JP2016519152A - 治療用タンパク質を含む粒子を製造する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法に関する。

Description

本発明は、医薬製剤の分野におけるものである。より詳細には、本発明は、抗体などの治療用タンパク質を含む微粒子を製造するための方法に関する。

治療、診断又は予防目的、例えばワクチン接種などのための分子の標的化放出及び／又は制御放出は、従来の、治療剤、診断剤又はワクチンの投与に比べ、利点をもたらす可能性があるので、広く検討されている。タンパク質などの高分子、例えば抗体又はポリヌクレオチドの標的化放出及び／又は制御放出は、際立った技術上の難題の１つである。

多くの場合、動物又はヒトでの治療、診断又は予防用途（例えばワクチン接種）に有用な、抗体などのタンパク質は、効力を生ずるには高用量で投与しなければならない。ワクチン、抗体、又は他の治療用若しくは診断用タンパク質は一般に、動物又はヒトに非経口的に投与しなければならない。このようなタンパク質は通常、例えば静脈内、皮下又は筋肉内などに注射する必要がある。したがって、長期間、例えば数日、数週又は数ヶ月に渡って制御されながら放出されるデポー製剤は、頻繁な注射を回避するのに必要であり、要求された投与計画へのコンプライアンスを高める。

承認された治療用抗体及び他のタンパク質治療剤の医薬製剤は通常、抗体などのタンパク質の制御放出には向かない。抗体又は他の治療用タンパク質の制御放出製剤は、投与頻度の低下を可能にする目的で望ましく、投与頻度の低下により、注射の必要性が低減され、患者のコンプライアンスが向上する。したがって当技術分野では、抗体又は他のタンパク質治療剤の制御放出をもたらす医薬製剤を提供することが、必要とされている。

分子の標的化放出及び制御放出をｉｎ ｖｉｖｏで実現する方法の１つは、ナノ粒子又は微粒子などの粒子の使用によるものである。これらの粒子は、経口経路及び非経口経路を含めた様々な経路で投与することができる。粒子を例えば吸入させることもできるし、例えば静脈内、皮下又は筋肉内などに注射することもできる。

粒子が、動物又はヒトでのｉｎ ｖｉｖｏの用途に有用であるには、生分解性及び生体適合性でなければならない。この２０年間、合成生分解性ポリマーが、低分子薬物を送達するためのキャリア又は微粒子若しくはナノ粒子として使用されてきた［１］。ポリ−ラクチド［ＰＬＡ］、ポリ−グリコリド［ＰＧＡ］及び特にポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）［ＰＬＧＡ］などの熱可塑性脂肪族ポリエステルは、その生体適合性及び生分解性が優れていることから大変な関心を集めてきた。粒子、マイクロカプセル、ナノ粒子、ペレット、植込錠、及び薄膜など種々のポリマー薬物送達システムが、種々の治療薬を送達するために、これらのポリマーを使用して製造されている。これらのポリマー薬物送達システムは、薬物送達用途に関してＦＤＡにより承認されてもいる。

ＰＬＡ又はＰＬＧＡベースの粒子は、例えば、ポリ（エチレングリコール）［ＰＥＧ］又はタンパク質などの標的化部分を付加することによってさらに修飾することもできる。この種の粒子の主な限界の１つは、血漿タンパク質が微粒子に非特異的に吸着してしまうことである。血漿タンパク質の吸着は、微粒子の臓器分布を説明する主要な要因の１つと考えられる。例えば、特定のタンパク質の存在は、細胞膜受容体との特異的又は非特異的相互作用を介した、一部の細胞による取込みを促進することが知られている。したがって、この効果を抑制するために様々な修飾戦略が進められた。ＰＬＧＡ粒子のＰＥＧによる修飾は、タンパク質吸着を低減するための重要且つよく知られたアプローチである。別の選択肢は、官能化ポリ（Ｌ−リシン）−ｇ−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）を介して官能基をＰＬＧＡ微粒子に導入し、こうして、タンパク質吸着の強く低減されたＰＬＧＡ微粒子を製造することであった［２］。

粒子を修飾する別の根本的目的は、所望の治療効果を実現するために、体内の所望の組織又は細胞型に前記粒子を標的化することである。所望の標的細胞に有効成分を特異的に送達すると、有効性を増大することだけでなく、この活性成分が様々な組織に与える望ましくない効果に由来する副作用を低減することも、可能になる。これは、様々な標的化部分、例えば抗体、その断片、又は受容体標的化ペプチドを使用して実現できる。例えば、抗体及び受容体標的化ペプチドのいずれも、皮下注射後に効果的に、ＰＬＧＡ粒子を樹状細胞へと優先的に標的化することが示されている［３］。

ポリマーマトリックスベースの粒子、特にＰＬＡ、ＰＧＡ又はＰＬＧＡをベースとする粒子の、従来の薬物送達システムに対する優位点には、その生体適合性及び生分解性に加え、数日、数週又は数ヶ月に及ぶ徐放性が含まれる。しかし、これらのポリマーマトリックスの使用は、抗体などのタンパク質との関連で問題があることが指摘されてきた。これは、主としてタンパク質の分解の酸触媒的性質のために、調製中及び保存中のその安定性に対する負の効果がこれらのポリマーマトリックスにはあるようだからである。加えて、ポリマーマトリックス薬物送達ビヒクルの製造の際に用いられる処理条件には、タンパク質二次構造に対し有害な効果がある［４］。

ＰＬＡ、ＰＧＡ又はＰＬＧＡなどのポリマーマトリックスをベースとする粒子を生成するには、複数のステップが必要とされ、複数のパラメータが関与する。タンパク質、例えば抗体を含む、ポリマーマトリックスベースの粒子は、タンパク質、及び抗体などの大きなタンパク質の複雑性及びそれ固有の不安定性により、製造が特に難題となる。タンパク質及び抗体は、ポリマーマトリックスベースの粒子を形成する工程の間に不活性化する傾向がある。

ＰＬＧＡベースの粒子を製造するために、幾つかの方法が用いられてきた。最も一般的な方法は、乳化−溶媒蒸発法を採用している。この方法では疎水性薬物の場合、ポリマー及び活性分子（例えば、予防、予後予測、診断又は治療用の分子）の双方を、塩化メチレンなどの有機溶媒に溶解してエマルション油を形成する。続いて水と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの乳化剤とをポリマー溶液に添加することによって、水（ｗ）中のエマルション油（ｏ）、すなわちｏ／ｗを次に調製する。超音波処理又は均質化処理によって粒子を誘導し、粒子を製造するために次に溶媒を蒸発させるか又は次に抽出する。タンパク質などの親水性薬物の場合、ポリマーは有機溶媒に溶解し、活性分子は水相に溶解し、ここから第１の水−油エマルションを調製する。次に水及び乳化剤を添加して、二重の水中油中水型エマルション（ｗ／ｏ／ｗ）を生成する。次にこの第２のエマルションから粒子を誘導し、溶媒を後で蒸発させるか又は抽出して、粒子を得る。

水／溶媒界面でのタンパク質吸着及び変性は、マイクロカプセル封入工程の間に起きるタンパク質生理活性減少の主要因の１つである。水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）法で油中水（ｗ／ｏ）型エマルションを形成する間に主に起きるタンパク質変性を回避するために、水中油中固体（ｓ／ｏ／ｗ）法が開発された［５］。実際、固体においてタンパク質は、劇的にコンホメーションの可動性を低減することによってその生理活性を維持すると考えられる。ｓ／ｏ／ｗ法では、油中固体（ｓ／ｏ）型一次懸濁液を生成するために、固体タンパク質粒子を分散させてある有機溶媒にポリマーを溶解させる。この懸濁液は次に、ＰＶＡ又はＰＶＰなどの乳化剤を含有する水相に添加して、ｓ／ｏ／ｗ型エマルションを形成する。生じたエマルションを次に撹拌し続けることで、有機溶媒の抽出及び蒸発の両方、並びに続く粒子の回収が可能となる。

ｓ／ｏ／ｗ法の核心の１つは、タンパク質粒子の微粒子化、すなわちこれらの固体粒子の平均直径を低減することであり、微粒子化法には、冷凍乾燥、噴霧乾燥及び噴霧凍結乾燥が含まれる［６］。凍結乾燥としても知られる冷凍乾燥は、物質を凍結し、次いで周囲圧力を下げて、物質中の凍結水を固相から気相に直接昇華させることによって進む脱水工程である。一方、噴霧乾燥は、熱ガスで急速に乾燥させることによって、液体又はスラリーから乾燥粉末を製造する方法である。この加熱した乾燥媒体は空気だが、液体がエタノールなどの可燃性溶媒であるか又は生成物が酸素感受性である場合は、窒素を使用する。最後になるが、噴霧凍結乾燥は手短に言えば、極低温ガス又は極低温液体中へと液体溶液を微粒化することからなり、ここで、生じた液滴は瞬時に凍結し、続いて氷は凍結乾燥時の低温低圧で昇華する。

噴霧乾燥には、低い回収率、並びに熱及び物理的ストレスによるタンパク質変性及び凝集のリスクなどの問題があるにも関わらず、実際は、タンパク質微粒子を製造するために一般に用いられるのはこの方法である。

治療用タンパク質一般の、特に抗体の高いコストを考慮すると、この工程の間、高いタンパク質担持率及び高い封入効率が決定的なパラメータである。封入効率（ＥＥ％）とは、最初に有機相に導入した活性分子の量と比較した、微粒子内に検出される活性分子の量を指す。一方、タンパク質担持率とは、微粒子内にある活性分子の量を、一般には重量比で表したものを指す。

さらに、注射による投与などの特定の用途には、注射可能な粒子の平均直径が、注射するのに十分な小ささでなければならない。通常、２２〜２５ゲージの針（内径３９４〜２４１μｍ）を、静脈注入並びに筋肉内注射及び皮下注射に使用する。したがって、２５０μｍ未満、理想的には１２５μｍ未満の平均直径により特徴付けられる粒子が、個体への投与に適していると考えられる。タンパク質送達のための総表面積は粒径に依存することから、粒径及びその分布も、タンパク質放出速度における重要な要因である［７］。

当技術分野では、抗体、又は他の治療、診断若しくは予防用タンパク質を含む、ポリマーマトリックスベースの粒子を製造するための改良された方法を提供することが必要とされている。当技術分野では、制御放出するための抗体、又は他の治療、診断若しくは予防用タンパク質を含む、改良されたポリマーマトリックスベースの粒子が必要とされている。当技術分野では、封入効率を増加させたポリマーマトリックスベースの粒子を製造するための改良された方法を提供して、商業的に立ち行くコストでそのような粒子を製造できるようにすることが必要とされている。

本発明の目的の１つは、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法を提供することである。

一実施形態では、本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、タンパク質を含む溶液から前記タンパク質を固化させるステップ、固化させた前記タンパク質を、ポリマーマトリックスを含む溶媒と合わせるステップ、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含む溶媒を乳化剤と合わせるステップであって、それにより水中でエマルションを安定化する上記ステップ、エマルションを形成するために、前記ポリマーマトリックス、前記タンパク質及び前記乳化剤を含む溶媒をかき混ぜるステップ、粒子を形成させるために、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含むエマルションを水と合わせるステップ、並びに前記粒子を回収するステップを含む上記方法を提供する。

本発明の方法の別の実施形態では、固化は噴霧乾燥によって実行する。

本発明の方法の別の実施形態では、前記ポリマーは、混合されたＤ，Ｌ−乳酸及びグリコール酸のコポリマー、又はＬ−乳酸及びグリコール酸のコポリマーである。

本発明の方法の別の実施形態では、前記乳化剤はポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンである。

さらなる実施形態では、安定剤はプロリン、ヒスチジン、グルタミンなどのアミノ酸であっても、代わりにスクロース若しくはトレハロースなどの糖であっても、又はマンニトール、マルチトール若しくはソルビトール若しくは上記の任意の組合せなどのポリオールから形成される群から選択してもよい。

本発明の方法の別の実施形態では、前記ポリマーマトリックスを含む溶媒は酢酸エチルである。

別の実施形態では、前記タンパク質は抗体である。

異なるＰＬＧＡ濃度（１、１０及び１５％）で製造したＩｇＧを充填したＰＬＧＡ微粒子の平均粒径に対する乳化速度（４５００から１３５００ｒｐｍ）の影響を示す図である。この図は、ＰＬＧＡ濃度ごとに粒径の観測値を乳化速度に対して示す。明確にするために平滑化曲線（３次のスプライン補間によって得た）をグラフに加えた。 図２（ａ）は、ＩｇＧを充填したＰＬＧＡ微粒子の走査型電子顕微鏡写真：（製剤２５）表面空隙率を倍率８００倍で示す図である；微粒子の可視化を助けるために円を加えた。 図２（ｂ）は、ＩｇＧを充填したＰＬＧＡ微粒子の走査型電子顕微鏡写真：（製剤２５）表面空隙率を倍率５００倍で示す図である。 図２（ｃ）は、ＩｇＧを充填したＰＬＧＡ微粒子の走査型電子顕微鏡写真：（製剤２５）横断面を得た後の内部形状を倍率５００倍で示す図である；微粒子の可視化を助けるために円を加えた。 図２（ｄ）は、ＩｇＧを充填したＰＬＧＡ微粒子の走査型電子顕微鏡写真：（製剤２５）横断面を得た後の内部形状を倍率８００倍で示す図である。微粒子の可視化を助けるために円を加えた。 蛍光顕微鏡観察によって決定した、ＩｇＧ−ＦＩＴＣ担持ＰＬＧＡ微粒子（ＩｇＧ−ＦＩＴＣ ｌｏａｄｅｄ ＰＬＧＡ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の分布を示す図である。 ＩｇＧ担持ＰＬＧＡ微粒子での薬物担持率（％ｗ／ｗ）に対する、ＳＤ ＩｇＧの量（３０から１００ｍｇ）及び外部相の体積（３０、６５及び１００ｍｌ）の影響を示す図である。この図は、外部相の体積ごとに薬物担持率の観測値をＳＤ ＩｇＧの量に対して示す。明確にするために平滑化曲線（３次のスプライン補間によって得た）をグラフに加えた。 ＩｇＧ担持ＰＬＧＡ微粒子での封入効率（ＥＥ％）に対する、理論上の薬物担持率（４から３６％ｗ／ｗ）の影響を示す図である。この図は、ＥＥ％の観測値を理論上の薬物担持率に対して示す。明確にするために平滑化曲線（３次のスプライン補間によって得た）をグラフに加えた。 ＩｇＧ担持ＰＬＧＡ微粒子のバースト効果（２４時間後に放出されたＩｇＧの％ｗ／ｗ）に対する、ＰＬＧＡ濃度（１から１５％ｗ／ｖ）の影響を示す図である。この図は、バースト効果の観測値をＰＬＧＡ濃度に対して示す。明確にするために平滑化曲線（３次のスプライン補間によって得た）をグラフに加えた。 ＩｇＧ担持ＰＬＧＡ微粒子からのＩｇＧ放出特性に対する、ＰＬＧＡ濃度（１％から１５％ｗ／ｖ）の影響を示す図である。（黒菱形）は、１％ＰＬＧＡ溶液を用いて製造した微粒子の溶出曲線を表し（ｎ＝６）、（黒丸）は、５．５％ＰＬＧＡ溶液を用いて製造した微粒子の溶出曲線を表し（ｎ＝３）、（黒三角）は、１０％ＰＬＧＡ溶液を用いて製造した微粒子の溶出曲線を表し（ｎ＝１６）、（黒四角）は、１５％ＰＬＧＡ溶液を用いて製造した微粒子の溶出曲線を表す（ｎ＝９）。 単量体（１７．７分）、二量体（１５．１分）、三量体（１３．７分）及び多凝集体（ｐｏｌｙａｇｇｒｅｇａｔｅ）（１１．９分）の４化学種として溶出するＩｇＧ試料のＳＥＣクロマトグラムを示す図である。（ａ）５．５％ｗ／ｖのＰＬＧＡ微粒子の、１時間の時点における溶出後のＩｇＧ、（ｂ）１％ｗ／ｖのＰＬＧＡ微粒子の、１時間の時点における溶出後のＩｇＧ、（ｃ）溶液にしたＩｇＧ粉末（封入していない冷凍乾燥ＩｇＧ）。 ＩｇＧ担持ＰＬＧＡ微粒子を１時間溶出させた後のＩｇＧ単量体の損失（％ｗ／ｗ）に対する、ＰＬＧＡ濃度（１から１５％ｗ／ｖ）の影響を示す図である。この図は、ＩｇＧ単量体の損失の観測値をＰＬＧＡ濃度に対して示す。明確にするために平滑化曲線（３次のスプライン補間によって得た）をグラフに加えた。 ＣＤＰ５７１担持ＰＬＧＡ微粒子での溶出速度に対する、異なる種類のＰＬＧＡの影響を示す図である。この図は、放出されたＣＤＰ５７１の観測された割合（％）を示す。 ５℃、２５℃及び４０℃で１２週間まで保存した、モノクローナル抗体担持ＲＧ７５５Ｓ微粒子における高分子量種の量変化を示す図である。 １時間並びに２週間及び４週間溶出させた後に放出されたモノクローナル抗体の相対的結合能を示す図である。 図１３（ａ）は、５℃、２５℃及び４０℃で１２週間までの間保存した、モノクローナル抗体担持ＲＧ５０５微粒子の薬物担持率変化を示す図である。 図１３（ｂ）は、５℃、２５℃及び４０℃で１２週間までの間保存した、モノクローナル抗体担持ＲＧ７５５Ｓ微粒子の薬物担持率変化を示す図である。 保存する前での（四角）、及び５℃（菱形）、２５℃（丸）及び４０℃（三角）で１２週間保存した後でのＲＧ５０５（実線）及びＲＧ７５５Ｓ（破線）ＭＳの溶出プロファイルを、時間（週）に対する累積のＭＡｂ放出（％ｗ／ｗ）で示す図である。 ＣＤＰ５７１溶液（黒丸）、ＣＤＰ５７１：ＲＧ５０５微粒子（黒四角）及びＣＤＰ５７１：ＲＧ７５５Ｓ微粒子（黒三角）を皮下投与した後の、平均血漿ＣＤＰ５７１濃度（μｇ／ｍＬ）の対数をとったものを、時間（時間）に対して示す図である。 ＭＡｂ溶液並びにＲＧ５０５及びＲＧ７５５Ｓ微粒子を４８時間及び１週間投与した後のＣＤＰ５７１血漿試料で測定したＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）を比較した、ＴＮＦ−アルファ細胞毒性バイオアッセイを示す図である。

本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための新規の方法を提供することによって、上に特定した必要性に対処する。ポリマーマトリックスと、動物及びヒトでの予防、診断、予後予測又は治療用途に適した抗体などのタンパク質とを含む粒子をさらに提供する。本発明は、ポリマーマトリックスと、例えば皮下又は筋肉内などに注射することによって、動物又はヒトに投与するのに適した抗体などのタンパク質とを含む粒子も提供する。

驚くべきことに本発明者らは、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）法で油中水（ｗ／ｏ）型エマルションを形成する間に主に起きるタンパク質変性は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための本発明の水中油中固体（ｓ／ｏ／ｗ）法を用いることによって回避できることをついに見出した。

本発明の目的の１つは、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法を提供することである。

第１の実施形態では、本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、タンパク質及び安定剤を含む溶液から前記タンパク質を固化させるステップ、固化させた前記タンパク質を、ポリマーマトリックスを含む溶媒と合わせるステップ、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含む溶媒を、水中で乳化剤と合わせるステップ、エマルションを形成するために、前記ポリマーマトリックス、前記タンパク質及び前記乳化剤を含む溶媒をかき混ぜるステップ、粒子を形成させるために、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含むエマルションを水と合わせるステップ、並びに前記粒子を回収するステップを含む上記方法を提供する。

本発明の第２の実施形態では、タンパク質固化は、タンパク質及び安定剤を含む水相を噴霧乾燥するステップを含む。別の選択肢では、本発明のタンパク質固化は、タンパク質及び安定剤を含む水溶液からのタンパク質沈殿を含む。前記安定剤はプロリン、ヒスチジン、グルタミンなどのアミノ酸であっても、代わりにスクロース若しくはトレハロースなどの糖であっても、又はマンニトール、マルチトール若しくはソルビトールなどのポリオールから形成される群から選択してもよい。別の選択肢としては、上記のありとあらゆる種類の安定剤の組合せを使用することができる。活性タンパク質水溶液に安定剤を、タンパク質の重量当たりの安定剤の重量が１０から５０％の間、好ましくは２０から３０％の間の量で添加することができる。前記水溶液は典型的には、１５から７５ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２５から５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のタンパク質を含有する。本発明のタンパク質固化では、例えばタンパク質を他の分子に囲まれた状態で維持することなどによってタンパク質を環境から隔てる粒子が、前記固化によって生じる必要はない。したがって特定の一実施形態では、タンパク質及び安定剤を含有する前記溶液は、固化工程で前記タンパク質を粒子に封入できるように、本質的に両親媒性分子を含まない。

本発明の第３の実施形態では、第１又は第２の実施形態の方法において、前記ポリマーは、混合されたＤ，Ｌ−乳酸及びグリコール酸のコポリマー、又はＬ−乳酸及びグリコール酸のコポリマーである。

本発明の第４の実施形態では、第１、第２又は第３の実施形態の方法において、前記コポリマー内の、Ｄ，Ｌ−乳酸又はＬ−乳酸のグリコール酸に対する比が５０：５０から８５：１５の間、好ましくは７５：２５である。

本発明の第５の実施形態では、第１、第２、第３又は第４の実施形態の方法において、理論上のタンパク質担持率は、重量当たりの重量が５％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％又は２５％を超えない。理論上のタンパク質担持率は、好ましくは、元の全粒子成分の重量当たりの重量が１％から２５％、３％から２０％、最も好ましくは５％から１５％であり、ただしここで１００％には、ポリマーと、界面活性剤と、タンパク質と安定剤と、さらに製剤に含まれる場合には添加剤との合計重量が含まれる。

本発明の第６の実施形態では、第１、第２、第３、第４又は第５の実施形態の方法において、前記溶媒は塩化メチレン又は酢酸エチルである。

本発明の第７の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５又は第６の実施形態の方法において、前記溶媒は前記ポリマーマトリックスを、体積当たりの重量が１％から２０％、２％から１７．５％又は５％から１５％の濃度で含む。

本発明の第８の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６又は第７の実施形態の方法において、前記乳化剤はポリ（エチレングリコール）［ＰＥＧ］ではない。

本発明の第９の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７又は第８の実施形態の方法において、前記乳化剤はポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンである。

本発明の第１０の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８又は第９の実施形態の方法において、前記乳化剤は水中にあって体積当たりの重量が０．０１％から１０％、０．０２５％から５．０％、０．０５％から３．０％、０．１％から２．５％、０．１％から２．０％、０．１％から２．０％の濃度である。

本発明の第１１の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９又は第１０の実施形態の方法において、水の体積は、有機溶媒：水の体積比が１：２５から１：１５０の間、好ましくは１：２６から１：１００の間である。

本発明の第１２の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又は第１１の実施形態の方法において、エマルションを形成するための前記かき混ぜは、３０００ｒｐｍから１４０００ｒｐｍ、３２００ｒｐｍから１３８００ｒｐｍ、３４００ｒｐｍから１３５００ｒｐｍ、又は５０００ｒｐｍから１３５００ｒｐｍで撹拌することによって実行される。

本発明の第１３の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１又は第１２の実施形態の方法において、エマルションを形成するための前記かき混ぜは、少なくとも５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、２時間、３時間又は４時間実行される。エマルションを形成し、続いて有機溶媒を抽出し、蒸発させるための前記かき混ぜは、５分間から１時間の間、５分間から４０分間の間、好ましくは３０分間実行される。

本発明の第１４の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２又は第１３の実施形態の方法において、前記タンパク質は抗体である。

本発明の第１５の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３又は第１５の実施形態の方法において、前記粒子は濾過又は遠心分離によって回収される。

本発明の第１６の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３又は第１５の実施形態の方法において、前記粒子は、１５℃から３５℃、好ましくは２０℃から２５℃で、回収後に２０分間から２４時間真空下で乾燥されるか、又は前記粒子は凍結乾燥される。

本発明の第１７の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１５又は第１６の実施形態の方法において、前記方法は、標的化部分を前記粒子に付加するステップをさらに含む。標的化部分は、好ましくは、ポリ（エチレングリコール）［ＰＥＧ］、ポリ（Ｌ−リシン）−ｇ−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）、抗体若しくはその断片、受容体標的化ペプチド、又は上記の任意の適切な組合せから選択される。

本発明の第１８の実施形態は、いずれか一実施形態の方法によって得ることのできる、前記ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子である。

本発明の第１９の実施形態は、医療に使用するための、第１８の実施形態の粒子である。

本発明の第２０の実施形態は、診断剤として使用するための、第１８の実施形態の粒子である。

本発明の第２１の実施形態は、第１８の実施形態の粒子を含む医薬組成物である。

本明細書で使用される「抗体」（単数又は複数）という用語は、モノクローナル又はポリクローナル抗体を指す。本明細書で使用される「抗体」（単数又は複数）という用語には、それだけに限らないが、当技術分野で知られる組換え技術によって作製した組換え抗体が含まれる。「抗体」（単数又は複数）には、任意の種、特に哺乳動物種の以下のような抗体が含まれる：ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＥ及びＩｇＭ及びそれらの改変変異体を含めた、任意のアイソタイプのヒト抗体、非ヒト霊長類の抗体、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザル由来の抗体；げっ歯類の抗体、例えばマウス、ラット若しくはウサギ由来の抗体；ヤギ若しくはウマ抗体；並びにラクダ科動物の抗体（例えば、ナノボディ（商標）などのラクダ又はラマ由来の抗体）及びその派生物；又はニワトリ抗体などの鳥類種の抗体、若しくはサメ抗体などの魚類種の抗体。「抗体」（単数又は複数）という用語は、少なくとも１つの重鎖抗体配列及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分が第１の種に由来し、重鎖抗体配列及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分が第２の種に由来する「キメラ」抗体も指す。本明細書で対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメインの抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体に由来する配列を含むキメラ抗体のことである。ヒト化抗体は概ね、レシピエントの超可変領域に由来する残基を、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域［又は相補性決定領域（ＣＤＲ）］であって、所望の特異性、親和性及び活性を有する上記超可変領域に由来する残基によって置換してあるヒト抗体（レシピエント抗体）である。大半の例では、ヒト（レシピエント）抗体における、ＣＤＲの外の、すなわちフレームワーク領域（ＦＲ）内の残基もさらに、対応する非ヒト残基によって置換する。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行う。ヒト化すると、非ヒト抗体のヒトでの免疫原性が低減され、したがって抗体を容易に、ヒト疾患の処置に応用できるようになる。ヒト化抗体、及びそれを作製する幾つかの異なる技術は、当技術分野でよく知られている。「抗体」（単数又は複数）という用語は、ヒト化に対する代替物として作製し得るヒト抗体も指す。例えば、免疫した際に内因性マウス抗体の産生を伴わずにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、抗体重鎖の連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ欠損があると、キメラマウス及び生殖系列変異を有するマウスで、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記述されている。生殖系列変異を有するこのようなマウスに、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子群を移すとその結果、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子を持つこのトランスジェニック動物を前記抗体で免疫した際に、特定の抗原に対して特異的なヒト抗体が産生されることになる。このようなトランスジェニック動物を作製するための技術、並びにこのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離及び製造するための技術は、当技術分野で知られている。別の選択肢では、トランスジェニック動物、例えばマウスで、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみを、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置換する。抗体の定常領域をコードする、マウス生殖系列の免疫グロブリン遺伝子は元のままである。こうすることで、トランスジェニックマウスの抗体エフェクターは免疫系において機能し、且つその結果、Ｂ細胞の発生は実質的にそのままであり、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原に曝露された際の抗体応答の向上につながり得る。対象とする特定の抗体をコードする遺伝子が、このようなトランスジェニック動物から単離されていたなら、完全ヒト抗体を得るために、定常領域をコードする遺伝子をヒト定常領域遺伝子で置換することができる。ヒト抗体／抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで得るための他の方法は、少なくとも部分的には人工的に作製されるか、又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーに由来するかのいずれかの組換えＤＮＡライブラリーを使用するディスプレイ技術、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などに基づく。ヒト抗体を作製するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当技術分野でよく知られている。ヒト抗体は、単離したヒトＢ細胞から作製することもできる。このヒトＢ細胞は、対象とする抗原を用いてｅｘ ｖｉｖｏで免疫し、次いで融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマは次に、最適なヒト抗体を求めてスクリーニングすることができる。本明細書で使用される「抗体」（単数又は複数）という用語は、非グリコシル化抗体（ａｎ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）も指す。

本明細書で使用される「抗体」（単数又は複数）という用語は、抗体断片も指す。抗体の断片は、当技術分野で知られる少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、抗原に結合する。本発明の抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖ及びｓｃＦｖ断片；並びにダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）；ドメイン抗体；単鎖抗体；Ｆａｂ−Ｆｖコンストラクトを含めた、しかしそれに限定されない抗体断片又は抗体から形成されている二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体が挙げられる。上に定義した抗体断片は、当技術分野で知られている。

本明細書で使用される「緩衝剤」という用語は、溶液中に存在することで、ｐＨを１単位変化させるために添加しなければならない酸又はアルカリの量を増加させる物資を指す。緩衝溶液はその酸塩基共役成分の作用のため、ｐＨが変化しにくい。生物学的試薬と共に使用するための緩衝溶液は一般に、溶液のｐＨが生理的範囲内にあるように、水素イオンの濃度を一定に維持することができる。伝統的な緩衝剤成分には、それだけに限らないが、有機及び無機の塩、酸及び塩基が含まれる。

本明細書で使用される「乳化剤」という用語は、エマルションを、その速度論的安定性を増加させることによって安定化する物質のことである。この用語は、「表面活性物質」又は界面活性剤として知られる特定のクラスの乳化剤を含意する。

本明細書で使用される「微粒子」という用語は、０．３から１０００μｍ、又は０．３から７００μｍ、又は０．７から７００μｍ、又は０．３から２５０μｍの直径を有する粒子を指す。

本明細書で使用される「粒子」という用語は、体積又は質量などの幾つかの物性を有すると考えることのできる、局在した小さな物体を指し、詳細には、上に定義した微粒子がこれに含まれる。より詳細には、本発明の趣旨の範囲内では、粒子とは、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を指す。

本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、重合過程によって生じる繰返し構造単位からなる化学化合物、又は化合物の混合物を指し、この重合過程から、相対分子質量が高いという性質、及び付随的特性が生まれる。一般に、ポリマーを構成する単位は、実際に又は概念的に、相対分子質量の低い分子に由来する。薬物送達の目的には、ポリ−ラクチド（ＰＬＡ）、ポリ−グリコリド（ＰＧＡ）及び特にＰＬＧＡなどの熱可塑性脂肪族ポリエステルは、生体適合性及び生分解性が優れているため、有用なポリマーである。

本明細書で使用される「マトリックス」という用語は、ポリマーが形成することのある三次元構造を指す。マトリックスは、有効成分など別の分子を、その内部に捕捉するか又は有することができ、その場合この有効成分は、例えば長期間に渡って放出され得る。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、複数の各抗体分子の組成物であって、各抗体分子が、少なくとも重鎖及び軽鎖の一次アミノ酸配列においては同一である、上記組成物を指す。概ね「モノクローナル抗体」は複数の細胞によって産生され、前記細胞中で、同一の組合せの免疫グロブリン遺伝子によってコードされている。一般に「モノクローナル抗体」は、単一の原Ｂ細胞（ａｎｃｅｓｔｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ）に由来する抗体遺伝子を有する細胞によって産生される。

対照的に「ポリクローナル抗体」（単数又は複数）とは、複数の各抗体分子の組成物であって、各抗体分子が重鎖の一次アミノ酸配列においても、軽鎖の一次アミノ酸配列においても同一でない、上記組成物を指す。概ね「ポリクローナル抗体」は同じ抗原に結合するが、抗原の同じ部分、すなわち抗原決定基（エピトープ）、に結合するとは限らない。一般に「ポリクローナル抗体」は、複数の細胞によって産生され、前記細胞中で、異なる少なくとも２つの組合せの抗体遺伝子によってコードされている。

本明細書に開示する抗体は、対象とする「抗原」に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害を患う哺乳動物に抗体を投与すると、その哺乳動物で治療効果が生じ得る。しかし、ポリペプチドではない抗原に対する抗体も検討される。抗原はポリペプチドである場合、膜貫通分子（例えば受容体）、又はリガンド、例えば増殖因子若しくはサイトカインなどのことがある。本発明に包含される抗体の好ましい分子標的には、以下のものが含まれる：ＣＤポリペプチド、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５及びＣＤ１５４；ＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、例えばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、及びα又はβサブユニットのいずれかを含めたａｖ／ｂ３インテグリン（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ケモカイン及びサイトカイン又はそれらの受容体、例えばＩＬ−１α及びβ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７の各型、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＴＮＦα及びＴＮＦβ；増殖因子、例えばＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ポリペプチドＣ；Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ受容体；ＬＩＮＧＯ；ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ；ＯＰＧ；ＯＸ４０；ＯＸ４０−Ｌ；並びにＦｃＲｎ。

さらなる実施形態では、本発明は、本明細書のいずれか一実施形態のポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、標的化部分を付加するために前記粒子をさらに修飾する上記方法を提供する。本発明の趣旨の範囲内で好まれる標的化部分には、それだけに限らないが、ＰＥＧ、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ、抗体又はその断片、受容体結合ペプチド、又は上記の組合せが含まれる。前記標的化部分を加えるための方法は、使用しようとする特定の部分、標的組織又は細胞、及び標的化部分の所望の組合せに応じて異なることがある。

さらなる実施形態では、本発明は、動物、哺乳動物又はヒト対象を処置するための方法であって、本明細書に開示するいずれか一実施形態の、治療有効量の粒子又は医薬組成物を動物、特に哺乳動物又はヒト対象に投与するステップを含み、ここで、前記動物、哺乳動物又はヒト対象が、前記粒子又は医薬組成物での処置によって緩解し得る障害を有し、前記障害ががん、自己免疫性又は炎症性障害、例えば関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患などである上記方法を提供する。

上記疾患を処置するには、適切な投与量は、例えば、利用しようとする特定のタンパク質又は抗体、処置する対象、投与方式、並びに処置している状態の性質及び重症度に応じて異なるはずである。自己免疫疾患及び炎症性疾患を、本発明の粒子を用いて処置するための好ましい投与レジメンは、例えば、抗体を１μｇから１ｇの間の量で含む粒子を投与するステップを含む。

本発明のいずれかの一実施形態の粒子又は医薬組成物は、好ましくは皮下注射経路で投与する。本発明のいずれかの一実施形態の医薬製剤は、筋肉内注射によって投与してもよい。医薬組成物は、シリンジ、又は自動注入装置などの注射デバイスを使用して注射してもよい。注射しようとする医薬組成物は微粒子を、体積当たりの重量が１０から４０％の間、好ましくは体積当たりの重量が２０から３０％の間の濃度で含むことになる。

本明細書で使用される「ａ」又は「ａｎ」という規定は、１つ又は複数を意味することがある。本明細書及び請求項（単数又は複数）で使用される際、「ａ」又は「ａｎ」という語は、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語と共に使用される場合は、１つ又は２つ以上を意味することがある。

本明細書で使用される「ｏｒ」という用語の使用は、一方のみを指すことが明示されている、又は両方が相互排他的であることがない限り、「ａｎｄ／ｏｒ」を意味するが、本開示では、一方のみ及び「ａｎｄ／ｏｒ」を指す定義が支持される。

本発明の他の目的、特徴及び優位点は、以下の詳細な記述から明らかとなるはずである。しかし、詳細な記述及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、例示としてのみ提供されているという点は理解されたい。本発明の趣旨内及び範囲内の様々な変更及び改変が、当分野の技術者にとっては、この詳細な記述から明白となるはずだからである。

本明細書で引用される全参考文献には雑誌論文若しくは要旨、公表された若しくは未公表の米国特許出願若しくは外国特許出願、発行された米国特許若しくは外国特許又は他のあらゆる参考文献が含まれるが、引用される参考文献に示されている全データ、表、図及び文を含めたその全体が、参照によって本明細書に組み込まれている。さらに、本明細書で引用される参考文献で引用される参考文献の全内容も、参照によって全体が組み込まれている。

（例１）
材料
ＩｇＧをモデル分子として使用し、これは冷凍乾燥粉末としてＥｑｕｉｔｅｃｈ（カービル、ＵＳＡ）から購入された。ＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０４、ＲＧ５０５及びＲＧ７５５Ｓ。それぞれが５０：５０、５０：５０及び７５：２５のラクチド：グリコリド比によって特徴付けられる）、これはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（インゲルハイム、ドイツ）によって供給される、を生分解性ポリマーとして使用した。ｓ／ｏ／ｗ封入工程の間、酢酸エチル（ＥｔＡｃ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ディーゲム、ベルギー）を有機溶媒として使用した。封入効率の評価の間、ＭＣ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）を使用してＰＬＧＡを溶解した。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ただし８７〜９０％加水分解されたもの、とポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ディーゲム、ベルギー）とを安定剤として使用した。噴霧乾燥工程の間、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ディーゲム、ベルギー）の提供するマンニトール及びＬ−ヒスチジンを使用してＩｇＧを安定化した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ディーゲム、ベルギー）を利用してＩｇＧ溶液を緩衝化した。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＵＳＡ）を使用してＩｇＧを標識した。粒子は、空隙率が０．２μｍのナイロンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＵＳＡ）を使用して回収した。Ａｍｉｃｏｎ１５−３０Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＵＳＡ）を使用して、ダイアフィルトレーションを行った。

噴霧乾燥工程を用いたＩｇＧ微粒子の調製
３０％（ｗ／ｗ）マンニトール入り２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０中の、ＩｇＧ濃度が２５ｍｇ／ｍｌであるＩｇＧ水溶液を、Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ−ｄｒｙｅｒ Ｂ−１９０（Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、フラヴィル、スイス）、及び以前に最適化しておいた工程パラメータを用いて噴霧乾燥した。入口温度（Ｔｉｎ）及び液流速はそれぞれ１３０℃及び３ｍｌ／分に設定した。乾燥空気流速は３０ｍ^３／時間、微粒化流速は８００ｌ／時間に固定した。得られた出口温度（Ｔｏｕｔ）は８０℃だった。

ｓ／ｏ／ｗ型エマルション工程によるＩｇＧ微粒子のＰＬＧＡ粒子内への封入
ｓ／ｏ／ｗ型エマルション蒸発／抽出法を用いてＩｇＧを封入した。手短に言えば、室温において磁気撹拌しながら、ＰＬＧＡを１〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内でＥｔＡｃ５ｍｌに溶解させた。油中固体（ｓ／ｏ）型懸濁液は、Ｔ２５ ｄｉｇｉｔａｌ Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）高性能分散機（ＩＫＡ（登録商標）、シュタウフェン、ドイツ）を１３５００ｒｐｍの設定で使用し、ＩｇＧの噴霧乾燥粉末（ＳＤ ＩｇＧ）３０〜１５０ｍｇをＰＬＧＡ有機溶液に添加することによって形成した。この懸濁液は、ＰＶＡ又はＰＶＰなどの界面活性剤を０．１〜２％（ｗ／ｖ）含有する外部水相３０〜１００ｍｌに添加し、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）撹拌機を３４００〜１３５００ｒｐｍで使用してかき混ぜ続けた。最後にこのｓ／ｏ／ｗ型エマルションを、追加容量の水（１００〜４００ｍｌ抽出相）に添加して、最終のｓ／ｏ／ｗ型エマルションを製造した。生じたエマルションを大気圧下で３０分磁気撹拌し続けることで、ＥｔＡｃの抽出及び蒸発の両方が可能となった。このポリマーは水に不溶性なため、封入されたＩｇＧを含有する粒子が製造された。これは、水相中のＥｔＡｃを急速に抽出すると、ポリマーが速やかに固化するためである。粒子は濾過によって回収し、ミリＱ水で数回洗浄し、室温で４８時間減圧したままにした。

粒径及び形状の評価
ＩｇＧ：ＰＬＧＡ粒子及び噴霧乾燥（ＳＤ）ＩｇＧ微粒子の双方の粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｈｙｄｒｏ２０００Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、モールバーン、ＵＫ）を使用して３連で測定した。ＳＤ ＩｇＧ微粒子は、イソプロパノールに分散させた後にレーザー回折によって分析した。ＩｇＧ微粒子については１．５２の屈折率を用いた。ＰＬＧＡ粒子は、水及びＰＬＧＡについてそれぞれ１．３３及び１．５５の屈折率を用いて、分散媒とした水の中で分析した。粒径分布は、中位径ｄ（０．５）及びｄ（０．９）、それらを粒子のうちそれぞれ５０％及び９０％が下回る直径のことである、に関して評価した。

製造した粒子の形状を評価するために、Ｈｉｒｏｘ ＭＸＧ−５０４０ＲＺ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍを備えたＨｉｒｏｘ ＫＨ−７７００（Ｈｉｒｏｘ Ｃｏ Ｌｔｄ、東京、日本）を使用して光学顕微鏡観察を行った。粒子は蒸留水に再分散させ、ガラススライド上に置いた。

ポリマー粒子の表面形状及び内部空隙率は、環境室を備えたＰｈｉｌｉｐｓ（アイントホーフェン、オランダ）製のモデルＸＬ３０ ＥＳＥＭ−ＦＥＧの走査型電子顕微鏡を使用して観察した。この顕微鏡は電界放出銃を装着していた。画像は、１０ｋＶの加速電圧で二次電子（形状コントラスト）を使用して取得した。外部表面を観察するために、粒子を、接着性の導電支持体（炭素）に付着させた。断面が視野に入るようにし、内部空隙率の評価は、試料をエポキシ樹脂で被覆し、ミクロトームダイヤモンドナイフを用いて切断及び研磨した後に行った。

ＰＬＧＡ粒子内の薬物分布の評価
ＰＬＧＡ粒子内に位置するＩｇＧ分子の分布を、ＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート及び蛍光顕微鏡を使用して調べた。ＩｇＧの標識化は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの取扱説明書に記述されている詳細な方法を用いて行った［１８］。手短に言えば、ＤＭＦに溶解させた１５倍から２０倍モル過剰のＦＩＴＣを、５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ溶液（５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．５）に添加した。次に、過剰の加水分解されたＦＩＴＣは、暗所で室温にて１時間インキュベーションした後、２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６中の１０％（ｗ／ｗ）マンニトール及びＡｍｉｃｏｎ（登録商標）１５−３０Ｋ遠心フィルターデバイスを使用して、緩衝液交換により除去した。次にＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲートを噴霧乾燥し、得られたＩｇＧ微粒子７０ｍｇは、既に記述したｓ／ｏ／ｗ封入法を使用し、最適化された工程パラメータを用いて封入した。ＰＬＧＡ粒子内の薬物分布は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５５を使用し蛍光顕微鏡によって観察した。

ＩｇＧアッセイ及び安定性の評価
溶出試験、及び封入効率の評価のためには、ＩｇＧ単量体の定量、並びに凝集体及び断片の両方の含有量の評価を、ＵＶ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヴァルトブロン、ドイツ）を備えたＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ Ａｇｉｌｅｎｔ１１００を使用して、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により行った。６．０ｍｍのＩＤｘ４．０ｃｍの長さのＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇｕａｒｄｃｏｌ ＳＷＸＬ ５ガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧＭＢＨ、シュトゥットガルト、ドイツ）を備えた、７．８ｍｍのＩＤｘ３０．０ｃｍの長さのＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧＭＢＨ、シュトゥットガルト、ドイツ）を、流速は０．５ｍｌ／分、注入容量は２０ｍｌ、及び検出は２８０ｎｍで使用した。移動層はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．０５Ｍ、ｐＨ７．２から構成されていた。ＩｇＧの安定性は、単量体の損失の割合、これは封入ステップの前後での単量体の割合の差に相当する、を用いて評価した。ＩｇＧ単量体の濃度は、濃度の分かっているＩｇＧ冷凍乾燥粉末を用いて構築した検量線を使用して決定した。検出された化学種の分子量は、１３５０から６７０，０００ダルトンの範囲の分子量マーカーの冷凍乾燥混合物であるＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）を使用して決定した。

全ＩｇＧアッセイは、Ｓｏｌｏ ＶＰＥ光ファイバー（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ブリッジウォーター、ＵＳＡ）を装着したＶａｒｉａｎ（登録商標）５０ Ｂｉｏ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で、２８０ｎｍにおいてＵＶ分光光度法を用いて行った。

封入効率及び薬物担持率の評価
ＩｇＧのＰＬＧＡ粒子への薬物担持率は、組み込まれたＩｇＧの測定量と、ＰＬＧＡ、並びに抗体及び不活性物質の双方を含有した噴霧乾燥ＩｇＧの総量との間の比である。ＥＥ％とは、最初に有機相に導入したＩｇＧの量と比較した、粒子内に検出されるＩｇＧの量を指す。５〜２０ｍｇのＩｇＧ：ＰＬＧＡ粒子を、７５０μｌのＭＣと接触するように配置して、ポリマーを溶解させる。ＩｇＧは、ＰＢＳ（４ｘ７５０μｌ）を使用し、８８００ｒｐｍで１５分間遠心分離することでさらに抽出した。水相を採取し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって、薬物担持率、ＥＥ％及び安定性を評価するために分析した。封入していないＩｇＧ冷凍乾燥粉末では、完全に回収されること、及び分解のないことは以前に確かめてあった。

溶出試験
ＩｇＧ：ＰＬＧＡ粒子からのＩｇＧの溶出プロファイルは、２ｍｌエッペンドルフ（登録商標）チューブ内の粒子３０ｍｇにＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．２を１ｍｌ添加することによって評価した。チューブを３７℃でインキュベートし、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｎｆｏｒｔ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ、ハンブルク、ドイツ）を使用して６００ｒｐｍで撹拌した。所定の時点において試料を１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清（１ｍｌ）を採取し、０．２μｍのＨＤＰＥ Ｍｉｌｌｅｘフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、英国）で濾過した。粒子は、新しいＰＢＳ溶液に懸濁した。放出されたＩｇＧの割合を次にＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。バースト効果は、１日後に放出されたＩｇＧの割合とした。

実験デザイン
ｓ／ｏ／ｗ封入工程における８通りの、工程及び製剤に関する変数の主な効果を検討した。試験した要因は、有機相中のＰＬＧＡ濃度、外部相中の安定剤濃度、外部相の体積、ｓ／ｏ／ｗ型乳化時間、ｓ／ｏ／ｗ型乳化速度、抽出相の体積、及び外部相安定剤の種類である。次に噴霧乾燥ＩｇＧの量も評価した。選択した出力は、粒径、薬物担持率、封入効率、溶出プロファイル、並びに封入工程及び溶出の間のＩｇＧの安定性だった。

選択した要因の主な効果を評価するために、８通りの製剤、及び中心点の３回の反復（３ ｃｅｎｔｅｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｏｆ ｐｏｉｎｔｓ）（製剤１から製剤１１）を用いたスクリーニングデザインを、バージョン８．０．２のＪＭＰ統計ソフトウェア（ＳＡＳ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して構築した。スクリーニングデザインは次に製剤（製剤１２から製剤３４）を追加することで完結として、有機溶媒中のＰＬＧＡ濃度、ｓ／ｏ／ｗ型乳化速度、ｓ／ｏ／ｗ型乳化時間、及び有機相中に分散されたＳＤ ＩｇＧの量の二次交互作用及び二次効果を評価した。これらの入出力関係に基づいた数理モデルを、スクリーニングデザイン及び拡張デザインの双方について構築した。調べたパラメータの効果は、最小二乗法を用いて決定した。

結果
前段落に明記した試験済み要因の効果を様々な出力特徴について評価した。評価した製剤を下の表１に要約する：

評価した製剤の結果は下の表２に詳細を示す：

（例２）
前の例と同様に、ＴＮＦ−アルファに対するモノクローナル抗体のＣＤＰ５７１を含有する微粒子製剤を、同じ方法に従って調製した。

手短に言えば微粒子を、体積当たりの重量（ｗ／ｖ）濃度が１０％のＰＬＧＡ、１％（ｗ／ｖ）の安定剤、及び追加の外部相１００ｍｌを使用して上記の工程により調製した。この混合物は、１３５００ｒｐｍで１分間撹拌することによって乳化させ、追加の抽出容量４００ｍｌを用いた。安定剤、緩衝液及びＰＬＧＡについて種々の条件をアッセイした。続いて凍結乾燥工程を用いてＣＤＰ５７１微粒子を製造した。図１０は、ＣＤＰ５７１含有微粒子製剤を得るために使用するＰＬＧＡの種類を変化させたことによる、タンパク質放出への影響に関する分析を示す。

（例３）
微粒子を上記の工程によって調製したが、ここで抗ＴＮＦαモノクローナル抗体は、１０％（ｗ／ｖ）ＰＬＧＡ（５０：５０及び７５：２５のラクチド：グリコリド比によってそれぞれが特徴付けられるＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０５又はＲＧ７５５Ｓ）を使用して理論的な薬物担持率が１７．４％になるように封入した。ｓ／ｏ型分散剤を、１％ｗ／ｖのポリビニルアルコールを含有する水溶液に添加し、かき混ぜ続けた。水で洗浄後、濾過した微粒子を２０℃で減圧下に乾燥し、５±３℃、２５±２℃／６０％相対湿度及び４０±２℃／７５％相対湿度の閉じたバイアル内に、１２週間まで入れておいた。

粒径は、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｈｙｄｒｏ２０００Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して測定した。表面形状は、環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）によって評価した。薬物担持率及び封入効率（ＥＥ％）は、ＰＬＧＡ微粒子をＤＣＭに浸し、ＰＢＳ緩衝液で抽出した後に、２８０ｎｍでのＵＶ分光光度法を用いた全ＭＡｂアッセイによって評価した。高分子量種（ＨＭＷＳ）のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定した。ＰＬＧＡ微粒子からのｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ溶出プロファイルは、ＰＢＳ緩衝液中で３７℃においてかき混ぜながらインキュベーションすることによって評価した。結合能は、９６ウェルプレート上に固定したＴＮＦアルファを使用し、ＥＬＩＳＡテストによって決定した。抗体の相対的な抗ＴＮＦ活性は、バイオアッセイ（細胞毒性中和アッセイ）によって測定した。

微粒子の体積直径（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）は、５℃及び２５℃で１２週間保存した場合、安定だった。対照的に、体積直径は、４０℃で６週間保存後、特にＲＧ５０５微粒子（６９．３μｍから２９１．１μｍ）で、またそれ程ではないがＲＧ７５５Ｓ微粒子（３８μｍから６０μｍ）で増加した。凝集は、５℃で１２週間保存したＲＧ５０５微粒子又はＲＧ７５５Ｓ微粒子のいずれについても、ＥＳＥＭでは観察されなかった。４０℃では、合体したＲＧ５０５微粒子が観察された。凝集は、５℃又は４０℃のいずれで保存した後もＲＧ７５５Ｓ微粒子では観察されなかった。

高分子量種（ＨＭＷＳ）含有量は、２５℃で保存した場合に経時的に増加し、４０℃ではさらに早く増加した（図１１）。抗体の結合能は、ＲＧ７５５Ｓ微粒子に封入した場合、保存の際も、溶出の間も変化しなかった。４０℃で４週間保存したＲＧ５０５微粒子から、４週間のインキュベーション後に放出された抗体は、１時間溶出させた後のＴ０において測定された（１０８±１２）％に比べ、（６７±１２）％の相対的結合能を示した（図１２）。ＲＧ５０５及びＲＧ７５５Ｓ微粒子から放出された抗体の抗ＴＮＦ活性は、封入工程及び保存を通じて保持されていた。

抗体担持率（％）は、ＲＧ７５５Ｓ微粒子でより一層安定なようであった（図１３）。４０℃で４週間の後、抗体含有量が減少するのが見られた。抗体の量の減少は、ＲＧ７５５Ｓを使用した場合には小さくなった。これはこのポリマーが、より高いラクチド：グリコリド比、ひいてはより遅い酸分解速度を特徴としていたからである。

溶出試験では、調製したばかりの微粒子から、４週間のテスト後に放出された含有抗体量は、ＲＧ７５５Ｓ微粒子（４７．０±０．６％）よりもＲＧ５０５微粒子（８４．９±９．８％）で高かった。５℃では、１２週間の保存の前後で両微粒子の間に放出プロファイルの差は観察されなかった。２４時間放出後に評価したバースト効果は、保存の期間及び温度とともに増加し、検出値は４０℃で６週間の後に最大であった（図１４）。

（例４）
ｉｎ ｖｉｖｏの環境下における本発明の微粒子の挙動を、ラットで５０ｍｇ／ｋｇのＣＤＰ５７１を単回皮下投与し、抗体の血漿ｐＫプロファイルを評価することによって分析した。

既に記述したように調製した、約３０％（ｗ／ｗ）トレハロース入り２０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０緩衝液中の、ＣＤＰ５７１濃度が４０ｍｇ／ｍＬであるＣＤＰ５７１水溶液を、噴霧乾燥した。次に、ＣＤＰ５７１担持Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０５微粒子を４バッチ、及びＣＤＰ５７１担持Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ７５５Ｓ微粒を４バッチ製造し、０．５％（ｗ／ｖ）トレハロース溶液１ｍＬに再懸濁後、凍結乾燥した。

ＲＧ５０５及びＲＧ７５５Ｓ微粒子の薬物担持率は、１０．０±０．０３％（ｗ／ｗ）及び１２．５±０．２％（ｗ／ｗ）と測定された。投与直前に凍結乾燥微粒子を、適切な体積の水に再懸濁して、１５％（ｗ／ｖ）懸濁液を調製した。抗体の投与量を５０ｍｇ／ｋｇとするために投与すべき容量は、ＲＧ５０５及びＲＧ７５５Ｓ微粒子についてそれぞれ３．３ｍＬ／ｋｇ及び２．７ｍＬ／ｋｇだった。

ｐＨ６．０でトレハロース及びヒスチジンを含有する２０ｍｇ／ｍＬのＣＤＰ５７１溶液を比較対照として使用し、２．５ｍＬ／ｋｇで投与した。

テストした製剤は、２２Ｇ針の１ｍＬシリンジを使用して注射した。各群で、テスト製剤を右側腹部に皮下注射した。それぞれのプラセボ対照は、左側腹部に皮下注射した。試験の終了時に注射部位の皮膚（対照及びテスト）を採取し、組織学的検査のために調製した。

血漿中濃度分析には、血液試料を尾静脈からヘパリンリチウム上に採取し、遠心分離して血漿を分離した。血漿試料は−９０℃で保存した。ＣＤＰ５７１の血漿中濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。

対応するプラセボ製剤は対照として、同じラットの反対の脇腹に注射した。

図１５で観察できるように、ＣＤＰ５７１血漿中濃度の経時プロファイルから、微粒子は抗体含有溶液に比べた場合、より高い血漿レベルを７週間に渡って維持できることが示された。

ＣＤＰ５７１含有微粒子では、抗体の血漿レベルのプロファイルは、投与して６時間から１週間以内にピークを迎える形で初期に上昇を示し、それに続いて、分析した６週間の期間に渡って若干の減少を示すものとなった。

一方、ＣＤＰ５７１溶液を皮下投与した後には、最大血漿中濃度は４８時間後に観察され、この後ＣＤＰ５７１濃度は経時的に減少し、投与後４週ではもはや検出できなかった。

いずれのＰＬＧＡ製剤も、類似したＣｍａｘ（ＲＧ５０５及びＲＧ７５５Ｓ微粒子それぞれについて２９．０±１３．４及び３０．３±６．９９μｇ／ｍＬ）を特徴とし、これはＣＤＰ５７１溶液について算出されたＣｍａｘ（１１２．０±１４μｇ／ｍＬ）よりも低い。Ｃｍａｘは、ＥＬＩＳＡによって決定されるＣＤＰ５７１の最大血漿中濃度である。さらに、ＣＤＰ５７１の抗ＴＮＦ活性を、異なる３つの製剤を投与した後４８時間及び１週間後に採取した血漿試料で評価した。

各試料のＣＤＰ５７１の力価は、ＷＨＩ１６４細胞を使用するＴＮＦ−アルファ細胞毒性中和アッセイからなるバイオアッセイを用いて決定した。ＥＣ_５０値は、細胞生存率を抗体濃度に対してプロットした用量反応曲線から、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（登録商標）ソフトウェアの補助により算出した。この値は、観察された最大の中和効果の５０％を誘導した、抗体の濃度を表す。血漿試料は、溶液中のＣＤＰ５７１、又は本発明のいずれかの微粒子中のＣＤＰ５７１を皮下投与した後４８時間及び１週間の時点で採り、ＥＣ_５０を３つのテスト群について評価した。得られた値は３４から５４ｎｇ／ｍＬの範囲で、これを基準値５６ｎｇ／ｍＬと比べると、抗体の抗ＴＮＦ−アルファ活性が皮下投与後に維持されていたことが確認された（図１６）。この基準値は、溶液中の完全な状態の、すなわちｉｎ ｖｉｖｏで投与されていないＣＤＰ５７１について、ＥＣ_５０を算出することによって得た。

最後に、抗体投与により炎症応答が生じる可能性について分析するために、種々のラット試験由来の組織試料を１０％ホルマリンで固定し、切片をパラフィンに浸し、ミクロトームを使用して切出した。ＰＬＧＡ微粒子の炎症効果は、組織学的検査により、ヘマトキシリン及びエオシン染色を用いて決定した。

ポリマー微粒子又は生物学的化合物のいずれかを投与した後に、表皮と真皮との間での血漿浸潤、又は真皮へのリンパ球浸潤の起きた証拠はなかった。ポリマー微粒子又は対照の投与によって免疫細胞の数が影響を受けたふうでもなかった。同一のプロファイルが、処置したラット又は対照ラットのいずれでも観察された。さらには皮膚構造の改変の証拠もなく、例えば、表皮の厚さは変化していなかった。巨視的には、発赤、浮腫、局所熱感の増加などの炎症の顕著な証拠は、テストしたいずれのラットの注射部位にも、また投与したいずれの製剤についても観察されなかった。したがって、ＰＬＧＡ微粒子はその直ぐ近傍に炎症応答を生じなかったと結論された。

参考文献一覧
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［７］ Ｔ． Ｋｉｓｓｅｌ， Ｓ． Ｍａｒｅｔｓｃｈｅｋ， Ｃ． Ｐａｃｋｈａｕｓｅｒ， Ｊ． Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒｓ ｅｔ Ｎ． Ｓｅｉｄｅｌ， 《Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｄｅｐｏｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，》 ｃｈｅｚ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｖｏｌ． ９９−１２２， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｉｍｏｎ Ｂｅｎｉｔａ， Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， ２００５．

Claims (15)

1. ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、
   ａ）タンパク質を含む溶液からタンパク質を固化させるステップ、
   ｂ）固化したタンパク質を、ポリマーマトリックスを含む溶媒と合わせるステップ、
   ｃ）ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む溶媒を、水中で乳化剤と合わせるステップ、
   ｄ）ポリマーマトリックス、タンパク質及び乳化剤を含む溶媒をかき混ぜるステップであって、それによりエマルションを形成する上記ステップ、
   ｅ）ポリマーマトリックス及びタンパク質を含むエマルションを水と合わせるステップであって、それにより粒子を形成させる上記ステップ、並びに
   ｆ）粒子を回収するステップ
   を含む上記方法。
2. ポリマーが、混合されたＤ，Ｌ−乳酸及びグリコール酸のコポリマー、又はＬ−乳酸及びグリコール酸のコポリマーである、請求項１に記載の方法。
3. コポリマー内の、Ｄ，Ｌ−乳酸又はＬ−乳酸のグリコール酸に対する比が７５：２５である、請求項２に記載の方法。
4. 溶媒が酢酸エチルである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
5. 溶媒がポリマーマトリックスを、体積当たり重量が１％から２０％の濃度で含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. 乳化剤がポリビニルアルコールである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
7. 乳化剤が水中にあって体積当たり重量が０．０５％から３．０％の濃度である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
8. 水の体積は、有機溶媒：水の体積比が１：２６から１：１００である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
9. エマルションを形成するためにかき混ぜる前記ステップが、３４００ｒｐｍから１３５００ｒｐｍで撹拌することによって実行される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
10. 溶媒を抽出するためにかき混ぜる前記ステップが、少なくとも３０分間実行される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
11. タンパク質が抗体である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
12. 粒子が濾過によって回収される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
13. 粒子が、回収後に少なくとも１時間真空下で乾燥されるか、又は凍結乾燥によって乾燥される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によって得ることのできる、前記ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子。
15. 請求項１４に記載の粒子を含む医薬組成物。