏ／Ｗ又はＳ／Ｏ／Ｗ方法を使用する場合の主要な課題である。

本明細書に開示される手順は、ＰＯＥマイクロスフェア中のタンパク質ＳＤＰ封入のためのＳ／Ｈ／Ｆ非水ベースのバルクエマルジョン方法を使用する例である。この方法は、再現性があり、スケーラブルで、調整可能である。製剤及びプロセスにおけるパラメータを変化させることにより、生成物特性を調整及び制御することができる。それらのパラメータのうちのいくつかの効果が、実施例４に開示される。

実施例４：炭化水素溶媒の効果
材料及び方法
ジクロロメタン又は酢酸エチルを炭化水素として使用して、実施例２に記載されるように微粒子を製造した。ＤＣＭ中３５％ｗ／ｖのＰＯＥ、及び酢酸エチル中３５％ｗ／ｖのＰＯＥを調製した。総固体重量が１０％（１０％）ｗ／ｗのタンパク質粉末を、ＤＣＭ中又は酢酸エチル中の０．５ｍＬのＰＯＥ溶液中に懸濁させた。これらの懸濁液を、２０ｍＬのシンチレーションバイアル中の０．５％ｗ／ｗのＦＳを含有する９．５ｍＬのＦＣ－４０中に移した。これらの混合物を均質化して、エマルジョンを生成し、ハウス真空下で１．５時間かき混ぜた。形成されたマイクロスフェアを濾過によって単離し、ＦＣ－４０で洗浄し、真空下で乾燥させた。

結果
図９は、炭化水素溶媒の種類（ジクロロメタン又は酢酸エチルのいずれか）を除いて、同じ製剤及びプロセス条件を使用して製造された微粒子のサイズ分布を示す。いずれかの炭化水素を使用して製造された微粒子は、噴霧乾燥タンパク質の封入を示す。ジクロロメタンを使用すると、より大きな微粒子が生成される。以下の表３を参照されたい。結果は、同じ製剤及びプロセス条件下で、異なる炭化水素溶媒を使用すると、異なるサイズのマイクロスフェアが得られることを示唆した。ＤＣＭは、酢酸エチルよりも大きなマイクロスフェアサイズを生成した。したがって、マイクロスフェアサイズを制御するために、炭化水素溶媒を意図的に選択することができる。

実施例５：タンパク質充填量の影響
材料及び方法
タンパク質充填量のみを変化させて、実施例２に記載されるように微粒子を製造した。ＤＣＭ中の３５％のＰＯＥを調製した。総固体重量が５％、１０％及び３０％ｗ／ｗのタンパク質粉末を、ＤＣＭ中の０．５ｍＬのＰＯＥ溶液中に懸濁させた。これらの懸濁液を、２０ｍＬのシンチレーションバイアル中の０．５％ｗ／ｗのＦＳを含有する９．５ｍＬのＦＣ－４０中に移した。これらの混合物を約１分間均質化してエマルジョンを生成し、次いで、Ｎｏｖｅｃ７５００とＦＣ－４０との１：１（ｖ：ｖ）混合物６ｍＬを１分以内にエマルジョンに添加した。その後、更に１分間撹拌した後、形成されたマイクロスフェアを濾過によって単離し、ＦＣ－４０で洗浄し、真空下で乾燥させた。

結果
表４に示すように、製剤中のタンパク質粉末の量を増加させると、レーザー回折分析によって測定されたより大きなＰＯＥ微粒子サイズが得られ、また、タンパク質抽出実験、明視野及び共焦点蛍光顕微鏡法によって観察された最終ＰＯＥマイクロスフェア生成物中のタンパク質充填も増加した。３０％ｗ／ｗのタンパク質粉末充填についての明視野画像は、１０％ｗ／ｗのタンパク質粉末よりも暗く、透明度が低いマイクロスフェアを示し、これは、より多くの薬物がマイクロスフェア生成物中に封入されていることを示している（図１０Ａ及び１０Ｂ）。代表的な共焦点画像は、ＳＤＰが、マイクロスフェアの断面図から、ＰＯＥマトリックス内に元の形態で封入されていることを確認した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。より多くのＳＤＰ粒子が、３０％ｗ／ｗの充填しているマイクロスフェア中で観察された。繰り返すが、封入されたＳＤＰは、元の窪んだ形状を保持し、これは製造プロセス全体中にそれらが無傷であったことを示している。

図１２Ａ及び１２Ｂは、５％ｗ／ｗのＳＤＰ及び１０％ｗ／ｗのＳＤＰが充填された微粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。

実施例６：Ｈ／Ｆバルク乳化を使用したＰＯＥマイクロスフェアへのＳＤＰの封入に関する実験計画法（ＤＯＥ）
材料及び方法
設計された空間における合成の重要な要因が最終生成物の特性に及ぼす影響を評価するために、ＤＯＥ試験を実行した。設計された実験における１０回の実行を、実施例２に記載の一般的手順に従って実行した。タンパク質粉末充填、タンパク質粉末粒子サイズ（Ｄｖ（５０）サイズは２．２ｕｍ及び５．６ｕｍであり、それぞれ図１３Ａ及び１３ＢのＳＥＭ画像を参照されたい）、ポリマー濃度、及びＨＦＥ濃度は、以下の製剤及びプロセス条件を一定に保ちながら変化させた（例えば、炭化水素及びフルオロカーボン相の体積、均質化速度、ＦＳ濃度（表５））。マイクロスフェアサイズ（Ｄｖ５０、レーザー回折によるスパン）、封入効率、１時間３７℃でのバースト放出、ＳＥＭ画像を含む測定された応答。

結果
ＤＯＥの結果を表５に要約する。

マイクロスフェアサイズ（Ｒ^２＝０．７６）に対するカスタム設計されたＤＯＥ適合により、タンパク質粉末充填及びＰＯＥ濃度の主な影響が明らかとなった（ｐ値＜０．０５、表６の相関結果を参照されたい）。加えて、バースト放出に対する適合（Ｒ^２＝０．９２）は、タンパク質粉末充填のみがバースト放出に有意に影響することを示す（ｐ値＜０．０５、表７の相関結果を参照されたい）。結果は、製剤中のタンパク質粉末量を増加させると、最終生成物中のペイロードがより高くなるが、また、バースト放出パーセンテージを増加させることを示唆する。バースト放出は、表面吸着されたタンパク質粒子によって引き起こされる可能性が高い。ポリマーマイクロスフェア中に内在化されるタンパク質粉末の最大量は、所与のマイクロスフェアサイズの物理空間によって決定される。製剤懸濁液中のタンパク質粉末濃度を単に増加させるだけでは、この実施例では約３０％ｗ／ｗであった特定の閾値を超えて薬物封入を増加させることはない。

実施例７．異なるタンパク質へのＳ／Ｈ／Ｆエマルジョンベースの封入方法の適用
開示されるＨ／Ｆベースのエマルジョンシステム及びプロセスは、異なるポリマー及び治療用タンパク質に適用可能なプラットフォーム技術であり得る。本発明の具体例では、組換えＩｇＧ４のタンパク質粉（ＭＷ：約１４５ｋＤａ）、組換えＩｇＧ１のタンパク質粉末（ＭＷ：約１４６ｋＤａ）、又は組換え融合タンパク質のタンパク質粉末（ＭＷ：約６４ｋＤａ）を、実施例２と同様のプロセスによって、それぞれＰＯＥマイクロスフェアに封入した。結果を表８に要約する。マイクロスフェア生成物中の封入されたタンパク質粉末の量を、抽出アッセイによって決定し、目標値と一致させた。タンパク質純度が組換え融合タンパク質、ＩｇＧ１について保持されたか、又は封入プロセス後にＩｇＧ４についてわずかに低下した（２％未満）ことは、良好なプロセス適合性を示す。

ＰＬＧＡ及びＰＬＡなどの他の生分解性ポリマーも、Ｈ／Ｆベースのエマルジョンに使用される。本発明の具体的な例では、実施例２に開示される同様の方法により、蛍光標識ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰを、それぞれ、ＰＬＧＡ（ラクチド：グリコライド５０：５０、Ｍｗ：４２～６５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＬＡ（アルキルエーテル末端、Ｍｗ：１８，０００～２８，０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）マイクロスフェア中に封入した。他のポリマー比及び分子量も使用することができる。明視野及び蛍光顕微鏡画像は、タンパク質粉末がポリマーマイクロスフェアの内部に首尾よく封入されたことを示した（ＰＬＡについては図１４Ａ～Ｃ、ＰＬＧＡについては図１５Ａ～Ｂ）。

実施例８：非水膜エマルジョン
表９に記載の材料を使用して膜エマルジョンを使用して微粒子を製造した。

膜乳化（ＭＥ）は、良好なサイズ制御及び狭いサイズ分布を可能にする粒子の高度に制御された製造のための比較的新しい技術である。これまでに、シラス多孔質ガラス（Ｓｈｉｒａｓｕ Ｐｏｒｏｕｓ Ｇｌａｓｓ、ＳＰＧ）、酢酸セルロース、ポリマー、陽極酸化アルミナ（ａｎｏｄｉｃ ｐｏｒｏｕｓ ａｌｕｍｉｎａ）、及びシリコンマイクロチャネルなど、ＭＥ用に多くの種類の膜が開発されてきた。開示されたプロセスについては、レーザードリルで開けた細孔を有するステンレス鋼膜が目的に最適であり、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｅｄｃａｒ、ＵＫ）による市販の装置が、実験室研究プロセスを可能にし、またＧＭＰ製造へのスケールアップも可能にすることを見出した。膜技術のいくつかの重要な特質は下記のものを含んでいる：１．厳しく制御された膜の細孔サイズにより、限界を下回る全てのＳＤＰの粒子は、膜を通過することができる。２．曲がりくねった経路を有しない直管状チャネルは、ＳＤＰによるチャネル遮断の傾向を低減する。３．親フッ素性膜コーティングは、フルオロカーボン中炭化水素（Ｈ／Ｆ）エマルジョンの製造との良好な適合性を提供する。更に、ステンレス膜は、堅牢で、清掃が容易で、滅菌可能である。

１つの実験について、ブランクＰＯＥマイクロスフェア（ＲＳ００１－バッチ１）又はタンパク質封入ＰＯＥマイクロスフェア（ＲＳ００１－バッチ２）を、従来の水性ベースのエマルジョンシステムを使用した膜乳化によって製造した。製造パラメータを、表１０に列挙する。バッチ１では、ＤＣＭ中１０％ｗ／ｗ ＰＯＥ溶液を分散相として使用し、１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を連続相（ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ ｐｈａｓｅ）として使用して、ブランクＰＯＥマイクロスフェアを製造した。バッチ２では、サイズＤ５０＝２．２（Ｄ１０＝１．０、Ｄ９０＝３．８、スパン＝１．２４）のＶＥＧＦトラップＳＤＰ（１％ Ａｌｅｘ４８８標識ＶＥＧＦトラップを含有する）についてマイクロ封入を実行した。ＳＤＰを、ＳＤＰ：ＰＯＥ＝９：１（重量による）のＤＣＭ中１０ｗ／ｗ％ ＰＯＥ溶液に添加した。混合物をボルテックスし、超音波処理浴中で５分間超音波処理して、均質な懸濁液を作製した。ＳＤＰ懸濁液を１０ｍＬのＢＤシリンジに直ちに充填し、シリンジポンプによって駆動される０．８ｍＬ／分の速度でＬＤＣ－１分散セルに供給した。エマルジョンは、有機相が１０ＶのＤＣ電力（粘度に応じて約１，０１５ｒｐｍ）を使用してかき混ぜながら３０ｕｍの細孔を有する膜を完全に通過するときに生成された。形成されたエマルジョンを、キャップされていないビーカーに移し、一晩かき混ぜることなく周囲条件でマイクロスフェアに硬化させた。マイクロスフェア生成物を、最終的にＭｉｌｌｉＱ水で真空フィルター上で洗浄し、真空下で一晩乾燥させた。

別の実験について、ブランクＰＯＥマイクロスフェア（バッチ３）又はタンパク質封入ＰＯＥマイクロスフェア（バッチ４）を、新規の非水フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンシステムを使用した膜乳化によって製造した。製造パラメータを、表１１に列挙する。バッチ４ａにおいて、上記ＶＥＧＦトラップＳＤＰ（１％ Ａｌｅｘａ４８８標識ＶＥＧＦトラップを含有する）を、生分解性又は生体侵食性ポリマーＰＯＥを含有する炭化水素溶媒ＤＣＭに添加した。混合物をボルテックスし、超音波処理して、均質な懸濁液を形成した。ＳＤＰ懸濁液を直ちにシリンジに充填し、シリンジポンプによってＬＤＣ－１分散セルに供給した。懸濁液を、タンパク質粉末粒子よりも大きい細孔サイズを有する多孔質膜を介して、フッ素系界面活性剤（例えば、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ１）を含有するフルオロカーボン（例えば、ＦＣ－４０）連続相に注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョン（図１６に示す）を形成した。その後のマイクロスフェア硬化は、共溶媒としてフルオロカーボンにヒドロフルオロエステルであるＮＯＶＥＣ７５００を添加することによって、形成されたエマルジョン液滴から炭化水素溶媒を除去することにより達成された。硬化マイクロスフェアを収集し、ＦＣ－４０で洗浄して、余分なフッ素系界面活性剤を除去し、ＰＥＳフィルターを含有する真空濾過を使用して乾燥させた。最後に、生成物を真空下で乾燥させ、残留溶媒を除去した。プロセス全体のフローチャートを図１７に示す。

結果
図１８に示されるように、従来の水性ベースのエマルジョンシステム（バッチ１）及び非水ベースのエマルジョンシステム（バッチ３）を介して製造されたブランクＰＯＥマイクロスフェアのＳＥＭ画像は、両方の方法によって球状の微粒子が得られるが、表面形態が異なることを示す。水性ベースの方法は、プロセス中に水が存在するために高多孔質表面をもたらしたが、非水ベースの方法は、完全に無水プロセスに起因してはっきりとした細孔のない滑らかなマイクロスフェア表面をもたらした。

ＶＥＧＦ－トラップＳＤＰのＰＯＥマイクロスフェアへのマイクロ封入に関する、両方法から得られた結果の比較を図１９に示す。水性の膜乳化（バッチ３）によって良好な単分散マイクロスフェアが得られたが、表面は高多孔質であり、水チャネルを有する。非水膜乳化から得られたマイクロスフェアの単分散性は、水性バージョンよりも悪いが、プロセスパラメータを調整することによって更に改善することができる。更に、多くのＳＤＰがＰＯＥマイクロスフェアの表面に埋め込まれていることが観察される。これらの表面に位置するＳＤＰは、マイクロスフェアが緩衝液中でインキュベートされた後のタンパク質のバースト放出に寄与し得る（表１１及び１２）。

蛍光顕微鏡画像から、ＰＯＥマイクロスフェア内部のタンパク質ＳＤＰの形態及び分布が明らかになった（図２０）。バッチ３の場合、ＳＤＰは、封入プロセス中に水によって再構成され、マイクロスフェアの内部のより大きな液滴に融合された。反対に、バッチ４の場合、マイクロスフェアの内部に封入されたＳＤＰは、水によるタンパク質の再構成がないため、ＳＤＰがプロセス後も完全性を維持したことを示す、元のレーズン形状の構造のままであった。

バッチ３及びバッチ４の場合の封入効率（生成物中の測定されたタンパク質充填／理論的タンパク質充填）は、それぞれ３５．０％及び８０．７％であることが決定された（表１２）。非水システムの場合の２倍超の封入効率は、水性システムと比較して、ＳＤＰが炭化水素液滴中でより良好に保持され、連続相への拡散がより少ないことを示唆する。ＰＯＥマイクロスフェア中に封入されたタンパク質の純度（モノマーのパーセンテージ）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した。バッチ４は、封入プロセス全体の後にタンパク質純度の良好な保持を示した。

上述の明細書において、本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細は、例示の目的のために提示されたが、本発明が、追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載の詳細の一部が、本発明の基本原則から逸脱することなく、かなり変動し得ることは、当業者には明らかであろう。

本発明は、その趣旨又は本質的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化されてもよく、したがって、前述の明細書ではなく、本発明の範囲を示す添付の特許請求の範囲を参照する必要がある。

Claims (45)

1. ポリマーコーティングされた微粒子を製造する方法であって、
   微粉化タンパク質粉末及びポリマーを炭化水素溶媒中で合わせて、第１の非水溶液を形成することと、
   前記第１の非水溶液を撹拌して、懸濁液を形成することと、
   前記懸濁液を分散セルに供給することであって、前記懸濁液を、フルオロカーボン液体及びフッ素系界面活性剤を含む連続相の接流の下で、前記連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する、供給することと、
   前記フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンにヒドロフルオロエステルを添加することと、
   前記炭化水素溶媒を除去して、硬化微粒子を提供することと、
   前記フルオロカーボン液体を除去して、前記微粒子を単離することであって、前記微粒子が、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む、除去することと、を含む、方法。
2. 前記フルオロカーボン液体中の前記微粒子を洗浄することによって、前記微粒子から残留フッ素系界面活性剤を除去するステップと、真空によって前記フルオロカーボンを除去するステップと、ポリエーテルスルホン膜フィルターを使用して前記微粒子を収集するステップと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記フルオロカーボン液体が、ペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記炭化水素溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. フルオロカーボン溶液が、１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記フッ素系界面活性剤が、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルを含む、請求項１～１のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ポリマーが、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ポリマーが、ポリ乳酸及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ヒドロフルオロエステルが、２－（トリフルオロメチル）－３－エトキシドデカフルオロヘキサンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記膜が、親フッ素性コーティングされたステンレス鋼膜である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記膜の細孔が、直径３～３００μｍである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記フッ素系界面活性剤が、約０．１～５％ｗ／ｖでフルオロカーボン液体中に存在する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. タンパク質粉末対ポリマー比が、０．１％～３０％である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記微粉化粉末が、抗体若しくはその抗原結合断片、融合タンパク質、組換えタンパク質、又はそれらの断片若しくは切断バージョンから製造される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記融合タンパク質が、ＶＥＧＦトラップ融合タンパク質又はその切断バージョンである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＶＥＧＦトラップ融合タンパク質が、アフリベルセプトである、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記懸濁液の供給が、０．１～１．０ｍｌ／分の速度である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記懸濁液が、均質懸濁液である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記微粒子が、単一コアシェル構造を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 少なくとも１つの微粒子が、前記ポリマー内に分散された複数のコアを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記微粒子が、ポリマーによって封入された単一コア構造の組み合わせを含む微粒子と、ポリマーによって封入されたマルチコア構造を含む微粒子と、を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記微粒子が、１～２００μｍの直径を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記微粒子が、３０～６０μｍの中央直径を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. タンパク質粉末が、噴霧乾燥、エレクトロスプレー乾燥、可逆沈殿、噴霧凍結、マイクロテンプレート、又はこれらの組み合わせによって微粉化される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記懸濁液が、均質化、ボルテックス、超音波処理、キャビテーション、撹拌、かき混ぜ、チャーニング、ウィスキング、振盪、乳化、又はこれらの組み合わせを使用して形成される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記炭化水素溶媒が、蒸発によって除去される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記フルオロカーボン液体が、真空濾過によって除去される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
28. 請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法によって製造された微粒子であって、持続放出微粒子である、微粒子。
29. 請求項２８に記載の微粒子を含む、持続放出組成物。
30. 前記微粒子が、ポリマー表層（ｃｏｒｔｅｘ）内にほとんど又はまったく細孔又はチャネルを有しない、請求項１～２９のいずれか一項に記載の微粒子。
31. ポリマー又はポリマーコーティングされた微粒子を製造する方法であって、
    炭化水素溶液中に懸濁した１～３０％ｗ／ｗの全固体噴霧乾燥タンパク質を合わせて、第１の非水溶液を形成することと、
    前記第１の非水溶液を撹拌して、懸濁液を形成することと、
    前記懸濁液を分散ポンプに供給することであって、前記懸濁液を、フルオロカーボン液体及び０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含む連続相の接流の下で、前記連続相に多孔質膜を介して注入して、フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンを形成する、供給することと、
    前記炭化水素溶媒を除去して、硬化ポリマー又はポリマーコーティングされたマイクロスフェアを提供することと、
    前記フルオロカーボン液体を除去して、前記微粒子を単離することであって、前記微粒子が、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む、除去することと、を含む、方法。
32. 前記炭化水素溶媒を除去する前に、前記フルオロカーボン中炭化水素エマルジョンの前記フルオロカーボン液体にヒドロフルオロエステルを添加するステップを更に含む、請求項３１に記載の方法。
33. 前記炭化水素溶液が、周囲大気圧下又は真空下での蒸発によって除去される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記硬化ポリマー又はポリマーコーティングされたマイクロスフェアが、真空濾過によって採取される、請求項３３に記載の方法。
35. 前記噴霧乾燥タンパク質が、抗体、組換えタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの断片である、請求項３１又は３２に記載の方法。
36. 前記タンパク質が、ＶＥＧＦトラップタンパク質又は切断ＶＥＧＦトラップタンパク質である、請求項３６５に記載の方法。
37. 前記炭化水素溶液が、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
38. 前記フルオロカーボン液体が、トリフルオロメチル）ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）アミンを含む、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記硬化微粒子を採取することを更に含む、請求項３８に記載の方法。
40. 請求項３１～３９に記載の方法のいずれか１つによって製造された、微粒子。
41. 請求項４０に記載の微粒子を含む、薬学的組成物。
42. １つ以上の賦形剤を更に含む、請求項４１に記載の薬学的組成物。
43. 前記薬学的組成物が、持続放出組成物である、請求項４１に記載の薬学的組成物。
44. 前記薬学的組成物が、非経口投与のために製剤化される、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
45. 前記ヒドロフルオロエーテルが、４－エトキシ－１，１，１，２，２，３，３，４，５，６，６，６－ジデカフルオロ－５－（トリフルオロメチル）ヘキサンを含む、請求項３に記載の方法。
    

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