JP2016519152A - 治療用タンパク質を含む粒子を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法に関する。
Description
本発明は、医薬製剤の分野におけるものである。より詳細には、本発明は、抗体などの治療用タンパク質を含む微粒子を製造するための方法に関する。
治療、診断又は予防目的、例えばワクチン接種などのための分子の標的化放出及び/又は制御放出は、従来の、治療剤、診断剤又はワクチンの投与に比べ、利点をもたらす可能性があるので、広く検討されている。タンパク質などの高分子、例えば抗体又はポリヌクレオチドの標的化放出及び/又は制御放出は、際立った技術上の難題の1つである。
多くの場合、動物又はヒトでの治療、診断又は予防用途(例えばワクチン接種)に有用な、抗体などのタンパク質は、効力を生ずるには高用量で投与しなければならない。ワクチン、抗体、又は他の治療用若しくは診断用タンパク質は一般に、動物又はヒトに非経口的に投与しなければならない。このようなタンパク質は通常、例えば静脈内、皮下又は筋肉内などに注射する必要がある。したがって、長期間、例えば数日、数週又は数ヶ月に渡って制御されながら放出されるデポー製剤は、頻繁な注射を回避するのに必要であり、要求された投与計画へのコンプライアンスを高める。
承認された治療用抗体及び他のタンパク質治療剤の医薬製剤は通常、抗体などのタンパク質の制御放出には向かない。抗体又は他の治療用タンパク質の制御放出製剤は、投与頻度の低下を可能にする目的で望ましく、投与頻度の低下により、注射の必要性が低減され、患者のコンプライアンスが向上する。したがって当技術分野では、抗体又は他のタンパク質治療剤の制御放出をもたらす医薬製剤を提供することが、必要とされている。
分子の標的化放出及び制御放出をin vivoで実現する方法の1つは、ナノ粒子又は微粒子などの粒子の使用によるものである。これらの粒子は、経口経路及び非経口経路を含めた様々な経路で投与することができる。粒子を例えば吸入させることもできるし、例えば静脈内、皮下又は筋肉内などに注射することもできる。
粒子が、動物又はヒトでのin vivoの用途に有用であるには、生分解性及び生体適合性でなければならない。この20年間、合成生分解性ポリマーが、低分子薬物を送達するためのキャリア又は微粒子若しくはナノ粒子として使用されてきた[1]。ポリ−ラクチド[PLA]、ポリ−グリコリド[PGA]及び特にポリ(D,L−ラクチド−co−グリコリド)[PLGA]などの熱可塑性脂肪族ポリエステルは、その生体適合性及び生分解性が優れていることから大変な関心を集めてきた。粒子、マイクロカプセル、ナノ粒子、ペレット、植込錠、及び薄膜など種々のポリマー薬物送達システムが、種々の治療薬を送達するために、これらのポリマーを使用して製造されている。これらのポリマー薬物送達システムは、薬物送達用途に関してFDAにより承認されてもいる。
PLA又はPLGAベースの粒子は、例えば、ポリ(エチレングリコール)[PEG]又はタンパク質などの標的化部分を付加することによってさらに修飾することもできる。この種の粒子の主な限界の1つは、血漿タンパク質が微粒子に非特異的に吸着してしまうことである。血漿タンパク質の吸着は、微粒子の臓器分布を説明する主要な要因の1つと考えられる。例えば、特定のタンパク質の存在は、細胞膜受容体との特異的又は非特異的相互作用を介した、一部の細胞による取込みを促進することが知られている。したがって、この効果を抑制するために様々な修飾戦略が進められた。PLGA粒子のPEGによる修飾は、タンパク質吸着を低減するための重要且つよく知られたアプローチである。別の選択肢は、官能化ポリ(L−リシン)−g−ポリ(エチレングリコール)(PLL−g−PEG)を介して官能基をPLGA微粒子に導入し、こうして、タンパク質吸着の強く低減されたPLGA微粒子を製造することであった[2]。
粒子を修飾する別の根本的目的は、所望の治療効果を実現するために、体内の所望の組織又は細胞型に前記粒子を標的化することである。所望の標的細胞に有効成分を特異的に送達すると、有効性を増大することだけでなく、この活性成分が様々な組織に与える望ましくない効果に由来する副作用を低減することも、可能になる。これは、様々な標的化部分、例えば抗体、その断片、又は受容体標的化ペプチドを使用して実現できる。例えば、抗体及び受容体標的化ペプチドのいずれも、皮下注射後に効果的に、PLGA粒子を樹状細胞へと優先的に標的化することが示されている[3]。
ポリマーマトリックスベースの粒子、特にPLA、PGA又はPLGAをベースとする粒子の、従来の薬物送達システムに対する優位点には、その生体適合性及び生分解性に加え、数日、数週又は数ヶ月に及ぶ徐放性が含まれる。しかし、これらのポリマーマトリックスの使用は、抗体などのタンパク質との関連で問題があることが指摘されてきた。これは、主としてタンパク質の分解の酸触媒的性質のために、調製中及び保存中のその安定性に対する負の効果がこれらのポリマーマトリックスにはあるようだからである。加えて、ポリマーマトリックス薬物送達ビヒクルの製造の際に用いられる処理条件には、タンパク質二次構造に対し有害な効果がある[4]。
PLA、PGA又はPLGAなどのポリマーマトリックスをベースとする粒子を生成するには、複数のステップが必要とされ、複数のパラメータが関与する。タンパク質、例えば抗体を含む、ポリマーマトリックスベースの粒子は、タンパク質、及び抗体などの大きなタンパク質の複雑性及びそれ固有の不安定性により、製造が特に難題となる。タンパク質及び抗体は、ポリマーマトリックスベースの粒子を形成する工程の間に不活性化する傾向がある。
PLGAベースの粒子を製造するために、幾つかの方法が用いられてきた。最も一般的な方法は、乳化−溶媒蒸発法を採用している。この方法では疎水性薬物の場合、ポリマー及び活性分子(例えば、予防、予後予測、診断又は治療用の分子)の双方を、塩化メチレンなどの有機溶媒に溶解してエマルション油を形成する。続いて水と、ポリビニルアルコール(PVA)又はポリビニルピロリドン(PVP)などの乳化剤とをポリマー溶液に添加することによって、水(w)中のエマルション油(o)、すなわちo/wを次に調製する。超音波処理又は均質化処理によって粒子を誘導し、粒子を製造するために次に溶媒を蒸発させるか又は次に抽出する。タンパク質などの親水性薬物の場合、ポリマーは有機溶媒に溶解し、活性分子は水相に溶解し、ここから第1の水−油エマルションを調製する。次に水及び乳化剤を添加して、二重の水中油中水型エマルション(w/o/w)を生成する。次にこの第2のエマルションから粒子を誘導し、溶媒を後で蒸発させるか又は抽出して、粒子を得る。
水/溶媒界面でのタンパク質吸着及び変性は、マイクロカプセル封入工程の間に起きるタンパク質生理活性減少の主要因の1つである。水中油中水(w/o/w)法で油中水(w/o)型エマルションを形成する間に主に起きるタンパク質変性を回避するために、水中油中固体(s/o/w)法が開発された[5]。実際、固体においてタンパク質は、劇的にコンホメーションの可動性を低減することによってその生理活性を維持すると考えられる。s/o/w法では、油中固体(s/o)型一次懸濁液を生成するために、固体タンパク質粒子を分散させてある有機溶媒にポリマーを溶解させる。この懸濁液は次に、PVA又はPVPなどの乳化剤を含有する水相に添加して、s/o/w型エマルションを形成する。生じたエマルションを次に撹拌し続けることで、有機溶媒の抽出及び蒸発の両方、並びに続く粒子の回収が可能となる。
s/o/w法の核心の1つは、タンパク質粒子の微粒子化、すなわちこれらの固体粒子の平均直径を低減することであり、微粒子化法には、冷凍乾燥、噴霧乾燥及び噴霧凍結乾燥が含まれる[6]。凍結乾燥としても知られる冷凍乾燥は、物質を凍結し、次いで周囲圧力を下げて、物質中の凍結水を固相から気相に直接昇華させることによって進む脱水工程である。一方、噴霧乾燥は、熱ガスで急速に乾燥させることによって、液体又はスラリーから乾燥粉末を製造する方法である。この加熱した乾燥媒体は空気だが、液体がエタノールなどの可燃性溶媒であるか又は生成物が酸素感受性である場合は、窒素を使用する。最後になるが、噴霧凍結乾燥は手短に言えば、極低温ガス又は極低温液体中へと液体溶液を微粒化することからなり、ここで、生じた液滴は瞬時に凍結し、続いて氷は凍結乾燥時の低温低圧で昇華する。
噴霧乾燥には、低い回収率、並びに熱及び物理的ストレスによるタンパク質変性及び凝集のリスクなどの問題があるにも関わらず、実際は、タンパク質微粒子を製造するために一般に用いられるのはこの方法である。
治療用タンパク質一般の、特に抗体の高いコストを考慮すると、この工程の間、高いタンパク質担持率及び高い封入効率が決定的なパラメータである。封入効率(EE%)とは、最初に有機相に導入した活性分子の量と比較した、微粒子内に検出される活性分子の量を指す。一方、タンパク質担持率とは、微粒子内にある活性分子の量を、一般には重量比で表したものを指す。
さらに、注射による投与などの特定の用途には、注射可能な粒子の平均直径が、注射するのに十分な小ささでなければならない。通常、22〜25ゲージの針(内径394〜241μm)を、静脈注入並びに筋肉内注射及び皮下注射に使用する。したがって、250μm未満、理想的には125μm未満の平均直径により特徴付けられる粒子が、個体への投与に適していると考えられる。タンパク質送達のための総表面積は粒径に依存することから、粒径及びその分布も、タンパク質放出速度における重要な要因である[7]。
当技術分野では、抗体、又は他の治療、診断若しくは予防用タンパク質を含む、ポリマーマトリックスベースの粒子を製造するための改良された方法を提供することが必要とされている。当技術分野では、制御放出するための抗体、又は他の治療、診断若しくは予防用タンパク質を含む、改良されたポリマーマトリックスベースの粒子が必要とされている。当技術分野では、封入効率を増加させたポリマーマトリックスベースの粒子を製造するための改良された方法を提供して、商業的に立ち行くコストでそのような粒子を製造できるようにすることが必要とされている。
本発明の目的の1つは、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法を提供することである。
一実施形態では、本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、タンパク質を含む溶液から前記タンパク質を固化させるステップ、固化させた前記タンパク質を、ポリマーマトリックスを含む溶媒と合わせるステップ、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含む溶媒を乳化剤と合わせるステップであって、それにより水中でエマルションを安定化する上記ステップ、エマルションを形成するために、前記ポリマーマトリックス、前記タンパク質及び前記乳化剤を含む溶媒をかき混ぜるステップ、粒子を形成させるために、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含むエマルションを水と合わせるステップ、並びに前記粒子を回収するステップを含む上記方法を提供する。
本発明の方法の別の実施形態では、固化は噴霧乾燥によって実行する。
本発明の方法の別の実施形態では、前記ポリマーは、混合されたD,L−乳酸及びグリコール酸のコポリマー、又はL−乳酸及びグリコール酸のコポリマーである。
本発明の方法の別の実施形態では、前記乳化剤はポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンである。
さらなる実施形態では、安定剤はプロリン、ヒスチジン、グルタミンなどのアミノ酸であっても、代わりにスクロース若しくはトレハロースなどの糖であっても、又はマンニトール、マルチトール若しくはソルビトール若しくは上記の任意の組合せなどのポリオールから形成される群から選択してもよい。
本発明の方法の別の実施形態では、前記ポリマーマトリックスを含む溶媒は酢酸エチルである。
別の実施形態では、前記タンパク質は抗体である。
本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための新規の方法を提供することによって、上に特定した必要性に対処する。ポリマーマトリックスと、動物及びヒトでの予防、診断、予後予測又は治療用途に適した抗体などのタンパク質とを含む粒子をさらに提供する。本発明は、ポリマーマトリックスと、例えば皮下又は筋肉内などに注射することによって、動物又はヒトに投与するのに適した抗体などのタンパク質とを含む粒子も提供する。
驚くべきことに本発明者らは、水中油中水(w/o/w)法で油中水(w/o)型エマルションを形成する間に主に起きるタンパク質変性は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための本発明の水中油中固体(s/o/w)法を用いることによって回避できることをついに見出した。
本発明の目的の1つは、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法を提供することである。
第1の実施形態では、本発明は、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、タンパク質及び安定剤を含む溶液から前記タンパク質を固化させるステップ、固化させた前記タンパク質を、ポリマーマトリックスを含む溶媒と合わせるステップ、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含む溶媒を、水中で乳化剤と合わせるステップ、エマルションを形成するために、前記ポリマーマトリックス、前記タンパク質及び前記乳化剤を含む溶媒をかき混ぜるステップ、粒子を形成させるために、前記ポリマーマトリックス及び前記タンパク質を含むエマルションを水と合わせるステップ、並びに前記粒子を回収するステップを含む上記方法を提供する。
本発明の第2の実施形態では、タンパク質固化は、タンパク質及び安定剤を含む水相を噴霧乾燥するステップを含む。別の選択肢では、本発明のタンパク質固化は、タンパク質及び安定剤を含む水溶液からのタンパク質沈殿を含む。前記安定剤はプロリン、ヒスチジン、グルタミンなどのアミノ酸であっても、代わりにスクロース若しくはトレハロースなどの糖であっても、又はマンニトール、マルチトール若しくはソルビトールなどのポリオールから形成される群から選択してもよい。別の選択肢としては、上記のありとあらゆる種類の安定剤の組合せを使用することができる。活性タンパク質水溶液に安定剤を、タンパク質の重量当たりの安定剤の重量が10から50%の間、好ましくは20から30%の間の量で添加することができる。前記水溶液は典型的には、15から75mg/mlの間、好ましくは25から50mg/mlの間の濃度のタンパク質を含有する。本発明のタンパク質固化では、例えばタンパク質を他の分子に囲まれた状態で維持することなどによってタンパク質を環境から隔てる粒子が、前記固化によって生じる必要はない。したがって特定の一実施形態では、タンパク質及び安定剤を含有する前記溶液は、固化工程で前記タンパク質を粒子に封入できるように、本質的に両親媒性分子を含まない。
本発明の第3の実施形態では、第1又は第2の実施形態の方法において、前記ポリマーは、混合されたD,L−乳酸及びグリコール酸のコポリマー、又はL−乳酸及びグリコール酸のコポリマーである。
本発明の第4の実施形態では、第1、第2又は第3の実施形態の方法において、前記コポリマー内の、D,L−乳酸又はL−乳酸のグリコール酸に対する比が50:50から85:15の間、好ましくは75:25である。
本発明の第5の実施形態では、第1、第2、第3又は第4の実施形態の方法において、理論上のタンパク質担持率は、重量当たりの重量が5%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、20%又は25%を超えない。理論上のタンパク質担持率は、好ましくは、元の全粒子成分の重量当たりの重量が1%から25%、3%から20%、最も好ましくは5%から15%であり、ただしここで100%には、ポリマーと、界面活性剤と、タンパク質と安定剤と、さらに製剤に含まれる場合には添加剤との合計重量が含まれる。
本発明の第6の実施形態では、第1、第2、第3、第4又は第5の実施形態の方法において、前記溶媒は塩化メチレン又は酢酸エチルである。
本発明の第7の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5又は第6の実施形態の方法において、前記溶媒は前記ポリマーマトリックスを、体積当たりの重量が1%から20%、2%から17.5%又は5%から15%の濃度で含む。
本発明の第8の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6又は第7の実施形態の方法において、前記乳化剤はポリ(エチレングリコール)[PEG]ではない。
本発明の第9の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7又は第8の実施形態の方法において、前記乳化剤はポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンである。
本発明の第10の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8又は第9の実施形態の方法において、前記乳化剤は水中にあって体積当たりの重量が0.01%から10%、0.025%から5.0%、0.05%から3.0%、0.1%から2.5%、0.1%から2.0%、0.1%から2.0%の濃度である。
本発明の第11の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9又は第10の実施形態の方法において、水の体積は、有機溶媒:水の体積比が1:25から1:150の間、好ましくは1:26から1:100の間である。
本発明の第12の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10又は第11の実施形態の方法において、エマルションを形成するための前記かき混ぜは、3000rpmから14000rpm、3200rpmから13800rpm、3400rpmから13500rpm、又は5000rpmから13500rpmで撹拌することによって実行される。
本発明の第13の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11又は第12の実施形態の方法において、エマルションを形成するための前記かき混ぜは、少なくとも5分間、少なくとも20分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、2時間、3時間又は4時間実行される。エマルションを形成し、続いて有機溶媒を抽出し、蒸発させるための前記かき混ぜは、5分間から1時間の間、5分間から40分間の間、好ましくは30分間実行される。
本発明の第14の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12又は第13の実施形態の方法において、前記タンパク質は抗体である。
本発明の第15の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13又は第15の実施形態の方法において、前記粒子は濾過又は遠心分離によって回収される。
本発明の第16の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13又は第15の実施形態の方法において、前記粒子は、15℃から35℃、好ましくは20℃から25℃で、回収後に20分間から24時間真空下で乾燥されるか、又は前記粒子は凍結乾燥される。
本発明の第17の実施形態では、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第15又は第16の実施形態の方法において、前記方法は、標的化部分を前記粒子に付加するステップをさらに含む。標的化部分は、好ましくは、ポリ(エチレングリコール)[PEG]、ポリ(L−リシン)−g−ポリ(エチレングリコール)(PLL−g−PEG)、抗体若しくはその断片、受容体標的化ペプチド、又は上記の任意の適切な組合せから選択される。
本発明の第18の実施形態は、いずれか一実施形態の方法によって得ることのできる、前記ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子である。
本発明の第19の実施形態は、医療に使用するための、第18の実施形態の粒子である。
本発明の第20の実施形態は、診断剤として使用するための、第18の実施形態の粒子である。
本発明の第21の実施形態は、第18の実施形態の粒子を含む医薬組成物である。
本明細書で使用される「抗体」(単数又は複数)という用語は、モノクローナル又はポリクローナル抗体を指す。本明細書で使用される「抗体」(単数又は複数)という用語には、それだけに限らないが、当技術分野で知られる組換え技術によって作製した組換え抗体が含まれる。「抗体」(単数又は複数)には、任意の種、特に哺乳動物種の以下のような抗体が含まれる:IgA1、IgA2、IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE及びIgM及びそれらの改変変異体を含めた、任意のアイソタイプのヒト抗体、非ヒト霊長類の抗体、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザル由来の抗体;げっ歯類の抗体、例えばマウス、ラット若しくはウサギ由来の抗体;ヤギ若しくはウマ抗体;並びにラクダ科動物の抗体(例えば、ナノボディ(商標)などのラクダ又はラマ由来の抗体)及びその派生物;又はニワトリ抗体などの鳥類種の抗体、若しくはサメ抗体などの魚類種の抗体。「抗体」(単数又は複数)という用語は、少なくとも1つの重鎖抗体配列及び/又は軽鎖抗体配列の第1の部分が第1の種に由来し、重鎖抗体配列及び/又は軽鎖抗体配列の第2の部分が第2の種に由来する「キメラ」抗体も指す。本明細書で対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル)に由来する可変ドメインの抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体に由来する配列を含むキメラ抗体のことである。ヒト化抗体は概ね、レシピエントの超可変領域に由来する残基を、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域[又は相補性決定領域(CDR)]であって、所望の特異性、親和性及び活性を有する上記超可変領域に由来する残基によって置換してあるヒト抗体(レシピエント抗体)である。大半の例では、ヒト(レシピエント)抗体における、CDRの外の、すなわちフレームワーク領域(FR)内の残基もさらに、対応する非ヒト残基によって置換する。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行う。ヒト化すると、非ヒト抗体のヒトでの免疫原性が低減され、したがって抗体を容易に、ヒト疾患の処置に応用できるようになる。ヒト化抗体、及びそれを作製する幾つかの異なる技術は、当技術分野でよく知られている。「抗体」(単数又は複数)という用語は、ヒト化に対する代替物として作製し得るヒト抗体も指す。例えば、免疫した際に内因性マウス抗体の産生を伴わずにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である。例えば、抗体重鎖の連結領域(JH)遺伝子のホモ欠損があると、キメラマウス及び生殖系列変異を有するマウスで、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記述されている。生殖系列変異を有するこのようなマウスに、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子群を移すとその結果、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子を持つこのトランスジェニック動物を前記抗体で免疫した際に、特定の抗原に対して特異的なヒト抗体が産生されることになる。このようなトランスジェニック動物を作製するための技術、並びにこのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離及び製造するための技術は、当技術分野で知られている。別の選択肢では、トランスジェニック動物、例えばマウスで、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみを、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置換する。抗体の定常領域をコードする、マウス生殖系列の免疫グロブリン遺伝子は元のままである。こうすることで、トランスジェニックマウスの抗体エフェクターは免疫系において機能し、且つその結果、B細胞の発生は実質的にそのままであり、in vivoで抗原に曝露された際の抗体応答の向上につながり得る。対象とする特定の抗体をコードする遺伝子が、このようなトランスジェニック動物から単離されていたなら、完全ヒト抗体を得るために、定常領域をコードする遺伝子をヒト定常領域遺伝子で置換することができる。ヒト抗体/抗体断片をin vitroで得るための他の方法は、少なくとも部分的には人工的に作製されるか、又はドナーの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーに由来するかのいずれかの組換えDNAライブラリーを使用するディスプレイ技術、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術などに基づく。ヒト抗体を作製するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当技術分野でよく知られている。ヒト抗体は、単離したヒトB細胞から作製することもできる。このヒトB細胞は、対象とする抗原を用いてex vivoで免疫し、次いで融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマは次に、最適なヒト抗体を求めてスクリーニングすることができる。本明細書で使用される「抗体」(単数又は複数)という用語は、非グリコシル化抗体(an aglycosylated antibody)も指す。
本明細書で使用される「抗体」(単数又は複数)という用語は、抗体断片も指す。抗体の断片は、当技術分野で知られる少なくとも1つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、抗原に結合する。本発明の抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv及びscFv断片;並びにダイアボディ;トリアボディ;テトラボディ;ミニボディ(minibodies);ドメイン抗体;単鎖抗体;Fab−Fvコンストラクトを含めた、しかしそれに限定されない抗体断片又は抗体から形成されている二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体が挙げられる。上に定義した抗体断片は、当技術分野で知られている。
本明細書で使用される「緩衝剤」という用語は、溶液中に存在することで、pHを1単位変化させるために添加しなければならない酸又はアルカリの量を増加させる物資を指す。緩衝溶液はその酸塩基共役成分の作用のため、pHが変化しにくい。生物学的試薬と共に使用するための緩衝溶液は一般に、溶液のpHが生理的範囲内にあるように、水素イオンの濃度を一定に維持することができる。伝統的な緩衝剤成分には、それだけに限らないが、有機及び無機の塩、酸及び塩基が含まれる。
本明細書で使用される「乳化剤」という用語は、エマルションを、その速度論的安定性を増加させることによって安定化する物質のことである。この用語は、「表面活性物質」又は界面活性剤として知られる特定のクラスの乳化剤を含意する。
本明細書で使用される「微粒子」という用語は、0.3から1000μm、又は0.3から700μm、又は0.7から700μm、又は0.3から250μmの直径を有する粒子を指す。
本明細書で使用される「粒子」という用語は、体積又は質量などの幾つかの物性を有すると考えることのできる、局在した小さな物体を指し、詳細には、上に定義した微粒子がこれに含まれる。より詳細には、本発明の趣旨の範囲内では、粒子とは、ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を指す。
本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、重合過程によって生じる繰返し構造単位からなる化学化合物、又は化合物の混合物を指し、この重合過程から、相対分子質量が高いという性質、及び付随的特性が生まれる。一般に、ポリマーを構成する単位は、実際に又は概念的に、相対分子質量の低い分子に由来する。薬物送達の目的には、ポリ−ラクチド(PLA)、ポリ−グリコリド(PGA)及び特にPLGAなどの熱可塑性脂肪族ポリエステルは、生体適合性及び生分解性が優れているため、有用なポリマーである。
本明細書で使用される「マトリックス」という用語は、ポリマーが形成することのある三次元構造を指す。マトリックスは、有効成分など別の分子を、その内部に捕捉するか又は有することができ、その場合この有効成分は、例えば長期間に渡って放出され得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、複数の各抗体分子の組成物であって、各抗体分子が、少なくとも重鎖及び軽鎖の一次アミノ酸配列においては同一である、上記組成物を指す。概ね「モノクローナル抗体」は複数の細胞によって産生され、前記細胞中で、同一の組合せの免疫グロブリン遺伝子によってコードされている。一般に「モノクローナル抗体」は、単一の原B細胞(ancestor B cell)に由来する抗体遺伝子を有する細胞によって産生される。
対照的に「ポリクローナル抗体」(単数又は複数)とは、複数の各抗体分子の組成物であって、各抗体分子が重鎖の一次アミノ酸配列においても、軽鎖の一次アミノ酸配列においても同一でない、上記組成物を指す。概ね「ポリクローナル抗体」は同じ抗原に結合するが、抗原の同じ部分、すなわち抗原決定基(エピトープ)、に結合するとは限らない。一般に「ポリクローナル抗体」は、複数の細胞によって産生され、前記細胞中で、異なる少なくとも2つの組合せの抗体遺伝子によってコードされている。
本明細書に開示する抗体は、対象とする「抗原」に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害を患う哺乳動物に抗体を投与すると、その哺乳動物で治療効果が生じ得る。しかし、ポリペプチドではない抗原に対する抗体も検討される。抗原はポリペプチドである場合、膜貫通分子(例えば受容体)、又はリガンド、例えば増殖因子若しくはサイトカインなどのことがある。本発明に包含される抗体の好ましい分子標的には、以下のものが含まれる:CDポリペプチド、例えばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD34、CD38、CD40、CD80、CD86、CD95及びCD154;HER受容体ファミリーのメンバー、例えばEGF受容体、HER2、HER3又はHER4受容体;細胞接着分子、例えばLFA−1、Mac1、p150,95、VLA−4、ICAM−1、VCAM、及びα又はβサブユニットのいずれかを含めたav/b3インテグリン(例えば抗CD11a、抗CD18又は抗CD11b抗体);ケモカイン及びサイトカイン又はそれらの受容体、例えばIL−1α及びβ、IL−2、IL−6、IL−6受容体、IL−12、IL−13、IL−17の各型、IL−18、IL−21、IL−23、IL−25、IL−27、TNFα及びTNFβ;増殖因子、例えばVEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3受容体;肥満(OB)受容体;mpl受容体;CTLA−4;ポリペプチドC;G−CSF、G−CSF受容体、GM−CSF、GM−CSF受容体、M−CSF、M−CSF受容体;LINGO;BAFF、APRIL;OPG;OX40;OX40−L;並びにFcRn。
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書のいずれか一実施形態のポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、標的化部分を付加するために前記粒子をさらに修飾する上記方法を提供する。本発明の趣旨の範囲内で好まれる標的化部分には、それだけに限らないが、PEG、PLL−g−PEG、抗体又はその断片、受容体結合ペプチド、又は上記の組合せが含まれる。前記標的化部分を加えるための方法は、使用しようとする特定の部分、標的組織又は細胞、及び標的化部分の所望の組合せに応じて異なることがある。
さらなる実施形態では、本発明は、動物、哺乳動物又はヒト対象を処置するための方法であって、本明細書に開示するいずれか一実施形態の、治療有効量の粒子又は医薬組成物を動物、特に哺乳動物又はヒト対象に投与するステップを含み、ここで、前記動物、哺乳動物又はヒト対象が、前記粒子又は医薬組成物での処置によって緩解し得る障害を有し、前記障害ががん、自己免疫性又は炎症性障害、例えば関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患などである上記方法を提供する。
上記疾患を処置するには、適切な投与量は、例えば、利用しようとする特定のタンパク質又は抗体、処置する対象、投与方式、並びに処置している状態の性質及び重症度に応じて異なるはずである。自己免疫疾患及び炎症性疾患を、本発明の粒子を用いて処置するための好ましい投与レジメンは、例えば、抗体を1μgから1gの間の量で含む粒子を投与するステップを含む。
本発明のいずれかの一実施形態の粒子又は医薬組成物は、好ましくは皮下注射経路で投与する。本発明のいずれかの一実施形態の医薬製剤は、筋肉内注射によって投与してもよい。医薬組成物は、シリンジ、又は自動注入装置などの注射デバイスを使用して注射してもよい。注射しようとする医薬組成物は微粒子を、体積当たりの重量が10から40%の間、好ましくは体積当たりの重量が20から30%の間の濃度で含むことになる。
本明細書で使用される「a」又は「an」という規定は、1つ又は複数を意味することがある。本明細書及び請求項(単数又は複数)で使用される際、「a」又は「an」という語は、「comprising(含む)」という語と共に使用される場合は、1つ又は2つ以上を意味することがある。
本明細書で使用される「or」という用語の使用は、一方のみを指すことが明示されている、又は両方が相互排他的であることがない限り、「and/or」を意味するが、本開示では、一方のみ及び「and/or」を指す定義が支持される。
本発明の他の目的、特徴及び優位点は、以下の詳細な記述から明らかとなるはずである。しかし、詳細な記述及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、例示としてのみ提供されているという点は理解されたい。本発明の趣旨内及び範囲内の様々な変更及び改変が、当分野の技術者にとっては、この詳細な記述から明白となるはずだからである。
本明細書で引用される全参考文献には雑誌論文若しくは要旨、公表された若しくは未公表の米国特許出願若しくは外国特許出願、発行された米国特許若しくは外国特許又は他のあらゆる参考文献が含まれるが、引用される参考文献に示されている全データ、表、図及び文を含めたその全体が、参照によって本明細書に組み込まれている。さらに、本明細書で引用される参考文献で引用される参考文献の全内容も、参照によって全体が組み込まれている。
(例1)
材料
IgGをモデル分子として使用し、これは冷凍乾燥粉末としてEquitech(カービル、USA)から購入された。PLGA(Resomer(登録商標)RG504、RG505及びRG755S。それぞれが50:50、50:50及び75:25のラクチド:グリコリド比によって特徴付けられる)、これはBoehringer Ingelheim(インゲルハイム、ドイツ)によって供給される、を生分解性ポリマーとして使用した。s/o/w封入工程の間、酢酸エチル(EtAc)(Sigma Aldrich、ディーゲム、ベルギー)を有機溶媒として使用した。封入効率の評価の間、MC(Merck、ダルムシュタット、ドイツ)を使用してPLGAを溶解した。ポリビニルアルコール(PVA)、ただし87〜90%加水分解されたもの、とポリビニルピロリドン(PVP)(Sigma−Aldrich、ディーゲム、ベルギー)とを安定剤として使用した。噴霧乾燥工程の間、Sigma Aldrich(ディーゲム、ベルギー)の提供するマンニトール及びL−ヒスチジンを使用してIgGを安定化した。リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.2(Sigma Aldrich、ディーゲム、ベルギー)を利用してIgG溶液を緩衝化した。フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ジメチルホルムアミド(DMF)、及び50mMホウ酸緩衝液、pH8.5(Pierce Biotechnology、ロックフォード、USA)を使用してIgGを標識した。粒子は、空隙率が0.2μmのナイロンフィルター(Millipore、ビルリカ、USA)を使用して回収した。Amicon15−30K膜(Millipore、ビルリカ、USA)を使用して、ダイアフィルトレーションを行った。
材料
IgGをモデル分子として使用し、これは冷凍乾燥粉末としてEquitech(カービル、USA)から購入された。PLGA(Resomer(登録商標)RG504、RG505及びRG755S。それぞれが50:50、50:50及び75:25のラクチド:グリコリド比によって特徴付けられる)、これはBoehringer Ingelheim(インゲルハイム、ドイツ)によって供給される、を生分解性ポリマーとして使用した。s/o/w封入工程の間、酢酸エチル(EtAc)(Sigma Aldrich、ディーゲム、ベルギー)を有機溶媒として使用した。封入効率の評価の間、MC(Merck、ダルムシュタット、ドイツ)を使用してPLGAを溶解した。ポリビニルアルコール(PVA)、ただし87〜90%加水分解されたもの、とポリビニルピロリドン(PVP)(Sigma−Aldrich、ディーゲム、ベルギー)とを安定剤として使用した。噴霧乾燥工程の間、Sigma Aldrich(ディーゲム、ベルギー)の提供するマンニトール及びL−ヒスチジンを使用してIgGを安定化した。リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.2(Sigma Aldrich、ディーゲム、ベルギー)を利用してIgG溶液を緩衝化した。フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ジメチルホルムアミド(DMF)、及び50mMホウ酸緩衝液、pH8.5(Pierce Biotechnology、ロックフォード、USA)を使用してIgGを標識した。粒子は、空隙率が0.2μmのナイロンフィルター(Millipore、ビルリカ、USA)を使用して回収した。Amicon15−30K膜(Millipore、ビルリカ、USA)を使用して、ダイアフィルトレーションを行った。
噴霧乾燥工程を用いたIgG微粒子の調製
30%(w/w)マンニトール入り20mMヒスチジン緩衝液pH6.0中の、IgG濃度が25mg/mlであるIgG水溶液を、Mini Spray−dryer B−190(Buchi Labortechnik、フラヴィル、スイス)、及び以前に最適化しておいた工程パラメータを用いて噴霧乾燥した。入口温度(Tin)及び液流速はそれぞれ130℃及び3ml/分に設定した。乾燥空気流速は30m3/時間、微粒化流速は800l/時間に固定した。得られた出口温度(Tout)は80℃だった。
30%(w/w)マンニトール入り20mMヒスチジン緩衝液pH6.0中の、IgG濃度が25mg/mlであるIgG水溶液を、Mini Spray−dryer B−190(Buchi Labortechnik、フラヴィル、スイス)、及び以前に最適化しておいた工程パラメータを用いて噴霧乾燥した。入口温度(Tin)及び液流速はそれぞれ130℃及び3ml/分に設定した。乾燥空気流速は30m3/時間、微粒化流速は800l/時間に固定した。得られた出口温度(Tout)は80℃だった。
s/o/w型エマルション工程によるIgG微粒子のPLGA粒子内への封入
s/o/w型エマルション蒸発/抽出法を用いてIgGを封入した。手短に言えば、室温において磁気撹拌しながら、PLGAを1〜15%(w/v)の濃度範囲内でEtAc5mlに溶解させた。油中固体(s/o)型懸濁液は、T25 digital Ultra−Turrax(登録商標)高性能分散機(IKA(登録商標)、シュタウフェン、ドイツ)を13500rpmの設定で使用し、IgGの噴霧乾燥粉末(SD IgG)30〜150mgをPLGA有機溶液に添加することによって形成した。この懸濁液は、PVA又はPVPなどの界面活性剤を0.1〜2%(w/v)含有する外部水相30〜100mlに添加し、Ultra−Turrax(登録商標)撹拌機を3400〜13500rpmで使用してかき混ぜ続けた。最後にこのs/o/w型エマルションを、追加容量の水(100〜400ml抽出相)に添加して、最終のs/o/w型エマルションを製造した。生じたエマルションを大気圧下で30分磁気撹拌し続けることで、EtAcの抽出及び蒸発の両方が可能となった。このポリマーは水に不溶性なため、封入されたIgGを含有する粒子が製造された。これは、水相中のEtAcを急速に抽出すると、ポリマーが速やかに固化するためである。粒子は濾過によって回収し、ミリQ水で数回洗浄し、室温で48時間減圧したままにした。
s/o/w型エマルション蒸発/抽出法を用いてIgGを封入した。手短に言えば、室温において磁気撹拌しながら、PLGAを1〜15%(w/v)の濃度範囲内でEtAc5mlに溶解させた。油中固体(s/o)型懸濁液は、T25 digital Ultra−Turrax(登録商標)高性能分散機(IKA(登録商標)、シュタウフェン、ドイツ)を13500rpmの設定で使用し、IgGの噴霧乾燥粉末(SD IgG)30〜150mgをPLGA有機溶液に添加することによって形成した。この懸濁液は、PVA又はPVPなどの界面活性剤を0.1〜2%(w/v)含有する外部水相30〜100mlに添加し、Ultra−Turrax(登録商標)撹拌機を3400〜13500rpmで使用してかき混ぜ続けた。最後にこのs/o/w型エマルションを、追加容量の水(100〜400ml抽出相)に添加して、最終のs/o/w型エマルションを製造した。生じたエマルションを大気圧下で30分磁気撹拌し続けることで、EtAcの抽出及び蒸発の両方が可能となった。このポリマーは水に不溶性なため、封入されたIgGを含有する粒子が製造された。これは、水相中のEtAcを急速に抽出すると、ポリマーが速やかに固化するためである。粒子は濾過によって回収し、ミリQ水で数回洗浄し、室温で48時間減圧したままにした。
粒径及び形状の評価
IgG:PLGA粒子及び噴霧乾燥(SD)IgG微粒子の双方の粒径分布は、Malvern Mastersizer Hydro2000S(Malvern Instruments、モールバーン、UK)を使用して3連で測定した。SD IgG微粒子は、イソプロパノールに分散させた後にレーザー回折によって分析した。IgG微粒子については1.52の屈折率を用いた。PLGA粒子は、水及びPLGAについてそれぞれ1.33及び1.55の屈折率を用いて、分散媒とした水の中で分析した。粒径分布は、中位径d(0.5)及びd(0.9)、それらを粒子のうちそれぞれ50%及び90%が下回る直径のことである、に関して評価した。
IgG:PLGA粒子及び噴霧乾燥(SD)IgG微粒子の双方の粒径分布は、Malvern Mastersizer Hydro2000S(Malvern Instruments、モールバーン、UK)を使用して3連で測定した。SD IgG微粒子は、イソプロパノールに分散させた後にレーザー回折によって分析した。IgG微粒子については1.52の屈折率を用いた。PLGA粒子は、水及びPLGAについてそれぞれ1.33及び1.55の屈折率を用いて、分散媒とした水の中で分析した。粒径分布は、中位径d(0.5)及びd(0.9)、それらを粒子のうちそれぞれ50%及び90%が下回る直径のことである、に関して評価した。
製造した粒子の形状を評価するために、Hirox MXG−5040RZ optical systemを備えたHirox KH−7700(Hirox Co Ltd、東京、日本)を使用して光学顕微鏡観察を行った。粒子は蒸留水に再分散させ、ガラススライド上に置いた。
ポリマー粒子の表面形状及び内部空隙率は、環境室を備えたPhilips(アイントホーフェン、オランダ)製のモデルXL30 ESEM−FEGの走査型電子顕微鏡を使用して観察した。この顕微鏡は電界放出銃を装着していた。画像は、10kVの加速電圧で二次電子(形状コントラスト)を使用して取得した。外部表面を観察するために、粒子を、接着性の導電支持体(炭素)に付着させた。断面が視野に入るようにし、内部空隙率の評価は、試料をエポキシ樹脂で被覆し、ミクロトームダイヤモンドナイフを用いて切断及び研磨した後に行った。
PLGA粒子内の薬物分布の評価
PLGA粒子内に位置するIgG分子の分布を、IgG−FITCコンジュゲート及び蛍光顕微鏡を使用して調べた。IgGの標識化は、Thermo Scientificの取扱説明書に記述されている詳細な方法を用いて行った[18]。手短に言えば、DMFに溶解させた15倍から20倍モル過剰のFITCを、5mg/mLのIgG溶液(50mMホウ酸緩衝液pH8.5)に添加した。次に、過剰の加水分解されたFITCは、暗所で室温にて1時間インキュベーションした後、20mMヒスチジン緩衝液pH6中の10%(w/w)マンニトール及びAmicon(登録商標)15−30K遠心フィルターデバイスを使用して、緩衝液交換により除去した。次にIgG−FITCコンジュゲートを噴霧乾燥し、得られたIgG微粒子70mgは、既に記述したs/o/w封入法を使用し、最適化された工程パラメータを用いて封入した。PLGA粒子内の薬物分布は、Perkin Elmer LS55を使用し蛍光顕微鏡によって観察した。
PLGA粒子内に位置するIgG分子の分布を、IgG−FITCコンジュゲート及び蛍光顕微鏡を使用して調べた。IgGの標識化は、Thermo Scientificの取扱説明書に記述されている詳細な方法を用いて行った[18]。手短に言えば、DMFに溶解させた15倍から20倍モル過剰のFITCを、5mg/mLのIgG溶液(50mMホウ酸緩衝液pH8.5)に添加した。次に、過剰の加水分解されたFITCは、暗所で室温にて1時間インキュベーションした後、20mMヒスチジン緩衝液pH6中の10%(w/w)マンニトール及びAmicon(登録商標)15−30K遠心フィルターデバイスを使用して、緩衝液交換により除去した。次にIgG−FITCコンジュゲートを噴霧乾燥し、得られたIgG微粒子70mgは、既に記述したs/o/w封入法を使用し、最適化された工程パラメータを用いて封入した。PLGA粒子内の薬物分布は、Perkin Elmer LS55を使用し蛍光顕微鏡によって観察した。
IgGアッセイ及び安定性の評価
溶出試験、及び封入効率の評価のためには、IgG単量体の定量、並びに凝集体及び断片の両方の含有量の評価を、UV検出器(Agilent Technologies、ヴァルトブロン、ドイツ)を備えたHPLC system Agilent1100を使用して、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー(SEC)により行った。6.0mmのIDx4.0cmの長さのTSK Gel Guardcol SWXL 5ガードカラム(Tosoh Bioscience GMBH、シュトゥットガルト、ドイツ)を備えた、7.8mmのIDx30.0cmの長さのTSK Gel G3000 SWXLカラム(Tosoh Bioscience GMBH、シュトゥットガルト、ドイツ)を、流速は0.5ml/分、注入容量は20ml、及び検出は280nmで使用した。移動層はリン酸緩衝食塩水(PBS)0.05M、pH7.2から構成されていた。IgGの安定性は、単量体の損失の割合、これは封入ステップの前後での単量体の割合の差に相当する、を用いて評価した。IgG単量体の濃度は、濃度の分かっているIgG冷凍乾燥粉末を用いて構築した検量線を使用して決定した。検出された化学種の分子量は、1350から670,000ダルトンの範囲の分子量マーカーの冷凍乾燥混合物であるBio−Rad Gel Filtration Standard(Bio−Rad Laboratories、ハーキュリーズ、USA)を使用して決定した。
溶出試験、及び封入効率の評価のためには、IgG単量体の定量、並びに凝集体及び断片の両方の含有量の評価を、UV検出器(Agilent Technologies、ヴァルトブロン、ドイツ)を備えたHPLC system Agilent1100を使用して、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー(SEC)により行った。6.0mmのIDx4.0cmの長さのTSK Gel Guardcol SWXL 5ガードカラム(Tosoh Bioscience GMBH、シュトゥットガルト、ドイツ)を備えた、7.8mmのIDx30.0cmの長さのTSK Gel G3000 SWXLカラム(Tosoh Bioscience GMBH、シュトゥットガルト、ドイツ)を、流速は0.5ml/分、注入容量は20ml、及び検出は280nmで使用した。移動層はリン酸緩衝食塩水(PBS)0.05M、pH7.2から構成されていた。IgGの安定性は、単量体の損失の割合、これは封入ステップの前後での単量体の割合の差に相当する、を用いて評価した。IgG単量体の濃度は、濃度の分かっているIgG冷凍乾燥粉末を用いて構築した検量線を使用して決定した。検出された化学種の分子量は、1350から670,000ダルトンの範囲の分子量マーカーの冷凍乾燥混合物であるBio−Rad Gel Filtration Standard(Bio−Rad Laboratories、ハーキュリーズ、USA)を使用して決定した。
全IgGアッセイは、Solo VPE光ファイバー(C Technologies,Inc.、ブリッジウォーター、USA)を装着したVarian(登録商標)50 Bio UV/VIS分光光度計で、280nmにおいてUV分光光度法を用いて行った。
封入効率及び薬物担持率の評価
IgGのPLGA粒子への薬物担持率は、組み込まれたIgGの測定量と、PLGA、並びに抗体及び不活性物質の双方を含有した噴霧乾燥IgGの総量との間の比である。EE%とは、最初に有機相に導入したIgGの量と比較した、粒子内に検出されるIgGの量を指す。5〜20mgのIgG:PLGA粒子を、750μlのMCと接触するように配置して、ポリマーを溶解させる。IgGは、PBS(4x750μl)を使用し、8800rpmで15分間遠心分離することでさらに抽出した。水相を採取し、SE−HPLCによって、薬物担持率、EE%及び安定性を評価するために分析した。封入していないIgG冷凍乾燥粉末では、完全に回収されること、及び分解のないことは以前に確かめてあった。
IgGのPLGA粒子への薬物担持率は、組み込まれたIgGの測定量と、PLGA、並びに抗体及び不活性物質の双方を含有した噴霧乾燥IgGの総量との間の比である。EE%とは、最初に有機相に導入したIgGの量と比較した、粒子内に検出されるIgGの量を指す。5〜20mgのIgG:PLGA粒子を、750μlのMCと接触するように配置して、ポリマーを溶解させる。IgGは、PBS(4x750μl)を使用し、8800rpmで15分間遠心分離することでさらに抽出した。水相を採取し、SE−HPLCによって、薬物担持率、EE%及び安定性を評価するために分析した。封入していないIgG冷凍乾燥粉末では、完全に回収されること、及び分解のないことは以前に確かめてあった。
溶出試験
IgG:PLGA粒子からのIgGの溶出プロファイルは、2mlエッペンドルフ(登録商標)チューブ内の粒子30mgにPBS緩衝液pH7.2を1ml添加することによって評価した。チューブを37℃でインキュベートし、Thermomixer confort(登録商標)(Eppendorf AG、ハンブルク、ドイツ)を使用して600rpmで撹拌した。所定の時点において試料を12000rpmで15分間遠心分離した。上清(1ml)を採取し、0.2μmのHDPE Millexフィルター(Millipore、英国)で濾過した。粒子は、新しいPBS溶液に懸濁した。放出されたIgGの割合を次にSE−HPLCによって測定した。バースト効果は、1日後に放出されたIgGの割合とした。
IgG:PLGA粒子からのIgGの溶出プロファイルは、2mlエッペンドルフ(登録商標)チューブ内の粒子30mgにPBS緩衝液pH7.2を1ml添加することによって評価した。チューブを37℃でインキュベートし、Thermomixer confort(登録商標)(Eppendorf AG、ハンブルク、ドイツ)を使用して600rpmで撹拌した。所定の時点において試料を12000rpmで15分間遠心分離した。上清(1ml)を採取し、0.2μmのHDPE Millexフィルター(Millipore、英国)で濾過した。粒子は、新しいPBS溶液に懸濁した。放出されたIgGの割合を次にSE−HPLCによって測定した。バースト効果は、1日後に放出されたIgGの割合とした。
実験デザイン
s/o/w封入工程における8通りの、工程及び製剤に関する変数の主な効果を検討した。試験した要因は、有機相中のPLGA濃度、外部相中の安定剤濃度、外部相の体積、s/o/w型乳化時間、s/o/w型乳化速度、抽出相の体積、及び外部相安定剤の種類である。次に噴霧乾燥IgGの量も評価した。選択した出力は、粒径、薬物担持率、封入効率、溶出プロファイル、並びに封入工程及び溶出の間のIgGの安定性だった。
s/o/w封入工程における8通りの、工程及び製剤に関する変数の主な効果を検討した。試験した要因は、有機相中のPLGA濃度、外部相中の安定剤濃度、外部相の体積、s/o/w型乳化時間、s/o/w型乳化速度、抽出相の体積、及び外部相安定剤の種類である。次に噴霧乾燥IgGの量も評価した。選択した出力は、粒径、薬物担持率、封入効率、溶出プロファイル、並びに封入工程及び溶出の間のIgGの安定性だった。
選択した要因の主な効果を評価するために、8通りの製剤、及び中心点の3回の反復(3 center replicates of points)(製剤1から製剤11)を用いたスクリーニングデザインを、バージョン8.0.2のJMP統計ソフトウェア(SAS、NC、USA)を使用して構築した。スクリーニングデザインは次に製剤(製剤12から製剤34)を追加することで完結として、有機溶媒中のPLGA濃度、s/o/w型乳化速度、s/o/w型乳化時間、及び有機相中に分散されたSD IgGの量の二次交互作用及び二次効果を評価した。これらの入出力関係に基づいた数理モデルを、スクリーニングデザイン及び拡張デザインの双方について構築した。調べたパラメータの効果は、最小二乗法を用いて決定した。
結果
前段落に明記した試験済み要因の効果を様々な出力特徴について評価した。評価した製剤を下の表1に要約する:
前段落に明記した試験済み要因の効果を様々な出力特徴について評価した。評価した製剤を下の表1に要約する:
評価した製剤の結果は下の表2に詳細を示す:
(例2)
前の例と同様に、TNF−アルファに対するモノクローナル抗体のCDP571を含有する微粒子製剤を、同じ方法に従って調製した。
前の例と同様に、TNF−アルファに対するモノクローナル抗体のCDP571を含有する微粒子製剤を、同じ方法に従って調製した。
手短に言えば微粒子を、体積当たりの重量(w/v)濃度が10%のPLGA、1%(w/v)の安定剤、及び追加の外部相100mlを使用して上記の工程により調製した。この混合物は、13500rpmで1分間撹拌することによって乳化させ、追加の抽出容量400mlを用いた。安定剤、緩衝液及びPLGAについて種々の条件をアッセイした。続いて凍結乾燥工程を用いてCDP571微粒子を製造した。図10は、CDP571含有微粒子製剤を得るために使用するPLGAの種類を変化させたことによる、タンパク質放出への影響に関する分析を示す。
(例3)
微粒子を上記の工程によって調製したが、ここで抗TNFαモノクローナル抗体は、10%(w/v)PLGA(50:50及び75:25のラクチド:グリコリド比によってそれぞれが特徴付けられるResomer(登録商標)RG505又はRG755S)を使用して理論的な薬物担持率が17.4%になるように封入した。s/o型分散剤を、1%w/vのポリビニルアルコールを含有する水溶液に添加し、かき混ぜ続けた。水で洗浄後、濾過した微粒子を20℃で減圧下に乾燥し、5±3℃、25±2℃/60%相対湿度及び40±2℃/75%相対湿度の閉じたバイアル内に、12週間まで入れておいた。
微粒子を上記の工程によって調製したが、ここで抗TNFαモノクローナル抗体は、10%(w/v)PLGA(50:50及び75:25のラクチド:グリコリド比によってそれぞれが特徴付けられるResomer(登録商標)RG505又はRG755S)を使用して理論的な薬物担持率が17.4%になるように封入した。s/o型分散剤を、1%w/vのポリビニルアルコールを含有する水溶液に添加し、かき混ぜ続けた。水で洗浄後、濾過した微粒子を20℃で減圧下に乾燥し、5±3℃、25±2℃/60%相対湿度及び40±2℃/75%相対湿度の閉じたバイアル内に、12週間まで入れておいた。
粒径は、Mastersizer Hydro2000S(Malvern Instruments、UK)を使用して測定した。表面形状は、環境制御型走査電子顕微鏡(ESEM)によって評価した。薬物担持率及び封入効率(EE%)は、PLGA微粒子をDCMに浸し、PBS緩衝液で抽出した後に、280nmでのUV分光光度法を用いた全MAbアッセイによって評価した。高分子量種(HMWS)のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定した。PLGA微粒子からのmAbのin vitro溶出プロファイルは、PBS緩衝液中で37℃においてかき混ぜながらインキュベーションすることによって評価した。結合能は、96ウェルプレート上に固定したTNFアルファを使用し、ELISAテストによって決定した。抗体の相対的な抗TNF活性は、バイオアッセイ(細胞毒性中和アッセイ)によって測定した。
微粒子の体積直径(volumetric diameter)は、5℃及び25℃で12週間保存した場合、安定だった。対照的に、体積直径は、40℃で6週間保存後、特にRG505微粒子(69.3μmから291.1μm)で、またそれ程ではないがRG755S微粒子(38μmから60μm)で増加した。凝集は、5℃で12週間保存したRG505微粒子又はRG755S微粒子のいずれについても、ESEMでは観察されなかった。40℃では、合体したRG505微粒子が観察された。凝集は、5℃又は40℃のいずれで保存した後もRG755S微粒子では観察されなかった。
高分子量種(HMWS)含有量は、25℃で保存した場合に経時的に増加し、40℃ではさらに早く増加した(図11)。抗体の結合能は、RG755S微粒子に封入した場合、保存の際も、溶出の間も変化しなかった。40℃で4週間保存したRG505微粒子から、4週間のインキュベーション後に放出された抗体は、1時間溶出させた後のT0において測定された(108±12)%に比べ、(67±12)%の相対的結合能を示した(図12)。RG505及びRG755S微粒子から放出された抗体の抗TNF活性は、封入工程及び保存を通じて保持されていた。
抗体担持率(%)は、RG755S微粒子でより一層安定なようであった(図13)。40℃で4週間の後、抗体含有量が減少するのが見られた。抗体の量の減少は、RG755Sを使用した場合には小さくなった。これはこのポリマーが、より高いラクチド:グリコリド比、ひいてはより遅い酸分解速度を特徴としていたからである。
溶出試験では、調製したばかりの微粒子から、4週間のテスト後に放出された含有抗体量は、RG755S微粒子(47.0±0.6%)よりもRG505微粒子(84.9±9.8%)で高かった。5℃では、12週間の保存の前後で両微粒子の間に放出プロファイルの差は観察されなかった。24時間放出後に評価したバースト効果は、保存の期間及び温度とともに増加し、検出値は40℃で6週間の後に最大であった(図14)。
(例4)
in vivoの環境下における本発明の微粒子の挙動を、ラットで50mg/kgのCDP571を単回皮下投与し、抗体の血漿pKプロファイルを評価することによって分析した。
in vivoの環境下における本発明の微粒子の挙動を、ラットで50mg/kgのCDP571を単回皮下投与し、抗体の血漿pKプロファイルを評価することによって分析した。
既に記述したように調製した、約30%(w/w)トレハロース入り20mMヒスチジンpH6.0緩衝液中の、CDP571濃度が40mg/mLであるCDP571水溶液を、噴霧乾燥した。次に、CDP571担持Resomer(登録商標)RG505微粒子を4バッチ、及びCDP571担持Resomer(登録商標)RG755S微粒を4バッチ製造し、0.5%(w/v)トレハロース溶液1mLに再懸濁後、凍結乾燥した。
RG505及びRG755S微粒子の薬物担持率は、10.0±0.03%(w/w)及び12.5±0.2%(w/w)と測定された。投与直前に凍結乾燥微粒子を、適切な体積の水に再懸濁して、15%(w/v)懸濁液を調製した。抗体の投与量を50mg/kgとするために投与すべき容量は、RG505及びRG755S微粒子についてそれぞれ3.3mL/kg及び2.7mL/kgだった。
pH6.0でトレハロース及びヒスチジンを含有する20mg/mLのCDP571溶液を比較対照として使用し、2.5mL/kgで投与した。
テストした製剤は、22G針の1mLシリンジを使用して注射した。各群で、テスト製剤を右側腹部に皮下注射した。それぞれのプラセボ対照は、左側腹部に皮下注射した。試験の終了時に注射部位の皮膚(対照及びテスト)を採取し、組織学的検査のために調製した。
血漿中濃度分析には、血液試料を尾静脈からヘパリンリチウム上に採取し、遠心分離して血漿を分離した。血漿試料は−90℃で保存した。CDP571の血漿中濃度はELISAによって測定した。
対応するプラセボ製剤は対照として、同じラットの反対の脇腹に注射した。
図15で観察できるように、CDP571血漿中濃度の経時プロファイルから、微粒子は抗体含有溶液に比べた場合、より高い血漿レベルを7週間に渡って維持できることが示された。
CDP571含有微粒子では、抗体の血漿レベルのプロファイルは、投与して6時間から1週間以内にピークを迎える形で初期に上昇を示し、それに続いて、分析した6週間の期間に渡って若干の減少を示すものとなった。
一方、CDP571溶液を皮下投与した後には、最大血漿中濃度は48時間後に観察され、この後CDP571濃度は経時的に減少し、投与後4週ではもはや検出できなかった。
いずれのPLGA製剤も、類似したCmax(RG505及びRG755S微粒子それぞれについて29.0±13.4及び30.3±6.99μg/mL)を特徴とし、これはCDP571溶液について算出されたCmax(112.0±14μg/mL)よりも低い。Cmaxは、ELISAによって決定されるCDP571の最大血漿中濃度である。さらに、CDP571の抗TNF活性を、異なる3つの製剤を投与した後48時間及び1週間後に採取した血漿試料で評価した。
各試料のCDP571の力価は、WHI164細胞を使用するTNF−アルファ細胞毒性中和アッセイからなるバイオアッセイを用いて決定した。EC50値は、細胞生存率を抗体濃度に対してプロットした用量反応曲線から、SoftMax Pro(登録商標)ソフトウェアの補助により算出した。この値は、観察された最大の中和効果の50%を誘導した、抗体の濃度を表す。血漿試料は、溶液中のCDP571、又は本発明のいずれかの微粒子中のCDP571を皮下投与した後48時間及び1週間の時点で採り、EC50を3つのテスト群について評価した。得られた値は34から54ng/mLの範囲で、これを基準値56ng/mLと比べると、抗体の抗TNF−アルファ活性が皮下投与後に維持されていたことが確認された(図16)。この基準値は、溶液中の完全な状態の、すなわちin vivoで投与されていないCDP571について、EC50を算出することによって得た。
最後に、抗体投与により炎症応答が生じる可能性について分析するために、種々のラット試験由来の組織試料を10%ホルマリンで固定し、切片をパラフィンに浸し、ミクロトームを使用して切出した。PLGA微粒子の炎症効果は、組織学的検査により、ヘマトキシリン及びエオシン染色を用いて決定した。
ポリマー微粒子又は生物学的化合物のいずれかを投与した後に、表皮と真皮との間での血漿浸潤、又は真皮へのリンパ球浸潤の起きた証拠はなかった。ポリマー微粒子又は対照の投与によって免疫細胞の数が影響を受けたふうでもなかった。同一のプロファイルが、処置したラット又は対照ラットのいずれでも観察された。さらには皮膚構造の改変の証拠もなく、例えば、表皮の厚さは変化していなかった。巨視的には、発赤、浮腫、局所熱感の増加などの炎症の顕著な証拠は、テストしたいずれのラットの注射部位にも、また投与したいずれの製剤についても観察されなかった。したがって、PLGA微粒子はその直ぐ近傍に炎症応答を生じなかったと結論された。
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Claims (15)
- ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子を製造するための方法であって、
a)タンパク質を含む溶液からタンパク質を固化させるステップ、
b)固化したタンパク質を、ポリマーマトリックスを含む溶媒と合わせるステップ、
c)ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む溶媒を、水中で乳化剤と合わせるステップ、
d)ポリマーマトリックス、タンパク質及び乳化剤を含む溶媒をかき混ぜるステップであって、それによりエマルションを形成する上記ステップ、
e)ポリマーマトリックス及びタンパク質を含むエマルションを水と合わせるステップであって、それにより粒子を形成させる上記ステップ、並びに
f)粒子を回収するステップ
を含む上記方法。 - ポリマーが、混合されたD,L−乳酸及びグリコール酸のコポリマー、又はL−乳酸及びグリコール酸のコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- コポリマー内の、D,L−乳酸又はL−乳酸のグリコール酸に対する比が75:25である、請求項2に記載の方法。
- 溶媒が酢酸エチルである、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- 溶媒がポリマーマトリックスを、体積当たり重量が1%から20%の濃度で含む、請求項1から4までのいずれか一項に記載の方法。
- 乳化剤がポリビニルアルコールである、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法。
- 乳化剤が水中にあって体積当たり重量が0.05%から3.0%の濃度である、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 水の体積は、有機溶媒:水の体積比が1:26から1:100である、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法。
- エマルションを形成するためにかき混ぜる前記ステップが、3400rpmから13500rpmで撹拌することによって実行される、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 溶媒を抽出するためにかき混ぜる前記ステップが、少なくとも30分間実行される、請求項1から9までのいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項1から10までのいずれか一項に記載の方法。
- 粒子が濾過によって回収される、請求項1から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 粒子が、回収後に少なくとも1時間真空下で乾燥されるか、又は凍結乾燥によって乾燥される、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の方法によって得ることのできる、前記ポリマーマトリックス及びタンパク質を含む粒子。
- 請求項14に記載の粒子を含む医薬組成物。
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