CN105188759A - 持续释放递送的组合物以及在制造过程中稳定蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

如本文所述的，通过施用一种或多种微粒进行的治疗剂(如蛋白质)的控制和持续施用可改善病状(如不希望的眼部病状)的治疗。可配制微球以提供蛋白质的持续释放，同时减少蛋白质聚集体的数量、获得理想的释放曲线以及增加微球制剂内蛋白质的稳定性。

Description

持续释放递送的组合物以及在制造过程中稳定蛋白质的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/786,035的权益，该申请的全部内容以引用的方式并入本文。
背景
领域
本公开一般涉及用于持续递送活性剂(例如蛋白质)的制剂。
背景技术
将药物递送至人类动物的身体，尤其是递送至人类或动物的眼睛(包括视网膜、玻璃体和葡萄膜)通常是通过高剂量全身给予眼内注射包含活性剂(如蛋白质)的组合物来实现的。
在合适载体(如微球)中稳定活性剂(如蛋白质)可能出现挑战。然而，通过一些不同的应力(如浓度、剪切和界面应力)包封蛋白质至微球制剂中的过程通常使蛋白质不稳定。这些过程应力的影响可能造成蛋白质变性和聚集，导致生物利用度降低和潜在不利的免疫反应。
除了过程应力之外，包封在聚合物基质中的蛋白质通常经受来自生理环境的不利条件以及来自聚合物基质内的微环境。在生理环境水平下，蛋白质经受高温(如37℃及以上)。在微环境水平下，蛋白质还经受初始水合阶段的浓度效应、pH改变以及基质中所使用聚合物的疏水效应。通过此类事件(如聚集、化学修饰和断裂)，这些环境条件可能对于蛋白质长期稳定性是不利的并且最终限制其效力和可用性。
概述
本文公开了制剂、制备制剂的方法和使用制剂的方法，该制剂包含包封在聚合物网络内具有高效率和高质量的蛋白质以确保持续递送很长一段时间。
在一个实施方案中，物质组合物包含颗粒，颗粒包含蛋白质、生物可降解的聚合物和一种或多种赋形剂。颗粒可被配置用于递送蛋白质持续不少于2个月的时间段。在一些实施方案中，生物可降解的聚合物包含特性粘度在0.1dL/g至1.0dL/g的范围内的特性粘度聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)、聚(d,l-丙交酯)和/或聚乙二醇共聚物。根据一些实施方案，蛋白质的分子量在10kDa至150kDa范围内。在一个实施方案中，一种或多种赋形剂包括环糊精、海藻糖、精氨酸或其组合。根据一个实施方案，环糊精是磺丁基醚-β-环糊精。
在另一个实施方案中，水性制剂包含蛋白质、缓冲液和选自由环糊精、海藻糖和精氨酸组成的组的一种或多种赋形剂。该一种或多种赋形剂可以相对于蛋白质摩尔浓度而言在10/1至200/1范围内的摩尔比存在于水性制剂中。
附图简述
现在将参照下面概述的附图对这些和其它特征进行描述。提供这些附图和相关描述是用来说明本发明的一个或多个实施方案而不是限制本发明的范围。
图1示出了比较示例性实施方案的可溶性蛋白质回收率的柱形图。
图2描述了比较其它示例性实施方案的可溶性蛋白质回收率的柱形图。
图3示出了比较另外其它示例性实施方案的可溶性蛋白质回收率的柱形图。
图4显示示出微球的示例性实施方案的释放曲线的图。
图5描述示出微球的示例性实施方案的释放曲线的图。
图6显示示出微球的示例性实施方案的释放曲线的图。
图7描述示出微球的示例性实施方案的释放曲线的图。
图8显示示出微球的示例性实施方案的结合活性的图。
图9描述示出微球的示例性实施方案的释放曲线的图。
详述
如本文所述的，通过施用一种或多种微粒控制和持续施用治疗剂(如蛋白质)可改善病状(如不希望的前段或后段眼部病状)的治疗。微粒包含药学上可接受的聚合物组合物，并且被配制成在长时间段内释放一种或多种药物活性剂(如蛋白质)，或其它降低眼内压的或神经保护性药剂。对微球可进行配制以提供蛋白质的持续释放，同时减少蛋白质聚集体的数量、获得理想的释放曲线以及增加微球制剂内蛋白质的稳定性。
以下术语定义如下，除非词语的上下文示出不同的意思。
如本文所用，“微球”或“微粒”，可互换地用于指代颗粒、微球、微粒、超细粉末等，其包括包封或掺入治疗组分的生物相容性基质。根据一些实施方案，微球不包括纳米颗粒或纳米球。微球通常可与人器官(如眼睛)的生理条件生物相容，并且不造成不良副作用。在不破坏眼睛视力情况下，可以安全地使用结膜下施用的微球。在一些实施方案中，微球具有的最大尺寸(如直径或长度)小于1mm。例如，微球的最大尺寸可能小于约500μm。微粒的最大尺寸还可不大于约200μm，或最大尺寸为约30μm至约50μm以及其它尺寸。
如本文所用，“治疗组分”是指除了聚合物基质之外包含一种或多种治疗剂或用以治疗眼部医学病状的物质的微球部分。治疗组分可以是微球的离散区域，或它可均匀分布于整个微球。治疗组分的治疗剂可包含至少一种蛋白质，通常是眼睛可接受的，并且以当把微球放在眼内时不造成显著不良反应的形式来提供。
如本文所用，“蛋白质”应该具有如本领域中已知的通用含义，并且可指由一条或多条氨基酸链组成的大的生物分子。蛋白质可以在活性生物体内执行大量功能，该功能包括催化代谢反应、复制DNA、对刺激作出响应以及将分子从一个位置运输至另一位置。蛋白质可以是直链、支链或环状，并且可以是化学合成或天然或重组产生的。在一些实施方案中，蛋白质还可包括修饰的蛋白质(如聚乙二醇化的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质)。
如本文所用，“药物持续释放组分”是指有效提供治疗剂从微球中持续释放的微球部分。药物持续释放组分可为生物可降解的聚合物基质，或它可为覆盖包含治疗组分的微球核心区域的包衣。
如本文所用，“与……缔合”是指与……混合、分散于……中、与……偶联、覆盖或包围。
术语“生物可降解的聚合物”是指体内降解的一种或多种聚合物，并且其中一种或多种聚合物随时间的侵蚀与治疗剂的释放同时发生或在其之后发生。术语“生物可降解的”与“生物可侵蚀的”为等效的且在本文可互换使用。生物可降解的聚合物可为均聚物、共聚物或包含两种以上不同聚合单元的聚合物。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗病状(如眼睛病状)或减少或预防眼睛损伤或损害而对眼或眼区域没有造成显著的消极或不良副作用所需的药剂的水平或数量。鉴于上文，治疗剂(如蛋白质)的治疗有效量为有效减轻眼睛病状的至少一种症状的数量。
本领域技术人员将会理解本文使用的程度的各个术语的含义。例如，如本文在提及数量(例如“约6％”)的上下文中使用的，术语“约”表示接近并包括仍执行所需功能或获得所需结果的所述量的量，例如“约6％”可包括6％以及仍执行所需功能或获得所需结果的接近6％的量。例如，术语“约”可指小于所述量的10％以内、小于所述量的5％以内、小于所述量的0.1％以内或小于所述量的0.01％以内的量。
蛋白质
根据一些实施方案，制剂或微球制剂含有蛋白质，本文中也称之为蛋白质组分。蛋白质可以是直链、支链或环状的。蛋白质可以是融合蛋白。在一些实施方案中，相对于蛋白质天然存在的形式，可以将其截短。蛋白质可包括不超过单条氨基酸链或两条或更多条氨基酸链。如果蛋白质含有两条以上氨基酸链，则两条或更多条链可以共价地或非共价地相互缔合。例如，氨基酸链可以通过二硫键缔合，或两条或更多条链可以仅通过非共价力相互缔合。根据一些实施方案，蛋白质不含有合成的或翻译后修饰的氨基酸。蛋白质可以重组(例如通过哺乳动物或原核细胞培养物)、合成(例如通过固相合成)、或可以从天然来源(例如哺乳动物或细菌细胞培养物、血浆、血清、植物、真菌等)分离而产生。
可被包括在制剂和微球制剂中并且因此被递送的蛋白质的非限制性实例包括单克隆或多克隆抗体、双特异性抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗钙素(anticalin)、DARPin和酶。其它实例包括糖蛋白和血清白蛋白。如果使用的话，单克隆或多克隆抗体可以以其天然形式(如例如通过细胞产生的)使用，并且可含有或可不含有翻译后修饰，或可以以化学或酶促修饰的形式使用，该形式是在将其从细胞培养物或其它生物样品中分离出来之后产生的。如果使用的话，抗体可以是嵌合的。在一些实施方案中，抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。抗体片段包括通过抗体的木瓜蛋白酶(例如Fab片段)或胃蛋白酶裂解产生的那些。更通常的是，有用的抗体片段包含Fab'、F(ab)2、Fabc和Fv片段。在一些实施方案中，可以使用补体抗体片段。抗体片段可以通过修饰全抗体或用重组DNA方法重新合成而产生，并且还包括通过现在的常规技术制成的“人源化”抗体。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合结构域或可变结构域。
一些实施方案提供包含抗VEGF抗体或蛋白质(即，特异性结合血管内皮细胞生长因子蛋白质或VEGF-A的抗体或蛋白质)的制剂和微球制剂。有用的抗VEGF抗体包括但不限于雷珠单抗和贝伐单抗有用的抗VEGF蛋白质包括阿柏西普(Aflibercept)(也称为VEGF捕获剂)、VEGF结合DARPin和VEGF结合抗钙素。VEGF捕获剂(RegeneronPharmaceuticals,NewYork)是融合蛋白质，其含有与人抗体的Fc区域(C端)连接的两种不同的VEGF受体的胞外结构域的部分。在一些实施方案中，制剂或微球制剂可包含选自由以下组成的组的抗体：抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、抗PDGF(血小板衍生的生长因子)抗体、抗整合蛋白抗体、其治疗上有效的片段及其组合。
在另一个实施方案中，制剂或微球制剂可包括包含抗TNF(肿瘤坏死因子)抗体或蛋白质的蛋白质。抗TNF抗体的实例包括但不限于阿达木单抗英夫利昔单抗赛妥珠单抗和戈利木单抗有用的抗TNF蛋白质包括融合蛋白质依那西普包括抗TNF蛋白质的制剂和微球制剂可对治疗葡萄膜炎和贝切特氏病(Behcet'sdisease)特别有用。
根据一些实施方案，蛋白质可包括生长因子(如神经生长因子、酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)；神经营养因子(如睫状神经营养因子、脑衍生的神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子)；细胞因子(如干扰素-γ和白介素-10)；抗增殖化合物(如利妥昔单抗)；和溶纤维蛋白酵素(fibrinolysing)蛋白质(如组织纤溶酶原活化物)。此类蛋白质的治疗用途通常可以是本领域中已知的。
因此，根据一些实施方案，制剂或微球制剂可包含选自由以下组成的组的抗体：抗VEGF抗体(特异性结合VEGF的抗体)、抗PDGF抗体、抗VEGF受体抗体、抗整合蛋白抗体、其治疗上有效的片段及其组合。
血管内皮生长因子A(VEGF-A，也称作VEGF)是一种分泌的对血管内皮细胞特异性的促分裂原，其可以刺激体外内皮细胞生长和体内血管生成。VEGF-A可能出现不同的同种型。除了VEGF-A121，VEGF-A的所有同种型结合肝素。人类中最丰富的VEGF-A同种型是165-氨基酸多肽、VEGF-A165。参见，例如Houck等,Mol.Endocrin.5:1806(1991)和Leung等,Science246:1306(1989)。
因此，一些实施方案提供包含生物可降解的聚合物基质和蛋白质的微球制剂，该蛋白质包括抗体、DARPin或结合VEGF-A165的抗钙素，基本上由它们组成，或由它们组成。相同的抗体、DARPin或抗钙素可以识别和结合所有VEGF-A的同种型，这是由于抗体、DARPin或抗钙素可以识别存在于所有VEGF-A的同种型的表位。例如，抗体、DARPin或抗钙素可以识别和特异性结合在存在于所有VEGF-A同种型(包括VEGF121)的VEGF-A受体结合结构域的区域中的表位。因此，在制剂或微球制剂中，单个抗VEGF抗体(或DARPin或抗钙素)可以识别和特异性结合VEGF-A的所有同种型。描述了与VEGF-A或VEGF受体结合的抗体，包括单克隆抗体和人源化抗VEGF抗体。参见，例如美国专利5,955,311和美国专利6,884,879。贝伐单抗是一个特异性结合并抑制人VEGF-A的单克隆抗体的实例。还描述了针对PDGF的抑制抗体。参见，例如WO2003/025019。因此，微粒可包含蛋白质，该蛋白质包括抗钙素，基本上由其组成，或由其组成。
包含VEGF(血管内皮生长因子)或血小板衍生的生长因子(PDGF)抑制剂或两者都有(如在体内特异性结合VEGF和/或PDGF的抗体或抗体组合)的制剂或微球制剂，对治疗有需要患者中黄斑变性(包括湿性年龄相关性黄斑变性)、视网膜病、糖尿病性视网膜病、增殖性糖尿病性视网膜病、镰状细胞视网膜病、早生儿视网膜病、局部缺血性视网膜病、眼部新生血管形成(在眼中新血管的异常生长)、脉络膜新生血管形成、由于视网膜静脉阻塞引起的新生血管形成、角膜新生血管形成、糖尿病性视网膜局部缺血和黄斑水肿具有特殊的用途。
在一个实施方案中，制剂或微球制剂包含生物可降解的聚合物基质和第一抗体以及第二抗体或分别特异性结合VEGF和PDGF的双特异性抗体，其中在哺乳动物的眼睛中放入制剂或微球制剂之后，该制剂或微球制剂提供生物活性形式的第一抗体和第二抗体或双特异性抗体的连续释放，持续至少30天、60天或90天。在一种形式中，抗体或双特异性抗体对血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和血小板衍生的生长因子-B(PDGF-B)具有特异性。这些制剂或微球制剂可对治疗眼部肿瘤、眼部新生血管形成、脉络膜新生血管形成和黄斑变性特别有用。"PDGF-B"意指PDGF的B链多肽。
本发明的制剂和微球制剂被设计用于保持抗体的生物活性，使得当从系统中释放抗体时，抗体将与其指定的靶蛋白特异性结合。抗体与靶蛋白结合可在蛋白质与其配体或受体之间提供干扰，由此抗体抑制或减少通过蛋白质/受体相互作用介导的功能。在本领域中测定是否抗体特异性结合靶蛋白(多肽)或与靶蛋白(多肽)“免疫反应”的几种方法是已知的。免疫化学发光度量测定(ICMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)是一些实例。
在一些实施方案中，制剂和微球制剂可包含生物可降解的聚合物基质和蛋白质(如一种或多种单克隆抗体、双特异性抗体、DARPin、抗钙素、抗体片段、衍生自抗体可变区的重组多肽、或其混合物)，该蛋白质与VEGF或血小板衍生的生长因子(PDFG)或VEGF和PDFG两者相互作用(例如结合并减少或抑制其活性)。例如，根据一个实施方案，制剂或微球制剂包含生物可降解的聚合物基质和特异性结合VEGF和PDFG的双特异性抗体，其中在哺乳动物眼中放入制剂或微球制剂后，制剂或微球制剂提供生物活性形式的抗体的连续释放，持续至少90天。在另一个实施方案中，制剂和微球制剂可包含生物可降解的聚合物基质和对VEGF受体特异性的抗体。
在制剂和微球制剂中有用的单克隆抗体可使用本领域中普通技术人员已知的常规方法而获得。简单地说，对动物(如老鼠)注射期望的靶蛋白或其部分(抗原)(如VEGF或VEGFR)。靶蛋白可以与载体蛋白偶联。用一种或多种靶蛋白注射给动物加强免疫，并且在融合之前3天通过静脉内(IV)加强对动物进行超免疫。从小鼠分离脾细胞并通过标准方法与骨髓瘤细胞融合。根据标准方法，可以在标准的次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培养基中选择杂交瘤。使用标准免疫学技术以及抗体提纯法(例如，通过亲和色谱法)，将识别靶蛋白的杂交瘤分泌的抗体进行鉴别、培养和亚克隆。在本发明递送系统的某些实施方案中，抗VEGF或抗VEGFR单克隆抗体从ImCloneSystems,Inc.(NY,NY)获得。例如，本发明制剂可包括从ImCloneSystems公司购买的商品名为IMC-18Fl的抗体，或商品名为IMC-1121Fab的抗体。可用于本发明药物制剂的另一个抗VEGF抗体片段是雷珠单抗，即结合VEGF-A的Fab片段。在本发明药物递送系统中有用的另一个抗VEGF抗体是贝伐单抗，即结合VEGF-A的单克隆抗体。
蛋白质组分可以呈液体、衍化、微粒化或粉末形式，并且可通过生物可降解的聚合物基质来包埋。通常，在喷雾干燥颗粒中或在粉末形式中的蛋白质颗粒的有效平均粒度将小于约1微米。在一些实施方案中，颗粒的平均粒度约小于1000纳米的数量级。例如，该颗粒的有效平均粒度可小于约500纳米。在一些微球制剂中，颗粒的有效平均粒度可小于约250纳米，而在另一些实施方案中，尺寸小于约200纳米。
根据一些实施方案，蛋白质组分可具有合适的分子量。蛋白质的分子量可在约10千道尔顿(“kDa”)至约150kDa的范围内。根据一些实施方案，蛋白质组分的分子量可大于约5kDa、大于10kDa、大于20kDa、大于50kDa或大于100kDa。根据一些实施方案，蛋白质组分的分子量可在约10kDa至30kDa、14kDa至16kDa、14kDa至21kDa或20kDa至50kDa的范围内。
在一些实施方案中，根据制剂或微球制剂的蛋白质的长度可为至少20、至少30、至少50、至少100、至少200或至少300个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质组分包括三个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的长度可为30至50个氨基酸或100至500个氨基酸。
根据一些实施方案，制剂或微球制剂可包括基于制剂或微球制剂的总重量，用量为制剂重量的1.0％至约50％的蛋白质。根据一些实施方案，基于制剂或微球制剂的总重量，蛋白质可存在于制剂或微球制剂中的量为约5重量％至约30重量％、约5重量％至约40重量％、约10重量％至约25重量％、或约重量5％、约10重量％、约20重量％或约30重量％的蛋白质。根据一些实施方案，制剂或微球制剂包含基于微球制剂的总重量，约5重量％、约6重量％、约7重量％的蛋白质、约8重量％的蛋白质、约10重量％的蛋白质、约15重量％的蛋白质、约20重量％的蛋白质、约25重量％的蛋白质、约30重量％的蛋白质或约35重量％的蛋白质。
赋形剂
根据一些实施方案，制剂或微球制剂可包括一种或多种一般类别的赋形剂。一般的赋形剂类别可包括白蛋白、缓冲剂、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、环糊精、聚乙二醇、表面活性剂等。根据一些实施方案，包括微球组合物的组合物包括不超过三种类别的赋形剂。根据一些实施方案，组合物仅包括两种类别的赋形剂。
缓冲剂可包括磷酸盐缓冲剂(如磷酸氢二钠七水合物、磷酸二氢钠一水合物)；和/或硼酸盐缓冲剂(如硼酸钠、硼酸、氯化钠)(根据Eu.Pharmacopeia)。根据一些实施方案，缓冲剂是用在制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。
本发明组合物的某些实施方案包含环糊精组分。例如，相对于包含相同治疗组分且基本上没有环糊精组分的组合物，环糊精组分可与治疗组分相结合以提高组合物中治疗组分的溶解度，提高或改善组合物中治疗组分的稳定性。
在某些实施方案中，本发明组合物的赋形剂包含环糊精组分(如一种或多种不同类型的环糊精或环糊精衍生物)。例如，环糊精组分可包含选自由α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、其衍生物和其混合物组成的组的环糊精。术语“环糊精衍生物”具有在本领域通常所理解的最广含义，并且是指化合物或化合物的混合物，其中α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精的一个或多个游离羟基被任何其它基团替代。“水溶性”环糊精衍生物可以至少300mg/mL的浓度溶于水中。用于本文公开的组合物的环糊精衍生物可以改变。可使用α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的衍生物。在某些组合物中，可以使用β-环糊精衍生物(如磺丁基醚-β-环糊精钙、磺丁基醚-β-环糊精钠和羟基丙基-β-环糊精)。可选地，可以使用γ-环糊精衍生物(如磺丁基醚-γ-环糊精钙、磺丁基醚-γ-环糊精钠和羟基丙基-γ-环糊精)。本文涉及的一些具体衍生物是环糊精的羟基丙基衍生物(如羟基丙基-β-环糊精或羟基丙基-γ-环糊精)。
环糊精(CD)是以如羟基丙基γ-CD(“HP-γ-CD”)的化合物可商购获得、作为磺丁基醚-4β-CD(“SBE-CD”)可商购获得、作为和羟基丙基β-CD(“HP-β-CD”)可商购获得、作为羟基丙基-α-环糊精(“HP-α-环糊精”)等可商购获得。
如果使用的话，环糊精占所公开的制剂或微球制剂的一定重量百分率。根据一些实施方案，基于制剂的总重量，存在于制剂中的环糊精的量在10重量％至75重量％的范围内。根据一些实施方案，基于制剂的总重量，存在于制剂中的环糊精的量在30重量％至70重量％、1重量％至10重量％、3重量％至7重量％或5重量％至15重量％的范围内。根据一些实施方案，环糊精是用于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，环糊精是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。根据一些实施方案，SBE-CD和缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂可包含与蛋白质组分分开的氨基酸。可用于制剂和微球制剂的实例赋形剂氨基酸可包括精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸和/或甘氨酸以及本领域技术人员已知的其它氨基酸。根据一些实施方案，基于制剂的总重量，存在于制剂中的第一氨基酸的量在0.5重量％至2重量％、1重量％至10重量％、1重量％至3重量％、4重量％至7重量％、3重量％至7重量％或5重量％至15重量％的范围内。根据一些实施方案，基于制剂的总重量，存在于制剂中的第二氨基酸的量在0.5重量％至2重量％、1重量％至10重量％、1重量％至3重量％、4重量％至7重量％、3重量％至7重量％或5重量％至15重量％的范围内。根据一些实施方案，氨基酸和缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，氨基酸是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂可包括碳水化合物。可用于制剂和微球制剂的示例性赋形剂碳水化合物可包括海藻糖、菊粉或三氯蔗糖以及本领域技术人员已知的其它碳水化合物。根据一些实施方案，基于制剂的总重量，存在于制剂中的碳水化合物的量在0.5重量％至2重量％、1重量％至10重量％、1重量％至3重量％、4重量％至7重量％、3重量％至7重量％或5重量％至15重量％的范围内。根据一些实施方案，碳水化合物和缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，碳水化合物是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂可包括螯合剂。可用于制剂和微球制剂的示例性赋形剂螯合剂可包括EDTA。根据一些实施方案，螯合剂和缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，螯合剂是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂可包括聚乙二醇。可用于制剂和微球制剂的示例性赋形剂聚乙二醇可包括PEG400。根据一些实施方案，聚乙二醇和缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，聚乙二醇是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂可包括表面活性剂。可用于制剂和微球制剂的示例性赋形剂表面活性剂可包括聚山梨醇酯80。根据一些实施方案，表面活性剂和缓冲剂是存在于制剂或微球制剂中的唯一赋形剂。在一些实施方案中，表面活性剂是存在于制剂或微球制剂中的两种或三种赋形剂中的一种。
根据一些实施方案，存在于组合物中的赋形剂组分可呈具有合适的摩尔浓度的液体形式。在一些实施方案中，存在于组合物中的一种或多种赋形剂的摩尔浓度在约6mM至约120mM的范围内。在一些实施方案中，赋形剂的浓度在约5mM至约75mM的范围内。根据其它实施方案，赋形剂的浓度在约6mM至约60mM的范围内。根据另外其它实施方案，赋形剂的浓度为约6mM、20mM、40mM、60mM、100mM、120mM等。根据一个实施方案，可使用具有60mM浓度的赋形剂(如环糊精(如磺丁基醚-β-环糊精))。
基于制剂的总重量，存在于制剂或微球制剂中的一种或多种赋形剂的量可为制剂的0.01重量％至约50重量％、0.01重量％至约20重量％、约0.01重量％至约15重量％、或制剂的约15重量％至约30重量％。
生物可降解的聚合物基质
在一个实施方案中，微球包含生物可降解的聚合物基质。生物可降解的聚合物基质是一种类型的药物持续释放组分。生物可降解的聚合物基质可由一种聚合物或两种或更多种聚合物的混合物制成。在形成生物可降解的微球中生物可降解的聚合物基质可以是有效的。生物可降解的微球包含与生物可降解的聚合物基质缔合的蛋白质组分。
用于微球的合适聚合材料或组合物包括可与眼睛相容，即可与眼睛生物相容的那些材料，以便不引起对眼睛功能或生理学的实质干扰。此类材料可为至少部分或基本上完全可生物降解的或可生物侵蚀的。
适用的聚合材料的实例包括(而不限于)衍生自和/或包括有机酯和有机醚的此类材料，其在降解时产生生理学上可接受的降解产物，包括单体。此外，也可使用衍生自和/或包括酐、酰胺、原酸酯等的聚合材料自身或与其它单体的组合。聚合材料可为加聚物或缩聚物，有利地是缩聚物。聚合材料可为交联或非交联的，例如最多轻微交联的，如小于约5％或小于约1％的聚合材料为交联的。在很大程度上，除了碳和氢外，聚合物还将包括氧和氮中的至少一种，有利地是氧。氧可以氧基(例如，羟基或醚)、羰基(例如，非氧羰基，如羧酸酯)等存在。氮可以酰胺、氰基和氨基存在。Heller,BiodegradablePolymersinControlledDrugDelivery,In:CRCCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,第1卷,CRCPress,BocaRaton,FL1987,第39-90页中阐明的聚合物可用于本发明微球，该文献描述了用于控制药物递送的包封。
另外关注羟基脂肪族羧酸聚合物(呈均聚物或共聚物)及多糖。关注的聚酯包括D-乳酸、L-乳酸、外消旋乳酸、乙醇酸、聚己内酯及其组合的聚合物。通常，通过使用L-乳酸酯或D-乳酸酯获得缓慢侵蚀的聚合物或聚合材料，而使用乳酸酯外消旋物时侵蚀大体上增强。
多糖中适用的是(而不限于)海藻酸钙和官能化纤维素，例如尤其是特征为不溶于水、分子量为约5kD至500kD的羧甲基纤维素酯。
关注的其它聚合物包括(而不限于)聚乙烯醇、聚酯、聚醚和其组合，其为生物相容的且可能是生物可降解的和/或生物可侵蚀的。
使用的聚合物或聚合材料的一些特征可包括生物相容性、与蛋白质的相容性、聚合物在制备微球中使用的便利性、在生理环境下至少约2周的半衰期、在某些实施方案中大于约1个月的半衰期和在水中的溶解性(或缺乏溶解性)。
包括的以形成的微球的生物可降解的聚合材料易受酶促不稳定性或水解不稳定性。水溶性聚合物可与水解或生物可降解的不稳定交联剂交联以提供有用的水不溶性聚合物。取决于选择的单体、是否使用均聚物或共聚物、使用聚合物的混合物和聚合物是否包括末端酸基，稳定性程度可广泛变化。
在一些实施方案中，对于控制聚合物的生物降解并因此控制微球制剂的延长释放曲线同等重要的是微球中所使用的聚合组合物的相对平均分子量。不同分子量的相同或不同聚合组合物可能包括在微球中以调整释放曲线。在某些制剂和微球制剂中，聚合物的相对平均分子量可以在约9kD至约64kD、约10kD至约54kD、或约12kD至约45kD的范围内。
在一些微球中，使用乙醇酸与乳酸的共聚物，其中生物降解率由乙醇酸与乳酸的比率控制。最快速降解的共聚物具有大致等量的乙醇酸和乳酸。具有除相等之外的比率的均聚物或共聚物对降解更具抵抗力。乙醇酸与乳酸的比率也影响微球的脆性。在聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)共聚物中的聚乳酸的摩尔百分数(摩尔％)可在15摩尔％与约85摩尔％之间。在一些实施方案中，在(PLGA)共聚物中的聚乳酸的摩尔百分数为在约35摩尔％与约65摩尔％之间。在一些实施方案中，在聚合物基质中可使用具有50摩尔％聚乳酸和50摩尔％聚乙醇酸的PLGA共聚物。在一些实施方案中，在聚合物基质中可使用具有75摩尔％聚乳酸和25摩尔％聚乙醇酸的PLGA共聚物。
结膜下微球的生物可降解的聚合物基质可包含两个或更多个生物可降解的聚合物的混合物。例如，微球可包含第一生物可降解的聚合物和不同的第二生物可降解的聚合物的混合物。一个或多个生物可降解的聚合物可具有末端酸基。
根据一些实施方案，使用的生物可降解的聚合物的特性粘度可在约0.1dL/g至约1.0dL/g的范围内。根据一些实施方案，使用的生物可降解的聚合物的特性粘度可在约0.5dL/g至约1.0dL/g的范围内。
可单独或组合使用以形成微球的一些示例性聚合物包括列于下面表A中的那些，可商购获得的聚合物的说明书、数据表和测试数据以引用的方式整体并入：
表A
生物可降解的聚合物微球可包含两种或更多种生物可降解的聚合物的混合物。例如，微球可包含第一生物可降解的聚合物和不同的第二生物可降解的聚合物的混合物。一个或多个生物可降解的聚合物可具有末端酸基。根据一些实施方案，微球包括不超过一种类型的生物可降解的聚合物。
根据一些实施方案，基于制剂的总重量，生物可降解的聚合物占所述微球制剂的75重量％至94重量％。根据其它实施方案，基于微球制剂的总重量，生物可降解的聚合物占微球制剂的75重量％至85重量％。根据其它实施方案，基于微球制剂的总重量，生物可降解的聚合物占微球制剂的85重量％至95重量％。
微球
使用适当的工艺可制得含有蛋白质的微球。在一个实施方案中，含有蛋白质的微球可通过如在PCT公开号2011/041642中所述的水包油包水乳液工艺来制得，通过水包油包水乳液工艺制备微球的方法以引用的方式整体并入本文。
蛋白质组分从微球中的释放可包括起始的突释，随后是释放的蛋白质组分的量的逐渐增加，或释放可包括蛋白质组分释放的起始延迟，随后是释放的增加。
提供蛋白质组分从微球中的相对恒定的释放速率可为合乎需要的。例如，对于微球的寿命来说，可希望每天释放约2μg至约10μg量的蛋白质组分。根据一些实施方案，可希望释放蛋白质组分的量约4μg/天、5μg/天、6μg/天、7μg/天等。然而，释放速率可取决于生物可降解的聚合物基质的制剂而改变为提高或降低。此外，蛋白质组分的释放曲线可包括一个或多个线性部分和/或一个或多个非线性部分。在一些实施方案中，一旦微球开始降解或侵蚀，那么释放速率大于零。
微球可为整体的，即一种或多种活性剂均匀地分布于聚合物基质中或包封，其中活性剂的储存器由聚合物基质包封。由于易于制造，微球可比包封形式展示优势。然而，在一些情况下，通过包封的微球得到的更大控制可具有益处，这种情况下，药物的治疗水平落入狭窄治疗窗内。另外，包括蛋白质组分的治疗组分可以非均质模式分布在基质中。例如，微球可包括相对于微球的第二部分具有更大蛋白质组分浓度的部分。
根据一些实施方案，本文公开的微球尺寸可在约5μm与约1mm之间或在约10μm与约0.2mm之间，以便用针施用。根据一个实施方案，微球的尺寸可为约.15mm。对于用针注射的微球，只要微球的最长尺寸允许微球穿过施用装置(如针(如22号针、25号针、27号针等))，那么微球可为任何合适的尺寸。
微球在单剂量中的总重量(最佳量)取决于结膜下空间的体积和蛋白质的活性或溶解性。根据一些实施方案，每剂量微球的剂量为约1mg至约40mg。在一些实施方案中，微球的剂量在0.1mg至1mg、10mg至30mg、10mg至20mg之间等。在一个实施方案中，单次注射可含有约1mg、或约5mg、或约10mg、或约15mg、或约17mg或约20mg、或约30mg、或约35mg的微球，包括并入的治疗组分。对于非人类个体，根据个体类型，微球的尺寸和总重量可为更大或更小。
基于聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(“PLGA”)的蛋白质微球制剂具有常规的溶液制剂，其优势在于微球制剂可在很长的时间段内递送活性蛋白，在一些情况下为几周或几个月内的事。
实施例
在不意图限制公开内容的范围的情况下，通过下列实施例阐述了示例性实施方案。
实施例1
通过掺入赋形剂稳定高度浓缩的蛋白质溶液。
根据一个实施例，一个月后在37℃下检测磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中配制含有以及不含赋形剂的100mg/ml抗钙素示例性实施方案溶液的可溶性蛋白质回收率。根据第一制剂，在具有摩尔浓度为6mM的SBE-CD的PBS中制备100mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的6mMSBE-CD的量为10.6重量％。根据第二制剂，在具有60mMSBE-CD的PBS中制备100mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的60mMSBE-CD的量为54.1重量％。根据第三制剂，在具有120mMSBE-CD的PBS中制备100mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的120mMSBE-CD的量为70.2重量％。根据第一比较制剂，在没有SBE-CD的PBS中制备100mg/mL抗钙素溶液。将该溶液于37℃下贮存一个月，然后分析以确定溶液中可回收的可溶性蛋白的百分率。结果在图1中示出。
如图1所示，第一比较制剂显示在37℃下孵育一个月后可溶性蛋白质回收率下降39％。可溶性蛋白质回收减少可归因于蛋白质聚集，导致不溶性颗粒物的形成。然而，如图1所示，在37℃下孵育一个月后添加浓度为6mM和60mM的SBE-CD至PBS中的100mg/mL抗钙素溶液分别将可溶性蛋白质回收率提高了19％和23％。在120mM的最高测试SBE-CD浓度下，与不含SBE-CD的第一比较制剂相比，可溶性蛋白质回收率仅提高10％。令人吃惊的是，在SBE-CD摩尔浓度为60mM时出现可溶性蛋白质的最高回收百分率，其不是用最高摩尔浓度的SBE-CD测试的制剂。与在PBS中不含有额外赋形剂的制剂相比，第一、第二、第三和第四制剂示出提高的蛋白质回收率。
实施例2
通过掺入赋形剂在升高温度下稳定抗钙素溶液。
根据另一个示例性实施方案，在50℃的升高温度下评价抗钙素蛋白质的稳定性。根据这个实施例，两天后在50℃下测试磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中配制含有以及不含赋形剂的10mg/ml抗钙素示例性实施方案溶液的可溶性蛋白质回收率。根据第四制剂，在具有SBE-CD的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的SBE-CD的量为46.0重量％。根据第五制剂，在具有羟基丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的HP-β-CD的量为35.2重量％。根据第六制剂，在具有羟基丙基-γ-环糊精(“HP-γ-CD”)的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的HP-γ-CD的量为38.4重量％。根据第七制剂，在具有海藻糖的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的海藻糖的量为35.2重量％。根据第二比较制剂，在没有额外赋形剂的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。将所述溶液在保持于50℃的烘箱中贮存2天，然后分析以确定溶液中可回收的可溶性蛋白质的百分率。结果在图2中示出。
图2显示在50℃烘箱中孵育2天后，在PBS中配制含有以及不含赋形剂的10mg/mL抗钙素溶液的可溶性蛋白质的回收率。如图2所示，比较制剂二的可溶性蛋白质的回收率为约66％。如所示的，添加SBE-CD(在第四制剂中)或海藻糖(在第七制剂中)将可溶性蛋白质回收率提高约18％，而添加HP-β-CD(在第五制剂中)或HP-γ-CD(在第六制剂中)将可溶性蛋白质回收率提高约12％。令人吃惊的是，包含碳水化合物海藻糖的制剂展示与包含SBE-CD的制剂一样高的可溶性蛋白质回收率。与在PBS中不含有额外赋形剂的制剂相比，第四、第五、第六和第七制剂都显示出提高的蛋白质回收率。
根据另一示例性实施方案，在50℃的升高温度下评价抗钙素蛋白质的稳定性。根据这个实施例，5天后在50℃下测试磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中配制含有以及不含赋形剂的10mg/ml抗钙素示例性实施方案溶液的可溶性蛋白质回收率。根据第八制剂，在具有PEG400的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的PEG400的量为54.6重量％。根据第九制剂，在具有葡聚糖的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的葡聚糖的量为63.7重量％。根据第十制剂，在具有甘氨酸的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的甘氨酸的量为4.8重量％。根据第十一制剂，在具有脯氨酸的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。基于制剂的总重量，存在于制剂中的脯氨酸的量为7.1重量％。根据第三比较制剂，在不含赋形剂的PBS中制备10mg/mL抗钙素溶液。将该溶液在保持于50℃的烘箱中贮存5天，然后分析以确定溶液中可回收的可溶性蛋白质的百分率。结果在图3中示出。
图3显示在50℃烘箱中孵育5天后，在PBS中配制含有以及不含赋形剂的10mg/mL抗钙素溶液的可溶性蛋白质的回收率。在此，结果显示当与不含额外赋形剂的蛋白质溶液相比时，不是所有的赋形剂提高可溶性蛋白质的回收率。例如，包括分别添加氨基酸甘氨酸和脯氨酸的第十和第十一制剂增加抗钙素的可溶性回收率。在第八和第九制剂中添加PEG400和葡聚糖分别将可溶性抗钙素回收率减小了7％-11％。
实施例3
基于PLGA的抗钙素微球的制造和测试
根据一个示例性实施方案，使用双重乳液溶剂蒸发方法生产基于PLGA的抗钙素微球。制备这些微球的方法被称为水包油包水(W/O/W)过程，并且将其公开例如在PCT公开号2011/041642中，制备本文所公开的微球的方法以引用的方式明确地并入。根据这个实施例，在约4℃至10℃的温度下执行该过程以提高批次间重现性并增加抗钙素的稳定性。
为了确定在PLGA聚合物网络内蛋白质的实验负载量和蛋白质的质量，使用两步萃取法将包封的蛋白质及其可溶性降解物从干燥的微球中萃取出来，随后进行SEC分析。将抗钙素的降解产物分成两类：高分子量(“HMW”)种类和低分子量(“LMW”)种类。HMW种类是分子量高于抗钙素单体的分子量的抗钙素聚集体，然而LMW种类是分子量低于抗钙素单体的分子量的抗钙素片段。
在pH＝7.4，37C温度下且不搅拌，在体外使用包含100mM磷酸盐的释放培养基评估制备的微球的释放曲线。所有样品都制备双份。在每个预设的时间点，对90％溶液进行取样用于解析分析，并且用相同体积的新制释放培养基来替代取样体积。
实施例4
在基于PLGA的微球中包封抗钙素
下面表B示出含抗钙素的基于PLGA的微球中的几种示例性制剂。如表B所示，不含任何赋形剂的基于PLGA的微球制剂的包封效率为约78.6％，该微球制剂包含11.4％的可溶性聚集体。如表所示，有利的是，添加精选的赋形剂将可溶性聚集体组合物从11.4％减少低至3.9％。
表B
在含有6％抗钙素的PLGA微球制剂中赋形剂的影响
如表B所示，包含SBE-CD的制剂的可溶性聚集体的最低量的范围为3.9％至4.7％[聚集体减少3倍]。虽然不希望受任何理论的束缚，但是这个结果可证明SBE-CD保护蛋白质不受微球加工条件和释放条件的影响的能力。有趣的是，尽管单独添加精氨酸具有很少减少可溶性聚集体的作用，但是当单独使用或与SBE-CD组合时，它提高蛋白质的包封效率。海藻糖还证明了在微球制剂中聚集体的减少。令人吃惊的是，在制备PLGA微球的过程中，SBE-CD和精氨酸的组合在减少聚集体以及最大化包封效率方面是协同的。
表C示出了这个组合在最小化聚集体中的更加广泛的应用，其中在其它PLGA聚合物组合中掺入这些赋形剂产生聚集体浓度约5％的微球。
表C
含有6％抗钙素的负载SBE-CD/精氨酸的微球的低聚集制剂
实施例5
抗钙素从基于PLGA的微球中的持续释放
如实施例3所述制造并测试基于PLGA的微球。图4和图5示出抗钙素的不同释放曲线，并且证明了通过微球组合物和制造工艺的修改来调节抗钙素至不同突释(burst)靶的释放、释放速率和持续时间的能力。
图4和图5证明由于向基于PLGA的微球中掺入某些赋形剂得到的一些有益特性，例如制剂实现持续释放两至三个月的能力。含有赋形剂的微球制剂显示稳定连续的释放，然而不含赋形剂的微球制剂7天后的释放速率迅速减慢，如图4所示。含有赋形剂的基于PLGA的微球显示几乎完全回收，累积释放为约77％，然而不含赋形剂的基于PLGA的微球显示累积释放为约47％。图5示出使用不同赋形剂和相同的过程参数调节突释和释放速率的能力。
实施例6
聚合物对抗钙素从基于PLGA的微球中释放的影响
聚合物特性(如特性粘度(“IV”)、玻璃化转变温度和分子量)可促进蛋白质包封和释放的程度。在微球制剂中评价具有不同IV(RG755S、RG753S和RG752S)的三种聚合物。表D示出聚合物特性粘度对包封和突释的影响。尽管此表显示虽然使用相同过程和相同的赋形剂组合物，但是显示含有RG755S的微球制剂具有最高的包封效率、最高的蛋白质质量(例如，最低百分率的可溶性聚集体)和最低的突释。
表D
聚合物特性粘度对包封和突释的影响
图6示出从由具有不同IV的聚合物制造的微球中释放抗钙素。由RG755S制造的微球具有最高的IV，其显示连续释放，然而由RG753S和RG752S产生的微球7天后显示扁平的释放曲线。
聚合物共混可影响抗钙素自基于PLGA的微球的突释和释放速率。如图7所示，RG755S可与更具亲水性的聚合物共混以降低抗钙素自微球的突释和释放速率。与主要具有RG755S的微球制剂相比，RG755S和RG502H的比率为13比1的聚合物共混物使得微球制剂具有比主要具有RG755S的微球制剂更低的突释和更快的释放速率。然而，释放持续时间减少至1个月。
实施例7
从基于PLGA的微球中释放的抗钙素的结合活性
通过酶联免疫吸附测定(“ELISA”)测量从所选的基于PLGA的微球中释放的抗钙素的结合活性。活性定义为通过ELISA浓度与SEC浓度之比测定的浓度百分率。图8示出持续两个月从基于PLGA的微球中释放的抗钙素的结合活性。在整个释放期间释放蛋白是有活性的，对于含有赋形剂的微球制剂其结合活性高于70％，对于不含赋形剂的微球制剂其结合活性高于50％。
实施例8
含有抗体的基于PLGA的微球的制造、测试以及释放
根据另一个实施例，如实施例3所述使用抗体、贝伐单抗代替抗VEGF蛋白、抗钙素制造并测试基于PLGA的微球。图9比较了含有抗钙素的基于PLGA的微球与含有贝伐单抗的基于PLGA的微球制剂的释放曲线。该数据表明用来开发用于递送抗钙素的持续释放制剂的过程和制剂可应用于分子量为149kDa的全长单克隆抗体以持续时间递送活性蛋白质。
虽然已经在某些优选实施方案和实施例的上下文中公开了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明将专门公开的实施方案扩展到本发明的其它替代实施方案和/或用途以及其明显修改和等价物。另外尽管已详细显示并描述了本发明的许多变型，但是根据本公开，在本发明的范围内的其它修改对于本领域的技术人员是显而易见的。还考虑的是可进行实施方案的具体特征和方面的各种组合或子组合，并且各种组合或子组合仍然落入本发明的范围之内。因此，应理解公开的实施方案的各种特征和方面可以互相组合或互相取代，以便执行所公开发明的不同模式。因此，意图是本文公开的本发明的范围不应限于上面描述的具体公开的实施方案，而是应该仅通过清楚地阅读权利要求书来确定。

Claims (6)

1.一种物质组合物，其包含：
颗粒，所述颗粒包含蛋白质、生物可降解的聚合物和一种或多种赋形剂；
其中所述颗粒被配置用于递送所述蛋白质，持续不少于2个月的时间段。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述生物可降解的聚合物包含聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)、聚(d,l-丙交酯)和/或聚乙二醇共聚物，其特性粘度在0.1dL/g至1.0dL/g的范围内。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白质的分子量在10kDa至150kDa的范围内。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含环糊精、海藻糖、精氨酸或其组合。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含环糊精，并且所述环糊精为磺丁基醚-β-环糊精。
6.一种水性制剂，其包含：
蛋白质；
缓冲剂；以及
一种或多种赋形剂，其选自由环糊精、海藻糖和精氨酸组成的组；
其中所述一种或多种赋形剂以相对于所述蛋白质的摩尔浓度而言在10/1至200/1范围内的摩尔比存在于所述水性制剂中。
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