CN105338961A - 制备包含治疗性蛋白质的颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法。

Description

制备包含治疗性蛋白质的颗粒的方法

发明领域

本发明处于药物制剂的领域中。更具体地，其涉及制备包含治疗性蛋白质诸如抗体的微粒的方法。

发明背景

用于治疗、诊断或预防目的诸如疫苗的分子的靶向和/或受控释放正在广泛地探索，因为其相比治疗剂、诊断剂或疫苗的常规施用提供了潜在益处。大分子(诸如蛋白质，例如抗体或多核苷酸)的靶向和/或受控释放代表了本领域的一个特定挑战。

经常用于动物或人中的治疗、诊断或预防应用(例如疫苗)的蛋白质诸如抗体必须以高剂量施用使其有效。疫苗、抗体或其它治疗或诊断蛋白质通常必须肠胃外施用于动物或人。通常此类蛋白质需要注射(例如静脉内、皮下或肌内)。经延长期间诸如数天、数周或数月以受控方式释放的的贮库制剂因此需要避免频繁注射且增加对于所要求施用方案的依从性。

批准的治疗性抗体和其它蛋白质治疗剂的药物制剂通常不适合用于蛋白质诸如抗体的受控释放。抗体或其它治疗性蛋白质的受控释放制剂是期望的，以允许较不频繁的施用，由此减少对注射的需求和改善患者依从性。因此，本领域中需要提供实现抗体或其它蛋白质治疗剂的受控释放的药物制剂。

实现分子在体内的靶向和受控释放的一种方式是通过使用颗粒，诸如纳米颗粒或微粒。这些颗粒可以通过不同的途径(包括口服和肠胃外途径)施用。颗粒可以例如吸入或注射(例如静脉内、皮下或肌内)。

可用于动物或人中的体内应用的颗粒应当是可生物降解且生物相容的。在过去二十年中，合成的可生物降解聚合物已被用作载体或用于微粒或纳米颗粒中以递送小分子药物[1]。热塑性脂族聚(酯)，诸如聚-丙交酯[PLA]，聚-乙交酯[PGA]，和特别是聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)[PLGA]由于其优异的生物相容性和生物降解性已经产生了极大的兴趣。已经使用这些聚合物产生了各种聚合物药物递送系统，诸如微粒、微囊、纳米颗粒、丸粒、植入物和膜，用于递送各种治疗性药物。它们也已经由FDA批准用于药物递送用途。

也可以进一步修饰基于PLA或PLGA的颗粒，例如通过连接靶向部分，所述连接靶向部分诸如聚(乙二醇)[PEG]或蛋白质。这种颗粒的主要限制之一是血浆蛋白质在微粒上的非特异性吸附。血浆蛋白质的吸附据信是解释微粒的器官分布的关键因素，例如已知特定蛋白质的存在经由与细胞膜受体的特异性或非特异性相互作用由一些细胞促进摄入。因此，已经追寻不同的修饰策略来抑制该效应。用PEG修饰PLGA颗粒是减少蛋白质吸附的重要和众所周知的方法。另一个选项已经经由官能化的聚(L-赖氨酸)-g-聚(乙二醇)(PLL-g-PEG)在PLGA微粒上引入官能团，由此产生具有强烈减少的蛋白质吸附的PLGA微粒[2]。

颗粒修饰的另一个潜在原因是将所述颗粒靶向至体内期望的组织或细胞类型，以便实现期望的治疗效果。将活性成分特异性递送至期望的目标细胞不仅允许效率增加，而且允许减少源自活性成分对不同组织的不希望的效果的副作用。这可以使用不同的靶向部分(诸如抗体、其片段或受体靶向肽)来实现。例如，抗体和受体靶向肽两者已经显示在皮下注射之后有效地将PLGA颗粒优选靶向至树突细胞[3]。

基于聚合物基质的颗粒、特别是基于PLA、PGA或PLGA的颗粒相比于常规的药物递送系统的优点，除了其生物相容性和生物降解性以外，包括长达数天、数周或数月的延长释放。然而，已经注意到，这些聚合物基质的使用对于蛋白质诸如抗体而言是有问题的，因为聚合物基质似乎对于制备和储存期间的蛋白质稳定性具有负面影响，这主要是由于其降解的酸催化性质。此外，聚合物基质药物递送媒介物的制备中使用的处理条件对蛋白质二级结构具有有害影响[4]。

基于聚合物基质诸如PLA、PGA或PLGA的颗粒的产生需要多个步骤，且涉及多个参数。包含蛋白质(例如抗体)的基于聚合物基质的颗粒的制备是特别有挑战性的，这是由于蛋白质和大蛋白质(诸如抗体)的复杂性和固有不稳定性。蛋白质和抗体易于在形成基于聚合物基质的颗粒的过程期间变得无活性。

几种方法已经用于产生基于PLGA的颗粒。最常用的方法采用乳化-溶剂挥发方法。在该方法中，在疏水性药物的情况下，聚合物和活性分子(例如预防、预后、诊断或治疗分子)两者均溶解于有机溶剂(诸如二氯甲烷)中，以形成乳剂油。然后通过随后将水和乳化剂诸如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)添加至聚合物溶液而制备水(w)包油(o)(即o/w)乳剂。通过超声处理或均质化诱导颗粒，且然后蒸发溶剂或然后萃取溶剂以制备颗粒。在亲水性药物诸如蛋白质的情况下，将聚合物溶解于有机溶剂，且将活性分子溶解于水相，第一水-油乳剂从所述水相中制备。接下来，添加水和乳化剂以生成双重水包油包水乳剂(w/o/w)。从该第二乳剂然后诱导颗粒，且随后蒸发或萃取溶剂以得到颗粒。

在水/溶剂界面处的蛋白质吸附和变性是在微囊化过程期间发生的蛋白质生物活性降低的主要因素之一。为了避免在水包油包水(w/o/w)方法中形成油包水(w/o)乳剂期间主要发生的蛋白质变性，已经开发了水包油包固体(s/o/w)方法[5]。实际上，在固态中，蛋白质据信通过急剧减少构象移动性(conformationalmobility)来保持它们的生物活性。在s/o/w方法中，将聚合物溶解于有机溶剂中，其中分散固体蛋白质颗粒以生成主要油包固体(s/o)悬浮液。然后将该悬浮液添加至含有乳化剂诸如PVA或PVP的水相中，以形成s/o/w乳剂。然后将所得乳剂维持在搅拌下，以允许有机溶剂的萃取和蒸发和随后颗粒的回收。

s/o/w方法中的主要问题之一是蛋白质颗粒微粉化，即用微粉化方法(包括冻干、喷雾-干燥和喷雾-冷冻-干燥)降低这些固体颗粒的平均直径[6]。冻干，也称为冷冻干燥，是一种脱水方法，其通过冷冻材料、然后降低周围压力以使材料中的冷冻水从固相直接升华为气相而发挥作用。另一方面，喷雾干燥是一种通过用热气体迅速干燥而从液体或浆料产生干燥粉末的方法。空气是加热的干燥介质；然而，如果液体是易燃溶剂诸如乙醇或产物是氧敏感的，则使用氮气。最后，喷雾-冷冻-干燥简要地由以下组成：将液体溶液雾化为低温气体或液体，伴随快速冷冻生成的小滴，随后在冷冻干燥期间在低温和压力下升华冰。

事实上，通常使用喷雾干燥制备蛋白质微粒，尽管该方法具有问题，诸如低回收率和由于热和物理应激导致的蛋白质变性和聚集的风险。

在该过程期间，鉴于治疗性蛋白质(一般)和抗体(具体地)的高成本，高蛋白质负载率和高囊化效率是关键参数。囊化效率(EE％)是指在微粒中检测到的活性分子的量与初始引入有机相的活性分子的量相比的比率。尽管蛋白质负载率是指微粒中存在的活性分子的量，通常表示为重量比。

此外，对于特定应用诸如通过注射施用，可注射的颗粒的平均直径应当足够小足以注射。通常，22-25号针(394–241μm的内径)用于静脉内输注以及肌内和皮下注射。因此，特征在于低于250μm、理想地小于125μm的平均直径的颗粒被认为适合用于施用于个体。粒径和粒径分布也是蛋白质释放速率中的重要因素，因为蛋白质递送的总表面积取决于粒径[7]。

本领域中需要提供用于制备包含抗体或其它治疗、诊断或预防蛋白质的基于聚合物基质的颗粒的改进的方法。本领域中需要用于受控释放的包含抗体或其它治疗、诊断或预防蛋白质的改进的基于聚合物基质的颗粒。本领域中需要提供用于制备基于聚合物基质的颗粒的改进方法，所述基于聚合物基质的颗粒具有增加的囊化效率以便能够以商业上可行的成本制备此类颗粒。

发明概述

本发明的一个目标是提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法，其包括以下步骤：从包含蛋白质的溶液使蛋白质凝固，将凝固的蛋白质与包含聚合物基质的溶剂合并，在水中将包含聚合物基质和蛋白质的溶剂与乳剂乳化剂合并来稳定，搅拌包含聚合物基质、蛋白质和乳化剂的溶剂以形成乳剂，将包含聚合物基质和蛋白质的乳剂与水合并以允许颗粒形成，和回收颗粒。

在根据本发明的方法的另一实施方案中，通过喷雾干燥进行凝固。

在根据本发明的方法的另一实施方案中，所述聚合物是混合的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物或L-乳酸和乙醇酸的共聚物。

在根据本发明的方法的另一实施方案中，所述乳化剂是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。

在另外的实施方案中，所述稳定剂可以是氨基酸诸如脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺等，或者它可以是糖诸如蔗糖或海藻糖，或者它也可以选自多元醇诸如甘露糖醇、麦芽糖醇或山梨糖醇，或上述的任何组合。

在根据本发明的方法的另一个实施方案中，所述包含聚合物基质的溶剂是乙酸乙酯。

在另一个实施方案中，所述蛋白质是抗体。

附图简述

图1：乳化速率(4500至13500rpm)对以不同的PLGA浓度(1、10和15％)产生的负载IgG的PLGA微粒的平均粒径的影响-图1显示粒径的观察值相对于乳化速率及PLGA浓度。为了清楚起见，将平滑曲线(通过三次样条获得)添加至图中。

图2：负载IgG的PLGA微粒的扫描电子显微照片：(制剂25)表面孔隙率(a)放大倍数800x和(b)放大倍数500x和横截之后的内部形态(c)放大倍数500x和(d)放大倍数800x；添加圆圈以帮助使可见微粒。

图3：通过荧光显微镜测定的负载IgG-FITC的PLGA微粒的分布。

图4：SDIgG量(30至100mg)和外相的体积(30、65和100ml)对负载IgG的PLGA微粒的载药率(％w/w)的影响-图4显示载药率的观察值相对于SDIgG量及外相体积。为了清楚起见，将平滑曲线(通过三次样条获得)添加至图中。

图5：理论载药率(4至36％w/w)对负载IgG的PLGA微粒的囊化效率(EE％)的影响。图5显示EE％的观察值相对于理论载药率。为了清楚起见，将平滑曲线(通过三次样条获得)添加至图中。

图6：PLGA浓度(1至15％w/v)对负载IgG的PLGA微粒的突释效应(24小时之后释放的％w/wIgG)的影响-图6显示突释效应的观察值相对于PLGA浓度。为了清楚起见，将平滑曲线(通过三次样条获得)添加至图中。

图7：PLGA浓度(1至15％w/v)对从负载IgG的PLGA微粒的IgG释放性质的影响：(◆)用1％PLGA溶液产生的微粒的平均溶出曲线(n＝6)，(●)用5.5％PLGA溶液产生的微粒的平均溶出曲线(n＝3)，(▲)用10％PLGA溶液产生的微粒的平均溶出曲线(n＝16)，和(■)用15％PLGA溶液产生的微粒的平均溶出曲线(n＝9)。

图8：作为四种种类(单体(17.7min)，二聚体(15.1min)，三聚体(13.7min)和多聚集体(11.9min))洗脱的IgG样品的SEC色谱图-(a)5.5％w/vPLGA微粒的1小时时间点溶出之后的IgG，(b)1％w/vPLGA微粒的1小时时间点溶出之后的IgG，(c)溶液中的IgG粉末(非包封的冻干IgG)。

图9：PLGA浓度(1至15％w/v)对负载IgG的PLGA微粒的1小时溶出之后IgG单体的损失(％w/w)的影响-图9显示IgG单体的损失的观察值相对于PLGA浓度。为了清楚起见，将平滑曲线(通过三次样条获得)添加至图中。

图10：不同类型的PLGA对负载CDP571的PLGA微粒的溶出速率的影响。图10显示释放的CDP571的观察百分比。

图11：在5℃、25℃和40℃下储存长达12周的负载单克隆抗体的RG755S微粒的高分子量物质进展。

图12：溶出1小时、2周和4周之后释放的单克隆抗体的相对结合能力。

图13：在5℃、25℃和40℃下储存长达12周的负载单克隆抗体的(a)RG505和(b)RG755S微粒的载药率演化。

图14：在储存之前(MSbefore)(■)和在5℃(◆)、25℃(●)和40℃(▲)储存12周之后的RG505(-)和RG755S(…)的溶出曲线：累积的释放的MAb(％w/w)相对于时间(周)。

图15：皮下施用CDP571溶液(●)、CDP571:RG505微粒(■)和CDP571:RG755S微粒(▲)之后的平均血浆CDP571浓度(μg/mL)的对数相对于时间(小时)。

图16：TNF-α细胞毒性生物测定-施用MAb溶液和RG505和RG755S微粒48小时和1周之后在CDP571血浆样品上测量的EC50(ng/mL)的比较。

发明详述

本发明通过提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的新方法解决以上确定的需求。另外提供了包含聚合物基质和蛋白质诸如抗体的颗粒，其适用于动物和人中的预防、诊断、预后或治疗应用。本发明还提供包含聚合物基质和蛋白质诸如抗体的颗粒，其适用于通过注射(例如，皮下或肌内)施用于动物或人。

本发明人现在已经令人惊讶地发现，可以通过使用本发明用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的水包油包固体(s/o/w)方法来避免在水包油包水(w/o/w)方法中形成油包水(w/o)乳剂期间主要发生的蛋白质变性。

本发明的一个目标是提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法。

在第一实施方案中，本发明提供用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法，其包括以下步骤：从包含蛋白质和稳定剂的溶液使蛋白质凝固，合并凝固的蛋白质与包含聚合物基质的溶剂，在水中合并包含聚合物基质和蛋白质的溶剂与乳化剂，搅拌包含聚合物基质、蛋白质和乳化剂的溶剂以形成乳剂，合并包含聚合物基质和蛋白质的乳剂与水以允许颗粒形成，和回收颗粒。

在本发明的第二实施方案中，蛋白质凝固包括喷雾干燥包含蛋白质和稳定剂的水溶液。或者，根据本发明的蛋白质凝固包括从包含蛋白质和稳定剂的水溶液沉淀蛋白质。所述稳定剂可以是氨基酸诸如脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺等，或者它可以是糖诸如蔗糖或海藻糖，或者它也可以选自多元醇诸如甘露糖醇、麦芽糖醇或山梨糖醇。或者，可以使用上述类型的稳定剂中的任何和所有的组合。可以以10至50％稳定剂重量/蛋白质重量、优选20至30％的量将稳定剂添加至活性蛋白质水溶液中。所述水溶液通常含有15至75mg/ml、优选25至50mg/ml的蛋白质浓度。根据本发明的蛋白质凝固不要求所述凝固导致其中将蛋白质与环境分离(例如，通过维持其被其它分子包围)的颗粒。因此，在一个特定实施方案中，所述含有蛋白质和稳定剂的溶液基本上不含两性分子，使得可以在凝固过程后将蛋白质包封于颗粒中。

在本发明的第三实施方案中，在根据第一或第二实施方案的方法中，所述聚合物是混合的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物或L-乳酸和乙醇酸的共聚物。

在本发明的第四实施方案中，在根据第一、第二或第三实施方案的方法中，所述共聚物中的D,L-乳酸或L-乳酸与乙醇酸的比率为50:50至85:15，优选75:25。

在本发明的第五实施方案中，在根据第一、第二、第三或第四实施方案的方法中，理论蛋白质负载率以重量/重量计为不超过5％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、20％或25％。优选地，理论蛋白质负载率以重量/总初始颗粒组分重量计为1％至25％、3％至20％，最优选5％至15％，其中100％包括聚合物、表面活性剂、蛋白质和稳定剂，还有赋形剂(当制剂中包括它们时)的集体重量。

在本发明的第六实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四或第五实施方案的方法中，所述溶剂是二氯甲烷或乙酸乙酯。

在本发明的第七实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五或第六实施方案的方法中，所述溶剂包含1％至20％、2％至17.5％或5％至15％重量/体积的浓度的聚合物基质。

在本发明的第八实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七实施方案的方法中，所述乳化剂不是聚(乙二醇)[PEG]。

在本发明的第九实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施方案的方法中，所述乳化剂是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。

在本发明的第十实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九实施方案的方法中，所述乳化剂在水中的浓度为0.01％至10％、0.025％至5.0％、0.05％至3.0％、0.1％至2.5％、0.1％至2.0％、0.1％至2.0％重量/体积。

在本发明的第十一实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施方案的方法中，水的体积为1:25至1:150、优选1:26至1:100的有机溶剂:水体积比。

在本发明的第十二实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案的方法中，通过以3000rpm至14000rpm、3200rpm至13800rpm、3400rpm至13500rpm或5000rpm至13500rpm搅拌进行搅拌以形成乳剂。

在本发明的第十三实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二实施方案的方法中，进行至少5分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、2小时、3小时或4小时搅拌以形成乳剂。进行5分钟至1小时、5分钟至40分钟、优选30分钟所述搅拌以形成乳剂和用于随后有机溶剂的萃取和蒸发。

在本发明的第十四实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三实施方案的方法中，所述蛋白质是抗体。

在本发明的第十五实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十五实施方案的方法中，通过过滤或离心回收颗粒。

在本发明的第十六实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、或第十五实施方案的方法中，在15℃至35℃下、优选在20℃至25℃下在真空下干燥颗粒20分钟至24小时，随后回收，或者可备选地将它们冷冻干燥。

在本发明的第十七实施方案中，在根据第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十五或第十六实施方案的方法中，其中所述方法进一步包括将靶向部分连接至颗粒。优选地，所述靶向部分选自聚(乙二醇)[PEG]、聚(L-赖氨酸)-g-聚(乙二醇)(PLL-g-PEG)、抗体或其片段、受体靶向肽、或上述的任何合适组合。

本发明的第十八实施方案是通过所述实施方案中任一种的方法可获得的包含聚合物基质和蛋白质的颗粒。

本发明的第十九实施方案是根据第十八实施方案的颗粒，其用于医药中。

本发明的第二十实施方案是根据第十八实施方案的颗粒，其用作诊断剂。

本发明的第二十一实施方案是包含根据第十八实施方案的颗粒的药物组合物。

如本文所使用的术语“抗体(antibody或antibodies)”是指单克隆或多克隆抗体。如本文所使用的术语“抗体”包括但不限于通过本领域已知的重组技术生成的重组抗体。“抗体”包括任何物种、特别是哺乳动物物种的抗体；诸如人抗体的任何同种型，包括IgA₁、IgA₂、IgD、IgG1、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgG₄、IgE和IgM及其修饰的变体，非人灵长类动物抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或猕猴；啮齿动物抗体，例如来自小鼠、大鼠或兔；羊或马抗体；和骆驼抗体(例如来自骆驼或美洲驼诸如Nanobodies^TM)及其衍生物；或禽类物种的抗体诸如鸡抗体或鱼类物种的抗体诸如鲨鱼抗体。术语“抗体”还指“嵌合”抗体，其中至少一种重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，且重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本文的目的嵌合抗体包括包含源自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”的抗体。“人源化”抗体是含有源自非人抗体的序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被替换为具有期望特异性、亲和力和活性的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物的高变区[或互补决定区(CDR)]的残基。在大多数情况下，CDR以外的人(受体)抗体的残基，即，在构架区(FR)中，额外被替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化降低人中的非人抗体的免疫原性，因此有利于应用抗体以治疗人疾病。人源化抗体和生成它们的几种不同的技术是本领域中众所周知的。术语“抗体”还指可以作为人源化的备选方案生成的人抗体。例如，可能产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在不产生内源鼠抗体的情况下产生人抗体的完整所有组成成分(fullrepertoire)。例如，已经描述嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失导致完全抑制内源抗体的产生。在此种系突变小鼠中的人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致，在用所述抗原使携带人种系免疫球蛋白基因的转基因动物免疫时，产生具有针对特定抗原的特异性的人抗体。用于产生此类转基因动物的技术和用于从此类转基因动物分离和产生人抗体的技术是本领域中众所周知的。或者，在转基因动物(例如小鼠)中，仅编码小鼠抗体的可变区的免疫球蛋白基因被替换为相应的人可变免疫球蛋白基因序列。编码抗体恒定区的小鼠种系免疫球蛋白基因保持不变。以该方式，转基因小鼠的免疫系统中的抗体效应物功能和因此B细胞发育基本上不变，这可导致在体内抗原攻击之后的改善的抗体应答。一旦已经从此类转基因动物分离编码特定目的抗体的基因，编码恒定区的基因就可以被替换为人恒定区基因，以获得完全人抗体。用于体外获得人抗体抗体片段的其它方法基于展示技术诸如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用重组DNA文库，其或者至少部分人工生成或者来自供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分。用于生成人抗体的噬菌体和核糖体展示技术是本领域中众所周知的。人抗体还可以从分离的人B细胞生成，所述分离的人B细胞用目的抗原离体免疫，且随后融合以生成杂交瘤，所述杂交瘤然后可以针对最佳人抗体进行筛选。如本文所使用的术语“抗体”也指非糖基化的抗体。

如本文所使用的术语“抗体”也指抗体片段。抗体的片段包含至少一个如本领域中已知的重链或轻链免疫球蛋白结构域且结合至抗原。根据本发明的抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂以及Fv和scFv片段；以及双抗体；三抗体；四抗体；微型抗体；结构域抗体；单链抗体；由抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv构建体。如上定义的抗体片段是本领域中已知的。

本文所使用的术语“缓冲剂”是指这样的物质，通过其存在于溶液中，其增加必须添加以引起pH的单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸-碱络合物组分的作用抵抗pH的变化。用于与生物试剂使用的缓冲溶液通常能够维持氢离子的恒定浓度，使得溶液的pH在生理范围内。传统的缓冲组分包括，但不限于，有机和无机盐、酸和碱。

如本文所使用的术语“乳化剂”是通过增加其动力学稳定性而稳定乳剂的物质，该术语包括被称为“表面活性物质”的特定类的乳化剂，或表面活性剂。

如本文所使用的术语“微粒”是指具有0.3至1000μm或0.3至700μm或0.7至700μm或0.3至250μm的直径的颗粒。

如本文所使用的术语“颗粒”是指具有几种物理特性(诸如体积或质量)的小的局部化的物体，其具体包括如上所定义的微粒。更具体地，在本发明的含义内，颗粒是指包含聚合物基质和蛋白质的颗粒。

如本文所使用的术语“聚合物”是指由通过聚合过程生成的重复结构单元组成的化学化合物或化合物的混合物，由其生成高相对分子质量的特征和伴随的性质。通常，构成聚合物的单元实际上或概念上源自相对低分子量的分子。出于药物递送的目的，热塑性脂族聚(酯)，诸如聚-丙交酯(PLA)、聚-乙交酯(PGA)，特别是PLGA，由于优异的生物相容性和生物降解性而是有用的聚合物。

如本文所使用的术语“基质”是指可以由聚合物形成的三维结构。基质可以在其内部捕获或带有另一分子，诸如活性成分，其可以，例如然后经延长的时间段被释放。

如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指多个单独抗体分子的组合物，其中各单独抗体分子至少在重链和轻链的一级氨基酸序列中是相同的。对于大多数，“单克隆抗体”由多个细胞产生，并且在所述细胞中由免疫球蛋白基因的相同组合编码。通常，“单克隆抗体”由带有抗体基因的细胞产生，所述细胞源自单一祖B细胞。

相反，“多克隆抗体(Polyclonalantibody或polyclonalantibodies)”是指多个单独抗体分子的组合物，其中所述单独抗体分子在重链或轻链的一级氨基酸序列中是不同的。对于大部分，“多克隆抗体”结合至相同抗原、但不一定结合至抗原的相同部分；即抗原决定簇(表位)。通常，“多克隆抗体”由多个细胞产生且在所述细胞中由抗体基因的至少两种不同组合编码。

如本文所公开的抗体针对目的“抗原”。优选地，所述抗原是生物学重要的多肽，且将抗体施用于患有疾病或病症的哺乳动物可以导致在该哺乳动物中产生治疗益处。然而，也可以考虑针对非多肽抗原的抗体。当所述抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体诸如生长因子或细胞因子。本发明涵盖的抗体的优选分子靶标包括CD多肽诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD34、CD38、CD40、CD80、CD86、CD95和CD154；HER受体家族的成员诸如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子诸如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整合素，包括其α或β亚基(例如，抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；趋化因子和细胞因子或它们的受体，诸如，IL-1α和β，IL-2，IL-6，IL-6受体，IL-12，IL-13，IL-17形式，IL-18，IL-21，IL-23，IL-25，IL-27，TNFα和TNFβ；生长因子诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C；G-CSF，G-CSF受体，GM-CSF，GM-CSF受体，M-CSF，M-CSF受体；LINGO；BAFF，APRIL；OPG；OX40；OX40-L；和FcRn。

在另外的实施方案中，本发明提供用于产生根据本文的任何实施方案的包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法，其中所述颗粒进一步被修饰以连接靶向部分。本发明的含义内的优选靶向部分包括但不限于PEG、PLL-g-PEG、抗体或其片段、受体结合肽或上述的组合。用于添加所述靶向部分的方法可以根据待使用的特定部分、靶标组织或细胞和靶向部分的期望组合而变化。

在另外的实施方案中，本发明提供用于治疗动物、哺乳动物或人受试者的方法，其包括将治疗有效量的本文公开的任何实施方案的颗粒或药物组合物施用于动物、特别是哺乳动物或人受试者，其中所述动物、哺乳动物或人受试者具有可以通过用所述颗粒或药物组合物治疗而减轻的病症，其中所述病症是癌症、自身免疫性或炎性病症，诸如例如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病。

对于上述疾病的治疗，适当的剂量将根据，例如，待采用的特定蛋白质或抗体、所治疗的受试者、施用模式和所治疗的病况的性质和严重度而变化。用于用本发明的颗粒治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的优选剂量方案包括，例如，以1μg至1g的量施用包含抗体的颗粒。

根据本发明的任何实施方案的颗粒或药物组合物优选通过皮下注射途径施用。根据本发明的任何实施方案的药物制剂也可以通过肌内注射施用。所述药物组合物可以使用注射器或注射装置诸如自动注射器来注射。待注射的药物组合物将包含10至40％重量/体积浓度的微粒，优选20至30％重量/体积。

如本文说明书中所使用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可意指一个/种或多个/种。如本文和权利要求中所使用，当结合词语“包含”使用时，词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可意指一个/种或多于一个/种。

如本文所使用的术语“或”意指“和/或”，除非明确指明，只指备选，或备选是相互排斥的，尽管本公开支持是只指备选和“和/或”的定义。

本发明的其它目的、特征和优点从以下详述将变得显而易见。然而，应当理解，详述和具体实施例，尽管指示本发明的优选实施方案，仅以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和改变对于本领域技术人员而言从该详述将变得显而易见。

本文引用的所有参考文献，包括期刊论文或摘要，公开的或未公开的美国或外国专利申请，授权的美国或外国专利或任何其它参考文献，都通过引用完整地并入本文，包括引用的参考文献中呈现的所有数据、表格、附图和文本。此外，本文引用的参考文献中引用的参考文献的全部内容也通过引用完整地并入。

实施例

实施例1

材料

IgG用作模型分子且作为冻干粉末购自Equitech(Kerrville,USA)。由BoehringerIngelheim(Ingelheim,Germany)提供的PLGA(RG504、RG505和RG755S，特征在于分别50:50、50:50和75:25的丙交酯:乙交酯比率)用作可生物降解的聚合物。乙酸乙酯(EtAc)(SigmaAldrich,Diegem,Belgium)在s/o/w包封过程期间用作有机溶剂。MC(Merck,Darmstadt,Germany)用于在包封效率评估期间溶解PLGA。聚乙烯醇(PVA)-87-90％水解-和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Sigma-Aldrich,Diegem,Belgium)用作稳定剂。由SigmaAldrich(Diegem,Belgium)提供的甘露醇和L-组氨酸在喷雾干燥过程期间用于稳定IgG。磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.2)(SigmaAldrich,Diegem,Belgium)用于缓冲IgG溶液。异硫氰酸荧光素(FITC)、二甲基甲酰胺(DMF)和50mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)(PierceBiotechnology,Rockford,USA)用于标记IgG。使用具有0.2μm的孔隙率的尼龙过滤器(Millipore,Billerica,USA)回收颗粒。Amicon15-30K膜(Millipore,Billerica,USA)用于进行渗滤。

使用喷雾干燥方法制备IgG微粒

使用微型喷雾干燥器B-190(BüchiLabortechnik,Flawil,Switzerland)和先前优化的工艺参数喷雾干燥25mg/ml浓度的IgG水溶液(在20mM组氨酸缓冲液(pH6.0)30％(w/w)甘露糖醇中的)。入口温度(Tin)和液体流速分别设定为130℃和3ml/分钟。干燥空气流速固定于30m³/小时，且雾化流速固定于800l/小时。所得出口温度(Tout)为80℃。

通过s/o/w乳剂将IgG微粒包封于PLGA颗粒中

使用s/o/w乳剂蒸发/萃取方法包封IgG。简而言之，将PLGA在磁力搅拌下以1-15％(w/v)的浓度范围在室温下溶解于5mlEtAc中。通过使用设定在13500rpm的T25数字高效分散机(Staufen,Germany)将30-150mgIgG喷雾干燥的粉末(SDIgG)添加至PLGA有机溶液中来形成油包固体(s/o)分散体。将该悬浮液添加至30-100ml含有0.1-2％(w/v)表面活性剂诸如PVA或PVP的水性外相且使用搅拌器以3400-13500rpm搅拌下维持。最后，将s/o/w乳剂添加至额外体积的水中(100-400ml萃取阶段)，以产生最终的s/o/w乳剂。将所得乳剂在大气压下在磁力搅拌下维持30分钟，以允许同时萃取和蒸发EtAc。由于该聚合物不溶于水，所以制备含有包封的IgG的颗粒。这是因为水相中的EtAc的快速萃取导致该聚合物的快速凝固。将颗粒通过过滤回收，用MilliQ水洗涤几次，且在室温下在真空下放置48小时。

粒径和形态评估

使用MalvernMastersizerHydro2000S(MalvernInstruments,Malvern,UK)一式三份测量IgG:PLGA颗粒和喷雾干燥(SD)的IgG微粒两者的粒径分布。SDIgG微粒在分散于异丙醇之后通过激光衍射进行分析。1.52的折射率用于IgG微粒。在作为分散介质的水中分析PLGA颗粒，对于水和PLGA分别使用1.33和1.55的折射率。在中值直径d(0.5)和d(0.9)的方面评估粒径分布，所述中值直径d(0.5)和d(0.9)分别是在其下有50％和90％的颗粒的直径。

使用具有HiroxMXG-5040RZ光学系统的HiroxKH-7700(HiroxCoLtd,Tokyo,Japan)进行光学显微镜分析，以评估产生的颗粒的形态。将颗粒重新分散于蒸馏水中且置于载玻片上。

使用具有环境室的扫描电子显微镜(来自Philips(Eindhoven,Holland)的型号XL30ESEM-FEG)观察聚合颗粒的表面形态和内部孔隙率。该显微镜配备有场发射枪。使用10kV的加速电压的二次电子(地形对比(topographiccontrast))获得图像。为了观察外表面，将颗粒沉积于粘合导电载体(碳)上。在将该样品在环氧树脂中包衣且用显微切片机钻石刀将其切割和抛光之后，获取截面图且实施内部孔隙率评估。

PLGA颗粒内的药物分布的评估

使用IgG-FITC缀合物和荧光显微镜研究位于PLGA颗粒中的IgG分子的分布。使用ThermoScientific说明书[18]中描述的详细方法进行IgG标记。简而言之，将溶解于DMF中的15至20倍摩尔过量的FITC添加至5mg/mLIgG溶液(50mM硼酸盐缓冲液pH8.5)。然后在室温下在黑暗中孵育1小时之后，使用10％(w/w)甘露糖醇/20mM组氨酸缓冲液(pH6)和15-30K离心过滤装置通过缓冲液交换去除过量和水解的FITC。然后将IgG-FITC缀合物喷雾干燥，且使用先前描述的s/o/w包封方法使用优化的工艺参数包封70mg所得IgG微粒。通过荧光显微镜使用PerkinElmerLS55观察PLGA颗粒内的药物分布。

IgG测定和稳定性评估

对于溶出研究和包封效率评估，通过大小排阻高效液相色谱(SEC)使用具有UV检测器的HPLC系统Agilent1100(AgilentTechnologies,Waldbronn,Germany)实施IgG单体的定量和聚集体及片段含量的评估。使用TSKGelG3000SWXL柱(TosohBioscienceGMBH,Stuttgart,Germany)(7.8mmIDx30.0cm长度)，与TSKGelGuardcolSWXL5保护柱(TosohBioscienceGMBH,Stuttgart,Germany)(6.0mmIDx4.0cm)，其具有0.5ml/分钟流速，20ml注射体积，且在280nm处检测。流动相由0.05M磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.2)构成。使用对应于包封步骤之前和之后的单体百分比的差异的单体损失的百分比评估IgG的稳定性。使用用已知浓度的IgG冻干粉末构建的校准曲线来测定IgG单体的浓度。使用Bio-Rad凝胶过滤标准(范围为1350至670,000道尔顿的分子量标记物的冻干混合物)评估所检测种类的分子量。(Bio-RadLaboratories,Hercules,USA)。

在装备有SoloVPE光纤的50BioUV/VIS分光计(CTechnologies,Inc.,Bridgewater,USA)上使用在280nm的UV光谱测定法进行总IgG检测。

包封效率和载药率评估

IgG至PLGA颗粒中的载药率是掺入的IgG的测量量和PLGA和含有抗体和惰性物质的喷雾干燥的IgG的总量之间的比率。EE％是指在颗粒中检测到的IgG的量与初始引入有机相中的IgG的量相比的比率。将5-20mgIgG:PLGA颗粒与750μlMC接触以溶解聚合物。以8800rpm离心15分钟，使用PBS(4x750μl)进一步提取IgG。收集水相，且通过SE-HPLC分析其载药率、EE％和稳定性评估。先前对非包封的IgG冻干粉末检查完全回收和降解的缺乏。

溶出研究

通过将1mlPBS缓冲液(pH7.2)添加至2ml管中的30mg颗粒来评估IgG从IgG:PLGA颗粒的溶出性质。将管在37℃孵育，且使用Thermomixer(EppendorfAG,Hamburg,Germany)以600rpm搅拌。在预定时间，将样品以12000rpm离心15分钟。收集上清液(1ml)，且在0.2μmHDPEMillex过滤器(Millipore,England)上过滤。将颗粒悬浮于新鲜PBS溶液中。然后通过SE-HPLC测量释放的IgG的百分比。突释效应是一天后释放的IgG的百分比。

实验设计

探索s/o/w包封过程中的八个过程和配制变量的主要影响。研究的因素是：有机相中的PLGA浓度，外相中的稳定剂浓度，外相的体积，s/o/w乳化时间，s/o/w乳化速度，萃取相的体积，和外相稳定剂的类型。然后还评估喷雾干燥的IgG的量。所选输出是粒径、载药率、包封效率、溶出性质和IgG在包封过程和溶出中的稳定性。

使用8.0.2版本JMP统计软件(SAS,NC,USA)构建具有八种制剂和3个中心点重复(从制剂1至制剂11)的筛选设计，以评估所选因素的主要影响。然后用额外制剂(从制剂12至制剂34)完成筛选设计，以评估二阶相互作用和有机溶剂中的PLGA浓度、s/o/w乳化速率、s/o/w乳化时间和分散于有机相中的SDIgG的量的二次效应。构建基于这些输入-输出关系的数学模型，用于筛选设计和延伸设计。使用最小二乘法测定所研究的参数的影响。

结果

对不同的输出特征评估先前段落中定义的研究因素的影响。评估的制剂总结于下表1中：

表1：实验设计-工艺和配制参数

表1：实验设计-工艺和配制参数

表1：实验设计-工艺和配制参数

评估的制剂的结果详述于下表2中：

表2：实验设计–测试的制剂的结果

表2：实验设计–测试的制剂的结果

实施例2

以与前面实施例类似的方式，遵循相同的方法制备含有针对TNF-α的单克隆抗体CDP571的微粒制剂。

简言之，使用10％重量/体积(w/v)浓度的PLGA、1％(w/v)稳定剂和100ml的额外外相通过上述过程制备微粒，通过在1分钟期间以13500rpm搅拌将混合物乳化，且使用400ml的额外萃取体积。分析在稳定剂、缓冲剂和PLGA方面的不同的条件。随后的冷冻干燥过程用于制备CDP571微粒。图10显示关于改变用于获得含有CDP571的微粒制剂的PLGA的类型对蛋白质释放的影响的分析。

实施例3

通过上述过程(其中将抗TNFα单克隆抗体包封至17.4％理论载药比)使用10％(w/v)PLGA(特征分别在于50:50和75:25的丙交酯:乙交酯比率的RG505或RG755S)制备微粒。将s/o分散体添加至含有1％w/v聚乙烯醇的水溶液，且在搅拌下维持。用水洗涤之后，将过滤的微粒在20℃下在真空下干燥，且在5±3℃、25±2℃/60％相对湿度和40±2℃/75％相对湿度置于封闭小瓶中，持续长达12周。

使用MastersizerHydro2000S(MalvernInstruments,UK)测量粒径。通过环境扫描电子显微镜(ESEM)评估表面形态。在将PLGA微粒浸入DCM中且用PBS缓冲液萃取之后，通过总MAb测定使用UV光谱测定法(在280nm)评估载药率和包封效率(EE％)。通过大小排阻色谱(SEC)测量高分子量种类(HMWS)的水平。通过在37℃下在搅拌下于PBS缓冲液中孵育评估mAb从PLGA微粒的体外溶出性质。通过ELISA测试使用96孔板上固定的TNFα测定结合能力。通过生物测定(细胞毒性中和测定)测定抗体的相对抗TNF活性。

当在5℃和25℃下储存12周时，该微粒的体积直径是稳定的。相反，体积直径在40℃下储存6周之后增加，特别是对于RG505微粒(从69.3μm至291.1μm)，并且对于RG755S微粒程度较小(从38μm至60μm)。对于在5℃下储存12周的RG505或RG755S微粒，通过ESEM没有观察到附聚。在40℃下，观察到凝聚的RG505微粒。在5℃或40℃下储存之后，用RG755S微粒没有观察到附聚。

高分子量种类(HMWS)含量当在25℃储存时随着时间增加，甚至在40℃储存时增加更快(图11)。当包封于RG755S微粒时，抗体的结合能力在储存后或溶解期间没有变化。抗体，4周孵育之后从在40℃下储存4周的RG505微粒释放，呈现出(67±12)％的相对结合能力，相比之下，在溶出1小时之后在T0测量的相对结合能力为(108±12)％(图12)。在包封过程和储存中保持从RG505和RG755S微粒释放的抗体的抗TNF活性。

抗体负载率(％)似乎在RG755S微粒稳定得多(图13)。在40℃4周之后，抗体含量似乎减少。当使用RG755S时，抗体量的减少更低，因为该聚合物的特征在于较高的丙交酯:乙交酯比率和因此较慢的酸性降解速率。

在溶出研究中，4周测试之后从新鲜制备的RG505微粒微粒释放的抗体含量(84.9±9.8％)高于RG755S微粒释放的抗体含量(47.0±0.6％)。在5℃下，12周储存之前和之后两种微粒的释放性质之间没有观察到差异。24小时释放之后评估的突释效应随着储存的持续时间和温度增加，其中在40℃下6周之后检测到的最大值。(图14)

实施例4

通过施用50mg/kgCDP571的单一皮下施用和评估该抗体的血浆PK性质在大鼠中分析本发明的微粒在体内情况下的行为。

喷雾干燥如先前所述制备的CDP571水溶液，其在～30％(w/w)海藻糖于20mM组氨酸pH6.0缓冲液中具有40mg/mLCDP571浓度。然后产生四批负载CDP571的RG505微粒和四批负载CDP571的RG755S微粒，并且在重悬浮于1mL0.5％(w/v)海藻糖溶液中之后冷冻干燥。

在10.0±0.03％(w/w)和12.5±0.2％(w/w)测量RG505和RG755S微粒的载药率。临施用前，将冷冻干燥的微粒重悬浮于适当体积的水中，以制备15％(w/v)悬浮液。对于RG505和RG755S微粒，待施用用于以50mg/kg抗体给药的体积分别为3.3mL/kg和2.7mL/kg。

将含有海藻糖和组氨酸(pH6.0)的20mg/mLCDP571溶液用作比较物，其以2.5mL/kg施用。

使用具有22G针头的1mL注射器注射测试的制剂。对于各组，在右侧腹皮下注射测试的制剂。在左侧腹皮下注射分别的对照安慰剂。在研究结束时，收集注射部位(对照和测试)的皮肤且准备用于组织学检查。

对于血浆浓度分析，在肝素锂上经由尾静脉收集血液样品，且离心以分离血浆。将血浆样品储存于-90℃。通过ELISA测量CDP571的血浆浓度。

在相同大鼠的对侧注射相应的安慰剂制剂作为对照。

如图15中可以观察到，CDP571血浆浓度随着时间的性质显示，当与含有抗体的溶液相比，该微粒能够经7周期间维持更大的血浆水平。

含有CDP571的微粒导致以下抗体血浆水平性质，其显示从施用起6小时至1周内达到峰值的最初增加，随后在分析的6周内的低减少。

另一方面，在皮下施用CDP571溶液之后，在48小时之后观察到最大血浆浓度，其后CDP571浓度随着时间降低，并且在施用之后4周不再可被检测到。

两种PLGA制剂的特征在于类似的Cmax(对于RG505和RG755S微粒分别为29.0±13.4和30.3±6.99μg/mL)，其低于对于CDP571溶液计算的Cmax(112.0±14μg/mL)。Cmax是如通过ELISA测定的CDP571溶液的最大血浆浓度。此外，对施用3种不同的制剂之后48小时和1周之后取出的血浆样品评估CDP571的抗TNF活性。

使用由使用WHI164细胞的TNF-α细胞毒性中和测定组成的生物测定来测定各样品中的CDP571的效力。在SoftMax软件的帮助下从绘制细胞活力相对于抗体浓度的剂量-应答曲线计算EC₅₀值。该值代表抗体浓度，所述抗体浓度诱导观察到的最大中和效应的50％。在皮下施用溶液或任一本发明的微粒中的CDP571之后48小时和1周取出血浆样品，且评估3个测试组的EC₅₀。所得值范围为34至54ng/mL，当与56ng/mL的参考值相比时，其证实皮下施用之后维持抗体的抗TNF-α活性(图16)。通过计算溶液中的完整CDP571(即没有体内施用)的EC₅₀来获得参考值。

最后，为了分析由抗体施用导致的可能的炎症反应，将来自各大鼠研究的组织样品固定于10％福尔马林中，且将切片浸入石蜡中且使用显微切片机切割。经由组织学检查(使用苏木精和曙红染色)来确定PLGA微粒的炎症效应。

施用聚合微粒或生物化合物之后，没有任何证据证明表皮和真皮之间的血浆浸润或真皮淋巴细胞浸润。免疫细胞的数目似乎不受聚合微粒或对照的施用影响。在处理大鼠或对照大鼠上观察到相同性质。此外，没有皮肤结构改变的证据，例如表皮的厚度没有改变。宏观上，在任一测试大鼠的注射部位上和对于任一施用制剂没有观察到任何炎症的显著证据，诸如发红、水肿、增加局部热。所以，得出结论：PLGA微粒没有导致该微粒的紧邻处的炎症反应。

参考文献列表

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Claims (15)

1.用于制备包含聚合物基质和蛋白质的颗粒的方法，其包括以下步骤：

a)从包含所述蛋白质的溶液使蛋白质凝固，

b)将凝固的蛋白质与包含所述聚合物基质的溶剂合并，

c)在水中将包含所述聚合物基质和所述蛋白质的溶剂与乳化剂合并，

d)搅拌包含所述聚合物基质、所述蛋白质和所述乳化剂的溶剂以形成乳剂，

e)将包含所述聚合物基质和所述蛋白质的乳剂与水合并以允许颗粒形成，和

f)回收所述颗粒。

2.根据权利要求1或2的方法，其中所述聚合物是混合的D,L-乳酸和乙醇酸的共聚物或L-乳酸和乙醇酸的共聚物。

3.根据权利要求3的方法，其中所述共聚物中的D,L-乳酸或L-乳酸与乙醇酸的比率为75:25。

4.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述溶剂是乙酸乙酯。

5.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述溶剂包含浓度在1％至20％重量/体积的聚合物基质。

6.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述乳化剂是聚乙烯醇。

7.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述乳化剂在水中的浓度为0.05％至3.0％重量/体积。

8.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述水的体积为1:26至1:100的有机溶剂:水体积比。

9.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中通过以3400rpm至13500rpm搅拌来进行搅拌以形成乳剂。

10.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中进行至少30分钟搅拌以萃取溶剂。

11.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述蛋白质是抗体。

12.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中通过过滤来回收所述颗粒。

13.根据权利要求1至16中任一项的方法，其中所述颗粒在真空下持续至少1小时干燥，随后回收，或通过冷冻干燥来干燥。

14.包含聚合物基质和蛋白质的颗粒,其是通过权利要求1至17中任一项的方法可获得的。

15.药物组合物，其包含根据权利要求18的颗粒。